WO2019231288A1 - 마이크로rna의 비정규 표적을 억제하는 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도 - Google Patents

마이크로rna의 비정규 표적을 억제하는 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도 Download PDF

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지성욱
장은숙
석희영
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Definitions

  • the present invention relates to RNA interference inducing nucleic acids and their use which inhibit gene expression, and to interference interference nucleic acids and the use thereof having useful effects exerted by selectively inhibiting an irregular target of a microRNA.
  • Korean Patent Application No. 10-2018-0063054 filed May 31, 2018, and Korean Patent Application No. 10-2018-0063055, filed May 31, 2018, on May 31, 2019.
  • Korean Patent Application No. 10-2019-0064333 filed May 31, 2019 Korean Patent Application No. 10-2019-0064334, filed May 31, 2019 Korean Patent Application No. 10-2019- filed May 31, 2019 Claim priority based on 0064335, and Korean Patent Application No. 10-2019-0064386, filed May 31, 2019, all the contents disclosed in the specification and drawings of the application are incorporated in this application.
  • RNA interference refers to a phenomenon of inhibiting the expression of genes in the post-transcriptional stage.
  • Naturally occurring RNA interference is caused by microRNA (miRNA).
  • miRNA microRNA
  • a microRNA consists of 18-25 bases, most of which are small RNAs consisting of about 21 bases, which are complementary to the messenger RNAs (mRNAs) of the genes targeted by the Argonaute protein. Do an array.
  • mRNAs messenger RNAs
  • mRNAs messenger RNAs
  • RNA interference material siRNA or shRNA
  • siRNA or shRNA RNA interference material containing the starting region of the microRNA
  • it can be used as a cure for disease.
  • complementary nucleotide sequences in the microRNA initiation region that are mediated by agon nuts to recognize the target messenger RNA are important for the function of the RNA interference material, including the microRNA.
  • RNA interference material it is required to understand the function of each microRNA, and the function of the microRNA is determined by which target genes are inhibited. Sieve analysis is needed.
  • the Ago HITS CLIP test method involves irradiating UV light to a cell or tissue sample to form a covalent complex between RNA and an argonaute protein (Ago) in a cell, and the RNA-agon nut complex is agonot specific. After separation by immunoprecipitation using an anti-recognition antibody, the isolated RNA is analyzed by next-generation sequencing. Through this, it is possible to accurately analyze the microRNA bound to the agonut, the target messenger RNA group complementary nucleotide sequence and its position (Chi S et al, Nature, 2009, 460 (7254): 479-86).
  • the inventors have found that when a microRNA binds to a target messenger RNA, it may bind even if it is not exactly complementary to the microRNA seed region. More specifically, the microRNA seed region defined by the 1st to 8th base sequences based on the 5 'end of the microRNA binds to the messenger RNA in an array of at least 6 consecutive and complete base sequences, in particular Most importantly, binding to the 2nd to 7th nucleotide sequences on the 5 'end is called canonical target recognition, and deviates from the above rule, and is continuous with the microRNA seed region. Recognition and binding to targets of microRNAs, even if they are not exact complementary sequences, are referred to as non-canonical target recognition. The results of the Ago HITS-CLIP analysis show that the frequency of microRNA recognition of targets irregularly through the initiation region is about 50% of the frequency of regular recognition.
  • RNA interference material eg, siRNA or shRNA
  • siRNA or shRNA designed to include the sequence of the origin of existing microRNAs exhibits biological function by inhibiting several non-regular target genes as well as regular target genes.
  • the problem to be solved by the present invention is to solve the limitations of the RNA interference material designed to include the sequence of the origin of the existing microRNA as it is and to increase the efficiency.
  • the RNA interference material designed to include the sequence of the origin of the existing microRNA intact inhibits both the regular target gene and the non-regular target gene, while strongly inhibiting the regular target gene but very weak the non-regular target gene. Suppress Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to efficiently increase the biological function of the existing microRNA by suppressing the non-regular target gene, or to suppress some of the functions represented by the existing microRNA, that is, by suppressing the non-regular target gene. To provide an RNA interference inducing nucleic acid having the effect of selectively displaying only biological function.
  • the present invention provides an RNA interference-inducing nucleic acid that is modified some of the sequence of a particular microRNA to suppress the noncanonical target gene of the microRNA.
  • nucleic acid in one or more single strands of a nucleic acid inducing RNA interference, some sequences of specific microRNAs are modified to induce RNA interference to suppress noncanonical target genes of the microRNAs.
  • nucleic acid As nucleic acid,
  • the RNA interference-inducing nucleic acid is the second to fifth base from the 5 'end, based on the second to seventh base sequence based on the 5' end, which is the most important site for binding to the target messenger RNA in a specific microRNA.
  • the 4th base and the 6th and 7th bases are the same, and the 6th and 7th bases have a base sequence complementary to the base which can arrange with the 6th base of a specific microRNA, and the said specific microRNA Bases that can be aligned with the 6th base of the include all complementary bases, including the G: A and G: U wobble arrays, resulting in a bulge in the target gene between the 5th and 6th microRNAs.
  • A) occurs in the irregular target nucleotide sequence to which it binds, and the ridge disappears and binds to the sequential nucleotide sequence, or
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a guanine base as uracil in the base sequence between the 5 'end and the 9th base of a specific microRNA, preferably in the 2nd to 7th sequences based on the 5' end. Characterized by having a modified base sequence substituted with at least one adenine (Adenine), such that the G: A or G: U wobble sequence of the site is a regular base sequence of U: A or A: U, Provide RNA interference inducing nucleic acid.
  • the specific microRNA is selected from the group consisting of miR-124, miR-155, miR-122, miR-1, let-7, miR-133, miR-302 and miR-372 has the same sequence And it provides an RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that consisting of 18-24 bases.
  • the RNA interference inducing nucleic acid provides an RNA interference inducing nucleic acid, characterized in that the 5 'terminal 2 to 7 base sequence is any one or more of the following:
  • RNA interference-inducing nucleic acid (miR-124-BS) (SEQ ID NO: 1), which exhibits the base sequence of 5'-AA GGC C-3 'as an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124;
  • RNA interference-inducing nucleic acid (miR-122-BS) (SEQ ID NO: 2), which exhibits the base sequence of 5'-GG AGU U-3 'as an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-122;
  • RNA interference-inducing nucleic acid (miR-155-BS) (SEQ ID NO: 3), which exhibits the base sequence of 5'-UA AUG G-3 'as an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-155; or
  • RNA interference-inducing nucleic acid (miR-1-BS) (SEQ ID NO: 4), which shows the base sequence of 5'-GG AAU U-3 'as an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-1.
  • an RNA interference-inducing nucleic acid is provided, characterized in that the base sequence of the RNA interference-inducing nucleic acid is represented by any one or more of the following:
  • RNA interference-inducing nucleic acid (miR-124-BS) (SEQ ID NO: 5) which shows the nucleotide sequence of 5'-UAA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3 'as an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124;
  • RNA interference-inducing nucleic acids (miR-122-BS) (SEQ ID NO: 6) which show the base sequence of 5'-UGG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3 'as an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-122;
  • RNA interference-inducing nucleic acid (miR-155-BS) (SEQ ID NO: 7) which shows the nucleotide sequence of 5'-UUA AUG GCU AAU CGU GAU AGG-3 'as an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-155; or
  • RNA interference inducing nucleic acid showing the nucleotide sequence of 5'-UGG AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3 'as an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-1 (SEQ ID NO: 8).
  • the RNA interference inducing nucleic acid provides an RNA interference inducing nucleic acid, characterized in that the base sequence between the 5 'end and the ninth base is any one or more of the following:
  • RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124, preferably a modified base sequence in which at least one guanine base is substituted with uracil in the second to seventh sequences based on the 5 'end.
  • 5'-UAA UGC ACG-3 '(miR-124-G4U) SEQ ID NO: 9
  • 5'-UAA GUC ACG-3' miR-124-G5U
  • 5'- RNA interference inducing nucleic acids comprising the nucleotide sequence of UAA UUC ACG-3 '(miR-124-G4,5U) (SEQ ID NO: 11);
  • RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-1, preferably a modified base sequence in which at least one guanine base is substituted with uracil in the second to seventh sequences based on the 5 'end.
  • RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-133, preferably a modified base sequence in which at least one guanine base is substituted with uracil in the second to seventh sequences based on the 5 'end.
  • RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-302a, preferably a modified base sequence in which at least one guanine base is substituted with uracil in the second to seventh sequences of the 5 'terminal 5'-UAA UUG CUU-3 '(miR-302a-G4U) (SEQ ID NO: 47), 5'-UAA GUU CUU-3' (miR-302a-G6U) (SEQ ID NO: 48), or 5 ' RNA interference inducing nucleic acids comprising the nucleotide sequence of -UAA UUU CUU-3 '(miR-302a-G4,6U) (SEQ ID NO: 49); or
  • RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-372 is preferably a modified base sequence in which at least one guanine base is substituted with uracil in the second to seventh sequences of the 5 'terminal.
  • an RNA interference-inducing nucleic acid is provided, characterized in that the base sequence of the RNA interference-inducing nucleic acid is represented by any one or more of the following:
  • RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-122 as 5'-UUG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 '(miR-122-G2U) (SEQ ID NO: 66), 5'-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3U) (SEQ ID NO: 67), 5'-UGG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 '(miR-122-G5U) (SEQ ID NO: 68), 5'-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3 '(miR-122-G7U) (SEQ ID NO: 69), 5'-UGG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G9U) (SEQ ID NO: 70), 5 '-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR
  • RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits the irregular target gene of let-7 as 5'-UUA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3 '(let-7-G2U) (SEQ ID NO: 84), 5'-UGA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3 '(let-7-G4U) (SEQ ID NO: 85), 5'-UGA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G5U) (SEQ ID NO: 86), 5'-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3 '(let-7-G8U) (SEQ ID NO: 87), 5'-UUA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,4U) (SEQ ID NO: 88 ), 5'-UUA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3 '(let-7-G2,5U) (SEQ ID NO: 89), 5
  • RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-302a as 5'-UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3 '(miR-302a-G4U) (SEQ ID NO: 94), 5'-UAA GUU CUA CCA UGU Base of UUU GGU GA-3 '(miR-302a-G6U) (SEQ ID NO: 95), or 5'-UAA UUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G4,6U) (SEQ ID NO: 96) RNA interference inducing nucleic acids representing sequences; or
  • RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits the non-regular target gene of miR-372 as 5'-AAA UUG CUG CGA CAU UUG AGC GU-3 '(miR-372-G4U) (SEQ ID NO: 97), 5'-AAA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3 '(miR-372-G6U) (SEQ ID NO: 98), 5'-AAA GUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G9U) (SEQ ID NO: 99), 5'-AAA UUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3 '(miR-372-G4,6U) (SEQ ID NO: 100), 5'-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,9U) (SEQ ID NO: No. 101), or an RNA interference inducing nu
  • composition for inhibiting the expression of the irregular target gene of the microRNA comprising the RNA interference induction nucleic acid of the present invention.
  • RNA interference inducing nucleic acid of the present invention comprising administering to a subject a composition comprising an RNA interference inducing nucleic acid of the present invention.
  • RNA interference inducing nucleic acids of the present invention to inhibit non-normal target gene expression of microRNAs.
  • RNA interference induction nucleic acid of the present invention It provides a cell cycle, differentiation, dedifferentiation, morphology, migration, dedifferentiation, division, proliferation or death control composition comprising the RNA interference induction nucleic acid of the present invention.
  • RNA interference inducing nucleic acid of the invention comprising administering to a subject a composition comprising an RNA interference inducing nucleic acid of the invention.
  • RNA interference inducing nucleic acids of the invention for cell cycle, differentiation, dedifferentiation, morphology, migration, division, proliferation or death control.
  • the composition provides a composition, characterized in that one or more of the following:
  • composition for inducing cancer cell death comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124;
  • composition for inducing neurites branching differentiation comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124;
  • composition for inducing cell cycle arrest of liver cancer cells comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-122;
  • composition for promoting myocyte differentiation or promoting muscle fibrosis including an RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-1;
  • composition for inducing myocyte death including an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-155;
  • composition for promoting cell death of neuroblastoma including RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124;
  • composition for promoting cell division proliferation of neuroblastoma including an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124;
  • composition for inducing myocardial hypertrophy comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-1;
  • composition for inducing myocardial hypertrophy comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-133;
  • composition for inducing cell cycle arrest of cancer cells including an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of let-7;
  • composition for inducing cell cycle progression activity of hepatocytes comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of let-7;
  • composition for promoting reverse differentiation comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-302a;
  • composition for promoting reverse differentiation comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-372; or
  • a composition for inhibiting cell migration of liver cancer cells comprising an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-122.
  • the present invention provides a noncanonical target gene of a microRNA by modifying some sequences of a specific microRNA in at least one single strand of a double strand of nucleic acid inducing RNA interference, comprising the following steps: There is provided a method for preparing an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits the expression of:
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and the base which can be arranged with the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences, and Constructing an RNA interference-inducing nucleic acid such that the bulge disappears and binds in a sequential nucleotide sequence in a non-normal target nucleotide sequence in which a bulge occurs in the target gene and binds between the fifth and sixth nucleotides, or
  • the guanine base in the base sequence between the 5 'end and the ninth base of a specific microRNA has a modified base sequence substituted with at least one of uracil, and thus G: A or G: U of the site. Constructing an RNA interference inducing nucleic acid such that the wobble sequence is a regular base sequence of U: A or A: U.
  • the present invention also provides a method for screening a test substance for controlling cell cycle, differentiation, reverse differentiation, morphology, migration, division, proliferation, reverse differentiation or death, comprising the following steps:
  • the present invention provides the following 1-3 for RNA interference inducing nucleic acid:
  • nucleic acid in one or more single strands of a nucleic acid inducing RNA interference, some sequences of specific microRNAs are modified to induce RNA interference to suppress noncanonical target genes of the microRNAs.
  • nucleic acid As nucleic acid,
  • the RNA interference-inducing nucleic acid comprises four to five base sequences from the 5 'end of a particular microRNA, the sixth and seventh bases are identical, and the sixth and seventh bases are the sixth of a particular microRNA.
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and a base sequenceable to the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences It is characterized in that the non-normal target nucleotide sequence that the bulge (binge) occurs in the target gene between the 5th and 6th of the microRNA, and the ridge disappears and binds in a continuous nucleotide sequence,
  • the specific microRNA provides an RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that a methyl group (2'OMe) is added at the 2 'position of the ribosil ring of the 6th nucleotide from the 5' end.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid provides an RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that it suppresses only the expression of the regular starting target gene of the RNA interference-inducing nucleic acid.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid provides RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that it specifically inhibits only the irregular nuclear ridge site of a specific microRNA, and eliminates the newly generated irregular nuclear ridge site.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting the expression of irregular target genes of microRNAs, including RNA interference-inducing nucleic acids.
  • the present invention also provides a method for inhibiting the expression of a non-normal target gene of a microRNA, comprising administering to a subject a composition comprising an RNA interference inducing nucleic acid.
  • the present invention also provides the use of RNA interference inducing nucleic acids to inhibit non-normal target gene expression of microRNAs.
  • the present invention provides a non-canonical target gene (noncanonical) of the microRNA in one or more of the double strands of the nucleic acid inducing RNA interference, comprising the following steps, wherein some sequence of the specific microRNA is modified
  • a method of producing an RNA interference inducing nucleic acid to suppress the expression of a target gene
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and the base which can be arranged with the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences, and Constructing RNA interference-inducing nucleic acids such that the bumps disappear from the irregular target nucleotide sequences to which the target genes bind with the fifth and sixth nucleotides, and the nucleotides bind to the consecutive nucleotide sequences; And
  • RNA interference-inducing nucleic acid comprising the step of adding a methyl group (2'OMe) in the 2 'position of the ribosil ring of the sixth nucleotide from the 5' end of the specific microRNA.
  • nucleic acid in one or more single strands of a nucleic acid inducing RNA interference, some sequences of specific microRNAs are modified to induce RNA interference to suppress noncanonical target genes of the microRNAs.
  • nucleic acid As nucleic acid,
  • the RNA interference-inducing nucleic acid comprises four to five base sequences from the 5 'end of a particular microRNA, the sixth and seventh bases are identical, and the sixth and seventh bases are the sixth of a particular microRNA.
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and a base sequenceable to the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences Inducing RNA interference, characterized in that the ridge disappears and binds in a contiguous nucleotide sequence in an irregular target nucleotide sequence in which a bulge occurs in the target gene between the fifth and sixth ends of the microRNA.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid provides RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that it selectively inhibits only the canonical nucleus target site and not the regular target gene of the microRNA.
  • the specific microRNA is let-7 / 98/4458/4500, miR-125a-5p / 125b-5p / 351/670/4319, miR-124 / 124ab / 506, miR-9 / 9ab, miR- 29abcd, miR-103a / 107 / 107ab, miR-221 / 222 / 222ab / 1928, miR-26ab / 1297/4465, miR-15abc / 16 / 16abc / 195/322/424/497/1907, miR-126- 3p, miR-30abcdef / 30abe-5p / 384-5p, miR-33ab / 33-5p, miR-34ac / 34bc-5p / 449abc / 449c-5p, miR-19ab, miR-99ab / 100, miR-17 / 17-5p / 20ab / 20b
  • the RNA interference-inducing nucleic acid provides an RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that it comprises a nucleotide sequence represented by any one or more of SEQ ID NO: 103 to 528 (see Table 3).
  • the present invention also provides a composition for inhibiting the expression of irregular target genes of microRNAs, including RNA interference-inducing nucleic acids.
  • the present invention also provides a method for inhibiting the expression of a non-normal target gene of a microRNA, comprising administering to a subject a composition comprising an RNA interference inducing nucleic acid.
  • the present invention also provides the use of RNA interference inducing nucleic acids to inhibit non-normal target gene expression of microRNAs.
  • the present invention provides a non-canonical target gene (noncanonical) of the microRNA in one or more of the double strands of the nucleic acid inducing RNA interference, comprising the following steps, wherein some sequence of the specific microRNA is modified
  • a method of producing an RNA interference inducing nucleic acid to suppress the expression of a target gene
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and the base which can be arranged with the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences, and And constructing an RNA interference-inducing nucleic acid such that the bump disappears from the irregular target nucleotide sequence to which the bulge occurs in the target gene and binds to the sequential nucleotide sequence between the fifth and sixth. It provides a method for producing an RNA interference induction nucleic acid.
  • nucleic acid in one or more single strands of a nucleic acid inducing RNA interference, some sequences of specific microRNAs are modified to induce RNA interference to suppress noncanonical target genes of the microRNAs.
  • nucleic acid As nucleic acid,
  • the RNA interference inducing nucleic acid has a modified base sequence in which at least one guanine base is substituted with an uracil base in a base sequence between the second and ninth bases from the 5 'end of a specific microRNA, and the corresponding Provided is an RNA interference inducing nucleic acid, characterized in that the G: A wobble of the site is a regular base sequence of U: A.
  • the RNA interference inducing nucleic acid comprises 6 to 8 consecutive base sequences starting at the second base from the 5 'end of the particular microRNA,
  • the base sequence provides an RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that at least one guanine base is substituted with an uracil base.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid selectively inhibits only the irregular target gene of the microRNA that binds in the G: A wobble array, but does not inhibit the regular target gene of the microRNA.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid selectively inhibits only the irregular target gene of the microRNA that binds in the G: A wobble array, but does not inhibit the regular target gene of the microRNA.
  • the specific microRNA is hsa-miR-1-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-15b-3p, hsa-miR-200c-5p, hsa- miR-214-5p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-145-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-423-3p, hsa-miR-873-3p, hsa-miR- 122-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-409-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-144- 5p, hsa-miR-379-5p, hsa-
  • Bases have a modified base sequence substituted with at least one uracil (Uracil), so that the G: A wobble sequence of the site is composed of 6-24 bases while being a regular base sequence of U: A An RNA interference induction nucleic acid is provided.
  • Uracil uracil
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has 6-8 consecutive base sequences SEQ ID NOs: 529-863 (starting at the second base from the 5 'end to the seventh or starting at the second base to the ninth).
  • An RNA interference-inducing nucleic acid is provided, which is represented by any one or more of 4).
  • the present invention provides a composition for inhibiting the expression of the irregular target gene of the microRNA containing the RNA interference-inducing nucleic acid.
  • the present invention also provides a method for inhibiting the expression of a non-normal target gene of a microRNA, comprising administering to a subject a composition comprising an RNA interference inducing nucleic acid.
  • the present invention also provides the use of RNA interference inducing nucleic acids to inhibit non-normal target gene expression of microRNAs.
  • the present invention provides a non-canonical target gene (noncanonical) of the microRNA in one or more of the double strands of the nucleic acid inducing RNA interference, comprising the following steps, wherein some sequence of the specific microRNA is modified
  • a method of producing an RNA interference inducing nucleic acid to suppress the expression of a target gene
  • RNA interference such that the guanine base of the six to eight consecutive base sequences, starting at the second base from the 5 'end of the particular microRNA, has a modified base sequence substituted with at least one or more uracil bases It provides a method for producing an RNA interference induced nucleic acid, characterized in that it comprises the step of constructing a derived nucleic acid.
  • the microRNA When a microRNA binds to a target messenger RNA, the microRNA may be recognized as a target of the microRNA and bind to the messenger RNA, even if it is not exactly complementary to the microRNA seed region, and thus a non-canonical target. recognition).
  • the present inventors have focused on the recognition of non-normal targets of such microRNAs, and have completed the present invention by developing RNA interference-inducing nucleic acids that selectively inhibit the non-regular target genes of the microRNAs by modifying some sequences of the microRNAs and revealing their efficacy. .
  • the present invention relates to RNA in which at least one of the double strands of a nucleic acid inducing RNA interference is modified, in which some sequences of a particular microRNA are modified to suppress only the expression of a noncanonical target gene of the microRNA.
  • interference-inducing nucleic acid As interference-inducing nucleic acid,
  • the RNA interference-inducing nucleic acid comprises four to five base sequences from the 5 'end of a particular microRNA, the sixth and seventh bases are identical, and the sixth and seventh bases are the sixth of a particular microRNA.
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and a base sequenceable to the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences Wherein the bumps disappear from the irregular target nucleotide sequence in which a bulge occurs in the target gene between the fifth and the sixth nucleotides of the microRNA and binds to the sequential nucleotide sequence, or
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a guanine base as uracil in the base sequence between the 5 'end and the 9th base of a specific microRNA, preferably in the 2nd to 7th sequences based on the 5' end. Characterized by having a modified base sequence substituted with at least one adenine (Adenine), such that the G: A or G: U wobble sequence of the site is a regular base sequence of U: A or A: U, Provide RNA interference inducing nucleic acid.
  • RNA interference inducing nucleic acid is a single strand of one or more of the double strands of nucleic acid inducing RNA interference, preferably microRNA, small hairpin RNA (shRNA) and small interfering RNA (small interfering RNA, siRNA), DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, asiRNA, piRNA, or endo-siRNA.
  • RNA interference preferably microRNA, small hairpin RNA (shRNA) and small interfering RNA (small interfering RNA, siRNA), DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, asiRNA, piRNA, or endo-siRNA.
  • RNA interference inducing nucleic acids according to the invention are based on two non-canonical target recognition of microRNAs.
  • microRNAs recognize not only regular target genes but also irregular target genes. Irregular target genes recognized by the microRNA do not have a complementary relationship that exactly matches the microRNA.
  • One aspect of an irregular target gene recognized by a microRNA and an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits the irregular target gene is as follows.
  • the recognition class of one of the non-normal target genes to which the microRNA binds has a continuous complementary relationship with all the bases from the 5 'end of the microRNA to the fifth.
  • a gene recognized by the 6th base at the 5 'end of the microRNA (arranged with the 6th base at the 5' end of the microRNA) has a base complementary to the 5th base at the 5 'end of the microRNA.
  • contiguous bases, rather than contiguous bases, are pushed out in the shape of a ridge, and then the base complementary to the microRNA is the base recognized by the sixth base at the 5 'end of the microRNA.
  • An RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene recognized by the microRNA of the above aspect comprises four base sequences from the 5 'end to the fifth to the fifth of the specific microRNA.
  • two bases consecutive to the four base sequences are identical to each other, and the two base sequences have a base sequence complementary to a base that can be arranged with the sixth base of a specific microRNA, Bases that can be aligned with the sixth base include all complementary bases, including G: A and G: U wobble configurations.
  • RNA interference-inducing nucleic acids that inhibit the non-canonical target genes recognized by this particular microRNA, as compared with the base sequence of the microRNA, share at least four base sequences from 2 'to 5' from the 5 'end of the particular microRNA. Include as.
  • the 6th base and the 7th base sequence from the 5 'end of the RNA interference induction nucleic acid may be identical, and these two base sequences are complementary to bases that can be arranged with the 6th base of a specific microRNA.
  • bases that can be arranged with the sixth base of the particular microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble configurations.
  • the sixth base of a specific microRNA a base that can be arranged with the sixth base: a base complementary to the base that can be arranged with the sixth base is (A: U, G: A, C), (G : A, U, C: U, A, G), (U: G, A: C, U) or (C: G: C).
  • the sixth and seventh base sequences from the 5 'end of the RNA interference inducing nucleic acid may be AA, CA;
  • the sixth base of a particular microRNA is G
  • the sixth and seventh base sequences from the 5 'end of the RNA interference inducing nucleic acid may be UG, AG or GG;
  • the sixth base of a particular microRNA is U
  • the sixth and seventh base sequences from the 5 'end of the RNA interference inducing nucleic acid may be CU, UU;
  • the sixth base of a particular microRNA is C
  • the sixth and seventh base sequences from the 5 'end of the RNA interference inducing nucleic acid may be CC.
  • the sixth base sequence from the 5 'end of the RNA interference-inducing nucleic acid and the sixth base sequence from the 5' end of the specific microRNA may be identical, and preferably the seventh base sequence from the 5 'end of the RNA interference-inducing nucleic acid.
  • the sixth base sequence from the 5 'end of a particular microRNA may be identical.
  • RNA interference-inducing nucleic acid may preferably include a 7th base sequence from the 5 'end of the specific microRNA as the 8th base sequence from the 5' end.
  • one aspect of an irregular target gene recognized by a microRNA and an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits the irregular target gene is as follows.
  • the irregular target gene recognized by the microRNA has a wobble relationship of G: A with an array of complementary relations of A: U, G: C, C: G, and U: A with the bases of the microRNA and the target gene recognized by the microRNA. Contains an array of or wobble relations of G: U.
  • a base of a specific microRNA a base of a target gene recognized by the specific microRNA: inhibits a target gene recognized by the specific microRNA
  • the base sequence of the RNA interference inducing nucleic acid is G: A: U.
  • a base of a specific microRNA a base of a target gene recognized by the specific microRNA: a target gene recognized by the specific microRNA
  • the sequence of bases of RNA interference inducing nucleic acids that inhibits is G: U: A.
  • RNA interference inducing nucleic acids according to the present invention have a modified base sequence in which one or more guanine (G) bases of the base sequence between the 5 'end and the ninth base of a specific microRNA are substituted with uracil (U).
  • the RNA interference inducing nucleic acid according to the present invention is a base sequence between the 5 'end and the 9th base of a specific microRNA, preferably one or more guanine (G) bases in the second to seventh sequences based on the 5' end.
  • guanine (G) bases When one or more guanine (G) bases are included in the base sequence between the 5 'end and the 9th base of a specific microRNA, all of the included guanine bases may be substituted with uracil (U) or adenine (A), At least one guanine base is substituted with uracil (U) or adenine (A). Substitution with uracil or adenine bases when one or more guanine (G) bases are included in the base sequence between the 5 'end and the ninth base of a specific microRNA, preferably in the second to seventh sequences based on the 5' end. In addition to the base being the other base may be the same as the base of a particular microRNA.
  • RNA interference inducing nucleic acids selectively inhibit the irregular target gene of the microRNA and do not inhibit the regular target gene of the microRNA.
  • the expression regulation function of messenger RNA for a target gene of an RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention is specific for a non-canonical target gene, and inhibited for a regular target gene. It did not show any effect.
  • RNA interference inducing nucleic acid using the RNA interference inducing nucleic acid according to the present invention, it is possible to selectively suppress only the irregular target gene expression, and thus to selectively induce only the effect expected through RNA interference inducing nucleic acid expression inhibition.
  • the specific microRNA may be one or more selected from the group consisting of miR-124, miR-155, miR-122, miR-1, miR-133, let-7, mR-302a, miR-372.
  • the base sequences of miR-124, miR-155, miR-122, miR-1, miR-133, let-7, miR-302a and miR-372, respectively, are miRBase, which is a sequence database of microRNAs. (http://www.mirbase.org/) as described in MIMAT0000422, MIMAT0000646, MIMAT0000421, MIMAT0000416, MIMAT0000427, MIMAT0000062, MIMAT0000684, and MIMAT0000724.
  • microRNA according to the present invention is not limited to human microRNAs, but includes microRNAs of animals including mammals.
  • RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene recognized by a specific microRNA according to the present invention, comprising a second to fifth base sequence from the 5 'end of a specific microRNA, and a sixth and seventh base May be the same, and the sixth and seventh bases have a base sequence complementary to the bases that can be arranged with the sixth base of a particular microRNA, and the bases that can be arranged with the sixth base of the particular microRNA include G: RNA interference inducing nucleic acids characterized by including all complementary bases, including A, G: U wobble sequences, include, but are not limited to, 6 or more nucleotide sequences, but usually about 21 to 24 It may have the following base sequences.
  • RNA interference inducing nucleic acid is an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124 when a specific microRNA is miR-124, and is the second to fifth from the 5 'end of miR-124. It comprises four base sequences, the sixth and seventh base may be the same and the sixth and seventh base has a base sequence complementary to the base that can be arranged with the sixth base of miR-124, the miR- The base that can be arranged with the sixth base of 124 is an RNA interference inducing nucleic acid including all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences.
  • the RNA interference induction nucleic acid may be an RNA interference induction nucleic acid (miR-124BS) in which the 2nd to 7th nucleotide sequences of the 5 ′ terminal represent the nucleotide sequence of 5′-AA GGC C-3 ′. More preferably, the RNA interference-inducing nucleic acid may be an RNA interference-inducing nucleic acid (miR-124BS) representing a nucleotide sequence of 5′-UAA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3 ′.
  • RNA interference inducing nucleic acid is an RNA interference inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-122 when a specific microRNA is miR-122, which is the second to fifth from the 5 'end of miR-122. It comprises four base sequences, the sixth and seventh base is the same and the sixth and seventh base has a base sequence complementary to the base that can be arranged with the sixth base of miR-122, Bases that can be aligned with the sixth base are RNA interference-inducing nucleic acids that include all complementary bases, including G: A, G: U wobble sequences.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid may be an RNA interference-inducing nucleic acid (miR-122BS) in which the 2nd to 7th base sequences of the 5 ′ terminal represent the base sequence of 5′-GG AGU U-3 ′. More preferably, the RNA interference inducing nucleic acid may be an RNA interference inducing nucleic acid (miR-122BS) representing the nucleotide sequence of 5′-UGG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3 ′.
  • RNA interference-inducing nucleic acids that suppress the irregular target gene of miR-155 when a specific microRNA is miR-155, the second to fifth from the 5 'end of miR-155 It comprises four base sequences, the sixth and seventh base is the same and the sixth and seventh base has a base sequence complementary to the base that can be arranged with the sixth base of miR-155, the base of miR-155 Bases that can be aligned with the sixth base are RNA interference-inducing nucleic acids that include all complementary bases, including G: A, G: U wobble sequences.
  • the RNA interference induction nucleic acid may be an RNA interference induction nucleic acid (miR-155BS) in which the 2nd to 7th nucleotide sequences of the 5 ′ terminal represent the nucleotide sequence of 5′-UA AUG G-3 ′. More preferably, the RNA interference inducing nucleic acid may be an RNA interference inducing nucleic acid (miR-155BS) representing the nucleotide sequence of 5′-UUA AUG GC UAA U CGU GAU AGG-3 ′.
  • RNA interference-inducing nucleic acids are RNA interference-inducing nucleic acids that inhibit the irregular target gene of miR-1 when a specific microRNA is miR-1, and is the second to fifth from the 5 'end of miR-1. It comprises four base sequences, the sixth and seventh base is the same and the sixth and seventh base has a base sequence complementary to the base that can be aligned with the sixth base of miR-1, Bases that can be aligned with the sixth base are RNA interference-inducing nucleic acids that include all complementary bases, including G: A, G: U wobble sequences.
  • the RNA interference induction nucleic acid may be an RNA interference induction nucleic acid (miR-1BS) in which the 2nd to 7th base sequences of the 5 ′ terminal represent the base sequence of 5′-GG AAU U-3 ′′. More preferably, the RNA interference inducing nucleic acid may be an RNA interference inducing nucleic acid (miR-1BS) representing the nucleotide sequence of 5′-UGG AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3 ′.
  • miR-1BS RNA interference induction nucleic acid
  • RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene recognized by a specific microRNA according to the present invention, and is preferably the second to seven of the base sequence between the 5 'end and the 9th base of the specific microRNA, preferably 5' end.
  • the length of the RNA interference-inducing nucleic acid characterized in that the guanine (G) base has at least one modified base sequence substituted with uracil (U) or adenine (A) in the first sequence has a base length of 6 or more, although not limited, it can usually have as many as 21 or less than 24 base sequences.
  • RNA interference inducing nucleic acids is an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-124 when a specific microRNA is miR-124, and includes a base between the 5 'end of the miR-124 and the ninth base.
  • an RNA interference-inducing nucleic acid having a modified base sequence wherein at least one guanine (G) base is substituted with uracil (U) or adenine (A) base in the second to seventh sequences based on the 5 'end. .
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a base sequence between the 5 'end and the 9th base, 5'-UAA UGC AC-3' (miR-124-G4U), 5'-UAA GUC AC-3 '(miR-124). -G5U) or RNA interference inducing nucleic acid indicating 5'-UAA UUC AC-3 '(miR-124-G4,5U).
  • the RNA interference inducing nucleic acid is 5'-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3 '(miR-124-G4U), 5'-UAA GUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3' (miR-124) -G5U) or 5'-UAA UUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3 '(miR-124-G4,5U).
  • RNA interference inducing nucleic acid is an RNA interference inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-1 when a specific microRNA is miR-1, and includes a base between the 5 'end of the miR-1 and the ninth base.
  • An RNA interference-inducing nucleic acid having a modified base sequence in which at least one guanine (G) base is substituted with uracil (U) or adenine (A) base in the sequence.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a base sequence between the 5 'end and the ninth base, 5'-UUG AAU GUA-3' (miR-1-G2U), 5'-UGU AAU GUA-3 '(miR-1).
  • the RNA interference inducing nucleic acid is 5'-UUG AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3 '(miR-1-G2U), 5'-UGU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1) -G3U), 5'-UGG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3 '(miR-1-G7U), 5'-UUU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,3U), 5'-UGU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3 '(miR-1-G3,7U), 5'-UUG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,7U) or 5 ' -UUU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3 '(miR-1-G2,3,7U) can be an RNA interference inducing nucleic acid
  • RNA interference inducing nucleic acid is an RNA interference inducing nucleic acid that suppresses an irregular target gene of miR-122 when a specific microRNA is miR-122, and a base between the 5 'end of the miR-122 and the ninth base.
  • an RNA interference-inducing nucleic acid having a modified base sequence wherein at least one guanine (G) base is substituted with uracil (U) or adenine (A) base in the second to seventh sequences based on the 5 'end. .
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a base sequence between the 5 'end and the ninth base, 5'-UUG AGU GUG-3' (miR-122-G2U), 5'-UGU AGU GUG-3 '(miR-122).
  • the RNA interference inducing nucleic acid is 5'-UUG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 '(miR-122-G2U), 5'-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122- G3U), 5'-UGG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 '(miR-122-G5U), 5'-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G7U), 5'- UGG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3 '(miR-122-G9U), 5'-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,3U), 5'-UUG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 '(miR-122-G2,5U), 5'-UUG AGU UUG ACA AUG GUG U
  • RNA interference-inducing nucleic acids is an RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-133 when a specific microRNA is miR-133, and is a base between the 5 'end of the miR-133 and the 9th base.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a base sequence between the 5 'end and the 9th base, 5'-UUU UGU CCC-3' (miR-133-G4U), 5'-UUU GUU CCC-3 '(miR-133). -G5U) or an RNA interference-inducing nucleic acid that represents 5'-UUU UUU CCC-3 '(miR-124-G4,5U).
  • the RNA interference inducing nucleic acid is 5'-UUU UGU CCC CUU CAA CCA GCU G-3 '(miR-133-G4U), 5'-UUU GUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3' (miR-133) -G5U) or 5'-UUU UUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3 '(miR-124-G4,5U) can be an RNA interference inducing nucleic acid.
  • RNA interference inducing nucleic acid is an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits a non-normal target gene of let-7 when a specific microRNA is let-7, a base between the 5 'end and the 9th base of let-7.
  • an RNA interference-inducing nucleic acid having a modified base sequence wherein at least one guanine (G) base is substituted with uracil (U) or adenine (A) base in the second to seventh sequences based on the 5 'end. .
  • the RNA interference inducing nucleic acid has a base sequence between the 5 'end and the 9th base, and has a 5'-UUA GGU AGU-3' (let-7-G2U), 5'-UGA UGU AGU-3 '(let-7 -G4U), 5'-UGA GUU AGU-3 '(let-7-G5U), 5'-UGA GGU AUU-3' (let-7-G8U), 5'-UUA UGU AGU-3 '(let- 7-G2,4U), 5'-UUA GUU AGU-3 '(let-7-G2,5U), 5'-UUA GGU AUU-3' (let-7-G2,8U), 5'-UGA UUU AGU-3 '(let-7-G4,5U), 5'-UGA UGU AUU-3' (let-7-G4,8U), or 5'-UGA GUU AUU-3 '(let-7-G5, RNA interference inducing nucleic acid).
  • the RNA interference inducing nucleic acid is 5'-UUA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3 '(let-7-G2U), 5'-UGA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7 -G4U), 5'-UGA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3 '(let-7-G5U), 5'-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G8U), 5 ' -UUA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3 '(let-7-G2,4U), 5'-UUA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,5U), 5'-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,5U), 5'-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,5U), 5'-
  • RNA interference induction nucleic acid is an RNA interference induction nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-302a when a specific microRNA is miR-302a, and a base between the 5 'end of the miR-302a and the 9th base.
  • an RNA interference-inducing nucleic acid having a modified base sequence wherein at least one guanine (G) base is substituted with uracil (U) or adenine (A) base in the second to seventh sequences based on the 5 'end. .
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a base sequence between the 5 'end and the 9th base, and has 5'-UAA UUG CUU-3' (miR-302a-G4U), 5'-UAA GUU CUU-3 '(miR-302a). -G6U), or an RNA interference inducing nucleic acid representing 5'-UAA UUU CUU-3 '(miR-302a-G4,6U).
  • the RNA interference inducing nucleic acid is 5'-UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3 '(miR-302a-G4U), 5'-UAA GUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a -G6U), or an RNA interference inducing nucleic acid showing the base sequence of 5'-UAA UUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3 '(miR-302a-G4,6U).
  • RNA interference inducing nucleic acid is an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-372 when a specific microRNA is miR-372, and includes a base between the 5 'end of the miR-372 and the ninth base.
  • an RNA interference-inducing nucleic acid having a modified base sequence wherein at least one guanine (G) base is substituted with uracil (U) or adenine (A) base in the second to seventh sequences based on the 5 'end. .
  • the RNA interference-inducing nucleic acid has a base sequence between the 5 'end and the ninth base, 5'-AAA UUG CUG-3' (miR-372-G4U), 5'-AAA GUU CUG-3 '(miR-372). -G6U), 5'-AAA GUG CUU-3 '(miR-372-G9U), 5'-AAA UUU CUG-3' (miR-372-G4,6U), 5'-AAA UUG CUU-3 '( miR-372-G4,9U), or an RNA interference inducing nucleic acid representing 5'-AAA GUU CUU-3 '(miR-372-G6,9U).
  • the RNA interference inducing nucleic acid is an RNA interference inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene of miR-372. 5'-AAA UUG CUG CGA CAU UUG AGC GU-3 '(miR-372-G4U), 5'- AAA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3 '(miR-372-G6U), 5'-AAA GUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G9U), 5'-AAA UUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3 '(miR-372-G4,6U), 5'-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,6U), 5'-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,9U), or 5'-AAA GUU CU
  • RNA interference in one or more of the double strand of nucleic acid that induces RNA interference (RNA), some of the sequence of a specific microRNA is modified to inhibit the noncanonical target gene of the microRNA (RNA) As interference-inducing nucleic acid,
  • the RNA interference-inducing nucleic acid comprises four to five base sequences from the 5 'end of a particular microRNA, the sixth and seventh bases are identical, and the sixth and seventh bases are the sixth of a particular microRNA.
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and a base sequenceable to the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences It is characterized in that the non-normal target nucleotide sequence that the bulge (binge) occurs in the target gene between the 5th and 6th of the microRNA, and the ridge disappears and binds in a continuous nucleotide sequence,
  • the specific microRNA provides an RNA interference-inducing nucleic acid, characterized in that a methyl group (2'OMe) is added at the 2 'position of the ribosil ring of the 6th nucleotide from the 5' end.
