JP2022141687A - マイクロrnaの非正規標的を抑制するrna干渉誘導核酸およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
RNAの非正規標的を選択的に抑制することによって発揮される有用な効果を有する干渉
誘導核酸およびその用途に関する。
3054号、2018年5月31日に出願された韓国特許出願第10-2018-006
3055号、2019年5月31日に出願された韓国特許出願第10-2019-006
4333号、2019年5月31日に出願された韓国特許出願第10-2019-006
4334号、2019年5月31日に出願された韓国特許出願第10-2019-006
4335号、および2019年5月31日に出願された韓国特許出願第10-2019-
0064386号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたす
べての内容は、本出願に援用される。
抑制する現象をいう。自然的に存在するRNA干渉現象は、マイクロRNA(micro
RNA,miRNA)によって起こる。マイクロRNAは、18~25個の塩基で構成
されており、そのうち大部分は、約21個の塩基で構成される小さいRNAであって、ア
ルゴノート(Argonaute)タンパク質を通じて標的となる遺伝子の伝令RNA(
mRNAs)と相補的塩基配列をする。動物マイクロRNAの場合、アルゴノートタンパ
ク質と結合して標的となる伝令RNAと部分的な塩基配列をすることになるが、この際、
マイクロRNAの5’末端基準1番目から8番目までの核酸で定義されるシード領域(s
eed region)で最小限6個以上の連続的な塩基配列をする場合、標的と認識し
、最も重要には、最小限5’末端基準2番目から7番目までの6個の塩基配列で連続的に
標的伝令RNAと結合した場合に、十分に当該標的伝令RNAを分解したり翻訳(tra
nslation)されることを抑制して、その発現を阻害する(Lewis BP,e
t.al,2003,Cell,115(7),787-98)。このようにマイクロR
NAが部分的な塩基配列を通じて標的遺伝子の伝令RNAを認識するので、1つのマイク
ロRNAは、通常、数百個から数千個の遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。
、正常状況では、細胞の分化と成長に関与し、機能に異常があるときは、癌および退行性
疾患、糖尿病などを誘発することになって、生命現象の鍵として注目されている。したが
って、マイクロRNAの遺伝子発現阻害作用を人為的に誘導するために、マイクロRNA
のシード領域を含むRNA干渉素材(siRNAまたはshRNA)をデザインして細胞
内に導入することによって、人為的に細胞を分化させたり機能を変え、場合に応じて疾病
治療剤として使用したりする。したがって、アルゴノートで媒介されて標的伝令RNAを
認識することになるマイクロRNAシード領域での相補的塩基配列は、マイクロRNAを
含むRNA干渉素材が機能を発揮するにあたって重要である。特に、このようなRNA干
渉素材を活用するためには、それぞれのマイクロRNAの機能を把握することが要求され
、この際、マイクロRNAの機能は、いかなる標的遺伝子を抑制するかによって決定され
るので、マイクロRNAの全体標的遺伝子(標的体)に対する分析が必要になった。
ITS-CLIP(またはCLIP-Seqと呼ばれる)実験を通じて初めて行われた。
Ago HITS CLIP実験方法は、細胞や組織サンプルにUVを照射して細胞内で
RNAとアルゴノートタンパク質(Argonaute;Ago)との間に共有結合を介
した複合体を形成するようにし、このようなRNA-アルゴノート複合体をアルゴノート
特異的認識抗体を用いて免疫沈降法で分離した後、分離したRNAを次世代塩基配列(N
ext-generation sequencing)で分析する方法である。これを
通してアルゴノートに結合したマイクロRNAと、相補的塩基配列する標的伝令RNA群
とその位置を正確に分析することができる(Chi S et al,Nature,2
009,460(7254):479-86)。
RNAシード領域(seed region)と正確に相補関係でなくても結合する場合
があることを明らかにした。より具体的に、マイクロRNAの5’末端基準1番目から8
番目の塩基配列で定義されるマイクロRNAシード領域(seed region)が最
小限6個以上の連続的且つ完ぺきな塩基配列の配列で伝令RNAと結合すること、特にそ
のうち最も重要には、5’末端基準2番目から7番目までの塩基配列で結合することを正
規標的認識(canonical target recognition)といい、上
述した規則から外れて、マイクロRNAシード領域(seed region)と連続的
且つ正確な相補配列関係でなくてもマイクロRNAの標的と認識し結合することを非正規
標的認識(non-canonical target recognition)とい
う。Ago HITS-CLIP分析結果によれば、マイクロRNAがシード領域を通じ
て非正規的に標的を認識する頻度は、正規的に認識する頻度の約50%に達するほど頻繁
に現れることが分かる。
NA干渉素材(例えば、siRNAまたはshRNA)は、正規標的遺伝子だけでなく、
様々な非正規標的遺伝子を抑制することによって生物学的機能が現れることが分かる。
列をそのまま含んでデザインされたRNA干渉素材が有する限界を解決し、効率を増大す
るためのものである。
れたRNA干渉素材は、正規標的遺伝子と非正規標的遺伝子の両方を抑制するものの、正
規標的遺伝子は強く抑制するが、それに比べて非正規標的遺伝子は非常に弱く抑制する。
したがって、本発明が解決しようとする課題は、従来のマイクロRNAが非正規標的遺伝
子を抑制することによって示す生物学的な機能を効率的に増大したり、従来のマイクロR
NAが示す機能のうち一部、すなわち非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物
学的機能のみを選択的に示す効果を有する、RNA干渉誘導核酸を提供するためのもので
ある。
てマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target ge
ne)を抑制するRNA干渉誘導核酸を提供する。
本発明は、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖
のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロ
RNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑
制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAで標的伝令RNAと結合で最も重要に
作用する部位である5’末端基準2番目から7番目までの塩基配列を基準として、5’末
端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり
、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補
的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G
:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにし
て、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結
合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにするこ
とを特徴とし、または
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩
基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Gu
anine)塩基がウラシル(Uracil)にまたはアデニン(Adenine)に少
なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のG:Aまたは
G:Uワブル配列がU:AまたはA:Uの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴
とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
122、miR-1,let-7、miR-133、miR-302およびmiR-37
2よりなる群から選ばれて、同じシード配列を有しながら18~24個の塩基で構成され
ることを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-A
A GGC C-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-124-BS)(
配列番号1);
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-G
G AGU U-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-122-BS)(
配列番号2);
miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
A AUG G-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-155-BS)(
配列番号3);または
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-GG
AAU U-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-1-BS)(配列番号
4)。
ことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
AA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3’の塩基配列を示すRNA
干渉誘導核酸(miR-124-BS)(配列番号5);
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
GG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3’の塩基配列を示すRNA
干渉誘導核酸(miR-122-BS)(配列番号6);
miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
UA AUG GCU AAU CGU GAU AGG-3’の塩基配列を示すRNA
干渉誘導核酸(miR-155-BS)(配列番号7);または
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-UGG
AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3’の塩基配列を示すRNA干渉
誘導核酸(miR-1-BS)(配列番号8)。
下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、好ましく
は、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラ
シル(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして
、5’-UAA UGC ACG-3’(miR-124-G4U)(配列番号9)、5
’-UAA GUC ACG-3’(miR-124-G5U)(配列番号10)または
、5’-UAA UUC ACG-3’(miR-124-G4,5U)(配列番号11
)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、好ましくは、
5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル
(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、5
’-UUG AAU GUA-3’(miR-1-G2U)(配列番号12)、5’-U
GU AAU GUA-3’(miR-1-G3U)(配列番号13)、5’-UGG
AAU UUA-3’(miR-1-G7U)(配列番号14)、5’-UUU AAU
GUA-3’(miR-1-G2,3U)(配列番号15)、5’-UGU AAU
UUA-3’(miR-1-G3,7U)(配列番号16)、5’-UUG AAU U
UA-3’(miR-1-G2,7U)(配列番号17)または、5’-UUU AAU
UUA-3’(miR-1-G2,3,7U)(配列番号18)の塩基配列を含むRN
A干渉誘導核酸;
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUG AGU GUG-3’(miR-122-G2U)(配列番号19)、
5’-UGU AGU GUG-3’(miR-122-G3U)(配列番号20)、5
’-UGG AUU GUG-3’(miR-122-G5U)(配列番号21)、5’
-UGG AGU UUG-3’(miR-122-G7U)(配列番号22)、5’-
UGG AGU GUU-3’(miR-122-G9U)(配列番号23)、5’-U
UU AGU GUG-3’(miR-122-G2,3U)(配列番号24)、5’-
UUG AUU GUG-3’(miR-122-G2,5U)(配列番号25)、5’
-UUG AGU UUG-3’(miR-122-G2,7U)(配列番号26)、5
’-UUG AGU GUU-3’(miR-122-G2,9U)(配列番号27)、
5’-UGU AUU GUG-3’(miR-122-G3,5U)(配列番号28)
、5’-UGU AGU UUG-3’(miR-122-G3,7U)(配列番号29
)、5’-UGU AGU GUU-3’(miR-122-G3,9U)(配列番号3
0)、5’-UGG AUU UUG-3’(miR-122-G5,7U)(配列番号
31)、5’-UGG AUU GUU-3’(miR-122-G5,9U)(配列番
号32)、または、5’-UGG AGU UUU-3(miR-122-G7,9U)
(配列番号33)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸であって、好ましくは、5’末端
基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Ura
cil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、5’-UU
G AGU GUG-3’(miR-122-G2U)(配列番号19)、5’-UGU
AGU GUG-3’(miR-122-G3U)(配列番号20)、5’-UGG
AUU GUG-3’(miR-122-G5U)(配列番号21)、5’-UGG A
GU UUG-3’(miR-122-G7U)(配列番号22)、5’-UUU AG
U GUG-3’(miR-122-G2,3U)(配列番号24)、5’-UUG A
UU GUG-3’(miR-122-G2,5U)(配列番号25)、5’-UUG
AGU UUG-3’(miR-122-G2,7U)(配列番号26)、5’-UGU
AUU GUG-3’(miR-122-G3,5U)(配列番号28)、5’-UG
U AGU UUG-3’(miR-122-G3,7U)(配列番号29)、5’-U
GG AUU UUG-3’(miR-122-G5,7U)(配列番号31)の塩基配
列を含むRNA干渉誘導核酸;
miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、好ましく
は、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラ
シル(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして
、5’-UUU UGU CCC-3’(miR-133-G4U)(配列番号34)、
5’-UUU GUU CCC-3’(miR-133-G5U)(配列番号35)また
は5’-UUU UUU CCC-3’(miR-124-G4,5U)(配列番号36
)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUA GGU AGU-3’(let-7-G2U)(配列番号37)、5’
-UGA UGU AGU-3’(let-7-G4U)(配列番号38)、5’-UG
A GUU AGU-3’(let-7-G5U)(配列番号39)、5’-UGA G
GU AUU-3’(let-7-G8U)(配列番号40)、5’-UUA UGU
AGU-3’(let-7-G2,4U)(配列番号41)、5’-UUA GUU A
GU-3’(let-7-G2,5U)(配列番号42)、5’-UUA GGU AU
U-3’(let-7-G2,8U)(配列番号43)、5’-UGA UUU AGU
-3’(let-7-G4,5U)(配列番号44)、5’-UGA UGU AUU-
3’(let-7-G4,8U)(配列番号45)、または5’-UGA GUU AU
U-3’(let-7-G5,8U)(配列番号46)の塩基配列を含むRNA干渉誘導
核酸であって、好ましくは、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Gu
anine)塩基がウラシル(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基
配列を有するようにして、5’-UUA GGU AGU-3’(let-7-G2U)
(配列番号37)、5’-UGA UGU AGU-3’(let-7-G4U)(配列
番号38)、5’-UGA GUU AGU-3’(let-7-G5U)(配列番号3
9)、5’-UUA UGU AGU-3’(let-7-G2,4U)(配列番号41
)、5’-UUA GUU AGU-3’(let-7-G2,5U)(配列番号42)
、5’-UGA UUU AGU-3’(let-7-G4,5U)(配列番号44)の
塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、好まし
くは、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウ
ラシル(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにし
て、5’-UAA UUG CUU-3’(miR-302a-G4U)(配列番号47
)、5’-UAA GUU CUU-3’(miR-302a-G6U)(配列番号48
)、または5’-UAA UUU CUU-3’(miR-302a-G4,6U)(配
列番号49)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;または
miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、好ましく
は、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラ
シル(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして
、
5’-AAA UUG CUG-3’(miR-372-G4U)(配列番号50)、
5’-AAA GUU CUG-3’(miR-372-G6U)(配列番号51)、5
’-AAA GUG CUU-3’(miR-372-G9U)(配列番号52)、5’
-AAA UUU CUG-3’(miR-372-G4,6U)(配列番号53)、5
’-AAA UUG CUU-3’(miR-372-G4,9U)(配列番号54)、
または5’-AAA GUU CUU-3’(miR-372-G6,9U)(配列番号
55)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸。
ことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3’(miR
-124-G4U)(配列番号56)、5’-UAA GUC ACG CGG UGA
AUG CCA A-3’(miR-124-G5U)(配列番号57)または5’-
UAA UUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3’(miR-124
-G4,5U)(配列番号58)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUG AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR
-1-G2U)(配列番号59)、5’-UGU AAU GUA AAG AAG U
AU GUA U-3’(miR-1-G3U)(配列番号60)、5’-UGG AA
U UUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR-1-G7U)(配列
番号61)、5’-UUU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3
’(miR-1-G2,3U)(配列番号62)、5’-UGU AAU UUA AA
G AAG UAU GUA U-3’(miR-1-G3,7U)(配列番号63)、
5’-UUG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR-
1-G2,7U)(配列番号64)または5’-UUU AAU UUA AAG AA
G UAU GUA U-3’(miR-1-G2,3,7U)(配列番号65)の塩基
配列を示すRNA干渉誘導核酸;
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
UG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-
G2U)(配列番号66)、5’-UGU AGU GUG ACA AUG GUG
UUU G-3(miR-122-G3U)(配列番号67)、5’-UGG AUU
GUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G5U)(配列
番号68)、5’-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3
’(miR-122-G7U)(配列番号69)、5’-UGG AGU GUU AC
A AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G9U)(配列番号70)、
5’-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-
122-G2,3U)(配列番号71)、5’-UUG AUU GUG ACA AU
G GUG UUU G-3’(miR-122-G2,5U)(配列番号72)、5’
-UUG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-12
2-G2,7U)(配列番号73)、5’-UUG AGU GUU ACA AUG
GUG UUU G-3’(miR-122-G2,9U)(配列番号74)、5’-U
GU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3(miR-122-G
3,5U)(配列番号75)、5’-UGU AGU UUG ACA AUG GUG
UUU G-3(miR-122-G3,7U)(配列番号76)、5’-UGU A
GU GUU ACA AUG GUG UUU G-3(miR-122-G3,9U
)(配列番号77)、5’-UGG AUU UUG ACA AUG GUG UUU
G-3’(miR-122-G5,7U)(配列番号78)、5’-UGG AUU
GUU ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G5,9U)(
配列番号79)または5’-UGG AGU UUU ACA AUG GUG UUU
G-3’(miR-122-G7,9U)(配列番号80)の塩基配列を示すRNA干
渉誘導核酸;
miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
UU UGU CCC CUU CAA CCA GCU G-3’(miR-133-
G4U)(配列番号81)、5’-UUU GUU CCC CUU CAA CCA
GCU G-3’(miR-133-G5U)(配列番号82)または5’-UUU U
UU CCC CUU CAA CCA GCU G-3’(miR-133-G4,5
U)(配列番号83)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-UUA
GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G2U)
(配列番号84)、5’-UGA UGU AGU AGG UUG UAU AGU
U-3’(let-7-G4U)(配列番号85)、5’-UGA GUU AGU A
GG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G5U)(配列番号86)、5
’-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7
-G8U)(配列番号87)、5’-UUA UGU AGU AGG UUG UAU
AGU U-3’(let-7-G2,4U)(配列番号88)、5’-UUA GU
U AGU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G2,5U)(
配列番号89)、5’-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U
-3’(let-7-G2,8U)(配列番号90)、5’-UGA UUU AGU
AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G4,5U)(配列番号91
)、5’-UGA UGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3’(le
t-7-G4,8U)(配列番号92)または5’-UGA GUU AUU AGG
UUG UAU AGU U-3’(let-7-G5,8U)(配列番号93)の塩基
配列を示すRNA干渉誘導核酸;
miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-
UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3’(miR-30
2a-G4U)(配列番号94)、5’-UAA GUU CUU CCA UGU U
UU GGU GA-3’(miR-302a-G6U)(配列番号95)、または5’
-UAA UUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3’(miR-3
02a-G4,6U)(配列番号96)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸;または
miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-A
AA UUG CUG CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372
-G4U)(配列番号97)、5’-AAA GUU CUG CGA CAU UUG
AGC GU-3’(miR-372-G6U)(配列番号98)、5’-AAA G
UG CUU CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372-G9U
)(配列番号99)、5’-AAA UUU CUG CGA CAU UUG AGC
GU-3’(miR-372-G4,6U)(配列番号100)、5’-AAA UU
G CUU CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372-G4,9
U)(配列番号101)、または5’-AAA GUU CUU CGA CAU UU
G AGC GU-3’(miR-372-G6,9U)(配列番号102)の塩基配列
を示すRNA干渉誘導核酸。
物を提供する。
Aの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
供する。
裂、増殖または死滅調節用組成物を提供する。
化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節方法を提供する。
たは死滅調節用途を提供する。
成物を提供する:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む癌細胞死滅誘
導用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む神経突起分岐
分化誘導用組成物;
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細
胞周期停止誘導用組成物;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む筋細胞分化促進ま
たは筋線維化促進用組成物;
miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む筋細胞死滅誘
導用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫
の細胞死滅促進用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫
の細胞分裂増殖促進用組成物;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組
成物;
miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導
用組成物;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む癌細胞の細胞周期
停止誘導用組成物;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む肝細胞の細胞周期
進行活性誘導用組成物;
miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む逆分化促進
用組成物;
miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む逆分化促進用
組成物;または
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細
胞移動阻害用組成物。
導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が
変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical targe
t gene)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法を提供する:
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の塩
基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての相
補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で隆
起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基
配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン(Gu
anine)塩基がウラシル(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基
配列を有するようにして、当該部位のG:AまたはG:Uワブル配列がU:AまたはA:
Uの正規的な塩基配列になるようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階。
、逆分化または死滅調節用試験物質をスクリーニングする方法を提供する:
RNA干渉誘導核酸を対象細胞にトランスフェクションする段階;
対象細胞に試験物質を処理する段階;および
