WO2019170147A1 - 用于治疗肿瘤的方法和组合物 - Google Patents

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李宗海
王华茂
周敏
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科济生物医药（上海）有限公司
上海市肿瘤研究所
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Definitions

  • the invention belongs to the field of immunotherapy; in particular, it relates to immunocyte treatment for targeting and recognizing tumor antigens, initiating activation of immune effector cells and exerting anti-tumor effects.
  • the first dose or subsequent dose is divided into N doses within 3-15 days, and N is a natural number not less than one.
  • the chemotherapeutic agent is a combination of cyclophosphamide and fludarabine; or a combination of cyclophosphamide, fludarabine, and albumin-bound paclitaxel.
  • the T lymphocytes are derived from a foreign body.
  • two or more subsequent doses of immune effector cells are administered, each administration of a subsequent dose of immune effector cells at intervals of from about 21 to about 80 days, or from about 25 to about 60 days, or about 2550 days, each including a terminal value.
  • the immune effector cells proliferate in the subject after administration of the first dose or subsequent dose of immune effector cells.
  • a neurotoxicity or CRS level is reduced compared to the peak level of neurotoxicity or CRS level after administration of the first dose of immune effector cells;
  • the composition comprises cyclophosphamide, fludarabine, and paclitaxel.
  • the tumor is a solid tumor.
  • the cyclophosphamide and/or the fludarabine are used continuously for no more than 4 days and the taxane compound is administered once.
  • the administration instructions describe that the cyclophosphamide, fludarabine, and taxane compounds are administered 4-12 days prior to administration of the immune effector cells.
  • a cell or population of cells is "negative” to a particular marker, which does not have a specific marker on the cell or in the cell, such as a surface marker or, although present, is substantially undetectable.
  • the term means that surface expression is not detected by flow cytometry, or although surface expression is detected, for example, when staining with an antibody that specifically binds to the marker, and detecting the antibody
  • the staining can be detected by flow cytometry at a level that is significantly lower than the level of staining detected when the same step is performed with the isotype-matched control under otherwise identical conditions. And/or significantly lower than the level of cells known to be positive for said marker, and/or substantially similar to the level of cells known to be negative for said marker.
  • the relapsed cells or immune effector cells that are reinfused each time within one of the plurality of courses are aliquots of the adoptive cells or immune effector cells to be reinfused. In some embodiments, the relapsed cells or immune effector cells that are reinfused each time within one of the plurality of courses are non-equal components of the adoptive cells or immune effector cells to be reinfused. In some embodiments, the amount of adoptive cells or immune effector cells that are reinfused each time during one of the plurality of courses is determined by the physician based on the particular circumstances of the subject.
  • the specific condition of the subject may be, for example, the overall health of the subject, the severity of the disease, the response to the previous dose of the same course of treatment, the response to the previous course of treatment, the combined use of the subject, the degree of toxicity or Probability, complications, cancer metastasis, and any other factors that the physician believes will affect the amount of adoptive cells or immune effector cells that the subject is suitable for reinfusion.
  • a certain amount of adoptive cells or immune effector cells are returned in the same number of times in each of the plurality of courses of treatment.
  • a certain amount of adoptive cells or immune effector cells are returned at different times in each of the plurality of courses of treatment.
  • a "subject” as used herein is a mammal, such as a human or other animal, and is usually a human.
  • the subject has employed tumor chemotherapy or radiation therapy prior to administration of the first dose and/or prior to administration of the subsequent dose.
  • the subject is refractory or non-responsive to other therapeutic agents.
  • the cells can be administered by any suitable means, for example, by injection, for example, intravenous or subcutaneous injection, intraocular injection, fundus injection, subretinal injection, intravitreal injection, reverse septal injection, subscleral injection, intrachoroidal injection. , anterior chamber injection, subconjectal injection, subconjuntival injection, intrascleral injection, retrobulbar injection, periocular injection or peribulbar delivery. In some embodiments, they are administered parenterally, intrapulmonally, and intranasally, and if desired for topical treatment, are administered intralesionally. Extraperitoneal infusion includes intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. In some embodiments, a given dose is administered by administering a single bolus to the cells. In some embodiments, the cells are administered by multiple bolus injections, for example, multiple administrations for no more than 20 days, or by continuous infusion of the cells.
  • the additional therapeutic agent can be administered by any suitable means, for example, by injection, for example, intravenous or subcutaneous injection, intraocular injection, fundus injection, subretinal injection, intravitreal injection, reverse septal injection, subscleral injection, Intrachoroidal injection, anterior chamber injection, subconjectal injection, subconjuntival injection, intrascleral injection, retrobulbar injection, periocular injection or peribulbar delivery.
  • injection for example, intravenous or subcutaneous injection, intraocular injection, fundus injection, subretinal injection, intravitreal injection, reverse septal injection, subscleral injection, Intrachoroidal injection, anterior chamber injection, subconjectal injection, subconjuntival injection, intrascleral injection, retrobulbar injection, periocular injection or peribulbar delivery.
  • they are delivered parenterally, intrapulmonarily, and intranasally, and if desired for topical treatment, can be administered intralesion.