  • RNA interference-inducing nucleic acids comprise four base sequences from the second to fifth from the 5 'end of a particular microRNA, the sixth and seventh base is the same and the sixth and seventh base is a specific microRNA It has a base sequence complementary to the base that can be arranged with the sixth base of, and the base that can be arranged with the sixth base of the specific microRNA, all complementary including the G: A, G: U wobble configuration If the base is included, and the methyl group (2'OMe) is added to the 2 'position of the ribosil ring of the 6th nucleotide from the 5' end of the microRNA, there is no restriction on the remaining base sequence except this, and any base All of the sequence may be included, wherein the RNA interference-inducing nucleic acid may include 6 to 24 base sequences, preferably 6 to 15, more preferably 6 to 8 base sequences It may include, but there is no particular limitation to the length of the nucleic acid.
  • RNA interference-inducing nucleic acid includes a base sequence chemically modified by the addition of a methyl group (2'OMe) at the 2 'position of the ribosil ring of the sixth nucleotide from the 5' end of the microRNA, 2 '
  • the RNA interference inducing nucleic acid in which the OMe modification has occurred may selectively inhibit only expression of its regular starting target gene, but may not inhibit expression of the non-normal starting target gene. Accordingly, the RNA interference-inducing nucleic acid in which the 2'OMe modification has occurred can completely eliminate the newly generated irregular nuclear ridge site while maintaining the object of the present invention for specifically inhibiting only the irregular nuclear ridge site of a specific microRNA. have.
  • RNA interference-inducing nucleic acid there is no restriction on the kind of microRNA to which the methyl group (2'OMe) can be added, and the 2 'position of the ribosil ring of the 6th nucleotide from the 5' end of the microRNA. If 2'OMe may be added to any microRNA, according to a specific embodiment of the present invention, the microRNA to which 2'OMe may be added may be miR-124 or miR-1.
  • RNA interference in one or more of the double strand of nucleic acid that induces RNA interference (RNA), some of the sequence of a specific microRNA is modified to inhibit the noncanonical target gene of the microRNA (RNA) As interference-inducing nucleic acid,
  • the RNA interference-inducing nucleic acid comprises four to five base sequences from the 5 'end of a particular microRNA, the sixth and seventh bases are identical, and the sixth and seventh bases are the sixth of a particular microRNA.
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and a base sequenceable to the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences Inducing RNA interference, characterized in that the ridge disappears and binds in a contiguous nucleotide sequence in an irregular target nucleotide sequence in which a bulge occurs in the target gene between the fifth and sixth ends of the microRNA.
  • RNA interference-inducing nucleic acids comprise four base sequences from the second to fifth from the 5 'end of a particular microRNA, the sixth and seventh base is the same and the sixth and seventh base is a specific microRNA It has a base sequence complementary to the base that can be arranged with the sixth base of, and the base that can be arranged with the sixth base of the specific microRNA, all complementary including the G: A, G: U wobble configuration If it contains a base, there is no limitation on the base sequence other than this, any base sequence may be included, wherein the RNA interference inducing nucleic acid may include 6 to 24 base sequences, preferably May comprise 6 to 15, more preferably 6 to 8 base sequences, but there is no particular limitation on the length of the nucleic acid.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention comprises two to fifth base sequences from the 5 'end of a specific microRNA, the sixth and seventh base is the same and the sixth and seventh base is a specific micro It has a base sequence complementary to the base that can be arranged with the sixth base of the RNA, and the base that can be arranged with the sixth base of the specific microRNA includes all complementary complements including G: A and G: U wobble sequences.
  • Non-normal nucleus target sites by allowing the base to be included so that the ridges disappear from the non-normal target nucleotide sequence that binds as a bulge occurs in the target gene between the 5th and 6th microRNAs It selectively inhibits but not the regular target genes of the microRNA.
  • RNA interference inducing nucleic acid according to the present invention may include a nucleotide sequence represented by any one or more of SEQ ID NOs: 103 to 528 (see Table 3).
  • RNA interference inducing nucleic acid in one or more single strands of the double strand of nucleic acid inducing RNA interference, a partial sequence of a particular microRNA is modified to inhibit only the expression of the noncanonical target gene of the microRNA As an RNA interference inducing nucleic acid,
  • RNA interference-inducing nucleic acid is a nucleotide sequence between the 2nd to 9th bases from the 5 'end of a specific microRNA, or the guanine base is the uracil base among the 2nd to 7th sequences based on the 5' end.
  • RNA interference inducing nucleic acid having at least one modified base sequence, wherein the G: A wobble of the site is to be a regular base sequence of U: A.
  • RNA interference-inducing nucleic acids is a guanine base of the sequence from the second base to the ninth base from the 5 'end of the specific microRNA, or from the second to the seventh sequence of the 5' end.
  • At least one or more bases, and the RNA interference-inducing nucleic acid has at least one guanine base between the second base and the ninth base from the 5 'end of a specific microRNA as the uracil base.
  • a modified base sequence substituted above there are no limitations on the remaining base sequences, and any base sequence may be included.
  • RNA interference-inducing nucleic acid that inhibits an irregular target gene recognized by a particular microRNA according to the present invention, comprising a base sequence between the second and ninth bases from the 5 'end of the specific microRNA, or the second to seven bases based on the 5' end.
  • RNA interference-inducing nucleic acid characterized in that the guanine base in the first sequence has a modified base sequence substituted with at least one or more of the uracil base may comprise 6 to 24 base sequences, preferably May comprise 6 to 15, more preferably 6 to 8 base sequences, but guanine in 6 to 8 consecutive base sequences starting at the second base from the 5 'end of the particular microRNA.
  • the Guanine base is an RNA interference-inducing nucleic acid comprising a modified base sequence substituted with at least one or more Uracil bases
  • RNA interference-inducing nucleic acid at least one guanine base among six to eight consecutive base sequences starting from the second base from the 5 'end of a specific microRNA is at least one of the uracil bases.
  • a modified base sequence substituted above there is no limitation on the type of base sequence except for this, and any base sequence may be included.
  • RNA interference inducing nucleic acid is a modified base sequence in which at least one guanine (G) base is substituted with an uracil (U) base among 6 to 8 consecutive base sequences starting from the second base from the 5 'end.
  • G guanine
  • U uracil
  • RNA interference inducing nucleic acid according to the present invention may include a nucleotide sequence represented by any one or more of SEQ ID NOs: 529 to 863 (see Table 4).
  • RNA interference inducing nucleic acid Using the above-described RNA interference inducing nucleic acid according to the present invention, it is possible to specifically suppress the irregular target gene of the microRNA.
  • the present invention provides a composition for inhibiting irregular target gene expression of microRNA comprising RNA interference inducing nucleic acid or a kit for inhibiting irregular target gene expression of microRNA comprising RNA interference inducing nucleic acid.
  • RNA interference induction nucleic acid by specifically inhibiting the irregular target gene of the microRNA, it is possible to selectively regulate the action that occurs due to suppression of the expression of the non-regular target gene of the microRNA.
  • RNA interference-inducing nucleic acid specifically inhibits the irregular target gene of the microRNA
  • expression of the non-regular target gene of the microRNA Action eg, cell cycle, differentiation, retrodifferentiation, morphology, migration, division, proliferation, or death
  • the non-regular target gene of the microRNA Action eg, cell cycle, differentiation, retrodifferentiation, morphology, migration, division, proliferation, or death
  • the present invention provides a composition or kit for regulating cell cycle, differentiation, dedifferentiation, morphology, migration, division, proliferation, or death, including RNA interference-inducing nucleic acids.
  • the 'cell cycle' is a continuous process in which cells grow, divide, and grow again, and the cells form M (cell division), G1 (first division preparation), S group (DNA synthesizer), This means repeating four phases of the G2 group (second cleavage preparation device).
  • the G1 group is a DNA synthesis preparation device from immediately after cell division to the start of DNA synthesis
  • the G2 group is a cell division preparation device from the end of DNA synthesis to the beginning of cell division.
  • the 'cell cycle regulation' includes inducing cells to fluctuate between the four phases, or promoting or arresting the fluctuations, for example, G1 / G2 cells of G1 Inducing variation in the / G2 phase can be included as an example of cell cycle regulation.
  • the 'cell differentiation (differentiation)' is a process by which cells acquire morphological and functional specificity, and the cells change in size, shape, membrane potential, metabolic activity, and response to signals through differentiation. .
  • the 'regulation of cell differentiation' includes promoting or delaying the rate at which cells differentiate, inducing differentiation to start, or suppressing differentiation from starting, for example, inducing nerve cells to differentiate.
  • morphological specificity eg neurite differentiation
  • inducing myocytes to differentiate and inducing them to have morphological specificities eg, myofibroblasts.
  • the term "de-differentiation” refers to a phenomenon of reversing the progression of the differentiation and acquiring the pluripotency of the undifferentiated period before the differentiation of cells is differentiated, and further changing the medium cells.
  • the 'dedifferentiation control' includes inducing, promoting, or inhibiting and retarding the progression of dedifferentiation so that the cells are dedifferentiated, and the result of dedifferentiation control is, for example, a cell growth form (eg, colony formation). , Can be determined by confirming the activity of dedifferentiation factors (Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, Klf4) and the like.
  • the 'cell morphology' refers to a phenotypic characteristic including the shape, structure, size, etc. of a cell, and the cell morphology depends on the type of organism, and even the same organisms are varied according to the type of tissue or organ. Varies.
  • the 'cell morphology control' is to induce changes in the characteristics of the phenotype, including the shape, structure, size, etc. of the cells, to promote, delay, induce or inhibit the change in the natural morphology of the cells and Promoting or inducing to change the form non-naturally.
  • inducing myocardial hypertrophy of cardiomyocytes may be included.
  • the 'cell movement' refers to the movement of the cells, and is an important process for the growth and physiological activity of the animal, while the cells mainly move fast to a given stimulus and usually move to a non-collective shape, Other cell types can only migrate during certain growth periods or in specific situations. Cell migration occurs mainly at the beginning of neural and vasculature or wound healing of epithelial tissues, and cell population migration contributes to multiple tumor metastases.
  • the 'cell movement control' means to delay, promote, induce or inhibit (inhibition) the movement of the cells.
  • 'cell division, proliferation' refers to a process of dividing a parent cell into two daughter cells and increasing the number of cells.
  • 'cell division, proliferation control' includes delaying, promoting, inhibiting or inducing cell division and proliferation. Induction of cell phase into the M phase (cell divider) in the cell cycle can lead to cell division and proliferation. For example, reducing the number of cells distributed in the G0 / G1 phase and increasing the number of cells distributed in the G2 / M phase may be included as examples of cell division and proliferation regulation.
  • 'apoptosis' refers to a step in which a cell dies by genetic properties while maintaining a functional role, and includes both early cell death and late cell death. In apoptosis, the entire cell shrinks and new proteins are synthesized and killed by the cell's suicide gene.
  • 'cell death control' includes inducing, delaying, promoting or inhibiting cell death.
  • the present invention provides a composition for inducing cancer cell death comprising an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-124BS) that suppresses an irregular target gene of miR-124;
  • an RNA interference-inducing nucleic acid preferably miR-124BS
  • composition for inducing neural branching differentiation including an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-124BS) that suppresses an irregular target gene of miR-124;
  • miR-124BS RNA interference-inducing nucleic acid
  • composition for inducing cell cycle arrest of liver cancer cells comprising an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-122BS) that inhibits an irregular target gene of miR-122;
  • compositions for promoting myocyte differentiation or promoting muscle fibrosis including an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-1BS) that suppresses an irregular target gene of miR-1;
  • miR-1BS RNA interference-inducing nucleic acid
  • composition for inducing myocyte death including an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-155BS) that suppresses an irregular target gene of miR-155;
  • miR-155BS RNA interference-inducing nucleic acid
  • compositions for promoting cell death of neuroblastoma including an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-124-G5U) that suppresses an irregular target gene of miR-124;
  • an RNA interference-inducing nucleic acid preferably miR-124-G5U
  • compositions for promoting cell division proliferation of neuroblastoma including an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-124-G4U) that suppresses an irregular target gene of miR-124;
  • an RNA interference-inducing nucleic acid preferably miR-124-G4U
  • composition for inducing myocardial hypertrophy comprising an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U) that inhibits an irregular target gene of miR-1;
  • an RNA interference-inducing nucleic acid preferably miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U
  • composition for inducing myocardial hypertrophy comprising an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-133-G4U) that suppresses an irregular target gene of miR-133;
  • an RNA interference-inducing nucleic acid preferably miR-133-G4U
  • compositions for inducing cell cycle arrest of cancer cells including RNA interference-inducing nucleic acids (preferably let-7-G2U, let-7-G2,4U) that inhibit the non-regular target genes of let-7;
  • RNA interference-inducing nucleic acids preferably let-7-G2U, let-7-G2,4U
  • composition for inducing cell cycle progression activity of hepatocytes comprising an RNA interference inducing nucleic acid (preferably let-7-G4U) that inhibits a non-canonical target gene of let-7;
  • an RNA interference inducing nucleic acid preferably let-7-G4U
  • composition for promoting reverse differentiation comprising an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-302a-G4U) that suppresses an irregular target gene of miR-302a;
  • an RNA interference-inducing nucleic acid preferably miR-302a-G4U
  • composition for promoting reverse differentiation comprising an RNA interference-inducing nucleic acid (preferably miR-372-G4U) that suppresses an irregular target gene of miR-372; or
  • a composition for inhibiting cell migration of liver cancer cells comprising an RNA interference induction nucleic acid (preferably miR-122-G2U, or miR-122-G2,3U) that suppresses an irregular target gene of miR-122.
  • an RNA interference induction nucleic acid preferably miR-122-G2U, or miR-122-G2,3U
  • RNA interference induction nucleic acid by specifically inhibiting the irregular target gene of the microRNA, it is possible to selectively regulate the action of the irregular target gene of the microRNA, various fields (eg, pharmaceutical, Cosmetics, cytology, etc.).
  • RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention can be utilized in a method for screening a test substance for controlling cell cycle, differentiation, reverse differentiation, morphology, migration, division, proliferation or death.
  • the step of introducing the RNA interference inducing nucleic acid according to the present invention to the target cell More specifically, the step of introducing the RNA interference inducing nucleic acid according to the present invention to the target cell;
  • Methods for screening test substances for controlling cell cycle, differentiation, retrodifferentiation, morphology, migration, division, proliferation or death are provided.
  • the target cell is not limited as long as it is derived from a mammal including a human, and the tissue or type from which the target cell is extracted is not limited, and examples thereof include neurons, cardiomyocytes, cancer cells, and muscle cells. Can be.
  • the introduction of the RNA interference-inducing nucleic acid into the target cell may be appropriately performed according to various methods known in the art, for example, the introduction may be performed by transfection using calcium phosphate (Graham, FL et al., Virology, 52: 456).
  • transfection efficiency can vary greatly depending on cell type as well as cell culture conditions and transfection reagents.
  • the test substance is an unknown substance used in screening to control the expression of the non-normal target gene of the microRNA, thereby affecting cell cycle, differentiation, reverse differentiation, morphology, migration, division, proliferation or death. It includes, but is not limited to, compounds, extracts, proteins or nucleic acids.
  • the expression level or expression of the non-regular target gene of the microRNA can be confirmed by various expression analysis methods known in the art, such as RT-PCR, ELISA (see Sambrook, J et al, Molecular Cloning A). Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Press (2001)), western blot, FACS analysis, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • the expression amount or expression of the non-regular target gene of the microRNA is confirmed, and as a result, the expression amount or expression of the non-regular target gene of the microRNA is compared with the case where only RNA interference-inducing nucleic acid is treated without a test substance. If there is a difference, the test substance may be judged to affect the expression of the non-normal target gene of the microRNA. Furthermore, the test substance may be determined to have a function of cell cycle, differentiation, dedifferentiation, morphology, migration, division, proliferation or death.
  • the present invention provides a method for producing an RNA interference-inducing nucleic acid described above.
  • a base having a base sequence complementary to that of the base and capable of aligning with the sixth base of the specific microRNA includes an RNA interference-inducing nucleic acid so as to include all complementary bases including G: A and G: U wobble sequences.
  • RNA interference-inducing nucleic acid such that the guanine base in the base sequence between the 5 'end and the ninth base of the specific microRNA has a modified base sequence substituted with at least one of uracil or adenine.
  • the present invention provides a non-canonical target gene (noncanonical) of the microRNA in one or more of the double strands of the nucleic acid inducing RNA interference, comprising the following steps, wherein some sequence of the specific microRNA is modified
  • a method of producing an RNA interference inducing nucleic acid to suppress the expression of a target gene
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and the base which can be arranged with the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences, and Constructing RNA interference-inducing nucleic acids such that the bumps disappear from the irregular target nucleotide sequences to which the target genes bind with the fifth and sixth nucleotides, and the nucleotides bind to the consecutive nucleotide sequences; And
  • RNA interference-inducing nucleic acid comprising the step of adding a methyl group (2'OMe) in the 2 'position of the ribosil ring of the sixth nucleotide from the 5' end of the specific microRNA.
  • the present invention provides a non-canonical target gene (noncanonical) of the microRNA in one or more of the double strands of the nucleic acid inducing RNA interference, comprising the following steps, wherein some sequence of the specific microRNA is modified
  • a method of producing an RNA interference inducing nucleic acid to suppress the expression of a target gene
  • a base having a base sequence complementary to that of the base, and the base which can be arranged with the sixth base of the specific microRNA include all complementary bases including G: A, G: U wobble sequences, and And constructing an RNA interference-inducing nucleic acid such that the bump disappears from the irregular target nucleotide sequence to which the bulge occurs in the target gene and binds to the sequential nucleotide sequence between the fifth and sixth. It provides a method for producing an RNA interference induction nucleic acid.
  • the present invention provides a non-canonical target gene (noncanonical) of the microRNA in one or more of the double strands of the nucleic acid inducing RNA interference, comprising the following steps, wherein some sequence of the specific microRNA is modified
  • a method of producing an RNA interference inducing nucleic acid to suppress the expression of a target gene
  • RNA interference such that the guanine base of the six to eight consecutive base sequences, starting at the second base from the 5 'end of the particular microRNA, has a modified base sequence substituted with at least one or more uracil bases It provides a method for producing an RNA interference induced nucleic acid, characterized in that it comprises the step of constructing a derived nucleic acid.
  • RNA interference inducing nucleic acid Since the RNA interference inducing nucleic acid has already been described, the description is omitted in order to avoid duplicate description.
  • RNA interference inducing nucleic acid construction is in accordance with various methods known in the art and is not limited to any particular method.
  • the present invention also provides an interference-inducing nucleic acid modified by inserting a methyl group (2'OME) at the 2 'position of the ribosil ring of the 6th nucleotide from the 5' end of a specific microRNA.
  • the modified interference-inducing nucleic acid has the effect of completely eliminating the newly appearing nonnuclear nucleus bonds while maintaining the object of the present invention to specifically suppress only the nonnuclear nucleus sites of the miRNA.
  • the interference-inducing nucleic acid By using the interference-inducing nucleic acid according to the present invention, it is possible to efficiently increase the biological function of the existing microRNA by suppressing the irregular target gene, or to suppress some of the functions of the existing microRNA, that is, the biological function of the non-regular target gene. Only functions can have the effect of selectively indicating.
  • the interference-inducing nucleic acid can control the cell cycle, differentiation, dedifferentiation, morphology, migration, division, proliferation or death, and is expected to be applicable to various fields such as drugs and cosmetics.
  • FIG. 1 schematically shows the mechanism of action of interference-inducing nucleic acids that inhibit non-normal targets of microRNAs.
  • FIGS. 2a to 2c show target gene inhibition of a canonical target (initiated: Seed) and a canonical nucleation target (nucleation bulge) of miR-124 by measuring the enzyme of a luciferase reporter to thereby determine the noncanonical target specificity of miR-124-BS. It was confirmed about the redox expression inhibitory effect.
  • 3A to 3B show flow cytometry of miR-124-BS in apoptosis induced by the canonical target of miR-124 (initiated: Seed) and the nonnuclear target (nucleation bulge) in cervical cancer cells (HeLa).
  • -Activated cell sorting (FACS) analysis shows the results confirmed.
  • 4A to 4B show neurites differentiation induced by an irregular nuclear bulge target (nucleation bulge) of miR-124 cells through expression in human neuronal tumor blastoma (Sh-Sy-5y) of miR-124-BS. The results observed with the form and expression of markers are shown.
  • 5A to 5B show miR-124-BS (4753) and miR, which are natural forms of miR-124-BS that regulate the nucleation bulge (nucleation bulge) of miR-124 to a canonical target (Seed).
  • miR-124-BS 4753
  • miR natural forms of miR-124-BS that regulate the nucleation bulge (nucleation bulge) of miR-124 to a canonical target (Seed).
  • the result of observing neurites branched differentiation induced by miR-124- (3714) having the same initiation sequence as -124 in terms of cell morphology and molecular biological characteristics is shown.
  • 6a to 6c show that the morphogenetic branching induced by miR-124's nonnuclear nucleation target (nucleation bulge) in mouse neuroblastoma (N2a) is a mechanism of cellular morphology and molecular biology that regulates expression of MAPRE1 gene. It shows the result observed with the characteristic.
  • Figures 7a to 7c shows the results confirmed by RNA-Seq analysis at the transcript level to suppress the expression of miR-124-BS-induced nonnuclear target (nucleation bulge) gene in mouse neuroblastoma (N2a) cells It is shown.
  • 8a to 8c show cell cycle arrest induced by miR-122 nonnuclear target (nucleation bulge) in human liver cancer cell line (HepG2) through miR-122-BS and flow cytometry analysis. .
  • 9A to 9E show the thickening effect of muscle cells induced by the miR-1 nonnuclear nuclear target (nucleation bulge) and the miR-155 nonnuclear nuclear target (nucleation bulge) in myocytes. Inhibition of myocyte differentiation and induction of apoptosis were observed by miR-1-BS and miR-155-BS in terms of cell morphology, molecular biological characteristics and flow cytometry.
  • Ago HITS-CLIP is a microRNA and target RNA data binding to an agon nut protein in human brain tissue, as well as a normal initiation target (initiation: seed), It shows the result of confirming that a non-normal GA (A: wobble) target exists naturally.
  • 11A-11D show that miR-124's 4th irregular GA sequence initiation target and 5th irregular GA sequence initiation target of mouse neuroblastoma (N2a) cells exhibit completely different functions from miR-124 in brain cell differentiation.
  • 124-G4U and miR-124-G5U show cell morphology observations and cell death by flow cytometry.
  • FIGS. 12A-12B show the biological functions of the inhibition of miR-124 4th irregular GA sequence initiation target, 5th irregular GA sequence initiation target in human neuroblastoma (SH-sy-5y) cells miR-124-G4U, miR- 124-G5U shows the results observed with Fluorescence-activated cell sorting (FACS) for cell proliferation and cell cycle analysis.
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • Figures 13a to 13d shows the results confirmed in the cardiomyocyte cell line (h9c2) through the flow cytometry (Fluorescence-activated cell sorting (FACS)) in the fluorescent protein reporter that the seventh non-regular GA sequence initiation target of miR-1 has gene suppression It is shown.
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • FIGS 14a-14c miR-1-G2U, miR-1-G3U in the neonatal cardiomyocytes of rats to function the second, third, and seventh irregular GA array initiation targets of miR-1 , miR-1-G7U was expressed and observed through observation of cell morphology and molecular biological characteristics on myocardial hypertrophy induction effect.
  • 15A to 15B show the results of observing cell morphological characteristics of myocardial hypertrophy-induced effects after expressing miR-133-G4U in cardiomyocytes (h9c2) as a function of miR-133's 4th irregular GA sequence initiation target will be.
  • 16A-16B show that human hepatocellular carcinoma cell line (HepG2) inhibits the expression of genes through miR-122's 2nd and 3rd irregular GA sequence initiation targets. Shows the results observed by measuring the enzyme activity of the luciferase reporter.
  • HepG2 human hepatocellular carcinoma cell line
  • 17A to 17D show that miR-122 inhibits the migration of the second irregular GA sequence initiation target and the second and third irregular GA sequence initiation target miR-122-G2U, which inhibits the migration of human liver cancer cell line (HepG2). It shows the results confirmed by the observation on the cell morphology through the expression of miR-122-G2,3, U.
  • 19A to 19B show that inhibition of expression of the 2,3 irregular GA sequence initiation target and the 2,7 irregular GA sequence initiation target by miR-122 induces cell cycle arrest of human liver cancer cell line (HepG2). It shows that the results confirmed by flow cytometry through the expression of miR-122-G2,3U, miR-122-G2,7U.
  • FIGS. 20A-20B show that inhibition of 2 or 2 or 4 non-regular GA sequence initiation target expression by let-7 induces cell cycle arrest of human liver cancer cell line (HepG2) and 4 non-normal GA sequences Inhibition of the expression of the starting target promotes the cell cycle, and the result of flow cytometry through the expression of let-7a-G2U, let-7a-G2,4U, let-7-G4U is shown.
  • 21A-21C show that miR-372-G4U or miR-302a-G4U, together with miR-372 or miR-302a, induce inhibition of expression of 4th irregular GA sequence initiation target expression by miR-372 or miR-302a. Shows the results confirmed by Oct4 gene expression reporter.
  • Figures 23a to 23b shows the results confirming that the 2'OMe modification at the 5 'terminal 6th does not inhibit the entire non-normal nuclear ridge target mRNA in the transcript.
  • Figures 24a to 24b shows the results of analyzing the microRNA binding to the irregular nuclear ridge site through the Ago HITS CLIP experiment.
  • 25A to 25F show the results of identifying G> U mutations in tumor microRNAs that recognize non-canonical GA sequence initiation targets as regular targets by analyzing sequence mutations in a cancer patient microRNA sequencing database (TCGA).
  • TCGA cancer patient microRNA sequencing database
  • the present inventors have shown that in addition to the normal initiation target which is completely complementary to the microRNA initiation, when the microRNA is nucleotide sequenced with the target in the agon nut protein, the present inventors have completed the complementary arrangement with the microRNA initiation. It was confirmed through the analysis of the RNA complex sequence result (Ago HITS-CLIP) bound to the agon nut protein.
  • the target that base 6 is arranged by inducing nucleation bulge to the target base of the microRNA, In the microRNA initiation region, it was confirmed that a target (microRNA non-regular GA alignment initiation target site) was naturally present (FIG. 1) allowing a GA wobble.
  • miR-124 is a minimum of 6 nucleotides of 5'-GUGCCUUA-3 'of the target through the nucleotide sequence (5'-UAAGGCAC-3') via an agon nut protein. Consecutive complementary nucleotide sequences are generated, and targets having such nucleotide sequences have been reported as canonical seed sites of microRNAs (Nature, 2009, 460 (7254): 479-86).
  • the miR-124 nucleotide sequence (5'-UAAGGCAC-3 ') and the microRNA irregular nucleus target site (5'- GUGGCCUU -3') were used as the 5 'terminal standards.
  • Targets with complementary base sequences were identified so that the G of the target messenger RNA was arranged in a bulge between the fifth and the sixth, and based on this, the base sequence was complementary to the microRNA irregular nucleus target site.
  • the starting nucleotide sequence of miR-124 has the nucleotide sequence (5-UAAGGCCA-3) in which 6 bases are repeated once more between 6 and 7 of the miR-124 beginning, with the continuous and complete complementary sequence being miR It was used as miR-124BS (BS: Bulge site) siRNA that inhibits -124 nonnuclear target.
  • miR-124BS Bulge site siRNA that inhibits -124 nonnuclear target.
  • the G A wobble base sequence in addition to the conventional complementary nucleotide sequence was used to bind the initiation sequence of the microRNA to the target messenger RNA. It was confirmed that it takes place.
  • the siRNA was invented miR-124-GU by designing a siRNA with a sequence that is continuous and perfectly complementary to the miR-124's irregular GA sequence initiation target site. It was used as an siRNA that inhibits the expression of the GA array initiation target.
  • the 5'-GUGCCUU-3 'base sequence is complementary to the second through seventh bases of the miR-124 base.
  • the regular initiation target site is completely complementary to the beginning of miR-124 (5'-UAAGGCAC-3 ') and at least six consecutive bases ( Figure 2a).
  • the nucleation bulge site of miR-124 discovered through Ago HITS CLIP experiment is 5'- GUGGCCUU -3 ', where C base 6 of miR-124 forms nucleus with target.
  • the nucleotide sequence is arranged so that the G of the target RNA arranged between the 5th and 6th bases of the 5 'terminal of miR-124 is formed into a bulge.
  • a siRNA whose microRNA originated the nucleotide sequence (5'-UAAGGCCA-3 ') that continuously and completely complements the non-normal nuclear bulge site and named it miR-124-BS siRNA. (FIG. 2A).
  • miR-124-BS recognizes miR-124's nonnuclear target nucleus target site as a regular initiation target and thinks it will specifically and more strongly inhibit gene expression of non-normal targets with it. This was confirmed through the luciferase reporter experiment (FIG. 2B-C).
  • the Luciferase reporter has the corresponding site for miR-124.
  • IC50 inhibitor concentration 50
  • the irregular nuclear ridge site was confirmed to be similar to about 0.2 nM (Fig. 2b).
  • the highest suppression rate was found to be about 50% for regular initiation sites and about 80% for non-regular nuclear sites, which was somewhat weaker.
  • the normal initiation target is about 0.01 nM or more and the irregular nuclear ridge target starts gene suppression at a concentration condition of 0.1 nM or more ( 2b). Therefore, miR-124 regulates the expression of the normal target and the irregular nuclear ridge target, and it can be seen that the efficiency of regulating the normal target expression is high.
  • the luciferase reporter experiment performed at this time was performed by cloning the corresponding miR-124 target site sequence in the sequence of 2 consecutive sequences in the 3'UTR (3'untranslated region) region of the renilla luciferase gene of the psi-check2 vector (Promega). .
  • the irregular ridge site sequence was used a non-nuclear ridge target site naturally present in the 3'UTR portion of MINK1.
  • miR-124 is a human-derived sequence prepared according to the miRBase database by chemically synthesizing the corresponding guide strands and the transport strands by Bioneer, and then separating them by HPLC and providing them by the company.
  • miR-124 and luciferase reporter vectors were co-transfected into approximately 10,000 cervical cancer cells (HeLa: ATCC CCL-2) using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. HeLa cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml steptomycin, and the complete medium without antibiotics when transfection was performed. Cells were cultured.
  • luciferase activity was measured using Promega's Dual-luciferase reporter assay system according to the manufacturer's protocol, and Renilla luciferase activity measurement was performed using promega's Glomax Luminometer for at least 3 hours. More than one replicate was performed and normalized to the activity of firefly luciferase and calculated.
  • miR-124-BS did not inhibit luciferase reporter enzyme activity at any concentration (0-10 nM) against miR-124 normalized target, but concentration of 0.1nM or higher for miR-124 nonnuclear nuclear reporter target reporter. It was confirmed that the effect of inhibiting the luciferase reporter enzyme activity in (Fig. 2c). When the gene suppression efficiency at this time was measured by IC50, the inhibition of the irregular nuclear ridge target was about 0.5 nM.
  • the function of miR-124 irregular nuclear ridge target expression regulation of miR-124-BS is specific to the irregular nuclear ridge target site (FIG. 2C).
  • the luciferase reporter experiment at this time was prepared by synthesizing miR-124-BS in Bioneer as before, and transfection (co-) into cervical cancer cells (HeLa: ATCC CCL-2) with the corresponding luciferase reporter vector. 24 hours after the transfection, luciferase enzyme activity was measured.
  • miRNA-BS comprising a region of origin that is continuous and completely complementary to the site sequence for the purpose of inhibiting only the non-normal organic target of the microRNA, and verifying its effect.
  • miR-124 When applied to miR-124 and confirmed through the luciferase reporter experiment, it was confirmed that miR-124-BS did not inhibit the expression of the normal initiation target and effectively suppressed the expression of the irregular ridge target. .
  • miR-124-BS inhibits only non-normal raised target among several targets inhibited by miR-124
  • miR-124 is specifically expressed in neurons, so it is known to play a role mainly related to neurons.
  • the tumor-induced nocturnal tumors showed that miR-124 expression was deteriorated, and correlated with this could lead to the death of tumor cells if artificially induced miR-124 expression. Therefore, in order to confirm whether the various different functions of miR-124 are different depending on the kind of recognition of the target, miR-124-BS was introduced into cervical cancer cells (HeLa) and cell death was observed by flow cytometry ( 3a).
  • miR-124 is a brain tissue-specific microRNA, and has been reported to have no brain-specific function in completely different cells without tissue cell-specific transcript expression (Farh K et al, 2005, Science, 310 (5755). 1817-21).
  • miR-124-BS was introduced into the cerebellar neural stem cell line C17.2 and then cell differentiation was observed morphologically ( 3b, above).
  • the introduction of miR-124 was promoted by the differentiation of neurites of C17.2 cells, but in the case of miR-124-BS, differentiation was observed in the form of short branches.
  • the general neural branch differentiation caused by miR-124 occurs by suppressing the regular initiation site target.
  • the introduction of miRNA was carried out with RNAiMax reagent by synthesizing 50nM miRNA in the same manner as in Example 2.
  • miR-124-BS induced cell death in HeLa cells, it was observed by flow cytometry in C17.2 cells in the same manner as in Example 2 to see whether such a function is also observed in neurons.
  • the rate of apoptosis was 22.4%, which is almost similar to that of 21% of the control group, whereas miR-124-BS was slightly increased to 33.4% (FIG. 3B, intermediate figure).
  • the same trend was observed in the cervical cancer cells in that apoptosis occurred through the inhibition of miR-124 irregular target, but the increase rate was much smaller than that of cervical cancer, which was about doubled.
  • miR-124 plays a role in differentiation in neural stem cells, and cell cycle regulation may play an important role. Therefore, after introducing miR-124 and miR-124-BS into C17.4 cells, the cell cycle was observed by applying flow cytometry through PI (Propidium Iodide) staining (FIG. 3B, below). MiR-124 induced cell cycle arrest at G0 / G1 to 83%, slightly higher than the control group of 69%. In contrast, it was observed that expression of miR-124-BS did not cause significant cell cycle arrest.
  • PI Propidium Iodide
  • the microRNA was transfected in the same manner as in the previous example, cultured for 48 hours, the cells were removed, fixed with ethanol, and 1 mg / ml propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich) 0.2 mg / After reacting with ml of RnaseA for 30 minutes at 37 ° C, flow cytometry was performed with BD FACSCalibur (BD Biosciences).
  • PI propidium iodide
  • the results of the above-described embodiments induce death of cervical cancer cells (Hela) in the same manner as miR-124, even if miR-124-BS inhibits the expression of miR-124 irregular nuclear ridge targets.
  • the inhibitory function of miR-124's irregular ridge target is the death of cancer cells.
  • differentiation of neurite branches occurs due to the expression of miR-124, and a little cell death and cell cycle arrest occur.
  • miR-124-BS which inhibits only the miR-124 irregular target, It appears somewhat different. Therefore, miR-124's neuronal differentiation function is mainly caused by the suppression of known regular initiation target genes, and it can be thought that other forms can occur through irregular ridge targets.
  • miR-124-BS causes a different type of neural dendritic differentiation from miR-124
  • the sh-sy-5y cell line (CRL-2266), which is a human neuroblastoma, was examined in detail. ) was used.
  • miR-124 has the same starting sequence for recognizing and inhibiting the irregular nuclear ridge site, but other sequences have the same microRNA sequence as miR-124.
  • One miR-124-BS (4753) was synthesized by the method described in the previous example was conducted. At this time, the sequence of miR-124-BS (4753) was 5'-CAAGGCCAAAGGAAGAGAACAG-3 '.
  • cel-miR-67 (NT; non- Synthesis was performed in the same manner as in the targeting). After transfecting the corresponding miRNAs in the same manner described in the previous example and incubating the cells for 60 hours, cell morphological changes were observed by light microscopy (FIG. 4A).
  • miR-124 was able to observe morphological changes that elongate the neurites of human neuroblastoma (Sh-sy-5y), whereas the development of miR-124 was able to inhibit only the irregular bump target.
  • miR-124-BS (4753) having the same sequence as miR-124-BS, a short but branched neurite outgrowth was observed with a large number of neurites in one cell (FIG. 4A).
  • catecholamine-based neurons CAD, CRL-11179
  • miR-124 has a small number but long protrusions
  • miR-124-BS (4753) has a short but large number of nerves, as shown in human neuroblastoma (Sh-sy-5y, CRL-2266) cells. The eruption of the protruding branches could be observed. (FIG. 4B).
  • miR-124 and miR-124-BS (4753) when intracellularly delivered miR-124 and miR-124-BS (4753) at the same rate, cells with long neurites and cells with many neurites were observed simultaneously.
  • this shows the possibility of promoting differentiation of various types of neurons similar to brain cells seen in artificially more complex neural networks.
  • Tuj1 a neuron-specific marker
  • FIG. 4B a neuron-specific marker
  • miR-124 has a function of forming a short but many neurite branches, which is different from the function of the existing miR-124 by suppressing only irregular nuclear ridge targets.
  • miR-124-BS 4753
  • the RNA interference derivative including the starting sequence which can recognize the same effect as miR-124-BS.
  • the complex neurites produced by miR-124-BS can be used as a way to promote various forms of neuronal differentiation, similar to human brain cells showing complex neural networks.
  • miR-124-BS Specific neuronal differentiation induced by the expression of miR-124-BS was further confirmed in the mouse neuroblastoma N2a (CCL-131), as in Example 4 miR-124, miR-124-BS (4753) The morphology of the cells was observed while incubating for 72 hours after introducing them into the cells (FIG. 5A).
  • miR-124 (3714), which has the same initiation sequence of miR-124 but other portions, is also synthesized by 5'-GAAGGCAGCAGUGCUCCCCUGU-3 'sequence to form duplexes in siRNA form, and then into cells. Introduced and tested. At this time, as a control, the same sequence as that of cel-miR-67 (NT; non-targeting), which is a microRNA of a pretty little nematode (C.elegans), was used.
  • miR-124-BS (4753), which is similar to miR-124 but shows a different morphology, was slightly different in morphology, but it was confirmed that differentiation was induced on the gene expression marker.
  • miR-124-BS (4753) and miR-124 (3714) were expressed, the amount of protein expression seen in differentiated neurons was increased, all of which have molecular characteristics of differentiated neurons. It could be confirmed.
  • microRNAs in the previous examples has been performed by introducing a synthesized duplex into cells, but the expression of microRNAs can also be introduced by introducing a vector expressing shRNA forms, which are hairpin RNAs capable of producing them. . Therefore, a vector expressing miR-124, miR-124-BS (4753) and miR-124 (3714) in the shRNA form was constructed using pCAG-miR30 plasmid (addgene # 14758), which is a vector expressed by pre-miRNA. .
  • the pCAG-miR30 vector used was a CAG promoter for strongly expressing the microRNA, and designed to express the backbone of the microRNA-30, which has the advantage of maximizing microRNA expression (Paddison P et. al, Nature methods, 2004, 1 (2): 163-7).
  • PCAG vectors designed to express miR-124, miR-124-BS (4753) and miR-124 (3714), respectively, were introduced into N2a cells using a pCAG vector expressing nothing as a control, and then cell morphology. Was observed (FIG. 5B).
  • the experimental group of the hairpin structure introduced into the neuroblastoma N2a showed similar changes in the cell morphology of the miR-124, miR-124-BS (4753) and miR-124 (3714) duplexes.
  • miR-124 and miR-124 (3714) expressed in the experimental group was observed neuroblastoma with long neurites.
  • TUJ1 An increase in TUJ1 was observed by immunoblot experiment in the same manner as in the previous example, and Synaptophysin was tested in the previous paper (SEKwon et al. 2011 Neuron 70, 847-54) through qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) experiment. Proceed using the sequence.
  • the vector was transfected using Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen) according to the company's protocol for N2a cells, and after 24 hours, total RNA was extracted with the RNeasy kit (Qiagen), and the protocol.
  • miR-124 3714
  • the inhibition of the expression of a regular target gene generally causes long neurogenesis differentiation.
  • the irregular ridge target of miR-124 is expressed in the shRNA form only the end portion of the miR-124-BS (miR-124-BS (4753))
  • the branch can cause more neurites differentiation.
  • both miR-124 normal and non-normal antagonistic target inhibition showed the expression of molecular markers of neuronal neurite differentiation, and all of them were differentiated into neurons.
  • the number of neurite branches expressed per cell was about 3-5 in miR-124, miR-124-BS (4753) and miR-124 (3714) compared to the control group. It was confirmed that the fold increased (FIG. 6A, bottom left). However, when miR-124-BS (4753) is expressed, it was observed that significantly more branches were produced than when miR-124 or miR-124 (3714) were expressed.
  • MAPRE1 Microtubule-associated protein RP / EB family member 1: Maria Tortosa et al. 2013 EMBO 32, 1293-1306 gene, which has been reported to regulate neuronal differentiation, was found.
  • MAPRE1 is a protein attached to the ends of the microtubules constituting the neurites, and the shape of the neurites may be determined by controlling the formation of the microtubules.
  • Example 5b the method was performed in Example 5b after introducing miR-124-BS into N2a cells and the amount of messenger RNA of MAPRE1. According to the qPCR experiment was measured (Fig. 6b). When qPCR was performed with two different primers, both results showed that MAPRE1 expression was reduced to 70-40% in the miR-124-BS introduced experimental group compared to the control group. This confirmed that MAPRE1 was suppressed by the irregular ridge site of miR-124.
