WO2020002398A1 - Mikrofluidische flusszelle und verfahren zur separierung von zellen - Google Patents

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WO2020002398A1
WO2020002398A1 PCT/EP2019/066950 EP2019066950W WO2020002398A1 WO 2020002398 A1 WO2020002398 A1 WO 2020002398A1 EP 2019066950 W EP2019066950 W EP 2019066950W WO 2020002398 A1 WO2020002398 A1 WO 2020002398A1
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flow cell
posts
cells
row
electrodes
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PCT/EP2019/066950
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Christoph FAIGLE
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Robert Bosch Gmbh
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    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
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    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/088—Passive control of flow resistance by specific surface properties

Definitions

  • Liquid biopsy is the analysis of liquid samples for the detection of diseases. Because only a liquid sample, usually blood, is needed, the patient is spared a tissue biopsy. In the case of cancer examinations, one would like to isolate circulating tumor cells (CTCs) directly from a blood sample in order to determine clinically relevant information on a disease using suitable detection methods, for example by detecting mutated nucleic acids.
  • CTCs circulating tumor cells
  • crossover frequencies There is interest in a marker-free, flexible insulation method.
  • One approach uses the different dielectrophoretic properties of CTCs compared to normal blood components to isolate them from the blood sample using suitable electrical fields.
  • the polarizability of cells depends on the frequency of the applied alternating electrical field and can jump from positive to negative at certain frequencies (so-called crossover frequency, hereinafter referred to as crossover frequencies).
  • crossover frequencies Gascoyne et al. IEEE Trans Ind Appl. 1997; 33 (3): 670-678 have shown that tumor cells have different crossover frequencies than normal blood cells.
  • DLD deterministic lateral displacement
  • the invention relates to a microfluidic flow cell for separating cells.
  • the flow cell includes electrodes for generating an electric field in the flow cell and rows of posts for local changes in an electric field strength. At least one row of posts is arranged inclined with respect to a flow direction from an entrance of the flow cell to an exit of the flow cell.
  • the cells can be biological cells, in particular human or animal cells, for example cells of microorganisms, in particular pathogens such as bacteria.
  • Posts can in particular be understood to mean elongated projections, for example columnar projections with in particular round or rounded or also angular cross sections, for example columns with in particular cylindrical bodies and circular cross sections.
  • the direction of flow can be understood in particular to be the direction which a fluid would take, in particular in the absence of the posts, which enters the flow cell through the entrance and exits the flow cell through the exit. In particular, this can be the direction from the entrance to the exit of the flow cell along the shortest route between the entrance and the exit.
  • An inclined arrangement of the row of posts with respect to the flow direction is understood to mean the presence of an angle between the flow direction and a second direction, the posts of the row being arranged along the second direction.
  • a line connecting the posts of the row is inclined or oblique with respect to the direction of flow.
  • an angle of inclination between a row of posts and the direction of flow is between 5 and 85 degrees, preferably between 10 and 80 degrees, very preferably between 15 and 75 degrees.
  • the flow cell can advantageously be used for the setting of the electric field for a wide range of different cells, also for the separation of cells which differ only slightly from one another. It is also advantageous that no complex electrode arrangements, for example micro-structured electrodes, have to be provided for a separation. In addition, it is advantageously possible to dispense with an often complex and not very specific marking of cells for the separation.
  • the flow cell preferably comprises two or more rows of posts, the rows being arranged inclined with respect to the flow direction.
  • the inclined arrangement advantageously supports the deflection of the cells from the direction of flow.
  • at least two rows of posts are arranged parallel to one another.
  • the separation effect of the flow cell is advantageously increased by further rows of posts.
  • a distance between a first row of posts and a second row of posts is greater than a distance between the posts of the first row. This advantageously causes an electric field strength between the first row posts to be greater than an electric field strength between a first row post and a second row post.
  • the posts of one or more rows are very preferably arranged periodically. This means in particular that the distances between the posts are the same size or that at least differences between the sizes of the distances with regard to the size of the distances are negligible.
  • the periodic arrangement has the advantage that the cells can be separated from one another uniformly and thus efficiently.
  • At least one of the electrodes is preferably arranged at the inlet and at least one of the electrodes is arranged at the outlet of the flow cell. This has the advantage that the electromagnetic field generated by the electrodes extends over the entire area between the entrance and the exit and in particular along or parallel to the direction of flow.
  • the electrodes are connected or connectable to a voltage source, in particular modulated with an electrostatic field
  • the electrodes are connected to a control unit, the control unit being set up to control the electrodes and the voltage source for generating the electrical fields.
  • a wall of the flow cell has a coating for the adhesion of cells. This has the advantage that cells separated by the flow cell can be temporarily immobilized and separated from the liquid phase.
