KR20170092829A - 류마티스성 관절염 진단방법 - Google Patents

류마티스성 관절염 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 류마티스성 관절염 환자의 지단백질을 수집하는 단계; 상기 지단백질의 이동성, 응집 및 분해 여부, 산화물 함량 증가 여부, 당화 정도, 혈관 대식세포 탐식 정도, 항염증 기능 감소 여부, 및 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP) 활성 정도로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염 진단방법에 관한 것으로, 본 발명의 진단방법은 관절염의 조기진단 및 진행 정도를 간단한 절차를 통하여 효과적으로 진단할 수 있다.

Description

류마티스성 관절염 진단방법{Diagnostic method for rheumatoid arthritis}
본 발명은 류마티스성 관절염의 발명 및 진행 정도를 조기 진단할 수 있는 진단 방법에 관한 것이다.
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 여러 관절에 다발성으로 나타나는 염증성 자가면역질환이다. 관절염에 걸린 환자의 경우, 관절의 활막 조직이 과증식되며, 판누스의 형성, 연골 및 뼈의 파괴가 특징으로 나타나며 대식세포, 수지상세포 및 활성화된 T 림프구와 B 림프구가 활막 조직으로 이동하고 다형핵 세포는 활액내와 연골표면에 축적되어 염증을 유발하게 되는 것이다.
초기 류마티스성 관절염은 처음에 더 작은 관절, 예컨대 손목, 손, 발목 및 발의 관절에 영향을 미치며 질환이 진행됨에 따라, 어깨, 팔꿈치, 무릎, 둔부, 턱 및 목의 관절들에도 영향을 나타낼 수 있다.
또한, 관절 내 부위 또는 관절 주변 부위에만 영향을 미치는 다른 관절염 상태들과는 달리, 류마티스성 관절염은 피부, 혈관, 심장, 폐 및 근육을 포함하는 신체에 걸쳐 관절외 조직에서 염증을 야기할 수 있는 전신성 질환이다.
이러한 류마티스성 관절염은 통증, 기형, 삶의 질 하락 및 장애와 연관되며, 결과적으로 환자가 정상적이고 생산적인 삶을 살 수 있는 능력에 대해 영향을 미친다.
최근의 연구에 따르면, 상기 질환이 개시되고 5년 후에 류마티스성 관절염 환자의 약 1/3이 더 이상 작업을 할 수 없었으며, 10년 내에 환자의 절반이 실질적인 기능 장애를 나타내었다고 보고되었으며, 이러한 류마티스성 관절염 환자는 현대화와 공해물질 증가로 인해 꾸준히 증가하고 있으며 발병 연령층 또한 30대로 점점 낮아지고 있다.
한번 발병이 시작되면 꾸준히 악화되고 관절에 심각한 염증과 통증이 증가하는 질병인 류마티스성 관절염에 대한 적절한 치료방법이 없기 때문에 류마티스성 관절염의 초기 진단이 매우 중요하나 현재로서는 류마티스성 관절염의 발병 및 진행 정도를 조기에 진단하는 기술 또한 미흡하여 이에 대한 연구 및 개발이 필요한 실정이다.
한국공개특허 제2001-0112861호(2001.12.22 공개)
본 발명은 리피드 및 지단백질 프로필을 통하여 류마티스성 관절염의 발명 및 진행 정도를 조기 진단할 수 있는 바이오마커 및 진단 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 류마티스성 관절염 환자의 지단백질을 수집하는 단계; 상기 지단백질의 이동성, 응집 및 분해 여부, 지단백질 산화물 함량 증가 여부, 지단백질 당화 정도, 혈관 대식세포 탐식 정도, 항염증 기능 감소 여부, 및 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP) 활성 정도로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 류마티스성 관절염 환자의 지단백질을 제브라피쉬 배아에 처리하는 단계; 및 상기 지단백질이 처리된 제브라피쉬 배아 내 활성산소종 증가 여부, 및 제브라피쉬 배아 사멸 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 류마티스성 관절염 환자의 혈청에서 분리된 리피드 및 지단백질에서 류마티스성 관절염 환자의 고유한 지단백질 특성인 지단백질의 이동성, 응집 및 분해, 산화물 함량 증가, 당화 증가, 혈관 대식세포 탐식 증가, 항염증 기능 감소 및 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP) 활성이 증가한 것을 확인하고 이를 류마티스성 관절염 진단용 바이오마커로 제공하여 관절염의 조기진단 및 진행 정도를 간단한 절차를 통하여 효과적으로 진단할 수 있는 진단방법으로 사용될 수 있다.