対象細胞でRNA干渉誘導核酸が抑制するマイクロRNAの非正規標的遺伝子の発現量
乃至発現有無を確認する段階。
本発明は、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖
のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロ
RNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑
制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、
前記特定マイクロRNAは、5’末端から6番目のヌクレオチドのリボース環の2’位
にメチル基(2’OMe)が添加されたことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供す
る。
伝子の発現のみを抑制することを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
みを特異的に抑制し、新しく発生しうる非正規核隆起サイトを除去することを特徴とする
、RNA干渉誘導核酸を提供する。
制用組成物を提供する。
クロRNAの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
用途を提供する。
)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部
配列が変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical ta
rget gene)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で
隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩
基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階;および
前記特定マイクロRNAの5’末端から6番目のヌクレオチドのリボース環の2’位に
メチル基(2’OMe)を添加する段階を含むことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸の
製造方法を提供する。
号103~528)に対して
本発明は、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖
のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロ
RNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑
制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とする、RNA干渉
誘導核酸を提供する。
し、マイクロRNAの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする、RNA干渉誘導核
酸を提供する。
iR-125a-5p/125b-5p/351/670/4319、miR-124/
124ab/506、miR-9/9ab、miR-29abcd、miR-103a/
107/107ab、miR-221/222/222ab/1928、miR-26a
b/1297/4465、miR-15abc/16/16abc/195/322/4
24/497/1907、miR-126-3p、miR-30abcdef/30ab
e-5p/384-5p、miR-33ab/33-5p、miR-34ac/34bc
-5p/449abc/449c-5p、miR-19ab、miR-99ab/100
、miR-17/17-5p/20ab/20b-5p/93/106ab/427/5
18a-3p/519d、miR-27abc/27a-3p、miR-218/218
a、miR-22/22-3p、miR-185/882/3473/4306/464
4、miR-181abcd/4262、miR-338/338-3p、miR-12
7/127-3p、miR-101/101ab、miR-149、miR-324-5
p、miR-24/24ab/24-3p、miR-33a-3p/365/365-3
p、miR-139-5p、miR-138/138ab、miR-143/1721/
4770、miR-25/32/92abc/363/363-3p/367、miR-
574-5p、miR-7/7ab、miR-145、miR-135ab/135a-
5p、miR-148ab-3p/152、miR-28-5p/708/1407/1
653/3139、miR-130ac/301ab/301b/301b-3p/45
4/721/4295/3666、miR-3132、miR-155、miR-485
-3p、miR-132/212/212-3p、hsa-miR-9-3p、miR-
374ab、miR-129-3p/129ab-3p/129-1-3p/129-2
-3p、hsa-miR-126-5p、miR-425/425-5p/489、mi
R-423-3p、miR-21/590-5p、miR-31、hsa-miR-20
b-3p、hsa-let-7d-3p、miR-191、miR-18ab/4735
-3p、miR-369-3p、hsa-miR-5187-5p、miR-382、m
iR-485-5p/1698/1703/1962、hsa-miR-136-3p、
miR-576-3p、miR-204/204b/211、miR-769-5p、m
iR-342-5p/4664-5p、miR-361-5p、miR-199ab-3
p/3129-5p、miR-142-3p、miR-299-5p/3563-5p、
miR-193/193b/193a-3p、hsa-miR-1277-5p、miR
-140/140-5p/876-3p/1244、hsa-miR-30a/d/e-
3p、hsa-let-7i-3p、miR-409-5p/409a、miR-379
/1193-5p/3529、miR-136、miR-154/872、miR-46
84-3p、miR-361-3p、miR-335/335-5p、miR-423a
/423-5p/3184/3573-5p、miR-371/373/371b-5p
、miR-1185/3679-5p、miR-3613-3p、miR-93/93a
/105/106a/291a-3p/294/295/302abcde/372/3
73/428/519a/520be/520acd-3p/1378/1420ac、
miR-876-5p/3167、miR-329/329ab/362-3p、miR
-582-5p、miR-146ac/146b-5p、miR-380/380-3p
、miR-499-3p/499a-3p、miR-551a、miR-142-5p、
hsa-miR-17-3p、miR-199ab-5p、miR-542-3p、mi
R-1277、hsa-miR-29c-5p、miR-3145-3p、hsa-mi
R-106b-3p、hsa-miR-22-5p、miR-744/1716、hsa
-miR-132-5p、miR-488、miR-501-3p/502-3p/50
0/502a、miR-486-5p/3107、miR-450a/451a、hsa
-miR-30c-3p、miR-499-5p、miR-421、miR-197、m
iR-296-5p、miR-326/330/330-5p、miR-214/761
/3619-5p、miR-612/1285/3187-5p、miR-409-3p
、miR-378/422a/378bcdefhi、miR-342-3p、miR-
338-5p、miR-625、miR-200bc/429/548a、hsa-mi
R-376a-5p、miR-584、miR-411、miR-573/3533/3
616-5p/3647-5p、miR-885-5p、hsa-miR-99-3p、
miR-876-3p、miR-654-3p、hsa-miR-340-3p、miR
-3614-5p、hsa-miR-124-5p、miR-491-5p、miR-9
6/507/1271、miR-548a-3p/548ef/2285a、hsa-m
iR-32-3p、miR-3942-5p/4703-5p、miR-34b/449
c/1360/2682、hsa-miR-23a/b-5p、miR-362-5p/
500b、miR-677/4420、miR-577、miR-3613-5p、mi
R-369-5p、miR-150/5127、miR-544/544ab/544-
3p、hsa-miR-29a-5p、miR-873、miR-3614-3p、mi
R-186、miR-483-3p、hsa-miR-374a-3p、miR-196
abc、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-29b-2-5p、hsa-
miR-221-5p、miR-323b-3p、miR-616、miR-330-3
p、hsa-miR-7-3p、miR-187、hsa-miR-26a-3p、mi
R-452/4676-3p、miR-129-5p/129ab-5p、miR-22
3、miR-4755-3p、miR-1247、miR-3129-3p、hsa-m
iR-335-3p、miR-542-5p、hsa-miR-181a-3p、hsa
-miR-186-3p、hsa-miR-27b-5p、miR-491-3p、mi
R-4687-3p、hsa-miR-101-5p、miR-4772-5p、miR
-337-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-16/195-3p
、miR-3677-3p、hsa-miR-766-5p、miR-299/299-
3p/3563-3p、miR-3140-3p、miR-532-5p/511、hs
a-miR-24-5p、miR-4778-5p、miR-642b、miR-483
-5p、miR-767-5p、hsa-miR-31-3p、miR-574-3p、
miR-3173-3p、miR-2127/4728-5p、hsa-miR-103
a-2-5p、miR-3591-3p、hsa-miR-625-3p、hsa-mi
R-15b-3p、miR-522/518e/1422p、miR548d-3p/5
48acbz、hsa-miR-452-3p、miR-192/215、miR-15
51/4524、hsa-miR-425-3p、miR-3126-3p、hsa-m
iR-125b-2-3p、miR-324-3p/1913、hsa-miR-141
-5p、hsa-miR-365a/b-5p、hsa-miR-29b-1-5p、m
iR-563/380-5p、miR-1304、miR-216c/1461/468
4-5p、hsa-miR-2681-5p、miR-194、miR-296-3p、
hsa-miR-205-3p、miR-888、miR-4802-3p、hsa-l
et-7a/g-3p、miR-762/4492/4498、hsa-miR-744
-3p、hsa-miR-148b-5p、miR-514/514b-3p、miR-
28-3p、miR-550a、hsa-miR-125b-1-3p、hsa-miR
-506-5p、hsa-miR-1306-5p、miR-3189-3p、miR-
675-5p/4466、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-454-5
p、miR-509-5p/509-3-5p/4418、hsa-miR-19a/b
-5p、miR-4755-5p、hsa-miR-93-3p、miR-3130-5
p/4482、hsa-miR-488-5p、hsa-miR-378a-5p、mi
R-575/4676-5p、miR-1307、miR-3942-3p、miR-4
677-5p、miR-339-3p、miR-548b-3p、hsa-miR-64
2b-5p、miR-188-5p、hsa-miR-652-5p、miR-2114
、miR-3688-5p、hsa-miR-15a-3p、hsa-miR-181c
-3p、miR-122/122a/1352、miR-556-3p、hsa-miR
-218-2-3p、miR-643、miR-140-3p、miR-1245、hs
a-miR-2115-3p、miR-518bcf/518a-3p/518d-3p
、miR-3200-3p、miR-545/3065/3065-5p、miR-19
03/4778-3p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-183-3
p、miR-3144-5p、miR-582-3p、miR-4662a-3p、mi
R-3140-5p、hsa-miR-106a-3p、hsa-miR-135a-3
p、miR-345/345-5p、miR-125a-3p/1554、miR-31
45-5p、miR-676、miR-3173-5p、hsa-miR-5586-3
p、miR-615-3p、miR-3688-3p、miR-4662a-5p、mi
R-4659ab-5p、hsa-miR-5586-5p、hsa-miR-514a
-5p、miR-10abc/10a-5p、hsa-miR-888-3p、miR-
3127-5p、miR-508-3p、hsa-miR-185-3p、hsa-mi
R-200c-5p、hsa-miR-550a-3p、miR-513c/514b-
5p、miR-490-3p、hsa-miR-5187-3p、miR-3664-3
p、miR-3189-5p、miR-4670-3p、miR-105/105ab、
hsa-miR-135b-3p、hsa-miR-5010-3p、miR-493/
493b、miR-3605-3p、miR-188-3p、hsa-miR-449c
-3p、miR-4761-5p、miR-224、miR-4796-5p、hsa-
miR-551b-5p、miR-556-5p、hsa-miR-122-3p、mi
R-4677-3p、miR-877、miR-576-5p、miR-490-5p、
hsa-miR-589-3p、miR-4786-3p、hsa-miR-374b-
3p、hsa-miR-26b-3p、miR-3158-3p、miR-4423-3
p、miR-518d-5p/519bc-5p520c-5p/523b/526a、
miR-4707-3p、hsa-miR-10a-3p、miR-526b、hsa-
miR-676-5p、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-5004-3
p、miR-193a-5p、hsa-miR-222-5p、miR-4661-3p
、hsa-miR-25-5p、miR-4670-5p、miR-659、miR-1
745/3194-3p、hsa-miR-182-3p、miR-298/2347/
2467-3p、hsa-miR-130b-5p、miR-4746-3p、miR-
1
893/2277-5p、miR-3619-3p、hsa-miR-138-1-3p
、miR-4728-3p、miR-3127-3p、miR-671-3p、hsa-
miR-211-3p、hsa-miR-2114-3p、hsa-miR-877-3
p、miR-3157-5p、miR-502-5p、miR-500a、miR-54
8g、miR-523、hsa-miR-584-3p、miR-205/205ab、
miR-4793-5p、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-214-5
p、miR-3180-5p、miR-1404/2110、miR-3157-3p、
hsa-miR-191-3p、miR-1346/3940-5p/4507、miR
-4746-5p、miR-3939、hsa-miR-181a-2-3p、hsa-
miR-500a-3p、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-675-
3p、hsa-miR-548aj/g/x-5p、miR-4659ab-3p、hs
a-miR-5001-3p、hsa-miR-1247-3p、miR-2890/4
707-5p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-629-3p、miR
-2277-3p、miR-3547/3663-3p、miR-34bc-3p、mi
R-518ef、miR-3187-3p、miR-1306/1306-3p、miR
-3177-3p、miR-1ab/206/613、miR-128/128ab、m
iR-1296、miR-598/598-3p、miR-887、miR-1-5p、
miR-376c/741-5p、miR-374c/655、miR-494、miR
-651、miR-1301/5047、miR-381-5p、miR-216a、m
iR-300/381/539-3p、miR-1249、miR-579、miR-6
56、miR-433、miR-1180、miR-597/1970、miR-190
a-3p、miR-1537、miR-874-5p、miR-410/344de/3
44b-1-3p、miR-370、miR-219-2-3p/219-3p、miR
-3620、miR-504/4725-5p、miR-2964/2964a-5p、
miR-450a-2-3p、miR-511、miR-6505-3p、miR-43
3-5p、miR-6741-3p、miR-370-5p、miR-579-5p、m
iR-376c-5p、miR-376b-5p、miR-552/3097-5p、m
iR-1910、miR-758、miR-6735-3p、miR-376a-2-5
p、miR-585miR-451、およびmiR-137/137abよりなる群から
選ばれて、同じシード配列から5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、
6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの
6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有しながら6~24個の塩基で構成
されることを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
以上で表示される塩基配列を含むことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する(表
3参照)。
制用組成物を提供する。
クロRNAの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
用途を提供する。
)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部
配列が変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical ta
rget gene)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で
隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩
基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、R
NA干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
配列番号529~863)に対して
本発明は、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖
のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロ
RNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑
制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から9番目の塩
基の間の塩基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩
基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有し、当該部位のG:Aワブル(wo
bble)がU:Aの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、RNA干渉
誘導核酸を提供する。
塩基から始まって6個~8個の連続的な塩基配列を含み、
前記塩基配列は、グアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に
少なくとも1つ以上置換されたことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
るマイクロRNAの非正規標的遺伝子のみを選択的に抑制し、マイクロRNAの正規標的
遺伝子は抑制しないことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
-194-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-15b-3p、h
sa-miR-200c-5p、hsa-miR-214-5p、hsa-miR-13
4-5p、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-mi
R-423-3p、hsa-miR-873-3p、hsa-miR-122-5p、h
sa-miR-143-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-409
-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR
-144-5p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-146b-5p/h
sa-miR-146a-5p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-29
6-5p、hsa-miR-767-5p、hsa-miR-34a-5p/hsa-m
iR-34c-5p、hsa-let-7f-5p/hsa-let-7d-5p/hs
a-let-7b-5p/hsa-let-7a-5p/hsa-let-7e-5p/
hsa-miR-202-3p/hsa-let-7i-5p/hsa-miR-98-
5p/hsa-let-7c-5p/hsa-let-7g-5p、hsa-miR-1
271-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-19b-3p/hsa
-miR-19a-3p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-146b-
3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3
24-5p、hsa-miR-629-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-
miR-30d-5p/hsa-miR-30e-5p/hsa-miR-30a-5p
/hsa-miR-30c-5p/hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-2
21-3p/hsa-miR-222-3p、hsa-miR-509-3p、hsa-
miR-769-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-185-5p
、hsa-miR-508-3p/hsa-miR-219a-5p、hsa-miR-
31-5p、hsa-miR-103a-3p/hsa-miR-107、hsa-mi
R-542-3p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-29c-3
p/hsa-miR-29a-3p/hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-
125b-1-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-196a-5p
/hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-3622a-5p、hsa-mi
R-127-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-153-3p、hs
a-miR-15b-5p/hsa-miR-16-5p/hsa-miR-424-5
p、hsa-let-7g-3p/hsa-miR-493-5p/hsa-let-7
c-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-218-5p、hsa-mi
R-1307-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-210-3p、
hsa-miR-187-3p、hsa-miR-192-3p、hsa-miR-19
2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-500a-3p、hsa-m
iR-203a-3p、hsa-miR-30c-2-3p、hsa-miR-488-
3p、hsa-miR-301a-3p/hsa-miR-301b-3p、hsa-m
iR-126-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-324-3p、
hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-124-5p、hsa-miR-3
45-5p、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-889-5p/hsa-
miR-135a-5p/hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-18a-
5p、hsa-miR-708-5p/hsa-miR-28-5p、hsa-miR-
224-5p、hsa-miR-100-3p、hsa-miR-873-5p、hsa
-miR-4662a-5p、hsa-miR-99b-3p/hsa-miR-99a
-3p、hsa-miR-433-5p、hsa-miR-3605-5p、hsa-m
iR-744-5p、hsa-miR-1296-5p、hsa-miR-133a-3
p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-
377-5p、hsa-miR-3180-3p、hsa-miR-758-3p、hs
a-miR-93-3p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-124-3
p、hsa-miR-194-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-148
a-5p、hsa-miR-2277-5p、hsa-miR-17-3p、hsa-m
iR-4772-3p、hsa-miR-329-5p、hsa-miR-182-5p
/hsa-miR-96-5p、hsa-miR-2467-5p/hsa-miR-4
85-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29b-2-5p、hs
a-miR-122-3p、hsa-miR-302a-3p/hsa-miR-520
a-3p/hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-520b/hsa-mi
R-519c-3p/hsa-miR-520c-3p/hsa-miR-519a-3
p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-132-5p、hsa-miR-
541-5p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-518e-3p、hs
a-miR-487a-5p、hsa-miR-589-5p/hsa-miR-146
b-5p/hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-196b-5p/hsa
-miR-196a-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-378a
-3p、hsa-miR-27b-5p、hsa-miR-6720-3p、hsa-m
iR-574-3p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-30c-2-3
p/hsa-miR-30c-1-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-m
iR-574-5p、hsa-miR-4677-3p、hsa-miR-654-3p
、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-19a-3p/hsa-miR-1
9b-3p、hsa-let-7c-5p/hsa-miR-98-5p/hsa-le
t-7g-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-miR-202-3p/hsa
-let-7b-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7a-5p/h
sa-let-7d-5p/hsa-let-7i-5p、hsa-miR-3663-
3p、hsa-miR-152-3p/hsa-miR-148b-3p/hsa-mi
R-148a-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-502-3p
/hsa-miR-501-3p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-1
40-5p、hsa-miR-96-5p/hsa-miR-182-5p、hsa-m
iR-193b-3p、hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-486-5
p、hsa--493-3p、hsa-miR-548am-5p、hsa-miR-2
0b-5p/hsa-miR-20a-5p/hsa-miR-93-5p/hsa-m
iR-17-5p/hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-541-3p、
hsa-miR-452-5p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-51
8f-3p、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-107/hsa-miR
-103a-3p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-409-3p、h
sa-let-7d-5p/hsa-let-7g-5p/hsa-let-7i-5p
/hsa-let-7f-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7a-
5p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7c-5p、hsa-miR-1
30b-3p/hsa-miR-301a-3p/hsa-miR-130a-3p/h
sa-miR-301b-3p、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-19
1-5p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-92a-3p/hsa
-miR-92b-3p/hsa-miR-363-3p/hsa-miR-25-3p
/hsa-miR-32-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-13
07-3p、hsa-miR-499a-5p/hsa-miR-208a-3p、hs
a-miR-186-5p、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-450
a-5p、hsa-miR-101-3p/hsa-miR-144-3p、hsa-m
