WO2019211971A1 - セロオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

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WO2019211971A1
WO2019211971A1 PCT/JP2019/015839 JP2019015839W WO2019211971A1 WO 2019211971 A1 WO2019211971 A1 WO 2019211971A1 JP 2019015839 W JP2019015839 W JP 2019015839W WO 2019211971 A1 WO2019211971 A1 WO 2019211971A1
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cdp
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glucose
water
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PCT/JP2019/015839
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芹澤　武
敏樹 澤田
聖人 西浦
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第一工業製薬株式会社
国立大学法人東京工業大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01049—Cellodextrin phosphorylase (2.4.1.49)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cellooligosaccharide using an enzyme.
  • a synthesis method using a reverse reaction of cellodextrin phosphorylase which is a hyperphosphate degrading enzyme is known.
  • Non-Patent Document 1 describes that cellooligosaccharide having an average degree of polymerization of 9 is synthesized by reacting ⁇ -glucose-1-phosphate and glucose as a primer with cellodextrin phosphorylase. .
  • Patent Document 1 discloses that ⁇ -glucan phosphorylase is allowed to act on soluble starch to produce glucose-1-phosphate, and the obtained glucose-1-phosphate is cellobiose phosphorylase and cellodextrin phosphorylase in the presence of glucose. Describes the synthesis of cellooligosaccharides having a degree of polymerization of 2-6 by reacting with.
  • enzymes catalyze biochemical reactions in aqueous solutions, and in the presence of organic solvents, they are easily denatured and deactivated to lose their catalytic functions. Therefore, enzymatic synthesis of cellooligosaccharides using cellodextrin phosphorylase is also possible.
  • the reaction is carried out in a buffer solution using water as a reaction solvent.
  • an embodiment of the present invention aims to provide a method capable of suppressing the production of cellooligosaccharide having a high degree of polymerization in the enzymatic synthesis of cellooligosaccharide.
  • the method for producing cellooligosaccharides comprises using ⁇ -glucose-1-phosphate and at least one primer selected from the group consisting of glucose, cellobiose and alkylated glucose, water and a water-soluble organic compound. It includes a step of reacting with cellodextrin phosphorylase in a mixed solvent containing a solvent.
  • the production of cellooligosaccharide having a high degree of polymerization is suppressed by using a mixed solvent to which a water-soluble organic solvent is added as a reaction solvent. It is possible to synthesize cellooligosaccharides having a small degree of polymerization distribution.
  • the cellooligosaccharide production method comprises ⁇ -glucose-1-phosphate (hereinafter sometimes referred to as ⁇ G1P) and at least one primer selected from the group consisting of glucose, cellobiose and alkylated glucose. Is reacted with cellodextrin phosphorylase (hereinafter sometimes referred to as CDP) in a mixed solvent containing water and a water-soluble organic solvent.
  • ⁇ G1P ⁇ -glucose-1-phosphate
  • CDP cellodextrin phosphorylase
  • This reaction is a synthesis method using the reverse reaction of CDP, ⁇ G1P is a glucose donor, and at least one selected from the group consisting of glucose, cellobiose and alkylated glucose is used as a primer (ie, glucose acceptor).
  • a primer ie, glucose acceptor
  • the reaction when the primer is glucose is as follows.
  • the reaction when the primer is cellobiose is as follows.
  • the reaction when the primer is alkylated glucose is as follows.
  • n is an integer indicating the degree of polymerization of the cellooligosaccharide.
  • R represents an alkyl group.
  • alkyl group in alkylated glucose examples include an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms. Therefore, the alkyl group R in the above reaction formula preferably has 1 to 12 carbon atoms. Specific examples include ethyl glucoside, octyl glucoside, decyl glucoside, dodecyl glucoside and the like.
  • CDP is known to be produced by microorganisms such as Clostridium thermocellum and Cellulomonas, and can be obtained by a known method using these microorganisms.
  • CDP is an M.I. Krishnareddy et al. Appl. Glycosci. , 2002, 49, 1-8
  • CDP derived from Clostridium thermothermum YM4 can be prepared by an E. coli expression system.
  • the enzyme amount of CDP can be determined by, for example, incubating ⁇ G1P, cellobiose and CDP, quantifying the phosphoric acid produced by CDP, and determining the amount of enzyme that liberates 1 ⁇ mol of phosphoric acid per minute as 1 U.
  • This embodiment is characterized in that a mixed solvent containing water and a water-soluble organic solvent is used as a reaction solvent in the enzyme synthesis of cellooligosaccharide using CDP.
  • the mixed solvent is a solvent obtained by mixing water and a water-soluble organic solvent, and is usually obtained by mixing a buffer solution that is an aqueous solution and a water-soluble organic solvent.
  • the water-soluble organic solvent is an organic solvent having a solubility in water of 100 mL at 20 ° C., for example, alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, 1-propanol, isopropyl alcohol, and t-butanol. Ketones such as acetone; ethers such as tetrahydrofuran; amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; nitriles such as acetonitrile; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, etc. It is done. These may be used alone or in combination of two or more. More preferably, the water-soluble organic solvent is at least one selected from the group consisting of methanol (MeOH), ethanol (EtOH), N, N-dimethylformamide (DMF), and dimethyl sulfoxide (DMSO). .
  • the buffer mixed with the water-soluble organic solvent is not particularly limited, and examples thereof include HEPES buffer, Tris-HCl buffer, MOPS buffer, acetate buffer, phosphate buffer, and the like, and the pH of the reaction solvent at the reaction temperature.
  • a buffer solution that can maintain the pH of about 5 to 9 is used.
  • the use ratio of water and the water-soluble organic solvent is not particularly limited, and the water-soluble organic solvent is preferably 5 to 50% by volume, more preferably 5 to 40% by volume as the mixed solvent 100% by volume. More preferably, it is 5 to 30% by volume, 10 to 25% by volume, or 10 to 20% by volume.
  • the reaction conditions are not particularly limited, but are preferably as follows.
  • the concentration of ⁇ G1P is preferably 10 to 1000 mM, more preferably 100 to 300 mM.
  • the concentration of the primer (glucose, cellobiose, alkylated glucose) is preferably 10 to 200 mM, more preferably 30 to 70 mM.
  • the concentration of CDP is preferably 0.01 to 1.5 U / mL, more preferably 0.05 to 0.5 U / mL.
  • the concentration of the buffer solution (for example, the concentration of HEPES in the HEPES buffer solution) is preferably 100 to 1000 mM, more preferably 250 to 750 mM.
  • the reaction temperature may be 10 to 80 ° C. or 20 to 70 ° C.
  • the reaction time may be 1 hour to 15 days, or 1 day to 10 days.
  • a reaction solution containing cellooligosaccharide can be obtained. Since the reaction solution contains an enzyme such as CDP or a primer, washing may be performed to remove this. Washing can be performed by separating the precipitate and the supernatant by centrifugation and repeating the step of redispersing the precipitate using a washing solvent, and cellooligosaccharide is obtained.
  • the washing solvent a mixed solvent containing water and a water-soluble organic solvent similar to the reaction solvent may be used, or water may be used.
  • Cellooligosaccharide is obtained as a precipitate (precipitation product) as described above, but is also contained in the supernatant. Therefore, cellooligosaccharide can also be obtained by recovering the product in the supernatant.
  • the cellooligosaccharide obtained is an oligosaccharide having a structure in which glucose is linked by ⁇ -1,4 glycosidic bonds.
  • the degree of polymerization of the cellooligosaccharide (that is, n in the above formula) may be 4 or more, 5 or more, 6 or more, for example 15 or less, 13 or less, or 11 or less.