도 1은 류마티스 관절염 환자의 저밀도 지단백질(LDL)의 당화 증가 여부를 확인한 결과로, 도 1A는 당화변형 정도를 형광활성으로 확인한 결과이며, 도 1B는 전기영동으로 저밀도 지단백질의 응집, 분해 및 이동성을 확인한 결과이다.
도 2는 구리이온 처리에 따른 류마티스 관절염 환자의 저밀도 지단백질(LDL) 산화민감도를 확인한 결과로, 도 2A는 각 류마티스 관절염 환자군의 저밀도 지단백질의 산화물 양을 자외선 흡광도(A234)로 확인한 결과이며, 도 2B는 저밀도지단백질의 이동성을 확인한 결과이다(YM: young male; RAM: rheumatoid arthritis male; YF: young female; RAF: rheumatoid arthritis female).
도 3은 류마티스 관절염 환자의 고밀도지단백질의 당화 정도를 확인한 결과로, 도 3A는 류마티스 관절염 환자에서 고밀도지단백질의 당화산물을 형광활성으로 확인한 그래프이며, 도 3B는 류마티스 관절염 환자의 고밀도지단백질(HDL3)의 이동성을 확인한 결과이다(YM: young male; RAM: rheumatoid arthritis male; YF: young female; RAF: rheumatoid arthritis female).
도 4는 류마티스 관절염 환자의 고밀도지단백질에서 CETP(Cholesteryl ester transfer protein) 활성을 확인한 결과이다(YM: young male; RAM: rheumatoid arthritis male; YF: young female; RAF: rheumatoid arthritis female).
도 5 및 도 6은 사람혈관 대식세포에서 류마티스 관절염 환자의 저밀도 지단백질(LDL)의 탐식 정도를 확인한 결과로, 도 5는 관절염 환자 LDL가 처리된 대식세포에서 LDL의 탐식 정도를 오일 레드 O로 염색하고 염색 여부를 확인한 세포 사진이며, 도 6은 오일 레드 O 염색 비율을 나타낸 그래프이다(YM: young male; RAM: rheumatoid arthritis male; YF: young female; RAF: rheumatoid arthritis female).
도 7은 산화물 증가를 확인한 결과로, 남자 및 여자 관절염환자의 대식세포를 배양한 배지에서 산화물 증가를 확인한 결과이다(YM: young male; RAM: rheumatoid arthritis male; YF: young female; RAF: rheumatoid arthritis female).
도 8은 콜레스테롤 유도체형광물질(NBD-cholesterol)이 표지된 관절염환자의 LDL을 대식세포에 처리하여 관절염환자의 동맥경화 진행 정도를 확인한 결과이다(YM: young male; RAM: rheumatoid arthritis male; YF: young female; RAF: rheumatoid arthritis female).
도 9는 관절염환자 및 대조군인 정상인의 LDL을 제브라피쉬 배아(4hpf)에 미세주입하여 배아생존률을 확인한 결과이다.
도 10은 관절염환자 및 대조군인 정상인의 LDL을 제브라피쉬 배아(4hpf)에 미세주입하여 배아 내 생성된 활성산소종(ROS) 농도를 확인한 결과이다.
도 11은 산화된 LDL을 제브라피쉬 배아(4hpf)에 미세주입하고 관절염환자 및 대조군인 정상인의 HDL을 처리하여 각 실험군의 HDL 항염증 기능을 확인한 그래프이다.
도 12는 관절염환자 및 대조군인 정상인의 LDL을 제브라피쉬 배아(4hpf)에 미세주입하고 DHE 형광염색을 수행하여 배아 내 생성된 산화물 정도를 확인한 결과이다.
본 발명은 류마티스성 관절염 환자의 지단백질을 수집하는 단계; 상기 지단백질의 이동성, 응집 및 분해 여부, 지단백질 산화물 함량 증가 여부, 지단백질 당화 정도, 혈관 대식세포 탐식 정도, 항염증 기능 감소 여부, 및 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP) 활성 정도로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염 진단방법을 제공한다.
상기 지단백질은 저밀도지단백질(low density lipoprotein; LDL), 고밀도지단백질(high density lipoprotein; HDL) 및 아포지단백질(Apolipoprotein)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
보다 상세하게는 본 발명의 지단백질의 응집 분해 여부 및 이동성은 혈청에서 분리된 지단백질의 전기영동 이동성 분석을 통하여 확인될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 류마티스성 관절염 환자의 혈청에서 분리된 지단백질과 정상 대조군의 혈청에서 분리된 지단백질 중 각각의 저밀도지단백질을 0.5% 아가로즈겔상에 전기영동하고, 아가로즈겔을 건조한 후 0.125% 쿠마시 블라이언트 블루로 밴드를 염색하였다.