iR-320a、hsa-miR-199b-5p/hsa-miR-199a-5p、
hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-2
6a-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa
-miR-526b-5p、hsa-miR-16-5p/hsa-miR-15b-5
p/hsa-miR-424-5p/hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-
9-3p、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-1298-3p、hsa-
miR-148a-3p、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-9-5p
、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-508-3p、hsa-miR-13
7、hsa-miR-5010-5p、hsa-miR-523-5p、hsa-miR
-128-3p、hsa-miR-199a-5p/hsa-miR-199b-5p、
hsa-miR-181a-2-3p、hsa-miR-27a-3p/hsa-miR
-27b-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-129-5p、hsa
-miR-424-3p、hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-10a-
5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-
miR-483-5p、hsa-miR-1537-3p、hsa-miR-106b-
5p/hsa-miR-20a-5p/hsa-miR-17-5p/hsa-miR-
93-5p、hsa-miR-30a-3p/hsa-miR-30e-3p、hsa-
miR-374a-3p、hsa-miR-675-5p、hsa-miR-503-5
p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-208a-3p、hsa-miR
-200b-3p/hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-518f-5p
/hsa-miR-523-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-1
94-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-miR-514a-5p、hsa-
miR-381-3p、hsa-miR-513c-5p/hsa-miR-514b-
5p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-125b-5p/hsa-m
iR-125a-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-874-3p
、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-3
61-3p、hsa-miR-513b-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa
-let-7a-5p/hsa-let-7c-5p/hsa-let-7b-5p/h
sa-let-7d-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-let-7e-5p
/hsa-let-7i-5p/hsa-let-7g-5p、hsa-miR-136
-3p、hsa-miR-508-5p、hsa-miR-204-5p/hsa-mi
R-211-5p、hsa-miR-146a-5p/hsa-miR-146b-5p
、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-87
7-5p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-139-5p、hsa-
miR-99a-5p/hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99b-5p
、
hsa-miR-216a-5p、およびhsa-miR-3157-3pよりなる群か
ら選ばれて、好ましくは、5’末端基準2番目から7番目の配列または2番目から9番目
の配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)に少なくとも
1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のG:Aワブル配列がU
:Aの正規的な塩基配列になるようにしつつ、6~24個の塩基で構成されることを特徴
とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
目までまたは2番目の塩基から始まって9番目までの6個~8個の連続的な塩基配列が配
列番号529~863(表4参照)のうちいずれか1つ以上で表示されることを特徴とす
る、RNA干渉誘導核酸を提供する。
現抑制用組成物を提供する。
クロRNAの非正規標的遺伝子発現抑制方法を提供する。
用途を提供する。
)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部
配列が変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical ta
rget gene)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目の塩基から始まって6個~8個の連続的な塩
基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に少なく
とも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階
を含むことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
d region)と正確に相補関係でなくてもマイクロRNAの標的と認識し、伝令R
NAに結合する場合があるところ、これを非正規標的認識(non-canonical
target recognition)という。本発明者らは、このようなマイクロ
RNAの非正規標的認識に着目して、マイクロRNAの一部配列を変形させてマイクロR
NAの非正規標的遺伝子を選択的に抑制するRNA干渉誘導核酸を開発し、その効能を明
らかにすることによって、本発明を完成した。
のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロ
RNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene)の発
現のみを抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴として、または
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩
基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Gu
anine)塩基がウラシル(Uracil)にまたはアデニン(Adenine)に少
なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のG:Aまたは
G:Uワブル配列がU:AまたはA:Uの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴
とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖であって、好ましくは、マイクロRN
A、短ヘアピンRNA(small hairpin RNA、shRNA)および低分
子干渉RNA(small interfering RNA、siRNA)、DsiR
NA、lsiRNA、ss-siRNA、asiRNA、piRNA、またはendo-
siRNAなどが含まれる。
-canonical target recognition)を基とする。
識する。マイクロRNAが認識する非正規標的遺伝子は、マイクロRNAと正確に一致す
る相補関係を有しない。
NA干渉誘導核酸の一様態は、次の通りである。
の5’末端から5番目までの塩基と全部連続的に相補関係を有する。しかしながら、マイ
クロRNAの5’末端から6番目の塩基が認識する(マイクロRNAの5’末端から6番
目の塩基と配列される)遺伝子は、前記マイクロRNAの5’末端から5番目の塩基と相
補関係を有する塩基とすぐに連続する塩基でなく、すぐに連続する塩基は、隆起形に押し
出し、その次にマイクロRNAと相補関係を有する塩基がマイクロRNAの5’末端から
6番目の塩基が認識する塩基となる。
酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目までの4個の塩基配列を含む
。また、前記4個の塩基配列に連続する2個の塩基は、互いに同一であり、前記2個の塩
基配列は、特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有
し、前記特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブ
ル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれる。
核酸は、前記マイクロRNAの塩基配列と比較したところ、少なくとも特定マイクロRN
Aの5’末端から2番目から5番目までの4個の塩基配列を共通で含む。
一であり得、これら2つの塩基配列は、特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる
塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩
基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれ
る。例えば、特定マイクロRNAの6番目の塩基:前記6番目の塩基と配列できる塩基:
前記6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基は、(A:U,G:A,C)、(G:
A,U,C:U,A,G)、(U:G,A:C,U)または(C:G:C)であり得る。
例えば、特定マイクロRNAの6番目の塩基がAであるとき、RNA干渉誘導核酸の5’
末端から6番目の塩基配列と7番目の塩基配列は、AA,CAであり得;特定マイクロR
NAの6番目の塩基がGであるとき、RNA干渉誘導核酸の5’末端から6番目の塩基配
列と7番目の塩基配列は、UG、AGまたはGGであり得;特定マイクロRNAの6番目
の塩基がUであるとき、RNA干渉誘導核酸の5’末端から6番目の塩基配列と7番目の
塩基配列は、CU、UUであり得;または特定マイクロRNAの6番目の塩基がCである
とき、RNA干渉誘導核酸の5’末端から6番目の塩基配列と7番目の塩基配列は、CC
であり得る。
Aの5’末端から6番目の塩基配列は、同一であり得、好ましくは、RNA干渉誘導核酸
の5’末端から7番目の塩基配列と特定マイクロRNAの5’末端から6番目の塩基配列
は、同一であり得る。
の塩基配列を5’末端から8番目の塩基配列で含むことができる。
標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸の一様態は、次の通りである。
識する標的遺伝子の塩基がA:U,G:C,C:G,U:Aの相補関係の配列と共にG:
Aのワブル関係の配列またはG:Uのワブル関係の配列を含む。
き、特定マイクロRNAの塩基:前記特定マイクロRNAが認識する標的遺伝子の塩基:
前記特定マイクロRNAが認識する標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸の塩基の配
列は、G:A:Uである。また、マイクロRNAとマイクロRNAが認識する標的遺伝子
がG:Uのワブル関係にあるとき、特定マイクロRNAの塩基:前記特定マイクロRNA
が認識する標的遺伝子の塩基:前記特定マイクロRNAが認識する標的遺伝子を抑制する
RNA干渉誘導核酸の塩基の配列は、G:U:Aである。
の間の塩基配列のうち1つ以上のグアニン(G)塩基がウラシル(U)に置換された変形
塩基配列を有する。または本発明によるRNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5
’末端から9番目の塩基の間の塩基配列、好ましくは、5’末端基準2番目から7番目の
配列のうち1つ以上のグアニン(G)塩基がアデニン(A)に置換された変形塩基配列を
有する。特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン
(G)塩基が1つ以上含まれた場合、含まれたグアニン塩基が全部ウラシル(U)または
アデニン(A)に置換されることもでき、少なくとも1つ以上のグアニン塩基がウラシル
(U)またはアデニン(A)に置換される。特定マイクロRNAの5’末端から9番目の
塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグ
アニン(G)塩基が1つ以上含まれた場合、ウラシルまたはアデニン塩基に置換される塩
基の他に、残りの塩基は、特定マイクロRNAの塩基と同一であり得る。
制し、マイクロRNAの正規標的遺伝子は抑制しない。
的遺伝子に対する伝令RNAの発現調節機能は、非正規標的遺伝子に対して特異的であり
、正規標的遺伝子に対しては抑制効果を示さなかった。
を選択的に抑制することができ、したがって、RNA干渉誘導核酸発現の抑制を通じて期
待される効果のみを選択的に誘導することができる。
22、miR-1、miR-133、let-7、miR-302a、miR-372よ
りなる群から選ばれた1つ以上であり得る。
miR-1、miR-133、let-7、miR-302aおよびmiR-372の塩
基配列は、マイクロRNAの配列データベースであるmiRBase(http://w
ww.mirbase.org/)でMIMAT0000422、MIMAT00006
46、MIMAT0000421、MIMAT0000416,MIMAT000042
7、MIMAT0000062、MIMAT0000684、およびMIMAT0000
724に記載されている通りである。
乳動物を含む動物のマイクロRNAを含む。
導核酸であって、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列
を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり得、6番目と7番目の塩基は、特定マイク
ロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロ
RNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配
列を含むすべての相補的塩基が含まれることを特徴とするRNA干渉誘導核酸の長さは、
6個以上の塩基配列を含み、これに制限されないが、通常、21個程度であって、24個
以下の塩基配列を有することができる。
、miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-
124の5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基
は、同一であり得、6番目と7番目の塩基は、miR-124の6番目の塩基と配列でき
る塩基と相補的な塩基配列を有し、前記miR-124の6番目の塩基と配列できる塩基
には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれる
RNA干渉誘導核酸である。
A GGC C-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-124BS)であ
り得る。より好ましくは、前記RNA干渉誘導核酸は、5’-UAA GGC CAC
GCG GUG AAU GCC-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-
124BS)であり得る。
、miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-
122の5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基
は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、miR-122の6番目の塩基と配列できる
塩基と相補的な塩基配列を有し、前記miR-122の6番目の塩基と配列できる塩基に
は、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるR
NA干渉誘導核酸である。
G AGU U-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-122BS)であ
り得る。より好ましくは、前記RNA干渉誘導核酸は、5’-UGG AGU UGU
GAC AAU GGU GUU-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-
122BS)であり得る。
、miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-
155の5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基
は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、miR-155の6番目の塩基と配列できる
塩基と相補的な塩基配列を有し、前記miR-155の6番目の塩基と配列できる塩基に
は、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるR
NA干渉誘導核酸である。
A AUG G-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-155BS)であ
り得る。より好ましくは、前記RNA干渉誘導核酸は、5’-UUA AUG GC U
AA U CGU GAU AGG-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR
-155BS)であり得る。
iR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-1の5’
末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であ
り、6番目と7番目の塩基は、miR-1の6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩
基配列を有し、前記miR-1の6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワ
ブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるRNA干渉誘導核酸であ
る。
G AAU U-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-1BS)であり得
る。より好ましくは、前記RNA干渉誘導核酸は、5’-UGG AAU UGU AA
A GAA GUA UGU-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-1B
S)であり得る。
導核酸であって、特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうち
、好ましくは、5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(G)塩基がウラシ
ル(U)またはアデニン(A)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するこ
とを特徴とするRNA干渉誘導核酸の長さは、6個以上の塩基配列を有し、これに制限さ
れないが、通常、21個の程度であって、24個以下の塩基配列を有することができる。
、miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-
124の5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2
番目から7番目の配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)またはアデニン(A)
塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するRNA干渉誘導核酸である。
-UAA UGC AC-3’(miR-124-G4U)、5’-UAA GUC A
C-3’(miR-124-G5U)または5’-UAA UUC AC-3’(miR
-124-G4,5U)を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記R
NA干渉誘導核酸は、5’-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA
A-3’(miR-124-G4U)、5’-UAA GUC ACG CGG UG
A AUG CCA A-3’(miR-124-G5U)または5’-UAA UUC
ACG CGG UGA AUG CCA A-3’(miR-124-G4,5U)
の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。
iR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-1の5’
末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)または
アデニン(A)塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するRNA干渉誘
導核酸である。
-UUG AAU GUA-3’(miR-1-G2U)、5’-UGU AAU GU
A-3’(miR-1-G3U)、5’-UGG AAU UUA-3’(miR-1-
G7U)、5’-UUU AAU GUA-3’(miR-1-G2,3U)、5’-U
GU AAU UUA-3’(miR-1-G3,7U)、5’-UUG AAU UU
A-3’(miR-1-G2,7U)または5’-UUU AAU UUA-3’(mi
R-1-G2,3,7U)を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記
RNA干渉誘導核酸は、5’-UUG AAU GUA AAG AAG UAU GU
A U-3’(miR-1-G2U)、5’-UGU AAU GUA AAG AAG
UAU GUA U-3’(miR-1-G3U)、5’-UGG AAU UUA
AAG AAG UAU GUA U-3’(miR-1-G7U)、5’-UUU A
AU GUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR-1-G2,3U)
、5’-UGU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR
-1-G3,7U)、5’-UUG AAU UUA AAG AAG UAU GUA
U-3’(miR-1-G2,7U)または5’-UUU AAU UUA AAG
AAG UAU GUA U-3’(miR-1-G2,3,7U)の塩基配列を示すR
NA干渉誘導核酸であり得る。
、miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-
122の5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2
番目から7番目の配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)またはアデニン(A)
塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するRNA干渉誘導核酸である。
-UUG AGU GUG-3’(miR-122-G2U)、5’-UGU AGU
GUG-3’(miR-122-G3U)、5’-UGG AUU GUG-3’(mi
R-122-G5U)、5’-UGG AGU UUG-3’(miR-122-G7U
)、5’-UGG AGU GUU-3’(miR-122-G9U)、5’-UUU
AGU GUG-3’(miR-122-G2,3U)、5’-UUG AUU GUG
-3’(miR-122-G2,5U)、5’-UUG AGU UUG-3’(miR
-122-G2,7U)、5’-UUG AGU GUU-3’(miR-122-G2
,9U)、5’-UGU AUU GUG(miR-122-G3,5U)、5’-UG
U AGU UUG-3’(miR-122-G3,7U)、5’-UGU AGU G
UU-3’(miR-122-G3,9U)、5’-UGG AUU UUG-3’(m
iR-122-G5,7U)、5’-UGG AUU GUU-3’(miR-122-
G5,9U)、または5’-UGG AGU UUU-3(miR-122-G7,9U
)を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記RNA干渉誘導核酸は、
5’-UUG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-
122-G2U)、5’-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU
G-3(miR-122-G3U)、5’-UGG AUU GUG ACA AUG
GUG UUU G-3’(miR-122-G5U)、5’-UGG AGU UUG
ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G7U)、5’-UG
G AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G
9U)、5’-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3’(
miR-122-G2,3U)、5’-UUG AUU GUG ACA AUG GU
G UUU G-3’(miR-122-G2,5U)、5’-UUG AGU UUG
ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G2,7U)、5’-
UUG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122
-G2,9U)、5’-UGU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G
-3(miR-122-G3,5U)、5’-UGU AGU UUG ACA AUG
GUG UUU G-3(miR-122-G3,7U)、5’-UGU AGU G
UU ACA AUG GUG UUU G-3(miR-122-G3,9U)、5’
-UGG AUU UUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-12
2-G5,7U)、5’-UGG AUU GUU ACA AUG GUG UUU
G-3’(miR-122-G5,9U)または5’-UGG AGU UUU ACA
AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G7,9U)の塩基配列を示す
RNA干渉誘導核酸であり得る。
、miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-
133の5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2
番目から7番目の配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)またはアデニン(A)
塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するRNA干渉誘導核酸である。
-UUU UGU CCC-3’(miR-133-G4U)、5’-UUU GUU
CCC-3’(miR-133-G5U)または5’-UUU UUU CCC-3’(
miR-124-G4,5U)を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。より好ましくは、
前記RNA干渉誘導核酸は、5’-UUU UGU CCC CUU CAA CCA
GCU G-3’(miR-133-G4U)、5’-UUU GUU CCC CUU
CAA CCA GCU G-3’(miR-133-G5U)または5’-UUU
UUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3’(miR-133-G4,
5U)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。
et-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、let-7の5’
末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2番目から7番
目の配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)またはアデニン(A)塩基に少なく
とも1つ以上置換された変形塩基配列を有するRNA干渉誘導核酸である。
-UUA GGU AGU-3’(let-7-G2U)、5’-UGA UGU AG
U-3’(let-7-G4U)、5’-UGA GUU AGU-3’(let-7-
G5U)、5’-UGA GGU AUU-3’(let-7-G8U)、5’-UUA
UGU AGU-3’(let-7-G2,4U)、5’-UUA GUU AGU-
3’(let-7-G2,5U)、5’-UUA GGU AUU-3’(let-7-
G2,8U)、5’-UGA UUU AGU-3’(let-7-G4,5U)、5’
-UGA UGU AUU-3’(let-7-G4,8U)、または5’-UGA G
UU AUU-3’(let-7-G5,8U)を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。
より好ましくは、前記RNA干渉誘導核酸は、5’-UUA GGU AGU AGG
UUG UAU AGU U-3’(let-7-G2U)、5’-UGA UGU A
GU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G4U)、5’-UG
A GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G5U
)、5’-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3’(le
t-7-G8U)、5’-UUA UGU AGU AGG UUG UAU AGU
U-3’(let-7-G2,4U)、5’-UUA GUU AGU AGG UUG
UAU AGU U-3’(let-7-G2,5U)、5’-UUA GGU AU
U AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G2,8U)、5’-U
GA UUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G4
,5U)、5’-UGA UGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3’
(let-7-G4,8U)または5’-UGA GUU AUU AGG UUG U
AU AGU U-3’(let-7-G5,8U)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核
酸であり得る。
き、miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、mi
R-302aの5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、5’末端