  • Extraperitoneal infusion includes intramuscular, intravenous, intraart
  • a microtubule inhibitor eg, paclitaxel, particularly albumin-bound paclitaxel
  • two additional chemotherapeutic agents eg, fludarabine and cyclophosphamide
  • fludarabine and cyclophosphamide will be used as representative chemotherapeutic agents
  • (albumin-bound) paclitaxel as a representative microtubule inhibitor is described in the use of a microtubule inhibitor and Specific embodiments when two additional chemotherapeutic agents are pretreated.
  • the invention includes a pretreatment method prior to infusion of an immune effector cell, the method comprising administering to the patient a dose of about 20 mg/m 2 /day of fludarabine at a dose of about 507 mg/m 2 /day cyclophosphamide and albumin-bound paclitaxel at a dose of about 68 mg/m 2 /day, wherein fludarabine is administered on day -6, and rings are given at -6, -5, -4, and -3 days Phosphoramide, and albumin-bound paclitaxel was administered on day -5.
  • 1 ⁇ 10 7 equal to or about 1.3 ⁇ 10 7 , equal to or about 1.6 ⁇ 10 7 , equal to or about 1.9 ⁇ 10 7 , equal to or about 2 ⁇ 10 7 , equal to or about 2.2 ⁇ 10 7 , equal to or about 3.7 ⁇ 10 7 , equal to or about 5 ⁇ 10 7 , or equal to or about 5.1 ⁇ 10 7 , or equal to or about 1 ⁇ 10 8 , or equal to or about 2.5 ⁇ 10 8 , or equal to or about 1 ⁇ 10 9 , or equal to or Approximately 1 x 10 10 , or equal to or about 5 x 10 10 such cells per kilogram of subject weight, or a value in the range between any two of the above values.
  • the subsequent doses can be increased, e.g., more than about 1 ⁇ 10 7 cells (e.g., total cellular receptor - expressing cells, T cells, or PBMCs) / kg body weight, for example greater than about 2.0x10 7, 2.5x10 7, 3.0x10 7 , 5.0x10 7, 1x10 8, 2.5x10 8 cells / kg, and / or greater than the first dose.
  • 1 ⁇ 10 7 cells e.g., total cellular receptor - expressing cells, T cells, or PBMCs
  • kg body weight for example greater than about 2.0x10 7, 2.5x10 7, 3.0x10 7 , 5.0x10 7, 1x10 8, 2.5x10 8 cells / kg, and / or greater than the first dose.
  • the subsequent dose administered is no more than about 21 to about 80 days, about 25 to about 60 days, or 25 to 55 days after administration of a subsequent preceding amount. In some embodiments, administration of the subsequent subsequent dose does not exceed about 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 31 days, 32 days, 33 days, 34 after administration of the adjacent online subsequent dose. Day, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 days, 52 days, 53 days, 54 days, 55 days, 56 days, 57 days, 58 days, 59 days or 60 days.
  • an immune response to a chimeric antigen receptor or cell has been developed in a subject, an adaptive or specific immune response, a detectable immune response and/or a memory response prior to administration of a subsequent dose.
  • the ability of subsequent doses of cell proliferation and/or persistence in the subject is improved as compared to other methods of administering subsequent doses at later time points than other prior or first doses.
  • the method includes detecting the presence or absence or level of such an immune response or its indicator, for example, after administration of a first or subsequent dose and prior to administration of a subsequent or next subsequent dose.
  • the treatment by this method has a reduced probability of recurrence compared to other methods.
  • the probability of recurrence or progression 1 month after the first dose is less than about 80%, less than about 70%, less than about 60%, less than about 50%, less than about 40%, less than about 30%, less than About 20%, less than about 10%, less than about 9%, less than about 8%, less than about 7%, and less than about 6%.
  • the number of copies of the nucleic acid encoding the chimeric antigen receptor per 100 cells eg, vector copy number, as measured in immunohistochemistry, PCR, and/or flow cytometry, eg, in peripheral blood or bone marrow or other compartments
  • at least 0.01, at least 0.1, at least 1, or at least 10 administered to the cells, for example, about 1 week, about 2 weeks, about 3 weeks, about 4 weeks, about 5 weeks after the first dose or subsequent dose, Or at least about 6 weeks, or at least about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 months, or at least 2 or 3 years.
  • the transmembrane domain is a transmembrane domain derived from CD4, CD28 or CD8, eg, CD8 ⁇ or a functional variant thereof.
  • the transmembrane domain is synthetic.
  • the synthetic transmembrane domain comprises predominantly hydrophobic residues such as leucine and valine.
  • trimers of phenylalanine, tryptophan, and valine will occur at each end of the synthetic transmembrane domain.
  • the ligation occurs through a linker, a spacer, and/or a transmembrane domain.
  • the transmembrane domain of the chimeric antigen receptor is or comprises a transmembrane domain of human CD28 (eg, Accession No. P01747.1) or variant thereof, for example, comprising The transmembrane domain of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, or at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, with SEQ ID NO: 39, Amino acid sequence of 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence identity.
  • the memory T cells are present in the CD62L+ and CD62L-subgroups of CD8+ peripheral blood lymphocytes.
  • PBMC can be enriched or consumed for CD62L-CD8+ and/or CD62L+CD8+ moieties, for example, anti-CD8 and anti-CD62L antibodies.
  • the method of preparation comprises: a freezing step, for example, freezing the cells before or after isolation, incubation, and/or engineering.