그 결과, 도 1B와 같이 대조군과 비교하여 관절염환자에서 apo-B 밴드가 부러지는 현상을 보였으며, 여자관절염환자에서 가장 심각한 부러짐 현상을 나타내었다. 상기 결과를 통하여 당화물의 형성과 당화 스트레스에 의해 혈청 아포지단백질이 분해되는 것이 확인하였으며, 이를 진단방법으로 사용하여 류마티스성 관절염 진단에 이용할 수 있다.
또한, 상기 지단백질의 당화 정도는 저밀도 지단백질에서의 최종당화산물(advanced glycation end-product; AGE)의 함량 증가를 통하여 확인할 수 있으며, 이를 류마티스성 관절염진단에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 류마티스성 관절염 환자의 지단백질을 제브라피쉬 배아에 미세주입하는 단계; 및 상기 지단백질이 미세주입된 제브라피쉬 배아 내 활성산소종 증가 여부, 및 제브라피쉬 배아 사멸 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염 진단방법을 제공할 수 있다.
상기 지단백질은 저밀도지단백질(low density lipoprotein; LDL), 고밀도지단백질(high density lipoprotein; HDL) 및 아포지단백질(Apolipoprotein)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 참고예 > 류마티스성 관절염환자 모집
인터넷 광고를 통해 모집한 20대 대조군 및 영남대병원, 서울대병원 류마티즘 내과를 내원한 환자군을 대상으로 연구참여 사전 동의를 받고 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 혈청으로부터 밀도차에 의한 초원심분리를 통해 VLDL, LDL, HDL2, HDL3의 순으로 지단백질을 순차적으로 분리하였다.
각 지단백질 분획들을 정제하여 분석실험에 사용하였다.
< 실시예 1> 류마티스성 관절염환자의 혈청 리피드 및 염증 프로필 비교
관절염 환자들과 남자노인 또는 중년 여자 대조군의 혈청에서 혈청 리피드, 염증인자 및 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 (CETP, cholesteryl ester tansfer protein) 의 활성을 비교하였다. (YM, young male; control M, control male; RAM, rheumatoid arthritis male; YF young female; RAF, rheumatoid arthritis female)
그 결과, 하기 표 1과 같이 남자 관절염 환자군은 같은 나이인 70대 대조군과 비교하였을 때 총 콜레스테롤은 오히려 감소하는 경향을 보였고 중성지방은 큰 차이가 없었다. 그러나 HDL-cholestefol (HDL-C)은 절반 이하로 감소하였다. 염증 인자에서는 큰 차이를 보이지 않았으나 CETP의 활성은 20대 또는 70대 대조군보다 크게 증가하였다.
YM
(n=3) 		control M
(n=5) 		RAM
(n=5) 		YF
(n=3) 		control F
(n=8) 		RAF
(n=15)
Age(years) 27±1 69±4 69±4 22±1 54±1 35±7
TC (mg/ dL ) 165±32 218±28 184±17 166±18 210±14 191±20
TG(mg/ dL ) 78±27 114±54 101±28 64±15 91±14 181±29**
HDL- cholestefol
(mg/ dL ) 		57±6 57±18 22±5** 60±13 47±4 25±6**
%HDL - cholestefol 33±8 26±7 12±3 34±7 23±2 14±4
LDL- cholestefol
(mg/ dL ) 		80±7 169±33 142±34 88±7 145±12 129±19
%LDL - cholestefol 42±5 77±5 77±7 34±14 69±2 67±4
AST ( IU /L) 8±1 24±7 26±3 11±1 14±0 25±6*
ALT( IU /L) 6±2 20±8 19±4 5±1 16±0 26±13*
Glucose(mg/ dL ) 83±10 105±23 104±24 79±21 76±9 95±4
CETP activity
( %CE -transfer) 		22±1 23±2 41±2** 21±3 36±1 41±5*
여자 관절염 환자군의 경우, 총 콜레스테롤은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았으나 중성지방은 2배 이상 증가하였고 HDL-C(HDL-cholestefol)는 절반 이하로 감소하였다. 간 염증 수치는 2배 가까이 증가하였으며 CETP의 활성 또한 크게 증가하였다.