  • the invention also relates to a method for separating cells with a microfluidic flow cell, the flow cell having electrodes for generating an electric field in the flow cell and the flow cell having rows of posts for local changes in an intensity of the electric field, at least one row of posts with respect to one
  • Flow cell is arranged inclined.
  • a sample is introduced into the flow cell, the sample comprising a first type of cells with a first crossover frequency and a second type of cells with a second crossover frequency.
  • the method uses an alternating electric field across the electrodes to separate the cells of the first type from cells of the second type, the frequency of the alternating field between the first crossover frequency and the second crossover frequency.
  • an electrostatic field for the electrophoretic transport of the cells through the flow cell is applied.
  • FIGS. 1 and 2 show an exemplary embodiment of the flow cell according to the invention
  • FIG. 3 is a flow diagram of an embodiment of the
  • FIGS 1 and 2 show an embodiment of the invention
  • Flow cell 100 for example for separating healthy cells and tumor cells.
  • FIG. 1 shows a schematic top view of the flow cell 100.
  • a buffer medium is fed into an interior 140 via an inlet 110 or an inlet 110 the flow cell that contains the cells to be separated.
  • the flow cell 100 further comprises an outlet 120 or outlet 120, from which the buffer medium can exit the flow cell 100 again.
  • the direction 130 from the inlet 110 to the outlet 120 is referred to below as the flow direction 130.
  • the flow direction 130 can in particular extend parallel to the walls 101, 102 of the flow cell 100.
  • the outlet can have, for example, two separate exits 121, 122 through which the separated cells can be removed from the flow cell 100 in a locally separated manner.
  • An electrode 115, 125 which generate a sinusoidal alternating field (AC) with a direct voltage offset (DC), is attached in each case near the inlet 110 or directly at the inlet 110 and near the outlet 120 or directly at the outlet 120.
  • the electrodes 115, 125 are preferably connected to a control unit, the control unit being set up to control the electrodes 115, 125 and a voltage source 126 connected to the electrodes 115, 125 for generating the electrical fields.
  • the cathode 115 is located at the inlet 110 and the anode 125 is located at the outlet 120.
  • the applied AC voltage can be varied depending on the crossover frequency, the frequency of the AC voltage being set between the frequencies of the healthy cells and the tumor cells. Both the healthy cells and the tumor cells migrate electrophoretically towards the anode 125 due to the DC offset, since they are negatively charged.
  • the healthy cells are preferably connected to a control unit, the control unit being set up to control the electrodes 115, 125 and a voltage source 126 connected
  • insulating posts 160 are periodically attached in a plurality of parallel rows 161, 162, the rows 161, 162 being inclined by an angle ⁇ with respect to the flow direction 130 from the inlet 110 of the flow cell 100 to the outlet 120.
  • the distance between the individual rows of posts 161, 162 is greater than the distance between the posts 160 of a single row 161, 162.
  • the alternating electrical field creates 160 local points with a higher field strength gradient in the spaces between the insulating posts. Cells with positive polarizability are attracted to these regions, while cells with negative polarizability are repelled by these regions. This causes the cells to be deflected from the flow direction and thus the separation.
  • the DC offset is preferably large enough that the electrophoretic component is stronger than the dielectrophoretic component of the electric field force on the cells so that the cells are not held on the posts 160.
  • the DC voltage offset can be dispensed with and the cells can be conveyed from the inlet 110 to the outlet 120, for example with a pump.
  • an area 300 coated for example, with fibronectin or collagen, preferably adhering to the cells, in particular in the form of a coating 300.
  • fibronectin or collagen preferably adhering to the cells, in particular in the form of a coating 300.
  • FIG. 2 shows an example of the separation of the cells using a positively polarizable cell (FIG. 2a) and a negatively polarizable cell (FIG. 2b).
  • the flow direction 130 is hereinafter referred to as the x direction and the direction transverse to the flow direction 130 as the y direction as indicated.
  • the cell 10 with positive polarizability first migrates in the flow direction 130, i.e. the x direction, to the first row of posts 161 by the electrophoresis caused by the direct voltage and is then dielectrophoretically into a region between posts 160 with a high level
  • FIG. 2a also shows that, as described above, the distance b between the individual rows of posts 161, 162 is greater than the distance c between the posts 160 of an individual row 161, 162. This has the effect that the in FIGS. 2a and 2b hatched areas between the posts represent the areas with the strongest local positive field strength.
  • the cell continues to move in the x direction by moving along the bottom of a post 163 of the first row of posts 160 in areas with a higher field strength gradient emotional. The sequence is repeated for the next row of posts 162. The cell is thus deflected further transversely to the flow direction 130 by each further row of posts and in each case passes through the row of posts between two posts.