  • MAPRE1 is an irregular ridge target of the miR-124 and is a very important target, the neuronal differentiation resulting from the inhibition of the irregular ridge target of miR-124-BS should be further promoted due to the decreased expression of MAPRE-1. Therefore, to confirm this point, two siRNAs capable of inhibiting MAPRE1 were prepared, and experiments were also performed to transfect miR-124 together with N2a cells and to show cytomorphological changes (FIG. 6C). As a result, it was observed that the number of neurite branches increased significantly in the experimental group expressing the siRNAs for miR-124 and MAPRE1, compared to the control group expressing only miR-124, which used MAPRE1 siRNAs of two different sequences. The same was observed in the experiment (FIG. 6C). At this time, if RNA was introduced into the cells in the same manner as in the previous example, the morphology was observed while cell culture for 48 hours thereafter.
  • the short and branched neural process differentiation induced by miR-124-BS is a biological function that can be at least partially inhibited the expression of MAPRE1 gene through the non-normal ridge target site of miR-124.
  • the miR-124-BS invented by the present inventors introduced miR-124 and miR-124-BS into N2a cells in order to identify only the irregular ridge target gene of miR-124 at the transcript level where all genes are expressed.
  • RNA-Seq analysis was performed later. In this case, if the same nucleotide sequence as miR-124 or a duplex (miR-124-6pi) having a non-base (pi) number 6 based on the 5 'end was used, the modification was the sixth based on the 5' end of the miRNA. It has been reported that it does not align with the target messenger RNA at all because there is no base (Lee HS et. Al. 2015, Nat Commun. 6: 10154).
  • RNA-Seq experiment was performed by converting the 5 'terminal reference number 6 into a non-base (NT-6pi) in the sequence of cel-miR-67, a microRNA of C. elegans, as an experimental control.
  • NT-6pi non-base
  • MiR-124, miR-124-BS, and miR-124-6pi duplexes were delivered at 75 nM concentrations, and after 24 hours of incubation, total RNA was extracted with RNAeasy (Qiagen) kit, and then libraries were prepared from Otogenetics and Next-generation sequencing was performed.
  • the FASTAQ file which is the sequence data obtained in the above experiment, was mapped to the mouse genome sequence (mm9) by the TopHat2 program, the expression value (FPKM) was obtained by the Cufflink and Cuffdiff programs, and mouse neuroblastoma cells into which the control NT-6pi was introduced ( N2a) was normalized to the results in the cells and expressed as a log change (Fold change, log2 ratio) was analyzed.
  • RNA-Seq results whether the amount of messenger RNA of a gene having a target site of a microRNA is inhibited by the expression of the microRNA
  • the normal initiation site of miR-124 (2nd to 8th of the 5 'end) Genes with a phastCons score of 0.9 or higher were selected to select those whose sequences were sequenced in 3'UTRs with 7mer) and nucleotide sequences, and inhibited these profile results depending on the expression of the corresponding microRNAs.
  • the cumulative fraction was compared and analyzed in order of success.
  • the miR-124 irregular bump site was also identified, and the inhibition rate of the gene was analyzed in the same cumulative ratio.
  • miR-124-BS In the case of expressing miR-124-BS developed by the present inventors, when miR-124-BS was analyzed, the fold change according to miR-124-BS expression was analyzed according to the cumulative fraction.
  • the gene having 124 conserved normal initiation sites in the 3'UTR (miR-124 seed) showed some inhibitory effects, but there was no miR-124 irregular proliferation site and only the normal initiation site (miR-124 seed). Seed only) was confirmed that there is no change at all (Fig. 7c, above). However, both genes with miR-124's irregular ridge targets (miR-124 nuc) and those with only those targets (miR-124 nuc only) show strong and effective gene suppression. (Figure 7c, below).
  • miR-124-BS When miR-124-BS is expressed in FIG. 7C, genes having miR-124 seed only (miR-124 seed only) are not inhibited, and thus do not inhibit miR-124 normal start site at all. It can be concluded that miR-124-BS somewhat inhibited miR-124's initiation site target, but in the presence of a regular site of miR-124, the miR-124's irregular ridge site was also present. It is guessed that it shows the inhibitory effect even a little.
  • miRNA at the transcript level inhibits the inhibition of the existing regular initiation target gene very strongly and efficiently, but weakly inhibits the irregular ridge target.
  • miR -122-BS is human Liver cancer cell line ( HepG2 Of cell cycle arrest induced in Flow cell Confirmation through analysis
  • miR-122 has 5'-UGG AGU GU-3 'as the base sequence
  • miR-122-BS which is the base sequence of siRNA nucleotide sequence with its irregular nucleus target site, repeats U 6 more times
  • the 5'-UGG AGU U GUG ACA AUG GUG-3 'sequence consists of 19 bases at the 5' end, and the 20th and 21st bases are dt (Deoxy Thymine Nucleotide). Is done.
  • the dt portion was composed of a duplex of guide and carrier strands so as to constitute two nucleotide overhangs at the 3 'end.
  • the carrier strand is completely complementary to the guide strand, and the 5 'terminal based on both the first and second modified 2'OMe, and the base sequence was configured to include two dt (Fig. 8a).
  • the guide strand and carrier strand of miR-122-BS were chemically synthesized and separated by HPLC from Bioneer, and prepared as a duplex of the guide strand and the transport strand according to the method provided by the company.
  • the miR-122-BS (FIG. 8a) thus prepared was introduced into human liver cancer cell line (HepG2), and then the change in cell cycle was observed through flow cytometry.
  • miR-122-BS experimental group increased the G0 / G1 phase cells by 10-fold from 10.7% to 24.3%. It was confirmed that the cell cycle arrest of HepG2 was increased (FIGS. 8B-C). This increase in G0 / G1 phase was not observed in the cells to which miR-122 was delivered. Subsequently, the G2 / M phase cell distribution of human liver cancer cell line (HepG2) to which miR-122-BS was delivered decreased from 83.4% to 67.3% compared to the control group. It was not observed (Figure 8b, c).
  • miR-122-BS exhibits a biological function of inducing cell cycle arrest in human liver cancer cell lines through the regulation of miR-122's irregular nuclear ridge target expression, which is completely different from the biological function that miR-122 acts on. It could be observed that it is a function.
  • miR -1-BS are skeletal muscle cells Muscle fibrosis function induced by ( C2C12 ) and miR -155-BS confirmed cell death function
  • miRNA-BS Since miRNA-BS observed a new biological function that differs from the function of suppressing the expression of miRNA's regular initiation target, miR-1 is expressed in muscle cells to play an important role in observing how this function appears in muscle cells. , miRNA-BS was applied to miR-155.
  • miR-1 is a muscle tissue-specific microRNA, which has been reported to function in myocyte differentiation (Chen J et al, Nature genetics, 2006, 38 (2): 228-233), miR-1- BS is skeletal muscle cell owner After expression in C2C12, cell morphological changes (Fig. 9a) and the expression of gene markers expressed at differentiation (Fig. 9b) were investigated.
  • miR-1-BS was synthesized and transfected into the cells in the same manner as used in the previous example, 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / Using Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with ml steptomycin, this was followed by growth condition (GM) conditions (FIG. 9A, above) and deprivation media condition (DM) after which FBS was removed. ) was observed by dividing the culture into a further 48 hours (Fig. 9a, below).
  • FBS fetal bovine serum
  • DM deprivation media condition
  • the cells were then treated with 4% para-form aldehyde (PFA) to immobilize the cells and react with myosin 2 heavy chain protein expressed in differentiated muscle cells with a primary antibody (MF20: Developmental studies hybridoma bank). Thereafter, staining with a mouse secondary antibody (ab150105) attached with Alexa 488 fluorescent material was observed for cell morphology and differentiation (FIG. 9A).
  • PFA para-form aldehyde
  • the mouse skeletal muscle cells (C2C12) MF20 increased the number of differentiated myocytes when the miR-1-BS was expressed in the growth culture condition (GM), compared to cells to which NT or miR-1 duplexes, which were control groups, were delivered. As a result of staining, it could be confirmed.
  • GM growth culture condition
  • DM deprivation media condition
  • This differentiation of muscle cells can be molecularly confirmed by markers the amount of expression of genes that increase expression during differentiation, so that the expression of sk-actin and Myogenin expression as primers specific for the messenger RNA, RT (Reverse transcription) -PCR was performed to detect the b-actin messenger RNA with no difference in expression level even during differentiation (Fig. 9b).
  • RT Reverse transcription
  • miR-155 is a microRNA that inhibits myocyte differentiation (Seok H et. Al, JBC, 286 (41): 35339-46-2011), and miR-155-BS is effective in the same way as described above for miR-1. Observation was made through differentiation of skeletal muscle cells (C2C12) (FIG. 9C). As a result, after expressing the control group NT, miR-155, miR-155-BS, no morphological differences of cells were observed in the growth culture conditions (GM), but the deficient culture conditions (inducing differentiation of muscle cells) In DM), the control group is differentiated and suppressed when miR-155 is expressed, but when the miR-155-BS is introduced, the differentiation disappears.
  • GM growth culture conditions
  • DM deficient culture conditions
  • miR-1-BS promotes the differentiation of skeletal muscle cells to induce coarse muscle fiber differentiation
  • miR-155-BS induces the death of skeletal muscle cells, and this function is the existing muscle
  • miR-1's ability to contract cells and miR-155's ability to inhibit muscle cell differentiation were different.
  • Ago HITS CLIP As a method to analyze the target of the microRNA at the transcript level, an experimental method called Ago HITS CLIP has been developed and widely used (Nature, 2009, 460 (7254): 479-86).
  • Ago HITS CLIP experiments induce a covalent bond between RNA and agon nut protein in the cell by irradiating UV to a cell or tissue sample, and use an antibody that specifically recognizes the agon nut from the RNA-agon nut complex thus produced. After separation by immunoprecipitation, RNA is analyzed by next-generation sequencing. The sequencing data thus obtained can not only identify the target mRNA of the microRNA through bioinformatics but also accurately analyze the binding position and sequence (Nature, 2009, 460 (7254): 479-86). .
  • Ago HITS-CLIP was first applied to the cerebral cortical tissues of mice to map the targets of microRNAs in the brain tissues. These multiple Ago HITS-CLIP analyzes have revealed the location of microRNA binding in multiple tissues, particularly similar to the initiation of microRNA binding in these target sequences, but other forms of irregular binding targets in the target mRNA sequence. Many were found (Nat Struct Mol Biol. 2012 Feb 12; 19 (3): 321-7).
  • the canonical target site having a complementary sequence from the second to the eighth end of the corresponding sequence was examined for the top20 miRNA thus identified (FIG. 10b).
  • FIG. 10b the canonical target site having a complementary sequence from the second to the eighth end of the corresponding sequence was examined for the top20 miRNA thus identified.
  • FIG. 3B median value 1292.5 sites, margin of error +/ ⁇ 706.62.
  • G U or G: A wobble nucleotide sequence in the starting nucleotide sequence of such microRNA.
  • G U or G: A wobble nucleotide sequence in the starting nucleotide sequence of such microRNA.
  • both the targets with G: A wobble (median 1119.5, error range +/- 526.48) and the targets with G: U wobble (median 995 site, error range +/- 523.22) were both control (median 891 Site, margin of error +/- 410.71), and particularly showed that the microRNA target site with G: A wobble is present about 1.1 times more than G: U wobble (FIG. 10B).
  • MiR-124 which is specifically expressed in brain tissue, has two Gs at the end and 4th and 5th from the 5 'end, thereby enabling G: U and G: A wobble sequences. 10c).
  • G A
  • G U wobble nucleotide sequence by G at this specific position was analyzed (Fig. 10d), the most common initiation target site (seed) of miR-124 was found (1,992). However, it was found that the fourth made G: U wobble (1,542), and then the G: A wobble (1,542). In addition, there were many target sites consisting of G: U wobbles (1,800) and G: A wobbles (1,198) in the fifth G, and all the sites surveyed in this way existed more than the number of controls (647). It could be confirmed (FIG. 10D).
  • microRNAs when recognizing target mRNAs via nucleotide sequences, allow for G: U or G: A wobble sequences as well as canonical nucleotide sequences through the nucleotides, in particular G: A It was found that the wobble sequence could bind to the target mRNA through this binding.
  • Target recognition of microRNAs through these G: A wobble bases is a novel result that has not been reported, and thus it can be seen that it is recognized as an irregular target in several microRNAs as observed in the above examples.
  • Example 11 Of microRNA Irregular target G: A Inset arrangement Site Aware mIRNA -GU development and miR -124 applied miR -124- Of G5U Confirmation of neuronal cell death increase effect
  • Example 10 it was found that the irregular target recognition of the microRNA may allow a G: A wobble sequence to the initiation sequence, which may be referred to as an irregular G: A initiation sequence site, and may be complementarily arranged.
  • the miRNA-GU sequence of the novel RNA interference inducing substance was invented as follows. Applying this sequencing technique to miR-124, miR-124 has an initiation sequence of 5'-AAGGCAC-3 'and the non-normal GA sequence initiation target is G: A at base 4 and G base at G: A, respectively.
  • Wobble nucleotide sequence is possible, and thus, when the G: A wobble sequence is replaced with the sequence of miRNA-GU, which is a form of replacing the existing complementary nucleotide sequence, miR-124-G4U (5'-AAUGCAC-3 '), Can be changed to miR-124-G5U (5'-AAGUCAC-3 ').
  • the modified miR-124-G4U and miR-124-G5U combine the irregular target sites that miR-124 weakly binds and recognizes in the form of G: A wobble arrays in a complementary arrangement. Can display the function of an irregular G: A initiation array target.
  • NT described as N2a in FIG. 11B
  • miR-124, miR-124-G4U, and miR-124-G5U were introduced into the neuroblastoma N2a as a control group according to the same method as in the previous example, and the shape of the cells was changed. Observation was performed while incubating for 72 hours (FIG. 11B).
  • the expression of miR-124-G-5U was confirmed to increase cell death more than two times compared to the control group (Fig. 11c), which was subdivided into early apoptosis or late apoptosis.
  • the miR-124-G-5U group was significantly increased in both early and late apoptosis groups compared to the miR-124 group. (FIG. 11D).
  • the experimental group to which miR-124-G-4U was delivered late apoptosis was significantly suppressed compared to the experimental group to which miR-124 was delivered (FIG. 11 c, d).
  • FIG. 11 b the expression of miR-124-G-5U was confirmed to increase cell death more than two times compared to the control group (Fig. 11c), which was subdivided into early apoptosis or late apoptosis.
  • the miR-124-G-5U group was significantly increased in both early and late apoptosis groups compared to the miR-124 group.
  • miR-124-regulated GAR initiation target inhibition by miR-124-GU was confirmed that the ability of neuronal differentiation induced by miR-124 disappears, but instead exhibits a different biological function, cell death regulation. .
  • miR-124-G4U loses neuronal cell differentiation capacity and does not show any function even in cell death, and thus cell division was examined.
  • control NT, miR-124, miR-124-G4U, miR-124-G5U were introduced into N2a, a neuroblastoma cell, respectively, in the same manner as in the previous example, and then flow cytometry for cell division proliferation phenomenon.
  • FIG. 12A the cells were treated using the Muse Ki67 Proliferation Kit (millipore's company) according to the experimental method provided by the manufacturer, and analyzed by cell division using the Muse 'Cell Analyzer (Milipore).
  • This method quantitatively analyzes the number of cells with increased cell division proliferation by measuring the number of cells stained with Ki67.
  • miR-124 is expressed in N2a cells, the cells differentiated as compared to the control NT, resulting in a decrease in the intensity of Ki67 staining.
  • the miR-124-G4U-delivered experimental group had slightly increased Ki67-stained cells from 61% to 65% compared to the control group (NT). In comparison, miR-14-G5U was no difference compared to the control group.
  • miR-124-G4U has a function of increasing cell division proliferation of neuroblasts among RNA interference-inducing modified sequences that inhibit miR-124 irregular GA array initiation targets.
  • Cardiomyocyte line in miR -1 initiates an irregular GA array target Can suppress gene expression Fluorescent Protein Check with reporter
  • Fluorescent protein expression reporter system is composed of two colors of fluorescent protein expressed in one vector, in which SV40 promoter expresses green fluorescent protein (GFP) and its 3'UTR (3'untranslated region) By arranging several target sites of microRNA in the region, it is possible to measure the gene suppression effect by microRNA through the intensity of green fluorescent protein, while at the same time red fluorescent protein (RFP) is a TK promoter The green fluorescence signal was normalized to the intensity of the green fluorescent signal (FIG. 13A, above).
  • GFP green fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • the fluorescent protein expression reporter vector thus constructed, a non-normal target site complementary to the bases from the 5 ′ end of the miR-1 to the 2nd to 8th bases, and to the 7th base, G; After the reporter was prepared by inserting (A-site) (GFP-7G: A site), it was experimentally confirmed whether it was inhibited by miR-1.
  • GFP-7G A site reporter vector and 25uM of miR-1 were co-transfected into cardiomyocyte H9c2 using lipofectamine 2000 (Invitrogen) reagent according to the protocol provided by the company. After 24 hours, each fluorescence signal was measured by flow cytometry through Attune NxT of Life Technologu.
  • the 7G A site of miR-1 was suppressed very efficiently by the expression of miR-1 (Fig. 13A, in the middle) compared with the cells into which the control nucleic acid (cont; NT) was introduced (Fig. 13A, left). Confirmed.
  • miR-1 was introduced into the control nucleic acid. the decrease in the case where the introduction of more than 3 of the 10 century, red fluorescent protein and 10 3rd century the cellular distribution of the visible green fluorescent protein 59.51% (control:: Q5-3) 41.80% (Q5-3 miR-1) from Was observed.
  • GFP-7G A site reporter vector was suppressed to some extent in h9c2 cells without the introduction of miR-1. This can be expected to be inhibited via G; A wobble nucleotide sequence with reporter target mRNA by miR-1 already expressed in h9c2 cells.
  • miRIDIAN microRNA Hairpin inhibitor (miR-1 inhibitor, FIG. 13A, right), which can inhibit the expression of miR-1 in h9c2 cells, was purchased from Dharmacon and transfected into cells at a concentration of 50 uM. It was.
  • miR-1 inhibitor Q5-3
  • control group without the microRNA target site in the fluorescent protein expression reporter and GFP-7G: A site, which is a reporter containing the 7G: A site of miR-1, were introduced into H9c2 cells to compare their activities.
  • GFP-7G A site, which is a reporter containing the 7G: A site of miR-1
  • RFP red fluorescent protein
  • GFP green fluorescent protein
  • the reporter experiment was performed by inserting the miR-1-7G; A sequence 5 times in the 3 'UTR portion of the red fluorescent protein (RFP) controlled by the SV40 promoter in the p.UTA.3.0 vector and then reporting The vector (RFP-7G: A site) was constructed and the red fluorescent protein expression level was standardized by reflecting the level of green fluorescent protein (GFP) expressed by the Tk promoter. Modified and used (FIG. 13C, above).
  • the 7G; A site of miR-1 was inhibited by miR-1 expressed in h9c2, and the control group of the reporter without the miRNA target site (RFP-no site) and 7G of miR-1;
  • the results of the reporter containing the A site (RFP-7G: A site) were compared and confirmed.
  • the positive control group observed the same phenomenon as the previous example in co-transfection with miR-1 (FIG. 4C-D).
  • the non-normal target of the microRNA found through the Ago HITS-CLIP analysis can not only bind through the G: A wobble sequence in the initiation sequence of the microRNA, but also inhibit the expression of the target gene. Confirmed.
  • a wobble array can be sufficiently combined with the microRNA, and if this point can be induced historically through miRNA-GU, it may be necessary to It is thought that only the biological function of the microRNA can be utilized.
  • This non-regular gene suppression phenomenon is miR-1 of the cardiomyocytes described in the previous example to confirm the possibility that the G: A wobble sequence can act as an atypical target of the microRNA, and may regulate biological function through miRNA-GU. The experiment was carried out mainly.
  • miR-1 should not recognize a regular target but only the non-normal G: A wobble array target site.
  • primary rat myocardial cells primary rat neonatal cardiomyocyte culture
  • cardiomyocytes were 10% FBS (fetal bovine serum), 5% HS.
  • brdU was added to a medium prepared by mixing Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) and M199 (WellGene) medium at 4: 1 supplemented with horse serum, 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml steptomycin. Cultures were distinguished from other cells having a cell cycle present in the tissue.
  • cardiomyocytes are characterized by stopping the cell cycle and increasing the size of myocardial cells, which is called myocardial hypertrophy.
  • Myocardial hypertrophy is a cardiac disease model system that has played a role in compensating myocardial cell function, is also known as an intermediate pathology of heart disease, and is well known for changes in cell morphology and gene expression profiles.
  • cardiomyocytes can be induced with an adrenal receptor agonist such as phenylephrine (PE) (Molkentin, JD et al, 1998, Cell 93 (2), 215-228).
  • PE phenylephrine
  • the cultured cardiomyocytes were treated with 100 uM of phenylephrine to induce myocardial hypertrophy, thereby morphologically confirming that the size of the cardiomyocytes was increased compared to the control group (FIG. 6A, rCMC) which had not been treated with anything. (FIG. 14A, + PE).
  • the size of the cardiomyocytes was observed to be reduced (FIG. 14A, upper right row).
  • miR-1 contains three Gs at the initiation region, and thus miR-1 is substituted with U in order to recognize only irregular G: A wobble array target sites without recognition of regular targets.
  • the design was applied to the 2nd position (miR-1-G2U), the 3rd position (miR-1-G3U), and the 7th position (miR-1-G7U) based on the position of G '. Synthesized. At this time, the substitution base sequence of miR-1 used in FIG.
  • the non-normal target inhibited by the G: A wobble configuration in the microRNA initiation region may have a biological function different from the conventional normal target recognition.
  • Example 15 myocardial cell line ( H9c2 )in miR -133- G4U Through expression Cardiac hypertrophy Induction observation
  • a wobble sequence acts on the end of the microRNA, it additionally functions in cardiomyocytes in addition to miR-1, as discussed in the previous example, to confirm its biological function in cardiomyocytes.
  • the miRNA-GU was applied to miR-133, which is known to be. miR-133 regulates myocyte development and disease pathology and is known to have myocardial hypertrophy (Nat Med. 2007, 13 (5): 613-618; Ikeda S et al, Mol cell boil, 2009, vol29, 2193-2204).
  • miR-133-G4U (5'-UUUUGUCCCCUUCAACCAGCUG-3 '), which is an interference-inducing nucleic acid that specifically inhibits target recognition through the fourth G of the 5' end of the irregular GA array target site of miR-133.
  • RNAiMAX reagent Invitrogen
  • FIG. 15A expression of miR-133-G4U increased the size of H9c2 cells compared to the control group (NT) (FIG. 15A), and quantitatively analyzed the size of 100 or more cells through the Image J (NIH) program. , It was confirmed that about 2 times increased significantly (Fig. 15b).
  • hypomorphic GA sequence initiation target expression degradation of miR-133 caused by miR-133-G4U induces cardiac hypertrophy, inferring that it is a new function different from the normal initiation target inhibition function of miR-133 that inhibits cardiac hypertrophy. can do.
  • MiR-122 that expresses and functions specifically in liver cancer or liver tissues has a 2, 3, or 5, terminal basis based on its initiation sequence (5 'initiation base 1-8 bases: 5'- UGG AGU GU-3')
  • the fifth, fifth, and seventh G's have a G: A wobble array. Therefore, first of all, in order to measure the inhibition efficiency of the corresponding target site that the second G can be recognized irregularly through the G: A wobble configuration, the IC50 (Inhibitory concentration 50) method was performed in the same manner as in Example 2. ) was measured and compared with the normal initiation site (Fig. 16a).
  • the luciferase reporter vector for performing the experiment was subjected to a nonnormalization of the G base of miRNA-122.
  • the GA sequence initiation site (2G: A) sequence (5 'base of bases 1-9: 5'-CAC ACU CAA-3') is 3 'of the Renilla luciferase gene in the psi-check2 (Promega) vector.
  • the UTR (3'untranslated region) was prepared by introducing five consecutive arrays.
  • the luciferase reporter vector for the normal initiation site bases 1-9 of the 5 'initiation: 5'-CAC ACU CCA-3' was also identically produced.
  • the target gene having a normalized seed site and a non-normal GA arraying site (2G: A site) through the second G at the 5 'end at various concentrations of miR-122 was obtained.
  • the inhibition of expression was measured by the change in the activity of the corresponding luciferase reporter and the value of IC50 (inhibitory concentration 50) showed that miR-122 was approximately 0.5 nM for the normal initiation target site, and the irregular GA array initiation site (2G: A site) was measured at about 7nM, and miR-122 inhibited the expression of genes having a non-regular GA sequence initiation site (2G: A site), and its efficiency was lower than that of normal initiation site. (FIG. 16A).
  • This experiment synthesizes duplexes of miR-122 by the same method used in the above examples, and uses the Lipofectamine 2000 reagent with the corresponding psi-check2 vector (50 ng) at various concentrations (0, 1, 5, 10, 25 nM).
  • (Invitrogen) was co-transfected into approximately 10,000 hepatocellular carcinoma cell lines (Huh7, KCLB: 60104) ⁇ according to the manufacturer's protocol, and incubated in 96 wells. Lucifer was performed in the same manner as in Example 2. Laze activity was measured and performed.
  • Huh7 cell line which is a hepatic cancer cell with miR-122, is used to confirm that it is equally regulated by miR-122 present in the cell. Luciferase reporter experiments were performed on the irregular GA arraying initiation site (2G: A) caused by the 2nd G and the 3rd G on the 5 'end (Fig. 16b).
  • miR-122 the expression inhibitor of miR-122 (hsa-miR-122-5p inhibitor, IH-300591-06-0010) was purchased from Damacon Corporation and treated with 50 nM. At this time, it was confirmed that all such suppression phenomenon disappeared.
  • miR-122 was found to be able to inhibit the expression of the 2nd non-regular GA sequence initiation target on the 5 'end, although weaker than the normal initiation site, and also naturally in Huh7, a liver cancer cell.
  • Existing miR-122 inhibited the expression of the 3rd non-regular GA sequence initiation target gene on the 5 'end and the 2,3 non-regular GA sequence initiation target gene.
  • the inhibitory effect made in Huh7, a hepatic cancer cell is controlled by miR-122 by disappearing by expression inhibitor treatment of miR-122 (FIG. 16B).
  • miR-122 has a regulatory function of inhibiting the expression of the non-regular GA sequence initiation target gene.
  • MiRNA-GU was synthesized into the corresponding sequence and introduced into hepG2 cells by the same method as in the above example, and after 24 hours of incubation, scratches were applied to the cell layer using a 1000ul tip. The cells were cultured for up to 48 hours, and the movement of cells in each experimental group was observed by comparison with the introduction of NT-6pi as a control group.
  • the sequence of the interference-inducing nucleic acid used in the experiment is as follows (miR-122: 5 '-UG GAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3'; miR-122-G2U: 5 '-UU GAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3 '; miR-122-G3U: 5'-UG UAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3 '; miR-122-G2,3U: 5'-UU UAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3 ').
  • the quantitative analysis was carried out by observing the cell migration of miR-122 in the form of cells, and then analyzed the observation results by using the Image J program (NIH).
  • NIH Image J program
  • cell migration inhibition function could not be observed by miR-122-G3U (Fig. 17C-D).
  • the percentage of cells with G0 / G1 distribution increased from an average of 52% of the control group (NP-6pi) to 68%, and the cell distribution of the G2 / M phase was significantly lower. (FIG. 18).
  • miR-122, miR-122-G2U, miR-122-G3U did not observe a significant difference compared to the control.
  • the cell cycle assay was performed by transferring the synthesized siRNA duplex to HepG at a concentration of 50 nM, incubating for 24 hours, and using a Muse Cell Cycle Kit (Catalog No. MCH100106, Milipore) according to a protocol provided by the company. Experiments were performed and measured with a Muse Cell Analyzer (Milipore).
  • miR-122-G2,3U has a function of inhibiting the migration of hepatocytes, in particular the expression of miR-122-G2,3U Inhibition of the cell migration induced by the effect of maximizing the function of G base No. 3 when the regulatory effect of G base is added to the biological function of the regulation of non-regular GA sequence initiation of G base No. 2 (Fig. 17).
  • miR-122-G7U, miR-122-G3,7U, miR-122 Experiments were conducted to further confirm cell cycle regulation function of -G2,7U siRNA.
  • hepG2 a liver cancer cell line
  • hepG2 a liver cancer cell line
  • nocodazole was treated at 100ng / ml for 16 hours to synchronize HepG2 cells with G2 / M (dividing prep / division phase), and then how many The amount of cells in cell cycle arrest at G0 / G1 was measured with a Muse Cell Analyzer (Milipore) flow cytometer as cells stopped at G2 / M (FIG. 19).
  • miR-122-G2U showed no difference in cell count in G0 / G1, which is cell cycle stationary, compared to NT-6pi, but miR-122-G2,3U siRNA, miR-122-G2,7U.
  • G0 / G1 the ratio of cell cycle stationary state
  • Fig. 19a the ratio of cell cycle stationary state
  • the experimental group delivered miR-122-G2,3U siRNA increased the rate of cell cycle arrest (G0 / G1) more than about 2 times compared to the control group, followed by miR-122-G2, In the 7U experimental group, it was observed that the ratio of the cell cycle stationary state (G0 / G1) was about 1.5 times higher (FIG. 19B).
  • the cell cycle arrest state can be increased through the regulation of the irregular GA sequence initiation target by miR-122-G2,3U siRNA and miR-122-G2,7U siRNA.
  • let-7a- G2U irregular by let-7a-G2,4U GA array Induction of cell cycle arrest induced by initiation target regulation
  • a representative microRNA that acts as a tumor suppressor is the let-7 family. It is reported that the function of regulating the developmental process of the pretty little nematode (Nature, 2000, 403 (6772): 901-906), then suppressed expression in various cancer cells (Cancer Res., 2004, 64 (11): 3753- 3756) and anticancer function through control of tumorigenesis (Cell, 2005, 120 (5): 635-647; Genes Dev. 2007, 21 (9): 1025-1030), It has been studied as an important gene with the possibility of cancer diagnosis and anticancer drug development. In this regard, the present inventors conducted an experiment to investigate the biological function induced by the inhibition of let-7's non-normal GA array initiation target.
  • the starting sequence from the 1st to 9th 5 'terminal of let-7a is 5'-UGA GGU AGU-3', and the G which is capable of G:
  • a wobble sequence is 2nd, 4th, 5th, 8th
  • the present inventors pay attention to the second and fourth G among them, modified them with miRNA-GU, synthesized them, and introduced them into HepG2 cells, which are liver cancer cell lines, and then, how the cell cycle was affected in Example 19 was carried out. The experiment was carried out in the same manner.
  • let-7a 5'- U GAG GUA GUA GGU UGU AUA G UU-3 '
  • let-7a-G2U 5'-U UAG GUA GUA GGU UGU AUA G UU-3 '
  • let-7a-G4U 5'-U GAU GUA GUA GGU UGU AGU G UU-3 '
  • let-7a-G2,4U 5'- U UAU GUA GUA GGU UGU AUA G UU -3 '
  • let-7a did not show any difference compared to the control group NT-6pi, but let-7a-G2U and let-7a-G2,4U increased the cell cycle arrest state at G0 / G1, let-7-G4U was observed to increase the amount of cells in G2 / M rather than to quickly cycle the cell cycle (FIG. 20A). Quantifying this in four replicates, the let-7a-G2U experimental group showed a 1.5-fold increase in the distribution of G1 / G0 cells compared to the control group (Nt-6pi), and a decrease in the distribution of G2 / M cells. Was observed (Figure 20b).
  • let-7a's second non-regular GA sequence initiation target was confirmed to induce cell cycle arrest of HepG2 cells.
  • the single GA sequence (let-7a-G4U) proceeds rapidly to the G2 / M state while reducing the induction of cell cycle arrest of HepG2.
  • Sol drug treatment resulted in high cell numbers.
  • HepG2 induced cell cycle arrest. This cell cycle arrest was not observed in HepG2 cells to which let-7a was delivered (FIG. 20 b).
  • let-7 serves to promote cancer cell cycle arrest by inhibiting the gene of the non-regular GA initiation sequence through G at the 5 ′ end 2, more preferably at the 5 ′ end 2 It can be seen that the effect is greatest when G and G number 4 work together in a G; A wobble arrangement.
  • the non-regular GA initiation site through let-7's 5 ′ end G is likely to promote cancer cell proliferation, leading to cancer cell proliferation.
  • induced pluripotent stem cells Differentiated cells can regain their differentiation ability by artificial expression of several transcription factors.
  • embryonic cells the cells that acquire omnipotent differentiation capacity such as embryonic cells are called induced pluripotent stem cells.
  • This technique introduces four factors (Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, Klf4) into mouse embryonic fibroblasts (MEM), and induces pluripotent stem cells (iPS) with differentiation diversity like stem cells.
  • induced pluripotent stem cells can be produced by delivering four factors (OCT4, SOX2, NANOG, and LIN28) to human somatic cells (Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920).
  • OCT4, SOX2, NANOG, and LIN28 factors that can generate regeneration potential through any cell including human cells through dedifferentiation process, and after the first discovery, induced pluripotent stem cell generation. Efforts have been made to increase efficiency.
  • MicroRNA-induced pluripotent stem cells reported as part of this method, also efficiently induce pluripotency, and microRNAs such as miR-302a and miR-372 are used alone or in four factors (Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, Klf4) has been reported to function to dedifferentiate cells (RNA, 2008 14 (10): 2115-2124; Nat Biotechnol. 2011, 29 (5): 443-448). Therefore, the present inventors conducted an experiment to determine whether inhibition of the expression of miR-302a and miR-372 atypical GA sequence initiation targets can promote the process of dedifferentiating cells.
  • a plasmid containing an Oct4 promoter reported to be activated in stem cells and a green fluorescent protein expressed depending thereon was purchased (Addgene # 21319) (FIG. 21 a).
  • the Oct4 expression reporter vector pOct4: GFP
  • the green fluorescent protein was not expressed, but when the cell was reversed to obtain differentiation ability, the green fluorescent protein was expressed in the Oct4 expression reporter. Will be.
  • miR-302a and miR-372 which are microRNAs known to cause reverse differentiation with such Oct4 expression reporter vectors.
  • the 2nd to 8th sequences based on the 5 'end of the miR-302a and miR-372 start sequences are "AA GUG CU", and thus, the irregular GA sequence starts through the 4th and 6th G based on the 5' end.
  • the inventors carried out the experiment by synthesizing miR-302-G4U and miR-372-G4U by paying attention to the fourth G.
  • the experiment was performed by delivering Oct4 expression reporter vector (pOct4: GFP) to HeLa cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) reagent according to the manufacturer's protocol, followed by guide strands according to human miR-302 and miR-372 sequences, Carrier strands were synthesized in Bioneer as in Example, prepared as duplexes, and delivered sequentially at 50 nM concentration using RNAimax (Invitrogen) reagent.
  • the preparation of non-regular GA sequence initiation target specific siRNA of miR-302 and miR-372 was prepared in the same manner as in the above example by substituting U in the end G base, and delivered to the cells at a concentration of 50 nM.
  • the base sequence of the nucleic acid used therein is as follows (miR-302: 5'- UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA-3 '; miR-302-4GU: 5'- UAAUUGCUU CCAUGUUUUGGUGA-3'; miR-302 transport strand: 5'- ACUUAAACGUGGAUGUACUUGCU- 3 ′; miR-372: 5′-AAAGUGCUGCG ACAUUUGAGCGU-3 ′; miR-372-G4U: 5′-AAAUUGC UGCGACA UUUGAGCGU-3 ′, miR-372 Transport Strand: 5′-CCUCAAAUGUGGAGCACUAUUCU-3 ′).
  • the HeLa cells incorporating the reporter vector and RNA were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml steptomycin for 14 days. In the transfection, cells were cultured in a complete medium without antibiotics.
  • miR-372-G4U and miR-302a-G4U express only existing miR-372 and miR-302 alone to promote cell dedifferentiation more efficiently than causing cell dedifferentiation. It can be seen that miR-372-G4U and miR-302a-G4U can be used as a material to promote the reverse differentiation of cells.
  • the nonnuclear nucleus target exhibits a novel biological function that is completely different from the normal initiation target, and thus invents miRNA-BS, an RNA interference-inducing nucleic acid that only regulates the inhibition of expression of the nonnuclear nucleus target, and confirms its function. It was. However, in the case of miRNA-BS, the initiation sequence was changed to complementarily arrange the irregular nuclear ridge site of the existing miRNA, but the new initiation site was confirmed through the changed initiation sequence. Therefore, it has been found that an RNA interference inducing nucleic acid such as miRNA-BS recognizes only a normal starting sequence and a technology that does not recognize an irregular nuclear ridge site.
  • the inventors of the present invention is important for the base sequence of the base position of the 6 'position 5' in order to make a non-normal nuclear fusion, the degree of non-nuclear fusion occurs depending on the sequence intensity of the base sequence at the 6 position Note that it can be, in order to reduce the intensity of the nucleotide sequence at position 6, the following experiment was carried out. That is, a methyl group (2 'OMe) is put in the 2' position of the ribosil ring of nucleotide 6 of miR-124, and the modified interference-inducing nucleic acid (miR-124-6me) is a non-normal nuclear fusion target of miR-124. The inhibition function was observed by the luciferase reporter experiment.
  • 2'OMe modified miR-124 was prepared through synthesis (Bionia), and the luciferase reporter experiment was carried out in the same manner as in the previous Example 2 and the gene inhibition efficiency was measured by IC50 (FIG. 22A). .
  • the luciferase reporter vector used at this time was used for the normal initiation site of the miR-124 (Luc-seed) and the irregular nucleation site (Luc-nucleation bulge).
  • the irregular bump by miR-1 was the same as the result of the previous miR-124.
  • the target gene inhibition effect disappeared, whereas the inhibition of gene expression through the normal initiation site was confirmed to be excellent IC50 value of 0.7nM.
  • the 2'OMe modification is applied to the 6th 5 'end of the nucleic acid inducing RNA interference, the expression suppression effect of the normal initiation target gene induced by the RNA interference inducing nucleic acid is maintained, Inhibition of the expression of the irregular nuclear target gene was confirmed to disappear.
  • Example 22 when the 2'OM modification is applied to the 6th nucleotide of miR-1 (miR-1-6me), the expression suppression effect of the normal initiation target gene is maintained, and the expression inhibition of the irregular nuclear ridge target gene is It was confirmed that the decrease. Therefore, the present inventors confirmed that miR-1-6me reduced the inhibitory function of the miR-1 non-regulated target gene in the transcript of h9c2, a cardiomyocyte cell line in which all genes related to miR-1 function were actually expressed. To this end, RNA-Seq analysis was performed after introducing miR-1 and miR-1-6me into h9c2 cells.
  • RNA-Seq experiment was carried out using an example in which the 5'-terminal 6 was converted to a non-base (NT-6pi) in the sequence of cel-miR-67, a microRNA of C. elegans, as an experimental control. The experiment was performed in the same manner as in 7.
  • the RNA-Seq library was prepared using Lexogen's SENSE Total RNA-Seq Library Kit, and then sequenced using Illumina's MiniSeq.
  • the FASTAQ file which is the sequence data obtained in the above experiment, was mapped to the mouse genome sequence (rn6) using the TopHat2 program, the expression value (FPKM) was obtained using the Cufflink and Cuffdiff programs, and the h9c2 cells into which the control NT-6pi was introduced. The results were normalized and expressed as a log change (Fold change, log2 ratio).
  • the normal initiation site of miR-1 (2 to 8 based on the 5 'end) Genes in the 3′UTR were selected from the first and the base sequence of 7mer), and the results of these profiles were compared and analyzed in cumulative fractions in the order of being inhibited depending on the expression of the corresponding microRNAs (FIG. 23A). .
  • both miR-1 and miR-1-6me can suppress the gene having the normal initiation site of miR-1 at 3'UTR compared to the distribution of total mRNA. .
  • the non-regular ridge site of miR-1 (nuc, 7mer) was analyzed in cumulative proportions for genes having 3'UTR in the same manner, and miR-1-6me was used for miR-1-6me irregular nuclear ridge target genes. It was compared with the amount of the corresponding target mRNA in the miR-1 introduced cells and miR-1-6me introduced cells to see whether the inhibition of expression was reduced (FIG. 23B). As a result, it was observed that miR-1 still significantly inhibits the non-normal nuclear target gene relative to the total gene (total mRNA) compared with expression in miR-1-6me. In 6me, it was confirmed that the suppression of expression of the non-normal nuclear ridge target gene was reduced.
  • the existing microRNA at the transcript level effectively suppresses the non-normal raised target gene together with the existing normal initiation target gene, but adds 2'OMe modification to the 6th nucleotide. It was found that the microRNA (miRNA-6me) still inhibited the normal initiation target gene, but not the irregular ridge target gene.
  • the 2'OMe modifications applied at the 6th end of the 5 'end may be applied to miRNA-BS to maintain the original intention of specifically inhibiting only the nonnuclear nucleus site of the miRNA, while newly emerging nonnuclear nucleus bonds may By eliminating it completely, the side effects can be minimized.
  • microRNAs to which the invention can be applied which enables microRNAs to recognize and suppress only non-nuclear nucleus sites
  • Ago HITS CLIP experiments a method that can analyze microRNA targets at the transcript level.
  • the microRNAs bound to the nonnuclear nucleus site were analyzed.
  • the Ago HITS-CLIP data performed in the cerebral cortex of mice 13 days old (p13) were sequenced in the same manner as in Example 10. It was confirmed that the binding to the target mRNA and the irregular nuclear ridge site (Fig. 24a). Therefore, the microRNA (Fig. 24B) can bind to the target mRNA through the nucleus site irregularly as well as the normal nucleotide sequence through the nucleotide when the target mRNA is recognized through the nucleotide sequence of the end could know.