상기 결과들로부터 관절염 환자의 경우 중성지방이 증가하고 HDL이 감소하며 CETP가 증가하는 것이 확인되었으며, 이를 관절염 진단 바이오 마커로 사용할 수 있다.
< 실시예 2> 관절염 환자에서 분리된 저밀도지단백질(LDL)의 특성 확인
1. 관절염 환자의 저밀도 지단백질 (LDL) 당화 정도 확인
남자와 여자 관절염 환자군과 대조군의 저밀도 지단백질의 당화 변형 정도 비교를 위해서, 각 환자군과 대조군의 저밀도 지단백질에서의 최종당화산물(advanced glycation end-product; AGE)의 함량을 370 nm (excitation) 및 440 nm (emission)에서의 형광 강도로 측정하여 결정하였다. 이때, WinLab 소프트웨어 패키지 4.00 (Perkin-Elmer)과 1-cm 경로 길이 suprasil 석영 큐베트 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)를 구비한 LS55 형광분광 분석기 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)를 사용하였다.
그 결과, 도 1A와 같이 남자환자군에서는 저밀도지단백질의 당화물이 17% 증가하였으며, 여자환자는 44% 증가한 것으로 확인되었다.
또한, 저밀도지단백질의 단백질 패턴을 비교하기 위해, 각 환자군과 대조군의 저밀도지단백질을 0.5% 아가로즈겔 상 전기영동하고, 아가로즈겔을 건조한 후 0.125% 쿠마시 블라이언트 블루로 밴드를 염색하였다.
그 결과, 도 1B와 같이 대조군과 비교하여 관절염환자에서 apo-B 밴드가 부러지는 현상을 보였으며, 여자관절염환자에서 가장 심각한 부러짐 현상을 나타내었다. 상기 결과를 통하여 당화물의 형성과 당화 스트레스에 의해 혈청 아포지단백질이 분해되는 것이 확인되었다.
2. 관절염환자의 저밀도지단백질 (LDL) 산화 민감도 확인
각 관절염환자군의 저밀도지단백질에 구리이온을 처리하여 구리-매개 저밀도지단백질(LDL) 산화를 유도시키고 160분 후 형성된 산화물의 양을 자외선 흡광도(A234)로 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 2A에서와 같이 여자 관절염환자가 가장 빠른 산화민감도를 나타내었으며, 160분 후 초기 값의 2배 이상 증가한 것으로 확인되었으며, 남자 관절염환자는 초기 값의 1.7배 증가하였다.
또한, 아가로스 전기영동을 통하여 각 저밀도지단백질의 이동성을 비교하였다. 그 결과, 도 2B와 같이 관절염환자 저밀도지단백질의 이동성이 빨라졌으며 남자 관절염환자의 경우 아포지단백질 (apo-B100)의 분해가 심해지는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 관절염환자들의 저밀도 지단백질(LDL)은 산화에 민감하였으며, 아포지단백질은 분해되는 것으로 확인되었다.
3. 관절염환자의 저밀도 지단백질 (LDL) 탐식 및 세포 산화물 확인
사람혈관 대식세포에 정상대조군의 저밀도 지단백질(LDL) 또는 관절염환자의 저밀도 지단백질(LDL)을 처리하고 오일 레드 O로 염색하여 저밀도 지단백질(LDL)이 대식세포 내로 탐식되는 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5와 같이 사람혈관 대식세포에 정상대조군의 LDL이 처리된 대조군보다 관절염환자의 LDL이 처리된 실험군에서 대식세포 내로 LDL 탐식 정도가 현저하게 증가하였다. 또한, 도 6을 참고하면 오일 레드 O 염색 비율이 대조군과 비교하여 남자의 경우 2.6배 증가하였으며, 여자의 경우 3.3배 증가한 것으로 나타났다.
또한, 세포 배지에 산화물의 증가를 확인하기 위해, 이미 공개된 방법(Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958; 181:1199-1200)에 따라 말론디알데하이드(malondialdehyde; MDA)를 표준으로 이용하여, 세포 배양 배지에서 바비튜릭산 활성 기질 (TBARS) 분석을 수행하였다.