  • the average degree of polymerization (DP) is not particularly limited, but may be, for example, 5.5 or more, 6.0 or more, 6.3 or more, or, for example, 9.0 or less, or 8.5 or less. It may be 8.3 or less.
  • the cellooligosaccharide obtained by this embodiment may be not alkylated as in the case of synthesis using glucose or cellobiose as a primer, or alternatively, as in the case of synthesis using an alkylated glucose as a primer. It may be alkylated. That is, the cellooligosaccharide according to the present embodiment includes a cellooligosaccharide derivative such as an alkylated cellooligosaccharide. Naturally, alkali metal ion adducts such as sodium ion adducts and potassium ion adducts are also included. In addition, after synthesizing using alkylated glucose as a primer, non-alkylated cellooligosaccharide may be produced by hydrolyzing the alkyl group by a known method.
  • the degree of polymerization selectivity of the product is higher, and the distribution of the degree of polymerization can be narrowed. The reason is not intended to be limited by this, but it is thought that cellobiose is more uniform in the time until the start of the reaction between enzymes.
  • cellooligosaccharide is not particularly limited, and can be used for various known uses such as a pharmaceutical field.
  • Experimental method 1-1 Reagents LB-BROTH LENNOX and LB-AGAR LENNOX were purchased from Funakoshi. Glycerol, kanamycin sulfate, isopropyl- ⁇ -D ( ⁇ )-thiogalactopyranoside (IPTG), N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine (TEMED), dithiothreitol (DTT), 1- Butanol, ⁇ G1P disodium n hydrate, and 40% sodium bicarbonate aqueous solution were purchased from Wako Pure Chemical.
  • D-(+)-cellobiose was purchased from Nacalai Tesque.
  • Nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose gel was purchased from QIAGEN.
  • Protein Molecular Weight Marker (Broad) was purchased from Takara Bio.
  • the ultrapure water used was water purified by the Milli-Q system (Milli-Q Advantage A-10, Merck Millipore). Pure water used was purified by TANK 60 Lite PE (Merck Millipore).
  • kanamycin stock solution 1.5 g of kanamycin sulfate was dissolved in sterilized purified water and made up to 30 mL.
  • the prepared solution was sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m filter made of polyvinylidene fluoride (PVDF) in a clean bench, dispensed 1 mL at a time into a 1.7 mL tube, and stored at ⁇ 20 ° C.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • IPTG stock solution 71.5 mg of IPTG was dissolved in sterilized purified water and made up to 30 mL.
  • the prepared solution was sterilized by filtration with a PVDF 0.22 ⁇ m filter in a clean bench. 1 mL was dispensed into 1.7 mL tubes and stored at ⁇ 20 ° C.
  • LB-AGAR / Kanamycin Plate 2.8 g of LB-AGAR LENNOX was collected in a 250 mL wide-mouthed medium bottle, dissolved by adding 80 mL of ultrapure water, and autoclaved. After cooling to 60 ° C. or lower at room temperature, 80 ⁇ L of 50 mg / mL kanamycin stock solution was added and mixed in a clean bench. After dispensing into a sterilized petri dish and solidifying at room temperature, it was stored at 4 ° C. Used within one month after preparation.
  • LB medium 10 g of LB-BROTH LENNOX was dissolved in 500 mL of pure water in a 500 mL wide-mouthed medium bottle, and autoclaved and stored at room temperature.
  • MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) 4.18 g of 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) was dissolved in about 600 mL of ultrapure water. After adjusting to pH 7.5 with 4N aqueous sodium hydroxide solution, the volume was increased to 1 L. The solution was sterilized by filtration through a PVDF 0.10 ⁇ m filter and stored at 4 ° C.
  • Elution buffer (20 mM MOPS, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 7.5) 2.09 g of MOPS, 8.77 g of sodium chloride, and 8.51 g of imidazole were dissolved in about 350 mL of ultrapure water. After adjusting to pH 7.5 with 4N aqueous sodium hydroxide solution, the volume was adjusted to 500 mL. The solution was sterilized by filtration through a PVDF 0.10 ⁇ m filter and stored at 4 ° C.
  • Tris-HCl buffer 1.5 M, pH 8.8 18.17 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) was dissolved in about 80 mL of ultrapure water with stirring. After adjusting to pH 8.8 with 6N hydrochloric acid, the volume was adjusted to 100 mL and stored at 4 ° C.
  • Tris-HCl buffer 0.5 M, pH 6.8, 6.06 g of Tris was dissolved in about 80 mL of ultrapure water with stirring. After adjusting the pH to 6.8 with 6N hydrochloric acid, the volume was adjusted to 100 mL and stored at 4 ° C.
  • SDS aqueous solution 10 g of sodium dodecyl sulfate (SDS) was dissolved in about 90 mL of ultrapure water with stirring. The volume was increased to 100 mL and stored at room temperature.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • E. coli culture and CDP expression (1) E. coli Preparation of E. coli BL21-CDP Glycerol Stock Escherichia coli BL21-Gold (DE3) strain (E. coli BL21-) having a plasmid containing the gene for CDP derived from Clostridium thermocellum YM4 using a platinum loop sterilized by heating with a gas burner and allowed to cool. LB-AGAR / kanamycin plates were inoculated from a glycerol stock of CDP) and cultured at 37 ° C. for 8-12 hours.
  • a mixed solution of 5 mg of a 50 mg / mL kanamycin stock solution and 5 mL of LB medium was added to a test tube previously sterilized by dry heat, and then inoculated from a single colony using a heated platinum loop. Shaking culture (reciprocating, 200 rpm) was performed at 37 ° C. using a shaking incubator (BR-23FP, TAITEC) until OD 660 reached 0.6 to 0.8. Thereafter, 800 ⁇ L of the culture solution was collected in a 1.7 mL tube, and 100 ⁇ L of 50% glycerol solution was added and mixed. Frozen with liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • E.E. Preparation of E. coli BL21-CDP Master Plate E. coli BL21-CDP Master Plate
  • the LB-AGAR / kanamycin plate was inoculated from a glycerol stock of E. coli BL21-CDP or a master plate within one month after preparation and cultured at 37 ° C. for 8 to 12 hours. When inoculated from the master plate, it was stored as it was at 4 ° C. When inoculated from a glycerol stock, it was further inoculated on an LB-AGAR / kanamycin plate, cultured at 37 ° C. for 8-12 hours, and stored at 4 ° C.
  • E.E. Preparation of E. coli BL21-CDP Preculture Solution 3 mL of LB medium was collected in a dry heat sterilized test tube and 3 ⁇ L of a 50 mg / mL kanamycin stock solution was added. Using platinum ears sterilized by heat and allowed to cool, E. coli was used. Inoculated from a single colony of E. coli BL21-CDP master plate. Shaking culture (reciprocating, 200 rpm) was performed at 37 ° C. for 10-12 hours using a shaking incubator.
  • E.E. Coli BL21-CDP culture and CDP expression 6 g of LB-BROTH LENNOX was weighed into two 1 L baffled flasks, 300 mL of pure water was added, and the mixture was autoclaved and allowed to cool. After adding and mixing 300 ⁇ L of 50 mg / mL kanamycin stock solution to each, E. coli. 300 ⁇ L of E. coli BL21-CDP preculture was added. After confirming that OD 660 reached 0.55 to 0.60 by shaking culture (rotation, 600 rpm) at 30 ° C. using a shaking incubator, 3 mL of 10 mM IPTG stock solution was added, respectively, and 25 hours at 25 ° C. CDP was expressed by shaking culture (rotation, 200 rpm).