  • the freezing and subsequent melting steps remove granulocytes and, to some extent, remove monocytes from the population of cells.
  • the cells are suspended in a frozen solution, for example, after a washing step to remove plasma and platelets.
  • any of a variety of known frozen solutions and parameters can be employed.
  • the cells are then typically frozen to -80 ° C or -90 ° C at a rate of 1 ° / minute using a programmed cooling device and stored in the vapor phase of the liquid nitrogen storage tank.
  • the cells are incubated and/or cultured prior to genetic engineering or with genetic engineering.
  • the incubation step can include culturing, culturing, stimulating, activating, and/or proliferating.
  • the cells or compositions are incubated in the presence of a stimulating or stimulating agent.
  • Such conditions include designing to induce cell proliferation, reproduction, activation, and/or survival in a population to mimic antigen contact, and/or to prime cells for genetic engineering, such as those used to introduce recombinant antigen receptors.
  • pharmaceutical formulation refers to a formulation of a form that allows for the biological activity of the active ingredient contained therein to be effective and free of additional ingredients that are unacceptable to the subject to which the formulation is to be administered.
  • the liquid or viscous composition may include a carrier, which may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, saline, phosphate buffered saline, a polyhydroxy compound (eg, glycerin, propylene glycol, liquid polyethylene glycol) and A suitable mixture.
  • a carrier which may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, saline, phosphate buffered saline, a polyhydroxy compound (eg, glycerin, propylene glycol, liquid polyethylene glycol) and A suitable mixture.
  • Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the cells in a solvent such as a suitable vehicle, diluent, or excipient such as sterile water, physiological saline, dextrose, dextrose, and the like.
  • the anti-tumor effect on solid tumors is remarkable, and provides a safe and effective treatment method for stabilizing and even curing CLA18A2-positive middle and late stage digestive tract adenocarcinoma.

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Abstract

本发明提供一种免疫效应细胞的组合物，其中所述免疫效应细胞的组合物包含首剂量的免疫效应细胞和后续剂量的免疫效应细胞以及包含这种免疫效应细胞的组合物的治疗用试剂盒。

Description

用于治疗肿瘤的方法和组合物 技术领域
本发明属于免疫治疗领域；具体地，涉及靶向识别肿瘤抗原、引发免疫效应细胞活化且发挥抗肿瘤效应的免疫细胞治疗。
背景技术
肿瘤免疫疗法近年来得到广泛的关注和应用，尤其是CAR-T技术的出现，使人类对肿瘤的控制得到了里程碑式的发展。
实体瘤中的癌细胞能够在其周围形成肿瘤微环境以支持癌细胞的生长和转移。肿瘤微环境是肿瘤存在的细胞环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、其他细胞、可溶性因子、信号传导分子、细胞外基质和可促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、培养治疗抗性并为休眠转移茁壮成长提供微环境的机械因子(mechanical cue)。肿瘤及其周围的微环境密切相关，不断交互，肿瘤可以通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响它们的微环境。参见Swarts等，“Tumor Microenvironment Complexity:Emerging Roles in Cancer Therapy”Cancer Res,72卷,第2473-2480页,2012。因此CAR-T技术应用于实体瘤的治疗通常难以奏效。例如，目前大多文献报道在血液肿瘤中，CD19的CAR T细胞治疗能给病人带来很好的临床治疗效果。但CAR T细胞治疗在实体肿瘤治疗中，尚未取得令人满意的疗效。