먼저, 세포 배양 배지 200 μL를 테스트 튜브에 넣고 20% trichloroacetic acid (in 0.05 N NaOH, TCA) 1 mL과 0.67 % Thiobarbituric acid (in 0.05 N NaOH, TBA) 1 mL을 넣은 후 교반기로 혼합하여 95 ℃에서 20 분 동안 반응시키고, 반응이 끝난 시료를 e-tube로 옮겨 12,000 rpm에서 3 분 원심분리 시킨 후 상층액 200 μL를 96 well plate에 넣고 Victor X4 multimode microplate reader (Perkin elmer)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 7과 같이 세포 배지 내 산화물이 남자의 경우 대조군에 비해 2.9배 증가하였으며, 여자의 경우 2.8배 증가하였다.
상기 결과로부터 관절염환자의 LDL들이 대식세포 내로의 탐식이 현저히 증가하고, 산화물의 생성이 급증하는 것이 확인되었다.
< 실시예 3> 관절염 환자에서 분리된 고밀도지단백질(HDL)의 특성 확인
1. 관절염 환자의 고밀도 지단백질 (HDL) 당화 정도 확인
남자와 여자 관절염 환자군과 대조군의 고밀도 지단백질의 당화 변형 정도 비교를 위해서, 각 환자군과 대조군의 고밀도 지단백질에서의 최종당화산물(advanced glycation end-product; AGE)의 함량을 370 nm (excitation) 및 440 nm (emission)에서의 형광 강도로 측정하여 확인하였다. 이때, WinLab 소프트웨어 패키지 4.00 (Perkin-Elmer)과 1-cm 경로 길이 suprasil 석영 큐베트 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)를 구비한 LS55 형광 분광 분석기 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)를 사용하였다.
그 결과, 도 3A와 같이 고밀도 지단백질의 당화 정도가 관절염 환자군에서 매우 높은 것으로 확인되었다. 특히, HDL2의 경우 남자관절염 환자군은 대조군보다 49% 증가하였으며, 여자관절염 환자는 대조군보다 66% 증가한 당화산물을 나타내었다.
상기 결과로부터 관절염 환자들의 고밀도 지단백질에서 당화 변형이 심각하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 아가로스 전기영동을 통하여 각 HDL3의 이동성을 비교하였다.
그 결과, 도 3B와 같이 관절염환자 고밀도 지단백질(HDL3)들이 당량체 형성을 나타내었으며, 특히 여자 관절염환자의 경우 다량체 형성이 심각하게 나타났으며, apoA-Ⅰ 밴드(28 kDa)의 위치가 위로 이동되어 약 30 kDa에 가까운 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 관절염환자의 경우, 당화 변형에 의해 apoA-Ⅰ단백질의 뭉침, 분자량 증가 및 이동성 감소 등의 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
2. 관절염 환자의 고밀도 지단백질(HDL)의 CETP 활성 확인
콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(Cholesteryl ester transfer protein, CETP)은 지단백질간에 콜레스테릴 에스테르(CE)와 중성지방(TG)의 수송과 교환을 담당하는 기능을 가지며, 분자량 70-74 kDa에 달하여 30%가 글리코실화반응(glycosylation)된 당단백질로, CE 전달 활성으로 혈액에서의 콜레스테롤 제거가 느려져 동맥경화를 유발 및 촉진시키고, 혈청에서 콜레스테롤을 배설하는 역할을 하는 HDL의 기능을 저하시켜 관절염과 같은 염증질환을 악화시키는 것으로 알려져 있으므로, 관절염 환자의 고밀도 지단백질(HDL)의 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(Cholesteryl ester transfer protein, CETP) 활성을 확인하였다.
이미 공개된 문헌( Lim SM, Yoo JA, Lee EY, Cho KH. Enhancement of HDL functions by encapsulation of policosanol exerts anti-senescence and tissue regeneration effects via improvement of anti-glycation, anti-apoptosis, and cholesteryl ester transfer inhibition. Rejuvenation Res. 2015; accepted.PMID: 26161621)에 따라, 공여체 HDL 내부의 [3H]-Cholesteryl oleate를 이용하여 CE가 LDL 내부로 전달되는 능력을 측정하였다.
그 결과, 도 4와 같이 관절염환자들의 HDL3에서 대조군보다 증가된 CETP 활성이 확인되었는데, 특히 남자환자는 59% 증가하였고 여자환자는 66% 증가 확인됨에 따라, 여자환자에서 더욱 높은 CETP 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4> 제브라피쉬 배아를 이용한 관절염환자의 지단백질 특성 확인
1. 관절염환자의 저밀도 지단백질(LDL)의 제브라피쉬 배아세포 사멸 및 활성산소종 생성 정도 확인
관절염환자 및 정상대조군의 LDL을 각각 제브라피쉬 배아(4hpf)에 미세주입하여 배아생존률을 확인하였다.