  • E. coli BL21-CDP E. coli expressing CDP prepared in 1-2-2
  • E. coli BL21-CDP suspension is equally dispensed into 12 50 mL tubes, approximately 50 mL each, and centrifuged (3500 rpm, 20 using a centrifuge (centrifuge: EX-126, TOMY, rotor: 3850-04P, TOMY)). For 4 minutes). The supernatant was removed by decantation and precipitated E. coli.
  • MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) was added to the E.
  • E. coli BL21-CDP pellet to make up to about 15 mL each, and suspended by vigorous shaking by hand.
  • E. E. coli BL21-CDP suspension was dispensed into four 100 mL free-standing tubes, about 45 mL each, and ultrasonically irradiated with a probe type ultrasonic irradiator (Sonifier 250, BRANSON) while ice bathing.
  • E. coli BL21-CDP was disrupted. The ultrasonic irradiation was performed for 2 cycles (power cycle: 200 W (dial 10), duty cycle: 30%) for 2 cycles (1 cycle consisting of 5 seconds of ultrasonic irradiation and 4 repetitions of 25 seconds interval).
  • power cycle 200 W (dial 10), duty cycle: 30%
  • E. coli BL21-CDP disruption solution In order to prevent the degradation of CDP by protease or the like in the E. coli BL21-CDP disruption solution, E. The E. coli lysate was always bathed in ice. E. coli in 4 100 mL tubes. E. coli BL21-CDP disruption solution was transferred to a 50 mL tube and centrifuged (3500 rpm,> 20 minutes, 4 ° C.). Thereafter, the supernatant was collected into a 50 mL tube by decantation.
  • Ni-NTA affinity column Dispersed Ni-NTA agarose gel (GE Healthcare) in a plastic column of diameter 1.8 cm and length 10 cm previously sterilized with 70% ethanol and replaced with ultrapure water 9.8 mL of the liquid was charged.
  • the NI-NTA agarose gel was sterilized and washed by filling the column with 70% ethanol and flowing it. This operation was repeated twice.
  • 3 mL of MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) was applied and flowed, and another 3 mL was applied. Stirring with a spatula re-dispersed the Ni-NTA agarose gel to remove bubbles. After that, it was replaced four times with 5 mL of MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5).
  • Buffer replacement of the CDP solution was performed using a PD10 column (Sephadex G-25, GE Healthcare) according to the attached instructions. The required number of PD10 columns was used depending on the volume of the CDP solution.
  • the PD10 column was fixed to a 50 mL tube using the attached adapter. It was filled with 70% ethanol, and centrifuged (1000 g, 2 minutes, 4 ° C.) using a centrifuge (MX-305, TOMY). The column was sterilized and washed by repeating this operation twice.
  • 5% (w / v) sodium azide stock solution was filled with 0.02% sodium azide / 20 mM MOPS-Na buffer prepared by diluting 250 times with MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5), The PD10 column was replaced with a buffer solution by repeating the operation of allowing the solution to flow by allowing it to stand still 4 times. Further, 0.02% sodium azide / 20 mM MOPS-Na buffer was added and centrifuged.
  • the PD10 column was transferred to a new 50 mL tube, and 1.75 to 2.5 mL of CDP solution was applied to each PD10 column so as not to break the slope of Sephadex by centrifugation. It fixed to the centrifuge at the same angle as the above-mentioned centrifugation, and centrifuged. The eluted solution was collected to obtain a CDP stock solution, and the absorbance at 280 nm of the CDP stock solution was measured by NanoDrop 2000c, dispensed 1 mL each into a 1.7 mL tube, and stored at 4 ° C.
  • the column was washed by adding 30 mL of MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) per column and allowing to stand. Next, the operation of filling with ultrapure water and centrifuging was repeated twice. Similarly, it was washed twice with a 50% by volume aqueous ethanol solution. A PD-10 column was filled with 50% by volume ethanol aqueous solution and stored at 4 ° C.
  • the polyacrylamide gel prepared in this section (1) was set in an electrophoresis container (miniprotean Tetra cell, BIO RAD), 500 mL of 5 ⁇ electrophoresis buffer diluted 5-fold with ultrapure water was poured, and the comb was removed. The electrophoresis sample was loaded into each well, and electrophoresed at a voltage of 150 V for about 40 minutes using an electrophoresis apparatus (mini-PROTEAN Tetra system, BIO RAD).
  • an electrophoresis apparatus mini-PROTEAN Tetra system, BIO RAD.
  • the electrophoresis was stopped, the gel was taken out of the glass plate, immersed in the fixative, and shielded from light and shaken with a shaker (Wave-PR, TAITECH) for 30 minutes.
  • the fixing solution was removed, the staining solution was added, the gel was immersed, and the mixture was shaken for 60 minutes in the dark.
  • the staining solution was collected, the decolorizing solution was added, the gel was immersed, and the mixture was shaken for 30 minutes in the dark.
  • the operation of removing the decoloring solution and adding a new decolorizing solution and shaking was repeated until the protein band contained in the marker was clearly seen.
  • the gel was washed with ultrapure water, photographed with Gel Doc EZ Imager (BIO RAD), and analyzed with the attached software.
  • D-(+)-glucose and ⁇ G1P disodium n-hydrate were weighed in predetermined amounts and dissolved in ultrapure water to be 1M, respectively, to obtain a 1M glucose stock solution and a 1M ⁇ G1P aqueous solution.
  • HEPES buffer, 1M ⁇ G1P aqueous solution, and 1M glucose stock solution are added to a 4 mL tube so that the concentrations at the time of reaction are 500 mM, 200 mM, and 50 mM, respectively, and a predetermined amount of methanol (MeOH), ethanol (EtOH), N , N-dimethylformamide (DMF) and dimethyl sulfoxide (DMSO) were added, and the volume was increased with ultrapure water in consideration of the amount of the CDP stock solution to be used.
  • the sample was deaerated by suction with an aspirator while irradiating with ultrasonic waves.
  • CDP stock solution An appropriate amount of the CDP stock solution was added so that the final concentration was 0.2 U / mL, and mixed by pipetting so as not to generate bubbles. A predetermined amount was taken into a 1.7 mL tube or a 1 mL mighty vial and incubated at 60 ° C. for 3 days.
  • a HEPES buffer solution 500 mM, pH 7.5
  • 10% MeOH that is, 10% by volume of MeOH was included in the mixed solvent.
  • a water-soluble organic solvent was not added, and the others incubated in the same manner are represented as “( ⁇ )”.
  • the 300 mM ethyl glucoside stock solution and the 300 mM octyl glucoside stock solution were prepared by weighing a predetermined amount of ethyl ⁇ -D-glucoside (Carbosy Limited) and n-octyl ⁇ -glucoside (Dojindo Laboratories) and dissolving them in ultrapure water to 300 mM each. Prepared.
  • the yield of the product was calculated by completely drying the purified aqueous dispersion.
  • the sample tube which had been dried at 105 ° C. for 24 hours in advance and allowed to cool in a desiccator was weighed, the purified aqueous dispersion was added and dried at 105 ° C. for 24 hours, then allowed to cool in the desiccator and weighed.
  • the product concentration was calculated from the difference in weight before and after drying. This operation was performed three times at the same time, and the yield of the product was calculated from the average value thereof.
  • the purified dispersion was diluted with ultrapure water.