基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)またはアデニン
(A)塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するRNA干渉誘導核酸で
ある。
-UAA UUG CUU-3’(miR-302a-G4U)、5’-UAA GUU
CUU-3’(miR-302a-G6U)、または5’-UAA UUU CUU-
3’(miR-302a-G4,6U)を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。より好ま
しくは、前記RNA干渉誘導核酸は、5’-UAA UUG CUU CCA UGU
UUU GGU GA-3’(miR-302a-G4U)、5’-UAA GUU C
UU CCA UGU UUU GGU GA-3’(miR-302a-G6U)、ま
たは5’-UAA UUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3’(m
iR-302a-G4,6U)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸であり得る。
、miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、miR-
372の5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうち、好ましくは、5’末端基準2
番目から7番目の配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)またはアデニン(A)
塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するRNA干渉誘導核酸である。
-AAA UUG CUG-3’(miR-372-G4U)、5’-AAA GUU
CUG-3’(miR-372-G6U)、5’-AAA GUG CUU-3’(mi
R-372-G9U)、5’-AAA UUU CUG-3’(miR-372-G4,
6U)、5’-AAA UUG CUU-3’(miR-372-G4,9U)、または
5’-AAA GUU CUU-3’(miR-372-G6,9U)を示すRNA干渉
誘導核酸であり得る。より好ましくは、前記RNA干渉誘導核酸は、miR-372の非
正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-AAA UUG CUG
CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372-G4U)、5’-A
AA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372
-G6U)、5’-AAA GUG CUU CGA CAU UUG AGC GU-
3’(miR-372-G9U)、5’-AAA UUU CUG CGA CAU U
UG AGC GU-3’(miR-372-G4,6U)、5’-AAA UUG C
UU CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372-G4,9U)、
または5’-AAA GUU CUU CGA CAU UUG AGC GU-3’(
miR-372-G6,9U)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸の塩基配列を示すR
NA干渉誘導核酸であり得る。
二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマ
イクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene
)を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、
前記特定マイクロRNAは、5’末端から6番目ヌクレオチドのリボース環の2’位に
メチル基(2’OMe)が添加されたことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する
。
番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の
塩基は、特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し
、前記特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基にG:A、G:Uワブル(w
obble)配列を含むすべての相補的塩基を含み、前記マイクロRNAの5’末端から
6番目ヌクレオチドのリボース環の2’位にメチル基(2’OMe)が添加されている場
合であれば、これを除いた残りの塩基配列には制限がなく、どんな塩基配列でも全部含ま
れ得、この際、前記RNA干渉誘導核酸は、6個~24個の塩基配列を含むことができ、
好ましくは、6個~15個、さらに好ましくは、6個~8個の塩基配列を含むことができ
るが、前記核酸の長さに特別な制限はない。
チドのリボース環の2’位にメチル基(2’OMe)が添加されて化学的に変形が起こっ
た塩基配列を含み、前記2’OMe変形が起こったRNA干渉誘導核酸は、これの正規シ
ード標的遺伝子の発現のみを選択的に抑制し、非正規シード標的遺伝子の発現は抑制しな
いことがある。これにより、前記2’OMe変形が起こったRNA干渉誘導核酸は、特定
マイクロRNAの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制するための本発明の目的は維持
しつつ、新しく発生しうる非正規核隆起サイトは完全に除去することができる。
るマイクロRNAの種類には制限がなく、マイクロRNAの5’末端から6番目のヌクレ
オチドのリボース環の2’位であれば、どんなマイクロRNAにも2’OMeが添加され
得るが、本発明の具体的な実施例によれば、前記2’OMeが添加され得るマイクロRN
Aは、miR-124またはmiR-1であり得る。
二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマ
イクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene
)を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とする、RNA干渉
誘導核酸を提供する。
番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の
塩基は、特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し
、前記特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基にG:A、G:Uワブル(w
obble)配列を含むすべての相補的塩基を含んでいる場合であれば、これを除いた残
りの塩基配列には制限がなく、どんな塩基配列でも全部含まれ得、この際、前記RNA干
渉誘導核酸は、6個~24個の塩基配列を含むことができ、好ましくは、6個~15個、
さらに好ましくは、6個~8個の塩基配列を含むことができるが、前記核酸の長さに特別
な制限はない。
ら5番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番
目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を
有し、前記特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワ
ブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロR
NAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標
的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることによって、非
正規核隆起標的サイトのみを選択的に抑制し、マイクロRNAの正規標的遺伝子は抑制し
ない。
で表示される塩基配列を含むことができる(表3参照)。
二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマ
イクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gene
)の発現のみを抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から9番目の塩
基の間の塩基配列、または5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Gua
nine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩
基配列を有し、当該部位のG:Aワブル(wobble)がU:Aの正規的な塩基配列に
なるようにすることを特徴とする、RNA干渉誘導核酸を提供する。
から9番目の塩基の間の配列、または5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニ
ン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に少なくとも1つ以上置換さ
れたものであり得、前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番
目の塩基から9番目の塩基の間のグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Urac
il)塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を含む場合であれば、これを除
いた残りの塩基配列には制限がなく、どんな塩基配列でも全部含まれ得る。この際、前記
特定マイクロRNAの5’末端から2番目の塩基から9番目の塩基の間の塩基配列、また
は5’末端基準2番目から7番目の配列のうちウラシル(U)塩基に置換される塩基の他
に、残りの塩基は、特定マイクロRNAの塩基と同じであってもよい。
導核酸であって、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から9番目の塩基の間の塩基
配列、または5’末端基準2番目から7番目の配列のうちグアニン(Guanine)塩
基がウラシル(Uracil)塩基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有す
ることを特徴とするRNA干渉誘導核酸は、6個~24個の塩基配列を含むことができ、
好ましくは、6個~15個、さらに好ましくは、6個~8個の塩基配列を含むことができ
るが、前記特定マイクロRNAの5’末端から2番目の塩基から始まって6個~8個の連
続的な塩基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基
に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸であれば、核酸
の長さに特別な制限はない。この際、前記RNA干渉誘導核酸において、特定マイクロR
NAの5’末端から2番目の塩基から始まって6個~8個の連続的な塩基配列のうちグア
ニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に少なくとも1つ以上置換
された変形塩基配列を含む場合であれば、これを除いた残りの塩基配列の種類には制限が
なく、どんな塩基配列でも全部含まれ得る。
個の連続的な塩基配列のうちグアニン(G)塩基がウラシル(U)塩基に少なくとも1つ
以上置換された変形塩基配列を有して当該部位のG:Aワブル配列がU:Aの正規的な塩
基配列になるようにすることによって、G:Aワブル(wobble)配列で結合するマ
イクロRNAの非正規標的遺伝子のみを選択的に抑制し、マイクロRNAの正規標的遺伝
子は抑制しない。
示される塩基配列を含むことができる(表4参照)。
伝子を特異的に抑制することができる。
発現抑制用組成物またはRNA干渉誘導核酸を含むマイクロRNAの非正規標的遺伝子発
現抑制用キットを提供する。
標的遺伝子を特異的に抑制することによって、マイクロRNAの非正規標的遺伝子の発現
抑制によって起こる作用を選択的に調節することができる。
標的遺伝子を特異的に抑制するので、本発明による上述したRNA干渉誘導核酸を用いる
と、マイクロRNAの非正規標的遺伝子発現による作用(例えば、細胞周期、分化、逆分
化、形態、移動、分裂、増殖、または死滅)を特異的に調節することができる。
動、分裂、増殖、または死滅調節用組成物またはキットを提供する。
な過程であって、細胞がM期(細胞分裂期)、G1期(第1分裂準備期)、S期(DNA
合成期)、G2期(第2分裂準備期)の4期(phase)を繰り返すことを意味する。
G1期は、細胞分裂直後からDNA合成開始までのDNA合成準備期であり、G2期は、
DNA合成の終了から細胞分裂開始までの細胞分裂準備期である。
するように誘導したり、前記変動を促進または停止(arrest)させることを含み、
例えば、G2/M期の細胞をG1/G2期に変動するように誘導することが細胞周期調節
の例として含まれ得る。
態的、機能的に特殊性を獲得する過程であって、細胞は、分化を通じて大きさや形態、膜
電位、代謝活性、そして信号に対する反応が変化する。
たり、分化が始まるように誘導したり、分化が始まらないように抑制することを含み、例
えば、神経細胞が分化するように誘導して形態的特殊性(例えば、神経突起分化)を獲得
するように誘導することが、細胞分化調節の例として含まれ得る。または、例えば、筋細
胞が分化するように誘導して形態的特殊性(例えば、筋細胞の筋線維化)を有するように
誘導することが、細胞分化調節の例として含まれ得る。
胞を分化になる前の未分化時期の全分化能を獲得してさらに中期細胞のように変わる現象
をいう。
、逆分化進行を抑制、遅延することを含み、逆分化調節結果は、例えば細胞成長形態(例
えば、群集形成など)、逆分化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)
の活性などを確認することによって判断することができる。
の特徴を意味し、細胞形態は、生物の種類によって、また、同じ生物であっても組織や器
官の種類によって多種多様である。
型上の特徴の変化を誘導することであり、細胞の自然的形態変化を促進、遅延、誘導また
は抑制することと、細胞の形態を非自然的に変化させることを促進乃至誘導することを含
む。例えば、心筋細胞の心筋肥大現象を誘導することが一例として含まれ得る。
動のために重要な過程であり、細胞は、主に与えられた刺激に速い反応を示し、通常、非
集団的な形状で移動するのに対し、他の細胞類型は、特定の成長期間や特殊な状況だけで
移動することができる。細胞移動は、神経管と脈管のシードや上皮組織の創傷治癒過程で
主に起こり、細胞集団移動は、多種の腫瘍転移に寄与する。
(阻害)することを意味する。
、細胞数を増やす過程を意味する。
誘導することを含む。細胞周期のうちM期(細胞分裂期)に細胞の期(phase)を誘
導する場合、細胞分裂、増殖を誘導できることになる。例えば、G0/G1期に分布する
細胞の数を減少させ、G2/M期に分布する細胞の数を増加させると、細胞分裂、増殖調
節の例として含まれ得る。
しつつ、遺伝的性質によって死に至る段階を意味し、早い細胞死滅と遅い細胞死滅が全部
含まれる。細胞死滅によれば、細胞全体が萎縮して新しいタンパク質が合成され、細胞の
自殺遺伝子により死に誘導される。
とを含む。
導核酸(好ましくは、miR-124BS)を含む癌細胞死滅誘導用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-124BS)を含む神経突起分岐分化誘導用組成物;
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-122BS)を含む肝癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、miR-
1BS)を含む筋細胞分化促進または筋線維化促進用組成物;
miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-155BS)を含む筋細胞死滅誘導用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-124-G5U)を含む神経芽細胞腫の細胞死滅促進用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-124-G4U)を含む神経芽細胞腫の細胞分裂増殖促進用組成物;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、miR-
1-G2U、miR-1-G3U、miR-1-G7U)を含む心筋肥大誘導用組成物;
miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-133-G4U)を含む心筋肥大誘導用組成物;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、let-
7-G2U、let-7-G2,4U)を含む癌細胞の細胞周期停止誘導用組成物;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、let-
7-G4U)を含む肝細胞の細胞周期進行活性誘導用組成物;
miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、m
iR-302a-G4U)を含む逆分化促進用組成物;
miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-372-G4U)を含む逆分化促進用組成物;または
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸(好ましくは、mi
R-122-G2U、またはmiR-122-G2,3U)を含む肝癌細胞の細胞移動阻
害用組成物。
子を特異的に抑制することによって、マイクロRNAの非正規標的遺伝子の作用を選択的
に調節できるところ、多様な分野(例えば、薬学、化粧品学、細胞学など)において活用
され得る。
裂、増殖または死滅調節用試験物質をスクリーニングする方法に活用され得る。
対象細胞に試験物質を処理する段階;および
対象細胞でRNA干渉誘導核酸が抑制するマイクロRNAの非正規標的遺伝子の発現量
乃至発現有無を確認する段階を含む、
細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用試験物質をスクリ
ーニングする方法を提供する。
されずに含まれ、対象細胞を抽出する組織乃至種類などは制限されず、例えば神経細胞、
心筋細胞、癌細胞、筋細胞などが含まれ得る。
た多様な方法により適宜行われ得、例えば、導入は、リン酸カルシウムを用いた形質感染
(Graham、FLなど,Virology,52:456(1973))、DEAE
デキストランによる形質感染、微細注射による形質感染(Capecchi,MR,Ce
ll,22:479(1980))、陽イオン性脂質による形質感染(Wong,TKな
ど,Gene,10:87(1980))、電気穿孔法(Neumann Eなど、EM
BO J,1:841(1982))、形質導入またはトランスフェクションのように文
献(Basic methods in molecular biology,Dav
isなど,1986およびMolecular cloning:A laborato
ry manual,Davisなど,1986)に記載されたように、本発明の属する
技術分野における通常の知識を有する者によく公知されている方法により行われる。好ま
しくは、トランスフェクションによることができる。トランスフェクション効率は、細胞
の種類だけでなく、細胞培養条件、トランスフェクション試薬などによって大きな差が生
じることができる
胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅に影響を及ぼすかを検査する
ためにスクリーニングに用いられる未知の物質を意味し、化合物、抽出物、タンパク質ま
たは核酸などが含まれ、これらに制限されない。
に公知となった多様な発現分析方法により確認することができ、例えばRT-PCR、E
LISA(参照:Sambrook,J et al,Molecular Cloni
ng A Laboratory Manual,3rd ed Cold Sprin
g Harbor Press(2001)),western blot,FACS
analysisなどが使用され得、これに制限されない。
し、その結果、マイクロRNAの非正規標的遺伝子の発現量乃至発現において試験物質な
しにRNA干渉誘導核酸のみを処理した場合と比較して差異があれば、試験物質は、マイ
クロRNAの非正規標的遺伝子の発現に影響を及ぼすものと判断することができる。ひい
ては、前記試験物質は、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調
節機能を有するものと判断することができる。
を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配
列が変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical tar
get gene)を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法を提供する:
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン(Gu
anine)塩基がウラシルまたはアデニンに少なくとも1つ以上置換された変形塩基配
列を有するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階。
)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部
配列が変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical ta
rget gene)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で
隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩
基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階;および
前記特定マイクロRNAの5’末端から6番目ヌクレオチドのリボース環の2’位にメ
チル基(2’OMe)を添加する段階を含むことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸の製
造方法を提供する。
)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部
配列が変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical ta
rget gene)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で
隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩
基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、R
NA干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部
配列が変形されてマイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical ta
rget gene)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目の塩基から始まって6個~8個の連続的な塩
基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に少なく
とも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階
を含むことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸の製造方法を提供する。
省略する。
されない。
の2’位にメチル基(2’OME)を入れて変形した干渉誘導核酸を提供する。
抑制しようとする本発明の目的は維持しつつ、新しく現れることができる非正規核隆起結
合は完全に除去する効果がある。
制することによって示す生物学的な機能を効率的に増大したり、従来のマイクロRNAが
示す機能のうち一部、すなわち非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的機
能のみを選択的に示す効果を有することができる。また、このような干渉誘導核酸を通じ
て細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節が可能であるところ
、薬物、化粧品など多様な分野において活用が可能なものと期待される。
本発明の一例に過ぎず、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
本発明者らは、Ago HITS CLIP実験を通じて、アルゴノートタンパク質で
マイクロRNAが標的体と塩基配列をするとき、マイクロRNAシードと完全相補的配列
をする正規シードターゲットの他にも、マイクロRNAシードと完全相補的配列をせずに
標的伝令RNAと結合するという事実をアルゴノートタンパク質に結合したRNA複合体
配列結果(Ago HITS-CLIP)の分析を通じて確認した。しかも、このような
特徴を有するRNAの塩基配列を分析してみた結果、マイクロRNAの6番塩基が標的体
に核隆起(nucleation bulge)を誘導して塩基配列する標的体(マイク
ロRNA非正規核隆起ターゲットサイト)と、マイクロRNAシード領域でGA配列(w
obble)を許容する標的体(マイクロRNA非正規GA配列シードターゲットサイト
)が自然的に存在することを確認した(図1)。
媒介としてシード塩基配列(5’-UAAGGCAC-3’)を通じて標的体の塩基配列
5’-GUGCCUUA-3’に対して最小6個の連続した相補的塩基配列をすることに
なり、このような塩基配列を有する標的体は、マイクロRNAの正規シードターゲットサ
イト(canonical seed site)であると報告されたことがある(Na
ture,2009,460(7254):479-86)。
5’-UAAGGCAC-3’)とマイクロRNA非正規核隆起ターゲットサイト(5’
-GUGGCCUU-3’)でmiR-124の5’末端基準5番目と6番目の間に標的
伝令RNAのGがバルジ(bulge)で配列されるように相補的塩基配列をした標的を
確認し、これを基にマイクロRNA非正規核隆起ターゲットサイトと相補的に塩基配列が
可能なmiR-124のシード塩基配列は、miR-124シードの6番と7番の間に6
番塩基がもう一度繰り返される塩基配列(5-UAAGGCCA-3)を有し、これに対
して連続的で且つ完ぺきな相補配列は、miR-124の非正規核隆起ターゲットを抑制
するmiR-124BS(BS:Bulge site)siRNAとして使用した。
列を分析したとき、従来の相補的な塩基配列以外にG:Aワブル(wobble)塩基配
列がマイクロRNAのシード配列と標的伝令RNAの結合で起こることを確認した。した
がって、miR-124の場合、シード塩基配列(5’-UAAGGCAC-3’)で5
’末端基準4番目のG塩基がG:Aワブル配列をしてマイクロRNA非正規GA配列シー
ドターゲットサイト(5’-UGGCAUU-3’)を認識し、これを基にmiR-12
4の非正規GA配列シードターゲットサイトと連続的で且つ完ぺきに相補的な配列でsi
RNAをデザインしてmiR-124-GUを発明し、このsiRNAは、miR-12
4の非正規GA配列シードターゲットの発現を阻害するsiRNAとして使用した。
をシード領域に含むマイクロRNA-BSの抑制能確認
自然的に存在するmiR-124の正規的なシードターゲットサイト(seed ta
rget site)のうちmiR-124の5’末端基準2番目から7番目までの塩基
と相補的なものは、5’-GUGCCUU-3’塩基配列であり、このような正規的なシ
ードターゲットサイトは、miR-124のシード(5’-UAAGGCAC-3’)と
最小6個の連続した塩基で完全相補的塩基配列をすることになる(図2a)。
ゲットサイト(Nuc site;nucleation bulge site)は、
5’-GUGGCCUU-3’であり、miR-124の6番C塩基がターゲットと核隆
起を形成して塩基配列することになり、これによって、miR-124の5’末端基準5
番目と6番目の間に配列される標的RNAのGがバルジ(bulge)で形成される。こ
れを基に非正規核隆起ターゲットサイト(nucleation bulge site
)と連続的で且つ完全に相補結合する塩基配列(5’-UAAGGCCA-3’)をマイ
クロRNAシードとするsiRNAをデザインしてmiR-124-BS siRNAと
命名した(図2a)。miR-124-BSは、miR-124の非正規標的である核隆
起ターゲットサイト(Nuc site)を正規的なシードターゲットと認識して、これ
を有している非正規的標的の遺伝子発現を特異的で且つより強力に阻害するものと考え、
このような事実をルシフェラーゼレポータ実験を通じて確認した(図2b-c)。
比べてどれくらい非正規的な標的である核隆起ターゲットサイトを抑制できるかを確認す
るために、ルシフェラーゼレポータにmiR-124に対する当該サイトを挿入し、これ
と共に様々な濃度(0、0.01、0.1、0.5、2.5、15nM)のmiR-12
4を細胞に導入させた後、ルシフェラーゼの活性でIC50(inhibitory c
oncentration 50)を測定してみた結果、正規シードサイトは、約0.5
nM、非正規核隆起サイトは、約0.2nMであって、類似していることを確認すること
ができた(図2b)。しかしながら、最高に抑制される比率を見ると、正規シードサイト
は、約50%、非正規核隆起サイトは、約80%であって、非正規核隆起サイトを通した
阻害が多少弱いことが分かった。特に遺伝子発現阻害が始まるという点を見たとき、正規
シードターゲットは、約0.01nM以上で、非正規核隆起ターゲットは、0.1nM以
上の濃度条件で遺伝子抑制が始まるという点をルシフェラーゼ活性測定を通じて確認した
(図2b)。したがって、miR-124は、正規ターゲットと非正規核隆起ターゲット
の発現を調節し、正規ターゲット発現調節効率が高いという点が分かった。
サイト配列をpsi-check2ベクター(Promega社)のレニラルシフェラー
ゼ遺伝子3’UTR(3’untranslated region)部分に2回連続配
列でクローニングして実施した。非正規隆起サイト配列は、MINK1の3’UTR部分
に自然的に存在する非正規核隆起ターゲットサイトを使用した。miR-124は、ヒト
由来の配列であって、miRBaseデータベースによって、該当するガイド鎖(gui
de strand)、パッセンジャー鎖(passenger strand)をそれ
ぞれBioneer社で化学的に合成製作後、HPLCで分離、前記会社で提供した方法
によってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二重体(duplex)で製造した。miR-1
24とルシフェラーゼレポータベクターは、Lipofectamine 2000試薬
(Invitrogen)を用いて製造者のプロトコルによって略10,000個の子宮
頸癌細胞(HeLa:ATCC CCL-2)に伝達(co-transfection
)させた。HeLa細胞は、10%FBS(fetal bovine serum)、
100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充したDu
lbecco’s改質Eagle’s培地(Invitrogen)で培養し、トランス
フェクションを行うときは、抗生剤ない完全培地で細胞を培養した。トランスフェクショ
ンを行った24時間後、Promega社のDual-luciferase repo
rter assay systemを用いてメーカーのプロトコルによってルシフェラ
ーゼの活性を測定し、レニラルシフェラーゼ活性の計測は、promega社のGlom
ax Luminometerを用いて最小3回以上の反復実験を行い、ホタル(fir