  • FIG. 2b shows the same situation with the cell with negative polarizability: the cell 11 migrates in the x direction by electrophoresis and becomes
  • the inclination or inclination of the rows of posts 161, 162 with respect to the direction of flow 130 thus results in the spatial separation of the cells with positive polarizability from cells with negative polarizability.
  • the two different cell types can then be conveyed out of the flow cell 100 via two different exits 121, 122.
  • FIG. 3 shows a flow chart for an exemplary embodiment of the
  • the method 600 according to the invention is shown, the method 600 using, for example, the exemplary embodiment described above
  • Flow cell 100 can be carried out.
  • the sample is introduced into the flow cell 100, the sample comprising a first type of cells 10 with a first crossover frequency and a second type of cells 11 with a second crossover frequency.
  • an alternating electrical field is applied via the electrodes 115, 125 for separating the cells of the first type from cells of the second type, the frequency of the alternating field lying between the first crossover frequency and the second crossover frequency ,
  • the flow cell comprises insulating material, for example glass and / or one or more polymers, for example polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the interior 140 of the flow cell is coated with a material, for example adsorbed polymers such as silanes or parylenes, in order to reduce an undesired electroosmotic flow.
  • a material for example adsorbed polymers such as silanes or parylenes.
  • the width of the interior can vary, for example, from 100 to 1000 micrometers, the height of the interior can be, for example, between 5 to 10 micrometers.
  • the cells 10, 11 can, for example, with a buffer medium in the
  • Flow cell 100 can be introduced, for example with standardized
  • Culture medium such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), or as a direct blood sample.
  • the electrodes 115, 125 can be integrated into the flow cell 100 during manufacture or attached externally through contact holes.
  • they are platinum electrodes.
  • Posts 160 may preferably comprise electrically insulating material, such as polymers such as PDMS.
  • the posts can have different geometries, in particular the shape of cylinders with a round or oval cross section.
  • the posts 160 have a diameter between 10 and 30 micrometers and a height up to the height of the interior 140.
  • the distance c between posts in a row can be, for example, between 5 and 10 micrometers, and the distance b between two posts in two rows can be 10 to 20 micrometers ,
  • the second distance b is preferably at least twice as large as the first distance b.
  • the angle of inclination of the rows 161, 162 to the direction of flow can be between 5 and 30 degrees, for example.
  • the size, the geometry and the spacing of the posts 160 can be adapted, preferably after performing one
  • AC voltage at a frequency between 50 and 200 kilohertz can be used, preferably with a tunable frequency, so that, for example, the strength of the electric field is between 10,000 and 500,000 volts (V) per meter (m) in the flow cell 100, the posts 160
  • a field strength gradient between 10 L 10 and 10 L 16 V A 2 / m A 3 can cause, as described above, depending in particular on

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Flusszelle (100) und ein Verfahren (600) zur Separierung von Zellen (10, 11), wobei die Flusszelle (100) Elektroden (115, 125) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in der Flusszelle (100) aufweist und wobei die Flusszelle (100) Reihen (161, 162) von Pfosten (160) für lokale Änderungen einer Stärke des elektrischen Feldes aufweist, wobei mindestens eine Reihe (161, 162) von Pfosten (160) bezüglich einer Flussrichtung (130) von einem Eingang (110) der Flusszelle (100) zu einem Ausgang (120) der Flusszelle (100) geneigt angeordnet ist.

Description

Beschreibung
Titel
Mikrofluidische Flusszelle und Verfahren zur Separierung von Zellen
Stand der Technik
Als Liquid Biopsy wird die Analyse von flüssigen Proben zur Detektion von Krankheiten bezeichnet. Dadurch, dass nur eine flüssige Probe, meistens Blut, benötigt wird, wird dem Patienten eine Gewebebiopsie erspart. Im Falle von Krebsuntersuchungen möchte man frei zirkulierende Tumorzellen (CTCs, circulating tumor cells) direkt aus einer Blutprobe isolieren, um mittels geeigneter Nachweisverfahren, beispielsweise über den Nachweis mutierter Nukleinsäuren, klinisch relevante Informationen einer Krankheit zu bestimmen.