  • the product measurement sample was 0.1% (w / v) aqueous dispersion of product 1 ⁇ L, 10 mg / mL DHBA aqueous solution 1 ⁇ L, trifluoroacetic acid (0.2 vol%) acetonitrile solution 3 ⁇ L, It was prepared by mixing in a mighty vial washed with a methanol solution of potassium oxide (3.3% by mass).
  • the MS spectrum obtained by the measurement was processed under the conditions of Smoothing method: Gaussian, Smoothing filter width: 19, and Baseline filter width: 1000.
  • the peak areas of the sodium ion adduct and potassium ion adduct were summed to calculate the peak area of each degree of polymerization.
  • the average value of the degree of polymerization was calculated from the ratio of the calculated peak area of each degree of polymerization, and was defined as the average degree of polymerization.
  • the distribution of the degree of polymerization was evaluated based on the standard deviation from the average degree of polymerization by analyzing the MALDI-TOF-MS spectrum according to the following formula.
  • Table 1 shows the results of calculating the ratio of each degree of polymerization for 10% MeOH, 20% DMSO, and control (-) from the MS spectrum data of FIG. As is clear from Table 1, when a mixed solvent was used, the formation of oligomers having a high degree of polymerization was suppressed as compared with control (-). In Table 1, the ratios of the degree of polymerization of 15 and 16 are not shown, but this is because the ratio is less than 1%. Further, “0%” in Table 1 means that it is below the detection limit.
  • Table 2 shows the result of calculating the ratio of each degree of polymerization for 10% MeOH, 15% DMF, 20% DMSO and control (-) from the MS spectrum data of FIG.
  • polymerization degree 8 to 9
  • control ( ⁇ ) particularly 15% DMF.
  • the effect was high at 20% DMSO. Note that “0%” in Table 2 means below the detection limit.
  • the supernatant in the supernatant obtained by mixing the supernatant after one-time centrifugation and desalting with ZipTip manufactured by Millipore, and the precipitated product after being centrifuged five times were each subjected to MALDI-TOF-MS spectrum measurement.
  • Table 3 shows the results of calculating the ratio of each degree of polymerization from the MS spectrum data of FIG. As is apparent from Table 3, when a mixed solvent was used, the formation of oligomers having a high degree of polymerization was suppressed compared to control (-). Note that “0%” in Table 3 means below the detection limit.
  • Table 4 below shows the results of calculating the ratio of each degree of polymerization from the MS spectrum data of FIG. As is apparent from Table 4, when a mixed solvent was used, the formation of oligomers having a high degree of polymerization was suppressed as compared with control (-). In Table 4, “0%” means below the detection limit.

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Abstract

セロオリゴ糖の酵素合成において高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制する。　α－グルコース－１－リン酸と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、セロオリゴ糖の製造方法である。

Description

セロオリゴ糖の製造方法
　本発明は、酵素を用いたセロオリゴ糖の製造方法に関する。
　酵素を用いたセルロースオリゴマー、即ちセロオリゴ糖の製造方法として、過リン酸分解酵素であるセロデキストリンホスホリラーゼの逆反応を利用した合成法が知られている。
　例えば、非特許文献１には、α－グルコース－１－リン酸とプライマーとしてのグルコースとを、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させることにより、平均重合度９のセロオリゴ糖を合成することが記載されている。
　また、特許文献１には、可溶性澱粉にα－グルカンホスホリラーゼを作用させてグルコース－１－リン酸を生成し、得られたグルコース－１－リン酸をグルコースの存在下にセロビオースホスホリラーゼ及びセロデキストリンホスホリラーゼと反応させることにより重合度２～６のセロオリゴ糖を合成することが記載されている。
特開２００１－１１２４９６号公報
Masao Hiraishi他５名,"Synthesis of Highly Ordered Cellulose II in vitro usingCellodextrin Phosphsrylase", Carbohydrate Research, Vol. 344, (2009) pp.2468-2473
　一般に、酵素は水溶液中で生化学反応を触媒し、有機溶媒の存在下では容易に変性・失活してその触媒機能を喪失することから、セロデキストリンホスホリラーゼを用いたセロオリゴ糖の酵素合成についても、従来は反応溶媒として水を用いて、緩衝液中で反応を行っている。
　しかしながら、反応溶媒として水を用いた場合、セロオリゴ糖の重合度の分布が広く、平均重合度に対して相当程度大きな重合度を持つセロオリゴ糖が生成されることが判明した。このような高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制して重合度の分布を小さくすることがセロオリゴ糖の性能向上の観点から望ましい場合がある。
　本発明の実施形態は、以上の点に鑑み、セロオリゴ糖の酵素合成において高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制することができる方法を提供することを目的とする。
　本発明の実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法は、α－グルコース－１－リン酸と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含むものである。
　本発明の実施形態であると、セロデキストリンホスホリラーゼを用いたセロオリゴ糖の酵素合成において、反応溶媒として水溶性有機溶媒を添加した混合溶媒を用いることにより、高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制することができ、重合度の分布が小さいセロオリゴ糖を合成することができる。
グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における酵素反応後の溶液状態を示す写真である。 セロビオースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における酵素反応後の溶液状態を示す写真である。 グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。 セロビオースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。 セロビオースプライマー合成系における、２種の洗浄溶媒それぞれについての、沈殿生成物と上清中の生成物のＭＳスペクトルを示す図である。 セロビオースプライマー合成系における、沈殿生成物と上清中の生成物のＭＳスペクトルを示す図である。 エチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。 オクチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。
　本実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法は、α－グルコース－１－リン酸（以下、αＧ１Ｐということがある）と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼ（以下、ＣＤＰということがある）と反応させるものである。
　この反応は、ＣＤＰの逆反応を利用した合成法であり、αＧ１Ｐをグルコース供与体とし、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種をプライマー（即ち、グルコース受容体）として、これらをＣＤＰと反応させることにより、プライマーに対してαＧ１Ｐがモノマーとして逐次的に重合される。
　例えば、プライマーがグルコースの場合の反応は以下に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　また、プライマーがセロビオースである場合の反応は以下に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　また、プライマーがアルキル化グルコースである場合の反応は以下に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記の反応式中において、ｎは整数であり、セロオリゴ糖の重合度を示す。また、Ｒはアルキル基を示す。
　アルキル化グルコースにおけるアルキル基としては、例えば、炭素数１～１２のアルキル基が挙げられる。そのため、上記の反応式中のアルキル基Ｒの炭素数は好ましくは１～１２である。具体的には、エチルグルコシド、オクチルグルコシド、デシルグルコシド、ドデシルグルコシドなどが挙げられる。
　ＣＤＰについては、クロストリジウム・サーモセラリム（Clostridium thermocellum）、セルロモナス（Cellulomonas）属などの微生物が産生することが知られており、これらの微生物を利用して公知の方法により取得することができる。例えば、ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１－８に記載の方法に準じて、大腸菌発現系によりClostridium thermocellum YM4由来ＣＤＰを調製することができる。