因此，本领域急需能够在实体瘤的肿瘤微环境中具备显著抗肿瘤能力的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够对CLD18阳性的实体瘤具备优异杀伤作用的技术手段。
在第一方面，本发明提供一种治疗CLD18阳性的肿瘤方法，所述方法包括将首剂量的免疫效应细胞给予有此需要的受试者，所述免疫效应细胞表达嵌合抗原受体(CAR)且特异性识别CLD18，所述首剂量包含不超过约2x10 10细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 12细胞。优选地，所述首剂量包含不超过约2x10 9细胞 /千克受试者体重或总量不超过约1x10 11细胞。优选的，所述首剂量包含不超过约2.5x10 8细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 10细胞。优选地，所述首剂量包含不超过约5x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过约1x10 10细胞。更优选地，所述首剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过约5x10 9或约2x10 9细胞。
在优选的实施方式中，所述首剂量不低于1*10 5细胞/千克受试者体重。
在具体的实施方式中，所述CLD18为CLD18A2。
在具体的实施方式中，给予所述首剂量的免疫效应细胞后，再给予至少一次的后续剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)且特异性识别CLD18的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，在对患者安全的前提下，给予所述后续剂量的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，所述首剂量的免疫效应细胞与所述后续剂量的免疫效应细胞相同。
在优选的实施方式中，所述首剂量的免疫效应细胞与所述后续剂量的免疫效应细胞均识别CLD18A2，但含有不同的嵌合抗原受体，如嵌合抗原受体的胞外段不同，但均识别CLD18A2，或者嵌合抗原受体的胞外段相同，但跨膜域或者胞内域不同。
在具体的实施方式中，所述首剂量给予的免疫效应细胞在体内检测不到后，再给予所述后续剂量的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，如通过qPCR测量。
在具体的实施方式中，所述首剂量给予后约21至80天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；优选的，在所述首剂量给予后约25至60天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；更优选地，在所述首剂量给予后约-25至50给予所述的后续剂量的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量低于或等于或高于首剂量。
在优选的实施方式中，所述后续剂量与所述首剂量相当。
在优选的实施方式中，所述后续剂量低于所述首剂量。
在优选的实施方式中，所述后续剂量高于所述首剂量。
在具体的实施方式中，所述后续剂量高于首剂量；优选的，所述后续剂量是所述首剂量中的至少2倍、5倍、7倍或10倍。
在具体的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约2x10 10细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 12细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约2x10 9细胞/千克受试者体重或总量不超过约1x10 11细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约2.5x10 8细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 10细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约5x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过约1x10 10细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过5x10 9或约2x10 9细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量不低于1x10 5细胞/千克受试者体重。
在具体的实施方式中，所述首剂量或后续剂量在20天内，分成N次给药，N为不小于1的自然数。
在优选的实施方式中，所述首剂量或后续剂量在3-15天内，分成N次给药，N为不小于1的自然数。
在优选的实施方式中，N为1、2、3或4。
在优选的实施方式中，N为2或3。
在具体的实施方式中，给予后续剂量时，所述受试者具有以下任一特征：
(i)指示细胞因子释放综合征(CRS)的因子的受试者中血清水平倍数比在所述首剂量给予之前即刻的受试者中的水平小约10倍、小约25倍、和/或小约50倍；
(ii)没有显示出3级或更高的神经毒性；
(iii)神经毒性或CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞后的神经毒性或CRS水平的峰值水平相比，呈现降低；或者
(iv)所述受试者没有显示出针对由所述首剂量的细胞表达的CAR的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。
在具体的实施方式中，上述给予后续剂量时，所述受试者具有特征(iii)时，CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞后的CRS的峰值水平相比，降低至少50％，优选的，降低至少20％，更优的，降低至少5％，或者CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞之前的CRS水平相当。
在优选的实施方式中，所述CRS水平可以由以下信息进行评估：发热、低血压、缺氧、神经障碍、或炎性细胞因子或C反应性蛋白(CRP)的血清水平。
在优选的实施方式中，与神经毒性的临床风险和/或3级或更高神经毒性相关的症状选自混乱、谵妄、表达性失语、反应迟钝、肌阵挛、嗜睡、改变的精神状态、惊厥、癫痫-样活动、癫痫(任选地由脑电图EEG确诊)、淀粉样β(Aβ)水平升高、谷 氨酸水平升高、和氧自由基水平升高。
在具体的实施方式中，所述方法还包括在给予所述的免疫效应细胞之前进行预处理，所述预处理包括给予所述受试者化疗剂、或者对所述受试者进行全身辐射、或对所述受试者进行局部辐射治疗，或其组合。