efly)ルシフェラーゼの活性により標準化されて計算した。
R-124-BSの機能を確認するために、同一にルシフェラーゼレポータを使用して実
験した。その結果、miR-124-BSは、miR-124正規シードターゲットに対
してどんな濃度(0~10nM)でもルシフェラーゼレポータ酵素の活性を阻害させなか
ったが、miR-124非正規核隆起ターゲットレポータに対しては、0.1nM以上の
濃度でルシフェラーゼレポータ酵素の活性を阻害させる効果を確認することができた(図
2c)。この際の遺伝子抑制効率をIC50で測定してみたとき、非正規核隆起ターゲッ
トに対する抑制が約0.5nMであることが示された。このような点から見て、miR-
124-BSのmiR-124非正規核隆起ターゲット発現調節機能は、非正規核隆起タ
ーゲットサイト特異的であると解析することができる(図2c)。この際のルシフェラー
ゼレポータ実験は、miR-124-BSを以前と同一にバイオニア社で合成して製作し
、当該ルシフェラーゼレポータベクターとともに子宮頸癌細胞(HeLa:ATCC C
CL-2)にトランスフェクション(co-transfection)した後、24時
間後にルシフェラーゼ酵素の活性を測定して行った。
るようにする目的で当該サイト配列に対して連続的で且つ完ぺきに相補的なシード領域配
列を含むmiRNA-BSを発明し、その効果を検証するためにmiR-124に適用し
てルシフェラーゼレポータ実験を通じて確認してみたとき、miR-124-BSが正規
シード標的の発現は抑制せず、非正規隆起標的の発現は効果的に抑制できるという特徴を
検証することができた。
宮頸癌細胞の細胞死滅現象観察
miR-124-BSが、miR-124が抑制する様々な標的のうち非正規隆起標的
のみを抑制するという事実を以前の実施例で確認した後、これを通してmiR-124の
特定機能のみを示すことができるかを確認しようとした。miR-124の場合、一般的
に神経細胞にのみ特異的に発現するので、主に神経細胞に関連した役割をするものと知ら
れている。しかしながら、腫瘍で発生した膠腫では、miR-124の発現が劣っており
、これと関係してmiR-124の発現を人為的に腫瘍細胞に誘導する場合、腫瘍細胞の
死滅を起こすことができるという事実が観察された。したがって、このようにmiR-1
24の多様で且つ異なる機能がその標的を認識する種類によって異なるかを確認するため
に、miR-124-BSを子宮頸癌細胞(HeLa)に導入し、細胞の死滅をフローサ
イトメトリー分析で観察した(図3a)。
胞(HeLa:ATCC CCL-2)にRNAiMAX試薬(Invitrogen社
)を使用して製造者のプロトコルによってトランスフェクション(transfecti
on)した後、72時間後にトリプシンを処理して細胞を培養皿から引き離し、BD P
harmingen社のAnnexin V:FITC Apoptosis Dete
ction Kit IIを製造社が提供した方法によって細胞を処理してBD Ari
a I(BD Biosciences)でAnnexin Vではapoptosis
を、PI(Propidium Iodide)ではnecrosisを測定して行った
。この際、対照群としては、美しい小さな線虫(C.elegans)のマイクロRNA
であるcel-miR-67の配列と同一に合成して使用した
分けて比較してみた結果、miR-124が発現した場合、子宮頸癌細胞(HeLa)で
対照群に比べてapoptosis(Annexin Vで染色された細胞の数)により
死滅が進行される比率が、約30%から約78%に増加することを観察し、同一にmiR
-124-BSも、約73%であって、2倍以上増加することを確認した(図3a)。m
iR-124-BSがmiR-124の正規シードサイトは抑制せず、非正規隆起サイト
のみを抑制した以前の実施例2の結果に照らしてみるとき、子宮頸癌の細胞死滅は、非正
規核隆起ターゲットの発現抑制によって起こることが分かる。
がない全く異なる細胞では、脳組織特異的機能をしないと報告されたことがある(Far
h K et al,2005,Science,310(5755)1817-21)
。したがって、miR-124が非正規隆起標的を抑制することで起こす機能を神経細胞
で観察するために、miR-124-BSを小脳神経幹細胞株であるC17.2に導入し
た後、細胞分化を細胞形態学的に観察した(図3b、上図)。その結果、miR-124
を導入した場合には、C17.2細胞の神経突起分岐分化が長く作られながら促進された
が、miR-124-BSの場合には、分化は観察されたが、分岐が短い形態で相異に観
察された。したがって、miR-124により起こる一般的な神経突起分岐分化は、正規
的なシードサイト標的を抑制することで起こることが分かる。この際、miRNAの導入
は、以前の実施例2と同じ方法で50nMのmiRNAを合成してRNAiMax試薬で
実行した。
胞でもこのような機能が現れるかを実施例2で行った方法と同一にC17.2細胞でフロ
ーサイトメトリー分析で観察した。その結果、miR-124発現の場合には、細胞死滅
が起こる比率が、対照群の21%に比べてほぼ類似した程度である22.4%であるのに
対し、miR-124-BSは、33.4%であって、多少増加することが示された(図
3b、中間図)。これは、子宮頸癌細胞で同一に細胞死滅がmiR-124の非正規隆起
標的抑制を通じて起こるという点から同じ傾向性を示すが、その増加率は、約2倍で現れ
る子宮頸癌よりは非常に小さいことが分かった。miR-124は、神経幹細胞で分化に
関連した役割を主にするが、この際、細胞周期の調節は、重要な役割をすることができる
。したがって、miR-124とmiR-124-BSをC17.4細胞に導入した後、
細胞周期をPI(Propidium Iodide)染色を通じてフローサイトメトリ
ー分析を適用して観察した(図3b、下図)。この際、miR-124は、G0/G1で
の細胞周期停止状態(cell cycle arrest)を対照群である69%に比
べて多少増加させた83%で誘導させることが示された。これに対し、miR-124-
BSの発現は、細胞周期停止が顕著に起こらないことを観察することができた。この際の
実験は、以前の実施例と同一に、当該マイクロRNAをトランスフェクションし、48時
間の間培養後、細胞を引き離してエタノールで固定(fix)、1mg/mlのprop
idium iodide(PI;Sigma-Aldrich)を0.2mg/mlの
RnaseAとともに37℃で30分間反応させた後、BD FACSCalibur(
BD Biosciences)でフローサイトメトリー分析を行った。
規核隆起ターゲット発現を阻害する場合だけでも、miR-124と同一に、子宮頸癌細
胞(Hela)の死滅を誘導し、これを通してmiR-124の非正規隆起標的の阻害機
能は、癌細胞の死滅であることが分かる。また、神経幹細胞の場合、miR-124の発
現によって神経突起分岐分化が起こり、若干の細胞死滅と細胞周期停止が起こるが、mi
R-124の非正規隆起標的のみを阻害するmiR-124-BSでは、このような機能
が多少異なる形態で現れる。したがって、miR-124の神経細胞分化機能は、従来の
知られている正規的なシード標的遺伝子の抑制によって主に起こることが分かり、異なる
形態としては、非正規隆起ターゲットを通じて起こり得ることを考えることができた。
害することによって、分岐が多く突起が短い異なる形態の神経分化(branched
neurite outgrowth)誘導機能確認
miR-124-BSがmiR-124とは異なる形態の神経分岐突起分化を起こすこ
とを以前の実施例で確認した後、これをより詳しく調べるために、ヒト神経芽細胞腫(n
euroblastoma)であるsh-sy-5y細胞株(CRL-2266)を使用
して実験をした。この際、追加的にmiR-124-BS以外にmiR-124の非正規
核隆起サイトを認識し抑制できるシード配列を同一に有するが、その他の配列は、異なる
配列を有しているマイクロRNA配列をmiR-124と同一にしたmiR-124-B
S(4753)を以前の実施例で記述した方法で合成して実験を進めた。この際、使用し
たmiR-124-BS(4753)の配列は、5’-CAAGGCCAAAGGAAG
AGAACAG-3’であり、対照群(control)としては、美しい小さな線虫(
C.elegans)のマイクロRNAであるcel-miR-67(NT;non-t
argeting)の配列と同一に合成して使用した。該当するmiRNAを以前の実施
例で記述した同じ方法でトランスフェクションし、60時間の間細胞を培養した後、細胞
形態学的変化を光学顕微鏡で観察した(図4a)。
起を長く分化させる形態上の変化を観察することができ、反面、miR-124の非正規
隆起標的のみを抑制できるシード配列をmiR-124-BSと同一に有しているmiR
-124-BS(4753)の場合には、短いが、1つの細胞で多数の神経突起分岐が生
じる細胞形態(branched neurite outgrowth)が観察された
(図4a)。これを基に追加でカテコールアミン系神経細胞(CAD,CRL-1117
9)でも同じ実験を進めてみた。この際は、当該マイクロRNAをトランスフェクション
させ、52時間の間細胞を培養した後、観察した(図4b)。その結果、ヒト神経芽細胞
腫(Sh-sy-5y、CRL-2266)細胞で示した結果と同一に、miR-124
は、数字が少ないが、長い突起を形成し、miR-124-BS(4753)は、短いが
、多くの神経突起分岐が伸長する分化現象を観察することができた。(図4b)。追加的
に、miR-124とmiR-124-BS(4753)を共に同一割合で細胞内に伝達
する場合、長い神経突起を有する細胞と多くの神経突起分岐を形成させた細胞が同時に観
察された。これは、発明したmiR-124-BSと従来のmiR-124とともに発現
した場合、人為的にさらに複雑な神経ネットワークで示される脳細胞と類似に多様な形態
の神経分化を促進させることができる可能性を示す。
経細胞特異的なマーカーであるTuj1に対する免疫染色を通じて確認した(図4b、下
図)。この際の実験は、当該マイクロRNAをトランスフェクションした後、52時間後
に、CAD細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定(fixation)後、1次抗体で
あるTuj1(MRB-435P、Covance Antibody Product
s社)を1:1000の割合で、Alexa 594蛍光3物質が結合された2次抗体(
Abcam:ab150076)は、1:1000の割合で抗体染色(immune-s
taining)した後、DAPIで核を染色して行った。
とによって、従来のmiR-124の機能とは異なる形態である短いが多くの神経突起分
岐を形成させる機能を有していることが分かる。特にmiR-124-BSとは配列が異
なるが、同一にシード領域の配列を有していて、非正規核隆起標的のみを抑制できるmi
R-124-BS(4753)を使用してこのような事実を観察し、これは、非正規核隆
起標的を認識できるシード配列を含んでいるRNA干渉誘導体は、miR-124-BS
と同じ効果を示すという事実を明らかにする。また、miR-124-BSにより生成さ
れる複雑な神経突起分岐は、複雑な神経ネットワークを示すヒト脳細胞と類似に多様な形
態の神経分化を促進させることができる方法として活用され得ることを示す。
、これによって誘導される神経突起分化(branched neurite outg
rowth)の形態および分子生物学的特徴確認
miR-124-BSの発現で誘導される特異的な神経突起分化現象をラット神経芽細
胞腫であるN2a(CCL-131)で追加的に確認するために、実施例4と同一にmi
R-124、miR-124-BS(4753)を細胞に導入した後、72時間の間培養
しながら細胞の形態変化を観察した(図5a)。また、同時にmiR-124のシード配
列を同一に有しているが、その他の部分は、異なる配列を有するmiR-124(371
4)も、5’-GAAGGCAGCAGUGCUCCCCUGU-3’配列で合成してs
iRNA形態で二重体を形成させた後、細胞に導入して実験した。この際、対照群として
は、美しい小さな線虫(C.elegans)のマイクロRNAであるcel-miR-
67(NT;non-targeting)の配列と同一に合成して使用した。
るCADで見られたのと類似した長い神経突起を有する神経細胞を観察することができ、
miR-124-BS(4753)をトランスフェクションした細胞では、多様な方向に
分岐を形成した短い神経突起を有する細胞形態上の特徴を確認することができた(図5a
、上)。また、miR-124(3714)をトランスフェクションした実験群では、m
iR-124と同一に比較的長い細胞突起を示す細胞を多く観察することができた(図5
a、上)。このような細胞形態上の変化は、分化した神経細胞で発現する当該タンパク質
に対する抗体、Tuj1(Covance Antibody Products,MR
B-435P)、vGLUT1(synaptic systes社、135-303)
、MAP2(millipore社、MAB3418)を使用してその発現量が増加した
ことを免疫ブロット実験(immuno blotting)を通じて4つの対照群タン
パク質(ACT-B、TUB-A、GAPDH、H3B)の発現に対比して確認すること
ができた(図5a、下)。これを通してmiR-124と類似しているが、異なる形態を
示すmiR-124-BS(4753)による神経分化は、形態学的には多少異なってい
るが、遺伝子発現マーカー上、同一に分化を誘導したことを確認することができ、miR
-124と同じシード配列を有していて、同一に主に正規的シード標的を抑制するものと
認められるmiR-124(3714)は、予想通りmiR-124のように神経細胞の
分岐が長く分化する特徴を示すという点が分かった。また、miR-124-BS(47
53)、miR-124(3714)が発現した場合、いずれも、分化した神経細胞で見
られるタンパク質発現量が増加したところ、これらは、いずれも、分化した形態の神経細
胞の分子的特徴を有していることを確認することができた。
たが、マイクロRNAの発現は、これを生成させることができるヘアピン形態のRNAで
あるshRNA形態を発現させるベクターを導入しても可能である。したがって、pre
-miRNAで発現させるベクターであるpCAG-miR30プラスミド(addge
ne #14758)を使用してmiR-124、miR-124-BS(4753)、
miR-124(3714)をshRNA形態で発現させるベクターを製作した。この際
、使用したpCAG-miR30ベクターは、マイクロRNAを強く発現させるためにC
AGプロモーターを使用し、マイクロRNA-30のバックボーン(backbone)
を発現させるようにデザインされて、マイクロRNA発現を最大化させる長所を有してい
る(Paddison P et al,Nature methods,2004,1
(2):163-7)。
14)を発現させるように作られたpCAGベクターは、何も発現しないpCAGベクタ
ーを対照群として使用して、N2a細胞に導入され、その後、細胞形態を観察した(図5
b)。神経芽細胞腫であるN2aに導入されたヘアピン構造の実験群は、miR-124
、miR-124-BS(4753)、miR-124(3714)二重体が見られる細
胞形態上の変化と類似した変化を示した。トランスフェクション後、72時間培養時、m
iR-124とmiR-124(3714)が発現した実験群では、長い神経突起を有す
る神経芽細胞腫を観察することができた。これに対し、miR-124-BS(4753
)が発現した実験群では、短くて多様な方向に伸長した神経突起を有する神経細胞腫を観
察することができた(図5b、上)。このような細胞形態の変化は、分化した神経細胞で
発現するタンパク質であるTuj1(O.von Bohlen et al.2007
Cell and Tissue Research,329,3,409-20)の
発現や、Synaptophysin(SYP)の発現が増加したことが確認され(図5
b、下)、したがって、miR-124、miR-124-BS(4753)、miR-
124(3714)ヘアピンベクターが導入された細胞が対照群に比べて分化した形態の
神経細胞の特徴を有することを確認することができた。TUJ1の増加は、以前の実施例
と同じ方法で免疫ブロット実験で観察し、Synaptophysinは、qPCR(Q
uantitative Polymerase Chain Reaction)実験
を通じて以前の論文(S.E.Kwon et al.2011 Neuron 70,
847-54)で記述されたprimer配列を使用して進めた。この際の実験は、当該
ベクターをN2a細胞にLipofectamine 3000試薬(Invitrog
en社)を当該会社のプロトコルによって使用して行ってトランスフェクションした後、
24時間後にトータルRNAをRNeasyキット(Qiagen)で抽出し、当該プロ
トコルによってSuperscript III RT(Invitrogen)で逆転
写し、SYBR Green PCR Master Mix(Applied Bio
systems)でqPCRを行って、当該プライマーでSYPの伝令RNAの量を測定
し、GAPDH伝令RNA値で標準化した。
するようにするベクターを使用しても、miR-124のシード部分の配列のみを同一に
有する場合(miR-124(3714))、miR-124と同一に正規的な標的遺伝
子の発現抑制を通じて一般的に長い神経突起分化を起こすことが分かる。また、miR-
124の非正規隆起標的も、shRNA形態でシード部分のみがmiR-124-BSと
同一に発現(miR-124-BS(4753))されると、分岐がさらに多い神経突起
分化を起こすことができる。このようにmiR-124による正規標的抑制と非正規隆起
標的抑制が両方とも神経細胞の神経突起分化形態の分子的な遺伝子マーカー発現を示し、
これを通して全部神経細胞に分化したことを確認することができた。
胞腫(N2a)の神経突起分化誘導確認
追加的にmiR-124、miR-124-BS(4753)、miR-124(37
14)の神経芽細胞腫(N2a)で神経突起分化誘導を細胞形態学上で観察し、これを定
量的に分析してみた(図6a)。定量分析時、それぞれの神経細胞に由来した神経分岐を
区分するために緑色蛍光タンパク質(GFP:Green fluorescent p
rotein)を発現させるpUltra(addgene #24129)プラスミド
と当該マイクロRNA発現ベクターを以前の実施例での方法と同一にトランスフェクショ
ン(co-transfection)させ、72時間の間細胞培養を進めながら、神経
突起を蛍光顕微鏡(Leica社)で観察して神経突起分岐の数を測定し、細胞当たり生
成された神経突起の長さをイメージJプログラムを通じて分析した。
ite branch)が対照群に比べてmiR-124、miR-124-BS(47
53)、miR-124(3714)では約3~5倍増加したことを確認した(図6a、
下左側)。しかしながら、miR-124-BS(4753)が発現した場合には、mi
R-124やmiR-124(3714)が発現した場合に比べて有意的にさらに多くの
分岐が形成されることが観察された。また、細胞当たり生成された神経突起の長さも、対
照群に比べてmiR-124-BS(4753)、miR-124(3714)実験群で
4~6倍に増加したことを確認することができ、より詳しくは、miR-124またはm
iR-124(3714)が発現した場合には、miR-124-BS(4753)が発
現したときよりさらに長い神経突起分岐が形成されることを観察することができた(図6
a、右下側)。これは、以前の実施例(図4、図5、図6)で細胞形態学的に観察したの
と同じ結果である。
起サイトにより起こるかを調べるために、神経分化に関連した遺伝子の3’UTR部分に
配列でmiR-124の非正規隆起標的配列を探してみた。その結果、神経細胞の分化を
調節すると報告されたMAPRE1(Microtubule-associated
protein RP/EB family member 1:Elena Tort
osa et al.2013 EMBO 32,1293-1306)遺伝子を探すこ
とになった。MAPRE1は、神経突起を生成させるとき、これを構成するマイクロチュ
ーブル(micorotubule)の端部につくタンパク質であって、当該マイクロチ
ューブルの形成調節を通じて神経突起の形態を決めることができる。したがって、このM
APRE1遺伝子がmiR-124の非正規隆起標的と認識されてその発現が阻害される
かを確認するために、N2a細胞にmiR-124-BSを導入した後、MAPRE1の
伝令RNAの量を実施例5bで行った方法によってqPCR実験を実施して測定してみた
(図6b)。2つの異なるプライマーをもってqPCRを施行してみたとき、2つの結果
がいずれも対照群に比較してmiR-124-BS導入された実験群では70~40%水
準にMAPRE1発現が減少することを確認することができた。これを通してMAPRE
1がmiR-124の非正規隆起サイトでその発現が抑制されることを確認することがで
きた。
れば、miR-124-BSの非正規隆起標的抑制によって現れる神経分化形態がMAP
RE-1の発現減少によってさらに促進されなければならない。したがって、このような
点を確認するためにMAPRE1を阻害できるsiRNAを2つ製作し、これと共にmi
R-124を共にN2a細胞にトランスフェクションし、細胞形態学上の変化を示すかを
確認する実験を行った(図6c)。その結果、miR-124のみを発現させた対照群に
比べて、miR-124とMAPRE1に対するsiRNAを共に発現させた実験群で神
経突起分岐が多く増加したことを観察することができ、これは、二種類の異なる配列のM
APRE1 siRNAを使用した実験でも同一に観察した(図6c)。この際の実験は
、以前の実施例で使用した方法と同一にRNAを細胞に導入したら、その後、48時間の
間細胞培養しながら形態を観察した。
くとも部分的にはMAPRE1遺伝子の発現をmiR-124の非正規隆起標的サイトを
通じて抑制して現れることができる生物学的機能であることを確認した。
規隆起標的遺伝子の阻害傾向性分析
マウス神経芽細胞腫(N2a)でmiR-124-BSを通じて抑制された遺伝子は、
究極的に神経芽細胞腫の神経突起分岐を多く生成させる神経細胞分化を誘導することを確
認した(図5)。このような現象は、miR-124-BSのシード配列がmiR-12
4の非正規隆起標的を認識し抑制する機序によって現れるものと考えられ、そのような可
能性を標的遺伝子で捜し出したMAPRE1で確認した(図6)。しかしながら、実際に
は、数百個のmiR-124非正規隆起標的遺伝子が抑制されて起こる現象であろう。
写体水準でmiR-124の非正規隆起標的遺伝子のみを確認するために、miR-12
4とmiR-124-BSをN2a細胞に導入した後に、RNA-Seq分析を施行した
。この際の対照群としては、miR-124と同じ塩基配列や5’末端基準6番が非塩基
(pi)である二重体(miR-124-6pi)を使用したら、このような変形は、m
iRNAの5’末端基準6番目に塩基がないので、標的伝令RNAと全く配列しないと報
告された((Lee HS et.Al.2015,Nat Commun.6:101
54)。
マイクロRNAであるcel-miR-67の配列で5’末端基準6番を非塩基に変換し
たもの(NT-6pi)を使用してN2a細胞にmiR-124、miR-124-BS
、miR-124-6pi二重体を75nM濃度でそれぞれ伝達させ、24時間培養後、
全体RNAをRNAeasy(Qiagen)キットで抽出した後、Otogeneti
csでライブラリーを製作し、次世代配列分析(Next-generation se
quencing)を行った。その後、前記実験で得られた配列データであるFASTA
QファイルをTopHat2プログラムでマウス誘電体配列(mm9)にマッピングし、
Cufflink、Cuffdiffプログラムで発現値(FPKM)を求めて、対照群
NT-6piを導入したマウス神経芽細胞腫(N2a)細胞での結果で標準化して、ログ
比(Fold change,log2 ratio)で示して分析を実施した。
Aの発現で阻害されるかをRNA-Seq結果で分析するために、miR-124の正規
シードサイト(5’末端基準2番目から8番目までと塩基配列する7mer)を3’UT
Rに有しており、当該サイトの配列が複数種で保存されたものを選択するために、pha
stCons点数が0.9以上である遺伝子を選別し、このようなプロファイル結果を当
該マイクロRNAの発現に依存的に阻害される順に累積比率(cumulative f
raction)で比較分析した。また、同じ方法でmiR-124の非正規隆起サイト
(nuc、7mer)も同定して、当該遺伝子の抑制比率を同一に累積比率で分析した。
この際、miR-124の非正規隆起サイトを有している遺伝子が同時に正規シードサイ
トを有していて、その抑制効果に対する判断が難しいことがあるので、全体伝令RNAに
miR-124の正規シード配列がない場合(nuc only)と反対に、正規シード
サイトのみがあり、非正規隆起サイトはない場合(seed only)も分析した。
比率変化(fold change)を累積比率(cumulative fracti
on)によって分析したとき、miR-124の保存された正規シードサイトを3’UT
Rに有している遺伝子(miR-124 seed)や当該サイトのみを有している遺伝
子(miR-124 seed only)は、全体遺伝子(Total mRNA)に
分布に比べて非常に多く抑制される現象を確認し(図7a、上)、これに対し、miR-
124の非正規隆起サイトを有している遺伝子は、有意に抑制され、非常に弱く阻害され
ることを観察することができた(図7a、下)。しかしながら、このような抑制現象は、
対照群であるmiR-124-6piを導入した細胞では観察されなかった(図7b)。
分析でmiR-124-BS発現による比率変化(fold change)を累積比率
(cumulative fraction)によって分析したとき、miR-124の
保存された正規シードサイトを3’UTRに有している遺伝子(miR-124 see
d)では、若干の阻害効果を示したが、miR-124の非正規隆起サイトはなく、当該
正規シードサイトのみを有している遺伝子(miR-124 seed only)では
、全く変化がないことを確認した(図7c、上)。しかしながら、miR-124の非正
規隆起標的を有している遺伝子の場合(miR-124 nuc)や当該標的のみを有し
ている遺伝子の場合(miR-124 nuc only)、両方とも強くて且つ有効に
遺伝子抑制現象が起こることが分かった(図7c、下)。図7cでmiR-124-BS
が発現した場合、miR-124の正規シードサイトのみを(miR-124 seed
only)有している遺伝子は、阻害が起こらないことから見てmiR-124の正規
シードサイトを全く抑制しないと結論を下すことができるが、miR-124-BSが多
少miR-124のシードサイト標的を阻害したことは、miR-124の正規サイトが
ある場合には、おそらくmiR-124の非正規隆起サイトが共に存在して抑制効果を少
しでも示すものと推察される。
標的遺伝子の抑制を非常に強くて且つ効率的に抑制するが、非正規隆起標的は、非常に弱
く阻害することが分かり、miRNA-BSは、転写体水準でmiRNAの非正規隆起標
的の発現を抑制するが、従来の正規シード配列は抑制しないことを確認することができた
。
期停止状態(cell cycle arrest)のフローサイトメトリー分析を通し
た確認
miR-124の非正規核隆起標的によるmiR-124の神経細胞分化誘導を観察し
た結果を基に他のマイクロRNAの非正規核隆起標的の生物学的機能に対する実験を行っ
た。miR-122は、シード塩基配列として5’-UGG AGU GU-3’を有し
、これの非正規核隆起ターゲットサイトと塩基配列するsiRNAの塩基配列であるmi
R-122-BSは、6番Uがもう一度繰り返される形態であり得、この場合には、5’
-UGG AGU U GUG ACA AUG GUG-3’配列を5’末端に有して
19個の塩基で構成され、20番目と21番目の塩基としては、dt(Deoxy Th
ymine Nucleotide)からなる。特に二重体構造では、当該dt部分が3
’末端に2個のヌクレオチド突出部(overhang)を構成することができるように
ガイドとパッセンジャー鎖の二重体で構成した。この際、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖
と完全相補塩基結合をし、5’末端基準1番目と2番目の両方を2’OMeで変形し、塩
基配列の端部にdtを2個含むように構成した(図8a)。miR-122-BSのガイ
ド鎖とパッセンジャー鎖は、バイオニア社で化学的に合成し、HPLCで分離し、前記会
社で提供した方法によってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二重体(duplex)で製造
した。
に導入し、以後、細胞周期の変化をフローサイトメトリー分析を通じて観察した。この際
の実験は、対照群であるNT-6pi、miR-122、miR-122-BSの二重体
を50nMの濃度でHepG2にRNAiMAX(Invitrogen)試薬を用いて
、細胞に伝達(transfection)し、24時間培養後、ノコダゾール(noc
odazole)を100ng/mlで16時間の間処理してG2/M(分裂準備期/分
裂期)に細胞を同期化(synchronization)した後、MuseTM Ce
ll Cycle Kit(Catalog No.MCH100106、Milipo
re)を用いて、会社が提供する実験方法によってMuse Cell Analyze
r(Milipore)で細胞周期を分析した。
2-BS実験群は、G0/G1期の細胞が10.7%から24.3%に約2倍程度増加し
、肝癌細胞であるHepG2の細胞周期停止が増加することを確認することができた(図
8b-c)。このようなG0/G1期の細胞増加は、miR-122が伝達された細胞で
は観察されなかった。次に、miR-122-BSが伝達されたヒト肝癌細胞株(Hep
G2)のG2/M期細胞分布は、対照群と比較時に83.4%から67.3%に減少し、
このような結果は、miR-122が伝達された細胞では観察されなかった(図8b、c
)。
を通じて、ヒト肝癌細胞株で細胞周期停止を誘導する生物学的機能を示し、これは、mi
R-122が作用する生物学的機能とは全く異なる機能であることを観察することができ
た。
能および、miR-155-BSが細胞死滅機能確認
miRNA-BSがmiRNAの正規シード標的の発現を抑制して現れる機能とは異な
る新しい生物学的機能を観察したので、このような機能が筋肉細胞でどのように現れるか
を観察するために、筋肉細胞で発現して重要な機能をするmiR-1、miR-155に
miRNA-BSを適用してみた。
rentiation)に機能すると報告されているので(Chen J et.al,
Nature genetics,2006,38(2):228-233),miR-
1-BSを骨格筋肉細胞株であるC2C12に発現させた後、細胞形態学的変化(図9a
)と分化時に発現する遺伝子マーカーの発現有無(図9b)を調査した。この際、miR
-1-BSを以前の実施例で使用した同じ方法で合成し、細胞にトランスフェクションし
、48時間の間細胞培養時に10%FBS(fetal bovine serum)、
100 U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充したD
ulbecco’s改質Eagle’s培地(Invitrogen)を使用して、これ
は、増殖培養条件(growth condition;GM)状態(図9a、上)とこ
のように成長させた後、FBSを除去した欠乏培養条件(deprivation me
dia condition;DM)で48時間さらに培養した状態(図9a、下)に分
けて観察した。以後、細胞は、4%パラホルムアルデヒド(para-form ald
ehyde:PFA)を処理して細胞を固定し、分化した筋肉細胞に発現するmyosi
n 2 heavy chainタンパク質を1次抗体(MF20:Developme
ntal studies hybridoma bank )で反応させた後、Ale
xa 488蛍光物質がついたマウス2次抗体(ab150105)で染色して、細胞形
態および分化を観察した(図9a)。
1-BSが発現したとき、対照群であるNTやmiR-1二重体が伝達された細胞に比べ
てさらに多い数の分化した筋細胞をMF20染色結果で確認することができた。培養時に
血清を減少させる欠乏培養条件(deprivation media conditi