  • microRNAs that bind to the irregular ridge targets in various tissue cells were identified, and when the present invention was applied to modify the non-nuclear ridge site to be recognized as a normal initiation site, A total of 426 BS sequences were generated, thus completing a technique that showed only the non-normal target inhibition function of the microRNA.
  • Example 25 cancer patients MicroRNA Sequencing Database ( TCGA ) Analyze the sequence variation and thereby G: A Wobble Inset arrangement On the site Combined Of microRNA Sympathy
  • sequence to recognize the irregular G A wobble site as a normal initiation site in the present invention.
  • miRNA-BS microRNA sequence conversion scheme
  • the frequency of mutations was divided by microRNA 5 'end position, and the distribution of 10,000 most frequently occurring mutations (top 10000) and 10,000 less likely mutations (bottom 10000) was examined.
  • FIG. 25B it was observed that in 10,000 cases, the most frequently occurring mutation occurred mainly at the initiation portion (between 2nd and 8th) of the microRNA.
  • FIG. 25C it could be seen that the mutations were concentrated in the same area as in the above example.
  • the sequence variation of the tumor microRNA showing a tendency in the incidence is reverse transcribed and sequenced with DNA, and the G is formed only in the initiation sequence when it is divided into A, T, C, and G as the base composition. Tendency to become (FIG. 25D). This tendency was again confirmed not only for the top 100 mutation rates but also in all cases where mutations occurred beyond this (FIG. 25E).
  • mutant microRNAs that recognized non-regular G: A wobble-initiated targets as regular targets in several cancer patients, thereby recognizing the non-normal G: A wobble-initiated sites as normal initiation sites.
  • the application of the modified invention resulted in a total of 335 sequences (G> U) (Table 4), thus completing a technique that only represents the non-normal target inhibition function of the microRNA.
  • RNA interference-inducing nucleic acid By using the RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention, it is possible to efficiently increase the biological function of the microRNA by suppressing the irregular target gene, or to suppress some of the functions of the existing microRNA, that is, the biological function of the abnormal target gene. It has the effect of selectively displaying only the function, the cell cycle, differentiation, dedifferentiation, morphology, migration, division, proliferation or death can be controlled through the interference-inducing nucleic acid of the present invention, it can be used in various fields such as drugs, cosmetics It is expected.

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Abstract

본 발명은 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산에 관한 것으로, 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 마이크로RNA가 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적인 기능을 효율적으로 증대하거나, 기존의 마이크로RNA가 나타내는 기능 중 일부, 즉 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적 기능만 선택적으로 나타내는 효과를 가지며, 본 발명의 간섭 유도 핵산을 통해 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절이 가능한바, 약물, 화장품 등 다양한 분야에서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

마이크로RNA의 비정규 표적을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산 및 그 용도
본 발명은 유전자 발현을 저해하는 RNA 간섭 유도 핵산 및 그 용도에 관한 것으로, 마이크로RNA의 비정규 표적을 선택적으로 억제함으로써 발휘되는 유용한 효과를 갖는 간섭 유도 핵산 및 그 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2018년 5월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2018-0063054호, 2018년 5월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2018-0063055호, 2019년 5월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0064333호, 2019년 5월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0064334호, 2019년 5월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0064335호, 및 2019년 5월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0064386호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
RNA 간섭(RNA interference)은 전사후 단계에서 유전자의 발현을 억제하는 현상을 말한다. 자연적으로 존재하는 RNA 간섭 현상은 마이크로RNA(micro RNA, miRNA)에 의해서 일어난다. 마이크로RNA는 18-25개의 염기로 구성되어 있으며, 그 중 대부분은 약 21개의 염기로 구성되는 작은 RNA로서, 아고너트(Argonaute) 단백질을 통해 표적이 되는 유전자의 전령RNA (mRNAs)와 상보적 염기 배열을 한다. 동물 마이크로RNA의 경우, 아고너트 단백질과 결합해 표적이 되는 전령RNA와 부분적인 염기배열을 하게 되는데, 이때 마이크로RNA의 5' 말단 기준 1번째부터 8번째까지의 핵산으로 정의되는 발단 지역(seed region)에서 최소한 6개 이상의 연속적인 염기 배열을 할 경우 표적으로 인식하고, 가장 중요하게는 최소한 5'말단 기준 2번째부터 7번째까지의 6개의 염기배열로 연속적으로 표적 전령RNA와 결합했을 경우에 충분히 해당 표적 전령RNA를 분해하거나 번역(translation)이 되는 것을 억제하여 그 발현을 저해한다 (Lewis BP, et.al, 2003, Cell, 115 (7), 787-98). 이렇게 마이크로RNA가 부분적인 염기 배열을 통해 표적 유전자의 전령RNA를 인식하기 때문에, 한개의 마이크로RNA는 보통 수 백개에서 수 천개의 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다.
마이크로RNA의 표적 유전자 발현 저해 작용은 유전자 발현의 중요한 기전의 하나로서 정상상황에서는 세포의 분화와 성장에 관여하고, 기능에 이상이 있을 때는 암 및 퇴행성 질환, 당뇨병 등을 유발하게 되어 생명 현상의 열쇠로 주목받고 있다. 따라서, 마이크로RNA의 유전자 발현 저해 작용을 인위적으로 유도하기 위해, 마이크로RNA의 발단 지역을 포함하는 RNA 간섭 소재(siRNA 또는 shRNA)를 디자인하여 세포 안으로 도입함으로써 인위적으로 세포를 분화시키거나 기능을 바꾸고, 경우에 따라 질병 치료제로 사용하기도 한다. 그러므로, 아고너트로 매개되어 표적 전령RNA를 인식하게 되는 마이크로RNA 발단 지역에서의 상보적 염기 배열은 마이크로RNA를 포함하는 RNA 간섭 소재가 기능을 발휘함에 있어 중요하다. 특히, 이러한 RNA 간섭 소재를 활용하기 위해서는, 각각의 마이크로RNA의 기능을 파악하는 것이 요구되며, 이 때 마이크로RNA의 기능은 어떠한 표적 유전자를 억제하는지에 따라 결정되므로, 마이크로RNA의 전체 표적 유전자(표적체)에 대한 분석이 필요하게 되었다.
전사체적 수준에서, 마이크로RNA 표적체에 대한 연구는 본 발명자에 의해 Ago HITS-CLIP (또는 CLIP-Seq이라 불림) 실험을 통해 처음으로 수행되었다. Ago HITS CLIP 실험 방법은 세포나 조직 샘플에 UV를 조사하여 세포 내에서 RNA와 아고너트 단백질 (Argonaute; Ago) 사이에 공유결합을 통한 복합체를 형성하게 하고, 이러한 RNA-아고너트 복합체를 아고너트 특이적 인식 항체를 이용하여 면역침강법으로 분리한 다음, 분리된 RNA를 차세대염기서열 (Next-generation sequencing)로 분석하는 방법이다. 이를 통해서 아고너트에 결합한 마이크로RNA와, 상보적 염기 배열하는 표적 전령RNA군과 그 위치를 정확하게 분석할 수 있다 (Chi S et al, Nature, 2009, 460 (7254): 479-86).
그 결과, 본 발명자들은 마이크로RNA가 표적 전령RNA와 결합할 때 마이크로RNA 발단 지역(seed region)과 정확히 상보관계가 아니더라도 결합하는 경우가 있다는 것을 밝혀냈다. 보다 구체적으로, 마이크로RNA의 5' 말단 기준 1번째부터 8번째 염기 서열로 정의되는 마이크로RNA 발단 지역(seed region)이 최소한 6개 이상의 연속적이고 완벽한 염기 서열의 배열로 전령RNA와 결합하는 것, 특히 그중 가장 중요하게는 5'말단 기준 2번째에서 7번째까지의 염기 배열로 결합하는 것을 정규 표적 인식(canonical target recognition)이라고 하고, 상술한 규칙에서 벗어나, 마이크로RNA 발단 지역(seed region)과 연속적이고 정확한 상보서열 관계가 아니더라도 마이크로RNA의 표적으로 인식하고 결합하는 것을 비정규 표적 인식(non-canonical target recognition)이라 한다. Ago HITS-CLIP 분석 결과에 따르면 마이크로RNA가 발단 지역을 통해 비정규적으로 표적을 인식하는 빈도는 정규적으로 인식하는 빈도의 약 50%에 이를 정도로 빈번히 나타남을 알 수 있다.
따라서, 기존의 마이크로RNA의 발단 지역의 서열을 포함하도록 디자인된 RNA 간섭 소재(예컨대, siRNA 또는 shRNA)는 정규 표적 유전자뿐만 아니라 여러 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 생물학적 기능이 나타나는 것임을 알 수 있다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 기존의 마이크로RNA의 발단 지역의 서열을 그대로 포함하여 디자인된 RNA 간섭 소재가 가지는 한계를 해결하고 효율을 증대하기 위한 것이다.
보다 구체적으로, 기존의 마이크로RNA의 발단 지역의 서열을 그대로 포함하여 디자인된 RNA 간섭 소재는 정규 표적 유전자와 비정규 표적 유전자 모두를 억제하되, 정규 표적 유전자는 강하게 억제하지만 그에 비해 비정규 표적 유전자는 매우 약하게 억제한다. 따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 기존의 마이크로RNA가 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적인 기능을 효율적으로 증대하거나, 기존의 마이크로RNA가 나타내는 기능 중 일부, 즉 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적 기능만 선택적으로 나타내는 효과를 갖는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공하기 위한 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
보다 구체적으로,
본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA에서 표적 전령RNA와 결합에서 가장 중요하게 작용하는 부위인 5'말단 기준 2번째에서 7번째까지의 염기 서열을 기준으로 하여, 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하고, 또는
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 또는 아데닌(Adenine)으로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 해당 부위의 G:A 또는 G:U 워블 배열이 U:A 또는 A:U의 정규적인 염기 배열이 되게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 특정 마이크로RNA는 miR-124, miR-155, miR-122, miR-1, let-7, miR-133, miR-302 및 miR-372로 이루어진 군에서 선택되어 동일한 발단서열을 가지면서 18-24개의 염기로 구성된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단 2번째에서 7번째 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다:
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-AA GGC C-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-124-BS) (서열번호 1);
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로 5'-GG AGU U-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-122-BS) (서열번호 2);
miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UA AUG G-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-155-BS) (서열번호 3); 또는
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-GG AAU U-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-1-BS) (서열번호 4).
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상으로 나타내는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다:
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UAA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3‘ 의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-124-BS) (서열번호 5);
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로 5'-UGG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-122-BS) (서열번호 6);
miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UUA AUG GCU AAU CGU GAU AGG-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-155-BS) (서열번호 7); 또는
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UGG AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-1-BS) (서열번호 8).
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다:
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 5'-UAA UGC ACG-3' (miR-124-G4U) (서열번호 9), 5'-UAA GUC ACG-3' (miR-124-G5U) (서열번호 10) 또는 5'-UAA UUC ACG-3' (miR-124-G4,5U) (서열번호 11)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 5'-UUG AAU GUA-3' (miR-1-G2U) (서열번호 12), 5'-UGU AAU GUA-3' (miR-1-G3U) (서열번호 13), 5'-UGG AAU UUA-3' (miR-1-G7U) (서열번호 14), 5'-UUU AAU GUA-3' (miR-1-G2,3U) (서열번호 15), 5'-UGU AAU UUA-3' (miR-1-G3,7U) (서열번호 16), 5'-UUG AAU UUA-3' (miR-1-G2,7U) (서열번호 17) 또는 5'-UUU AAU UUA-3' (miR-1-G2,3,7U) (서열번호 18)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
5'-UUG AGU GUG-3' (miR-122-G2U) (서열번호 19), 5'-UGU AGU GUG-3' (miR-122-G3U) (서열번호 20), 5'-UGG AUU GUG-3' (miR-122-G5U) (서열번호 21), 5'-UGG AGU UUG-3' (miR-122-G7U) (서열번호 22), 5'-UGG AGU GUU-3' (miR-122-G9U) (서열번호 23), 5'-UUU AGU GUG-3' (miR-122-G2,3U) (서열번호 24), 5'-UUG AUU GUG-3' (miR-122-G2,5U) (서열번호 25), 5'-UUG AGU UUG-3' (miR-122-G2,7U) (서열번호 26), 5'-UUG AGU GUU-3' (miR-122-G2,9U) (서열번호 27), 5'-UGU AUU GUG-3' (miR-122-G3,5U) (서열번호 28), 5'-UGU AGU UUG-3' (miR-122-G3,7U) (서열번호 29), 5'-UGU AGU GUU-3' (miR-122-G3,9U) (서열번호 30), 5'-UGG AUU UUG-3' (miR-122-G5,7U) (서열번호 31), 5'-UGG AUU GUU-3' (miR-122-G5,9U) (서열번호 32), 또는 5'-UGG AGU UUU-3 (miR-122-G7,9U) (서열번호 33)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산으로, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 5'-UUG AGU GUG-3' (miR-122-G2U) (서열번호 19), 5'-UGU AGU GUG-3' (miR-122-G3U) (서열번호 20), 5'-UGG AUU GUG-3' (miR-122-G5U) (서열번호 21), 5'-UGG AGU UUG-3' (miR-122-G7U) (서열번호 22), 5'-UUU AGU GUG-3' (miR-122-G2,3U) (서열번호 24), 5'-UUG AUU GUG-3' (miR-122-G2,5U) (서열번호 25), 5'-UUG AGU UUG-3' (miR-122-G2,7U) (서열번호 26), 5'-UGU AUU GUG-3' (miR-122-G3,5U) (서열번호 28), 5'-UGU AGU UUG-3' (miR-122-G3,7U) (서열번호 29), 5'-UGG AUU UUG-3' (miR-122-G5,7U) (서열번호 31)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 5'-UUU UGU CCC-3' (miR-133-G4U) (서열번호 34), 5'-UUU GUU CCC-3' (miR-133-G5U) (서열번호 35) 또는 5'-UUU UUU CCC-3'(miR-124-G4,5U) (서열번호 36)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
5'-UUA GGU AGU-3' (let-7-G2U) (서열번호 37), 5'-UGA UGU AGU-3' (let-7-G4U) (서열번호 38), 5'-UGA GUU AGU-3' (let-7-G5U) (서열번호 39), 5'-UGA GGU AUU-3' (let-7-G8U) (서열번호 40), 5'-UUA UGU AGU-3' (let-7-G2,4U) (서열번호 41), 5'-UUA GUU AGU-3' (let-7-G2,5U) (서열번호 42), 5'-UUA GGU AUU-3' (let-7-G2,8U) (서열번호 43), 5'-UGA UUU AGU-3' (let-7-G4,5U) (서열번호 44), 5'-UGA UGU AUU-3' (let-7-G4,8U) (서열번호 45), 또는 5'-UGA GUU AUU-3' (let-7-G5,8U) (서열번호 46)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산으로, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 5'-UUA GGU AGU-3' (let-7-G2U) (서열번호 37), 5'-UGA UGU AGU-3' (let-7-G4U) (서열번호 38), 5'-UGA GUU AGU-3' (let-7-G5U) (서열번호 39), 5'-UUA UGU AGU-3' (let-7-G2,4U) (서열번호 41), 5'-UUA GUU AGU-3' (let-7-G2,5U) (서열번호 42), 5'-UGA UUU AGU-3' (let-7-G4,5U) (서열번호 44)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 5'-UAA UUG CUU-3' (miR-302a-G4U) (서열번호 47), 5'-UAA GUU CUU-3' (miR-302a-G6U) (서열번호 48), 또는 5'-UAA UUU CUU-3' (miR-302a-G4,6U) (서열번호 49)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산; 또는
miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 5'-AAA UUG CUG-3' (miR-372-G4U) (서열번호 50), 5'-AAA GUU CUG-3' (miR-372-G6U) (서열번호 51), 5'-AAA GUG CUU-3' (miR-372-G9U) (서열번호 52), 5'-AAA UUU CUG-3' (miR-372-G4,6U) (서열번호 53), 5'-AAA UUG CUU-3' (miR-372-G4,9U) (서열번호 54), 또는 5'-AAA GUU CUU-3' (miR-372-G6,9U) (서열번호 55)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상으로 나타내는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다:
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
5'-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3' (miR-124-G4U) (서열번호 56), 5'-UAA GUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G5U) (서열번호 57) 또는 5'-UAA UUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G4,5U) (서열번호 58)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
5'-UUG AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2U) (서열번호 59), 5'-UGU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G3U) (서열번호 60), 5'-UGG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G7U) (서열번호 61), 5'-UUU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,3U) (서열번호 62), 5'-UGU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G3,7U) (서열번호 63), 5'-UUG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,7U) (서열번호 64) 또는 5'-UUU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,3,7U) (서열번호 65) 의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서5'-UUG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2U) (서열번호 66), 5'-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3U) (서열번호 67), 5'-UGG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5U) (서열번호 68), 5'-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G7U) (서열번호 69), 5'-UGG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G9U) (서열번호 70), 5'-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,3U) (서열번호 71), 5'-UUG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,5U) (서열번호 72), 5'-UUG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,7U) (서열번호 73), 5'-UUG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,9U) (서열번호 74), 5'-UGU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,5U) (서열번호 75), 5'-UGU AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,7U) (서열번호 76), 5'-UGU AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,9U) (서열번호 77), 5'-UGG AUU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5,7U) (서열번호 78), 5'-UGG AUU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5,9U) (서열번호 79) 또는 5'-UGG AGU UUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G7,9U) (서열번호 80)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UUU UGU CCC CUU CAA CCA GCU G -3' (miR-133-G4U) (서열번호 81), 5'-UUU GUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3' (miR-133-G5U) (서열번호 82) 또는 5'-UUU UUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3'(miR-124-G4,5U) (서열번호 83)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UUA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2U) (서열번호 84), 5'-UGA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4U) (서열번호 85), 5'-UGA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G5U) (서열번호 86), 5'-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G8U) (서열번호 87), 5'-UUA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,4U) (서열번호 88), 5'-UUA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,5U) (서열번호 89), 5'-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,8U) (서열번호 90), 5'-UGA UUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4,5U) (서열번호 91), 5'-UGA UGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4,8U) (서열번호 92) 또는 5'-UGA GUU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G5,8U) (서열번호 93)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G4U) (서열번호 94), 5'-UAA GUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G6U) (서열번호 95), 또는 5'-UAA UUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G4,6U) (서열번호 96)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산; 또는
miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-AAA UUG CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4U) (서열번호 97), 5'-AAA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G6U) (서열번호 98), 5'-AAA GUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G9U) (서열번호 99), 5'-AAA UUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,6U) (서열번호 100), 5'-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,9U) (서열번호 101), 또는 5'-AAA GUU CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G6,9U) (서열번호 102)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산.
본 발명의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도를 제공한다.
본 발명의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 역분화, 분열, 증식 또는 사멸 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절 방법을 제공한다.
본 발명의 RNA 간섭 유도 핵산의, 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절 용도를 제공한다.
바람직하게, 상기 조성물은 다음 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다:
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물;
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 신경 돌기 가지 분화 유도용 조성물;
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암 세포의 세포 주기 정지 유도용 조성물;
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 근세포 분화 촉진 또는 근섬유화 촉진용 조성물;
miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 근세포 사멸 유도용 조성물;
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 신경 모세포종의 세포 사멸 촉진용 조성물;
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 신경 모세포종의 세포 분열 증식 촉진용 조성물;
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 심근 비대 유도용 조성물;
miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 심근 비대 유도용 조성물;
let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 암 세포의 세포 주기 정지 유도용 조성물;
let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간세포의 세포 주기 진행 활성 유도용 조성물;
miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 역분화 촉진용 조성물;
miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 역분화 촉진용 조성물; 또는
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암 세포의 세포 이동 저해용 조성물.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다:
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계, 또는
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 해당 부위의 G:A 또는 G:U 워블 배열이 U:A 또는 A:U의 정규적인 염기 배열이 되도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식, 역분화 또는 사멸 조절용 시험 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
RNA 간섭 유도 핵산을 대상 세포에 트랜스펙션하는 단계;
대상 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
대상 세포에서 RNA 간섭 유도 핵산이 억제하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현양 내지 발현 여부를 확인하는 단계.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산에 대하여, 하기 1 내지 3을 제공한다:
1. 2'OMe 변형된 RNA 간섭 유도 핵산에 대하여
본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하며,
상기 특정 마이크로RNA는 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)가 첨가된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 해당 RNA 간섭 유도 핵산의 정규 발단 표적 유전자의 발현만을 억제하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 비정규 핵융기 싸이트만을 특이적으로 억제하고, 새롭게 발생할 수 있는 비정규 핵융기 싸이트를 제거하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계; 및
상기 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다.
2. 마이크로RNA의 비정규 핵융기 표적 싸이트를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(서열번호 103 내지 528)에 대하여
본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 비정규 핵융기 표적 싸이트만을 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 특정 마이크로RNA는 let-7/98/4458/4500, miR-125a-5p/125b-5p/351/670/4319, miR-124/124ab/506, miR-9/9ab, miR-29abcd, miR-103a/107/107ab, miR-221/222/222ab/1928, miR-26ab/1297/4465, miR-15abc/16/16abc/195/322/424/497/1907, miR-126-3p, miR-30abcdef/30abe-5p/384-5p, miR-33ab/33-5p, miR-34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p, miR-19ab, miR-99ab/100, miR-17/17-5p/20ab/20b-5p/93/106ab/427/518a-3p/519d, miR-27abc/27a-3p, miR-218/218a, miR-22/22-3p, miR-185/882/3473/4306/4644, miR-181abcd/4262, miR-338/338-3p, miR-127/127-3p, miR-101/101ab, miR-149, miR-324-5p, miR-24/24ab/24-3p, miR-33a-3p/365/365-3p, miR-139-5p, miR-138/138ab, miR-143/1721/4770, miR-25/32/92abc/363/363-3p/367, miR-574-5p, miR-7/7ab, miR-145, miR-135ab/135a-5p, miR-148ab-3p/152, miR-28-5p/708/1407/1653/3139, miR-130ac/301ab/301b/301b-3p/454/721/4295/3666, miR-3132, miR-155, miR-485-3p, miR-132/212/212-3p, hsa-miR-9-3p, miR-374ab, miR-129-3p/129ab-3p/129-1-3p/129-2-3p, hsa-miR-126-5p, miR-425/425-5p/489, miR-423-3p, miR-21/590-5p, miR-31, hsa-miR-20b-3p, hsa-let-7d-3p, miR-191, miR-18ab/4735-3p, miR-369-3p, hsa-miR-5187-5p, miR-382, miR-485-5p/1698/1703/1962, hsa-miR-136-3p, miR-576-3p, miR-204/204b/211, miR-769-5p, miR-342-5p/4664-5p, miR-361-5p, miR-199ab-3p/3129-5p, miR-142-3p, miR-299-5p/3563-5p, miR-193/193b/193a-3p, hsa-miR-1277-5p, miR-140/140-5p/876-3p/1244, hsa-miR-30a/d/e-3p, hsa-let-7i-3p, miR-409-5p/409a, miR-379/1193-5p/3529, miR-136, miR-154/872, miR-4684-3p, miR-361-3p, miR-335/335-5p, miR-423a/423-5p/3184/3573-5p, miR-371/373/371b-5p, miR-1185/3679-5p, miR-3613-3p, miR-93/93a/105/106a/291a-3p/294/295/302abcde/372/373/428/519a/520be/520acd-3p/1378/1420ac, miR-876-5p/3167, miR-329/329ab/362-3p, miR-582-5p, miR-146ac/146b-5p, miR-380/380-3p, miR-499-3p/499a-3p, miR-551a, miR-142-5p, hsa-miR-17-3p, miR-199ab-5p, miR-542-3p, miR-1277, hsa-miR-29c-5p, miR-3145-3p, hsa-miR-106b-3p, hsa-miR-22-5p, miR-744/1716, hsa-miR-132-5p, miR-488, miR-501-3p/502-3p/500/502a, miR-486-5p/3107, miR-450a/451a, hsa-miR-30c-3p, miR-499-5p, miR-421, miR-197, miR-296-5p, miR-326/330/330-5p, miR-214/761/3619-5p, miR-612/1285/3187-5p, miR-409-3p, miR-378/422a/378bcdefhi, miR-342-3p, miR-338-5p, miR-625, miR-200bc/429/548a, hsa-miR-376a-5p, miR-584, miR-411, miR-573/3533/3616-5p/3647-5p, miR-885-5p, hsa-miR-99-3p, miR-876-3p, miR-654-3p, hsa-miR-340-3p, miR-3614-5p, hsa-miR-124-5p, miR-491-5p, miR-96/507/1271, miR-548a-3p/548ef/2285a, hsa-miR-32-3p, miR-3942-5p/4703-5p, miR-34b/449c/1360/2682, hsa-miR-23a/b-5p, miR-362-5p/500b, miR-677/4420, miR-577, miR-3613-5p, miR-369-5p, miR-150/5127, miR-544/544ab/544-3p, hsa-miR-29a-5p, miR-873, miR-3614-3p, miR-186, miR-483-3p, hsa-miR-374a-3p, miR-196abc, hsa-miR-145-3p, hsa-miR-29b-2-5p, hsa-miR-221-5p, miR-323b-3p, miR-616, miR-330-3p, hsa-miR-7-3p, miR-187, hsa-miR-26a-3p, miR-452/4676-3p, miR-129-5p/129ab-5p, miR-223, miR-4755-3p, miR-1247, miR-3129-3p, hsa-miR-335-3p, miR-542-5p, hsa-miR-181a-3p, hsa-miR-186-3p, hsa-miR-27b-5p, miR-491-3p, miR-4687-3p, hsa-miR-101-5p, miR-4772-5p, miR-337-3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-16/195-3p, miR-3677-3p, hsa-miR-766-5p, miR-299/299-3p/3563-3p, miR-3140-3p, miR-532-5p/511, hsa-miR-24-5p, miR-4778-5p, miR-642b, miR-483-5p, miR-767-5p, hsa-miR-31-3p, miR-574-3p, miR-3173-3p, miR-2127/4728-5p, hsa-miR-103a-2-5p, miR-3591-3p, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-15b-3p, miR-522/518e/1422p, miR-548d-3p/548acbz, hsa-miR-452-3p, miR-192/215, miR-1551/4524, hsa-miR-425-3p, miR-3126-3p, hsa-miR-125b-2-3p, miR-324-3p/1913, hsa-miR-141-5p, hsa-miR-365a/b-5p, hsa-miR-29b-1-5p, miR-563/380-5p, miR-1304, miR-216c/1461/4684-5p, hsa-miR-2681-5p, miR-194, miR-296-3p, hsa-miR-205-3p, miR-888, miR-4802-3p, hsa-let-7a/g-3p, miR-762/4492/4498, hsa-miR-744-3p, hsa-miR-148b-5p, miR-514/514b-3p, miR-28-3p, miR-550a, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-506-5p, hsa-miR-1306-5p, miR-3189-3p, miR-675-5p/4466, hsa-miR-34a-3p, hsa-miR-454-5p, miR-509-5p/509-3-5p/4418, hsa-miR-19a/b-5p, miR-4755-5p, hsa-miR-93-3p, miR-3130-5p/4482, hsa-miR-488-5p, hsa-miR-378a-5p, miR-575/4676-5p, miR-1307, miR-3942-3p, miR-4677-5p, miR-339-3p, miR-548b-3p, hsa-miR-642b-5p, miR-188-5p, hsa-miR-652-5p, miR-2114, miR-3688-5p, hsa-miR-15a-3p, hsa-miR-181c-3p, miR-122/122a/1352, miR-556-3p, hsa-miR-218-2-3p, miR-643, miR-140-3p, miR-1245, hsa-miR-2115-3p, miR-518bcf/518a-3p/518d-3p, miR-3200-3p, miR-545/3065/3065-5p, miR-1903/4778-3p, hsa-miR-302a-5p, hsa-miR-183-3p, miR-3144-5p, miR-582-3p, miR-4662a-3p, miR-3140-5p, hsa-miR-106a-3p, hsa-miR-135a-3p, miR-345/345-5p, miR-125a-3p/1554, miR-3145-5p, miR-676, miR-3173-5p, hsa-miR-5586-3p, miR-615-3p, miR-3688-3p, miR-4662a-5p, miR-4659ab-5p, hsa-miR-5586-5p, hsa-miR-514a-5p, miR-10abc/10a-5p, hsa-miR-888-3p, miR-3127-5p, miR-508-3p, hsa-miR-185-3p, hsa-miR-200c-5p,hsa-miR-550a-3p, miR-513c/514b-5p, miR-490-3p, hsa-miR-5187-3p, miR-3664-3p, miR-3189-5p, miR-4670-3p, miR-105/105ab, hsa-miR-135b-3p, hsa-miR-5010-3p, miR-493/493b, miR-3605-3p, miR-188-3p, hsa-miR-449c-3p, miR-4761-5p, miR-224, miR-4796-5p, hsa-miR-551b-5p, miR-556-5p, hsa-miR-122-3p, miR-4677-3p, miR-877, miR-576-5p, miR-490-5p, hsa-miR-589-3p, miR-4786-3p, hsa-miR-374b-3p, hsa-miR-26b-3p, miR-3158-3p, miR-4423-3p, miR-518d-5p/519bc-5p520c-5p/523b/526a, miR-4707-3p, hsa-miR-10a-3p, miR-526b, hsa-miR-676-5p, hsa-miR-660-3p, hsa-miR-5004-3p, miR-193a-5p, hsa-miR-222-5p, miR-4661-3p, hsa-miR-25-5p, miR-4670-5p, miR-659, miR-1745/3194-3p, hsa-miR-182-3p, miR-298/2347/2467-3p, hsa-miR-130b-5p, miR-4746-3p, miR-1893/2277-5p, miR-3619-3p, hsa-miR-138-1-3p, miR-4728-3p, miR-3127-3p, miR-671-3p, hsa-miR-211-3p, hsa-miR-2114-3p, hsa-miR-877-3p, miR-3157-5p, miR-502-5p, miR-500a, miR-548g, miR-523, hsa-miR-584-3p, miR-205/205ab, miR-4793-5p, hsa-miR-363-5p, hsa-miR-214-5p, miR-3180-5p, miR-1404/2110, miR-3157-3p, hsa-miR-191-3p, miR-1346/3940-5p/4507, miR-4746-5p, miR-3939, hsa-miR-181a-2-3p, hsa-miR-500a-3p, hsa-miR-196b-3p, hsa-miR-675-3p, hsa-miR-548aj/g/x-5p, miR-4659ab-3p, hsa-miR-5001-3p, hsa-miR-1247-3p, miR-2890/4707-5p, hsa-miR-150-3p, hsa-miR-629-3p, miR-2277-3p, miR-3547/3663-3p, miR-34bc-3p, miR-518ef, miR-3187-3p, miR-1306/1306-3p, miR-3177-3p, miR-1ab/206/613, miR-128/128ab, miR-1296, miR-598/598-3p, miR-887, miR-1-5p, miR-376c/741-5p, miR-374c/655, miR-494, miR-651, miR-1301/5047, miR-381-5p, miR-216a, miR-300/381/539-3p, miR-1249, miR-579, miR-656, miR-433, miR-1180, miR-597/1970, miR-190a-3p, miR-1537, miR-874-5p, miR-410/344de/344b-1-3p, miR-370, miR-219-2-3p/219-3p, miR-3620, miR-504/4725-5p, miR-2964/2964a-5p, miR-450a-2-3p, miR-511, miR-6505-3p, miR-433-5p, miR-6741-3p, miR-370-5p, miR-579-5p, miR-376c-5p,miR-376b-5p, miR-552/3097-5p, miR-1910, miR-758, miR-6735-3p, miR-376a-2-5p, miR-585, miR-451, 및 miR-137/137ab로 이루어진 군에서 선택되어 동일한 발단서열로부터 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지면서 6-24개의 염기로 구성된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 서열번호 103 내지 528 중 어느 하나 이상으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다(표 3 참조).
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다.
3. 마이크로RNA의 비정규 G:A 워블 표적 싸이트를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(서열번호 529 내지 863)에 대하여
본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지며, 해당 부위의 G:A 워블(wobble)이 U:A의 정규적인 염기 배열이 되게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열을 포함하고,
상기 염기 서열은 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 G:A 워블(wobble) 배열로 결합하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자만을 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 특정 마이크로RNA는 hsa-miR-1-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-15b-3p, hsa-miR-200c-5p, hsa-miR-214-5p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-145-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-423-3p, hsa-miR-873-3p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-409-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-144-5p, hsa-miR-379-5p, hsa-miR-146b-5p/hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-539-5p, hsa-miR-296-5p, hsa-miR-767-5p, hsa-miR-34a-5p/hsa-miR-34c-5p, hsa-let-7f-5p/hsa-let-7d-5p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7a-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-miR-202-3p/hsa-let-7i-5p/hsa-miR-98-5p/hsa-let-7c-5p/hsa-let-7g-5p, hsa-miR-1271-3p, hsa-miR-138-5p, hsa-miR-19b-3p/hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-30d-5p/hsa-miR-30e-5p/hsa-miR-30a-5p/hsa-miR-30c-5p/hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-221-3p/hsa-miR-222-3p, hsa-miR-509-3p, hsa-miR-769-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-508-3p/hsa-miR-219a-5p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-103a-3p/hsa-miR-107, hsa-miR-542-3p, hsa-miR-219a-2-3p, hsa-miR-29c-3p/hsa-miR-29a-3p/hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-411-5p, hsa-miR-196a-5p/hsa-miR-196b-5p, hsa-miR-3622a-5p, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-153-3p, hsa-miR-15b-5p/hsa-miR-16-5p/hsa-miR-424-5p, hsa-let-7g-3p/hsa-miR-493-5p/hsa-let-7c-3p, hsa-let-7i-3p, hsa-miR-218-5p, hsa-miR-1307-5p, hsa-miR-127-3p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-192-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-500a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-30c-2-3p, hsa-miR-488-3p, hsa-miR-301a-3p/hsa-miR-301b-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-26b-3p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-3065-3p, hsa-miR-124-5p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-889-5p/hsa-miR-135a-5p/hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-18a-5p, hsa-miR-708-5p/hsa-miR-28-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-873-5p, hsa-miR-4662a-5p, hsa-miR-99b-3p/hsa-miR-99a-3p, hsa-miR-433-5p, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-1296-5p, hsa-miR-133a-3p, hsa-miR-382-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-377-5p, hsa-miR-3180-3p, hsa-miR-758-3p, hsa-miR-93-3p, hsa-miR-154-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-148a-5p, hsa-miR-2277-5p, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-4772-3p, hsa-miR-329-5p, hsa-miR-182-5p/hsa-miR-96-5p, hsa-miR-2467-5p/hsa-miR-485-5p, hsa-miR-149-5p, hsa-miR-29b-2-5p, hsa-miR-122-3p, hsa-miR-302a-3p/hsa-miR-520a-3p/hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-520b/hsa-miR-519c-3p/hsa-miR-520c-3p/hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-132-5p, hsa-miR-541-5p, hsa-miR-671-3p, hsa-miR-518e-3p, hsa-miR-487a-5p, hsa-miR-589-5p/hsa-miR-146b-5p/hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-196b-5p/hsa-miR-196a-5p, hsa-miR-486-3p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-27b-5p, hsa-miR-6720-3p, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-29a-5p, hsa-miR-30c-2-3p/hsa-miR-30c-1-3p, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-574-5p, hsa-miR-4677-3p, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-652-3p, hsa-miR-19a-3p/hsa-miR-19b-3p, hsa-let-7c-5p/hsa-miR-98-5p/hsa-let-7g-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-miR-202-3p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7a-5p/hsa-let-7d-5p/hsa-let-7i-5p, hsa-miR-3663-3p, hsa-miR-152-3p/hsa-miR-148b-3p/hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-193b-5p, hsa-miR-502-3p/hsa-miR-501-3p, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-96-5p/hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-365a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-493-3p, hsa-miR-548am-5p, hsa-miR-20b-5p/hsa-miR-20a-5p/hsa-miR-93-5p/hsa-miR-17-5p/hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-541-3p, hsa-miR-452-5p, hsa-miR-221-5p, hsa-miR-518f-3p, hsa-miR-370-3p, hsa-miR-107/hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-409-3p, hsa-let-7d-5p/hsa-let-7g-5p/hsa-let-7i-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7a-5p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7c-5p, hsa-miR-130b-3p/hsa-miR-301a-3p/hsa-miR-130a-3p/hsa-miR-301b-3p, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-92a-3p/hsa-miR-92b-3p/hsa-miR-363-3p/hsa-miR-25-3p/hsa-miR-32-5p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-499a-5p/hsa-miR-208a-3p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-450a-5p, hsa-miR-101-3p/hsa-miR-144-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-199b-5p/hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-526b-5p, hsa-miR-16-5p/hsa-miR-15b-5p/hsa-miR-424-5p/hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-9-3p, hsa-miR-363-5p, hsa-miR-1298-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-9-5p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-137, hsa-miR-5010-5p, hsa-miR-523-5p, hsa-miR-128-3p, hsa-miR-199a-5p/hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-181a-2-3p, hsa-miR-27a-3p/hsa-miR-27b-3p, hsa-let-7d-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-424-3p, hsa-miR-181a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-196b-5p, hsa-miR-92a-1-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-1537-3p, hsa-miR-106b-5p/hsa-miR-20a-5p/hsa-miR-17-5p/hsa-miR-93-5p, hsa-miR-30a-3p/hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-374a-3p, hsa-miR-675-5p, hsa-miR-503-5p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-208a-3p, hsa-miR-200b-3p/hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-518f-5p/hsa-miR-523-5p, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-miR-514a-5p, hsa-miR-381-3p, hsa-miR-513c-5p/hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-125b-5p/hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-874-3p, hsa-miR-202-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-513b-5p, hsa-miR-33a-5p, hsa-let-7a-5p/hsa-let-7c-5p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7d-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7i-5p/hsa-let-7g-5p, hsa-miR-136-3p, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-204-5p/hsa-miR-211-5p, hsa-miR-146a-5p/hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-21-3p, hsa-miR-877-5p, hsa-miR-302a-5p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-99a-5p/hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-216a-5p, 및 hsa-miR-3157-3p로 이루어진 군에서 선택되어, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 또는 2번째에서부터 9번째 서열 중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 해당 부위의 G:A 워블 배열이 U:A의 정규적인 염기 배열이 되게 하면서 6-24개의 염기로 구성된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 7번째까지 또는 2번째 염기에서 시작하여 9번째까지의 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열이 서열번호 529 내지 863(표 4 참조) 중 어느 하나 이상으로 표시되는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
마이크로RNA가 표적 전령RNA와 결합할 때 마이크로RNA 발단 지역(seed region)과 정확히 상보관계가 아니더라도 마이크로RNA의 표적으로 인식하고 전령RNA에 결합하는 경우가 있는바, 이를 비정규 표적 인식(non-canonical target recognition)이라고 한다. 본 발명자들은 이러한 마이크로RNA의 비정규 표적 인식에 착안하여, 마이크로RNA의 일부 서열을 변형시켜 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자를 선택적으로 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 개발하고 이의 효능을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현만을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하고, 또는
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 또는 아데닌(Adenine)으로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 해당 부위의 G:A 또는 G:U 워블 배열이 U:A 또는 A:U의 정규적인 염기 배열이 되게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥으로서, 바람직하게 마이크로RNA, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, asiRNA, piRNA, 또는 endo-siRNA 등이 포함된다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA의 2가지 비정규 표적 인식(non-canonical target recognition)을 토대로 한다.
보다 구체적으로, 마이크로RNA는 정규 표적 유전자 뿐만 아니라 비정규 표적 유전자도 인식한다. 마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자는 마이크로RNA와 정확하게 일치하는 상보 관계를 가지지 않는다.
마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자 및 상기 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 일 양태는 다음과 같다.
마이크로RNA가 결합하는 비정규 표적 유전자중 하나의 인식 종류는 마이크로RNA의 5' 말단에서 5번째까지의 염기와 모두 연속적으로 상보 관계를 가진다. 그러나 마이크로RNA의 5' 말단에서 6번째의 염기가 인식하는 (마이크로RNA의 5' 말단에서 6번째의 염기와 배열되는) 유전자는 상기 마이크로RNA의 5' 말단에서 5번째 염기와 상보 관계를 갖는 염기와 바로 연속되는 염기가 아니라, 바로 연속되는 염기는 융기 모양으로 밀어내고, 그 다음에 마이크로RNA와 상보 관계를 갖는 염기가 마이크로RNA의 5' 말단에서 6번째의 염기가 인식하는 염기가 된다.
상기 일 양태의 마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째까지의 4개의 염기 서열을 포함한다. 또한, 상기 4개의 염기 서열에 연속하는 2개의 염기는 서로 동일하며, 상기 2개의 염기 서열은 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함된다.
이러한 특정 마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산은 상기 마이크로RNA의 염기 서열과 비교하건대, 적어도 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째까지의 4개의 염기 서열을 공통으로 포함한다.
또한, RNA 간섭 유도 핵산의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열과 7번째 염기 서열은 동일할 수 있으며, 이들 2개의 염기 서열은 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함된다. 예컨대, 특정 마이크로RNA의 6번째 염기: 상기 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기: 상기 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기는 (A: U,G: A,C), (G: A,U,C: U,A,G), (U: G,A: C,U) 또는 (C: G: C)일 수 있다. 예컨대, 특정 마이크로RNA의 6번째 염기가 A일때, RNA 간섭 유도 핵산의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열과 7번째 염기 서열은 AA, CA일 수 있고; 특정 마이크로RNA의 6번째 염기가 G일때, RNA 간섭 유도 핵산의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열과 7번째 염기 서열은 UG, AG 또는 GG 일 수 있고; 특정 마이크로RNA의 6번째 염기가 U일때, RNA 간섭 유도 핵산의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열과 7번째 염기 서열은 CU, UU 일 수 있으며; 또는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기가 C일때, RNA 간섭 유도 핵산의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열과 7번째 염기 서열은 CC 일 수 있다.