Dabei besteht Interesse an einer markerfreien, flexiblen Isolationsmethode. Ein Ansatz nutzt die unterschiedlichen dielektrophoretischen Eigenschaften von CTCs im Vergleich zu normalen Blutbestandteilen, um sie mit geeigneten elektrischen Feldern aus der Blutprobe zu isolieren. Die Polarisierbarkeit von Zellen ist abhängig von der Frequenz des angelegten elektrischen Wechselfelds und kann bei gewissen Frequenzen (sogenannter crossover frequency, im weiteren Crossover- Frequenzen) von positiv zu negativ springen. Gascoyne et al. IEEE Trans Ind Appl. 1997; 33(3): 670-678 haben gezeigt, dass Tumorzellen andere Crossover- Frequenzen als normale Blutzellen haben. Bei Wahl einer Frequenz zwischen diesen Frequenzen werden somit gesunde Zellen dielektrophoretisch zu Bereichen mit hohen Feldstärkegradienten angezogen (positive Dielektrophorese) und Krebszellen von hohen Feldstärkegradienten abgestoßen (negative Dielektrophorese). Dies kann man sich zur Separierung von Blutproben zunutze machen, wie beispielsweise in US 2016/0209299 A1 unter Verwendung einer mikrostrukturierten Elektrode beschrieben. Ein anderer Ansatz zur T rennung von Zellen basiert auf dem Prinzip des deterministic lateral displacement (DLD), beispielsweise beschrieben in WO 2016/136273 A1 als Realisierung in Form einer Flusszelle, welche eine Reihe von zueinander versetzten Pfosten aufweist und damit Zellen der Größe nach aufteilt, indem sie auf verschiedene Stromlinien geschoben werden.
Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung eine mikrofluidische Flusszelle zur Separierung von Zellen. Die Flusszelle umfasst Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in der Flusszelle sowie Reihen von Pfosten für lokale Änderungen einer Stärke des elektrischen Feldes. Mindestens eine Reihe von Pfosten ist dabei bezüglich einer Flussrichtung von einem Eingang der Flusszelle zu einem Ausgang der Flusszelle geneigt angeordnet.
Bei den Zellen kann es sich um biologische Zellen, insbesondere menschliche oder tierische Zellen handeln, beispielsweise um Zellen von Mikroorganismen, insbesondere Pathogene wie beispielsweise Bakterien. Unter Pfosten können insbesondere längliche Vorsprünge, beispielsweise säulenförmige Vorsprünge mit insbesondere runden oder abgerundeten oder auch eckigen Querschnitt verstanden werden, beispielsweise Säulen mit insbesondere zylindrischen Körper und kreisrundem Querschnitt. Unter der Flussrichtung kann insbesondere die Richtung verstanden werde, welche ein Fluid insbesondere bei Abwesenheit der Pfosten nehmen würde, das durch den Eingang in die Flusszelle eintritt und durch den Ausgang aus der Flusszelle wieder austritt. Dabei kann es sich insbesondere um die Richtung von Eingang zu Ausgang der Flusszelle entlang der kürzesten Strecke zwischen Eingang und Ausgang handeln. Unter einer geneigten Anordnung der Reihe von Pfosten bezüglich der Flussrichtung ist das Vorliegen eines Winkels zwischen der Flussrichtung und einer zweiten Richtung zu verstehen, wobei die Pfosten der Reihe entlang der zweiten Richtung angeordnet sind. Mit andere Worten ist eine die Pfosten der Reihe verbindende Strecke geneigt oder schräg gegenüber der Flussrichtung. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung liegt ein Neigungswinkel zwischen einer Reihe von Pfosten und der Flussrichtung zwischen 5 und 85 Grad, bevorzugt zwischen 10 und 80 Grad, ganz bevorzugt zwischen 15 und 75 Grad.
Die erfindungsgemäße Flusszelle hat den Vorteil, dass Zellen mit
unterschiedlichen Crossover- Frequenzen effektiv voneinander separiert werden können. Aufgrund der Anordnung der Pfosten wird das elektrische Feld lokal um die Pfosten derart abgeändert, dass die Zellen mit unterschiedlichen Crossover- Frequenzen vorteilhafterweise in unterschiedlichen Richtungen von der
Flussrichtung abgelenkt und somit separiert werden. Die Flusszelle kann vorteilhafterweise über die Einstellung des elektrischen Feldes für eine große Bandbreite unterschiedlicher Zellen verwendet werden, auch für die Trennung von Zellen, welche sich nur gering voneinander unterscheiden. Ferner ist von Vorteil, dass keine aufwändigen Elektrodenanordnungen, beispielsweise mikrostrukturierte Elektroden, für eine Separierung vorgesehen werden müssen. Außerdem kann vorteilhafterweise auf eine oft aufwändige und nicht sehr spezifische Markierung von Zellen zur Separierung verzichtet werden.
Vorzugsweise umfasst die Flusszelle zwei oder mehr Reihen von Pfosten, wobei die Reihen bezüglich der Flussrichtung geneigt angeordnet sind. Die geneigte Anordnung unterstützt vorteilhafterweise die Ablenkung der Zellen aus der Flussrichtung. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind mindestens zwei Reihen von Pfosten zueinander parallel angeordnet. Durch weitere Reihen von Pfosten wird die Separationswirkung der Flusszelle vorteilhafterweise erhöht.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist ein Abstand zwischen einer ersten Reihe von Pfosten und einer zweiten Reihe von Pfosten größer als ein Abstand zwischen den Pfosten der ersten Reihe ist. Dies bewirkt vorteilhafterweise, dass eine Stärke des elektrischen Feldes zwischen den Pfosten der ersten Reihe größer als eine Stärke des elektrischen Feldes zwischen einem Pfosten der ersten Reihe und einem Pfosten der zweiten Reihe ist.