on;DM)では、筋線維(muscle fiber)への分化が進行されることを全
部観察したが、miR-1-BSが対照群であるNTを発現させた骨格筋肉細胞でさらに
太い形態を観察することができた(図9a)。これは、miR-1-BSが増殖培養条件
でさらに速く筋細胞分化を誘導して生じた結果であり得る。このような筋肉細胞の分化は
、分化時に発現が増加する遺伝子の発現量をマーカーで分子的に確認することがきるが、
これによって、sk-actinとMyogenin発現量を当該伝令RNAに特異的な
プライマーでRT(Reverse transcription)-PCRを行って、
分化時にも発現量に差異がないb-actinの伝令RNAの量と比較して検出してみた
(図9b)。その結果、miR-1(1)とmiR-1-BS(1BS)が全部発現時に
sk-actinとMyogeninの転写量が増加することを確認することができ、M
yogeninの場合、その量がmiR-1-BSによりmiR-1よりさらに多く増加
することを観察することができた。
,JBC,286(41):35339-46 2011)であって、上記でmiR-1
に対して実施した同じ方法でmiR-155-BSの効果を骨格筋肉細胞(C2C12)
の分化を通じて観察した(図9c)。その結果、対照群であるNT、miR-155、m
iR-155-BSを発現させた後、増殖培養条件(GM)では細胞の特別な形態学的差
異を観察しなかったが、筋細胞の分化を誘導する欠乏培養条件(DM)では対照群は分化
し、miR-155が発現する場合には抑制されるが、miR-155-BSを導入した
場合には、分化がかえってなくなることをmyosin 2 heavy chainタ
ンパク質を通した免疫染色(immune-staining)実験を通じて確認した(
図9c)。特に、miR-155-BSを発現したC2C12細胞を詳しく調べたとき、
miR-155-BSが細胞の死滅を誘導したことが観察された。これに対し、miR-
155が伝達された筋細胞では、細胞死滅は全く観察されなかった(図9c、下)。これ
をさらに詳しく調べるために、当該マイクロRNAが発現したC2C12細胞を48時間
の間増殖培養条件で成長させた後に、実施例3での方法と同じフローサイトメトリー分析
を適用して細胞死滅を調べた(図9d)。その結果、miR-155-BSが伝達された
実験群は、対照群に比べて約1.5~2.5倍以上細胞死滅が増加したことが確認された
(図9d、e)。
維分化を誘導し、miR-155-BSは、骨格筋肉細胞の死滅を誘導し、このような機
能は、従来の筋肉細胞を収縮させるmiR-1の機能と筋肉細胞分化を抑制するmiR-
155の機能とは異なることを確認することができた。
マイクロRNAのシード位置で許容する非正規標的サイトの発見
マイクロRNAの標的を転写体水準で分析できる方法としては、Ago HITS C
LIPという実験方法が開発されて広く使用されている(Nature,2009,46
0(7254):479-86)。Ago HITS CLIP実験は、細胞や組織サン
プルにUVを照射して細胞内でRNAとアルゴノートタンパク質の間に共有結合を誘導し
、このように生成されたRNA-アルゴノート複合体をアルゴノートを特異的に認識する
抗体を用いて免疫沈降法で分離した後、分離したRNAを次世代塩基配列(Next-g
eneration sequencing)で分析する方法である。このように得られ
た塩基配列データは、生物情報学的分析を通じてマイクロRNAの標的mRNAを同定す
ることができるだけでなく、その結合位置と配列も正確に分析することができる(Nat
ure,2009,460(7254):479-86)。Ago HITS-CLIP
は、最初にラットの大脳皮質組織に適用されて脳組織でのマイクロRNAの標的に対する
地図を作成し、その後、今まで様々な組織に当該方法が適用された。このような様々なA
go HITS-CLIP分析を通じて様々な組織でのマイクロRNA結合位置が明らか
にされ、特にこのような標的配列でマイクロRNAのシード結合とは類似しているが、標
的mRNAの配列で異なる形態の非正規的結合標的が多く存在することを知ることになっ
た(Nat Struct Mol Biol.2012 Feb 12;19(3):
321-7)。
塩基配列を通したワブル(wobble)で存在することが観察された。ワブル塩基配列
は、従来の塩基配列とは異なって、特定RNAで発見され、よく知られたG:Uワブルは
、マイクロRNAの非正規標的でも配列できることが提示された。しかしながら、これに
比べてその結合が弱く、頻繁に観察されず、特にG:Aワブルの場合は、特定RNAで塩
基配列を形成できるが、その他には全く調査されなかった。しかしながら、マイクロRN
Aのシード配列のような場合には、塩基配列の自由エネルギー(free energy
)が構造的にアルゴノートタンパク質により安定化されるので、一般的に弱いG:A塩基
配列が相対的に重要になり得、本発明者らは、このような事実に注目して次のような分析
を進めた。
かを確認するために、死後脳組織の灰白質(gray matter)にAgo HIT
S-CLIPを行ったデータ(Boudreau RL et al,Neuron、V
ol.81(2),2014,294-305)を分析した(図10a)。この際の分析
は、Ago HITS-CLIPを開発(Nature、2009、460(7254)
:479-86)したときの方法によってアルゴノート-マイクロRNAとともに結合し
たRNA配列をシーケンシングされたFASTQファイルでBowtie2プログラムで
ヒト遺伝体配列に配列して行った。また、同時に当該シーケンシング結果をヒトマイクロ
RNA配列に配列して、当該脳組織でアルゴノートタンパク質と頻繋に結合している20
種類のマイクロRNA(top20 miRNA:図10b)も分析した。最終的には、
このように把握したtop20 miRNAに対して当該シード(seed)配列である
5’末端から2番目から8番目までに対して相補的な配列を有する正規標的(canon
ical target)サイトを調べた(図10b)。この際、マイクロRNA結合位
置に、相当に多い数の正規シード標的サイトが発見されることを観察した(図3b、メデ
ィアン値1292.5サイト、誤差範囲+/-706.62)。その後、このようなマイ
クロRNAのシード塩基配列でG:UまたはG:Aワブル塩基配列で結合できる非正規的
標的サイトが存在するかをAgo HITS-CLIPデータで調べた。この際、分析に
対する対照群(Control)としてマイクロRNAシード(seed)塩基配列と同
じ塩基配列によって塩基の相補的配列が不可能な標的配列を使用して分析した。
-526.48)とG:Uワブルが許容された標的(中央値995サイト、誤差範囲+/
-523.22)サイトが全部対照群(中央値891サイト、誤差範囲+/-410.7
1)に比べて高い分布を示し、特にG:Aワブルが存在するマイクロRNA標的サイトは
、G:Uワブルより約1.1倍さらに多く存在することを示した(図10b)。脳組織で
特異的に発現するmiR-124は、シード部分に2個のGを5’末端から4番目と5番
目に有していて、これを通じたG:U,G:Aワブル塩基配列をすることができる(図1
0c)。したがって、このような特定位置のGによるG:A、G:Uワブル塩基配列を区
別して分析してみた結果(図10d)、miR-124の正規シード標的サイト(see
d)が最も多く発見された(1,992個)。しかしながら、これと比べることができる
ほどに4番目がG:Uワブル(1,542個)をなすことを発見し、その次には、G:A
ワブル(1,542個)をなすことを観察した。また、5番目のGも、G:Uワブル(1
,800個)とG:Aワブル(1,198個)をなす標的サイトが多く見られ、このよう
に調査したすべてのサイトは、対照群の個数(647個)より全部多く存在することを確
認することができた(図10d)。したがって、マイクロRNAは、シード部分の塩基配
列を通した標的mRNAを認識する時、シード部分を通した正規的な塩基配列だけでなく
、非正規的にG:UまたはG:Aワブル塩基配列を許容し、特にG:Aワブル塩基配列が
このような結合を通じて標的mRNAと結合できることが分かった。このようなG:Aワ
ブル塩基を通したマイクロRNAの標的認識は、報告されたことがない新しい結果であり
、したがって、上記実施例で観察したように、様々なマイクロRNAで非正規的な標的と
認識されることを確認することができた。
ブル配列を許容する場合が存在し、これを通して多くのマイクロRNAが標的遺伝子の伝
令RNAに結合してその遺伝子の発現を抑制するものと思われる。
mIRNA-GUの開発およびmiR-124適用時にmiR-124-G5Uの神経細
胞死滅増大効果確認
実施例10において、マイクロRNAの非正規標的認識には、シード配列にG:Aワブ
ル配列を許容する場合があることを発見し、これを非正規G:Aシード配列サイトと名称
し、これに対して相補的に配列できる新しいRNA干渉誘導物質の配列であるmiRNA
-GUを次のように発明した。このような配列決定技術をmiR-124を対象に適用し
てみると、miR-124は、シード配列が5’-AAGGCAC-3’であって、非正
規GA配列シード標的は、4番G塩基、5番G塩基がそれぞれG:Aワブル塩基配列が可
能な塩基配列であり、したがって、このようなG:Aワブル配列を従来の相補的な塩基配
列に変える形式であるmiRNA-GUの配列に変えると、miR-124-G4U(5
’-AAUGCAC-3’)、miR-124-G5U(5’-AAGUCAC-3’)
に変更することができる。このように変更されたmiR-124-G4UとmiR-12
4-G5Uは、従来のmiR-124がG:Aワブル配列形態で弱く結合し認識した非正
規標的サイトを相補的な配列で結合することができるので、miR-124での非正規G
:Aシード配列標的の機能を示すことができる。
調べるために、非正規GA配列シードターゲットをmiR-124に適用して実験を行っ
た。このために、以前に実施例での同じ方法によって対照群としてNT(図11bにN2
aで記述)、miR-124、miR-124-G4U、miR-124-G5Uを神経
芽細胞腫であるN2aに導入し、細胞の形態を72時間の間培養しながら、観察してみた
(図11b)。その結果、miR-124を発現させた場合、長い神経分岐突起が形成さ
れる分化現象が起こるが、miR-124-G4U、miR-124-G5Uが伝達され
た実験群の場合、分化が起こらない現象を観察した(図11b)。このように従来のmi
R-124の機能である神経分化能がmiRNA-GUに変更したときに観察されないの
で、細胞死滅程度での変化をヒト神経芽細胞腫であるSh-sy-5y細胞株で観察した
。この際のフローサイトメトリー分析は、実施例9で使用した方法と同様に、Muse
Annexin V and Dead Cell Assay Kit(millip
ore社)を用い、Muse Cell Analyzer(Milipore)を通じ
て行った。その結果、miR-124-G-5Uの発現は、細胞死滅を対照群に比べて2
倍以上増加させたことを確認し(図11c)、これを早い細胞死滅(early apo
ptosis)や遅い細胞死滅(late apoptosis)に細分化して分析した
場合、miR-124が伝達された実験群に比べて、miR-124-G-5Uが伝達さ
れた実験群は、早い細胞死滅(early apoptosis)と遅い細胞死滅(la
te apoptosis)の2つの場合が全部有意的に増加したと分析された(図11
d)。miR-124-G-4Uが伝達された実験群の場合、miR-124が伝達され
た実験群に比べて遅い細胞死滅(late apoptosis)が有意的に抑制され(
図11c、d)、生きている細胞の数も多いことを観察することができた(図11b)。
ット抑制は、miR-124により誘導される神経分化の能力は消え、その代わりに、異
なる生物学的機能である細胞死滅調節機能を示すことを確認することができた。
以前の実施例でmiR-124-G4Uの場合には、神経細胞分化能を喪失し、細胞死
滅でも特別な機能が現れないので、細胞分裂に対して調べた。すなわち、対照群NT、m
iR-124、miR-124-G4U、miR-124-G5Uをそれぞれ神経芽細胞
腫細胞であるN2aに以前の実施例で行った方法と同じ方法で導入させた後、細胞分裂増
殖現象に対してフローサイトメトリー分析を実施した(図12a)。この際の実験は、M
use Ki67 Proliferation Kit(millipore社)を用
いて製造社が提供した実験方法によって細胞を処理した後、Muse Cell Ana
lyzer(Milipore)で細胞分裂を分析して進めた。この方法は、Ki67が
染色された細胞の数を測定することによって、細胞分裂増殖が増加した細胞の数を定量的
に分析する方法である。N2a細胞でmiR-124を発現させると、対照群であるNT
に比べて細胞が分化することによって、Ki67の染色の強さが減少した細胞が増える。
しかしながら、miR-124-G4Uが伝達された実験群は、対照群(NT)に比較し
て細胞分裂が増殖した細胞であるKi67染色細胞が61%から65%に多少増えた。こ
れに対し、miR-14-G5Uは、対照群と比較して差異がないことを観察することが
できた。
経芽細胞腫であるsh-sy-5y細胞株を用いてフローサイトメトリー分析を実施した
(図12b)。この際の分析は、miR-124-G4UとmiR-124-G5Uの機
能を細胞周期別に調べるために、MuseTM Cell Cycle Kit(Cat
alog No.MCH100106、Milipore)を用いて、Muse Cel
l Analyzer(Milipore)で分析した。その結果、miR-124の場
合、細胞の周期がG0/G1にある数が増加する細胞分裂停止(cell cycle
arrest)が観察されたが、miR-124-G4U、miR-124-G5Uは、
miR-124による細胞分裂停止現象は消え、対照群と同一に細胞周期が進行されるこ
とを観察した。
A干渉誘導変形配列のうちmiR-124-G4Uは、神経芽細胞の細胞分裂増殖を増加
させる機能を有することが分かった。
現を抑制できることを蛍光タンパク質レポータを用いて確認
上記の実施例でマイクロRNAが非正規的にシード配列でG:Aワブル配列を許容して
標的mRNAと結合することができ、これが新しい機能を有することができるという事実
を発見した後、このような結合が実際に標的遺伝子の抑制を起こすことができるかを細胞
水準で確認するレポータ実験を進めた。この際、確認実験は、心筋細胞であるh9c2の
ように筋肉系細胞で多く発現すると知られたmiR-1を対象に進め、特にmiR-1の
5’末端から7番目に存在するGに注目して、これを通したG:Aワブル塩基配列を対象
として行った(図13)。マイクロRNAによる遺伝子抑制は、より精密に個別細胞水準
で測定するために、蛍光タンパク質発現レポータシステムを構築して使用した(図13)
。蛍光タンパク質発現レポータシステムは、2つの色の蛍光タンパク質が1つのベクター
に発現するように構成され、この際、SV40プロモーターには、緑色蛍光タンパク質(
green fluorescent protein:GFP)が発現するようにし、
その3’UTR(3’untranslated region)部分にマイクロRNA
の標的サイトを複数個連続的に配列して、緑色蛍光タンパク質の強さを通じてマイクロR
NAによる遺伝子抑制効果を測定することができるようにし、同時に赤色蛍光タンパク質
(red fluorescent protein:RFP)は、TKプロモーターに
より発現するようにして、その強さ程度で緑色蛍光信号を標準化して使用した(図13a
、上)。
ら2番目から8番目まで塩基に対して相補的であり、7番目の塩基にGに対してはG;A
ワブルで塩基配列する非正規標的サイト(7G:A-site)を挿入してレポータを製
作した後(GFP-7G:A site)、これがmiR-1により抑制されるかを実験
を通じて確認した。この際、実験は、500ng GFP-7G:A siteレポータ
ベクターと25uMのmiR-1をlipofectamine 2000(Invit
rogen社)試薬を用いて会社で提供するプロトコルによって心筋細胞株であるH9c
2に同時に導入(co-transfection)し、24時間後にLife Tec
hnologu社のAttune NxTを通じてそれぞれの蛍光信号をフローサイトメ
トリー分析で測定した。その結果、miR-1の発現によってmiR-1の7G:Aサイ
トが非常に効率的に抑制(図13a、中間)されることを対照群核酸(cont;NT)
を導入した細胞(図13a、左側)と比較して確認した。すなわち、心筋細胞株であるh
9c2で2つの蛍光タンパク質の発現程度によって4つの部分(Q5-1、Q5-2、Q
5-3、Q5-4)で分析した結果、miR-1が導入された細胞の場合、対照群核酸が
導入された場合より103強さの赤色蛍光タンパク質と103強さの緑色蛍光タンパク質
を示す細胞の分布が59.51%(control:Q5-3)から41.80%(mi
R-1:Q5-3)に減少したことを観察した。
2細胞である程度抑制されていることが対照群で観察された。これは、h9c2細胞内で
すでに発現しているmiR-1によりレポータ標的mRNAとのG;Aワブル塩基配列を
通じて抑制すると予想することができる。このような点を確認するために、h9c2細胞
内のmiR-1の発現を抑制できるmiRIDIAN microRNA Hairpi
n inhibitor(miR-1 inhibitor、図13a、右側)をDha
rmacon社から購入して50uM濃度で細胞にトランスフェクションさせて使用した
。このような結果、対照群に比べて(図13a、左側)miR-1 inhibitor
を導入した場合(図13a、右側)、103強さの赤色蛍光タンパク質と103強さの緑
色蛍光タンパク質を示す細胞の分布が81.56%(miR-1 inhibitor:
Q5-3)に増加することから見て、細胞内に存在するmiR-1がmiR-1の7G:
Aサイトを通じて遺伝子発現を抑制することができることを確認した(図13a)。
対照群(GFP-no site)とmiR-1の7G:Aサイトが入ったレポータであ
るGFP-7G:A siteをH9c2細胞に導入してその活性を比較して確認し、陽
性対照群としては、miR-1を共に導入した場合と定量的に比較して確認した(図13
b)。この際の分析は、フローサイトメトリー分析器で測定した赤色蛍光タンパク質(R
FP)値を区間別に分け、この際の緑色蛍光タンパク質(GFP)値を平均を出してログ
比率で変換し、この際、対照群であるGFP-no siteの緑色蛍光タンパク質数値
を1に置いて(relative log GFP)相対的に計算した。この際、mR-
1と7番G塩基に対して、G:Aワブル(wobble)を通じて相補的に塩基配列され
るサイトがある場合(GFP-7G:A site)、特に1.5-3値の赤色蛍光タン
パク質の発現(log RFP)が見られる区間で、G:Aワブル(wobble)を通
した緑色蛍光タンパク質の発現(relative log GFP)が1より10%程
度低くなることを確認した。このような抑制は、陽性対照群では、特に1.5-4区間の
赤色蛍光タンパク質の発現(log RFP)で40%-10%程度緑色蛍光タンパク質
の発現(relative log GFP)が抑制されるパターンと同一に現れるとい
う点を観察した。
ロモーターの強さと2つの異なる蛍光タンパク質が有する蛍光活性度の差異によって影響
を受けないことを確認するために、2つの蛍光タンパク質を互いに変えられている蛍光タ
ンパク質レポータであるp.UTA.3.0(Lemus-Diaz N et al,
Scientific Reports,(7),2017)をAddgene(pla
smid # 82447)から購入して使用した。この際、レポータ実験は、p.UT
A.3.0ベクターでSV40プロモーターにより調節される赤色蛍光タンパク質(re
d fluorescent protein:RFP)の3’UTR部分にmiR-1
-7G;A配列を5回繰り返して挿入した後、レポータベクター(RFP-7G:A s
ite)を製作して進め、この際、赤色蛍光タンパク質発現数値は、Tkプロモーターで
発現する緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein:
GFP)値を細胞内に導入された程度を反映した標準化で使用して変形して使用した(図
13c、上)。その結果、以前の実施例と同一にmiR-1の7G;Aサイトがh9c2
で発現するmiR-1により抑制されることをmiRNA標的位置がないレポータ(RF
P-no site)の対照群とmiR-1の7G;A siteが入ったレポータ(R
FP-7G:A site)の結果を比較して確認し、同時に陽性対照群がmiR-1と
のco-transfectionでも以前の実施例のような現象を観察した(図13c
-d)。
標的が実際にマイクロRNAのシード配列でG:Aワブル配列を通じて結合することがで
きるだけでなく、当該標的遺伝子の発現を抑制することができることを確認した。したが
って、このような点から推察してみるとき、G;Aワブル配列を通した標的サイトを用い
てマイクロRNAと十分に結合することができ、このような点をmiRNA-GUを通じ
て類似に誘導できると、非正規的標的抑制によるマイクロRNAの生物学的機能のみを活
用できると考えられる。
ット遺伝子調節を通した心筋細胞の肥大化誘導機能確認
このような非正規的な遺伝子抑制現象は、G:Aワブル塩基配列がマイクロRNAの非
典型ターゲットとして作用して、生物学的機能を調節することもできるという可能性をm
iRNA-GUを通じて確認するために、以前の実施例で調べた心筋細胞のmiR-1を
中心に実験を進めた。
、miR-1が正規的な標的は認識せずに、非正規的なG:Aワブル配列標的サイトのみ
を認識するようにしなければならないので、miR-1のシード領域にあるGがCでない
Aと塩基配列するように当該GをUに置換して製作したmiRNA-GUを実験に使用し
た。本実験では、より生理学的に心臓と類似した条件で行うために、ラット(rat)の
心臓組織から1次心筋細胞(primary rat neonatal cardio
myocyte culture)を培養して行った。この際、心筋細胞の培養は、生後
1日目のラット(rat neonate)の心臓組織から酵素反応を通じて心筋細胞を
分離し(Cellutron社、neomyt kit)、心筋細胞は、10%FBS(
fetal bovine serum)、5%HS(horse serum)、10
0U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充したDulb
ecco’s改質Eagle’s培地(Invitrogen)とM199(WellG
ene)培地を4:1で混ぜて準備した培地にbrdUを添加して、心臓組織に存在する
細胞周期を有する他の細胞と区別して培養した。
た(図14a)。心筋細胞は、細胞周期を止め、心筋細胞の大きさを増加させることがで
きる特徴を有しているが、これを心筋肥大現象という。心筋肥大現象は、心筋細胞の機能
低下を補完する役割をし、心臓疾病の病理中間段階とも知られており、細胞形態学的観察
および遺伝子発現プロファイル変化がよく知られた心臓疾病モデルシステムである。心筋
肥大症の細胞モデルでは、フェニレフリン(PE)のようなアドレナリン作用性レセプタ
ー作用剤(agonist)を心筋細胞に処理すると、心筋肥大症を誘導することができ
る(Molkentin,JD et al,1998,Cell 93(2),215
-228)。したがって、培養した心筋細胞に100uMのフェニレフリンを処理して心
筋肥大を誘導し、これによって、何も処理しない対照群(図14a、rCMC)と比較し
て心筋細胞の大きさが増加することを形態学的に確認した(図14a、+PE)。また、
1次心筋細胞にmiR-1を導入したとき、心筋細胞の大きさが減少することを観察した
(図14a、右上側)。これは、よく知られた心筋肥大現象とmiR-1の心筋細胞での
機能と一致する(Molkentin,JD et al,1998,Cell 93(
2),215-228,Ikeda S et al,Mol cell boil,2
009,vol29,2193-2204)。
識せずに、非正規的なG:Aワブル配列標的サイトのみを認識するようにするために、こ
のようなGをUに置換したmiR-1をデザインし、これをGがある位置によって5’末
端基準2番目の位置(miR-1-G2U)、3番目の位置(miR-1-G3U)、7
番目の位置(miR-1-G7U)に適用して合成した。この際、図14に使用したmi
R-1の置換塩基配列は、次の通りであり(miR-1-G2U:5’p-UUGAAU
GUAAAGAAGUAUGUAU-3’;miR-1-G3U:5’p-UGUAAU
GUAAAGAAGUAUGUAU-3’;miR-1-G7U:5’p-UGGAAU
UUAAAGAAGUAUGUAU-3’)、これは、ガイド鎖で合成され、パッセンジ
ャー鎖は、従来のmiR-1のものをデザインしてBioneer社で化学的に合成製作
後、HPLCで分離、前記会社で提供した方法によってガイド鎖とパッセンジャー鎖の二
重体(duplex)で製造して使用した。当該マイクロRNAの1次心筋細胞株への導
入(transfection)は、RNAimax(Invitrogen社)試薬を
用いて50uM濃度で行った
1次心筋細胞培養に導入したとき、心筋細胞の形態が心筋肥大を誘導した細胞(図14a
、+PE)と類似した水準に大きくなったことを観察することができた(図14a)。こ
の際、それぞれの細胞の大きさを定量的に分析するために、100個以上の細胞がイメー
ジJプログラム(NIH)を通じて定量化され、これによって、miR-1のG:Aワブ
ル配列サイトのみを認識するように合成したmiR-1置換体(miR-1-G2U、m
iR-1-G3U、miR-1-G7U)が全部対照群(NT)核酸を導入したときと比
較して約1.5~1.8倍程度その大きさが大きくなったと分析された。これは、フェニ
レフリン(PE)薬物が誘導する心筋細胞肥大症モデルの心筋細胞の大きさと類似した水
準であり、miR-1自体は、心筋細胞形態上では細胞の大きさを減少させる効果を示す
ことによって、その正規的な標的抑制効果がG;Aワブルを通した標的抑制とは細胞形態
学上で異なる機能を示すことを観察した(図14b)。また、追加的に本実施例で観察し
た心筋肥大現象を分子的水準で確認するために、マーカーでその発現が増加すると知られ
たANP(atrial naturiuretic peptide)遺伝子の発現を
qPCR(Quantitative Polymerase Chain React
ion)実験を通じてGAPDHと比較して相対的な値で測定してみた(図14c)。そ
の結果、miR-1のG:Aワブル配列サイトのみを認識するように合成したmiR-1
置換体(miR-1-G2U、miR-1-G3U、miR-1-G7U)を心筋細胞に
導入した場合には、全部ANP発現量を対照群(NT)に比べて1.2~1.5倍程度有
意に増加させたことを4回の反復実験を通じて確認することができた。このようなANP
発現増加は、フェニレフリン(PE)薬物を処理した心筋細胞実験群が対照群に比べて大
きさが約2倍程度増加したことよりは少ないが、本来のmiR-1が導入されたとき、か
えってANP発現が有意に減少する現象とは反対になることであって、これを通してmi
R-1は、G:Aワブル配列サイトを通じて完全に異なる生物学的機能を示すと見ること
ができる。
、従来の正規的な標的認識とは生物学的に異なる機能を示すことができるという点が最終
的に分かった。このような発見は、マイクロRNAの正規的な標的を通した機能と非正規
的標的を通した機能が互いに異なることを示し、このような点から推察してみるとき、マ
イクロRNAのG:Aワブル標的のみを抑制できると、G:Aワブル標的により起こる生
物学的機能のみを選択的に制御することができる。
症の誘導観察
G:Aワブル塩基配列がマイクロRNAのシード部分に作用して認識する非正規的標的
現象に対して、追加的にその生物学的機能を心筋細胞で確認するために、以前の実施例で
調べたmiR-1以外に心筋細胞で機能をすると知られたmiR-133に対してmiR
NA-GUを適用してみた。miR-133は、筋細胞発達および疾病病理を調節し、心
筋肥大現象の抑制機能を有すると知られた(Nat Med.2007,13(5):6
13-618;Ikeda S et al,Mol cell boil,2009,
vol29,2193-2204)。したがって、本発明者は、miR-133の非正規
GA配列ターゲットサイトのうち5’末端基準4番目のGを通じて行われる標的認識を特
異的に抑制する干渉誘導核酸であるmiR-133-G4U(5’-UUUUGUCCC
CUUCAACCAGCUG-3’)を上記の実施例のようにバイオニア社で合成製作し
て、50nM濃度の二重体でRNAiMAX試薬(Invitrogen社)を用いて心
筋細胞株h9c2に伝達させてその細胞形態上の変化を観察した(図15a)。その結果
、miR-133-G4Uの発現がH9c2細胞の大きさを対照群(NT)に比べて増大
させ(図15a)、100個以上の細胞の大きさをイメージJ(NIH)プログラムを通
じて定量的に分析した結果、約2倍程度有意に増加させることを確認することができた(
図15b)。
ードターゲット発現低下は、心肥大症を誘導し、これは、心肥大症を抑制するmiR-1
33の正規シード標的阻害機能とは異なる新しい機能であることを類推することができる
。
の発現阻害効果をルシフェラーゼレポータを通じて確認
以前の実施例10でmiRNAが非正規的にG:Aワブル配列シードサイトと結合する
という発見で、このような非正規的標的結合のみを特異的に認識するようにするmiRN
A-GUを発明することになり、これをmiR-124、miR-1、miR-133に
適用したとき、従来の機能とは異なる効果が現れることを実施例11、12、13、14
で観察した。そして、また、実際にマイクロRNAに非正規的G:Aワブル配列シードサ
イトを有している標的遺伝子の発現を阻害できるかを確認するために、実施例13におい
てmiR-1を対象として心筋組織細胞株でその機能を確認した。追加的に肝組織と肝癌
細胞に特異的に発現するmiR-122を対象として非正規G:Aワブル配列シード標的
遺伝子の発現を阻害できるかをルシフェラーゼレポータシステムを使用して確認しようと
した(図16)。
’シード基準1-8番塩基:5’-UGG AGU GU-3’)に5’末端基準2番目
、3番目、5番目、7番目にG:Aワブル配列をすることができるGを有している。した
がって、優先的には、このうち2番目のGが非正規的にG:Aワブル配列を通じて認識で
きる当該標的サイトを対象にその抑制効率を測定するために、実施例2で進めた同じ方法
でIC50(Inhibitory concentration 50)を測定して正
規的シードサイトと比較して調べた(図16a)。
に対してGA塩基配列が可能な非正規GA配列シードターゲットの発現抑制を感知するた
めに、miRNA-122の2番G塩基に対する非正規GA配列シードサイト(2G:A
)配列(5’シード基準1-9番塩基:5’-CAC ACU CAA-3’)をpsi
-check2(Promega社)ベクター内にあるレニラルシフェラーゼ遺伝子の3
’UTR(3’untranslated region)部分に5回連続的に配列され
るように導入して製作した。また、同時に正規シードサイト(5’シード基準1-9番塩
基:5’-CAC ACU CCA-3’)に対するルシフェラーゼレポータベクターも
同一に製作した。
な濃度で正規シードサイト(seed site)と5’末端基準2番目のGを通した非
正規GA配列シードサイト(2G:A site)を有する標的遺伝子の発現阻害効果を
当該ルシフェラーゼレポータの活性の変化で測定し、IC50(inhibitory
concentration 50)値を調べた結果、miR-122は、正規シード標
的サイトに対しては、約0.5nM、非正規GA配列シードサイト(2G:A site
)に対しては、約7nMで測定され、miR-122が非正規GA配列シードサイト(2
G:A site)を有する遺伝子の発現を抑制することを確認し、その効率は、正規シ
ードサイトに比べて低いことが分かる(図16a)。また、遺伝子発現抑制が始まる濃度
を非正規GA配列シードターゲットでルシフェラーゼレポータで調べたとき、1.5nM
以上の濃度条件でルシフェラーゼ酵素活性が阻害されることを確認した(図16a)。こ
れは、miR-122が正規シードターゲットサイト発現を抑制することと約2倍程度抑
制効率の差異を示した。
様々な濃度(0、1、5、10、25nM)で当該psi-check2ベクター(50
ng)とともにLipofectamine 2000試薬(Invitrogen)を
用いて製造者のプロトコルによって略10,000個の肝癌細胞株(Huh7、KCLB
:60104)に伝達(co-transfection)させて96wellで培養し