　なお、ＣＤＰの酵素量は、例えばαＧ１Ｐとセロビオース及びＣＤＰをインキュベーションし、ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間当たり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕとして求めることができる。
　本実施形態では、上記のＣＤＰを用いたセロオリゴ糖の酵素合成において、反応溶媒として、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いることを特徴とする。混合溶媒は、水と水溶性有機溶媒を混合してなる溶媒であり、通常は水溶液である緩衝液と水溶性有機溶媒とを混合して得られる。
　水溶性有機溶媒とは、２０℃において水１００ｍＬへの溶解度が５ｍＬ以上の有機溶媒であり、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔ－ブタノールなどの炭素数１～４のアルコール類；　アセトンなどのケトン類；　テトラヒドロフランなどのエーテル類　Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアミド類；　アセトニトリルなどのニトリル類；　ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類などが挙げられる。これらはいずれか一種用いても、２種以上組み合わせて用いてもよい。水溶性有機溶媒として、より好ましくは、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択される少なくとも一種を用いることである。
　水溶性有機溶媒と混合する緩衝液としては、特に限定されず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられ、反応温度において反応溶媒のｐＨを５～９程度に維持できる緩衝液が好ましく用いられる。
　水と水溶性有機溶媒との使用割合は、特に限定されず、混合溶媒１００体積％として、水溶性有機溶媒が５～５０体積％であることが好ましく、より好ましくは５～４０体積％であり、更に好ましくは５～３０体積％であり、１０～２５体積％でもよく、１０～２０体積％でもよい。
　反応条件については特に限定しないが、以下の通りであることが好ましい。αＧ１Ｐの濃度は、１０～１０００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１００～３００ｍＭである。プライマー（グルコース、セロビオース、アルキル化グルコース）の濃度は、１０～２００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは３０～７０ｍＭである。ＣＤＰの濃度は、０．０１～１．５Ｕ／ｍＬであることが好ましく、より好ましくは０．０５～０．５Ｕ／ｍＬである。また、緩衝液の濃度（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＨＥＰＥＳの濃度）としては、１００～１０００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは２５０～７５０ｍＭである。反応温度としては、１０～８０℃でもよく、２０～７０℃でもよい。また、反応時間としては、１時間～１５日間でもよく、１日間～１０日間でもよい。
　反応終了後、セロオリゴ糖を含む反応液を得ることができる。該反応液には酵素であるＣＤＰやプライマーなどが含まれるため、これを除去するために洗浄を行ってもよい。洗浄は、遠心により沈殿物と上清を分離し、洗浄溶媒を用いて沈殿物を再分散させる工程を繰り返すことにより行うことができ、セロオリゴ糖が得られる。洗浄溶媒としては、反応溶媒と同様の水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いてもよく、あるいはまた水を用いてもよい。セロオリゴ糖は、上記の沈殿物（沈殿生成物）として得られるが、上清中にも含まれており、従って、上清中の生成物を回収することによってもセロオリゴ糖が得られる。
　得られるセロオリゴ糖は、グルコースがβ－１，４グリコシド結合により連結された構造を持つオリゴ糖である。セロオリゴ糖の重合度（即ち、上記式中のｎ）は、例えば４以上でもよく、５以上でもよく、６以上でもよく、また、例えば１５以下でもよく、１３以下でもよく、１１以下でもよい。平均重合度（ＤＰ）は、特に限定しないが、例えば５．５以上でもよく、６．０以上でもよく、６．３以上でもよく、また、例えば９．０以下でもよく、８．５以下でもよく、８．３以下でもよい。
　本実施形態により得られるセロオリゴ糖は、グルコースやセロビオースをプライマーとして用いて合成した場合のようにアルキル化されてないものでもよく、あるいはまた、アルキル化グルコースをプライマーとして用いて合成した場合のようにアルキル化されたものでもよい。すなわち、本実施形態に係るセロオリゴ糖は、アルキル化セロオリゴ糖のようなセロオリゴ糖の誘導体も包含するものである。ナトリウムイオン付加体やカリウムイオン付加体などのアルカリ金属イオン付加体も当然に包含される。なお、アルキル化グルコースをプライマーとして用いて合成した後、アルキル基を公知の方法で加水分解することにより、アルキル化されていないセロオリゴ糖を製造してもよい。
　本実施形態であると、ＣＤＰを用いたセロオリゴ糖の酵素合成において、反応溶媒として水と水溶性有機溶媒との混合溶媒を用いることにより、高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制し、比較的重合度が低いセロオリゴ糖を選択的に得ることができる。
　プライマーとしては、グルコースよりもセロビオースを用いた方が生成物の重合度選択性がより高くなり、重合度の分布をより狭くすることができる。その理由は、これにより限定することを意図するものではないが、セロビオースの方が、酵素間における反応開始までの時間がより均一になるためと考えられる。
　本実施形態に係るセロオリゴ糖の用途は、特に限定されず、例えば医薬品分野など、公知の様々な用途に用いることができる。
　以下、実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．実験方法
１－１．試薬
　ＬＢ－ＢＲＯＴＨ　ＬＥＮＮＯＸ及びＬＢ－ＡＧＡＲ　ＬＥＮＮＯＸはフナコシより購入した。グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル－β－Ｄ（－）－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１－ブタノール、αＧ１Ｐ二ナトリウム・ｎ水和物、４０％重水酸化ナトリウム重水溶液は和光純薬より購入した。
　Ｄ－（＋）－セロビオースはナカライテスクより購入した。ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）アガロースゲルはＱＩＡＧＥＮより購入した。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）はタカラバイオより購入した。
　アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、重水、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ　Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　１－７　ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ　Ｐ１４Ｒ　ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（Ｐ１４Ｒ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ　ＡＣＴＨ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　１８－３９　ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（ＡＣＴＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アセトニトリルはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
　その他の試薬は、特に表記しない限りナカライテスクより購入し、特級以上の試薬を使用した。
　超純水は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　Ａ－１０，　Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された水を使用した。純水はＴＡＮＫ　６０　Ｌｉｔｅ　ＰＥ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された水を使用した。
１－２．セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の調製及び酵素活性評価
　ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１－８に記載の方法と同様の方法により調製した。詳細は以下の通り。
１－２－１．試薬の調製
（１）滅菌精製水
　５００ｍＬ広口メディウム瓶に超純水５００ｍＬを採取してオートクレーブ（１２１℃、２０分間、ＢＳ－２４５、ＴＯＭＹ）して室温で保存した。
（２）５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液
　カナマイシン硫酸塩１．５ｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して－２０℃で保存した。
（３）１０ｍＭＩＰＴＧストック溶液
　ＩＰＴＧ７１．５ｍｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内においてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して－２０℃で保存した。
（４）ＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレート
　２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ－ＡＧＡＲ　ＬＥＮＮＯＸ２．８ｇを採取し、超純水８０ｍＬを添加して溶解させてオートクレーブした。６０℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液８０μＬを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、４℃で保存した。調製後１ヶ月以内に使用した。
（５）５０％グリセロール溶液
　２５０ｍＬ広口メディウム瓶にグリセロール５０ｍＬ、超純水５０ｍＬを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
（６）ＬＢ培地
　５００ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ－ＢＲＯＴＨ　ＬＥＮＮＯＸ１０ｇを純水５００ｍＬに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
（７）ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）
　３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）４．１８ｇを約６００ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１Ｌにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
（８）７０％エタノール（バイオテクノロジーグレード）
　エタノール（バイオテクノロジーグレード）１４０ｍＬ及び超純水６０ｍＬを２５０ｍＬ広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
（９）洗浄バッファー（２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
　ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール３４０ｍｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
（１０）溶出バッファー（２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
　ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール８．５１ｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
（１１）５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液
　アジ化ナトリウム５００ｍｇをプラスチック製スパチュラにより秤量してＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を添加して全量が１０ｍＬとなるよう溶解させて４℃で遮光保存した。