바람직하게 RNA 간섭 유도 핵산의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열과 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열은 동일할 수 있고, 바람직하게 RNA 간섭 유도 핵산의 5' 말단으로부터 7번째 염기 서열과 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 염기 서열은 동일할 수 있다.
또한, 바람직하게 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 7번째 염기 서열을 5' 말단으로부터 8번째 염기 서열로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로, 마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자 및 상기 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 일 양태는 다음과 같다.
마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자는 마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자의 염기가 A:U, G:C, C:G, U:A 의 상보 관계의 배열과 함께 G:A 의 워블 관계의 배열 또는 G:U 의 워블 관계의 배열을 포함한다.
마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자가 G:A 의 워블 관계에 있을 때, 특정 마이크로RNA의 염기: 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자의 염기: 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 염기의 배열은 G:A:U 이다. 또한, 마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자가 G:U 의 워블 관계에 있을 때, 특정 마이크로RNA의 염기: 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자의 염기: 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 염기의 배열은 G:U:A 이다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 하나 이상의 구아닌(G) 염기가 유라실(U)로 치환된 변형 염기 서열을 가진다. 또는 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 하나 이상의 구아닌(G) 염기가 아데닌(A)로 치환된 변형 염기 서열을 가진다. 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(G) 염기가 하나 이상 포함된 경우, 포함된 구아닌 염기가 모두 유라실(U) 또는 아데닌(A)로 치환될 수도 있고, 적어도 하나 이상의 구아닌 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A)로 치환된다. 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(G) 염기가 하나 이상 포함된 경우, 유라실 또는 아데닌 염기로 치환되는 염기 외에 나머지 염기는 특정 마이크로RNA의 염기와 동일할 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자를 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는다.
본 발명의 구체적 실시예 2 (도 2 참고)에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산의 표적 유전자에 대한 전령RNA의 발현 조절 기능은 비정규 표적 유전자에 대해 특이적이며, 정규 표적 유전자에 대해서는 억제 효과를 나타내지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 비정규 표적 유전자 발현만을 선택적으로 억제할 수 있고, 그러므로 RNA 간섭 유도 핵산 발현 억제를 통해 기대되는 효과만을 선택적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 있어서, 특정 마이크로RNA가 miR-124, miR-155, miR-122, miR-1, miR-133, let-7, mR-302a, miR-372 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 각각 인간의 miR-124, miR-155, miR-122, miR-1, miR-133, let-7, miR-302a 및 miR-372의 염기 서열은 마이크로RNA의 서열 데이터베이스인 miRBase (http://www.mirbase.org/)에서 MIMAT0000422, MIMAT0000646, MIMAT0000421, MIMAT0000416, MIMAT0000427, MIMAT0000062, MIMAT0000684, 및 MIMAT0000724에 기재된 바와 같다.
다만, 본 발명에 따른 특정 마이크로RNA는 인간의 마이크로RNA로 한정되지 않고, 포유동물을 포함하는 동물의 마이크로RNA를 포함한다.
본 발명에 따른 특정 마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일할 수 있으며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산의 길이는 6개 이상의 염기 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않지만, 보통 21개 정도로 24개 이하의 염기 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-124일 때, miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-124의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일할 수 있으며 6번째와 7번째 염기는 miR-124의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 miR-124의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단 2번째에서 7번째 염기 서열이 5'-AA GGC C-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-124BS)일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UAA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3‘ 의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-124BS)일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-122일 때, miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-122의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 miR-122의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 miR-122의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단 2번째에서 7번째 염기 서열이 5'-GG AGU U-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-122BS)일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UGG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-122BS)일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-155일 때, miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-155의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 miR-155의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 miR-155의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단 2번째에서 7번째 염기 서열이 5'-UA AUG G-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-155BS)일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UUA AUG GC UAA U CGU GAU AGG-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-155BS)일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-1일 때, miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-1의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 miR-1의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 miR-1의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단 2번째에서 7번째 염기 서열이 5'-GG AAU U-3''의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-1BS)일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UGG AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-1BS)일 수 있다.
본 발명에 따른 특정 마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A)으로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산의 길이는 6개 이상의 염기 서열을 가지며, 이에 제한되지 않지만, 보통 21개 정도로 24개 이하의 염기 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-124일 때, miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-124의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 5'-UAA UGC AC-3' (miR-124-G4U), 5'-UAA GUC AC-3'(miR-124-G5U) 또는 5'-UAA UUC AC-3'(miR-124-G4,5U)을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3' (miR-124-G4U), 5'-UAA GUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G5U) 또는 5'-UAA UUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G4,5U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-1일 때, miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-1의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 5'-UUG AAU GUA-3' (miR-1-G2U), 5'-UGU AAU GUA-3' (miR-1-G3U), 5'-UGG AAU UUA-3' (miR-1-G7U), 5'-UUU AAU GUA-3' (miR-1-G2,3U), 5'-UGU AAU UUA-3' (miR-1-G3,7U), 5'-UUG AAU UUA-3' (miR-1-G2,7U) 또는 5'-UUU AAU UUA-3' (miR-1-G2,3,7U)을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UUG AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2U), 5'-UGU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G3U), 5'-UGG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G7U), 5'-UUU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,3U), 5'-UGU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G3,7U), 5'-UUG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,7U) 또는 5'-UUU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,3,7U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-122일 때, miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-122의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 5'-UUG AGU GUG-3' (miR-122-G2U), 5'-UGU AGU GUG-3' (miR-122-G3U), 5'-UGG AUU GUG-3' (miR-122-G5U), 5'-UGG AGU UUG-3' (miR-122-G7U), 5'-UGG AGU GUU-3' (miR-122-G9U), 5'-UUU AGU GUG-3' (miR-122-G2,3U), 5'-UUG AUU GUG-3' (miR-122-G2,5U), 5'-UUG AGU UUG-3' (miR-122-G2,7U), 5'-UUG AGU GUU-3' (miR-122-G2,9U), 5'-UGU AUU GUG (miR-122-G3,5U), 5'-UGU AGU UUG-3' (miR-122-G3,7U), 5'-UGU AGU GUU-3' (miR-122-G3,9U), 5'-UGG AUU UUG-3' (miR-122-G5,7U), 5'-UGG AUU GUU-3' (miR-122-G5,9U), 또는 5'-UGG AGU UUU-3 (miR-122-G7,9U)을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UUG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2U), 5'-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3U), 5'-UGG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5U), 5'-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G7U), 5'-UGG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G9U), 5'-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,3U), 5'-UUG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,5U), 5'-UUG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,7U), 5'-UUG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,9U), 5'-UGU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,5U), 5'-UGU AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,7U), 5'-UGU AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,9U), 5'-UGG AUU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5,7U), 5'-UGG AUU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5,9U) 또는 5'-UGG AGU UUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G7,9U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-133일 때, miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-133의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 5'-UUU UGU CCC-3' (miR-133-G4U), 5'-UUU GUU CCC-3' (miR-133-G5U) 또는 5'-UUU UUU CCC-3'(miR-124-G4,5U)을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UUU UGU CCC CUU CAA CCA GCU G -3' (miR-133-G4U), 5'-UUU GUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3' (miR-133-G5U) 또는 5'-UUU UUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3'(miR-124-G4,5U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 let-7 일 때, let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, let-7의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 5'-UUA GGU AGU-3' (let-7-G2U), 5'-UGA UGU AGU-3' (let-7-G4U), 5'-UGA GUU AGU-3' (let-7-G5U), 5'-UGA GGU AUU-3' (let-7-G8U), 5'-UUA UGU AGU-3' (let-7-G2,4U), 5'-UUA GUU AGU-3' (let-7-G2,5U), 5'-UUA GGU AUU-3' (let-7-G2,8U), 5'-UGA UUU AGU-3' (let-7-G4,5U), 5'-UGA UGU AUU-3' (let-7-G4,8U), 또는 5'-UGA GUU AUU-3' (let-7-G5,8U)을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UUA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2U), 5'-UGA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4U), 5'-UGA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G5U), 5'-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G8U), 5'-UUA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,4U), 5'-UUA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,5U), 5'-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,8U), 5'-UGA UUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4,5U), 5'-UGA UGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4,8U) 또는 5'-UGA GUU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G5,8U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-302a일 때, miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-302a의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 5'-UAA UUG CUU-3' (miR-302a-G4U), 5'-UAA GUU CUU-3' (miR-302a-G6U), 또는 5'-UAA UUU CUU-3' (miR-302a-G4,6U)을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5'-UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G4U), 5'-UAA GUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G6U), 또는 5'-UAA UUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G4,6U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은, 특정 마이크로RNA가 miR-372일 때, miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, miR-372의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중, 바람직하게는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 또는 아데닌(A) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 RNA 간섭 유도 핵산이다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 5'-AAA UUG CUG-3' (miR-372-G4U), 5'-AAA GUU CUG-3' (miR-372-G6U), 5'-AAA GUG CUU-3' (miR-372-G9U), 5'-AAA UUU CUG-3' (miR-372-G4,6U), 5'-AAA UUG CUU-3' (miR-372-G4,9U), 또는 5'-AAA GUU CUU-3' (miR-372-G6,9U)을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-AAA UUG CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4U), 5'-AAA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G6U), 5'-AAA GUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G9U), 5'-AAA UUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,6U), 5'-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,9U), 또는 5'-AAA GUU CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G6,9U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산일 수 있다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하며,
상기 특정 마이크로RNA는 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)가 첨가된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기로 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기를 포함하고, 상기 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)가 첨가되어 있는 경우라면, 이를 제외한 나머지 염기 서열에는 제한이 없고, 어떤 염기 서열이든 모두 포함될 수 있으며, 이 때 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 6개 내지 24개의 염기 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 6개 내지 15개, 더 바람직하게는 6개 내지 8개의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 상기 핵산의 길이에 특별한 제한은 없다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)가 첨가되어 화학적으로 변형이 일어난 염기 서열을 포함하며, 상기 2'OMe 변형이 일어난 RNA 간섭 유도 핵산은 이의 정규 발단 표적 유전자의 발현만을 선택적으로 억제하고, 비정규 발단 표적 유전자의 발현은 억제하지 않을 수 있다. 이에, 상기 2'OMe 변형이 일어난 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 비정규 핵융기 싸이트만을 특이적으로 억제하기 위한 본 발명의 목적은 유지하면서, 새롭게 발생할 수 있는 비정규 핵융기 싸이트는 완전히 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산에 있어서, 상기 메틸기(2'OMe)가 첨가될 수 있는 마이크로RNA의 종류에는 제한이 없으며, 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치라면, 어떤 마이크로RNA에도 2'OMe가 첨가될 수 있으나, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 2'OMe가 첨가될 수 있는 마이크로RNA는 miR-124 또는 miR-1일 수 있다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기로 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기를 포함하고 있는 경우라면, 이를 제외한 나머지 염기 서열에는 제한이 없고, 어떤 염기 서열이든 모두 포함될 수 있으며, 이 때 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 6개 내지 24개의 염기 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 6개 내지 15개, 더 바람직하게는 6개 내지 8개의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 상기 핵산의 길이에 특별한 제한은 없다.
본 발명에 따른 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 함으로써 비정규 핵융기 표적 싸이트만을 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 서열번호 103 내지 528 중 어느 하나 이상으로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있다(표 3 참조).
또한, 본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현만을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 9번째 염기 사이의 염기 서열, 또는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지며, 해당 부위의 G:A 워블(wobble)이 U:A의 정규적인 염기 배열이 되게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 9번째 염기 사이의 서열, 또는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 것일 수 있으며, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 9번째 염기 사이의 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 포함하는 경우라면, 이를 제외한 나머지 염기 서열에는 제한이 없으며, 어떤 염기 서열이든 모두 포함될 수 있다. 이 때 상기 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 9번째 염기 사이의 염기 서열, 또는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 유라실(U) 염기로 치환되는 염기 외에 나머지 염기는 특정 마이크로RNA의 염기와 동일할 수도 있다.
본 발명에 따른 특정 마이크로RNA가 인식하는 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서, 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 9번째 염기 사이의 염기 서열, 또는 5'말단 기준 2번째에서부터 7번째 서열 중에서 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산은 6개 내지 24개의 염기 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 6개 내지 15개, 더 바람직하게는 6개 내지 8개의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 상기 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산이라면 핵산의 길이에 특별한 제한은 없다. 이 때, 상기 RNA 간섭 유도 핵산에 있어서, 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 포함하는 경우라면, 이를 제외한 나머지 염기 서열의 종류에는 제한이 없으며, 어떤 염기 서열이든 모두 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열 중 구아닌(G) 염기가 유라실(U) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가져 해당 부위의 G:A 워블 배열이 U:A의 정규적인 염기 배열이 되게 함으로써, G:A 워블(wobble) 배열로 결합하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자만을 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 서열번호 529 내지 863 중 어느 하나 이상으로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있다(표 4 참조).
본 발명에 따른 상술한 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자를 특이적으로 억제할 수 있다.
이에, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물 또는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 상술한 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자를 특이적으로 억제함으로써, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현 억제로 인해서 일어나는 작용을 선택적으로 조절할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자를 특이적으로 억제하므로, 본 발명에 따른 상술한 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현에 따른 작용(예컨대, 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식, 또는 사멸)을 특이적으로 조절할 수 있다.
이에, 본 발명은 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식, 또는 사멸 조절용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 주기'는 세포가 성장하여 분열하고 다시 성장하는 연속적인 과정으로, 세포가 M기(세포분열기), G1기(제1분열준비기), S기(DNA 합성기), G2기(제2분열준비기)의 4기(phase)를 반복하는 것을 의미한다. G1기는 세포분열 직후에서 DNA 합성 개시까지의 DNA 합성준비기이고 G2기는 DNA 합성의 종료에서 세포분열 개시까지의 세포분열 준비기이다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 주기 조절'은 세포가 상기 4기(phase) 간에 변동하도록 유도하거나, 상기 변동을 촉진 또는 정지(arrest)시키는 것을 포함하며, 예컨대, G2/M기의 세포를 G1/G2기로 변동하도록 유도하는 것이 세포 주기 조절의 예로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 분화(differentiation)'는 세포가 형태적, 기능적으로 특수성을 획득하는 과정으로, 세포는 분화를 통해서 크기나 모양, 막전위, 대사 활성, 그리고 신호에 대한 반응이 변화한다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 분화 조절'은 세포가 분화하는 속도를 촉진 또는 지연시키거나, 분화가 시작되도록 유도하거나, 분화가 시작되지 않도록 억제하는 것을 포함하며, 에컨대 신경세포가 분화되도록 유도하여 형태적 특수성(예. 신경돌기분화)을 획득하도록 유도하는 것이 세포 분화 조절의 예로 포함될 수 있다. 또는 예컨대, 근세포가 분화되도록 유도하여 형태적 특수성(예. 근세포의 근섬유화)을 갖도록 유도하는 것이 세포 분화 조절의 예로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 ‘역분화’란 분화 진행을 되돌리는 것 내지 분화가 다 된 세포를 분화가 되기 전의 미분화 시기의 전분화능을 획득하여 나아가 중기세포와 같이 변하는 현상을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 '역분화 조절'은 세포가 역분화 되도록 유도, 촉진하거나, 역분화 진행을 억제, 지연하는 것을 포함하며, 역분화 조절 결과는 예컨대 세포 성장 형태(예. 군집 형성 등), 역분화 인자(Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4)의 활성 등을 확인함으로써 판단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 형태'는 세포의 모양, 구조, 크기 등을 포함하는 표현형 상의 특징을 의미하며, 세포 형태는 생물의 종류에 따라, 또 같은 생물이라도 조직이나 기관의 종류에 따라 다종다양하다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 형태 조절'은 세포의 모양, 구조, 크기 등을 포함하는 표현형 상의 특징의 변화를 유도하는 것으로, 세포의 자연적 형태 변화를 촉진, 지연, 유도 또는 억제하는 것과 세포의 형태를 비-자연적으로 변화시키는 것을 촉진 내지 유도하는 것을 포함한다. 예컨대, 심근 세포의 심근 비대 현상을 유도하는 것이 예로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 이동'은 세포의 움직임을 의미하며, 동물의 성장 및 생리 활동을 위해 중요한 과정으로, 세포들은 주로 주어진 자극에 빠른 반응을 보이며 보통 비집단적인 형상으로 이동하는데 반해, 다른 세포 유형들은 특정한 성장 기간이나 특수한 상황에서만 이동할 수 있다. 세포 이동은 신경관과 맥관의 발단이나 상피 조직의 상처 치유 과정에서 주로 일어나며, 세포 집단 이동은 다종의 종양 전이에 기여한다.
본 발명에 있어서, 상기 '세포 이동 조절'은 세포의 이동을 지연, 촉진, 유도 또는 억제(저해)하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, '세포 분열, 증식'은 모 세포가 두 개의 딸 세포로 나뉘는 과정으로, 세포 수를 늘리는 과정을 의미한다.
본 발명에 있어서, '세포 분열, 증식 조절'은 세포 분열, 증식을 지연, 촉진, 억제 내지 유도하는 것을 포함한다. 세포 주기 중 M기(세포분열기)로 세포의 기(phase)를 유도하는 경우 세포 분열, 증식을 유도하게 될 수 있다. 예컨대, G0/G1 기에 분포하는 세포의 수를 감소시키고 G2/M 기에 분포하는 세포의 수를 증가시키면, 세포 분열, 증식 조절의 예로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, '세포 사멸(Apoptosis)'은 세포가 기능적인 역할은 유지하면서 유전적 성질에 의해 죽음으로 이르는 단계를 의미하며, 이른 세포 사멸과 늦은 세포 사멸이 모두 포함된다. 세포 사멸에 의하면 세포 전체가 위축되면서 새로운 단백질이 합성되고 세포의 자살 유전자에 의해 죽음으로 유도된다.
본 발명에 있어서, '세포 사멸 조절'은 세포 사멸을 유도, 지연, 촉진 또는 억제하는 것을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-124BS)을 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물;
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-124BS)을 포함하는 신경 돌기 가지 분화 유도용 조성물;
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-122BS)을 포함하는 간암 세포의 세포 주기 정지 유도용 조성물;
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-1BS)을 포함하는 근세포 분화 촉진 또는 근섬유화 촉진용 조성물;
miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-155BS)을 포함하는 근세포 사멸 유도용 조성물;
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-124-G5U)을 포함하는 신경 모세포종의 세포 사멸 촉진용 조성물;
miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-124-G4U)을 포함 하는 신경 모세포종의 세포 분열 증식 촉진용 조성물;
miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U)을 포함하는 심근 비대 유도용 조성물;
miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-133-G4U)을 포함하는 심근 비대 유도용 조성물;
let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, let-7-G2U, let-7-G2,4U)을 포함하는 암 세포의 세포 주기 정지 유도용 조성물;
let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, let-7-G4U)을 포함하는 간세포의 세포 주기 진행 활성 유도용 조성물;
miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-302a-G4U)을 포함하는 역분화 촉진용 조성물;
miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-372-G4U)을 포함하는 역분화 촉진용 조성물; 또는
miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산(바람직하게, miR-122-G2U, 또는 miR-122-G2,3U)을 포함하는 간암 세포의 세포 이동 저해용 조성물.
또한, 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자를 특이적으로 억제함으로써, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 작용을 선택적으로 조절할 수 있는바, 다양한 분야(예컨대, 약학, 화장품학, 세포학 등)에서 활용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절용 시험 물질을 스크리닝하는 방법에 활용될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산을 대상 세포에 도입하는 단계;
대상 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
대상 세포에서 RNA 간섭 유도 핵산이 억제하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현양 내지 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는,
세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절용 시험 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 대상 세포는 인간을 포함한 포유 동물에서 유래된 것이면 제한되지 않고 포함되며, 대상 세포를 추출하는 조직 내지 종류 등은 제한되지 않으며 예컨대 신경세포, 심근세포, 암세포, 근세포 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 대상 세포에의 도입은 당업계 공지된 다양한 방법에 따라 적절히 수행될 수 있으며, 예컨대 도입은 인산칼슘를 이용한 형질감염(Graham, FL 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염(Capecchi, MR, Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염(Wong, TK 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법(Neumann E등, EMBO J, 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션과 같이 문헌(Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 이뤄질 수 있다. 바람직하게, 트랜스펙션에 의할 수 있다. 트랜스펙션 효율은 세포의 종류 뿐만 아니라 세포 배양조건, 트랜스펙션 시약 등에 따라 많은 차이가 날 수 있다
본 발명에 있어서, 시험 물질은 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현을조절하여 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸에 영향을 미치는지 검사하기 위해 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미하며, 화합물, 추출물, 단백질 또는 핵산 등이 포함되고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현양 내지 발현 여부는 당업계 공지된 다양한 발현 분석 방법에 의해 확인할 수 있으며, 예컨대 RT-PCR, ELISA(참조: Sambrook, J et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Press(2001)), western blot, FACS analysis 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현양 내지 발현 여부를 확인하고, 그 결과 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현양 내지 발현에 있어 시험물질 없이 RNA 간섭 유도 핵산 만을 처리한 경우와 비교해 차이가 있다면, 시험물질은 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현에 영향을 미치는 것으로 판단할 수 있다. 나아가, 상기 시험물질은 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절 기능을 가지는 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다:
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계, 또는
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실 또는 아데닌으로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계; 및
상기 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법을 제공한다.
RNA 간섭 유도 핵산에 관해서는 이미 기재하였으므로, 중복 기재를 피하기 위해, 설명을 생략한다.
RNA 간섭 유도 핵산 작제는 당업계 공지된 다양한 방법에 따르며, 특정 방법으로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2'위치에 메틸기(2'OME) 를 넣어 변형한 간섭 유도 핵산을 제공한다.
상기 변형된 간섭 유도 핵산은 해당 miRNA의 비정규 핵융기 싸이트만을 특이적으로 억제하려는 본 발명의 목적은 유지하면서, 새롭게 나타날 수 있는 비정규 핵융기 결합은 완전히 제거하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 간섭 유도 핵산을 이용하면 기존의 마이크로RNA가 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적인 기능을 효율적으로 증대하거나, 기존의 마이크로RNA가 나타내는 기능 중 일부, 즉 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적 기능만 선택적으로 나타내는 효과를 가질 수 있다. 또한, 이러한 간섭 유도 핵산을 통해 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절이 가능한바, 약물, 화장품 등 다양한 분야에서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 마이크로RNA의 비정규 표적을 억제하는 간섭 유도 핵산의 작용 기작을 도식화해서 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2c는 miR-124의 정규 타겟 (발단:Seed) 과 비정규 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge) 의 표적 유전자 억제를 루시퍼라제 리포터의 효소로 측정하여 miR-124-BS의 비정규 표적 특이적 발현 억제 효과에 대해서 확인한 것이다.
도 3a 내지 3b는 자궁경부암세포 (HeLa)에서 miR-124의 정규 타겟 (발단:Seed) 과 비정규 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge) 이 유도하는 세포사멸을 miR-124-BS에서 유세포 (Fluorescence-activated cell sorting: FACS) 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 4b는 miR-124의 비정규 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge)이 유도하는 신경돌기 분화를 miR-124-BS의 인간 신경 종양 모세포종(Sh-Sy-5y)에서의 발현을 통해 세포형태 및 마커의 발현 양상으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5b는 miR-124의 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge) 을 정규 타겟 (발단:Seed)으로 조절하는 miR-124-BS의 자연적인 형태인 miR-124-BS(4753)와 miR-124와 동일한 발단 서열을 가지는 miR-124-(3714)이 유도하는 신경 돌기 가지 분화를 세포형태상, 분자생물학적 특징으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c는 마우스 신경모세포종 (N2a)에서 miR-124의 비정규 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge)이 유도하는 신경 돌기 가지 분화가 MAPRE1 유전자의 발현 조절을 통한 기작임을 세포형태상, 분자생물학적 특징으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7c는 마우스 신경 모세포종 (N2a) 세포에서 miR-124-BS가 유도하는 비정규 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge) 유전자의 발현 억제를 전사체 수준에서 RNA-Seq 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 8c는 인간 간암세포주 (HepG2)에서 miR-122의 비정규 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge) 이 유도하는 cell cycle arrest 를 miR-122-BS와 유세포 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a 내지 9e는 근세포주에서 miR-1의 비정규 핵융기 타겟 (핵융기: nucleation bulge)이 유도하는 근육세포의 두꺼워지는 효과와 miR-155 비정규 핵융기 타겟(핵융기: nucleation bulge)이 유도하는 근세포 분화 저해 및 세포사멸 유도를 각각 miR-1-BS, miR-155-BS를 통해 세포 형태상, 분자 생물학적 특징과 유세포 분석으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10d는 사람의 뇌조직에서 아고너트 단백질과 결합하는 마이크로RNA와 표적체 RNA 데이터인 Ago HITS-CLIP 결과를 생물정보학적으로 분석한 결과로, 정규 발단 타겟 (발단: seed) 뿐 아니라, 비정규 GA 배열 발단 (G:A wobble) 타겟이 자연적으로 존재하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 11d는 마우스 신경 모세포종 (N2a) 세포에서 miR-124의 4번 비정규 GA 배열 발단 타겟, 5번 비정규 GA 배열 발단 타겟이 뇌세포 분화에 있어 miR-124와 전혀 다른 기능을 보이는 것을 miR-124-G4U, miR-124-G5U를 통해 세포 형태상의 관찰과, 세포 사멸을 유세포 분석으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a 내지 12b는 인간 신경 모세포종 (SH-sy-5y) 세포에서 miR-124의 4번 비정규 GA 배열 발단 타겟, 5번 비정규 GA 배열 발단 타겟의 억제의 생물학적 기능을 miR-124-G4U, miR-124-G5U을 통해 세포 분열(proliferation)과 세포주기 분석에 대한 유세포 분석 (Fluorescence-activated cell sorting: FACS)으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 　
도 13a 내지 13d는 miR-1의 7번 비정규 GA 배열 발단 타겟이 유전자 억제 기능을 한다는 점을 형광 단백질 리포터에서 유세포 분석 (Fluorescence-activated cell sorting: FACS)을 통해 심근세포주(h9c2)에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a 내지 14c는 miR-1의 2번, 3번, 7번 비정규 GA 배열 발단 타겟의 기능을 랫트(rat)의 신생백서 심근세포 (neonatal cardiomyocyte)에서 miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U를 발현시킨 후 심근비대 유도 효과에 대한 세포형태상과 분자생물학적 특징에 대한 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a 내지 15b는 miR-133의 4번 비정규 GA 배열 발단 타겟의 기능을 심근세포 (h9c2)에서 miR-133-G4U를 발현시킨 후 심근비대 유도 효과에 대한 세포형태상 특징을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 16a 내지 16b는 miR-122의 2번, 3번 비정규 GA 배열 발단 타겟을 통해 유전자의 발현을 억제한다는 사실을 인간 간암세포주 (HepG2) 에서 루시퍼라제 리포터의 효소 활성 측정을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a 내지 17d는 miR-122에 의한 2번 비정규 GA 배열 발단 타겟, 2,3번 비정규 GA 배열 발단 타겟 발현의 저해가 인간 간암 세포주 (HepG2)의 이동을 저해하는 기능을 miR-122-G2U, miR-122-G2,3,U의 발현을 통해 세포형태상의 관찰로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18a 내지 18b는 miR-122에 의한 2,3번 비정규 GA 배열 발단 타겟 발현의 억제가 인간 간암 세포주 (HepG2)의 세포 주기 정지 (cell cycle arrest) 를 유도한다는 것을 miR-122-G2,3U의 발현을 통해 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19a 내지 19b는 miR-122에 의한 2,3번 비정규 GA 배열 발단 타겟, 2,7번 비정규 GA 배열 발단 타겟의 발현 저해가 인간 간암 세포주 (HepG2)의 세포 주기 정지 (cell cycle arrest) 를 유도한다는 것을 miR-122-G2,3U, miR-122-G2,7U의 발현을 통해 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20a 내지 20b는 let-7에 의한 2번 또는 2,4번 비정규 GA 배열 발단 타겟 발현의 저해가 인간 간암 세포주 (HepG2)의 세포 주기 정지 (cell cycle arrest) 를 유도한다는 것과 4번의 비정규 GA 배열 발단 타겟 발현의 저해가 세포 주기를 촉진한다는 것을 let-7a-G2U, let-7a-G2,4U, let-7-G4U의 발현을 통해 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21a 내지 21c는 miR-372 또는 miR-302a에 의한 4번 비정규 GA 배열 발단 타겟 발현의 저해를 유도하는 miR-372-G4U 또는 miR-302a-G4U가 miR-372 또는 miR-302a와 함께 역분화를 촉진시킨다는 것을 Oct4 유전자 발현 리포터로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22a 내지 22b는 5‘말단 기준 6번째에 2‘OMe 변형이 해당 RNA 간섭 유도체의 비정규 핵융기 표적을 억제하지 못하는 현상을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23a 내지 23b는 5‘말단 기준 6번째에 2‘OMe 변형이 전사체에서 전체 비정규 핵융기 표적 mRNA를 억제하지 못하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 24a 내지 24b는 Ago HITS CLIP 실험을 통해 비정규 핵융기 싸이트에 결합하는 마이크로RNA를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25a 내지 25f는 암환자 마이크로RNA 시퀀싱 데이터베이스(TCGA)에서 서열 변이를 분석하여 비정규 GA 배열 발단 타겟을 정규 타겟으로 인식하는 G>U 변이를 종양 마이크로RNA에 동정한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 일례일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정된 것은 아니다.
[ 실시예 1] 마이크로RNA의 비정규 표적을 억제하는 간섭 유도 핵산의 작용 기작
본 발명자들은 Ago HITS CLIP 실험을 통해, 아고너트 단백질에서 마이크로RNA가 표적체와 염기배열을 할 때, 마이크로RNA 발단과 완전 상보적 배열을 하는 정규 발단 타겟 외에도, 마이크로RNA 발단과 완전 상보적 배열을 하지 않고 표적 전령RNA와 결합한다는 사실을 아고너트 단백질에 결합한 RNA 복합체 서열 결과 (Ago HITS-CLIP) 의 분석을 통해 확인하였다. 아울러, 이런 특징을 지닌 RNA의 염기 서열을 분석해 본 결과, 마이크로RNA의 6번 염기가 표적체에 핵융기 (nucleation bulge) 를 유도하여 염기 배열하는 표적체 (마이크로RNA 비정규 핵융기 타겟 싸이트)와, 마이크로RNA 발단 지역에서 GA 배열 (wobble)을 허용하는 표적체 (마이크로RNA 비정규 GA배열 발단 타겟 싸이트)가 자연적으로 존재한다는 것을 확인하였다 (도 1).
도 1에 나타낸 도식화된 예로 보면, miR-124 는 아고너트 단백질을 매개로 발단염기서열 (5‘-UAAGGCAC-3')을 통해 표적체의 염기 서열 5'- GUGCCUUA-3'에 대하여 최소 6개의 연속된 상보적 염기배열을 하게 되며, 이러한 염기 배열을 가지는 표적체는 마이크로RNA 의 정규 발단 타겟 싸이트 (canonical seed site)로 보고된 바 있다 (Nature, 2009, 460 (7254): 479-86).
또한 아고너트와 결합한 RNA 복합체 중, miR-124 발단염기서열 (5'-UAAGGCAC-3')과 마이크로RNA 비정규 핵융기 타겟 싸이트 (5'- GUGGCCUU -3') 로 miR-124의 5‘말단 기준 5번째와 6번째에 사이에 표적 전령RNA의 G가 벌지(bulge)로 배열되도록 상보적 염기 배열을 한 표적을 확인하였고, 이를 바탕으로 마이크로RNA 비정규 핵융기 타겟 싸이트와 상보적으로 염기배열이 가능한 miR-124의 발단 염기 서열은 miR-124 발단의 6번-7번에 사이에 6번 염기가 한번 더 반복되는 염기서열 (5-UAAGGCCA-3)을 가지며, 이에 대하여 연속적이고 완벽한 상보 서열은 miR-124의 비정규 핵융기 타겟을 억제하는 miR-124BS (BS: Bulge site) siRNA 로 사용하였다.
아고너트와 결합한 RNA 복합체에서 마이크로RNA와 결합한 표적 전령RNA의 서열을 분석하였을 때, 기존의 상보적인 염기배열 이외에 G:A 워블(wobble) 염기 배열이 마이크로RNA의 발단서열과 표적 전령RNA의 결합에서 일어난다는 것을 확인하였다. 따라서 miR-124의 경우 발단염기서열 (5'-UAAGGCAC-3')에서 5'말단 기준 4번째의 G염기가 G:A 워블 배열을 하여 마이크로RNA 비정규 GA배열 발단 타겟 싸이트(5'- UGGCAUU -3')를 인식하고, 이를 바탕으로 miR-124의 비정규 GA배열 발단 타겟 싸이트와 연속적이고 완벽하게 상보적인 서열로 siRNA를 디자인 하여 miR-124-GU를 발명하였으며, 이 siRNA는 miR-124의 비정규 GA배열 발단 타겟의 발현을 저해하는 siRNA로 사용하였다.
[ 실시예 2] 비정규 핵융기 타겟 싸이트와 연속적이고 완벽하게 상보적인 염기 서열을 발단지역에 포함하는 마이크로RNA -BS의 억제능 확인
자연적으로 존재하는 miR-124의 정규적인 발단 타겟 싸이트 (seed target site) 중 miR-124의 5'말단 기준 2번째부터 7번째까지의 염기와 상보적인 것은 5'- GUGCCUU-3' 염기 서열로 이러한 정규적인 발단 타겟 싸이트는 miR-124의 발단 (5'-UAAGGCAC-3') 과 최소 6개의 연속된 염기로 완전 상보적 염기배열을 하게 된다 (도 2a).
Ago HITS CLIP 실험을 통해 발견한 miR-124의 비정규 핵융기 타겟 싸이트 (Nuc site; nucleation bulge site) 는 5'- GUGGCCUU -3'로 miR-124의 6번 C 염기가 타겟과 핵융기를 형성하여 염기 배열하게 되고, 이에 따라 miR-124의 5‘말단 기준 5번째와 6번째 사이에 배열되는 표적 RNA의 G가 벌지(bulge)로 형성된다. 이를 바탕으로 비정규 핵융기 타겟 싸이트 (nucleation bulge site)와 연속적이고 완전하게 상보 결합하는 염기 서열 (5'-UAAGGCCA-3') 을 마이크로RNA 발단으로 하는 siRNA를 디자인하여 miR-124-BS siRNA로 명명하였다 (도 2a). miR-124-BS는 miR-124의 비정규 표적인 핵융기 타겟 싸이트 (Nuc site)를 정규적인 발단 타겟으로 인식하여 이를 가지고 있는 비정규적 표적의 유전자 발현을 특이적이고 보다 강력하게 저해할 것으로 생각하고, 이러한 사실을 루시퍼라제 리포터 실험을 통해 확인하였다 (도 2b-c).
우선은 miR-124가 기존의 정규적인 표적인 발단 싸이트(seed site)에 비하여 얼마나 비정규적인 표적인 핵융기 타겟 싸이트를 억제할 수 있는지를 확인하기 위해서 루시퍼라제 리포터에 miR-124에 대한 해당 싸이트를 삽입하였고, 이와 함께 여러 농도 (0, 0.01, 0.1, 0.5, 2.5, 15nM)의 miR-124를 세포에 도입 시킨 후 루시퍼라제의 활성으로 IC50 (inhibitory concentration 50)를 측정해 본 결과, 정규 발단 싸이트는 약 0.5nM, 비정규 핵융기 싸이트는 약 0.2nM로 유사한 것으로 확인할 수 있었다 (도 2b). 하지만 최고로 억제되는 비율을 보면 정규 발단 싸이트는 약 50%, 비정규 핵융기 싸이트는 약 80%로 비정규 핵융기 싸이트를 통한 저해가 다소 약함을 알 수 있었다. 특히 유전자 발현 저해가 시작되는 점을 살펴 보았을 때, 정규 발단 타겟은 약 0.01nM 이상에서, 비정규 핵융기 타겟은 0.1nM 이상의 농도 조건에서 유전자 억제가 시작되는 점을 루시퍼라제 활성 측정을 통해 확인하였다 (도 2b). 따라서 miR-124는 정규 타겟과 비정규 핵융기 타겟의 발현을 조절하며, 정규 타겟 발현 조절 효율이 높다는 점을 알 수 있었다.
이때 실시한 루시퍼라제 리포터 실험은 해당하는 miR-124 타겟 싸이트 서열을 psi-check2 벡터 (Promega 사)의 레닐라 루시퍼라제 유전자 3'UTR (3'untranslated region) 부분에 2번 연속 배열로 클로닝 하여 실시하였다. 비정규 융기싸이트 서열은 MINK1의 3'UTR 부분에 자연적으로 존재하는 비정규 핵융기 타겟 싸이트 를 사용하였다. miR-124는 인간 유래의 서열로 miRBase 데이터베이스에 따라, 해당되는 가이드 가닥 (guide strand), 운반 가닥 (passenger strand) 을 각각 Bioneer사에서 화학적으로 합성 제작 후, HPLC로 분리, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체 (duplex)로 제조하였다. miR-124와 루시퍼라제 리포터 벡터는 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 대략 10,000개의 자궁경부암 세포 (HeLa: ATCC CCL-2) 에 전달(co-transfection)시켰다. HeLa 세포는 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지 (Invitrogen)에서 배양하였으며, 트랜스펙션 수행시는 항생제 없는 완전배지에서 세포를 배양하였다. 트랜스펙션을 수행한 24시간 후, Promega사의 Dual-luciferase reporter assay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하였으며, 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 promega사의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 3번 이상의 반복 실험하였고, 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 의해 표준화되어 계산하였다.
miR-124의 비정규 핵융기 타겟만을 특이적으로 억제하기 위해 발명한 miR-124-BS의 기능을 확인하기 위하여, 동일하게 루시퍼라제 리포터를 사용하여 실험하였다. 그 결과 miR-124-BS는 miR-124 정규 발단 타겟에 대하여 어떤 농도 (0~ 10 nM) 에서도 루시퍼라제 리포터 효소 활성을 저해시키지 못하였으나, miR-124 비정규 핵융기 타겟 리포터에 대해서는 0.1nM 이상의 농도에서 루시퍼라제 리포터 효소 활성을 저해시키는 효과를 확인할 수 있었다 (도 2c). 이때의 유전자 억제 효율을 IC50으로 측정해보았을 때 비정규 핵융기 타겟에 대한 억제가 약 0.5nM로 나타났다. 이러한 점으로 보아, miR-124-BS의 miR-124 비정규 핵융기 타겟 발현 조절 기능은 비정규 핵융기 타겟 싸이트 특이적이라고 해석할 수 있다 (도 2c). 이때의 루시퍼라제 리포터 실험은 miR-124-BS를 이전과 동일하게 바이오니아사에서 합성하여 제작하고, 해당 루시퍼라제 리포터 벡터와 함께 자궁경부암 세포 (HeLa: ATCC CCL-2)에 트랜스펙션(co-transfection)한 후 24시간 후에 루시퍼라제 효소 활성을 측정하여 수행하였다.
상기의 실시예에서 발명자는 마이크로RNA의 비정규 유기 표적만을 억제할 수 있도록 하는 목적으로 해당 싸이트 서열에 대해서 연속적이고 완벽하게 상보적인 발단 지역 서열을 포함하는 miRNA-BS를 발명하였으며, 그 효과를 검증하기 위해서 miR-124에 적용해서 루시퍼라제 리포터 실험을 통해 확인해보았을 때, miR-124-BS가 정규 발단 표적의 발현은 억제하지 못하고, 비정규 융기 표적의 발현은 효과적으로 억제할 수 있다는 특징을 검증할 수 있었다.
[ 실시예 3] miR -124의 비정규 핵융기 타겟 발현 저해를 통해 유도되는 자궁경부암 세포의 세포 사멸현상 관찰
miR-124-BS가 miR-124가 억제하는 여러 표적 중 비정규 융기 표적만을 억제한다는 사실을 이전 실시예에서 확인한 후, 이를 통해 miR-124의 특정 기능만을 나타낼 수 있는지를 확인하고자 하였다. miR-124의 경우 일반적으로 신경세포에만 특이적으로 발현되므로 주로 신경세포에 관련된 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만 종양으로 발생된 야교종에서는 miR-124의 발현이 떨어져 있으며, 이와 상관되어 miR-124의 발현을 인위적으로 종양세포에 유도할 경우 종양 세포의 사멸을 일으킬 수 있다는 사실이 관찰되었다. 따라서 이러하게 miR-124의 다양하고 다른 기능이 그 표적을 인식하는 종류에 따라 다른지를 확인하고자, miR-124-BS를 자궁경부암 세포(HeLa)에 도입하고 세포의 사멸을 유세포 분석으로 관찰하였다 (도 3a).