在优选的实施方式中，所述预处理在首剂量之前或首剂量和后续剂量之间进行；更优选地，所述预处理在给予首剂量和后续剂量之前进行。
在优选的实施方式中，给予首剂量的免疫效应细胞之前进行所述预处理，在给予后续剂量的免疫效应细胞之前不需要进行所述预处理。
在优选的实施方式中，给予首剂量的免疫效应细胞之前和给予后续剂量的免疫效应细胞之前均需要进行所述预处理。
在优选的实施方式中，所述预处理是为了进行淋巴细胞清除。
在优选的实施方式中，所述预处理是为了稳定肿瘤负荷或降低肿瘤负荷，特别是在给予免疫效应细胞治疗之前维持肿瘤负荷稳定或降低肿瘤负荷。
在优选的实施方式中，给予所述受试者淋巴消耗剂进行淋巴细胞清除。淋巴消耗剂如环磷酰胺、氟达拉滨等。
在具体的实施方式中，所述预处理在给予免疫效应细胞前4-12天实施。
在具体的实施方式中，所述化疗剂选自以下任一种化疗药物或其组合：环磷酰胺、氟达拉滨、紫杉烷类化合物、嘧啶类抗肿瘤药物。
在优选的实施方式中，所述紫杉烷类化合物包括但不限于紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛，优选白蛋白结合型紫杉醇；所述嘧啶类抗肿瘤药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、吉美嘧啶、奥替拉西钾、双呋氟尿嘧啶、卡莫氟、去氧氟尿苷、卡培他滨。
在具体的实施方式中，所述化疗剂为环磷酰胺和氟达拉滨的组合；或者环磷酰胺、氟达拉滨以及白蛋白结合型紫杉醇的组合。
在优选的实施方式中，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天。
在优选的实施方式中，环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天。
在优选的实施方式中，白蛋白结合型紫杉醇给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
在具体的实施方式中，所述化疗剂连续使用不超过4天。
在具体的实施方式中，所述环磷酰胺和/或所述氟达拉滨连续使用不超过4天，所述白蛋白结合型紫杉醇给予一次。
在优选的实施方式中，进行预处理，特别是在给予首剂量和后续剂量之前进行预处理，随后给予的所述免疫效应细胞的剂量可以相应降低。
在具体的实施方式中，所述肿瘤为CLD18A2阳性的肿瘤；优选地，所述肿瘤为CLD18A2阳性消化道肿瘤；更优选地，所述消化道肿瘤为腺癌；最优选地，所述消化道肿瘤为胰腺癌、胃腺癌。
在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体包括胞外域、跨膜域及胞内域，胞外域为特异性结合CLD18A2的抗体或其片段。
在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的跨膜域为CD28或CD8的跨膜区。
在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的胞内域为CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽、或者CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽、或者CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽。
在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体包括特异性结合CLD18A2的抗体或其片段、跨膜域及胞内域，所述抗体具有：
SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：7所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：9或68所示的HCDR2、SEQ ID NO：10所示的HCDR3、SEQ ID NO：11所示的LCDR1、SEQ ID NO：12所示的LCDR2、SEQ ID NO：13所示的LCDR3。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段具有：
SEQ ID NO：14所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：20所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：53所示的重链可变区和SEQ ID NO：52所示的轻链可变区。优选的，所述抗体或其片段具有SEQ ID NO：54、56、57、或58所示的序列。
在优选的实施方式中，所述抗体或其片段具有SEQ ID NO：14所示的重链可 变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。
在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32任一所示氨基酸序列；优选的，为SEQ ID NO：24、25或26所示的序列。
在优选的实施方式中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26任一所示的氨基酸序列。
在一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述免疫效应细胞是T淋巴细胞、NK细胞或者NKT淋巴细胞。
在优选的实施方式中，所述的优选免疫效应细胞是T淋巴细胞。
在优选的实施方式中，所述T淋巴细胞来自所述受试者自体。
在优选的实施方式中，所述T淋巴细胞来自异体。
在具体的实施方式中，给予两次及以上的后续剂量的免疫效应细胞，每次给予后续剂量的免疫效应细胞的间隔时间是约21至约80天，或约25至约60天，或约2550天，各自包括端值。
在一优选方案中，在后给予的后续剂量的免疫效应细胞，与在先给予的后续剂量的免疫效应细胞相比，所述受试者的肿瘤负荷稳定或降低。
在具体的实施方式中，每次给予的后续剂量的免疫细胞数量基本相同。
在具体的实施方式中，后给的后续剂量的免疫效应细胞数量高于在先给的后续剂量的免疫细胞数。
在具体的实施方式中，后给的后续剂量的免疫效应细胞数量低于在先给的后续剂量的免疫细胞数。
在具体的实施方式中，给予所述免疫效应细胞之前，所述受试者没有接受过靶向CLD18的表达嵌合抗原受体的免疫细胞的治疗。
在具体的实施方式中，所述的后续剂量为足以稳定或降低所述受试者的肿瘤负荷的细胞数量。
在具体的实施方式中，在给予所述首剂量之前，所述受试者已经进行了手术治疗、化疗、或者不同于第一方面所述的免疫治疗。
在具体的实施方式中，在首剂量给予之前，或者在首剂量给予之后并在后续剂量给予之前，对所述受试者的指示CRS的因子、指示神经毒性的因子、指示肿瘤负荷的因子、和/或指示宿主抗-CAR免疫应答的因子的血清水平进行评价。