（１２）３０％アクリルアミド／ビス混合溶液
　アクリルアミド２９．２ｇ、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド０．８ｇを約７０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で遮光保存した。
（１３）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）１８．１７ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ８．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
（１４）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）
　Ｔｒｉｓ６．０６ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ６．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
（１５）１０％ＳＤＳ水溶液
　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０ｇを約９０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして室温で保存した。
（１６）１０％ＡＰＳ水溶液
　過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．１ｇを約１ｍＬの超純水に溶解させて４℃で保存した。
（１７）飽和１－ブタノール
　１－ブタノールと超純水を２：１の割合で混合して室温で保存した。
（１８）５×泳動バッファー（１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、９６０ｍＭグリシン、０．５％ＳＤＳ）
　Ｔｒｉｓ１５．１ｇ、グリシン７２．１ｇ、ＳＤＳ５．０ｇを全量が１Ｌとなるように超純水に溶解させて４℃で保存した。使用の際は超純水で５倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で２回とした。
（１９）５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．０５％ブロモフェノールブルー、１０％ＳＤＳ、５０％グリセロール）
　Ｔｒｉｓ２．４２ｇ、ＳＤＳ１０．０ｇ、ブロモフェノールブルー５０ｍｇを５０ｍＬのグリセロールと約４０ｍＬの超純水を添加して溶解させた。６Ｎ塩酸を用いてｐＨ６．８に調整後、１００ｍＬにメスアップした。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。
（２０）１Ｍ　ＤＴＴ溶液
　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）約１５０ｍｇを１Ｍとなるように約１ｍＬの超純水を添加して溶解させ、－２０℃で保存した。
（２１）固定液
　酢酸５０ｍＬ、エタノール２００ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
（２２）脱色液
　酢酸４０ｍＬ、エタノール１２５ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
（２３）染色液
　クマシーブリリアントブルーＲ－２５０　０．２５ｇを脱色液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
１－２－２．大腸菌の培養及びＣＤＰの発現
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰグリセロールストックの調製
　ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Clostridiumthermocellum YM4由来ＣＤＰの遺伝子を含むプラスミドをもつＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ）のグリセロールストックからＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌し、３７℃で８～１２時間培養した。予め乾熱滅菌した試験管に５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液５μＬとＬＢ培地５ｍＬの混合溶液を加えた後、加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから植菌した。ＯＤ６６０が０．６～０．８に達するまで振盪培養機（ＢＲ－２３ＦＰ、ＴＡＩＴＥＣ）を用いて３７℃で振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。その後、培養液８００μＬを１．７ｍＬチューブに採取し、５０％グリセロール溶液１００μＬを添加して混合した。液体窒素で凍結して－８０℃で保存した。
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰマスタープレートの調製
　ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰのグリセロールストックもしくは作製後１ヶ月以内のマスタープレートからＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８～１２時間培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま４℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８～１２時間培養して４℃で保存した。
（３）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ前培養液の調製
　乾熱滅菌した試験管にＬＢ培地３ｍＬを採取して５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３μＬを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて３７℃で１０～１２時間振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。
（４）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰの培養とＣＤＰの発現
　２本の１Ｌバッフル付きフラスコにＬＢ－ＢＲＯＴＨ　ＬＥＮＮＯＸ６ｇをそれぞれ秤量した後、純水３００ｍＬを加えてオートクレーブして放冷した。５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３００μＬをそれぞれに添加して混合した後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ前培養液３００μＬを加えた。振盪培養機を用いて３０℃で振盪培養（回転、６００ｒｐｍ）してＯＤ６６０が０．５５～０．６０に達したことを確認後、１０ｍＭ　ＩＰＴＧストック溶液３ｍＬをそれぞれ加えて２５℃で２０時間振盪培養（回転、２００ｒｐｍ）してＣＤＰを発現させた。
１－２－３．Ｈｉｓタグ精製及び緩衝液置換
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰの破砕によるＣＤＰの抽出
　１－２－２項（４）で調製したＣＤＰを発現させたＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ懸濁液を５０ｍＬチューブ１２本に約５０ｍＬずつ均等に分注し、遠心機（遠心機：ＥＸ－１２６、ＴＯＭＹ、ローター：３８５０－０４Ｐ、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間、４℃）した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰペレットにＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えてそれぞれ約１５ｍＬにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ懸濁液を４本の１００ｍＬ自立式チューブに約４５ｍＬずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて超音波照射してＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰを破砕した。超音波照射は、ｐｏｗｅｒ：２００Ｗ（ダイヤル１０）、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ：３０％の条件で２サイクル（５秒間超音波照射と２５秒間インターバルの４回繰り返しを１サイクル）行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液中のプロテアーゼ等によるＣＤＰの分解を防ぐために、以降はＥ．ｃｏｌｉ破砕液は常に氷浴した。４本の１００ｍＬチューブ中のＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液をそれぞれ５０ｍＬチューブに移して遠心（３５００ｒｐｍ、＞２０分間、４℃）した。その後、デカンテーションにより上清を５０ｍＬチューブに回収した。
（２）Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムによるＣＤＰの精製
　予め７０％エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径１．８ｃｍ、長さ１０ｃｍのプラスチック製カラムに、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースゲル（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分散液９．８ｍＬを充填した。カラム内を７０％エタノールで満たして流すことでＮＩ－ＮＴＡアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を２回繰り返した。ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）３ｍＬをアプライして流し、さらに３ｍＬアプライした。スパチュラで撹拌してＮｉ－ＮＴＡアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）５ｍＬで４回置換した。
　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液の上清をカラムにアプライし、カラムより流出した溶液を回収してフロースルー溶液とした。洗浄バッファー３～５ｍＬをアプライして置換し、さらに３～５ｍＬアプライした。ピペッティングによりＮｉ－ＮＴＡアガロースゲルを再分散させてゲル層の表面を均一にした後、アプライした洗浄バッファーを流した。さらに洗浄バッファー５ｍＬをアプライして置換する操作を繰り返し、合計で３０ｍＬ以上をアプライした。洗浄バッファーをアプライした際に通過した溶液は全て回収し、洗浄液とした。その後、溶出バッファー３～５ｍＬをアプライし、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつフラクションに分けて回収し、溶出液とした。この操作を繰り返し、合計で溶出バッファー２５ｍＬをアプライした。それぞれのフラクションの吸光度を微量紫外可視分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、２８０ｎｍの吸光度を指標にタンパク質の溶出を確認した。この際、バックグラウンド測定には超純水を用いた。タンパク質の溶出が完了していない場合は、２８０ｎｍの吸収が無くなるまでカラムに溶出バッファーをアプライした。回収した溶出液のうち、吸光度が高いフラクションを回収し、ＣＤＰ溶液とした。
（３）ＣＤＰ溶液の緩衝液置換
　ＣＤＰ溶液の緩衝液置換はＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、付属の説明書にしたがって行った。ＣＤＰ溶液の容量に応じて、必要な数のＰＤ１０カラムを用いた。付属のアダプターを用いてＰＤ１０カラムを５０ｍＬチューブに固定した。７０％エタノールで満たし、遠心機（ＭＸ－３０５、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（１０００ｇ、２分間、４℃）した。この操作を２回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液をＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で２５０倍希釈して調製した０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ　ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を４回繰り返すことでＰＤ１０カラムを緩衝液で置換した。さらに０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ　ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液を加え、遠心した。