Ganz bevorzugt sind die Pfosten einer oder mehrerer Reihen periodisch angeordnet. Darunter ist insbesondere zu verstehen, dass die Abstände zwischen den Pfosten gleich groß sind oder dass zumindest Unterschiede zwischen den Größen der Abstände bezüglich der Größe der Abstände vernachlässigbar sind. Die periodische Anordnung hat den Vorteil, dass die Zellen gleichförmig und somit effizient voneinander getrennt werden können. Vorzugsweise ist mindestens eine der Elektroden am Eingang und mindestens eine der Elektroden am Ausgang der Flusszelle angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass sich das durch die Elektroden erzeugte elektromagnetische Feld über den ganzen Bereich zwischen Eingang und Ausgang und insbesondere entlang oder parallel der Flussrichtung erstreckt.
Die Elektroden sind mit einer Spannungsquelle verbunden oder verbindbar, um insbesondere ein elektrostatisches Feld moduliert mit einem
elektromagnetischen Wechselfeld in der Flusszelle zu erzeugen. Durch das das elektrostatische Feld (auch Gleichspannungsoffset oder DC- Komponente bei Erzeugung durch eine Spannung genannt), kann vorteilhafterweise eine elektrophoretische Mobilität von Zellen zur Beförderung der Zellen durch die Flusszelle ausgenutzt werden. Damit kann vorteilhafterweise auf eine Pumpe zum Befördern der Zellen durch die Flusszelle verzichtet werden. In einer bevorzugten Weiterbildung sind die Elektroden mit einem Steuergerät verbunden, wobei das Steuergerät eingerichtet ist, die Elektroden und die Spannungsquelle für die Erzeugung der elektrischen Felder anzusteuern.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung weist eine Wand der Flusszelle eine Beschichtung zur Adhäsion von Zellen auf. Dies hat den Vorteil, dass durch die Flusszelle separierte Zellen vorübergehend immobilisiert und von der flüssigen Phase abgetrennt werden können.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Separierung von Zellen mit einer mikrofluidischen Flusszelle, wobei die Flusszelle Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in der Flusszelle aufweist und wobei die Flusszelle Reihen von Pfosten für lokale Änderungen einer Stärke des elektrischen Feldes aufweist, wobei mindestens eine Reihe von Pfosten bezüglich einer
Flussrichtung von einem Eingang der Flusszelle zu einem Ausgang der
Flusszelle geneigt angeordnet ist. In einem ersten Schritt des Verfahrens wird eine Probe in die Flusszelle eingebracht, wobei die Probe eine erste Art von Zellen mit einer ersten Crossover- Frequenz und eine zweite Art von Zellen mit einer zweiten Crossover- Frequenz umfasst. In einem zweiten Schritt des
Verfahrens wir ein elektrisches Wechselfeld über die Elektroden zur Separierung der Zellen der ersten Art von Zellen der zweiten Art angelegt, wobei die Frequenz des Wechselfeldes zwischen der ersten Crossover- Frequenz und der zweiten Crossover- Frequenz liegt.
In einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird zusätzlich zu dem elektrischen Wechselfeld ein elektrostatisches Feld zur elektrophoretischen Beförderung der Zellen durch die Flusszelle angelegt.
Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der vorteilhaften Weiterbildung wird auf die oben ausgeführten korrespondierenden Vorteile der erfindungsgemäßen Flusszelle verwiesen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen
Figuren 1 und 2ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Flusszelle und,
Figur 3 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des
erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsformen der Erfindung
Figuren 1 und 2 zeigen ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen
Flusszelle 100, beispielsweise zum Separieren von gesunden Zellen und Tumorzellen.