본 실험은 75nM의 miR-124 또는 miR-124-BS 이중체를 자궁경부암 세포 (HeLa: ATCC CCL-2)에 RNAiMAX 시약(Invitrogen 사)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스팩션(transfection)한 후, 72시간 후에 트립신을 처리하여 세포를 배양 접시로부터 떼어내고, BD Pharmingen　社 의 Annexin V: FITC Apoptosis Detection Kit II 를 제조사가 제공한 방법에 따라 세포를 처리하여 BD Aria I (BD Biosciences)으로 Annexin V로는 apoptosis를 PI(Propidium Iodide)로는 necrosis를 측정하여 수행하였다. 이때 대조군으로는 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-miR-67의 서열과 동일하게 합성하여 사용하였다
이러한 실험을 각각 대조군, miR-124 발현, miR-124-BS 발현으로 나누어서 비교해본 결과, miR-124가 발현 되었을 경우 자궁경부암 세포(HeLa)에서 대조군에 비해 apoptosis (Annexin V 로 염색 된 세포의 수)에 의해서 사멸이 진행되는 비율이 약 30%에서 약78%로 증가하는 것을 관찰하였으며, 동일하게 miR-124-BS도 약 73%로 2배이상 증가하는 것을 확인하였다 (도 3a). miR-124-BS가 miR-124의 정규 발단 싸이트는 억제하지 못하고 비정규 융기 싸이트만을 억제했던 이전 실시예 2의 결과로 비추어 볼 때, 자궁경부암의 세포 사멸은 비정규 핵융기 타겟의 발현 억제로 일어남을 알 수 있다.
miR-124 는 뇌조직 특이적 마이크로RNA로, 조직세포 특이적 전사체 발현이 없는 전혀 다른 세포에서는 뇌조직 특이적 기능을 하지 않는다고 보고된 바 있다 (Farh K et al, 2005, Science, 310 (5755) 1817-21). 따라서, miR-124가 비정규 융기 표적을 억제함으로 일으키는 기능을 신경 세포에서 관찰하기 위해서, miR-124-BS를 소뇌 신경줄기세포주인 C17.2에 도입한 후, 세포분화를 세포 형태학적으로 관찰하였다 (도 3b, 위의 도면). 그 결과 miR-124를 도입한 경우에는 C17.2 세포의 신경 돌기 가지 분화가 길게 만들어 지면서 촉진되었으나, miR-124-BS의 경우에는 분화는 관찰되었으나 가지가 짧은 형태로 다르게 관찰되었다. 따라서 miR-124에 의해서 일어나는 일반적인 신경 돌기 가지 분화는 정규적인 발단 싸이트 표적을 억제함으로 일어나는 것을 알 수 있다. 이때, miRNA의 도입은 이전 실시예 2와 동일한 방법으로 50nM의 miRNA를 합성하여 RNAiMax 시약으로 실행하였다.
또한, 이전 HeLa 세포에서 miR-124-BS가 세포 사멸을 유도하였으므로, 신경세포에서도 이러한 기능이 나타나는 지를 실시예 2에서 수행한 방법과 동일하게 C17.2 세포에서 유세포 분석으로 관찰하였다. 그 결과 miR-124 발현의 경우에는 세포사멸이 일어나는 비율이 대조군의 21%에 비해서 거의 비슷한 정도인 22.4% 인데 비해, miR-124-BS는 33.4%로 다소 증가하는 것으로 나타났다 (도 3b, 중간 도면). 이는 자궁경부암 세포에서 동일하게 세포 사멸이 miR-124의 비정규 융기 표적 억제를 통해 일어난다는 점에서 동일한 경향성을 보이나, 그 증가율은 약 2배로 나타나는 자궁경부암보다는 매우 작은 것을 알 수 있었다. miR-124는 신경줄기세포에서 분화에 관련된 역할을 주로 하는데, 이때 세포주기의 조절은 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서 miR-124와 miR-124-BS를 C17.4 세포에 도입한 후 세포주기를 PI(Propidium Iodide) 염색을 통해 유세포 분석을 적용하여 관찰하였다 (도 3b, 밑의 도면). 이때 miR-124는 G0/G1에서의 세포주기 정지 상태(cell cycle arrest)를 대조군인 69%에 비해 다소 증가시킨 83%로 유도시키는 것으로 나타났다. 이에 비하여 miR-124-BS의 발현은 세포주기 정지가 현저하게 일어나지 않음을 관찰할 수 있었다. 이때의 실험은 이전 실시예와 동일하게 해당 마이크로RNA를 트랜스팩션하고 48시간동안 배양 후, 세포를 떼어 에탄올로 고정 (fix) 하고 1mg/ml 의 propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich)를 0.2 mg/ml의 RnaseA 와 함께 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 BD FACSCalibur (BD Biosciences) 로 유세포 분석을 수행하였다.
상기의 실시예에서의 결과를 정리하면, miR-124-BS에 의해 miR-124 비정규 핵융기 타겟 발현을 저해하는 경우만으로도, miR-124와 동일하게 자궁경부암 세포 (Hela) 의 사멸을 유도하며, 이를 통해 miR-124의 비정규 융기 표적의 저해 기능은 암세포의 사멸임을 알 수 있다. 또한 신경줄기세포의 경우 miR-124의 발현에 의해서 신경 돌기 가지 분화가 일어나면서, 약간의 세포사멸과 세포 주기 정지가 일어나는 데, miR-124의 비정규 융기 표적만을 저해하는 miR-124-BS에서는 이러한 기능 다소 다른 형태로 나타난다. 따라서 miR-124의 신경세포 분화 기능은 기존의 알려진 정규적인 발단 표적 유전자의 억제에 의해서 주로 일어남을 알 수 있으며, 다른 형태로는 비정규 융기 타겟을 통해 일어날 수 있음을 생각할 수 있었다.
[ 실시예 4] miR -124-BS가 miR -124 비정규 핵융기 타겟 발현을 저해함으로써 가지가 많고 돌기가 짧은 다른 형태의 신경분화(branched neurite outgrowth) 유도 기능 확인
miR-124-BS가 miR-124와는 다른 형태의 신경 가지 돌기 분화를 일으키는 것을 이전 실시예에서 확인한 후, 이를 보다 자세히 살펴보기 위해서 인간 신경 모세포종(neuroblastoma)인 sh-sy-5y 세포주(CRL-2266)를 사용하여 실험을 하였다. 이때 추가적으로 miR-124-BS 이외에 miR-124의 비정규 핵융기 싸이트를 인식하고 억제할 수 있는 발단 서열을 동일하게 가지지만, 이외의 서열은 다른 서열을 가지고 있는 마이크로RNA 서열을 miR-124와 동일하게 한 miR-124-BS(4753)을 이전 실시예에서 기술한 방법으로 합성하여 실험을 진행하였다. 이때 사용한 miR-124-BS(4753)의 서열은 5‘-CAAGGCCAAAGGAAGAGAACAG-3’ 이며, 대조군(control)으로써는 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-miR-67(NT; non-targeting)의 서열과 동일하게 합성하여 사용하였다. 해당되는 miRNA를 이전 실시예에서 기술한 동일한 방법으로 트랜트팩션하고 60시간 동안 세포를 배양을 한 후, 세포 형태학적 변화를 광학현미경으로 관찰하였다 (도 4a).
그 결과, miR-124의 발현은 인간 신경 모세포종 (Sh-sy-5y)의 신경돌기를 길게 분화시키는 형태상 변화를 관찰할 수 있었으며, 반면에 miR-124의 비정규 융기 표적만을 억제할 수 있는 발단 서열을 miR-124-BS와 동일하게 지니고 있는 miR-124-BS(4753)의 경우에는, 짧지만 한 세포에서 많은 수의 신경 돌기 가지가 생기는 세포 형태 (branched neurite outgrowth) 가 관찰되었다 (도 4a). 이를 바탕으로 추가로 카테콜아민계 신경세포 (CAD, CRL-11179)에서도 동일한 실험을 진행해 보았다. 이때는 해당 마이크로RNA를 트랜스펙션 시키고, 52시간 동안 세포를 배양한 후 관찰하였다 (도 4b). 그 결과 인간 신경 모세포종 (Sh-sy-5y, CRL-2266) 세포에서 보인 결과와 동일하게 miR-124는 숫자가 적지만 긴 돌기를 형성하고, miR-124-BS(4753)은 짧지만 많은 신경돌기 가지가 뻗어 나오는 분화 현상을 관찰할 수 있었다. (도 4b). 추가적으로, miR-124와 miR-124-BS(4753)을 함께 동일 비율로 세포내에 전달할 경우, 긴 신경 돌기를 가진 세포와 많은 신경돌기 가지를 친 세포가 동시에 관찰되었다. 이는 발명한 miR-124-BS와 기존의 miR-124와 함께 발현했을 경우, 인위적으로 좀 더 복잡한 신경 네트워크에서 보이는 뇌세포와 유사하게 다양한 형태의 신경 분화를 촉진시킬 수 있는 가능성을 보여준다.
추가적으로 이러한 마이크로RNA에 의해서 촉진되는 CAD 세포주의 신경분화는 신경세포 특이적인 마커인 Tuj1에 대한 면역 염색을 통해서 확인하였다 (도 4b, 아래 도면). 이때의 실험은 해당 마이크로RNA를 트랜스팩션 한 후 52시간 후에, CAD 세포를 4% 파라포름 알데하이드로 고정 (fixation) 후, 1차 항체인 Tuj1 (MRB-435P, Covance Antibody Products　社) 을 1:1000 의 비율로, Alexa 594 형광물질이 결합된 2차 항체 (Abcam: ab150076)는 1:1000 의 비율로 항체 염색 (immune-staining) 한 후, DAPI로 핵을 염색하여 수행하였다.
상기의 실시예의 결과로 미루어, miR-124는 비정규 핵융기 표적만을 억제하므로써 기존의 miR-124의 기능과는 다른 형태인 짧지만 많은 신경돌기 가지를 형성시키는 기능을 가지고 있음을 알 수 있다. 특히 miR-124-BS와는 서열이 다르나 동일하게 발단지역의 서열을 가지고 있어서 비정규 핵융기 표적만을 억제할 수 있는 miR-124-BS(4753)을 사용하여 이러한 사실을 관찰하였으며, 이는 비정규 핵융기 표적을 인식할 수 있는 발단 서열을 포함하고 있는 RNA간섭 유도체는 miR-124-BS와 동일한 효과를 나타내다는 사실을 밝혀준다. 또한 miR-124-BS에 의해서 생성되는 복잡한 신경돌기 가지는 복잡한 신경 네트워크를 보이는 인간 뇌세포와 유사하게 다양한 형태의 신경 분화를 촉진시킬 수 있는 방법으로 활용될 수 있음을 나타낸다.
[ 실시예 5] miR -124-BS를 siRNA와 shRNA 벡터로 발현시킨 후, 이로 인하여 유도되는 신경 돌기 분화(branched neurite outgrowth) 의 형태 및 분자생물학적 특징 확인.
miR-124-BS의 발현으로 유도되는 특이적인 신경 돌기 분화 현상을 생쥐 신경 모세포종인 N2a (CCL-131)에서 추가적으로 확인하고자, 실시예 4와 동일하게 miR-124, miR-124-BS(4753)을 세포에 도입한 후 72시간동안 배양하면서 세포의 형태 변화를 관찰하였다 (도 5a). 또한 동시에 miR-124의 발단 서열을 동일하게 가지고 있지만 그 외의 부분은 다른 서열을 지닌 miR-124(3714)도 5‘-GAAGGCAGCAGUGCUCCCCUGU-3’ 서열로 합성하여 siRNA 형태로 이중체를 형성시킨 후 세포에 도입하여 실험하였다. 이때 대조군으로써는 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-miR-67(NT; non-targeting)의 서열과 동일하게 합성하여 사용하였다.
그 결과, miR-124 가 전달된 실험군에서는 카테콜아민계 신경세포인 CAD에서 보인 것과 유사한 긴 신경돌기를 가지는 신경세포를 관찰할 수 있었고, miR-124-BS(4753)을 트랜스팩션한 세포에서는 다양한 방향으로 가지를 뻗은 짧은 신경돌기를 가진 세포 형태상의 특징을 확인할 수 있었다(도 5a, 위). 또한 miR-124(3714)를 트랜스펙션한 실험군에서는 miR-124와 동일하게 비교적 긴 세포 돌기를 보이는 세포를 많이 관찰 할 수 있었다(도 5a, 위). 이와 같은 세포 형태상의 변화는 분화된 신경세포에서 발현되는 해당 단백질에 대한 항체, Tuj1 (Covance Antibody Products, MRB-435P), vGLUT1(synaptic systes 사, 135-303), MAP2 (millipore 사, MAB3418)을 사용하여 그 발현 양이 증가한 것을 면역 블롯 실험(immuno blotting)을 통해 4가지 대조군 단백질(ACT-B, TUB-A, GAPDH, H3B)의 발현에 대비하여 확인할 수 있었다 (도 5 a, 아래). 이를 통해 miR-124와 유사하지만 다른 형태를 보이는 miR-124-BS(4753)에 의한 신경분화는 형태학적으로는 다소 다르나, 유전자 발현 마커상 동일하게 분화를 유도한 것을 확인할 수 있었으며, miR-124와 동일한 발단 서열을 지니고 있어서 동일하게 주로 정규적 발단 표적을 억제할 것으로 보이는 miR-124(3714)는 예상대로 miR-124처럼 신경세포의 가지가 길게 분화하는 특징을 보인다는 점을 알 수 있었다. 또한 miR-124-BS(4753), miR-124(3714)가 발현된 경우 모두다 분화된 신경세포에서 보이는 단백질 발현양이 증가되었는바, 이들은 모두 분화된 형태의 신경세포의 분자적 특징을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.
지금까지의 실시예서의 마이크로RNA의 발현은 합성된 이중체를 세포에 도입하여 실시하였으나, 마이크로RNA의 발현은 이를 생성시킬 수 있는 헤어핀 형태의 RNA인 shRNA 형태를 발현 시키는 벡터를 도입하여서도 가능하다. 따라서 pre-miRNA로 발현시키는 벡터인 pCAG-miR30 플라스미드 (addgene #14758)를 사용하여 miR-124, miR-124-BS(4753), miR-124(3714)를 shRNA 형태로 발현시키는 벡터를 제작하였다. 이때 사용한 pCAG-miR30 벡터는 마이크로RNA를 강하게 발현시키기 위해 CAG 프로모터를 사용하였고, 마이크로RNA-30 의 원형체 (backbone)를 발현시키도록 디자인 되어서, 마이크로 RNA 발현을 극대화 시키는 장점을 지니고 있다 (Paddison P et al, Nature methods, 2004, 1(2): 163-7).
각각 miR-124, miR-124-BS(4753), miR-124(3714)를 발현시키도록 만들어진 pCAG 벡터는 아무것도 발현되는 않는 pCAG 벡터를 대조군으로 사용하여, N2a 세포에 도입되었고, 그 이후 세포 형태를 관찰하였다 (도 5b). 신경 모 세포종인 N2a에 도입된 헤어핀구조의 실험군은, miR-124, miR-124-BS(4753), miR-124(3714) 이중체가 보이는 세포 형태상의 변화와 유사한 변화를 보였다. 트랜스펙션 후 72시간 배양시, miR-124와 miR-124(3714)가 발현된 실험군에서는 긴 신경돌기를 지닌 신경 모 세포종을 관찰할 수 있었다. 이에 반하여, miR-124-BS(4753)가 발현된 실험군에서는 짧고 다양한 방향으로 뻗은 신경돌기를 지닌 신경 세포종을 관찰할 수 있었다(도 5b, 위). 이러한 세포 형태의 변화는 분화된 신경세포에서 발현되는 단백질인 Tuj1 (O. von Bohlen et al.　 2007 Cell and Tissue Research, 329, 3, 409-20) 의 발현이나, Synaptophysin (SYP)의 발현이 증가한 것으로 확인되었으며 (도 5b, 아래), 따라서 miR-124, miR-124-BS(4753), miR-124(3714) 헤어핀 벡터가 도입된 세포가 대조군에 비해 분화된 형태의 신경세포의 특징을 지님을 확인할 수 있었다. TUJ1의 증가는 이전 실시예와 동일한 방법으로 면역 블롯 실험으로 관찰하였으며, Synaptophysin은 qPCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction) 실험을 통해 이전 논문 (S.E.Kwon et al. 2011　 Neuron 70, 847-54)에서 기술된 primer 서열을 사용하여 진행하였다. 이때의 실험은 해당 벡터를 N2a 세포에 Lipofectamine 3000 시약 (Invitrogen 사)을 해당 회사의 프로토콜에 따라 사용하여 수행하여 트랜스팩션 한 후, 24시간 후에 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 추출하고, 해당 프로토콜에 따라 Superscript III RT(Invitrogen)로 역전사하고, SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 qPCR을 수행하여 해당 프라이머로 SYP의 전령RNA의 양을 측정하고 GAPDH 전령RNA 값으로 표준화하였다.
상기의 실시예의 결과로 미루어 볼 때, 마이크로RNA의 도입을 shRNA 형태로 발현하게 하는 벡터를 사용하더라도, miR-124의 발단 부분만의 서열만 동일하게 가진다면 (miR-124(3714)), miR-124와 동일하게 정규적인 표적 유전자의 발현 억제를 통해 일반적으로 긴 신경 돌기 분화를 일으킨다는 것을 알 수 있다. 또한 miR-124의 비정규 융기 표적도 shRNA형태로 발단 부분만 miR-124-BS와 동일하게 발현(miR-124-BS(4753))된다면 가지가 더 많은 신경 돌기 분화를 일으킬 수 있다. 이렇게 miR-124에 의한 정규 표적 억제와 비정규 융기 표적 억제 둘다 신경세포의 신경돌기분화형태의 분자적인 유전자 마커 발현을 보이며, 이를 통해 모두 신경세포로 분화했음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 6] miR -124-BS가 MAPRE1 의 발현 조절을 통해 마우스 신경모세포종 (N2a)의 신경돌기분화 유도 확인
추가적으로 miR-124, miR-124-BS(4753), miR-124(3714) 의 신경모세포종(N2a)에서 신경돌기분화 유도를 세포 형태학상으로 관찰하고, 이를 정량적으로 분석하여 보았다 (도 6a). 정량 분석 시, 각각의 신경세포에서 유래한 신경 가지를 구분하기 위해서 녹색형광단백질 (GFP: Green fluorescent protein) 을 발현시키는 pUltra (addgene #24129)　플라스미드와 해당 마이크로RNA 발현 벡터를 이전 실시예에서의 방법과 동일하게 트랜스펙션(co-transfection)시키고, 72시간동안 세포배양을 진행하면서, 신경돌기를 형광현미경 (Leica 사)으로 관찰하면서 신경돌기 가지의 수를 측정하고, 세포당 생성된 신경돌기의 길이를 이미지J 프로그램을 통해 분석하였다.
그 결과, 100개의 세포에 대해, 세포당 발현된 신경돌기 가지의 수 (neurite branch) 가 대조군에 비해 miR-124, miR-124-BS(4753), miR-124(3714) 에서는 약 3~5배 증가한 것을 확인하였다 (도 6a, 아래 왼쪽). 하지만 miR-124-BS(4753)가 발현되 경우에는 miR-124나 miR-124(3714)가 발현된 경우에 비해 유의하게 더 많은 가지가 만들어 짐이 관찰되었다. 또한 세포당 생성된 신경돌기의 길이도 대조군에 비해 miR-124-BS(4753), miR-124(3714) 실험군에서 4~6배로 증가한 것을 확인할 수 있었으면, 보다 자세하게는 miR-124 또는 miR-124(3714)가 발현되었을 경우에는 miR-124-BS(4753)이 발현되었을 때보다 더 긴 신경 돌기 가지가 만들어 진다는 것을 관찰할 수 있었다 (도 6a, 아래 오른쪽). 이는 이전 실시예 (도 4, 도 5, 도 6)에서 세포 형태학적으로 관찰한 것과 동일한 결과이다.
miR-124-BS의 의해서 일어나는 특이적인 신경분화 현상이 어떠한 유전자의 비정규 융기 싸이트에 의해서 일어나는지 알아보기 위해서, 신경분화에 관련된 유전자의 3‘UTR 부분에 서열에서 miR-124의 비정규 융기 표적 서열을 찾아보았다. 그 결과 신경세포의 분화를 조절한다고 보고된 MAPRE1(Microtubule-associated protein RP/EB family member 1: Elena　Tortosa　et al. 2013 EMBO　　　32,　1293-1306) 유전자를 찾게 되었다. MAPRE1은 신경 돌기를 생성시킬 때 이를 구성하는 마이크로튜블(micorotuble)의 끝에 붙는 단백질로 해당 마이크로튜블의 형성 조절을 통해 신경 돌기의 형태를 결정할 수 있다. 따라서 이 MAPRE1 유전자가 miR-124의 비정규 융기 표적으로 인식되어 그 발현이 저해되는 지를 확인하고자, N2a 세포에 miR-124-BS를 도입한 후 MAPRE1의 전령RNA의 양을 실시예 5b에서 수행한 방법에 따라 qPCR 실험을 실시하여 측정해보았다 (도 6b). 2가지 다른 프라이머를 가지고 qPCR을 시행해 보았을 때 두 결과 모두 대조군에 비교하여 miR-124-BS 도입된 실험군에서는 70~40 % 수준으로 MAPRE1 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 MAPRE1이 miR-124의 비정규 융기 싸이트로 그 발현이 억제된다는 것을 확인할 수 있었다.
MAPRE1이 miR-124의 비정규 융기 표적이고, 매우 중요한 타겟이라면, miR-124-BS의 비정규 융기 표적 억제로 인하여 나타나는 신경분화 형태가 MAPRE-1의 발현 감소로 인해서 더 촉진이 되어야 한다. 따라서 이러한 점을 확인하기 위해서 MAPRE1을 저해할 수 있는 siRNA를 2가지 제작하고 이와 함께 miR-124를 함께 N2a 세포에 트랜스팩션하고 세포형태학상 변화를 보이는 지 확인하는 실험을 수행하였다 (도 6c). 그 결과, miR-124만 발현시킨 대조군에 비해서, miR-124와 MAPRE1에 대한 siRNA를 함께 발현시킨 실험군에서 신경돌기 가지가 많이 증가한 것을 관찰할 수 있었고, 이는 두 종류의 다른 서열의 MAPRE1 siRNA를 사용한 실험에서도 동일하게 관찰하였다 (도 6c). 이때의 실험은 이전 실시예에서 사용한 방법과 동일하게 RNA를 세포에 도입했으면, 이 후 48시간동안 세포 배양하면서 형태를 관찰하였다.
이를 통해 miR-124-BS 가 유도하는 짧고 가지가 많은 신경 돌기 분화는 적어도 부분적으로는 MAPRE1 유전자의 발현을 miR-124의 비정규 융기 표적 싸이트를 통해서 억제하여 나타날 수 있는 생물학적 기능임을 확인하였다.
[ 실시예 7] 전사체 수준에서 miR -124-BS의 세포 도입시 miR -124의 비정규 융기 표적 유전자의 저해 경향성 분석
마우스 신경모세포종(N2a)에서 miR-124-BS를 통해 억제된 유전자는 궁극적으로 신경모세포종의 신경돌기가지를 많이 생성시키는 신경세포 분화를 유도한다는 것을 확인하였다 (도 5). 이러한 현상은, miR-124-BS의 발단서열이 miR-124의 비정규 융기 표적을 인식하고 억제하는 기작에 의해서 나타날 것으로 생각되며, 그러한 가능성을 표적 유전자로 찾아낸 MAPRE1으로 확인하였다 (도 6). 하지만 실제로는 수백개의 miR-124 비정규 융기 표적 유전자들이 억제되어 일어나는 현상 일 것이다.
본 발명자들이 발명한 miR-124-BS가 실제로 모든 유전자가 발현되어 있는 전사체 수준에서 miR-124의 비정규 융기 표적 유전자만을 확인하기 위하여, miR-124와 miR-124-BS를 N2a 세포에 도입한 후에 RNA-Seq 분석을 시행하였다. 이때의 대조군으로는 miR-124와 동일한 염기서열이나 5' 말단 기준 6번이 비염기 (pi)인 이중체 (miR-124-6pi)를 사용하였으면, 이러한 변형은 miRNA의 5‘말단 기준 6번째에 염기가 없기에 표적 전령RNA와 전혀 배열하지 못한다고 보고되었다 ((Lee HS et. Al. 2015, Nat Commun. 6:10154).
RNA-Seq 실험은 실험 대조군으로 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-miR-67의 서열에서 5' 말단 기준 6번을 비염기로 변환한 것 (NT-6pi)를 사용하여 N2a세포에 miR-124, miR-124-BS, miR-124-6pi 이중체를 75nM 농도로 각각 전달시키고, 24시간 배양 후, 전체 RNA를 RNAeasy (Qiagen) 키트로 추출한 후, Otogenetics에서 라이브러리를 제작하고 차세대서열분석(Next-generation sequencing)을 수행하였다. 이 후, 상기 실험으로 얻어진 서열 데이터인 FASTAQ 파일을 TopHat2 프로그램으로 마우스 유전체 서열 (mm9)에 맵핑하고, Cufflink, Cuffdiff 프로그램으로 발현값 (FPKM)을 구하여, 대조군 NT-6pi를 도입한 마우스 신경 모세포종 (N2a) 세포에서의 결과로 표준화하여 로그비 (Fold change, log2 ratio)로 나타내어 분석을 실시하였다.
마이크로RNA의 표적 싸이트를 가지고 있는 유전자의 전령RNA의 양이 해당 마이크로RNA의 발현으로 저해되는 지를 RNA-Seq 결과에서 분석하기 위해서 miR-124의 정규 발단 싸이트 (5'말단 기준 2번째에서부터 8번째까지와 염기 배열하는 7mer)를 3'UTR에 가지고 있으면서, 해당 싸이트의 서열이 여러 종에서 보존된 것을 선택하고자 phastCons 점수가 0.9 이상인 유전자를 선별하였고, 이러한 프로파일 결과를 해당 마이크로RNA의 발현에 의존적으로 저해되는 순서대로 누적비율 (cumulative fraction)로 비교 분석하였다. 또한 동일한 방법으로 miR-124의 비정규 융기 싸이트(nuc, 7mer)도 동정하여 해당 유전자의 억제 비율을 동일하게 누적비율로 분석하였다. 이때 miR-124의 비정규 융기 싸이트를 가지고 있는 유전자가 동시에 정규 발단 싸이트를 가지고 있어서, 그 억제 효과에 대한 판단이 어려울 수 있으므로 전체 전령RNA에 miR-124의 정규 발단 서열이 없는 경우 (nuc only)와 반대로 정규 발단 싸이트만 있고 비정규 융기 싸이트는 없는 경우(seed only)도 분석하였다.
miR-124 발현된 실험군의 RNA-Seq 서열분석에서 miR-124 발현에 따른 비율 변화(fold change)를 누적비율 (cumulative fraction)에 따라 분석하였을 때, miR-124의 보존된 정규 발단 싸이트를 3‘UTR에 가지고 있는 유전자(miR-124 seed)나 해당 싸이트 만을 가지고 있는 유전자 (miR-124 seed only)는 전체 유전자(Total mRNA)에 분포에 비해 매우 많이 억제되는 현상을 확인하였으며 (도 7a, 위), 이에 비하여 miR-124의 비정규 융기 싸이트를 가지고 있는 유전자는 유의하게 억제되다 매우 약한게 저해되는 것으로 관찰할 수 있었다 (도 7a, 아래). 하지만, 이러한 억제 현상은 대조군인 miR-124-6pi를 도입한 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 7b).
본 발명자가 개발한 miR-124-BS를 발현시킨 경우에서는 RNA-Seq 서열분석에서 miR-124-BS 발현에 따른 비율 변화(fold change)를 누적비율 (cumulative fraction)에 따라 분석하였을 때, miR-124의 보존된 정규 발단 싸이트를 3‘UTR에 가지고 있는 유전자(miR-124 seed)에서는 약간의 저해 효과를 보였지만, miR-124의 비정규 융기 싸이트는 없고 해당 정규 발단 싸이트 만을 가지고 있는 유전자 (miR-124 seed only)에서는 전혀 변화가 없음을 확인하였다 (도 7c, 위). 하지만, miR-124의 비정규 융기 표적을 가지고 있는 유전자의 경우 (miR-124 nuc)나 해당 표적만을 가지고 있는 유전자의 경우 (miR-124 nuc only) 둘 다 강하고 유효하게 유전자 억제 현상이 일어남을 알 수 있었다 (도 7c, 아래). 도 7c에서 miR-124-BS가 발현 되었을 경우, miR-124의 정규 발단 싸이트 만을(miR-124 seed only) 가지고 있는 유전자는 저해가 일어나지 않는 것으로 보아 miR-124의 정규 발단 싸이트를 전혀 억제하지 못하는 것으로 결론을 내릴 수 있지만, miR-124-BS가 다소 miR-124의 발단 싸이트 표적을 저해한 것은, 아마도 하지만 miR-124의 정규 싸이트가 있는 경우에는 아마도 miR-124의 비정규 융기 싸이트가 함께 존재하여 억제 효과를 조금이라도 나타내는 것으로 추측된다.
상기의 실시예의 결과로 미루어 볼 때, 전사체 수준에서 miRNA는 기존의 정규 발단 표적 유전자의 억제를 매우 강하고 효율적으로 억제하지만, 비정규 융기 표적은 매우 약하게 저해함을 알 수 있었으며, miRNA-BS는 전사체 수준에서 miRNA의 비정규 융기 표적의 발현을 억제하지만, 기존의 정규 발단 서열은 억제하지 못한다는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 8] miR -122-BS가 인간 간암세포주 ( HepG2 ) 에서 유도하는 세포 주기 정지 상태 (cell cycle arrest)의 유세포 분석을 통한 확인
miR-124의 비정규 핵융기 표적에 의한 miR-124의 신경세포 분화유도를 관찰한 결과를 바탕으로 다른 마이크로RNA의 비정규 핵융기 표적의 생물학적 기능에 대한 실험을 수행하였다. miR-122 는 발단 염기 서열로 5'-UGG AGU GU-3'를 가지며, 이의 비정규 핵융기 타겟 싸이트와 염기 배열하는 siRNA의 염기 서열인 miR-122-BS는 6번 U가 한번 더 반복되는 형태 일 수 있으며, 이 경우에는 5'-UGG AGU U GUG ACA AUG GUG -3' 서열을 5‘ 말단에 가지면서 19개의 염기로 구성되며, 20번째와 21번째 염기로는 dt (Deoxy Thymine Nucleotide)로 이루어 진다. 특히 이중체 구조에서는 해당 dt 부분이 3'말단에 2개의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 구성할 수 있도록 가이드와 운반자 가닥의 이중체로 구성하였다. 이때, 운반자 가닥은 가이드 가닥과 완전 상보 염기 결합을 하며, 5'말단 기준 1번째와 2번째 모두를 2'OMe로 변형하고, 염기 서열 끝에 dt 를 2개 포함하게 구성하였다 (도 8a). miR-122-BS의 가이드 가닥과 운반자 가닥은 바이오니아사 에서 화학적으로 합성하고 HPLC로 분리하였으며, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체(duplex)로 제조하였다.
이렇게 제조한 miR-122-BS (도 8a)를 인간 간암세포주 (HepG2)에 도입하고 이후 세포 주기의 변화를 유세포 분석을 통해 관찰하였다. 이때의 실험은 대조군인 NT-6pi, miR-122, miR-122-BS의 이중체를 50nM 농도로 HepG2에 RNAiMAX (Invitrogen) 시약을 이용하여, 세포에 전달 (transfection) 하고, 24 시간 배양 후, 노코다졸(nocodazole) 을 100ng/ml 로 16시간 동안 처리하여 G2/M (분열준비기/분열기)에 세포를 동기화(synchronization)한 다음, Muse TM Cell Cycle Kit (Catalog No. MCH100106, Milipore)을 이용하여, 회사가 제공하는 실험 방법에 따라 Muse Cell Analyzer (Milipore) 로 세포 주기를 분석하였다.
그 결과, NT-6pi 가 전달된 대조군의 세포주기 분석과 비교하여, miR-122-BS 실험군은 G0/G1기의 세포가 10. 7% 에서 24.3% 로 약 2배 정도 증가하는 것으로 간암 세포인 HepG2의 세포 주기 정지가 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 8b-c). 이러한 G0/G1기의 세포 증가는 miR-122가 전달된 세포에서는 관찰되지 않았다. 이어, miR-122-BS 가 전달된 인간 간암세포주 (HepG2)의 G2/M 기 세포분포는 대조군과 비교시 83. 4% 에서 67.3% 로 감소하였으며, 이러한 결과는 miR-122가 전달된 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 8b,c).
이를 통해 miR-122-BS 는 miR-122 의 비정규 핵융기 표적 발현의 조절을 통해, 인간 간암 세포주에서 세포주기 정지를 유도하는 생물학적 기능을 보이며, 이는 miR-122 가 작용하는 생물학적 기능과는 전혀 다른 기능임을 관찰할 수 있었다.
[ 실시예 9] miR -1-BS가 골격 근육세포 ( C2C12 ) 에서 유도하는 근육섬유화 기능 및, miR -155-BS가 세포 사멸 기능 확인
miRNA-BS가 miRNA의 정규 발단 표적의 발현을 억제해서 나타나는 기능과는 다른 새로운 생물학적 기능을 관찰하였기에, 이러한 기능이 근육세포에서 어떻게 나타나는 지를 관찰하기 위해서 근육세포에서 발현하면서 중요한 기능을 하는 miR-1, miR-155에 miRNA-BS를 적용해보았다.
우선, miR-1은 근조직 특이적 마이크로RNA로, 근세포 분화 (differentiation) 에 기능한다고 보고되어 있으므로 (Chen J et.al, Nature genetics, 2006, 38(2): 228-233), miR-1-BS를 골격 근육세포주인 C2C12에 발현시킨 후 세포 형태학적 변화(도 9a)와 분화시에 발현되는 유전자 마커의 발현 유무(도 9b)를 조사하였다. 이 때 miR-1-BS를 이전 실시예에서 사용한 동일한 방법으로 합성하고 세포에 트랜스팩션 해주었으며, 48시간 동안 세포 배양시 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지 (Invitrogen)를 사용하여 이는 증식 배양 조건 (growth condition; GM) 상태 (도 9a, 위)와 이렇게 키운 후 FBS를 제거한 결핍 배양 조건 (deprivation media condition; DM) 으로 48시간 더 배양한 상태(도 9a, 아래)로 나누어서 관찰하였다. 이후 세포는 4% 파라포름 알데히드 (para-form aldehyde: PFA)를 처리하여 세포를 고정하고 분화된 근육세포에 발현하는 myosin 2 heavy chain 단백질을 1차 항체 (MF20 : Developmental studies hybridoma bank ) 로 반응 시킨 후 , Alexa 488 형광물질이 붙은 마우스 2차 항체 (ab150105) 로 염색하여 세포 형태 및 분화를 관찰하였다 (도 9a).
그 결과 생쥐 골격 근육세포(C2C12)는 증식 배양 조건(GM)에서는 miR-1-BS가 발현되었을 때, 대조군인 NT나 miR-1 이중체가 전달된 세포에 비해서 더 많은 수의 분화된 근세포를 MF20 염색 결과로 확인 할 수 있었다. 배양시 혈청을 감소시키는 결핍 배양 조건 (deprivation media condition; DM)에서는 근섬유 (muscle fiber) 로의 분화가 진행되는 것을 모두 관찰 하였으나, miR-1-BS가 대조군인 NT를 발현시킨 골격 근육세포에서 보다 더 굵은 형태를 관찰 할 수 있었다 (도 9a). 이는 miR-1-BS가 증식 배양 조건에서 보다 빨리 근세포 분화를 유도하여 생긴 결과 일 수 있다. 이러한 근육 세포의 분화는 분화시에 발현이 증가하는 유전자의 발현 양을 마커로 분자적으로 확인할 수 있는데, 이에 따라 sk-actin과 Myogenin 발현 양을 해당 전령RNA에 특이적인 프라이머로 RT(Reverse transcription)-PCR을 수행해서 분화시에도 발현량에 차이가 없는 b-actin의 전령RNA의 양과 비교하여 검출해 보았다 (도 9b). 그 결과 miR-1(1)과 miR-1-BS(1BS) 모두 발현시에 sk-actin과 Myogenin의 전사량이 증가함을 확인 할 수 있었으며, Myogenin의 경우 그 양이 miR-1-BS에 의해 miR-1보다 더 많이 증가함을 관찰할 수 있었다
miR-155는 근세포 분화를 억제하는 마이크로RNA (Seok H et. Al, JBC, 286(41):35339-46　2011)로, 위에서 miR-1에 대해서 실시한 동일한 방법으로 miR-155-BS의 효과를 골격 근육세포(C2C12)의 분화를 통해 관찰하였다 (도 9c). 그 결과, 대조군인 NT, miR-155, miR-155-BS를 발현시킨 후 증식 배양 조건(GM)에서는 세포의 별다른 형태학적 차이를 관찰하지 못하였으나, 근 세포의 분화를 유도하는 결핍 배양 조건(DM)에서는 대조군은 분화되고, miR-155이 발현되는 경우에는 억제되지만, miR-155-BS를 도입한 경우에는 분화가 도리어 없어지는 것을 myosin 2 heavy chain 단백질을 통한 면역염색(immune-staining) 실험을 통해 확인하였다 (도 9c). 특히, miR-155-BS를 발현한 C2C12 세포를 자세히 살펴보았을 때, miR-155-BS 가 세포의 사멸을 유도한 것이 관찰되었다. 이에 반해, miR-155가 전달된 근세포에서는 세포 사멸은 전혀 관찰되지 않았다 (도 9c, 아래). 이를 보다 자세히 조사해보기 위해서 해당 마이크로RNA가 발현된 C2C12 세포를 48시간동안 증식 배양 조건에서 키운 후에, 실시예 3에서의 방법과 동일한 유세포 분석을 적용하여 세포 사멸을 살펴보았다 (도 9d). 그 결과, miR-155-BS 가 전달된 실험군은 대조군에 비해 약 1.5~2.5배 이상 세포사멸이 증가한 것으로 확인되었다 (도 9d, e).
상기의 실시예를 통해, miR-1-BS는 골격 근육 세포의 분화를 촉진하여 굵은 근 섬유 분화를 유도하며, miR-155-BS는 골격 근육 세포의 사멸을 유도하며, 이러한 기능은 기존의 근육 세포를 수축시키는 miR-1의 기능과 근육 세포 분화를 억제하는 miR-155의 기능과는 다른 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 10] Ago HITS CLIP 분석에서 워블 (wobble) 염기 배열을 마이크로RNA의 발단위치에서 허용하는 비정규 표적 싸이트의 발견
마이크로RNA의 표적을 전사체 수준에서 분석할 수 있는 방법으로는 Ago HITS CLIP이라는 실험 방법이 개발되어 널리 사용되고 있다 (Nature, 2009, 460 (7254): 479-86). Ago HITS CLIP 실험은 세포나 조직 샘플에 UV를 조사하여 세포내에서 RNA와 아고너트 단백질 사이에 공유결합을 유도하고, 이렇게 생성된 RNA-아고너트 복합체를 아고너트를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 면역침강법으로 분리한 다음, 분리된 RNA를 차세대염기서열 (Next-generation sequencing)로 분석하는 방법이다. 이렇게 얻어진 염기서열 데이터는 생물정보학적 분석을 통해서 마이크로RNA의 표적mRNA를 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 그 결합 위치와 서열도 정확하게 분석할 수 있다 (Nature, 2009, 460 (7254): 479-86). Ago HITS-CLIP은 최초로 생쥐의 대뇌피질 조직에 적용되어 뇌 조직에서의 마이크로RNA의 표적에 대한 지도를 작성하였고, 그 이후 지금까지 여러 조직에 해당 방법이 적용되었다. 이러한 여러 Ago HITS-CLIP 분석을 통해 여러조직에서의 마이크로RNA 결합 위치가 밝혀지게 되었고, 특히 이러한 표적 서열에서 마이크로RNA의 발단 결합과는 유사하지만, 표적 mRNA의 서열에서 다른 형태의 비정규적 결합 표적이 많이 존재한다는 것을 알게 되었다 (Nat Struct Mol Biol. 2012 Feb 12;19(3):321-7).
밝혀진 비정규적 결합 법칙 중 일부는 기존의 알려진 염기배열 이외에 G:U 염기배열을 통한 워블(wobble)로 존재한다는 것이 관찰되었다. 워블 염기배열은 기존의 염기배열과는 다르게 특정 RNA에서 발견되며, 잘 알려진 G:U 워블은 마이크로RNA의 비정규 표적에서도 배열할 수 있음이 제시되었다. 하지만 이에 비해 그 결합이 약하고 자주 관찰 되지 않았고, 특히 G:A 워블의 경우는 특정 RNA에서 염기배열을 형성할 수 있지만 그 외에는 전혀 조사가 되지 않았다. 하지만 마이크로RNA의 발단 서열 같은 경우에는 염기배열의 자유에너지(free energy)가 구조적으로 아고너트 단백질에 의해 안정화되기 때문에 일반적으로 약한 G:A 염기배열이 상대적으로 중요할 수 있으며, 본 발명자들은 이러한 사실에 주목하여 다음과 같은 분석을 진행하였다.