在具体的实施方式中，所述的指示肿瘤负荷的因子为：所述受试者的肿瘤细 胞总数、或者所述受试者的器官中肿瘤细胞总数、或者所述受试者的组织中的肿瘤细胞总数、或者肿瘤的质量或体积，或者肿瘤转移的程度、或者肿瘤数量。
在具体的实施方式中，所述治疗肿瘤的方法包括：
i)在给予后续剂量之前评价指示肿瘤负荷的因子；和
ii)基于所述评价的结果，确定待给予所述受试者的细胞的连续剂量，并且
iii)如果评价确定所述受试者的肿瘤质量或体积稳定或下降，给予所述受试者包含少于或多于所述首剂量中的CAR-表达细胞的数量或与其大约相同的CAR表达细胞的数量的后续剂量。
在具体的实施方式中，所述首剂量或所述后续剂量给予的细胞的数量为约1.1x10 6细胞/kg受试者体重至2.8x10 7细胞/kg，约2.9x10 6细胞/kg至2.6x10 7细胞/kg或约3.3x10 6细胞/kg至1.3x10 7细胞/kg或约1.3x10 7细胞/kg至1.8x10 7细胞/kg，各自包括端值。
在具体的实施方式中，后续剂量的CAR表达细胞给予的细胞的数量包含约1.1x10 7细胞/千克(细胞/kg)体重至约5.1x10 7细胞/kg，约1.3x10 7细胞/kg至约3.7x10 7细胞/kg，约1.6x10 7细胞/kg至约2.2x10 7细胞/kg，约1.9x10 7细胞/kg至约2.2x10 7细胞/kg，约2.2x10 7细胞/kg至约2.7x10 7细胞/kg，各自包括端值。
在具体的实施方式中，在给予首剂量或后续剂量的免疫效应细胞之后，所述受试者没有显示出细胞因子释放综合征(CRS)，没有显示严重CRS，没有显示神经毒性，没有显示严重神经毒性，或没有显示超过3级的神经毒性。
在具体的实施方式中，在给予首剂量或后续剂量免疫效应细胞之后，所述免疫效应细胞在所述受试者中增殖。
在优选的实施方式中，所述增殖由以下显示：(i)与所述给予之前即刻相比，给予所述首剂量和/或后续剂量之后血清CRP水平增加，和/或(ii)与所述给予之前即刻相比，给予所述首剂量和/或后续剂量之后血清中CAR编码核酸的水平增加，如通过qPCR测量。
在具体的实施方式中，给予首剂量的免疫效应细胞后，所述受试者的肿瘤负荷稳定或降低。在具体的实施方式中，肿瘤负荷稳定或降低由指示肿瘤负荷的一种或多种因子的稳定或降低表示。
在优选的实施方案中，给予后续剂量的免疫效应细胞后，与给予首剂量的免疫效应细胞后的肿瘤负荷相比，肿瘤负荷的稳定或进一步降低。
在具体的实施方式中，给予后续剂量时，所述受试者还没有复发，和/或指示肿瘤负荷的一种或多种因子在降低之后还没有增加。
在具体的实施方式中，所述负荷稳定或降低和/或负荷的进一步降低包括所述受试者中，所述受试者的器官中，所述受试者的组织中，或所述受试者的体液中疾病细胞总数稳定或降低，和/或肿瘤的质量或体积稳定或降低，和/或转移的数量和/或程度稳定或降低，和/或肿瘤标志物稳定或降低，和/或中晚期癌症常见的并发症的消失或减弱。
在具体实施方案中，所述肿瘤标志物包括：甲胎蛋白(AFP)、CA125、CA15-3、鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19的可溶性片段(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、CA199、CA724等。
在具体实施方案中，中晚期癌症常见的并发症包括：癌症疼痛、感染、癌性胸腹水。
在具体实施方案中，肿瘤的质量或体积通过PET(正电子发射型计算机断层显像)和CT(计算机X线断层扫描)进行测量。
在本发明的第二方面，还给出了另一种肿瘤治疗的方法，包括：给予上述任一所述的方法治疗之前，所述受试者已经接受了化疗、放疗、免疫治疗、或其组合。
在一优选方案中，所述免疫治疗包括给予检查点抑制剂或给予不靶向CLD18的免疫效应细胞治疗。
在一优选方案中，所述免疫治疗是不包含靶向CLD18的免疫效应细胞治疗
在一优选的方案中，所述受试者接受了不靶向CLD18.2的免疫效应细胞治疗。
在优选的实施方式中，所述接受化疗、放疗、其他免疫治疗、或其组合后，肿瘤负荷没有维持稳定或者降低。
在具体的实施方式中，所述的肿瘤是复发的、难治性肿瘤。
在本发明的第三方面，提供了包含表达特异性识别CLD18的嵌合抗原受体的免疫效应细胞的组合物在制备用于治疗用CLD18A2-CAR T细胞在先治疗的受试者中的CLD18A2阳性肿瘤的药物中的用途，其中，在使用时，将首剂量的免疫效应细胞给予有此需要的受试者，所述免疫效应细胞表达嵌合抗原受体(CAR)且特异性识别CLD18，所述首剂量包含不超过约2x10 10细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 12细胞。优选地，所述首剂量包含不超过约2x10 9细胞/千克受试者体重或总量不超过约1x10 11细胞。优选的，所述首剂量包含不超过约2.5x10 8细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 10细胞。优选地，所述首剂量包含不超过约5x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过约1x10 10细胞。更优选地，所述首剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过5x10 9或约2x10 9细胞。
在具体的实施方式中，所述CLD18为CLD18A2。
在具体的实施方式中，给予所述首剂量的免疫效应细胞后，再给予至少一次的后续剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)且特异性识别CLD18的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，在对患者安全的前提下，给予所述后续剂量的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，所述首剂量的免疫效应细胞与所述后续剂量的免疫效应细胞相同。
在优选的实施方式中，所述首剂量的免疫效应细胞与所述后续剂量的免疫效应细胞均识别CLD18A2，但含有不同的嵌合抗原受体，如嵌合抗原受体的胞外段不同，但均识别CLD18A2，或者嵌合抗原受体的胞外段相同，但跨膜域或者胞内域不同。
在具体的实施方式中，所述首剂量给予的免疫效应细胞在体内检测不到后，再给予所述后续剂量的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，如通过qPCR测量。在具体的实施方式中，所述首剂量给予后约21至80天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；优选的，在所述首剂量给予后约25至60天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；更优选地，在所述首剂量给予后约25至50给予所述的后续剂量的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量与所述首剂量相当。