　ＰＤ１０カラムを新たな５０ｍＬチューブに移し、遠心によるＳｅｐｈａｄｅｘの斜面を崩さないようにＣＤＰ溶液をＰＤ１０カラム１本につき１．７５～２．５ｍＬアプライした。前述の遠心時と同じ角度で遠心機に固定し、遠心した。溶出した溶液を回収してＣＤＰストック溶液とし、ＣＤＰストック溶液の２８０ｎｍの吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００ｃにより測定し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。
　カラム１本につき３０ｍＬのＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えて静置してカラムを洗浄した。次いで超純水で満たし、遠心する操作を２回繰り返した。同様に５０体積％エタノール水溶液で２回洗浄した。ＰＤ－１０カラムを５０体積％エタノール水溶液で満たして４℃で保存した。
１－２－４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によるＣＤＰの精製の確認
（１）１０％アクリルアミドゲルの調製
　５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液３．３３ｍＬ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）２．５ｍＬ、超純水４．０１ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液１００μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液５０μＬ、ＴＥＭＥＤ１０μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液３．５ｍＬを２枚のガラスプレートの間隙（０．７５ｍｍ）に加え、飽和１－ブタノール９００μＬを静かに重層し、室温で１時間静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和１－ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
　５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液０．４４ｍＬ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）０．４４ｍＬ、超純水２．０３ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液３３μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液１６．７μＬ、ＴＥＭＥＤ１．６５μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。溶液を分離ゲルの上に十分に加え、１０ウェルのコームを空気が入らないように注意しながらセットし、室温で１時間静置して重合した。生成したゲルはガラスプレートごと十分に湿らせたキムワイプで挟み、さらにラップで包み４℃で保存した。
（２）電気泳動による評価
　１．７ｍＬチューブにＰｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）５μＬ、１Ｍ　ＤＴＴ溶液２μＬ、５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２０μＬ、滅菌精製水１７３μＬを加えて混合し、これをマーカーとし、－２０℃で保存した。ＣＤＰストック溶液及びＣＤＰの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ１μＬを５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２μＬ、１Ｍ　ＤＴＴ１μＬ、超純水６μＬと混合した。これらと室温で解凍したマーカー１０μＬを１０５℃で熱処理し、卓上小型遠心機（Ｒ５－ＡＱＢＤ０２、Ｒｅｃｅｎｔｔｅｃ）によりスピンダウンした。本項（１）で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器（ミニプロティアンＴｅｔｒａセル、ＢＩＯ　ＲＡＤ）にセットし、超純水で５倍希釈した５×泳動バッファーを５００ｍＬ注ぎ、コームを外した。１ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置（ミニプロティアンＴｅｔｒａシステム、ＢＩＯ　ＲＡＤ）を用いて電圧１５０Ｖで約４０分間泳動した。バンドがゲルの下端より約１ｃｍ上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー（Ｗａｖｅ－ＰＲ、ＴＡＩＴＥＣＨ）で３０分間振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して６０分間振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して３０分間振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Ｇｅｌ　Ｄｏｃ　ＥＺ　Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ）により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
１－２－５．ＣＤＰの酵素活性測定
　Ｄ－（＋）－セロビオースを３００ｍＭとなるように超純水を用いて溶解させ、セロビオースストック溶液とした。ＣＤＰの活性は以下のように測定した。αＧ１Ｐ５０ｍＭとＤ－（＋）－セロビオース５０ｍＭ、及び所定倍率希釈されたＣＤＰを含む３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を３７℃でインキュベーションした。ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義した際のＵ／ｍＬを求め、酵素活性とした。ＣＤＰの希釈率は、反応時間が１００分の際におけるαＧ１Ｐの転化率が１０％以下になるように決定した。
１－３．セロオリゴ糖の酵素合成
１－３－１．ＣＤＰによるセロオリゴ糖の酵素合成（プライマー：グルコース）
　２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２３．８ｇを約６０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１００ｍＬにメスアップしてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。これをＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）とし、４℃で保存した。
　Ｄ－（＋）－グルコース及びαＧ１Ｐ二ナトリウムｎ水和物を所定量秤量し、それぞれ１Ｍとなるよう超純水に溶解させて、１Ｍグルコースストック溶液及び１ＭαＧ１Ｐ水溶液を得た。
　ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ＭαＧ１Ｐ水溶液、１Ｍグルコースストック溶液を反応時の濃度がそれぞれ５００ｍＭ、２００ｍＭ、５０ｍＭとなるよう４ｍＬチューブに加え、水溶性有機溶媒として所定量のメタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、使用するＣＤＰストック溶液の量を考慮し、超純水でメスアップした。超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。終濃度が０．２Ｕ／ｍＬになるようＣＤＰストック溶液を適量加え、気泡が発生しないようピペッティングにより混合した。１．７ｍＬチューブもしくは１ｍＬマイティーバイアルに所定量分取し、６０℃で３日間インキュベーションした。
　反応溶媒である混合溶媒に関し、１０体積％のＭｅＯＨを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ７．５）を１０％ＭｅＯＨと表すこととした（即ち、混合溶媒中に１０体積％のＭｅＯＨを含む）。他の混合溶媒についても同様に表す。なお、コントロールとして、水溶性有機溶媒を添加せず、その他は同様にしてインキュベーションしたものを「（－）」と表す。
１－３－２．ＣＤＰによるセロオリゴ糖の酵素合成（プライマー：セロビオース）
　１Ｍグルコースストック溶液の代わりに３００ｍＭセロビオースストック溶液を用い、その他は１－３－１項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。
１－３－３．ＣＤＰによるセロオリゴ糖の酵素合成（プライマー：アルキル化グルコース）
　１Ｍグルコースストック溶液の代わりに、３００ｍＭエチルグルコシドストック溶液又は３００ｍＭオクチルグルコシドストック溶液を用い、その他は１－３－１項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。３００ｍＭエチルグルコシドストック溶液及び３００ｍＭオクチルグルコシドストック溶液は、エチルβ－Ｄ－グルコシド（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）及びｎ－オクチルβ－グルコシド（Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を所定量秤量し、それぞれ３００ｍＭとなるよう超純水に溶解させて調製したものである。
１－３－４．酵素合成されたセロオリゴ糖の精製
　１－３－１～３項において調製された生成物を各種分析に用いるために、超純水又は超純水と有機溶媒の混合溶媒を洗浄溶媒として用いて精製した。詳細には、洗浄溶媒を加えてピペッティングによる水流により生成物を機械的に破壊して分散させ、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間以上、４℃）し、上清を除去した。洗浄溶媒を加えて１０倍希釈し沈澱物を再分散させ、遠心する操作を５回繰り返し、溶液の置換率が９９．９９９％以上となるまで精製した。精製した分散液を１００℃のヒートブロックにより１０分間加熱することで、残存するＣＤＰを失活させた。なお、コントロール（－）については、洗浄溶媒として超純水を用いて精製した。
　生成物の収量は、精製後の水分散液を絶乾することで算出した。予め１０５℃で２４時間乾燥させ、デシケーター内で放冷したサンプル管を秤量し、精製後の水分散液を加えて１０５℃で２４時間乾燥させ、その後デシケーター内で放冷して秤量した。乾燥前後の重量の差から生成物の濃度を算出した。この操作は同時に３回行い、それらの平均値より生成物の収量を算出した。
　マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）法による測定を用いる場合は、精製後の分散液を超純水により希釈して用いた。
１－４．酵素合成されたセロオリゴ糖の特性評価
１－４－１．生成物の反転倒立試験
　１ｍＬマイティーバイアルを用いて調製したサンプルについて、反転倒立試験によりゲル化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物が流動しなかった場合にゲル状の構造体を形成したと判断した。
１－４－２．生成物の化学構造の評価
（１）生成物の収量測定
　１－３－４項で示した手法で、絶乾により収量を算出した。
（２）生成物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定
　質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはＢｒａｄｙｋｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　１－７水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ　Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ１－７、０．０５質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０質量％アセトニトリル）、Ｐ１４Ｒ水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ　Ｐ１４Ｒ、０．１質量％ＴＦＡ）、ＡＣＴＨ　ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ　ＡＣＴＨ　ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９、０．１質量％ＴＦＡ）それぞれ５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ　ＤＨＢＡ水溶液５μＬ、１．０質量％ＴＦＡ水溶液１μＬ、アセトニトリル４μＬを１．７ｍＬチューブ中で混合して調製した。