우선은 G:A를 포함한 워블 염기배열이 사람의 뇌 조직에서의 마이크로RNA 표적에 존재하는지를 확인하기 위해서 사후 뇌 조직의 회백질 (gray matter)에 Ago HITS-CLIP을 수행한 데이터(Boudreau RL et al, Neuron, Vol.81 (2), 2014, 294-305)를 분석하였다 (도 10a). 이때의 분석은 Ago HITS-CLIP을 개발(Nature, 2009, 460 (7254): 479-86)했을 때의 방법에 따라 아고너트-마이크로RNA와 함께 결합했던 RNA 서열을 시퀀싱된 FASTQ 파일에서 Bowtie2 프로그램으로 인간 유전체 서열에 배열하여 수행하였다, 또한 동시에 해당 시퀀싱 결과를 인간 마이크로RNA서열에 배열하여, 해당 뇌 조직에서 아고너트 단백질 자주 결합하고 있는 20 종류의 마이크로RNA (top20 miRNA: 도 10b) 도 분석하였다. 최종적으로는 이렇게 파악한 top20 miRNA에 대하여 해당 발단 (seed) 서열인 5’말단으로부터 2번째부터 8번째까지에 대하여 상보적인 서열을 가지는 정규 표적(canonical target) 싸이트를 살펴보았다 (도 10b). 이때 마이크로RNA 결합위치에, 상당히 많은 수의 정규 발단 표적 싸이트가 발견됨을 관찰하였다 (도 3b, 미디안 값 1292.5싸이트, 오차범위+/- 706.62). 이 후, 이러한 마이크로RNA의 발단 염기 서열에서 G:U 또는 G:A 워블 염기배열로 결합할 수 있는 비정규적 표적 싸이트가 존재하는 지를 Ago HITS-CLIP 데이터에서 살펴보았다. 이 때 분석에 대한 대조군(Control)으로 마이크로RNA 발단 (seed) 염기 서열과 동일한 염기 서열로 인해 염기의 상보적 배열이 불가능한 표적 서열을 사용하여 분석하였다.
분석 결과, G:A 워블이 허용된 표적 (중앙값 1119.5 싸이트, 오차범위+/- 526.48) 과 G:U 워블이 허용된 표적 (중앙값 995싸이트, 오차범위+/- 523.22) 싸이트 모두 대조군 (중앙값 891싸이트, 오차범위+/- 410.71) 에 비해 높은 분포를 보였으며, 특히 G:A 워블이 존재하는 마이크로RNA 표적 싸이트는 G:U 워블보다 약 1.1배 더 많이 존재함을 나타내었다 (도 10b). 뇌조직에서 특이적으로 발현되는 miR-124는 발단 부분에 2개의 G를 5’말단으로부터 4번째와 5번째에 가지고 있어서, 이를 통한 G:U, G:A 워블 염기배열을 할 수 있다 (도 10c). 따라서 이러한 특정 위치의G에 의한 G:A, G:U 워블 염기배열을 구별하여 분석해본 결과 (도 10d), miR-124의 정규 발단 표적 싸이트(seed)가 가장 많이 발견되었다 (1,992개). 하지만, 이와 견줄 수 있을 정도로 4번째가 G:U 워블(1,542개)을 이루는 것을 발견하였으며, 그 다음으로는 G:A 워블(1,542개)을 이루는 것을 관찰하였다. 또한 5번쨰의 G도 G:U 워블(1,800개)과 G:A 워블(1,198개)을 이루는 표적 싸이트가 많이 보였으며, 이렇게 조사한 모든 싸이트는 대조군의 개수(647개) 보다 모두 많이 존재하는 것을 확인할 수 있었다 (도 10d). 따라서, 마이크로RNA는 발단부분의 염기서열을 통한 표적 mRNA를 인식할 때, 발단 부분을 통한 정규적인 염기배열 뿐만 아니라 비정규적으로 G:U 또는 G:A 워블 염기배열을 허용하며, 특히 G:A 워블 염기배열이 이러한 결합을 통해서 표적 mRNA와 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 이러한 G:A 워블 염기를 통한 마이크로RNA의 표적 인식은 보고 된 바가 없는 새로운 결과이며, 따라서 상기 실시예에서 관찰한 바와 같이 여러 마이크로RNA에서 비정규적인 표적으로 인식된다는 것을 확인할 수 있었다,
상기의 실시예를 통해, 마이크로RNA의 비정규 표적 인식에는 발단 서열에 G:A 워블 배열을 허용하는 경우가 존재하고, 이를 통해 많은 마이크로RNA가 표적 유전자의 전령RNA에 결합하여 그 유전자의 발현을 억제할 것으로 여겨진다.
[ 실시예 11] 마이크로RNA의 비정규 표적인 G:A 발단 배열 싸이트를 인식하는 mIRNA -GU의 개발 및 miR -124 적용 시 miR -124- G5U의 신경세포 사멸 증대 효과 확인
실시예 10에서 마이크로RNA의 비정규 표적 인식에는 발단 서열에 G:A 워블 배열을 허용하는 경우가 있다는 것을 발견하였고, 이를 비정규 G:A 발단 배열 싸이트로 명칭하고, 이에 대하여 상보적으로 배열할 수 있는 새로운 RNA 간섭 유도 물질의 서열인 miRNA-GU를 다음과 같이 발명하였다. 이러한 서열 결정 기술을 miR-124를 대상으로 적용해 보면, miR-124는 발단서열이 5'-AAGGCAC-3'으로 비정규 GA 배열 발단 표적은 4번 G 염기, 5번 G염기가 각각 G:A 워블 염기 배열이 가능한 염기 서열이며, 따라서 이러한 G:A 워블 배열을 기존의 상보적인 염기 배열로 바꾸는 형식인 miRNA-GU의 서열로 바꾸면, miR-124-G4U (5'-AAUGCAC-3'), miR-124-G5U (5'-AAGUCAC-3')로 변경할 수 있다. 이렇게 변경된 miR-124-G4U와 miR-124-G5U는 기존의 miR-124가 G:A 워블 배열 형태로 약하게 결합하고 인식했던 비정규 표적 싸이트를 상보적인 배열로 결합할 수 있기에, miR-124에서의 비정규 G:A 발단 배열 표적의 기능을 나타낼 수 있다.
따라서, miRNA 비정규 GA 배열 발단 타겟을 매개로 하는 생물학적 기능을 알아보기 위하여, 비정규 GA 배열 발단 타겟을 miR-124에 적용하여 실험을 수행하였다. 이를 위해서 이전에 실시예서의 동일한 방법에 따라 대조군으로 NT (도 11b에 N2a로 기술), miR-124, miR-124-G4U, miR-124-G5U를 신경 모세포종인 N2a에 도입하고 세포의 형태를 72시간동안 배양하면서 관찰해보았다 (도 11b). 그 결과, miR-124를 발현 시켰을 경우 긴 신경 가지 돌기가 형성되는 분화 현상이 일어나지만, miR-124-G4U, miR-124-G5U가 전달된 실험군의 경우 분화가 일어나지 않는 현상을 관찰하다 (도 11b). 이렇게 기존의 miR-124의 기능인 신경분화능이 miRNA-GU로 변경하였을 때 관찰되지 않았기에, 세포 사멸 정도에서의 변화를 인간ㅇ 신경 모세포종인 Sh-sy-5y 세포주에서 관찰하였다. 이때의 유세포 분석은 실시예 9에서 사용한 방법과 유사하게, Muse Annexin V and Dead Cell Assay Kit　　(millipore　社)을 이용하였으며, Muse　Cell Analyzer (Milipore)을 통해 수행하였다. 그 결과 miR-124-G-5U의 발현은 세포 사멸을 대조군에 비해 2배이상 증가시킨 것을 확인하였고 (도 11c), 이를 이른 세포사멸 (early apoptosis) 이나 늦은 세포사멸 (late apoptosis) 로 세분화해서 분석한 경우, miR-124가 전달된 실험군에 비해, miR-124-G-5U가 전달된 실험군은 이른 세포사멸 (early apoptosis) 과 늦은 세포사멸 (late apoptosis) 두가지 경우 모두 유의적으로 증가한 것으로 분석되었다 (도 11d). miR-124-G-4U 가 전달된 실험군의 경우 miR-124가 전달된 실험군에 비해 늦은 세포사멸 (late apoptosis)이 유의적으로 억제되었으며 (도 11 c,d) 살아있는 세포의 수도 많음을 관찰할 수 있었다 (도 11 b).
이를 바탕으로, miR-124-GU에 의한 miR-124 비정규 GA 배열 발단 타겟 억제는 miR-124에 의해서 유도되는 신경분화의 능력은 사라지고, 대신에 다른 생물학적 기능인 세포 사멸 조절 기능을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.
[ 실시예 12] miR -124- G4U 가 유도하는 신경 모세포의 세포 분열 촉진
이전 실시예에서 miR-124-G4U의 경우에는 신경 세포 분화능을 상실하고, 세포 사멸에서도 별다른 기능이 나타나지 않아, 세포 분열에 대해서 살펴보았다. 즉, 대조군 NT, miR-124, miR-124-G4U, miR-124-G5U를 각각 신경 모세포종 세포인 N2a에 이전 실시예에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 도입 시킨 후 세포 분열 증식 현상에 대해서 유세포 분석을 실시하였다 (도 12a). 이 때의 실험은 Muse Ki67 Proliferation Kit (millipore　社)　을 이용하여 제조사가 제공한 실험 방법에 따라세포를 처리한 후, Muse　 Cell Analyzer (Milipore) 로 세포 분열을 분석하여 진행하였다. 이 방법은 Ki67이 염색된 세포의 수를 측정함으로 세포 분열 증식이 증가된 세포의 수를 정량적으로 분석하는 방법이다. N2a 세포에서 miR-124를 발현시키면 대조군인 NT에 비해서 세포가 분화함으로 Ki67의 염색의 세기가 줄어든 세포가 늘어난다. 하지만 miR-124-G4U 전달된 실험군은 대조군(NT)에 비교하여 세포 분열이 증식된 세포인 Ki67 염색 세포가 61%에서 65%로 다소 늘어났다. 이에 비해 miR-14-G5U는 대조군과 비교하여 차이가 없음을 관찰 할 수 있었다.
추가적으로 miR-124-G4U가 세포주기에 주는 영향을 조사하기 위해서, 인간 신경 모세포종인 sh-sy-5y 세포주를 이용하여 유세포 분석을 실시하였다 (도 12b). 이때의 분석은 miR-124-G4U와 miR-124-G5U의 기능을 세포 주기별로 알아보기 위하여 Muse TM Cell Cycle Kit (Catalog No. MCH100106, Milipore)을 이용하여, Muse Cell Analyzer (Milipore) 로 분석하였다. 그 결과, miR-124의 경우 세포의 주기가 G0/G1에 있는 수가 증가하는 세포 분열 정지(cell cycle arrest)가 관찰되었으나, miR-124-G4U, miR-124-G5U는 miR-124에 의한 세포 분열 정지 현상은 사라지고 대조군과 동일하게 세포 주기가 돌아가는 것을 관찰하였다.
상기의 실시예를 통해 miR-124 비정규 GA 배열 발단 타겟 억제하는 RNA 간섭 유도 변형 서열 중 miR-124-G4U는 신경 모세포의 세포 분열 증식을 증가 시키는 기능을 가지는 것을 알 수 있었다.
[ 실시예 13] 심근세포주 에서 miR -1이 비정규 GA 배열 발단 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있다는 것을 형광단백질 리포터를 이용하여 확인
위의 실시예에서 마이크로RNA가 비정규적으로 발단 서열에서 G:A 워블 배열을 허용하여 표적 mRNA와 결합할 수 있으며, 이것이 새로운 기능을 가질 수 있다는 사실을 발견한 후, 이러한 결합이 실제로 표적 유전자의 억제를 일으킬 수 있는지를 세포수준에서 확인하는 리포터 실험을 진행하였다. 이때 확인 실험은 심근세포인 h9c2와 같이 근육계 세포에서 많이 발현되는 것으로 알려진 miR-1을 대상으로 진행하였으며, 특히 miR-1의 5’말단으로부터 7번째에 존재하는 G에 주목하여, 이를 통한 G:A 워블 염기배열을 대상으로 수행하였다 (도 13). 마이크로RNA에 의한 유전자 억제는 보다 정밀하게 개별 세포 수준에서 측정하기 위해서 형광 단백질 발현 리포터 시스템을 구축하여 사용하였다 (도 13). 형광 단백질 발현 리포터 시스템은 두가지 색의 형광단백질이 하나의 벡터에 발현되게 구성되었으며, 이때 SV40 프로모터에는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP)이 발현되게 하고, 그 3'UTR (3'untranslated region) 부분에 마이크로 RNA의 표적 싸이트를 여러 개 연속적으로 배열하여, 녹색 형광 단백질의 세기를 통해 마이크로RNA에 의한 유전자 억제 효과를 측정할 수 있도록 하였으며, 동시에 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein: RFP)은 TK 프로모터에 의해 발현되도록 하여 그 세기 정도로 녹색 형광 신호를 표준화하여 사용하였다 (도 13a, 위).
이렇게 구축된 형광 단백질 발현 리포터 벡터에 miR-1의 5’말단으로부터 2번째부터 8번째까지 염기에 대해서 상보적이면서, 7번째 염기에 G에 대해서는 G;A 워블로 염기배열하는 비정규 표적 싸이트(7G:A-site)를 삽입하여 리포터를 제작한 후 (GFP-7G:A site), 이것이 miR-1에 의해서 억제되는지를 실험을 통해 확인하였다. 이때 실험은, 500ng GFP-7G:A site 리포터 벡터와 25uM의 miR-1을lipofectamine 2000 (Invitrogen 사) 시약을 이용하여 회사에서 제공하는 프로토콜에 따라 심근세포주인 H9c2에 동시에 도입(co-transfection)하였고, 24시간 후 Life Technologu사의 Attune NxT를 통해 각각의 형광 신호를 유세포 분석으로 측정하였다. 그 결과 miR-1의 발현에 의해서 miR-1의 7G:A 싸이트가 매우 효율적으로 억제(도 13a, 가운데)되는 것을 대조군 핵산(cont; NT)을 도입한 세포(도 13a, 왼쪽)와 비교하여 확인하였다. 즉, 심근세포주인 h9c2 에서 두가지 형광 단백질의 발현 정도에 따라 네부분 (Q5-1, Q5-2, Q5-3, Q5-4)으로 분석한 결과 miR-1이 도입된 세포의 경우, 대조군 핵산이 도입된 경우보다 10 3 세기의 적색 형광 단백질과 10 3 세기의 녹색 형광 단백질을 보이는 세포의 분포가 59.51% (control: Q5-3)에서 41.80 % (miR-1: Q5-3)로 감소된 것을 관찰하였다.
GFP-7G:A site 리포터 벡터는 miR-1의 도입 없이도 h9c2 세포에서 어느정도 억제되고 있는 것이 대조군에서 관찰되었다. 이것은 h9c2세포내에서 이미 발현되고 있는 miR-1에 의해서 리포터 표적 mRNA와의 G;A 워블 염기배열을 통해 억제하는 것으로 예상할 수 있다. 이러한 점을 확인하기 위해서 h9c2 세포 내의 miR-1의 발현을 억제할 수 있는 miRIDIAN microRNA Hairpin inhibitor (miR-1 inhibitor, 도 13a, 오른쪽)를 Dharmacon사로부터 구입하여 50uM 농도로 세포에 트랜스펙션시켜 사용하였다. 이러한 결과, 대조군에서 비해 (도 13a, 왼쪽 도면) miR-1 inhibitor를 도입한 경우 (도 13a, 오른쪽 도면), 10 3 세기의 적색 형광 단백질과 10 3 세기의 녹색 형광 단백질을 보이는 세포의 분포가 81.56% (miR-1 inhibitor: Q5-3) 로 증가하는 것으로 보아, 세포내에 존재하는 miR-1이 miR-1의 7G:A 싸이트를 통해 유전자 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 13a).
이는 추가적으로 형광 단백질 발현 리포터에 마이크로RNA 표적 싸이트를 넣지 않은 대조군 (GFP-no site)과 miR-1의 7G:A 싸이트 들어간 리포터인 GFP-7G:A site를 H9c2 세포에 도입하여 그 활성을 비교하여 확인하였으며, 양성 대조군으로는 miR-1을 함께 도입한 경우와 정량적으로 비교하여 확인하였다 (도 13b). 이때의 분석은 유세포 분석기에서 측정한 적색 형광 단백질(RFP) 값을 구간별로 나누고, 이때의 녹색 형광 단백질(GFP) 값을 평균을 내어 로그 비율로 변환하였으며, 이때 대조군인 GFP-no site의 녹색 형광 단백질 수치를 1로 두고 (relative log GFP) 상대적으로 계산하였다. 이때, mR-1 과 7번 G 염기에 대해, G:A 워블 (wobble) 을 통해 상보적으로 염기 배열되는 싸이트가 있는 경우 (GFP-7G:A site), 특히 1.5 - 3값의 적색 형광 단백질의 발현 (log RFP) 이 보이는 구간에서, G:A 워블 (wobble) 을 통한 녹색 형광 단백질의 발현 (relative log GFP) 이 1보다 10% 정도 낮아지는 것을 확인하였다. 이러한 억제는 양성 대조군에서는 특히 1.5 - 4 구간의 적색 형광 단백질의 발현 (log RFP)에서 40%-10% 정도 녹색 형광 단백질의 발현 (relative log GFP) 이 억제되는 패턴과 동일하게 나타나는 점을 관찰하였다.
위의 실시예에서 관찰한 결과가 해당 형광 단백질 리포터에서 사용한 서로 다른 프로모터의 세기와 두가지 다른 형광단백질이 가지는 형광 활성도의 차이에 의해서 영향을 받지 않음을 확인하기 위해서, 두개의 형광 단백질을 서로 바꿔져 있는 형광 단백질 리포터인 p.UTA.3.0 (Lemus-Diaz N et al, Scientific Reports,(7), 2017)을 Addgene(plasmid # 82447)으로부터 구입하여 사용하였다. 이때 리포터 실험은 p.UTA.3.0 벡터에서 SV40 프로모터에 의해 조절되는 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein: RFP)의 3’ UTR 부분에 miR-1-7G;A 서열을 5번 반복하여 삽입한 후 리포터 벡터(RFP-7G:A site)를 제작하여 진행하였으며, 이때 적색 형광 단백질 발현 수치는 Tk 프로모터로 발현되는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP) 값을 세포내에 도입된 정도를 반영한 표준화로 사용하여 변형하여 사용하였다 (도 13c, 위). 그 결과 이전 실시예와 동일하게 miR-1의 7G;A 싸이트가 h9c2에서 발현되는 miR-1에 의해서 억제되는 것을 miRNA 표적 위치가 없는 리포터 (RFP-no site)의 대조군과 miR-1의 7G;A site가 들어간 리포터(RFP-7G:A site)의 결과를 비교하여 확인하였으며, 동시에 양성 대조군이 miR-1과의 co-transfection 에서도 이전 실시예와 같은 현상을 관찰하였다 (도 4c-d).
상기로부터, Ago HITS-CLIP 분석을 통해 발견한 마이크로RNA의 비정규 표적이 실제로 마이크로RNA의 발단 서열에서 G:A 워블 배열을 통해 결합할 수 있을 뿐 아니라, 해당 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서 이러한 점으로 미루러 볼 때, G;A 워블 배열을 통한 표적 싸이트를 이용하여 마이크로RNA와 충분히 결합 할 수 있으며, 이러한 점을 miRNA-GU를 통해 유서하게 유도할 수 있다면, 비정규적 표적 억제에 의한 마이크로RNA의 생물학적 기능만을 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
[ 실시예 14] miR - 1 의 2, 3, 7 번 G 염기에 대한 비정규 GA 배열 발단 타겟 유전자 조절을 통한 심근세포의 비대화 유도 기능 확인
이러한 비정규적인 유전자 억제 현상은 G:A 워블 염기 배열이 마이크로RNA의 비전형 타겟으로 작용하여, 생물학적 기능을 조절할 수도 있다는 가능성을 miRNA-GU를 통해 확인하고자, 이전 실시예에서 살펴본 심근세포의 miR-1을 중심으로 실험을 진행하였다.
비정규적인 G:A 워블 표적이 특정한 생물학적 기능을 가지고 있는지를 조사하기 위해서는, miR-1이 정규적인 표적은 인식하지 않고, 비정규적인G:A 워블 배열 표적 싸이트만을 인식하게 하여야 하므로, miR-1의 발단 지역에 있는 G가 C가 아닌 A와 염기 배열하도록 해당 G를 U로 치환하여 제작한 miRNA-GU를 실험에 사용하였다. 본 실험에서는 보다 생리학적으로 심장과 유사한 조건으로 수행하기 위해서 랫트(rat)의 심장 조직으로부터 1차 심근세포 (primary rat neonatal cardiomyocyte culture)를 배양하여 수행하였다. 이때, 심근세포의 배양은 생후 1일차 랫트 (rat neonate) 의 심장조직에서 효소 반응을 통해 심근 세포를 분리하고 (Cellutron 사의 neomyt kit), 심근세포는 10% FBS (fetal bovine serum), 5% HS (horse serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지 (Invitrogen)와 M199 (WellGene) 배지를 4:1 로 섞어 준비한 배지에 brdU를 첨가하여, 심장 조직에 존재하는 세포주기를 갖는 다른 세포들과 구별하여 배양하였다.
이렇게 얻어진 1차배양 심근세포에서 심근비대현상이 유도되는 지를 우선적으로 확인하였다 (도 14a). 심근세포는 세포주기를 멈추고, 심근 세포의 크기를 증가시킬 수 있는 특징을 가지고 있는데, 이를 심근 비대 현상이라고 한다. 심근 비대 현상은 심근 세포의 기능 저하를 보완하는 역할을 해왔으며, 심장질병의 병리 중간 단계로도 알려져 있으며, 세포 형태학적 관찰 및 유전자 발현 프로파일 변화가 잘 알려진 심장 질병 모델 시스템이다. 심근 비대증의 세포 모델에서는 페닐에프린 (PE) 과 같은 아드레널직 리셉터 작용제 (agonist) 를 심근 세포에 처리해주면 심근 비대증을 유도할 수 있다 (Molkentin, JD et al, 1998, Cell 93(2), 215-228). 따라서, 배양한 심근 세포에 100uM의 페닐에프린을 처리하여 심근 비대를 유도 하였고, 이에 따라 아무것도 처리하지 않은 대조군(도 6a, rCMC)과 비교하여 심근 세포의 크기가 증가하는 것을 형태학적으로 확인하였다 (도 14a, +PE). 또한 1차 심근세포에 miR-1을 도입하였을 때 심근 세포의 크기가 감소하는 것을 관찰하였다 (도 14a, 위줄 오른쪽). 이는 잘 알려진 심근 비대현상과 miR-1 의 심근세포에서의 기능과 일치한다 (Molkentin, JD et al, 1998, Cell 93(2), 215-228, Ikeda S et al, Mol cell boil, 2009, vol29, 2193-2204).
miR-1은 발단지역에 3개의 G를 포함하고 있으며, 이에 따라 정규적인 표적은 인식하지 않고, 비정규적인G:A 워블 배열 표적 싸이트만을 인식하게 하기 위해서, 이러한 G를 U로 치환한 miR-1을 디자인 하였으며, 이를 G가 있는 위치에 따라 5’말단 기준 2번째 위치(miR-1-G2U), 3번째 위치(miR-1-G3U), 7번쨰 위치(miR-1-G7U)에 적용하여 합성하였다. 이때, 도 14에 사용한 miR-1의 치환 염기 서열은 다음과 같으며 (miR-1-G2U: 5’p-UUGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’; miR-1-G3U: 5’p-UGUAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’; miR-1-G7U: 5’p-UGGAAUUUAAAGAAGUAUGUAU-3’) 이는 가이드 가닥으로 합성되었고, 운반자 가닥은 기존의 miR-1의 것을 디자인하여 Bioneer사에서 화학적으로 합성 제작 후, HPLC로 분리, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체 (duplex)로 제조하여 사용하였다. 해당 마이크로RNA의 1차 심근세포주로의 도입(transfection)은 RNAimax (Invitrogen 사) 시약을 이용하여 50uM 농도로 수행 하였다
그 결과 miR-1-G2U 또는 miR-1-G3U 또는 miR-1-G7U 를 1차 심근세포배양에 도입하였을 때 심근 세포의 형태가 심근 비대를 유도한 세포 (도 14a, +PE)와 유사한 수준으로 커진 것을 관찰 할 수 있었다 (도 14a). 이때 각각의 세포 크기를 정량적으로 분석하기 위해서, 100개 이상의 세포가 이미지J 프로그램 (NIH)을 통해 정량화 되었으며, 이에 따라 miR-1의 G:A 워블 배열 싸이트만을 인식하게 합성한 miR-1 치환체(miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U) 모두 대조군(NT) 핵산을 도입했을 때와 비교해서 약 1.5~1.8 배 정도 그 크기가 커진것으로 분석되었다. 이는 페닐에프린(PE) 약물이 유도하는 심근세포비대증 모델의 심근 세포 크기와 비슷한 수준이며, miR-1 자체는 심근세포 형태상으로는 세포 크기를 감소시키는 효과를 보임으로써, 그 정규적인 표적 억제효과가 G;A 워블을 통한 표적 억제와는 세포 형태학상 다른 기능을 나타내는 것을 관찰하였다 (도 14b). 또한, 추가적으로 본 실시예에서 관찰한 심근비대 현상을 분자적 수준에서 확인하기 위해서 마커로 그 발현이 증가하는 것으로 알려진 ANP (atrial naturiuretic peptide) 유전자의 발현을 qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) 실험을 통해 GAPDH와 비교하여 상대적인 값으로 측정해 보았다 (도 14c). 그 결과, miR-1의 G:A 워블 배열 싸이트만을 인식하게 합성한 miR-1 치환 체 (miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U)를 심근세포에 도입했을 경우에는 모두ANP 발현양을 대조군(NT)에 비해 1.2~1.5 배 정도 유의하게 증가시킨 것을 4번의 반복 실험을 통해 확인할 수 있었다. 이러한 ANP 발현 증가는 페닐에프린(PE) 약물을 처리한 심근 세포 실험군이 대조군에 비해 크기가 약 2배 정도 증가한 것 보다는 적지만, 원래의 miR-1이 도입 되었을 때 도리어 ANP 발현이 유의하게 감소하는 현상과는 반대되는 것으로, 이를 통해 miR-1은 G:A 워블 배열 싸이트를 통해 완전히 다른 생물학적 기능을 나타낸다고 볼 수 있다.
상기로부터 마이크로RNA 발단 지역에서 G:A 워블 배열을 통해 억제하는 비정규 표적은 기존의 정규적인 표적 인식과는 생물학적으로 다른 기능을 나타낼 수 있다는 점을 최종적으로 알 수 있었다. 이러한 발견은 마이크로RNA의 정규적인 표적을 통한 기능과 비정규적 표적을 통한 기능이 서로 다르다는 것을 나타내며, 이러한 점으로 미루러 볼 때 마이크로RNA의 G:A 워블 표적만을 억제할 수 있다면 G:A 워블 표적에 의해서 일어나는 생물학적 기능만을 선택적으로 제어할 수 있을 것이다.
[ 실시예 15] 심근 세포주 ( H9c2 )에서 miR -133- G4U 발현을 통한 심비대증의 유도 관찰
G:A 워블 염기 배열이 마이크로RNA의 발단부분에 작용하여 인식하는 비정규적 표적 현상에 대해서, 추가적으로 그 생물학적 기능을 심근세포에서 확인하고자, 이전 실시예에서 살펴본 miR-1 이외에 심근 세포에서 기능을 하는 것으로 알려진 miR-133에 대해 miRNA-GU를 적용해 보았다. miR-133은 근세포 발달 및 질병 병리를 조절하며, 심근 비대현상의 억제기능을 지닌다고 알려졌다 (Nat Med. 2007, 13(5): 613-618; Ikeda S et al, Mol cell boil, 2009, vol29, 2193-2204). 따라서 본 발명진은 miR-133의 비정규 GA 배열 타겟 싸이트 중 5‘말단 기준 4번째 G를 통해서 이루어지는 표적 인식을 특이적으로 억제하는 간섭유도 핵산인 miR-133-G4U (5’-UUUUGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’)를 위의 실시예에서와 같이 바이오니아사에서 합성 제작하여, 50 nM 농도의 이중체로 RNAiMAX 시약 (Invitrogen 사) 을 이용하여 심근세포주 h9c2 에 전달시켜 그 세포 형태상의 변화를 관찰하였다 (도 15a). 그 결과, miR-133-G4U의 발현이 H9c2 세포의 크기를 대조군 (NT) 에 비해 증대시켰으며 (도 15a), 100개 이상의 세포의 크기를 이미지J (NIH) 프로그램을 통해 정량적으로 분석한 결과, 약 2배정도 유의하게 증가 시킴을 확인할 수 있었다 (도 15b).
따라서, miR-133-G4U에 의해서 일어나는 miR-133의 비정규 GA 배열 발단 타겟 발현 저하는 심비대증을 유도하며, 이는 심비대증을 억제하는 miR-133 의 정규 발단 표적 저해 기능과는 다른 새로운 기능임을 유추할 수 있다.
[ 실시예 16] 간암 세포내의 miR -122 에 의한 비정규 GA 배열 발단 싸이트 유전자의 발현 저해 효과를 루시퍼라제 리포터를 통해 확인
이전 실시예 10에서 miRNA가 비정규적으로 G:A 워블 배열 발단 싸이트와 결합한다는 발견에서, 이러한 비정규적 표적 결합만을 특이적으로 인식하게 하는 miRNA-GU를 발명하게 되었고, 이를 miR-124, miR-1, miR-133에 적용하였을 때, 기존의 기능과는 다른 효과가 나타남을 실시예 11, 12, 14, 14에서 관찰하였다. 그리고 또한 실제로 마이크로RNA에 비정규적 G:A 워블 배열 발단 싸이트를 가지고 있는 표적 유전자의 발현을 저해 할 수 있는지를 확인하기 위해, 실시예 13에서 miR-1을 대상으로 심근 조직 세포주에서 그 기능을 확인하였다. 추가적으로 간 조직과 간암 세포에 특이적으로 발현하는 miR-122을 대상으로 비정규 G:A 워블 배열 발단 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있는 지를 루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 확인하고자 하였다 (도 16).
간암 또는 간 조직에 특이적으로 발현하여 기능하는 miR-122는, 그 발단 서열 (5'발단 기준 1-8번 염기: 5’- UGG AGU GU-3’)에 5‘말단 기준 2번째, 3번째, 5번째, 7번째에 G:A 워블 배열을 할 수 있는 G를 가지고 있다. 따라서 우선적으로는 이중 2번째 G가 비정규적으로 G:A 워블 배열을 통해 인식할 수 있는 해당 표적 싸이트을 대상으로 그 억제 효율을 측정하기 위해서, 실시예 2에서 진행한 동일한 방법으로 IC50 (Inhibitory concentration 50)을 측정하여 정규적 발단 싸이트와 비교하며 살펴 보았다 (도면 16a).
실험을 진행하기 위한 루시퍼라제 리포처 벡터는 miR-122 의 2번 G 염기에 대해 GA염기 배열이 가능한 비정규 GA배열 발단 타겟의 발현 억제를 감지하기 위해서, miRNA-122의 2번 G 염기에 대한 비정규 GA배열 발단 싸이트 (2G:A) 서열 (5'발단 기준 1-9번 염기: 5’-CAC ACU CAA-3’)을 psi-check2 (Promega사) 벡터 안에 있는 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'UTR (3'untranslated region) 부분에 5번 연속적으로 배열되게 하게 도입하여 제작하였다. 또한 동시에 정규 발단 싸이트 (5'발단 기준 1-9번 염기: 5’-CAC ACU CCA-3’)에 대한 루시퍼라제 리포터 벡터도 동일하게 제작하였다.
이렇게 제작된 루시퍼라제 리포터 벡터를 가지고, miR-122의 여러 농도에서 정규 발단 싸이트 (seed site)와 5‘말단 기준 2번째 G를 통한 비정규 GA배열 발단 싸이트 (2G:A site)를 가지는 표적 유전자의 발현 저해 효과를 해당 루시퍼라제 리포터의 활성의 변화로 측정하고, IC50 (inhibitory concentration 50) 값을 살펴본 결과, miR-122는 정규 발단 표적 싸이트에 대해서는 약 0.5 nM, 비정규 GA배열 발단 싸이트 (2G:A site)에 대해서는 약 7nM 로 측정되어, miR-122가 비정규 GA배열 발단 싸이트 (2G:A site)를 가지는 유전자의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며, 그 효율은 정규 발단 싸이트에 비해서 낮음을 알 수 있다 (도 16a). 또한 유전자 발현 억제가 시작되는 농도를 비정규 GA배열 발단 타겟에서 루시퍼라제 리포터로 살펴보았을 때, 1.5 nM 이상의 농도 조건에서 루시퍼라제 효소 활성이 저해되는 것을 확인하였다 (도 16a). 이는 miR-122가 정규 발단 타겟 싸이트 발현을 억제하는 것과 약 2배 정도 억제 효율의 차이를 보였다.
본 실험은 상기 실시예에서 사용했던 동일한 방법으로 miR-122의 이중체를 합성하고, 이를 여러 농도 (0, 1, 5, 10, 25nM)에서 해당 psi-check2 벡터(50ng)와 함께 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 대략 10,000개의 간암세포주 (Huh7, KCLB: 60104)　에 전달(co-transfection)시켜서 96 well에서 배양하며 진행하였으며, 실시예 2에서 수행한 방법과 동일하게 루시퍼라제 활성을 측정하여 실행하였다.
miR-122가 비정규 GA배열 발단 싸이트 유전자의 발현을 억제한다는 사실을 확인한 후, 이것이 세포안에 존재하는 miR-122에 의해서 동일하게 조절되는 지를 확인하기 위해서, miR-122가 존재하는 간암세포인 Huh7 세포주를 사용하여, 5‘ 말단 기준 2번째 G 및 3번째 G에 의해서 일어나는 비정규 GA배열 발단 싸이트 (2G:A)에 대한 루시퍼라제 리포터 실험을 수행하였다 (도 16b). 이러한 실험을 진행하기 위해서 추가적으로 5' 말단 기준 3번째 G에 의해서 일어나는 비정규 GA배열 발단 싸이트 (3G:A)에 대한 루시퍼라제 리포터 벡터 (luc-3G:A site), 5' 말단 기준 2번째와 3번째 G에 의해서 함께 일어나는 비정규 GA배열 발단 싸이트 (luc-2G:A, 3G:A site)에 대한 루시퍼라제 리포터 벡터, 전체 miR-122의 서열에 완전 상보적인 서열을 측정하는 루시퍼라제 리포터 벡터 (luc-PM site) 를 상기에 기술된 동일한 방법으로 제작하였고, 5’말단 기준 2번째 G에 의해서 일어나는 비정규 GA배열 발단 싸이트(2G:A)에 대한 루시퍼라제 리포터 벡터 (luc-2G:A site) 와 함께 간암세포주에 도입 후 루시퍼라제의 활성을 측정하여 실험하였다 (도 16b).
그 결과, miR-122 존재하는 것으로 알려진 Huh7에 세포에 luc-PM site 벡터를 도입하였을 때 그 활성이 루시퍼라제 벡터 자체만 도입된 대조군에 비해 약 50% 정도 줄어드는 것을 관찰하여, Huh7 세포에 miR-122가 존재함을 확인하였으며, 동시에 miR-122는 3번 비정규 GA배열 발단 타겟 리포터 (Luc-3G:A), 2,3번 비정규 GA배열 발단 타겟 리포터 (Luc-2G:A, 3G:A)의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 억제 효과가 miR-122에 의해 유도된 것인지 알기 위하여, miR-122의 발현 저해제 (hsa-miR-122-5p inhibitor, IH-300591-06-0010)를 다마콘사에서 구매하여 50nM로 처리하였고, 이 때 이런 모든 억제 현상이 사라지는 것으로 확인하였다.
상기의 실시예를 통해, miR-122는 비록 정규적 발단 싸이트보다는 약하지만, 5‘말단 기준 2번 비정규 GA 배열 발단 타겟의 발현을 억제할 수 있다는 사실을 확인하였으며, 또한 간암세포인 Huh7에 자연적으로 존재하는 miR-122는 5‘ 말단 기준 3번 비정규 GA배열 발단 타겟 유전자와, 2,3번 비정규 GA배열 발단 타겟 유전자의 발현을 억제한다는 사실을 알 수 있었다. 특히 간암세포인 Huh7에서 이루어지는 억제 효과는 miR-122의 발현 저해제 처리에 의해 사라지는 것으로 miR-122에 의한 조절임을 확인하였다(도 16b). 따라서, miR-122는 비정규 GA배열 발단 타겟 유전자의 발현을 억제하는 조절 기능이 있음을 알 수 있다.
[ 실시예 17] miR -122의 특정 비정규 GA배열 발단 표적 유전자의 발현 억제를 통한 간암세포주의 세포 이동 저해 현상 확인
miR-122 의 비정규 GA 배열 발단 표적의 간암 세포내 기능을 알아보기 위해서, 해당 비정규 GA 배열 발단 표적 싸이트를 상보적으로 인식하여 저해하는 miRNA-GU를 적용하여 이를 간암세포인 hepG2에 도입한 후에, 간암 세포의 성질 중 암전이에 중요한 세포 이동 능력이 어떻게 달라지는 지를 상처 치유 분석(wound healing assay)을 수행하여 살펴보았다.
간암세포주인 hepG2에서의 상처 치유 분석은 우선은 miR-122의 5‘ 말단 기준 2번 비정규 GA배열 발단 타겟, 3번 비정규 GA배열 발단 타겟, 2,3번 비정규 GA배열 발단 타겟에 상보적으로 인식하는 miRNA-GU를 해당 서열로 합성한 후 이를 상기 실시예에서 실행한 동일한 방법으로 hepG2 세포안에 도입 하고, 24시간 배양 후, 1000ul팁을 이용하여 세포배양층 (cell layer) 에 흠 (scratch) 을 만들고, 세포를 48시간까지 배양하며 각 실험군의 세포가 이동하는 것을 대조군인 NT-6pi를 도입한 것과 비교 관찰하며 진행하였다. 이때 실험에 사용된 간섭 유도 핵산의 서열은 다음과 같다 (miR-122: 5’ - UG GAG UGU GAC AAU GGU GUU UG - 3’; miR-122-G2U: 5’ - UU GAG UGU GAC AAU GGU GUU UG - 3’; miR-122-G3U: 5’ - UG UAG UGU GAC AAU GGU GUU UG - 3’; miR-122-G2,3U: 5’ - UU UAG UGU GAC AAU GGU GUU UG - 3’).
그 결과, 대조군인 NT-6pi 의 경우와 동일한게 miR-122를 도입한 경우에는 , 48 시간 세포 배양 시, 만들어진 흠이 거의 채워지는 세포 이동을 관찰할 수 있었다. 하지만 miR-122-G2U, miR-122-G2,3U siRNA 가 전달된 실험군에서는 이러한 세포 이동이 저해되는 것을 보였으며, 이런 저해 현상은 miR-122-G2,3U siRNA 가 전달된 실험군에서 가장 강하게 나타났다 (도 17a). 이를 정량적으로 측정해본 결과, miR-122-G2U, miR-122-G2,3U siRNA의 경우 대조군에 비해 2~3배 세포 이동이 저해되었음을 확인하였다 (도 17 b). 해당, 정량 분석은 miR-122의 세포 이동을 세포 형태상으로 관찰한 다음, 이 관찰 결과를 이미지J 프로그램 (NIH) 을 이용하여 분석하여 측정하였다. 추가적으로, miR-122-G3U siRNA 가 유도하는 세포 이동을 실험을 진행한 결과, miR-122-G3U에 의해서는 세포 이동 저해 기능을 관찰할 수 없었다 (도 17c-d).
이를 바탕으로 miR-122 의 비정규 GA배열 발단 표적 억제는 간암 세포의 이동을 저해하며, 이는 2번 염기의 GA배열이 우선적으로 작용하며, 이어 첨가적으로 3번 염기의 GA배열이 더해질 경우, 세포 이동 저해 기능의 강화가 유도된다는 점을 알 수 있다.
[ 실시예 18] miR -122-G2,3U에 의한 비정규 GA배열 발단 표적 조절로 인한 세포 주기 정지(cell cycle arrest)의 증가 확인
세포의 이동은 세포 분열과 밀접하게 연관되어 있으며, 특히 암세포에서 많이 관찰되고 있다 (Cancer research, 2004, 64(22):8420-8427). 따라서 miR-122-G2,3U가 유도하는 간암 세포 이동의 저해가 세포 주기 조절과 관계가 있는지 확인하기 위해 실시예 12에서의 동일한 방법으로 유세포 분석 실험을 진행하였다. 이때 NT-6pi, miR-122, miR-122-G2, miR-122-3U, miR-122-G2,3U를 간암세포주인 HepG2에 전달한 후 각 세포의 세포주기를 측정한 결과, miR-122-G2,3U 전달된 실험군에서, G0/G1 분포를 보인 세포의 비율이 대조군(NP-6pi)의 평균 52%에서 68%로 증가한 것을 확인했으며, G2/M 기의 세포 분포가 현저히 낮은 것을 확인하였다 (도 18). 하지만, miR-122, miR-122-G2U, miR-122-G3U는 대조군에 비해 유의한 차이점을 관찰하지 못하였다. 이 때 세포 주기 분석 실험은, 합성된 해당 siRNA 이중체를 50nM 농도로 HepG 에 전달해, 24시간 배양하고 Muse Cell Cycle Kit (Catalog No. MCH100106, Milipore)을 이용하여, 해당 회사가 제공하는 프로토콜에 따라 실험을 수행하고, Muse Cell Analyzer (Milipore) 로 측정하였다.
따라서 miR-122-G2,3U 가 조절하는 암세포 기능은 세포 분열 (G2/M) 을 낮추고, 세포주기 정지상태 (cell cycle arrest: (G0/G1)) 를 유도한다는 것을 확인하였으며, 이에 본 실시예의 결과는 miR-122가 비정규 GA 배열 발단 싸이트를 5‘말단 기준 2번째 G 와 3번째 G 모두를 동시에 G:A 워블 배열하여 인식하여, 간암 세포 주기의 진행을 막는 기능을 나타낸다고 해석할 수 있다.