그 결과, 도 9와 같이 관절염환자 LDL이 미세주입된 제브라피쉬 배아의 사멸률이 대조군 LDL이 미세주입된 제브라피쉬 배아사멸율보다 높은 것으로 확인되었는데, 남자관절염환자의 경우 50%의 생존율을 나타내었으며, 여자관절염환자의 경우 40%의 생존율을 나타냄에 따라 여자관절염환자의 LDL이 염증 유발 및 배아세포 사멸을 촉진시키는 것으로 확인되었다.
또한, 관절염환자 및 정상대조군의 LDL이 각각 미세주입된 제브라피쉬 배아(4hpf)에서 활성산소종 생성 정도를 확인하기 위해 DHE 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 10과 같이 정상대조군의 LDL이 미세주입된 제브라피쉬 배아보다 관절염환자의 LDL이 미세주입된 제브라피쉬 배아에서 더욱 붉은 형광이 확인되었는데, 남자 관절염환자의 경우 대조군보다 4.5배 증가하였으며, 여자 관절염환자의 경우 4.0배 증가하였다.
상기 결과로부터 관절염환자의 LDL이 미세주입된 제브라피쉬 배아에서 활성산소종의 생성이 매우 증가하였음이 확인되었다.
2. 관절염 환자의 고밀도 지단백질(HDL)의 항염증 기능상실 확인
관절염환자 및 정상대조군의 HDL을 각각 제브라피쉬에 미세주입하여 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 11과 같이 정상적인 대조군의 HDL은 산화된 LDL(oxidized LDL, oxLDL)의 염증유발을 억제하여 제브라피쉬의 생존율을 증가시켰으나 관절염환자의 LDL은 제브라피쉬의 사멸율을 증가시켰는데, oxLDL 단독으로 제브라피쉬 배아에 미세주입된 경우 55%의 생존율을 나타낼 때 남자 정상적인 대조군의 HDL은 78%의 생존율을 나타낸 반면, 남자 관절염환자의 HDL은 73%의 생존율을 나타내어 항염증기능이 다소 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 여자의 경우 정상대조군의 HDL이 처리된 제브라피쉬는 약 80%의 생존을 나타내었으나 여자 관절염환자의 경우 61%의 생존율을 나타내었다.
상기 결과로부터 여자 관절염환자의 항염증 기능 손상이 더욱 심각한 것을 확인할 수 있었다.
또한, DHE 염색을 이용하여 관절염환자 및 정상대조군의 HDL이 각각 미세주입된 제브라피쉬 배아(4hpf)내 산화물 생성 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 12와 같이 oxLDL 단독으로 제브라피쉬 배아에 미세주입된 경우 가장 강한 염색수준인 4808 AU로 확인되었다. 이때 정상 HDL이 함께 주입된 경우 남자대조군 및 여자대조군에서는 형광활성이 현저하게 감소한 반면, 남자관절염환자의 경우 2774 AU로 감소하였으나 대조군과 비교하여 상대적으로 ROS 생성이 증가하였고 여자 관절염환자의 경우에도 대조군보다 증가된 ROS 생성을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 관절염환자의 HDL은 항염증기능이 상실된 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 류마티스성 관절염 환자의 지단백질을 수집하는 단계;
    상기 지단백질의 이동성, 응집 및 분해 여부,
    지단백질 산화물 함량 증가 여부,
    지단백질 당화 정도,
    혈관 대식세포 탐식 정도,
    항염증 기능 감소 여부, 및
    콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP) 활성 정도로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 지단백질은 저밀도지단백질(low density lipoprotein; LDL), 고밀도지단백질(high density lipoprotein; HDL) 및 아포지단백질(Apolipoprotein)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 지단백질의 이동성, 응집 및 분해 여부는 지단백질의 전기영동 분석으로 확인되는 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 당화 정도는 저밀도 지단백질에서의 최종당화산물(advanced glycation end-product; AGE)의 함량 증가를 확인하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
  5. 류마티스성 관절염 환자의 지단백질을 제브라피쉬 배아에 미세주입하는 단계; 및
    상기 지단백질이 미세주입된 제브라피쉬 배아 내 활성산소종 증가 여부, 및
    제브라피쉬 배아 사멸 증가 여부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염 진단방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 지단백질은 저밀도지단백질(low density lipoprotein; LDL), 고밀도지단백질(high density lipoprotein; HDL) 및 아포지단백질(Apolipoprotein)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 진단방법.
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