Figur 1 zeigt eine schematische Aufsicht auf die Flusszelle 100. Über einen Einlass 110 oder Eingang 110 wird ein Puffermedium in einen Innenraum 140 der Flusszelle eingegeben, das die zu separierenden Zellen enthält. Ferner umfasst die Flusszelle 100 einen Auslass 120 oder Ausgang 120, aus dem das Puffermedium wieder aus der Flusszelle 100 austreten kann. Die Richtung 130 vom Einlass 110 zum Auslass 120 wird im Weiteren als Flussrichtung 130 bezeichnet. Wie dargestellt, kann sich die Flussrichtung 130 insbesondere parallel zu den Wänden 101, 102, der Flusszelle 100 erstrecken. Wie in Figur 1 ferner dargestellt, kann der Auslass beispielsweise zwei separate Ausgänge 121, 122 aufweisen, durch welche die separierten Zellen örtlich getrennt aus der Flusszelle 100 entnommen werden können. Nahe des Einlasses 110 oder direkt am Einlass 110 sowie nahe des Auslasses 120 oder direkt am Auslass 120 ist jeweils eine Elektrode 115, 125 angebracht, die ein sinusoidales Wechselfeld (AC) mit einem Gleichspannungsoffset (DC) erzeugen. Bevorzugt sind die Elektroden 115, 125 mit einem Steuergerät verbunden, wobei das Steuergerät eingerichtet ist, die Elektroden 115, 125 und eine mit den Elektroden 115, 125 verbundene Spannungsquelle 126 für die Erzeugung der elektrischen Felder anzusteuern. Beispielsweise befindet sich am Einlass 110 die Kathode 115 und am Auslass 120 die Anode 125. Die applizierte Wechselspannung ist je nach Crossover- Frequenz variierbar, die Frequenz der Wechselspannung wird dabei zwischen den Frequenzen der gesunden Zellen und der Tumorzellen eingestellt. Sowohl die gesunden Zellen als auch die Tumorzellen migrieren aufgrund des Gleichspannungsoffsets elektrophoretisch in Richtung der Anode 125, da sie negativ geladen sind. Beispielsweise können die gesunden Zellen,
beispielsweise mononukleäre Blutzellen, eine Crossover- Frequenz von mehr als 120 Kilohertz aufweisen, während die Tumorzellen beispielsweise Crossover- Frequenzen zwischen 20 und 100 Kilohertz haben.
In einer Region 150 der Flusszelle befinden sich periodisch in mehreren parallelen Reihen 161, 162 angebrachte isolierende Pfosten 160, wobei die Reihen 161, 162 um einen Winkel a gegenüber der Flussrichtung 130 vom Einlass 110 der Flusszelle 100 zum Auslass 120 geneigt sind. Der Abstand zwischen den einzelnen Pfostenreihen 161, 162 ist größer als der Abstand zwischen den Pfosten 160 einer einzelnen Reihe 161, 162.
Das elektrische Wechselfeld erzeugt in der Region 150 in den Zwischenräumen der isolierenden Pfosten 160 lokale Stellen mit höherem Feldstärkegradienten. Zellen mit positiver Polarisierbarkeit werden von diesen Regionen angezogen, während Zellen mit negativer Polarisierbarkeit von diesen Regionen abgestoßen werden. Dies bewirkt die Ablenkung der Zellen von der Flussrichtung und somit die Separierung. Der Gleichspannungsoffset ist jedoch vorzugsweise derart groß, dass die elektrophoretische Komponente stärker als die dielektrophoretische Komponente der durch das elektrische Feld entstehenden Kraft auf die Zellen ist, damit die Zellen nicht an den Pfosten 160 festgehalten werden. Alternativ kann auf den Gleichspannungsoffset verzichtet werden und die Zellen beispielsweise mit einer Pumpe vom Einlass 110 zum Auslass 120 befördert werden.
Vorzugsweise befindet sich an der Wand 101 der Flusszelle 130, an der die Tumorzellen nach Passieren der Region 100 vorbeifließen, ein beispielsweise mit Fibronektin oder Kollagen beschichteter Bereich 300, an den Zellen bevorzugt adhärieren, insbesondere in Form einer Beschichtung 300. Nach dem Entfernen der gesunden Zellen aus der Flusszelle kann das elektrische Feld ausgeschaltet werden, die Tumorzellen adhärieren jedoch weiterhin und können beispielsweise mit einem Lysemedium aufgebrochen werden, um mit den vorhandene
Nukleinsäuren weitere Analysen durchzuführen.
In Figur 2 ist die Separierung der Zellen anhand einer positiv polarisierbaren Zelle (Figur 2a) und einer negativ polarisierbaren Zelle (Figur 2b) beispielhaft dargestellt. Die Flussrichtung 130 wird im Weiteren als x- Richtung und die Richtung quer zur Flussrichtung 130 als y-Richtung wie angezeigt bezeichnet. Wie in Figur 2a gezeigt, migriert die Zelle 10 mit positiver Polarisierbarkeit durch die aufgrund der Gleichspannung hervorgerufene Elektrophorese zunächst in Flussrichtung 130, also x-Richtung, zur ersten Pfostenreihe 161 und wird dann dielektrophoretisch in eine Region zwischen Pfosten 160 mit hohem
Feldstärkegradienten gezogen, also leicht quer gegen die Flussrichtung 130 in y- Richtung. In Figur 2a ist ferner gezeigt, dass, wie oben beschrieben, der Abstand b zwischen den einzelnen Pfostenreihen 161, 162 größer ist als der Abstand c zwischen den Pfosten 160 einer einzelnen Reihe 161, 162. Dies bewirkt, dass die in Figuren 2a und 2b schraffierten Bereiche zwischen den Pfosten die Bereiche mit stärkster lokaler positiver Feldstarke darstellen. Die Zelle bewegt sich in x-Richtung weiter, indem sie sich entlang der Unterseite eines Pfosten 163 der ersten Pfostenreihe 160 in Gegenden mit höherem Feldstärkegradienten bewegt. Bei der nächsten Pfostenreihe 162 wiederholt sich der Ablauf. Durch jede weitere Pfostenreihe wird die Zelle somit weiter quer zur Flussrichtung 130 abgelenkt und durchschreitet jeweils die Pfostenreihe zwischen zwei Pfosten.