[ 실시예 19] miR -122-G2,3U, miR -122-G2,7U에 의한 비정규 GA배열 발단 표적 조절로 인한 세포주기 정지상태 유도 관찰
miR-122의 비정규 GA 배열 발단 표적에 기능은 이전 실시예 17에서miR-122-G2,3U가 간세포의 이동을 저해하는 기능이 있다는 점을 파악했으며, 이때 특히 miR-122-G2,3U의 발현에 의해서 유도되는 세포 이동의 저해는, 2번 G 염기의 비정규 GA배열 발단 표적 조절의 생물학적 기능에 3번 G 염기의 조절 효과가 첨가될 경우, 그 기능이 극대화 되는 것을 관찰하였다 (도 17). 따라서 miR-122의 2, 3, 7번 G 염기가 추가적인 조합으로 비정규 GA배열 발단 표적 저해의 생물학적 기능이 변화하는지 알아보기 위해, miR-122-G7U, miR-122-G3,7U, miR-122-G2,7U siRNA의 세포 주기 조절 기능을 추가적으로 확인하는 실험을 수행하였다.
이 때의 실험은 동일하게 간암세포주인 HepG2를 사용하였으며, 이전 실시예 18에서의 방법과 동일하게 해당 miRNA-GU 이중체로 제조하여 50 nM 농도로 세포에 트랜스팩션 하였다. 하지만 이번 세포주기 관찰에서는 24시간 배양 후 노코다졸 (nocodazole) 을 100ng/ml 로 16시간 동안 처리하여 G2/M (분열준비기/분열기)에 HepG2 세포를 동기화(synchronization)한 다음, 얼마나 많은 수의 세포가 G2/M에서 멈춰있는지로 G0/G1에서의 세포주기 정지 상태의 세포의 양을 Muse Cell Analyzer (Milipore) 유세포 분서기로 측정하였다(도 19).
그 결과, miR-122-G2U는 대조군인 NT-6pi에 비하여 세포주기 정지상태인 G0/G1에 있는 세포 수가 차이가 없었지만, miR-122-G2,3U siRNA, miR-122-G2,7U와 같이 2번째 G에 첨부적으로 비정규 GA배열 발단 타겟 싸이트를 조절하는 경우, 세포주기 정지상태 (G0/G1) 의 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 19a). 하지만 miR-122-G3, 7U 는 별다른 증가를 보이지 않았다 (도 19a). 이를 정량적으로 분석해 보면, miR-122-G2,3U siRNA이 전달된 실험군의 경우, 대조군에 비해 약 2배 이상 세포주기 정지상태 (G0/G1) 의 비율이 증가했으며, 이어 miR-122-G2,7U 실험군에서는 약 1.5 배로 세포주기 정지상태 (G0/G1)의 비율이 중가함을 관찰했다 (도 19b).
이를 바탕으로, miR-122-G2,3U siRNA, miR-122-G2,7U siRNA에 의한 비정규 GA배열 발단 표적의 조절을 통해 세포 주기 중지 상태를 증대시킬 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 20] let-7a- G2U , let-7a-G2,4U에 의한 비정규 GA배열 발단 표적 조절이 유도하는 세포주기 정지 상태 유도 관찰
항암 조절 (Tumor suppressor) 기능을 하는 대표적인 마이크로RNA로는 let-7 family 가 있다. 이는 예쁜 꼬마 선충의 발달 과정을 조절하는 기능이 보고 (Nature, 2000, 403(6772): 901-906)된 이후, 다양한 암세포에서 억제된 발현 (Cancer Res., 2004, 64(11): 3753-3756) 및 종양 형성 과정 (Tumorigenesis) 조절을 통한 항암 기능 (Cell, 2005, 120(5): 635-647 ;Genes Dev. 2007, 21(9):1025-1030) 이 보고되어 왔으며, 이를 바탕으로 암진단 및 항암제 개발의 가능성을 지닌 중요한 유전자로 연구되어왔다. 이에 본 발명자들은 let-7 의 비정규 GA배열 발단 표적의 저해가 유도하는 생물학적 기능을 알아보는 실험을 진행하였다.
let-7a의 5'말단 1번째에서부터 9번째까지의 발단 서열은 5'-UGA GGU AGU-3'로써 G:A 워블 염기 배열을 할 수 있는 G는 2번째, 4번째, 5번째, 8번째에 존재한다. 본 발명자는 이 중에 2번째와 4번째 G에 주목을 하고 이를 miRNA-GU로 변형하여 합성하고, 이를 간암 세포주인 HepG2 세포에 도입한 후 세포 주기에서 어떠한 영향을 미치는 지를 이전 실시예 19에서 실시한 방법과 동일하게 실험을 수행하였다. 이때 합성하여 사용한 let-7에 대한 염기서열은 다음과 같다 (let-7a: 5’- U GAG GUA GUA GGU UGU AUA G UU - 3’;let-7a-G2U: 5’ - U UAG GUA GUA GGU UGU AUA G UU - 3’; let-7a-G4U: 5’ - U GAU GUA GUA GGU UGU AUA G UU - 3’; let-7a-G2,4U: 5’- U UAU GUA GUA GGU UGU AUA G UU - 3’).
그 결과, let-7a의 경우는 대조군인 NT-6pi에 비해서 별다른 차이를 나타내지 못하였지만, let-7a-G2U와 let-7a-G2,4U는 G0/G1에서의 세포 주기 정지 상태를 증가시키고, let-7-G4U는 도리어 G2/M에 있는 세포의 양을 증가시켜 세포 주기를 빠르게 돌아가게 한다는 것을 관찰할 수 있었다 (도 20a). 이를 4번의 반복 실험으로 정량화 해보면, let-7a-G2U 실험군의 경우, G1/G0세포의 분포가 대조군 (Nt-6pi) 과 비교시, 약 1.5 배 정도 증가하였으며, G2/M 세포의 분포가 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다 (도 20b). 이를 통해 let-7a의 2번 비정규 GA배열 발단 타겟의 발현 억제는 HepG2 세포의 세포 주기 정지상태를 유도함을 확인할 수 있었다. 이어 let-7a 의 발단에 존재하는 4번 G염기의 경우, 단독 GA 배열 (let-7a-G4U)로는 HepG2 의 세포 주기 정지 상태를 유도를 감소 시키면서, 도리어 G2/M 상태로 빠르게 진행되어 노코다졸 약물 처리로 많은 세포 수가 머무르는 결과를 보였다. 또한 2번과 4번이 동시에 GA 배열 할 경우 (let-7a-G2,4U), HepG2 의 세포 주기 정지 상태 유도를 관찰할 수 있었다. 이러한 세포 주기 정지 상태는 let-7a 가 전달된 HepG2 세포에서 관찰되지 않았다 (도 20 b). 따라서, let-7a의 2번과 2,4번 비정규 GA배열 발단 타겟의 발현 억제는 HepG2 세포의 세포 주기 정지 상태를 유도하며, 이는 let-7a 이 본 발명자들이 수행한 HepG2 세포 조절에서 보이는 기능과는 전혀 다른 기능임을 확인하였다.
상기의 실시예를 통해, let-7은 5‘말단 기준 2번 G를 통한 비정규 GA 발단 배열 싸이트의 유전자를 억제함으로써 암세포 주기 정지를 촉진 시키는 역할을 하며, 더 바람직하게는 5’ 말단 기준 2번 G와 4번 G가 함께 G;A 워블 배열로 작용할 때 그 효과가 가장 크다는 것을 알 수 있다. 또한 let-7의 5‘말단 기준 4번 G를 통한 비정규 GA 발단 배열 싸이트는 도리어 암세포의 세포 주기 진행을 촉진 시켜, 암세포의 증식을 유도할 것으로 여겨진다.
[ 실시예 21] miR -302- 4GU , miR -372- 4GU에 의한 비정규 GA배열 발단 표적 저해가 유도하는 역분화 촉진을 OCT4 프로모터 리포터로 관찰
분화된 세포는 몇가지 전사인자의 인위적인 발현으로 분화능을 다시 획득할 수 있으며, 최종적으로 다시 배아세포와 같은 전능 분화능을 획득한 세포를 역분화 세포 (induced pluripotent stem cell) 라고 한다. 이러한 기술은 쥐의 배성섬유아세포 (mouse embryonic fibroblast: MEM)에 4개의 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하여, 줄기세포와 같이 분화 다양성을 가진 유도 만능 줄기세포 (iPS cell: inducible pluripotent stem cell)를 만들 수 있음이 보고되었다 (Cell, 2006,126 (4): 663-676). 유사하게 인간의 체세포에 4개의 인자 (OCT4, SOX2, NANOG, and LIN28) 전달을 통해 유도 만능 줄기세포를 만들 수 있음이 보고된 바 있다 (Science,2007, 318(5858): 1917-1920). 이는 역분화 (dedifferentiation)과정을 거쳐 만능으로 분화될 수 있는 재생 가능성을 인간 세포를 포함한 어떤 세포를 통해서도 만들어 낼 수 있다는 점에서 그 응용 가능성이 매우 높은 분야이며, 최초 발견 후, 유도 만능 줄기세포 생성 효율성을 높히기 위한 노력이 지속되어왔다. 그 일환으로 보고된 마이크로RNA 유도 만능줄기세포 (mirPS) 역시 효율적으로 만능성 (pluripotency)을 유도 하는 방법의 하나로써, miR-302a와 miR-372 같은 마이크로RNA가 단독으로 또는 4개의 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 와 함께 세포를 역분화시키는 기능이 보고되었다 (RNA, 2008 14(10): 2115-2124; Nat Biotechnol. 2011, 29 (5): 443-448). 따라서, 본 발명자들은 miR-302a와 miR-372의 비정규 GA배열 발단 표적 발현의 저해가 세포를 역분화 시키는 과정을 촉진 할 수 있는지를 알아보는 실험을 진행하였다.
우선 만능성 (pluripotency) 유도를 모니터 하기 위해, 줄기세포에서 활성화된다고 보고된 Oct4 프로모터와 이에 의존하여 발현되는 녹색 형광 단백질이 포함된 플라스미드를 구입하였다 (Addgene #21319) (도 21 a). 이러한 Oct4 발현 리포터 벡터 (pOct4:GFP) 를 분화가 된 자궁경부암 세포 HeLa에 도입하였을 때는, 녹색 형광 단백질이 발현되지 않으나 해당 세포가 역분화되어 분화능을 획득하였을 때는 Oct4 발현 리포터에서 녹색 형광 단백질이 발현되게 된다. 이러한 Oct4 발현 리포터 벡터와 함께 역분화를 일으키는 것으로 알려진 마이크로RNA인 miR-302a, miR-372를 대상으로 실험을 수행하였다. miR-302a와 miR-372의 발단 서열중 5‘말단 기준 2번째에서 8번째의 서열은 "AA GUG CU" 이며 따라서 비정규 GA배열 발단 배열은 5’ 말단 기준 4번째 G와 6번째 G를 통해서 가능하다. 하지만 본 발명자들은 4번째의 G에 주목하여 miR-302-G4U, miR-372-G4U를 합성하여 실험을 수행하였다.
우선적으로 실험은, HeLa 세포에 Oct4 발현 리포터 벡터 (pOct4:GFP)를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사) 시약을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 전달한 다음, 인간 miR-302와 miR-372 서열대로 가이드 가닥과, 운반자 가닥을 상기 실시예와 같이 바이오니아에서 합성 제작하여, 이중체로 제조하고 RNAimax (Invitrogen 사) 시약을 이용하여 50nM 농도로 순차적 전달을 하였다. 또한, miR-302와 miR-372의 비정규 GA배열 발단 표적 특이적 siRNA의 제작은 발단내 G 염기를 U로 치환하여 상기예와 동일하게 준비하여, 50nM 농도로 세포에 전달하였다. 이에 사용된 핵산의 염기 서열은 다음과 같다 (miR-302: 5’- UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA-3’; miR-302-4GU: 5’- UAAUUGCUU CCAUGUUUUGGUGA-3’; miR-302 운반가닥: 5’- ACUUAAACGUGGAUGUACUUGCU-3’; miR-372: 5’- AAAGUGCUGCG ACAUUUGAGCGU-3’; miR-372-G4U: 5’- AAAUUGC UGCGACA UUUGAGCGU-3’, miR-372 운반가닥: 5’-CCUCAAAUGUGGAGCACUAUUCU-3’). 이렇게 리포터 벡터와 RNA를 도입한 HeLa 세포는 14일동안 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지 (Invitrogen)에서 배양하였으며, 트랜스펙션 수행시는 항생제 없는 완전배지에서 세포를 배양하였다.
그 결과, miR-302나 miR-372 가 단독으로 전달된 실험군에서는 대조군에 비해 군집형태 (colony) 의 세포 성장을 보였으나, Oct4 프로모터의 활성을 나타내는 녹색 형광 단백질 발현이 14일 배양 시기까지는 관찰되지는 않았다. 하지만, miR-302와 miR-372비정규 GA배열 발단 표적 억제 siRNA가 도입된 실험군에서는 군집 형태의 세포 성장 뿐 아니라, Oct4 프로모터의 활성을 나타내는 녹색 형광 단백질 발현이 관찰되었으며 (도 21 b-c, 적색 화살표), 이는 miR-302와 miR-372 과 각각의 비정규 GA배열 발단 표적 억제 siRNA 가 동시에 세포로 전달되었을 때 좀 더 강하고 큰 녹색 형광 단백질 발현 세포 군집을 관찰할 수 있었다 (도 21 b-c). 이를 바탕으로 miR-302와 miR-372 비정규 GA배열 발단 표적의 저해는 세포를 역분화시키고 Oct4 발현을 통해 분화능을 획득하는 것을 촉진 할 수 있다는 점을 알 수있다.
상기의 실시예를 통해, miR-372-G4U와 miR-302a-G4U는 기존의 miR-372, miR-302 만을 단독으로 발현 시켜 세포의 역분화를 일으키는 것 보다 효율적으로 세포의 역분화를 촉진 시킬 수 있다는 점을 관찰 할 수 있으며, 이에 따라 miR-372-G4U와 miR-302a-G4U는 세포의 역분화를 촉진 시키는 소재로 사용될 수 있다는 점을 알 수 있다.
[ 실시예 22] 5‘말단 기준 6번째에 2‘ OMe 변형이 해당 RNA 간섭 유도체의 비정규 핵융기 표적을 억제하지 못하는 현상을 확인
상기 실시예에서, 비정규 핵융기 타겟이 정규 발단 타겟과는 전혀 다른 새로운 생물학적 기능을 보이며, 따라서 비정규 핵융기 타겟의 발현 저해만 조절하는 RNA 간섭 유도 핵산인 miRNA-BS를 발명하고, 이의 기능을 확인하였다. 하지만 miRNA-BS의 경우에도 기존의 miRNA의 비정규 핵융기 싸이트를 상보적으로 배열하도록 그 발단 서열이 바뀌었지만, 바뀐 발단 서열을 통해서 또다시 새로운 핵융기 싸이트가 생겨남을 확인할 수 있었다. 따라서 miRNA-BS와 같은 RNA 간섭 유도 핵산이 정규 발단 서열만 인식하고, 비정규 핵융기 싸이트는 인식하지 못하는 기술이 필요함을 알게 되었다. 이에, 본 발명자들은 비정규 핵융기 결합을 하기 위해서는 발단 서열에 있어서 5‘말단 기준 6번 위치의 염기가 중요하며, 이 6번 위치에 염기 배열의 배열 세기에 따라 비정규 핵융기 결합이 일어나는 정도가 달라질 수 있음에 주목하여, 6번 위치의 염기 배열 세기를 줄일 목적으로, 다음과 같은 실험을 진행하였다. 즉, miR-124의 6번 뉴클레오티드의 리보실 링의 2’위치에 메틸기 (2’ OMe) 를 넣어 변형하고, 변형된 간섭 유도 핵산 (miR-124-6me)이 miR-124의 비정규 핵융기 타겟 저해 기능이 있는지를 루시퍼라제 리포터 실험으로 관찰하였다. 2'OMe 변형된 miR-124는 합성(바이오니아 사)을 통해 제조하였고, 이전 실시예 2에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 루시퍼라제 리포터 실험을 진행하고 유전자 억제 효율을 IC50로 측정하였다 (도 22a). 이 때 사용한 루시퍼라제 리포터 벡터는 miR-124의 정규 발단 싸이트 (Luc-seed)와 비정규 핵융기 싸이트 (Luc-nucleation bulge)에 대한 것을 사용하였다.
그 결과, 실시예 2에서 보였던 miR-124에 의한 비정규 융기 표적 유전자 저해 효과가 사라졌으며, 반면에 정규 발단 싸이트를 통한 유전자 발현 억제는 IC50 값이 0.3 nM로 2‘OMe를 6번째 뉴크레오티드에 가하더라도 여전히 우수한 억제 효과를 보이는 것으로 관찰되었다 (도 22a). 추가적으로 동일한 방법으로 miR-124가 아닌 다른 마이크로RNA인 miR-1의 6번째 뉴크레오티드에 2'OMe를 적용하고 (miR-1-6me), 이를 miR-1의 정규 발단 싸이트(Luc-seed)와 비정규 핵융기 싸이트 (Luc-nucleation bulge)를 포함한 루시퍼라제 벡터로 표적에 대한 유전자 발현 저해 효과를 살펴보았을 때 (도 22b), 이전 miR-124에서의 결과와 동일하게 miR-1에 의한 비정규 융기 표적 유전자 저해 효과가 사라졌으며, 반면에 정규 발단 싸이트를 통한유전자 발현 억제는 IC50 값이 0.7nM로 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. 상기의 실시예를 통해, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 5‘말단 기준 6번째에 2’OMe 변형을 가하게 되면, 해당 RNA 간섭 유도 핵산에 의해서 유도되는 정규 발단 표적 유전자의 발현 억제 효과는 유지되면서, 비정규 핵융기 표적 유전자의 발현 억제는 사라지는 것을 확인 할 수 있었다.
[ 실시예 23] 5 ‘말단 기준 6번째에 2‘ OMe 변형이 전사체에서 전체 비정규 핵융기 표적 mRNA를 억제하지 못하는 것을 RNA- Seq 분석으로 확인
상기 실시예 22에서 miR-1의 6번째 뉴크레오티드에 2'OM 변형을 가하게 되면 (miR-1-6me) 정규 발단 표적 유전자의 발현 억제 효과는 유지되면서, 비정규 핵융기 표적 유전자의 발현 억제는 감소되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들이 발명한 miR-1-6me가 실제로 miR-1 기능에 관련된 모든 유전자가 발현되어 있는 심근세포주인 h9c2의 전사체에서 miR-1의 비정규 융기 표적 유전자의 억제 기능이 감소하였는 지를 확인하기 위하여, miR-1과 miR-1-6me를 h9c2 세포에 도입한 후에 RNA-Seq 분석을 시행하였다. RNA-Seq 실험은 실험 대조군으로 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-miR-67의 서열에서 5' 말단 기준 6번을 비염기로 변환한 것 (NT-6pi)를 사용하여 실시예 7에서와 같은 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 이때 RNA-Seq 라이브러리는 Lexogen사의 SENSE Total RNA-Seq Library Kit를 사용하여 제작하였으며, 이 후 Illumina사의 MiniSeq을 사용하여 시퀀싱하였다.
이 후, 상기 실험으로 얻어진 서열 데이터인 FASTAQ 파일을 TopHat2 프로그램으로 생쥐 유전체 서열 (rn6)에 맵핑하고, Cufflink, Cuffdiff 프로그램으로 발현값 (FPKM)을 구하여, 대조군 NT-6pi를 도입한 h9c2 세포에서의 결과로 표준화하여 로그비 (Fold change, log2 ratio)로 나타내어 분석을 실시하였다. 이때, 마이크로RNA의 표적 싸이트를 가지고 있는 유전자의 전령RNA의 양이 해당 마이크로RNA의 발현으로 저해되는 지를 RNA-Seq 결과에서 분석하기 위해서 miR-1의 정규 발단 싸이트 (5'말단 기준 2번째에서부터 8번째까지와 염기 배열하는 7mer)를 3'UTR에 가지고 있는 유전자를 선별하였고, 이러한 프로파일 결과를 해당 마이크로RNA의 발현에 의존적으로 저해되는 순서대로 누적비율 (cumulative fraction)로 비교 분석하였다 (도 23a). 그 결과 miR-1과 miR-1-6me 모두 miR-1의 정규 발단 싸이트를 3‘UTR에 가지고 있는 유전자(seed)를 전체 유전자(Total mRNA)의 분포에 비해 매우 잘 억제할 수 있음을 확인하였다. 이 후, 동일한 방법으로 miR-1의 비정규 융기 싸이트(nuc, 7mer)를 3'UTR에 가지고 있는 유전자에 대해서도 누적비율로 분석하여, miR-1-6me에 의해 miR-1의 비정규 핵융기 표적 유전자의 발현 저해가 감소되었는지를 miR-1이 도입된 세포와 miR-1-6me가 도입된 세포 안에서의 해당 표적 mRNA의 양을 상대적으로 비교해보았다 (도23b). 그 결과, miR-1에서는 miR-1-6me에서의 발현과 비교했을 때 전체 유전자 (Total mRNA)에 비해 유의하게 상대적으로 비정규 핵융기 표적 유전자가 여전히 저해되는 것을 관찰하였고, 이것을 통해 miR-1-6me에서 해당 비정규 핵융기 표적 유전자의 발현 억제가 감소됨을 확인할 수 있었다.
상기의 실시예의 결과로 미루어 볼 때, 전사체 수준에서 기존의 마이크로RNA는 기존의 정규 발단 표적 유전자와 함께 비정규 융기 표적 유전자를 함께 효율적으로 억제하지만, 6번째 뉴크레오티드에 2'OMe 변형을 가한 마이크로RNA (miRNA-6me)는 여전히 정규 발단 표적 유전자를 억제하지만, 비정규 융기 표적 유전자는 억제하지 못한다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 5‘말단 기준 6번째에 가하는 2'OMe 변형은 miRNA-BS에 적용하여 해당 miRNA의 비정규 핵융기 싸이트만을 특이적으로 억제하려는 본래의 의도는 유지하면서, 새롭게 나타날 수 있는 비정규 핵융기 결합은 완전히 제거함으로써 그 부작용을 최소화 할 수 있다.
[ 실시예 24] Ago HITS CLIP 실험 분석을 통해 비정규 핵융기 싸이트에 결합하는 마이크로RNA의 동정
마이크로RNA가 비정규 핵융기 싸이트만을 인식하여 억제할 수 있게 만든 발명이 적용될 수 있는 마이크로RNA를 동정하기 위해서, 마이크로RNA의 표적을 전사체 수준에서 분석할 수 있는 방법인 Ago HITS CLIP 실험 결과를 분석하여, 비정규 핵융기 싸이트에 결합하는 마이크로RNA를 분석하였다. 우선 태어난지 13일이 지난 마우스(p13)의 대뇌 피질에서 수행한 Ago HITS-CLIP 데이터를 실시예 10에서의 방법과 동일하게 서열 분석하여, 우선은 아고너트와 함께 결합하는 발현 상위 20개의 마이크로RNA가 표적 mRNA와 비정규 핵융기 싸이트와 결합한다는 사실을 확인하였다(도 24a). 따라서, 해당 마이크로RNA(도 24b)는 발단부분의 염기서열을 통한 표적 mRNA를 인식할 때, 발단 부분을 통한 정규적인 염기배열뿐만 아니라 비정규적으로 핵융기 싸이트를 통해서 표적 mRNA와 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
상기 실시예의 마우스 Ago HITS-CLIP 데이터 분석에서 확장하여, 인간의 뇌와 심장 조직에서 수행한 다른 Ago HITS-CLIP 결과 (boudreau RL et al, 2014, Neuron, 81(2) 294-305, Spengler RM et al, 2016, Nucleic Acids Res, 44(15) 7120-7131)를 위의 실시예와 동일한 방법으로 분석하고, Ago와 해당 마이크로RNA가 결합하는 정규 발단 싸이트 및 비정규 핵융기 싸이트의 빈도수를 계산하였다 (인간 뇌 마이크로RNA, 표 1; 인간 심장 마이크로RNA, 표 2).
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그 결과 해당 결과 표에 기술되어 있는 마이크로RNA (표 1 내지 2)가 해당 조직에서 비정규 핵융기 싸이트와 결합하고 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 실시예에서 Ago HITS-CLIP을 분석한 모든 데이터를 종합하여 발굴된 마이크로RNA에 대해서, 비정규 핵융기 싸이트를 정규 발단 싸이트로 인식하도록 변형시키는 본 발명을 적용하게 되면, 하기 표 3에 나와 있는 것과 같이 총 426개의 서열(BS sequence)로 RNA 간섭 핵산의 5'말단 기준 2번째부터 7번째까지의 뉴크레오티드가 구성되게 되고, 이렇게 변형된 RNA 간섭 핵산은 해당 마이크로RNA의 비정규 융기 표적만을 결합하고 해당 기능만을 나타내게 될 것이다.
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상기의 실시예의 Ago HITS-CLIP 실험 시퀀싱 분석을 통해, 여러 조직 세포에서 비정규 융기 표적에 결합하는 마이크로RNA를 동정하였고, 이에 비정규 핵융기 싸이트를 정규 발단 싸이트로 인식하도록 변형시키는 본 발명을 적용하게 되면 총 426개의 서열(BS sequence)이 만들어지게 되고, 이에 따라 마이크로RNA의 비정규 표적 억제 기능만을 나타내는 기술을 완성하였다.
[ 실시예 25] 암환자 마이크로RNA 시퀀싱 데이터베이스( TCGA )에서 서열 변이를 분석하고, 이를 통해 비정규 G:A 워블 발단 배열 싸이트에 결합하는 마이크로RNA의 동정
상기의 실시예를 통하여 마이크로RNA가 비정규적으로 G:A 워블 싸이트와 결합하여 표적 유전자 발현을 저해한다는 사실을 확인하였고, 이를 통해 본 발명에서 비정규 G:A 워블 싸이트를 정규 발단 싸이트로 인식하도록 서열을 변형하는 마이크로RNA 서열 변환 방식(miRNA-BS)을 개발하였다. 이렇게 기존의 마이크로RNA 발단 서열에 있는 G를 통해서 워블 배열로 표적 mRNA의 A와 결합하는 것이 마이크로RNA의 기능을 바꾼다면, 이러한 기작이 종양과 같은 질병에서 마이크로RNA의 서열 변이를 통해 나타날 수 있다는 생각에서 암환자의 조직에서 마이크로RNA를 시퀀싱한 결과(miRNA-Seq)를 분석하였다. 이때, 암환자 마이크로RNA 서열 실험 관련 TCGA 데이터베이스에서 8105개를 얻고, 추가로 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스에서 암 관련 마이크로RNA 서열 결과 468개를 얻어, 총 8,573개의 종양 마이크로RNA 서열 결과를 실시예 10에서 사용한 방법과 동일하게 bowtie2 프로그램을 통해 맵핑하고 변이가 일어난 곳을 분석하였다. 이때의 각 암 종류별로 분석에 사용된 마이크로RNA 서열 데이터는 도 25a에 나와 있는 것과 같다.
해당 결과에서 변이가 일어난 빈도(fraction)를 마이크로RNA 5'말단 기준 위치(position)별로 구분하여 가장 많이 일어난 변이 10,000개(top 10000)와 가정 적게 일어난 변이 10,000개(bottom 10000)의 분포를 살펴본 결과 (도 25b), 가장 많이 일어난 변이 10,000개의 경우에는 마이크로RNA의 발단 부분 (2번째부터 8번째사이)에 주로 일어난다는 점을 관찰할 수 있었다. 또한 가장 많이 일어난 변이 100개와 가장 적게 일어난 변이 100개를 heatmap 상에서 살펴보았을 때도 (도 25c) 상기에서 실시예와 동일하게 변이가 발단 지역에 몰려 있음을 알 수 있었다. 이렇게 발단 부분에서 나타나는 경향성을 보이는 종양 마이크로RNA의 서열 변이는 이를 역전사시켜 DNA로 서열 분석한 해당 결과에서 염기 구성으로 각각 A, T, C, G로 구분해서 살펴보았을 때 오로지 G만이 발단 서열에서 형성되는 경향성을 보였다 (도 25d). 이러한 경향성은 상위 변이율 100개에 대해서뿐만 아니라, 이를 넘어서서 변이가 일어나는 모든 경우에 G에서 주로 변이가 일어나는 것임을 다시 확인할 수 있었다 (도 25e).
이는 본 발명자가 주목한 비정규 G:A 워블을 인식하는 마이크로RNA의 G가 반대편 표적 mRNA의 A를 더 잘 결합하기 위해서 U로 변이 되어 나타나는 현상일 수 있어, 실제로 상위 변이율로 나타나는 G에 일어나는 변이에서 어떤 염기로 바뀌었는지를 분석해본 결과 (도 25f), 대부분이 역전사시켜 DNA로 서열 분석한 해당 결과에서 G에서 T로 바뀐 것임을 관찰하였다. 이러한 결과는 마이크로RNA가 실제로 암조직에서는 발단 부분에 존재하는 G가 비정규 G:A 워블 발단 표적을 보다 더 잘 정규 발단으로 인식하기 위해, 자신의 G를 U로 바꿔 표적의 A랑 염기배열한다는 것을 의미하고, 따라서 이러한 방식의 변이는 본 발명에서 개발한 비정규 G:A 워블 발단 서열을 정규 발단 서열로 인식하게 만드는 서열 결정 방식을 어떠한 마이크로RNA의 어떤 위치의 G에 적용해야 하는지를 알려준다. 따라서 이러한 결과를 모두 종합하여, 암 환자당 정규화 변이 빈도수가 2이상인 마이크로RNA를 선정하였다 (표 4 참조). 표 4에 나와 있는 것과 같이 총 335개의 서열(sequence (G>U))로 RNA 간섭 핵산의 5'말단 기준 2번째부터 뉴크레오티드가 구성되게 되고, 이렇게 변형된 RNA 간섭 핵산은 해당 마이크로RNA의 비정규 G:A 워블 융기 표적만을 결합하고 해당 기능만을 나타내게 될 것이다.
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상기 실시예의 마이크로RNA 시퀀싱 변이 분석을 통해, 여러 암 환자에서 비정규 G:A 워블 발단 표적을 정규 표적으로 인식하는 변이 마이크로RNA를 동정하였고, 이에 비정규 G:A 워블 발단 싸이트를 정규 발단 싸이트로 인식하도록 변형시키는 본 발명(miRNA-GU)를 적용하게 되면 총 335개의 서열(sequence (G>U))이 만들어지게 되고 (표 4), 이에 따라 마이크로RNA의 비정규 표적 억제 기능만을 나타내는 기술을 완성하였다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산을 이용하면, 마이크로RNA가 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적인 기능을 효율적으로 증대하거나, 기존의 마이크로RNA가 나타내는 기능 중 일부, 즉 비정규 표적 유전자를 억제함으로써 나타내는 생물학적 기능만 선택적으로 나타내는 효과를 가지며, 본 발명의 간섭 유도 핵산을 통해 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절이 가능한바, 약물, 화장품 등 다양한 분야에서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Claims (38)

  1. RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하고, 또는
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 또는 아데닌(Adenine)으로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 해당 부위의 G:A 또는 G:U 워블 배열이 U:A 또는 A:U의 정규적인 염기 배열이 되게 하는 것을 특징으로 하는,
    RNA 간섭 유도 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자를 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 특정 마이크로RNA는 miR-124, miR-155, miR-122, miR-1, let-7, miR-133, miR-302 및 miR-372로 이루어진 군에서 선택되어 동일한 발단 서열을 가지면서 18 내지 24개의 염기로 구성된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단 2번째에서 7번째 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산:
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-AA GGC C-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-124-BS);
    miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로 5'-GG AGU U-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-122-BS);
    miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UA AUG G-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-155-BS); 또는
    miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-GG AAU U-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-1-BS).
  5. 제4항에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상으로 나타내는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산:
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UAA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3' 의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-124-BS);
    miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로 5'-UGG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-122-BS);
    miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UUA AUG GC UAA U CGU GAU AGG-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-155-BS);
    miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UGG AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3'의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산 (miR-1-BS).
  6. 제1항에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산:
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UAA UGC ACG-3' (miR-124-G4U), 5'-UAA GUC ACG-3' (miR-124-G5U) 또는 5'-UAA UUC ACG-3' (miR-124-G4,5U) 의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UUG AAU GUA-3' (miR-1-G2U), 5'-UGU AAU GUA-3' (miR-1-G3U), 5'-UGG AAU UUA-3' (miR-1-G7U), 5'-UUU AAU GUA-3' (miR-1-G2,3U), 5'-UGU AAU UUA-3' (miR-1-G3,7U), 5'-UUG AAU UUA-3' (miR-1-G2,7U) 또는 5'-UUU AAU UUA-3' (miR-1-G2,3,7U) 의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UUG AGU GUG-3' (miR-122-G2U), 5'-UGU AGU GUG-3' (miR-122-G3U), 5'-UGG AUU GUG-3' (miR-122-G5U), 5'-UGG AGU UUG-3' (miR-122-G7U), 5'-UGG AGU GUU-3' (miR-122-G9U), 5'-UUU AGU GUG-3' (miR-122-G2,3U), 5'-UUG AUU GUG-3' (miR-122-G2,5U), 5'-UUG AGU UUG-3' (miR-122-G2,7U), 5'-UUG AGU GUU-3' (miR-122-G2,9U), 5'-UGU AUU GUG (miR-122-G3,5U), 5'-UGU AGU UUG-3' (miR-122-G3,7U), 5'-UGU AGU GUU-3' (miR-122-G3,9U), 5'-UGG AUU UUG-3' (miR-122-G5,7U), 5'-UGG AUU GUU-3' (miR-122-G5,9U), 또는 5'-UGG AGU UUU-3 (miR-122-G7,9U) 의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UUU UGU CCC-3' (miR-133-G4U), 5'-UUU GUU CCC-3' (miR-133-G5U) 또는 5'-UUU UUU CCC-3'(miR-124-G4,5U) 의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
    let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UUA GGU AGU-3' (let-7-G2U), 5'-UGA UGU AGU-3' (let-7-G4U), 5'-UGA GUU AGU-3' (let-7-G5U), 5'-UGA GGU AUU-3' (let-7-G8U), 5'-UUA UGU AGU-3' (let-7-G2,4U), 5'-UUA GUU AGU-3' (let-7-G2,5U), 5'-UUA GGU AUU-3' (let-7-G2,8U), 5'-UGA UUU AGU-3' (let-7-G4,5U), 5'-UGA UGU AUU-3' (let-7-G4,8U), 또는 5'-UGA GUU AUU-3' (let-7-G5,8U)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UAA UUG CUU-3' (miR-302a-G4U), 5'-UAA GUU CUU-3' (miR-302a-G6U), 또는 5'-UAA UUU CUU-3' (miR-302a-G4,6U)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산; 또는
    miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-AAA UUG CUG-3' (miR-372-G4U), 5'-AAA GUU CUG-3' (miR-372-G6U), 5'-AAA GUG CUU-3' (miR-372-G9U), 5'-AAA UUU CUG-3' (miR-372-G4,6U), 5'-AAA UUG CUU-3' (miR-372-G4,9U), 또는 5'-AAA GUU CUU-3' (miR-372-G6,9U)의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 염기 서열이 다음 중 어느 하나 이상으로 나타내는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산:
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3' (miR-124-G4U), 5'-UAA GUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G5U) 또는 5'-UAA UUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G4,5U) 의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서
    5'-UUG AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2U), 5'-UGU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G3U), 5'-UGG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G7U), 5'-UUU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,3U), 5'-UGU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G3,7U), 5'-UUG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,7U) 또는 5'-UUU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3' (miR-1-G2,3,7U) 의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서5'-UUG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2U), 5'-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3U), 5'-UGG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5U), 5'-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G7U), 5'-UGG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G9U), 5'-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,3U), 5'-UUG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,5U), 5'-UUG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,7U), 5'-UUG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G2,9U), 5'-UGU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,5U), 5'-UGU AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,7U), 5'-UGU AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3 (miR-122-G3,9U), 5'-UGG AUU UUG ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5,7U), 5'-UGG AUU GUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G5,9U) 또는 5'-UGG AGU UUU ACA AUG GUG UUU G-3' (miR-122-G7,9U) 의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UUU UGU CCC CUU CAA CCA GCU G -3' (miR-133-G4U), 5'-UUU GUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3' (miR-133-G5U) 또는 5'-UUU UUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3'(miR-124-G4,5U) 의 염기 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산; let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UUA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2U), 5'-UGA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4U), 5'-UGA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G5U), 5'-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G8U), 5'-UUA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,4U), 5'-UUA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,5U), 5'-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G2,8U), 5'-UGA UUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4,5U), 5'-UGA UGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G4,8U) 또는 5'-UGA GUU AUU AGG UUG UAU AGU U-3' (let-7-G5,8U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산;
    miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G4U), 5'-UAA GUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G6U), 또는 5'-UAA UUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3' (miR-302a-G4,6U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산; 또는
    miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서 5'-AAA UUG CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4U), 5'-AAA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G6U), 5'-AAA GUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G9U), 5'-AAA UUU CUG CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,6U), 5'-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G4,9U), 또는 5'-AAA GUU CUU CGA CAU UUG AGC GU -3' (miR-372-G6,9U)의 염기 서열을 나타내는 RNA 간섭 유도 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 다음 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물:
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물;
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 신경 돌기 가지 분화 유도용 조성물;
    miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암 세포의 세포 주기 정지 유도용 조성물;
    miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 근세포 분화 촉진 또는 근섬유화 촉진용 조성물;
    miR-155의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 근세포 사멸 유도용 조성물;
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 신경 모세포종의 세포 사멸 촉진용 조성물;
    miR-124의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 신경 모세포종의 세포 분열 증식 촉진용 조성물;
    miR-1의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 심근 비대 유도용 조성물;
    miR-133의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 심근 비대 유도용 조성물;
    let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 암 세포의 세포 주기 정지 유도용 조성물;
    let-7의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간세포의 세포 주기 진행 활성 유도용 조성물;
    miR-302a의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 역분화 촉진용 조성물;
    miR-372의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 역분화 촉진용 조성물; 또는
    miR-122의 비정규 표적 유전자를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암 세포의 세포 이동 저해용 조성물.
  11. 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법:
    특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계, 또는
    특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil)로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지게 하여, 해당 부위의 G:A 또는 G:U 워블 배열이 U:A 또는 A:U의 정규적인 염기 배열이 되도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 대상 세포에 트랜스펙션하는 단계;
    대상 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    대상 세포에서 RNA 간섭 유도 핵산이 억제하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자의 발현양 내지 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는,
    세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절용 시험 물질을 스크리닝하는 방법.
  13. RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하며,
    상기 특정 마이크로RNA는 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)가 첨가된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 해당 RNA 간섭 유도 핵산의 정규 발단 표적 유전자의 발현만을 억제하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 비정규 핵융기 싸이트만을 특이적으로 억제하고, 새롭게 발생할 수 있는 비정규 핵융기 싸이트를 제거하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  17. 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
    특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계; 및
    상기 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 6번째 뉴클레오티드의 리보실 링의 2' 위치에 메틸기(2'OMe)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법.
  18. RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 비정규 핵융기 표적 싸이트만을 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 하기 표에 나타낸 서열번호 103 내지 528 중 어느 하나 이상으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
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  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  22. 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
    특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 5번째의 4개의 염기 서열을 포함하고, 6번째와 7번째 염기는 동일하며 6번째와 7번째 염기는 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기와 상보적인 염기 서열을 가지며, 상기 특정 마이크로RNA의 6번째 염기와 배열할 수 있는 염기에는 G:A, G:U 워블(wobble) 배열을 포함한 모든 상보적 염기가 포함되게 하여, 마이크로RNA의 5번째와 6번째 사이에 표적 유전자에서 융기(bulge)가 생기면서 결합하는 비정규 표적 염기 배열에서 해당 융기가 사라지고 연속적인 염기 배열로 결합하도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법.
  23. RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)를 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산으로서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째에서 9번째 염기 사이의 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지며, 해당 부위의 G:A 워블(wobble)이 U:A의 정규적인 염기 배열이 되게 하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열을 포함하고,
    상기 염기 서열은 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 G:A 워블(wobble) 배열로 결합하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자만을 선택적으로 억제하고 마이크로RNA의 정규 표적 유전자는 억제하지 않는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산은 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열이 하기 표에 나타낸 서열번호 529 내지 863 중 어느 하나 이상으로 표시되는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산.
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  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  28. 다음의 단계를 포함하는, RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 특정 마이크로RNA의 일부 서열이 변형되어 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자(noncanonical target gene)의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법으로서,
    특정 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째 염기에서 시작하여 6개 내지 8개의 연속적인 염기 서열 중 구아닌(Guanine) 염기가 유라실(Uracil) 염기로 적어도 하나 이상 치환된 변형 염기 서열을 가지도록 RNA 간섭 유도 핵산을 작제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭 유도 핵산의 제조방법.
  29. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법.
  30. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도.
  31. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절 방법.
  32. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산의, 세포 주기, 분화, 역분화, 형태, 이동, 분열, 증식 또는 사멸 조절 용도.
  33. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법.
  34. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도.
  35. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법.
  36. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도.
  37. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 방법.
  38. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항의 RNA 간섭 유도 핵산의, 마이크로RNA의 비정규 표적 유전자 발현 억제 용도.
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