て進め、実施例2で行った方法と同一にルシフェラーゼ活性を測定して実行した。
認した後、これが細胞内に存在するmiR-122により同一に調節されるかを確認する
ために、miR-122が存在する肝癌細胞であるHuh7細胞株を使用して、5’末端
基準2番目のGおよび3番目のGにより起こる非正規GA配列シードサイト(2G:A)
に対するルシフェラーゼレポータ実験を行った(図16b)。このような実験を進めるた
めに追加的に5’末端基準3番目のGにより起こる非正規GA配列シードサイト(3G:
A)に対するルシフェラーゼレポータベクター(luc-3G:A site)、5’末
端基準2番目と3番目のGにより共に起こる非正規GA配列シードサイト(luc-2G
:A、3G:A site)に対するルシフェラーゼレポータベクター、全体miR-1
22の配列に完全相補的な配列を測定するルシフェラーゼレポータベクター(luc-P
M site)を上記に記述された同じ方法で製作し、5’末端基準2番目のGにより起
こる非正規GA配列シードサイト(2G:A)に対するルシフェラーゼレポータベクター
(luc-2G:A site)とともに肝癌細胞株に導入後、ルシフェラーゼの活性を
測定して実験した(図16b)。
eベクターを導入したとき、その活性がルシフェラーゼベクター自体のみが導入された対
照群に比べて約50%程度減少することを観察して、Huh7細胞にmiR-122が存
在することを確認し、同時にmiR-122は、3番非正規GA配列シードターゲットレ
ポータ(Luc-3G:A)、2、3番非正規GA配列シードターゲットレポータ(Lu
c-2G:A、3G:A)の活性を抑制することを確認することができた。また、このよ
うな抑制効果がmiR-122により誘導されたのかを確認するために、miR-122
の発現阻害剤(hsa-miR-122-5p inhibitor、IH-30059
1-06-0010)をダーマコン社で購入して50nMで処理し、この際、このような
すべての抑制現象が消えることを確認した。
5’末端基準2番非正規GA配列シードターゲットの発現を抑制することができるという
事実を確認し、また、肝癌細胞であるHuh7に自然的に存在するmiR-122は、5
’末端基準3番非正規GA配列シードターゲット遺伝子と、2、3番非正規GA配列シー
ドターゲット遺伝子の発現を抑制するという事実が分かった。特に肝癌細胞であるHuh
7で行われる抑制効果は、miR-122の発現阻害剤の処理によって消えることで、m
iR-122による調節であることを確認した(図16b)。したがって、miR-12
2は、非正規GA配列シードターゲット遺伝子の発現を抑制する調節機能があることが分
かる。
した肝癌細胞株の細胞移動阻害現象確認
miR-122の非正規GA配列シード標的の肝癌細胞内機能を調べるために、当該非
正規GA配列シード標的サイトを相補的に認識して阻害するmiRNA-GUを適用して
、これを肝癌細胞であるhepG2に導入した後に、肝癌細胞の性質のうち癌転移に重要
な細胞移動能力がどのように変るかを創傷治癒分析(wound healing as
say)を行って調べた。
準2番非正規GA配列シードターゲット、3番非正規GA配列シードターゲット、2、3
番非正規GA配列シードターゲットに相補的に認識するmiRNA-GUを当該配列で合
成した後、これを上記実施例で実行した同じ方法でhepG2細胞内に導入し、24時間
培養後、1000ulチップを用いて細胞培養層(cell layer)にスクラッチ
(scratch)を作り、細胞を48時間まで培養しながら、各実験群の細胞が移動す
ることを対照群であるNT-6piを導入したことと比較観察して進めた。この際、実験
に使用された干渉誘導核酸の配列は、次の通りである(miR-122:5’-UG G
AG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3’;miR-122-G2U
:5’-UU GAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3’;miR
-122-G3U:5’-UG UAG UGU GAC AAU GGU GUU U
G-3’;miR-122-G2,3U:5’-UU UAG UGU GAC AAU
GGU GUU UG-3’)。
は、48時間細胞培養時に、作られたスクラッチがほぼ充填される細胞移動を観察するこ
とができた。しかしながら、miR-122-G2U、miR-122-G2,3U s
iRNAが伝達された実験群では、このような細胞移動が阻害されることを示し、このよ
うな阻害現象は、miR-122-G2,3U siRNAが伝達された実験群で最も強
く示された(図17a)。これを定量的に測定してみた結果、miR-122-G2U、
miR-122-G2,3U siRNAの場合、対照群に比べて2~3倍細胞移動が阻
害されたことを確認した(図17b)。当該定量分析は、miR-122の細胞移動を細
胞形態上で観察した後、この観察結果をイメージJプログラム(NIH)を用いて分析し
て測定した。追加的に、miR-122-G3U siRNAが誘導する細胞移動を実験
を進めた結果、miR-122-G3Uによっては細胞移動阻害機能を観察することがで
きなかった(図17c-d)。
し、これは、2番塩基のGA配列が優先的に作用し、引き続いて添加的に3番塩基のGA
配列が加えられる場合、細胞移動阻害機能の強化が誘導されるという点が分かる。
る細胞周期停止(cell cycle arrest)の増加確認
細胞の移動は、細胞分裂と密接に関連しており、特に癌細胞で多く観察されている(C
ancer research,2004,64(22):8420-8427)。した
がって、miR-122-G2,3Uが誘導する肝癌細胞移動の阻害が細胞周期調節と関
係があるかを確認するために、実施例12での同じ方法でフローサイトメトリー分析実験
を進めた。この際、NT-6pi、miR-122、miR-122-G2、miR-1
22-3U、miR-122-G2,3Uを肝癌細胞株であるHepG2に伝達した後、
各細胞の細胞周期を測定した結果、miR-122-G2,3Uが伝達された実験群で、
G0/G1分布を示した細胞の比率が対照群(NP-6pi)の平均52%から68%に
増加したことを確認し、G2/M期の細胞分布が顕著に低いことを確認した(図18)。
しかしながら、miR-122、miR-122-G2U、miR-122-G3Uは、
対照群に比べて有意な差異点を観察しなかった。この際、細胞周期分析実験は、合成され
た当該siRNA二重体を50nM濃度でHepGに伝達して、24時間培養し、Mus
e Cell Cycle Kit(Catalog No.MCH100106、Mi
lipore)を用いて、当該会社が提供するプロトコルによって実験を行い、Muse
Cell Analyzer(Milipore)で測定した。
M)を低減し、細胞周期停止状態(cell cycle arrest:(G0/G1
))を誘導することを確認し、これにより、本実施例の結果は、miR-122が非正規
GA配列シードサイトを5’末端基準2番目のGと3番目のGの両方を同時にG:Aワブ
ル配列して認識して、肝癌細胞周期の進行を防ぐ機能を示すと解析することができる。
規GA配列シード標的調節による細胞周期停止状態誘導観察
miR-122の非正規GA配列シード標的の機能は、以前の実施例17でmiR-1
22-G2,3Uが肝細胞の移動を阻害する機能があるという点を把握し、この際、特に
miR-122-G2,3Uの発現により誘導される細胞移動の阻害は、2番G塩基の非
正規GA配列シード標的調節の生物学的機能に3番G塩基の調節効果が添加される場合、
その機能が最大化されることを観察した(図17)。したがって、miR-122の2,
3,7番G塩基が追加的な組合せで非正規GA配列シード標的阻害の生物学的機能が変化
することかを調べるために、miR-122-G7U、miR-122-G3,7U、m
iR-122-G2,7U siRNAの細胞周期調節機能を追加的に確認する実験を行
った。
方法と同一に当該miRNA-GU二重体で製造して50nM濃度で細胞にトランスフェ
クションした。しかしながら、今回の細胞周期観察では、24時間培養後、ノコダゾール
(nocodazole)を100ng/mlで16時間の間処理してG2/M(分裂準
備期/分裂期)にHepG2細胞を同期化(synchronization)した後、
どれほど多い数の細胞がG2/Mで止まっているかによってG0/G1での細胞周期停止
状態の細胞の量をMuse Cell Analyzer(Milipore)フローサ
イトメトリー分析器で測定した(図19)。
止状態であるG0/G1にある細胞数が差異がなかったが、miR-122-G2,3U
siRNA、miR-122-G2,7Uのように2番目のGに添付的に非正規GA配
列シードターゲットサイトを調節する場合、細胞周期停止状態(G0/G1)の比率が増
加することを確認することができた(図19a)。しかしながら、miR-122-G3
,7Uは、特別な増加を示さなかった(図19a)。これを定量的に分析してみると、m
iR-122-G2,3U siRNAが伝達された実験群の場合、対照群に比べて約2
倍以上細胞周期停止状態(G0/G1)の比率が増加し、引き続いてmiR-122-G
2,7U実験群では、約1.5倍に細胞周期停止状態(G0/G1)の比率が増加するこ
とを観察した(図19b)。
siRNAによる非正規GA配列シード標的の調節を通じて細胞周期中止状態を増大さ
せることができることを確認した。
列シード標的調節が誘導する細胞周期停止状態誘導観察
抗癌調節(Tumor suppressor)機能をする代表的なマイクロRNAと
しては、let-7 familyがある。これは、美しい小さな線虫の発達過程を調節
する機能が報告(Nature,2000,403(6772):901-906)され
た以後、多様な癌細胞で抑制された発現(Cancer Res.,2004,64(1
1):3753-3756)および腫瘍形成過程(Tumorigenesis)調節を
通した抗癌機能(Cell,2005,120(5):635-647;Genes D
ev.2007,21(9):1025-1030)が報告されてき、これを基に癌診断
および抗癌剤開発の可能性を有する重要な遺伝子として研究されてきた。これにより、本
発明者らは、let-7の非正規GA配列シード標的の阻害が誘導する生物学的機能を調
べる実験を進めた。
AGU-3’であって、G:Aワブル塩基配列をすることができるGは、2番目、4番
目、5番目、8番目に存在する。本発明者は、このうち2番目と4番目のGに注目し、こ
れをmiRNA-GUで変形して合成し、これを肝癌細胞株であるHepG2細胞に導入
した後、細胞周期でいかなる影響を及ぼすかを以前の実施例19で実施した方法と同一に
実験を行った。この際、合成して使用したlet-7に対する塩基配列は、次の通りであ
る(let-7a:5’-U GAG GUA GUA GGU UGU AUA G
UU-3’;let-7a-G2U:5’-U UAG GUA GUA GGU UG
U AUA G UU-3’;let-7a-G4U:5’-U GAU GUA GU
A GGU UGU AUA G UU-3’;let-7a-G2,4U:5’-U
UAU GUA GUA GGU UGU AUA G UU-3’)。
さなかったが、let-7a-G2Uとlet-7a-G2,4Uは、G0/G1での細
胞周期停止状態を増加させ、let-7-G4Uは、かえってG2/Mにある細胞の量を
増加させて細胞周期を速く進行させることを観察することができた(図20a)。これを
4回の反復実験で定量化してみると、let-7a-G2U実験群の場合、G1/G0細
胞の分布が対照群(Nt-6pi)と比較時に、約1.5倍程度増加し、G2/M細胞の
分布が減少することを観察することができた(図20b)。これを通してlet-7aの
2番非正規GA配列シードターゲットの発現抑制は、HepG2細胞の細胞周期停止状態
を誘導することを確認することができた。引き続いて、let-7aのシードに存在する
4番G塩基の場合、単独GA配列(let-7a-G4U)では、HepG2の細胞周期
停止状態を誘導を減少させ、かえってG2/M状態に速く進行されて、ノコダゾール薬物
処理で多くの細胞数が留まる結果を示した。また、2番と4番が同時にGA配列する場合
(let-7a-G2,4U)、HepG2の細胞周期停止状態誘導を観察することがで
きた。このような細胞周期停止状態は、let-7aが伝達されたHepG2細胞で観察
されなかった(図20b)。したがって、let-7aの2番と2,4番非正規GA配列
シードターゲットの発現抑制は、HepG2細胞の細胞周期停止状態を誘導して、これは
、let-7aが本発明者が行ったHepG2細胞調節で見られる機能とは全く異なる機
能であることを確認した。
配列サイトの遺伝子を抑制することによって癌細胞周期停止を促進させる役割をし、さら
に好ましくは、5’末端基準2番Gと4番Gが共にG;Aワブル配列で作用するとき、そ
の効果が最も大きいことが分かる。また、let-7の5’末端基準4番Gを通した非正
規GAシード配列サイトは、かえって癌細胞の細胞周期進行を促進させて、癌細胞の増殖
を誘導すると思われる。
列シード標的阻害が誘導する逆分化促進をOCT4プロモーターレポータで観察
分化した細胞は、いくつかの転写因子の人為的な発現で分化能をさらに獲得することが
でき、最終的にさらに胚芽細胞のような全能分化能を獲得した細胞を逆分化細胞(ind
uced pluripotent stem cell)という。このような技術は、
ラットの胚性線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast:M
EM)に4個の因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)を導入して、幹
細胞のように分化多様性を有する誘導万能幹細胞(iPS cell:inducibl
e pluripotent stem cell)を作ることができることが報告され
た(Cell,2006,126(4):663-676)。同様にヒトの体細胞に4個
の因子(OCT4、SOX2、NANOG、およびLIN28)伝達を通じて誘導万能幹
細胞を作ることができることが報告されたことがある(Science,2007,31
8(5858):1917-1920)。これは、逆分化(dedifferentia
tion)過程を経て万能に分化できる再生可能性をヒト細胞を含む任意の細胞を通じて
も作り出すことができるという点からその応用可能性が非常に高い分野であり、最初発見
後に、誘導万能幹細胞生成の効率性を高めるための努力が持続してきた。その一環として
報告されたマイクロRNA誘導万能幹細胞(mirPS)も、効率的に万能性(plur
ipotency)を誘導する方法の1つであって、miR-302aとmiR-372
のようなマイクロRNAが単独でまたは4個の因子(Oct3/4、Sox2、c-My
c、Klf4)とともに細胞を逆分化させる機能が報告された(RNA,2008 14
(10):2115-2124;Nat Biotechnol.2011,29(5)
:443-448)。したがって、本発明者らは、miR-302aとmiR-372の
非正規GA配列シード標的発現の阻害が細胞を逆分化させる過程を促進することができる
かを調べる実験を進めた。
化すると報告されたOct4プロモーターとこれに依存して発現する緑色蛍光タンパク質
が含まれたプラスミドを購入した(Addgene #21319)(図21a)。この
ようなOct4発現レポータベクター(pOct4:GFP)を分化した子宮頸癌細胞H
eLaに導入したときは、緑色蛍光タンパク質が発現しないが、当該細胞が逆分化して分
化能を獲得したときは、Oct4発現レポータで緑色蛍光タンパク質が発現することにな
る。このようなOct4発現レポータベクターとともに逆分化を起こすものと知られたマ
イクロRNAであるmiR-302a、miR-372を対象として実験を行った。mi
R-302aとmiR-372のシード配列のうち5’末端基準2番目から8番目の配列
は、「AA GUG CU」であり、したがって、非正規GA配列シード配列は、5’末
端基準4番目のGと6番目のGを通じて可能である。しかしながら、本発明者らは、4番
目のGに注目してmiR-302-G4U、miR-372-G4Uを合成して実験を行
った。
P)をLipofectamine 2000(Invitrogen社)試薬を用いて
製造社のプロトコルによって伝達した後、ヒトmiR-302とmiR-372配列に基
づいてガイド鎖とパッセンジャー鎖を上記実施例のようにバイオニアで合成製作して、二
重体で製造し、RNAimax(Invitrogen社)試薬を用いて50nM濃度で
順次的伝達をした。また、miR-302とmiR-372の非正規GA配列シード標的
特異的siRNAの製作は、シード内G塩基をUに置換して上記例と同一に準備して、5
0nM濃度で細胞に伝達した。これに使用された核酸の塩基配列は、次の通りである(m
iR-302:5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA-3’;miR
-302-4GU:5’-UAAUUGCUU CCAUGUUUUGGUGA-3’;
miR-302パッセンジャー鎖:5’-ACUUAAACGUGGAUGUACUUG
CU-3’;miR-372:5’-AAAGUGCUGCG ACAUUUGAGCG
U-3’;miR-372-G4U:5’-AAAUUGC UGCGACA UUUG
AGCGU-3’、miR-372パッセンジャー鎖:5’-CCUCAAAUGUGG
AGCACUAUUCU-3’)。このようにレポータベクターとRNAを導入したHe
La細胞は、14日間10%FBS(fetal bovine serum)、100
U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充したDulbe
cco’s改質Eagle’s培地(Invitrogen)で培養し、トランスフェク
ション実行時は、抗生剤ない完全培地で細胞を培養した。
比べて群集形態(colony)の細胞成長を示したが、Oct4プロモーターの活性を
示す緑色蛍光タンパク質発現が14日培養時期までは観察されなかった。しかしながら、
miR-302とmiR-372非正規GA配列シード標的抑制siRNAが導入された
実験群では、群集形態の細胞成長だけでなく、Oct4プロモーターの活性を示す緑色蛍
光タンパク質発現が観察され(図21b-c、赤色矢印)、これは、miR-302とm
iR-372とそれぞれの非正規GA配列シード標的抑制siRNAが同時に細胞に伝達
されたとき、さらに強くて且つ大きい緑色蛍光タンパク質発現細胞群集を観察することが
できた(図21b-c)。これを基にmiR-302とmiR-372非正規GA配列シ
ード標的の阻害は、細胞を逆分化させ、Oct4発現を通じて分化能を獲得することを促
進することができるという点が分かる。
のmiR-372、miR-302のみを単独で発現させて細胞の逆分化を起こすことよ
り効率的に細胞の逆分化を促進させることができるという点を観察することができ、これ
によって、miR-372-G4UとmiR-302a-G4Uは、細胞の逆分化を促進
させる素材に使用され得るという点が分かる。
核隆起標的を抑制しない現象を確認
上記実施例において、非正規核隆起ターゲットが正規シードターゲットとは全く異なる
新しい生物学的機能を示し、したがって、非正規核隆起ターゲットの発現阻害のみを調節
するRNA干渉誘導核酸であるmiRNA-BSを発明し、その機能を確認した。しかし
ながら、miRNA-BSの場合にも、従来のmiRNAの非正規核隆起サイトを相補的
に配列するようにそのシード配列が変わったが、変わったシード配列を通じてさらに新し
い核隆起サイトが生じることを確認することができた。したがって、miRNA-BSの
ようなRNA干渉誘導核酸が正規シード配列のみを認識し、非正規核隆起サイトは認識し
ない技術が必要になることが分かった。これにより、本発明者らは、非正規核隆起結合を
するためには、シード配列において5’末端基準6番位置の塩基が重要であり、この6番
位置に塩基配列の配列強さによって非正規核隆起結合が起こる程度が変われることに注目
して、6番位置の塩基配列強さを減らす目的で、次のような実験を進めた。すなわち、m
iR-124の6番ヌクレオチドのリボース環の2’位にメチル基(2’OMe)を入れ
て変形し、変形された干渉誘導核酸(miR-124-6me)がmiR-124の非正
規核隆起ターゲット阻害機能があるかをルシフェラーゼレポータ実験で観察した。2’O
Me変形されたmiR-124は、合成(バイオニア社)を通じて製造し、以前の実施例
2で行った方法と同じ方法でルシフェラーゼレポータ実験を進め、遺伝子抑制効率をIC
50で測定した(図22a)。この際、使用したルシフェラーゼレポータベクターは、m
iR-124の正規シードサイト(Luc-seed)と非正規核隆起サイト(Luc-
nucleation bulge)に対するものを使用した。
消え、反面、正規シードサイトを通した遺伝子発現抑制は、IC50値が0.3nMであ
り、2’OMeを6番目ヌクレオイドに加えても、依然として優れた抑制効果を示すこと
が観察された(図22a)。追加的に同じ方法でmiR-124でなく、他のマイクロR
NAであるmiR-1の6番目ヌクレオイドに2’OMeを適用し(miR-1-6me
)、これをmiR-1の正規シードサイト(Luc-seed)と非正規核隆起サイト(
Luc-nucleation bulge)を含むルシフェラーゼベクターで標的に対
する遺伝子発現阻害効果を調べたとき(図22b)、以前のmiR-124での結果と同
一に、miR-1による非正規隆起標的遺伝子阻害効果が消え、反面、正規シードサイト
を介した遺伝子発現抑制は、IC50値が0.7nMと優れていることことを確認するこ
とができた。上記の実施例を通じて、RNA干渉を誘導する核酸の5’末端基準6番目に
2’OMe変形を加えると、当該RNA干渉誘導核酸により誘導される正規シード標的遺
伝子の発現抑制効果は維持され、非正規核隆起標的遺伝子の発現抑制は消えることを確認
することができた。
mRNAを抑制しないことをRNA-Seq分析で確認
上記実施例22においてmiR-1の6番目のヌクレオイドに2’OM変形を加えると
(miR-1-6me)正規シード標的遺伝子の発現抑制効果は維持され、非正規核隆起
標的遺伝子の発現抑制は減少することを確認した。したがって、本発明者らが発明したm
iR-1-6meが実際にmiR-1機能に関連したすべての遺伝子が発現している心筋
細胞株であるh9c2の転写体でmiR-1の非正規隆起標的遺伝子の抑制機能が減少し
たかを確認するために、miR-1とmiR-1-6meをh9c2細胞に導入した後に
RNA-Seq分析を施行した。RNA-Seq実験は、実験対照群として美しい小さな
線虫(C.elegans)のマイクロRNAであるcel-miR-67の配列で5’
末端基準6番を非塩基に変換したもの(NT-6pi)を使用して実施例7と同じ方法で
実験を行った。この際、RNA-Seqライブラリーは、Lexogen社のSENSE
Total RNA-Seq Library Kitを使用して製作し、その後、I
llumina社のMiniSeqを使用してシーケンシングした。
プログラムでラット遺伝体配列(rn6)にマッピングし、Cufflink、Cuff
diffプログラムで発現値(FPKM)を求めて、対照群NT-6piを導入したh9
c2細胞での結果で標準化してログ比(Fold change,log2 ratio
)で示して分析を実施した。この際、マイクロRNAの標的サイトを有している遺伝子の
伝令RNAの量が当該マイクロRNAの発現で阻害されるかをRNA-Seq結果で分析
するために、miR-1の正規シードサイト(5’末端基準2番目から8番目までと塩基
配列する7mer)を3’UTRに有している遺伝子を選別し、このようなプロファイル
結果を当該マイクロRNAの発現に依存的に阻害される順に累積比率(cumulati
ve fraction)で比較分析した(図23a)。その結果、miR-1とmiR
-1-6meが全部miR-1の正規シードサイトを3’UTRに有している遺伝子(s
eed)を全体遺伝子(Total mRNA)の分布に比べて非常によく抑制すること
ができることを確認した。その後、同じ方法でmiR-1の非正規隆起サイト(nuc、
7mer)を3’UTRに有している遺伝子に対しても累積比率で分析して、miR-1
-6meによりmiR-1の非正規核隆起標的遺伝子の発現阻害が減少したかをmiR-
1が導入された細胞とmiR-1-6meが導入された細胞内での当該標的mRNAの量
を相対的に比較してみた(図23b)。その結果、miR-1では、miR-1-6me
での発現と比較したとき、全体遺伝子(Total mRNA)に比べて有意に相対的に
非正規核隆起標的遺伝子が依然として阻害されることを観察し、これを通してmiR-1
-6meで当該非正規核隆起標的遺伝子の発現抑制が減少することを確認することができ
た。
来の正規シード標的遺伝子とともに非正規隆起標的遺伝子を共に効率的に抑制するが、6
番目のヌクレオイドに2’OMe変形を加えたマイクロRNA(miRNA-6me)は
、依然として正規シード標的遺伝子を抑制するが、非正規隆起標的遺伝子は抑制しないこ
とが分かった。したがって、5’末端基準6番目に加える2’OMe変形は、miRNA
-BSに適用して当該miRNAの非正規核隆起サイトのみを特異的に抑制しようとする
本来の意図は維持しつつ、新しく現れることができる非正規核隆起結合は完全に除去する
ことによって、その副作用を最小化することができる。
合するマイクロRNAの同定
マイクロRNAが非正規核隆起サイトのみを認識して抑制できるように作った発明が適
用され得るマイクロRNAを同定するために、マイクロRNAの標的を転写体水準で分析
できる方法であるAgo HITS CLIP実験結果を分析して、非正規核隆起サイト
に結合するマイクロRNAを分析した。まず、生まれて13日が過ぎったマウス(p13
)の大脳皮質で行ったAgo HITS-CLIPデータを実施例10での方法と同一に
配列分析して、まず、アルゴノートとともに結合する発現上位20個のマイクロRNAが
標的mRNAと非正規核隆起サイトと結合するという事実を確認した(図24a)。した
がって、当該マイクロRNA(図24b)は、シード部分の塩基配列を通した標的mRN
Aを認識するとき、シード部分を通した正規的な塩基配列だけでなく、非正規的に核隆起
サイトを通じて標的mRNAと結合できることが分かった。
心臓組織で行った他のAgo HITS-CLIP結果(boudreau RL et
al,2014,Neuron,81(2)294-305,Spengler RM
et al,2016,Nucleic Acids Res,44(15)7120
-7131)を上記の実施例と同じ方法で分析し、Agoと当該マイクロRNAが結合す
る正規シードサイトおよび非正規核隆起サイトの頻度数を計算した(ヒト脳マイクロRN
A、表1;ヒト心臓マイクロRNA、表2)。
正規核隆起サイトと結合しているという事実を確認することができた。したがって、上記
実施例でAgo HITS-CLIPを分析したすべてのデータを総合して発掘されたマ
イクロRNAに対して、非正規核隆起サイトを正規シードサイトと認識するように変形さ
せる本発明を適用すると、下記表3に示されているように、トータル426個の配列(B
S sequence)でRNA干渉核酸の5’末端基準2番目から7番目までのヌクレ
オイドが構成され、このように変形されたRNA干渉核酸は、当該マイクロRNAの非正
規隆起標的のみを結合し、当該機能のみを示すことになる。
組織細胞で非正規隆起標的に結合するマイクロRNAを同定し、これに非正規核隆起サイ
トを正規シードサイトと認識するように変形させる本発明を適用すると、トータル426
個の配列(BS sequence)が作られることになり、これによって、マイクロR
NAの非正規標的抑制機能のみを示す技術を完成した。
変異を分析し、これを通して非正規G:Aワブルシード配列サイトに結合するマイクロR
NAの同定
上記の実施例を通じてマイクロRNAが非正規的にG:Aワブルサイトと結合して標的
遺伝子発現を阻害するという事実を確認し、これを通して本発明で非正規G:Aワブルサ
イトを正規シードサイトと認識するように配列を変形するマイクロRNA配列変換方式(
miRNA-BS)を開発した。このように従来のマイクロRNAシード配列にあるGを
通じてワブル配列で標的mRNAのAと結合することがマイクロRNAの機能を変える場
合、このような機序が腫瘍のような疾病でマイクロRNAの配列変異を通じて現れること
ができるという考えから、癌患者の組織でマイクロRNAをシーケンシングした結果(m
iRNA-Seq)を分析した。この際、癌患者マイクロRNA配列実験関連TCGAデ
ータベースから8105個を得、追加でGene Expression Omnibu
s(GEO)データベースから癌関連マイクロRNA配列結果468個を得て、トータル
8,573個の腫瘍マイクロRNA配列結果を実施例10で使用した方法と同一にbow
tie2プログラムを通じてマッピングし、変異が起こった部位を分析した。この際の各
癌の種類別に分析に使用されたマイクロRNA配列データは、図25aに示されているの
と同じである。
位置(position)別に区分して最も多く起こった変異10,000個(top
10000)と最も少なく起こった変異10,000個(bottom 10000)の
分布を調べた結果(図25b)、最も多く起こった変異10,000個の場合には、マイ
クロRNAのシード部分(2番目から8番目の間)に主に起こるという点を観察すること
ができた。また、最も多く起こった変異100個と最も少なく起こった変異100個をh
eatmap上で調べたときにも(図25c)、上記で実施例と同一に変異がシード領域
に集まっていることが分かった。このようにシード部分に現れる傾向性を示す腫瘍マイク
ロRNAの配列変異は、これを逆転写させてDNAで配列分析した当該結果で塩基構成と
してそれぞれA、T、C、Gに区分して調べたとき、ただGのみがシード配列で形成され
る傾向性を示した(図25d)。このような傾向性は、上位変異率100個に対してだけ
でなく、これを超えて変異が起こるすべての場合に、Gで主に変異が起こることをさらに
確認することができた(図25e)。
側の標的mRNAのAをさらによく結合するために、Uに変異されて現れる現象であり得
、実際に上位変異率で現れるGに起こる変異でどんな塩基に変わったかを分析してみた結
果(図25f)、大部分が逆転写させてDNAで配列分析した当該結果でGからTに変わ
ったことを観察した。このような結果は、マイクロRNAが実際に癌組織ではシード部分
に存在するGが非正規G:Aワブルシード標的をさらによく正規シードと認識するために
、自分のGをUに変えて標的のAと塩基配列することを意味し、したがって、このような
方式の変異は、本発明で開発した非正規G:Aワブルシード配列を正規シード配列と認識
するようにする配列決定方式をいかなるマイクロRNAのどんな位置のGに適用しなけれ
ばならないかを知らせる。したがって、このような結果を全部総合して、癌患者当たり正
規化変異頻度数が2以上であるマイクロRNAを選定した(表4参照)。表4に示されて
いるように、トータル335個の配列(sequence(G>U))でRNA干渉核酸
の5’末端基準2番目からヌクレオイドが構成され、このように変形されたRNA干渉核
酸は、当該マイクロRNAの非正規G:Aワブル隆起標的のみを結合し、当該機能のみを
示すことになる。
G:Aワブルシード標的を正規標的と認識する変異マイクロRNAを同定し、これに非正
規G:Aワブルシードサイトを正規シードサイトと認識するように変形させる本発明(m
iRNA-GU)を適用すると、トータル335個の配列(sequence(G>U)
)が作られ(表4)、これによって、マイクロRNAの非正規標的抑制機能のみを示す技
術を完成した。
制することによって示す生物学的な機能を効率的に増大したり、従来のマイクロRNAが
示す機能のうち一部、すなわち非正規標的遺伝子を抑制することによって示す生物学的機
能のみを選択的に示す効果を有し、本発明の干渉誘導核酸を通じて細胞周期、分化、逆分
化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節が可能であところ、薬物、化粧品など多様な
分野において活用が可能なものと期待される。
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)またはアデニン(Adenine)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして、当該部位のG:AまたはG:Uワブル配列がU:AまたはA:Uの正規的な塩基配列になるようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階。
Claims (38)
- RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ
以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロRNAの非
正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑制するRN
A干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴として、または
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩
基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)またはアデニ
ン(Adenine)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにして
、当該部位のG:AまたはG:Uワブル配列がU:AまたはA:Uの正規的な塩基配列に
なるようにすることを特徴とする、RNA干渉誘導核酸。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、マイクロRNAの非正規標的遺伝子を選択的に抑制し、マ
イクロRNAの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項1に記載のRNA干
渉誘導核酸。 - 前記特定マイクロRNAは、miR-124、miR-155、miR-122、mi
R-1,let-7、miR-133、miR-302およびmiR-372よりなる群
から選ばれて、同じシード配列を有して18~24個の塩基で構成された1つ以上である
ことを特徴とする請求項1に記載のRNA干渉誘導核酸。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、5’末端2番目から7番目の塩基配列が下記のうちいずれ
か1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載のRNA干渉誘導核酸:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-A
A GGC C-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-124-BS);
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-G
G AGU U-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-122-BS);
miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
A AUG G-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-155-BS);
または
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-GG
AAU U-3’の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸(miR-1-BS)。 - 前記RNA干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴と
する請求項4に記載のRNA干渉誘導核酸:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
AA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3’の塩基配列を示すRNA
干渉誘導核酸(miR-124-BS);
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
GG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3’の塩基配列を示すRNA
干渉誘導核酸(miR-122-BS);
miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
UA AUG GC UAA U CGU GAU AGG-3’の塩基配列を示すRN
A干渉誘導核酸(miR-155-BS);
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-UGG
AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3’の塩基配列を示すRNA干渉
誘導核酸(miR-1-BS)。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列が下記のうちい
ずれか1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載のRNA干渉誘導核酸:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UAA UGC ACG-3’(miR-124-G4U)、5’-UAA G
UC ACG-3’(miR-124-G5U)または5’-UAA UUC ACG-
3’(miR-124-G4,5U)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUG AAU GUA-3’(miR-1-G2U)、5’-UGU AAU
GUA-3’(miR-1-G3U)、5’-UGG AAU UUA-3’(miR
-1-G7U)、5’-UUU AAU GUA-3’(miR-1-G2,3U)、5
’-UGU AAU UUA-3’(miR-1-G3,7U)、5’-UUG AAU
UUA-3’(miR-1-G2,7U)または5’-UUU AAU UUA-3’
(miR-1-G2,3,7U)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUG AGU GUG-3’(miR-122-G2U)、5’-UGU A
GU GUG-3’(miR-122-G3U)、5’-UGG AUU GUG-3’
(miR-122-G5U)、5’-UGG AGU UUG-3’(miR-122-
G7U)、5’-UGG AGU GUU-3’(miR-122-G9U)、5’-U
UU AGU GUG-3’(miR-122-G2,3U)、5’-UUG AUU
GUG-3’(miR-122-G2,5U)、5’-UUG AGU UUG-3’(
miR-122-G2,7U)、5’-UUG AGU GUU-3’(miR-122
-G2,9U)、5’-UGU AUU GUG(miR-122-G3,5U)、5’
-UGU AGU UUG-3’(miR-122-G3,7U)、5’-UGU AG
U GUU-3’(miR-122-G3,9U)、5’-UGG AUU UUG-3
’(miR-122-G5,7U)、5’-UGG AUU GUU-3’(miR-1
22-G5,9U)、または5’-UGG AGU UUU-3(miR-122-G7
,9U)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUU UGU CCC-3’(miR-133-G4U)、5’-UUU G
UU CCC-3’(miR-133-G5U)または5’-UUU UUU CCC-
3’(miR-133-G4,5U)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUA GGU AGU-3’(let-7-G2U)、5’-UGA UGU
AGU-3’(let-7-G4U)、5’-UGA GUU AGU-3’(let
-7-G5U)、5’-UGA GGU AUU-3’(let-7-G8U)、5’-
UUA UGU AGU-3’(let-7-G2,4U)、5’-UUA GUU A
GU-3’(let-7-G2,5U)、5’-UUA GGU AUU-3’(let
-7-G2,8U)、5’-UGA UUU AGU-3’(let-7-G4,5U)
、5’-UGA UGU AUU-3’(let-7-G4,8U)、または5’-UG
A GUU AUU-3’(let-7-G5,8U)の塩基配列を含むRNA干渉誘導
核酸;
miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UAA UUG CUU-3’(miR-302a-G4U)、5’-UAA
GUU CUU-3’(miR-302a-G6U)、または5’-UAA UUU C
UU-3’(miR-302a-G4,6U)の塩基配列を含むRNA干渉誘導核酸;ま
たは
miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-AAA UUG CUG-3’(miR-372-G4U)、5’-AAA G
UU CUG-3’(miR-372-G6U)、5’-AAA GUG CUU-3’
(miR-372-G9U)、5’-AAA UUU CUG-3’(miR-372-
G4,6U)、5’-AAA UUG CUU-3’(miR-372-G4,9U)、
または5’-AAA GUU CUU-3’(miR-372-G6,9U)の塩基配列
を含むRNA干渉誘導核酸。 - 前記RNA干渉誘導核酸の塩基配列が下記のうちいずれか1つ以上で示すことを特徴と
する請求項6に記載のRNA干渉誘導核酸:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3’(miR
-124-G4U)、5’-UAA GUC ACG CGG UGA AUG CCA
A-3’(miR-124-G5U)または5’-UAA UUC ACG CGG
UGA AUG CCA A-3’(miR-124-G4,5U)の塩基配列を示すR
NA干渉誘導核酸;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、
5’-UUG AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR
-1-G2U)、5’-UGU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U
-3’(miR-1-G3U)、5’-UGG AAU UUA AAG AAG UA
U GUA U-3’(miR-1-G7U)、5’-UUU AAU GUA AAG
AAG UAU GUA U-3’(miR-1-G2,3U)、5’-UGU AA
U UUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR-1-G3,7U)、
5’-UUG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3’(miR-
1-G2,7U)または5’-UUU AAU UUA AAG AAG UAU GU
A U-3’(miR-1-G2,3,7U)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核酸;
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
UG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-
G2U)、5’-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3(
miR-122-G3U)、5’-UGG AUU GUG ACA AUG GUG
UUU G-3’(miR-122-G5U)、5’-UGG AGU UUG ACA
AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G7U)、5’-UGG AG
U GUU ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G9U)、
5’-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-
122-G2,3U)、5’-UUG AUU GUG ACA AUG GUG UU
U G-3’(miR-122-G2,5U)、5’-UUG AGU UUG ACA
AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G2,7U)、5’-UUG
AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G2,
9U)、5’-UGU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3(m
iR-122-G3,5U)、5’-UGU AGU UUG ACA AUG GUG
UUU G-3(miR-122-G3,7U)、5’-UGU AGU GUU A
CA AUG GUG UUU G-3(miR-122-G3,9U)、5’-UGG
AUU UUG ACA AUG GUG UUU G-3’(miR-122-G5
,7U)、5’-UGG AUU GUU ACA AUG GUG UUU G-3’
(miR-122-G5,9U)または5’-UGG AGU UUU ACA AUG
GUG UUU G-3’(miR-122-G7,9U)の塩基配列を示すRNA干
渉誘導核酸;
miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-U
UU UGU CCC CUU CAA CCA GCU G-3’(miR-133-
G4U)、5’-UUU GUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3’
(miR-133-G5U)または5’-UUU UUU CCC CUU CAA C
CA GCU G-3’(miR-133-G4,5U)の塩基配列を含むRNA干渉誘
導核酸;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸てあって、5’-UUA
GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G2U)
、5’-UGA UGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’(let
-7-G4U)、5’-UGA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U
-3’(let-7-G5U)、5’-UGA GGU AUU AGG UUG UA
U AGU U-3’(let-7-G8U)、5’-UUA UGU AGU AGG
UUG UAU AGU U-3’(let-7-G2,4U)、5’-UUA GU
U AGU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G2,5U)、
5’-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-
7-G2,8U)、5’-UGA UUU AGU AGG UUG UAU AGU
U-3’(let-7-G4,5U)、5’-UGA UGU AUU AGG UUG
UAU AGU U-3’(let-7-G4,8U)または5’-UGA GUU
AUU AGG UUG UAU AGU U-3’(let-7-G5,8U)の塩基
配列を示すRNA干渉誘導核酸;
miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-
UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3’(miR-30
2a-G4U)、5’-UAA GUU CUU CCA UGU UUU GGU G
A-3’(miR-302a-G6U)、または5’-UAA UUU CUU CCA
UGU UUU GGU GA-3’(miR-302a-G4,6U)の塩基配列を
示すRNA干渉誘導核酸;または
miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸であって、5’-A
AA UUG CUG CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372
-G4U)、5’-AAA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU-
3’(miR-372-G6U)、5’-AAA GUG CUU CGA CAU U
UG AGC GU-3’(miR-372-G9U)、5’-AAA UUU CUG
CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-372-G4,6U)、5’
-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU-3’(miR-3
72-G4,9U)、または5’-AAA GUU CUU CGA CAU UUG
AGC GU-3’(miR-372-G6,9U)の塩基配列を示すRNA干渉誘導核
酸。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含むマイクロRNAの非正
規標的遺伝子発現抑制用組成物。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含む細胞周期、分化、逆分
化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用組成物。 - 前記組成物は、下記のうちいずれか1つ以上であることを特徴とする請求項9に記載の
組成物:
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む癌細胞死滅誘
導用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む神経突起分岐
分化誘導用組成物;
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細
胞周期停止誘導用組成物;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む筋細胞分化促進ま
たは筋線維化促進用組成物;
miR-155の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む筋細胞死滅誘
導用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫
の細胞死滅促進用組成物;
miR-124の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む神経芽細胞腫
の細胞分裂増殖促進用組成物;
miR-1の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導用組
成物;
miR-133の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む心筋肥大誘導
用組成物;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む癌細胞の細胞周期
停止誘導用組成物;
let-7の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む肝細胞の細胞周期
進行活性誘導用組成物;
miR-302aの非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む逆分化促進
用組成物;
miR-372の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む逆分化促進用
組成物;または
miR-122の非正規標的遺伝子を抑制するRNA干渉誘導核酸を含む肝癌細胞の細
胞移動阻害用組成物。 - 下記の段階を含む、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸
の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されて
マイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gen
e)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法:
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で
隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩
基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階、または
特定マイクロRNAの5’末端から9番目の塩基の間の塩基配列のうちグアニン(Gu
anine)塩基がウラシル(Uracil)に少なくとも1つ以上置換された変形塩基
配列を有するようにして、当該部位のG:AまたはG:Uワブル配列がU:AまたはA:
Uの正規的な塩基配列になるようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を対象細胞にトランスフェク
ションする段階;
対象細胞に試験物質を処理する段階;および
対象細胞でRNA干渉誘導核酸が抑制するマイクロRNAの非正規標的遺伝子の発現量
乃至発現有無を確認する段階を含む、
細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用試験物質をスクリ
ーニングする方法。 - RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ
以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロRNAの非
正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑制するRN
A干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とし、
前記特定マイクロRNAは、5’末端から6番目のヌクレオチドのリボース環の2’位
にメチル基(2’OMe)が添加されたことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、当該RNA干渉誘導核酸の正規シード標的遺伝子の発現の
みを抑制することを特徴とする請求項13に記載のRNA干渉誘導核酸。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの非正規核隆起サイトのみを特異的に
抑制し、新しく発生しうる非正規核隆起サイトを除去することを特徴とする請求項13に
記載のRNA干渉誘導核酸。 - 請求項13~15のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含むマイクロRNAの
非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。 - 下記の段階を含む、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸
の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されて
マイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gen
e)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で
隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩
基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階;および
前記特定マイクロRNAの5’末端から6番目のヌクレオチドのリボース環の2’位に
メチル基(2’OMe)を添加する段階を含むことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸の
製造方法。 - RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ
以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロRNAの非
正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑制するRN
A干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4
個の塩基配列を含み、6番目と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、
特定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特
定マイクロRNAの6番目の塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wob
ble)配列を含むすべての相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目
と6番目の間に標的遺伝子で隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で
当該隆起が消え、連続的な塩基配列で結合するようにすることを特徴とする、RNA干渉
誘導核酸。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、非正規核隆起標的サイトのみを選択的に抑制し、マイクロ
RNAの正規標的遺伝子は抑制しないことを特徴とする請求項18に記載のRNA干渉誘
導核酸。 - 請求項18~20のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含むマイクロRNAの
非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。 - 下記の段階を含む、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸
の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されて
マイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gen
e)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目から5番目の4個の塩基配列を含み、6番目
と7番目の塩基は、同一であり、6番目と7番目の塩基は、特定マイクロRNAの6番目
の塩基と配列できる塩基と相補的な塩基配列を有し、前記特定マイクロRNAの6番目の
塩基と配列できる塩基には、G:A、G:Uワブル(wobble)配列を含むすべての
相補的塩基が含まれるようにして、マイクロRNAの5番目と6番目の間に標的遺伝子で
隆起(bulge)が生じて結合する非正規標的塩基配列で当該隆起が消え、連続的な塩
基配列で結合するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階を含むことを特徴とする、R
NA干渉誘導核酸の製造方法。 - RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸の二本鎖のうち1つ
以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されてマイクロRNAの非
正規標的遺伝子(noncanonical target gene)を抑制するRN
A干渉誘導核酸であって、
前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目から9番目の塩
基の間の塩基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩
基に少なくとも1つ以上置換された変形塩基配列を有し、当該部位のG:Aワブル(wo
bble)がU:Aの正規的な塩基配列になるようにすることを特徴とする、RNA干渉
誘導核酸。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、特定マイクロRNAの5’末端から2番目の塩基から始ま
って6個~8個の連続的な塩基配列を含み、
前記塩基配列は、グアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に
少なくとも1つ以上置換されたことを特徴とする請求項23に記載のRNA干渉誘導核酸
。 - 前記RNA干渉誘導核酸は、G:Aワブル(wobble)配列で結合するマイクロR
NAの非正規標的遺伝子のみを選択的に抑制し、マイクロRNAの正規標的遺伝子は抑制
しないことを特徴とする請求項23に記載のRNA干渉誘導核酸。 - 請求項23~26のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含むマイクロRNAの
非正規標的遺伝子発現抑制用組成物。 - 下記の段階を含む、RNA干渉(RNA interference)を誘導する核酸
の二本鎖のうち1つ以上の一本鎖において、特定マイクロRNAの一部配列が変形されて
マイクロRNAの非正規標的遺伝子(noncanonical target gen
e)の発現を抑制するRNA干渉誘導核酸の製造方法であって、
特定マイクロRNAの5’末端から2番目の塩基から始まって6個~8個の連続的な塩
基配列のうちグアニン(Guanine)塩基がウラシル(Uracil)塩基に少なく
とも1つ以上置換された変形塩基配列を有するようにRNA干渉誘導核酸を作製する段階
を含むことを特徴とする、RNA干渉誘導核酸の製造方法。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する
段階を含む、マイクロRNAの非正規標的遺伝子発現抑制方法。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸の、マイクロRNAの非正規標
的遺伝子発現抑制用途。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与する
段階を含む、細胞周期、分化、逆分化、形態、移動、分裂、増殖または死滅調節方法。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸の、細胞周期、分化、逆分化、
形態、移動、分裂、増殖または死滅調節用途。 - 請求項13~15のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与
する段階を含む、マイクロRNAの非正規標的遺伝子発現抑制方法。 - 請求項13~15のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸の、マイクロRNAの非正
規標的遺伝子発現抑制用途。 - 請求項18~20のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与
する段階を含む、マイクロRNAの非正規標的遺伝子発現抑制方法。 - 請求項18~20のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸の、マイクロRNAの非正
規標的遺伝子発現抑制用途。 - 請求項23~26のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸を含む組成物を個体に投与
する段階を含む、マイクロRNAの非正規標的遺伝子発現抑制方法。 - 請求項23~26のいずれか1項に記載のRNA干渉誘導核酸の、マイクロRNAの非正
規標的遺伝子発現抑制用途。
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HUMAN MUTATION, vol. 33, no. 1, JPN6023028774, 2012, pages 254 - 263, ISSN: 0005105301 * |
PLOS ONE, vol. 12(8), JPN6023028773, 2017, pages 0181761 - 1, ISSN: 0005105302 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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WO2019231288A1 (ko) | 2019-12-05 |
US20220267766A1 (en) | 2022-08-25 |
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