Figur 2b zeigt die gleiche Situation mit der Zelle mit negativer Polarisierbarkeit: Die Zelle 11 migriert durch die Elektrophorese in x-Richtung und wird
dielektrophoretisch von Regionen (schraffierte Bereiche in Figur 2b) zwischen den Pfosten 160 mit hohen Feldstärkegradienten abgestoßen. Die Zelle 10 bewegt sich in x-Richtung weiter, diesmal indem sie sich entlang der Oberseite des Pfostens 164 in Gegenden mit niedrigeren Feldstärkegradienten bewegt. Bei der nächsten Pfostenreihe 161 geschieht dasselbe. Im Gegensatz zur oben beschriebenen Zelle 10 mit positiver Polarisierbarkeit bewegt sich die Zelle 11 mit negativer Polarisierbarkeit zwischen den Reihen der Pfosten 161, 162, ohne eine Reihe zu durchqueren.
Die Neigung oder Schrägstellung der Pfostenreihen 161, 162 gegenüber der Flussrichtung 130 bewirkt somit die räumliche Trennung der Zellen mit positiver Polarisierbarkeit von Zellen mit negativer Polarisierbarkeit.
Wie oben beschrieben, können die beiden unterschiedlichen Zelltypen anschließend über zwei verschiedene Ausgänge 121, 122 aus der Flusszelle 100 hinausbefördert werden.
In Figur 3 ist ein Ablaufdiagramm zu einem Ausführungsbeispiel des
erfindungsgemäßen Verfahrens 600 dargestellt, wobei das Verfahren 600 beispielsweise mit dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel der
erfindungsgemäßen Flusszelle 100 durchgeführt werden kann. In einem ersten Schritt 601 des Verfahrens 600 wird die Probe in die Flusszelle 100 eingebracht, wobei die Probe eine erste Art von Zellen 10 mit einer ersten Crossover- Frequenz und eine zweite Art von Zellen 11 mit einer zweiten Crossover- Frequenz umfasst. In einem zweiten Schritt 602 des Verfahrens 600 wird ein elektrisches Wechselfeld über die Elektroden 115, 125 zur Separierung der Zellen der ersten Art von Zellen der zweiten Art angelegt, wobei die Frequenz des Wechselfeldes zwischen der ersten Crossover- Frequenz und der zweiten Crossover- Frequenz liegt. Die Flusszelle umfasst isolierendes Material, beispielsweise Glas und/oder ein oder mehrere Polymere, beispielsweise Polydimethylsiloxan (PDMS).
Idealerweise ist der Innenraum 140 der Flusszelle mit einem Material, beispielsweise adsorbierte Polymere wie Silane oder Parylene, beschichtet, um einen unerwünschten elektroosmotischen Fluss zu verringern. Die Breite des Innenraums kann beispielsweise von 100 bis 1000 Mikrometer variieren, die Höhe des Innenraums kann beispielsweise zwischen 5 bislO Mikrometer betragen.
Die Zellen 10, 11, können beispielsweise mit einem Puffermedium in die
Flusszelle 100 eingebracht werden, beispielsweise mit standardisiertem
Nährmedium wie DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), oder auch als direkte Blutprobe.
Die Elektroden 115, 125 können bei der Herstellung in die Flusszelle 100 integriert oder extern durch Kontaktierungslöcher angebracht werden.
Beispielsweise handelt es sich um Platinelektroden.