　生成物の測定サンプルは、０．１％（ｗ／ｖ）とした生成物の水分散液１μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ　ＤＨＢＡ水溶液１μＬ、トリフルオロ酢酸（０．２体積％）のアセトニトリル溶液３μＬを、水酸化カリウム（３．３質量％）のメタノール溶液により洗浄したマイティーバイアル中で混合して調製した。
　標準サンプル及び生成物の測定サンプルそれぞれ１μＬをサンプルプレートにマウントし、風乾させる操作を５回繰り返した。１時間以上、真空乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＡＸＩＭＡ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、島津製作所）で測定した。測定条件はＭｏｄｅ：Ｌｉｎｅｒ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、Ｍａｓｓ　Ｒａｎｇｅ：１．０－３０００．０、Ｍａｘ　Ｌｅａｓｅｒ　Ｒａｐ　Ｒａｔｅ：１０、ｐｏｗｅｒ：１００、ｐｒｏｆｉｌｅｓ：１００、ｓｈｏｔｓ：２、Ｉｏｎ　Ｇａｔｅ（Ｄａ）：Ｂｌａｎｋ５００、Ｐｕｌｓｅｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ａｔ　（Ｄａ）：１０００．０とした。
　測定により得られたＭＳスペクトルは、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ：Ｇａｕｓｓｉａｎ、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ　ｆｉｌｔｅｒ　ｗｉｄｔｈ：１９、Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｆｉｌｔｅｒ　ｗｉｄｔｈ：１０００の条件で処理した。
　ナトリウムイオン付加体とカリウムイオン付加体のピーク面積を合計し、各重合度のピーク面積を算出した。算出した各重合度のピーク面積の割合から重合度の平均値を算出し、平均重合度とした。重合度の分布は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを以下の式に従って解析することにより、平均重合度からの標準偏差により評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
２．結果及び考察
２－１．酵素反応後の溶液状態
　グルコースもしくはセロビオースをＣＤＰによる酵素合成系に適用した。モノマーとしてαＧ１Ｐ、プライマーとしてグルコースもしくはセロビオースを用い、所定濃度の水溶性有機溶媒を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ７．５）中、６０℃で３日間インキュベーションした。その結果、いずれの水溶性有機溶媒を用いた場合も反応後の溶液全体が白濁したことから、同条件下でプライマーがＣＤＰにより認識され、セロオリゴ糖が酵素合成されていることが示唆された（図１（グルコースプライマー合成系）および図２（セロビオースプライマー合成系）参照）。さらに、グルコースプライマーでは反応溶媒として１０％ＥｔＯＨ、２０％ＤＭＳＯを用いた場合、及び、セロビオースプライマーではいずれの反応溶媒の場合も、容器を反転させても溶液が流れ落ちず、ゲル状の構造体が生成された。
２－２．酵素合成されたセロオリゴ糖の重合度とその分布の評価
２－２－１．グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
　グルコースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図３に示す通りであり、いずれもｍ／ｚの間隔がグルコシルユニット（１６２Ｄａ）に対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が６～１６量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合、水溶性有機溶媒を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが同等又はやや低くなった。また、標準偏差が小さく、重合度の分布が狭いものであった。また、図３から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、重合度ｎが１４～１６である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
　下記表１は、図３のＭＳスペクトルデータから１０％ＭｅＯＨと２０％ＤＭＳＯとコントロール（－）についての各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表１から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高いオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、表１では重合度１５及び１６の割合を示していないが、これはそれらの割合が１％未満であるためである。また、表１中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
２－２－２．セロビオースプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
　セロビオースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図４に示す通りであり、いずれもｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が４～１０量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、２－２－１項での結果との対比から明らかなように、セロビオースをプライマーとして用いた場合、グルコースをプライマーとして用いた場合よりも、重合度が低く、その分布も狭いものであり、重合度選択性がより高いことがわかった。
　水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合、水溶性有機溶媒を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰがやや低くなった。一方、標準偏差についてはコントロール（－）でもかなり小さい値であるため、顕著な違いは認められなかった。しかしながら、図４のＭＳスペクトルから明らかなように、混合溶媒を用いた場合、重合度ｎが８～１０である高重合度のオリゴマーの生成がコントロール（－）に対して抑えられていた。
　下記表２は、図４のＭＳスペクトルデータから１０％ＭｅＯＨと１５％ＤＭＦと２０％ＤＭＳＯとコントロール（－）についての各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表２から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高い（重合度＝８～９）オリゴマーの生成が抑えられており、特に１５％ＤＭＦと２０％ＤＭＳＯにおいてその効果が高かった。なお、表２中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
　絶乾により算出した沈澱生成物の収量とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定から算出した平均重合度ＤＰを用いて、モノマーであるαＧ１Ｐの転化率を算出した。結果は表２に示す通りであり、１０％ＭｅＯＨ、１５％ＤＭＦ、２０％ＤＭＳＯ、及びコントロール（－）についてのαＧ１Ｐ転化率はそれぞれおよそ６５％、５０％、６０％、５５％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
２－２－３．洗浄溶媒の影響、及び沈殿生成物と上清中の生成物の違いの確認
　２－２－２項と同様にセロビオースプライマーを用いて２０％ＤＭＳＯ中で酵素合成した生成物について、洗浄溶媒として水もしくは２０％ＤＭＳＯを用いて遠心・再分散を５回繰り返し精製した。該精製時における３～５回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、それぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。
　結果は図５に示す通りであり、ＭＳスペクトル、平均重合度ＤＰ及び標準偏差について洗浄溶媒による違いはほとんどみられなかった。そのため、２－２－２項におけるＭＳスペクトル等の違いは洗浄溶媒によるものではなく、反応溶媒の違いによるものであることがわかった。
２－２－４．上清中の生成物の確認
　２－２－２項と同様にセロビオースプライマーを用いて２０％ＤＭＳＯ又は３０％ＤＭＳＯ中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散を５回繰り返し精製した。２０％ＤＭＳＯの反応では該精製時における３～５回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、３０％ＤＭＳＯの反応では該精製時における１回遠心後の上清を混合しミリポア社製ＺｉｐＴｉｐにより脱塩して得られた上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、それぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。
　結果は図６に示す通りであり、３０％ＤＭＳＯを反応溶媒とする場合とする場合も、２０％ＤＭＳＯの場合と同様、重合度ｎが８～１０である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、図６における符号Ｚで示すピークは、ＺｉｐＴｉｐ由来の不純物と考えられる。
２－２－５．エチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
　エチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を５回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図７に示す通りであり、ｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が６～９量体程度のエチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度ｎが９～１１である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
　下記表３は、図７のＭＳスペクトルデータから各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表３から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高いオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、表３中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
２－２－６．オクチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
　オクチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を５回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図８に示す通りであり、ｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が５～７量体程度のオクチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度ｎが７～９である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
　下記表４は、図８のＭＳスペクトルデータから各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表４から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高いオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、表４中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

Claims (2)

  1. 　α－グルコース－１－リン酸と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、セロオリゴ糖の製造方法。
  2. 　前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
PCT/JP2019/015839 2018-05-02 2019-04-11 セロオリゴ糖の製造方法 WO2019211971A1 (ja)

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