Die Pfosten 160 können vorzugsweise elektrisch isolierendes Material umfassen, beispielsweise Polymere wie PDMS. Wie oben beschrieben, können die Pfosten unterschiedliche Geometrien aufweisen, insbesondere die Form von Zylindern mit rundem oder ovalem Querschnitt. Beispielsweise haben die Pfosten 160 einen Durchmesser zwischen 10 und 30 Mikrometer und eine Höhe bis zur Höhe des Innenraums 140. Der Abstand c zwischen Pfosten einer Reihe kann beispielsweise zwischen 5 und 10 Mikrometer, der Abstand b zwischen zwei Pfosten zweier Reihen 10 bis 20 Mikrometer betragen. Vorzugsweise ist der zweitgenannte Abstand b mindestens doppelt so groß wie der erstgenannte Abstand b. Der Neigungswinkel der Reihen 161, 162 zur Flussrichtung kann beispielsweise zwischen 5 und 30 Grad betragen. Abhängig von den zu trennenden Zellen können die Größe, die Geometrie und die Abstände der Pfosten 160 angepasst werden, vorzugsweise nach Durchführung einer
Computersimulation. Eine Spannungsquelle mit 12 Volt Gleichspannung, 200 bis 500 Volt
Wechselspannung bei einer Frequenz zwischen 50 und 200 Kilohertz kann verwendet werden, vorzugsweise mit durchstimmbarer Frequenz, so dass sich beispielsweise eine Stärke des elektrischen Feldes zwischen 10000 und 500000 Volt (V) pro Meter (m) in der Flusszelle 100 ergibt, wobei die Pfosten 160 beispielsweise eine Feldestärkegradienten zwischen 10L10 und 10L16 VA2 / mA3 hervorrufen können, wie oben beschrieben abhängig insbesondere von
Geometrien, Anordnungen, Material oder Ausformungen der Pfosten 160.

Claims

Ansprüche
1. Mikrofluidische Flusszelle (100) zur Separierung von Zellen (10, 11), wobei die
Flusszelle (100) Elektroden (115, 125) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in der Flusszelle (100) aufweist und wobei die Flusszelle (100) Reihen (161, 162) von Pfosten (160) für lokale Änderungen einer Stärke des elektrischen Feldes aufweist, wobei mindestens eine Reihe (161, 162) von Pfosten (160) bezüglich einer
Flussrichtung (130) von einem Eingang (110) der Flusszelle (100) zu einem Ausgang (120) der Flusszelle (100) geneigt angeordnet ist.
2. Mikrofluidische Flusszelle (100) nach Anspruch 1, wobei ein Abstand (b) zwischen einer ersten Reihe (161) von Pfosten (160) und einer zweiten Reihe (162) von Pfosten (160) größer als ein Abstand (c) zwischen den Pfosten (160) der ersten Reihe (161) ist.
3. Mikrofluidische Flusszelle (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens zwei Reihen (161, 162) von Pfosten (160) zueinander parallel angeordnet sind
4. Mikrofluidische Flusszelle (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reihen (161, 162) periodisch angeordnete Pfosten (160) aufweisen
5. Mikrofluidische Flusszelle (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Neigungswinkel (a) zwischen einer Reihe (161, 162) von Pfosten (160) und der Flussrichtung (130) zwischen 5 und 85 Grad, bevorzugt zwischen 10 und 80 Grad, ganz bevorzugt zwischen 15 und 75 Grad liegt.
6. Mikrofluidische Flusszelle (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eine der Elektroden (115) an einem Eingang (110) und mindestens eine der Elektroden (125) an einem Ausgang (120) der Flusszelle (100) angeordnet ist.
7. Mikrofluidische Flusszelle (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektroden (115, 125) mit einer Spannungsquelle (126) zur Erzeugung eines elektrostatischen Feldes moduliert mit einem elektromagnetischen Wechselfeld in der Flusszelle (100) verbunden sind.
8. Mikrofluidische Flusszelle (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Wand (101) der Flusszelle (100) eine Beschichtung (300) zur Adhäsion von Zellen aufweist
9. Verfahren (600) zur Separierung von Zellen (10, 11) mit einer mikrofluidischen
Flusszelle (100), wobei die Flusszelle (100) Elektroden (115, 125) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in der Flusszelle (100) aufweist und wobei die Flusszelle (100) Reihen (161, 162) von Pfosten (160) für lokale Änderungen einer Stärke des elektrischen Feldes aufweist, wobei mindestens eine Reihe (161, 162) von Pfosten (160) bezüglich einer Flussrichtung (130) von einem Eingang (110) der Flusszelle (100) zu einem Ausgang (120) der Flusszelle (100) geneigt angeordnet ist, umfassend die Schritte:
• Einbringen (601) einer Probe in die Flusszelle (100), wobei die Probe eine erste Art von Zellen (10) mit einer ersten Crossover- Frequenz und eine zweite Art von Zellen (11) mit einer zweiten Crossover- Frequenz umfasst.
• Anlegen (602) eines elektrischen Wechselfeldes über die Elektroden (115, 125) zur Separierung der Zellen (10) der ersten Art von Zellen (11) der zweiten Art, wobei die Frequenz des Wechselfeldes zwischen der ersten Crossover- Frequenz und der zweiten Crossover- Frequenz liegt.
10. Verfahren (600) nach Anspruch 9, wobei zusätzlich zu dem elektrischen Wechselfeld ein elektrostatisches Feld zur elektrophoretischen Beförderung der Zellen (10, 11) durch die Flusszelle (100) angelegt wird.
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