在优选的实施方式中，所述后续剂量低于所述首剂量。
在优选的实施方式中，所述后续剂量高于所述首剂量。
在具体的实施方式中，所述后续剂量高于首剂量，所述后续剂量是所述首剂量中的至少2倍、5倍、7倍或10倍。
在具体的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约2x10 10细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 12细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约2x10 9细胞/千克受试者体重或总量不超过约1x10 11细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约2.5x10 8细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 10细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约5x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过约1x10 10细胞。
在优选的实施方式中，所述后续剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或总量不超过5x10 9或约2x10 9细胞。
在具体的实施方式中，所述首剂量或后续剂量在20天内，分成N次给药，N为 不小于1的自然数。
在优选的实施方式中，所述首剂量或后续剂量在3-15天内，分成N次给药，N为不小于1的自然数。
在优选的实施方式中，N为1、2、3或4。
在优选的实施方式中，N为2或3。
在具体的实施方式中，给予后续剂量时，所述受试者具有以下任一特征：
(i)指示细胞因子释放综合征(CRS)的因子的受试者中血清水平倍数比在所述首剂量给予之前即刻的受试者中的水平小约10倍、小约25倍、和/或小约50倍；
(ii)没有显示出3级或更高的神经毒性；
(iii)神经毒性或CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞后的神经毒性或CRS水平的峰值水平相比，呈现降低；或者
(iv)所述受试者没有显示出针对由所述首剂量的细胞表达的CAR的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。
在具体的实施方式中，上述给予后续剂量时，所述受试者具有特征(iii)时，CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞后的CRS的峰值水平相比，降低至少50％，优选的，降低至少20％，更优的，降低至少5％，或者CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞之前的CRS水平相当。
在优选的实施方式中，所述CRS水平可以由以下信息进行评估：发热、低血压、缺氧、神经障碍、或炎性细胞因子或C反应性蛋白(CRP)的血清水平。
在优选的实施方式中，与神经毒性的临床风险和/或3级或更高神经毒性相关的症状选自混乱、谵妄、表达性失语、反应迟钝、肌阵挛、嗜睡、改变的精神状态、惊厥、癫痫-样活动、癫痫(任选地由脑电图EEG确诊)、淀粉样β(Aβ)水平升高、谷氨酸水平升高、和氧自由基水平升高。
在具体的实施方式中，所述方法还包括在给予所述的免疫效应细胞之前进行预处理，所述预处理包括给予所述受试者化疗剂、或者对所述受试者进行全身辐射、或对所述受试者进行局部辐射治疗，或其组合。
在优选的实施方式中，给予首剂量的免疫效应细胞之前进行所述预处理，在给予后续剂量的免疫效应细胞之前不需要进行所述预处理。
在优选的实施方式中，给予首剂量的免疫效应细胞之前和给予后续剂量的免疫效应细胞之前均需要进行所述预处理。
在优选的实施方式中，所述预处理是为了进行淋巴细胞清除。
在优选的实施方式中，所述预处理是为了稳定肿瘤负荷或降低肿瘤负荷，特 别是在给予免疫效应细胞治疗之前维持肿瘤负荷稳定或降低肿瘤负荷。
在优选的实施方式中，给予所述受试者淋巴消耗剂进行淋巴细胞清除。淋巴消耗剂如环磷酰胺、氟达拉滨等。
在具体的实施方式中，所述预处理在给予免疫效应细胞前4-12天实施。
在具体的实施方式中，所述化疗剂选自以下任一种化疗药物或其组合：环磷酰胺、氟达拉滨、紫杉烷类化合物、嘧啶类抗肿瘤药物。在具体的实施方式中，所述化疗剂为环磷酰胺和氟达拉滨的组合；或者环磷酰胺、氟达拉滨以及白蛋白结合型紫杉醇的组合。
在优选的实施方式中，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天。
在优选的实施方式中，环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天。
在优选的实施方式中，白蛋白结合型紫杉醇给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
在具体的实施方式中，所述化疗剂连续使用不超过4天。
在具体的实施方式中，所述环磷酰胺和所述氟达拉滨连续使用不超过4天，所述白蛋白结合型紫杉醇给予一次。
在具体的实施方式中，所述肿瘤为CLD18A2阳性的肿瘤；优选地，所述肿瘤为CLD18A2阳性消化道肿瘤；更优选地，所述消化道肿瘤为腺癌；最优选地，所述消化道肿瘤为胰腺癌、胃腺癌。
在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体包括胞外域、跨膜域及胞内域，胞外域为特异性结合CLD18A2的抗体或其片段。
在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的跨膜域为CD28或CD8的跨膜区。
在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的胞内域为CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽、或者CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽、或者CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽。
在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体包括特异性结合CLD18A2的抗体或其片段、跨膜域及胞内域，所述抗体具有：
SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、SEQ  ID NO：6所示的LCDR3；或者
SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：7所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：9或68所示的HCDR2、SEQ ID NO：10所示的HCDR3、SEQ ID NO：11所示的LCDR1、SEQ ID NO：12所示的LCDR2、SEQ ID NO：13所示的LCDR3。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段具有：
SEQ ID NO：14所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：20所示的轻链可变区。
在优选的实施方式中，所述抗体或其片段具有SEQ ID NO：14所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。
在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32任一所示氨基酸序列。
在优选的实施方式中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26任一所示的氨基酸序列。
在一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述免疫效应细胞是T淋巴细胞、NK细胞或者NKT淋巴细胞。
在优选的实施方式中，所述的优选免疫效应细胞是T淋巴细胞。
在优选的实施方式中，所述T淋巴细胞来自所述受试者自体。
在优选的实施方式中，所述T淋巴细胞来自异体。
在具体的实施方式中，给予两次及以上的后续剂量的免疫效应细胞，每次给予后续剂量的免疫效应细胞的间隔时间是约21至约80天，或约25至约60天，或约25-50天，各自包括端值。
在一优选方案中，在后给予的后续剂量的免疫效应细胞，与在先给予的后续剂量的免疫效应细胞相比，所述受试者的肿瘤负荷稳定或降低。
在具体的实施方式中，每次给予的后续剂量的免疫细胞数量基本相同。
在具体的实施方式中，后给的后续剂量的免疫效应细胞数量高于在先给的后续剂量的免疫细胞数。
在具体的实施方式中，其特征在于后给的后续剂量的免疫效应细胞数量低于 在先给的后续剂量的免疫细胞数。
在具体的实施方式中，给予所述免疫效应细胞之前，所述受试者没有接受过靶向CLD18的表达嵌合抗原受体的免疫细胞的治疗。
在具体的实施方式中，所述的后续剂量为足以稳定或降低所述受试者的肿瘤负荷的细胞数量。
在具体的实施方式中，在给予所述首剂量之前，所述受试者已经进行了手术治疗、化疗、或者不同于权利要求1所述的免疫治疗。
在具体的实施方式中，在首剂量给予之前，或者在首剂量给予之后并在后续剂量给予之前，对所述受试者的指示CRS的因子、指示神经毒性的因子、指示肿瘤负荷的因子、和/或指示宿主抗-CAR免疫应答的因子的血清水平进行评价。
在具体的实施方式中，所述的指示肿瘤负荷的因子为：所述受试者的肿瘤细胞总数、或者所述受试者的器官中肿瘤细胞总数、或者所述受试者的组织中的肿瘤细胞总数、或者肿瘤的质量或体积，或者肿瘤转移的程度、或者肿瘤数量。
在具体的实施方式中，所述治疗肿瘤的方法包括：
i)在给予后续剂量之前评价指示肿瘤负荷的因子；和
ii)基于所述评价的结果，确定待给予所述受试者的细胞的连续剂量，并且
iii)如果评价确定所述受试者的肿瘤质量或体积稳定或下降，给予所述受试者包含少于或多于所述首剂量中的CAR-表达细胞的数量或与其大约相同的CAR表达细胞的数量的后续剂量。
在具体的实施方式中，所述首剂量或所述后续剂量给予的细胞的数量为约1.1x10 6细胞/kg受试者体重至2.8x10 7细胞/kg，约2.9x10 6细胞/kg至2.6x10 7细胞/kg或约3.3x10 6细胞/kg至1.3x10 7细胞/kg，各自包括端值。
在具体的实施方式中，后续剂量的CAR表达细胞给予的细胞的数量包含约1.1x10 7细胞/千克(细胞/kg)体重至约5.1x10 7细胞/kg，约1.3x10 7细胞/kg至约3.7x10 7细胞/kg，约1.6x10 7细胞/kg至约2.2x10 7细胞/kg，约1.9x10 7细胞/kg至约2.2x10 7细胞/kg，各自包括端值。
在具体的实施方式中，在给予首剂量或后续剂量的免疫效应细胞之后，所述受试者没有显示出细胞因子释放综合征(CRS)，没有显示严重CRS，没有显示神经毒性，没有显示严重神经毒性，或没有显示超过3级的神经毒性。
在具体的实施方式中，在给予首剂量或后续剂量免疫效应细胞之后，所述免疫效应细胞在所述受试者中增殖。
在优选的实施方式中，所述增殖由以下显示：(i)与所述给予之前即刻相比， 给予所述首剂量和/或后续剂量之后血清CRP水平增加，和/或(ii)与所述给予之前即刻相比，给予所述首剂量和/或后续剂量之后血清中CAR编码核酸的水平增加，如通过qPCR测量。
在具体的实施方式中，给予首剂量的免疫效应细胞后，所述受试者的肿瘤负荷稳定或降低。在具体的实施方式中，肿瘤负荷稳定或降低由指示肿瘤负荷的一种或多种因子的稳定或降低表示。
在优选的实施方案中，给予后续剂量的免疫效应细胞后，与给予首剂量的免疫效应细胞后的肿瘤负荷相比，肿瘤负荷的稳定或进一步降低。
在具体的实施方式中，给予后续剂量时，所述受试者还没有复发，和/或指示肿瘤负荷的一种或多种因子在降低之后还没有增加。
在具体的实施方式中，所述肿瘤负荷稳定或降低和/或负荷的进一步降低包括所述受试者中，所述受试者的器官中，所述受试者的组织中，或所述受试者的体液中疾病细胞总数稳定或降低，和/或肿瘤的质量或体积稳定或降低，和/或转移的数量和/或程度稳定或降低，和/或肿瘤标志物稳定或降低，和/或中晚期癌症常见的并发症的消失或减弱。
在具体实施方案中，所述肿瘤标志物包括：甲胎蛋白(AFP)、CA125、CA15-3、鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19的可溶性片段(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、CA199、CA724等。
在具体实施方案中，中晚期癌症常见的并发症包括：癌症疼痛、感染、癌性胸腹水。
在具体实施方案中，肿瘤的质量或体积通过PET(正电子发射型计算机断层显像)和CT(计算机X线断层扫描)进行测量。
在本发明的第四方面，还给出了一种组合物，包括环磷酰胺和氟达拉滨以及紫杉烷类化合物和/或嘧啶类抗肿瘤药物。
在优选的实施方式中，所述紫杉烷类化合物包括但不限于紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛，优选白蛋白结合型紫杉醇；所述嘧啶类抗肿瘤药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、吉美嘧啶、奥替拉西钾、双呋氟尿嘧啶、卡莫氟、去氧氟尿苷、卡培他滨。
在具体的实施方式中，所述组合物包括环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉醇。
在具体的实施方式中，所述组合物包括环磷酰胺、氟达拉滨和白蛋白结合型紫杉醇。
在优选的实施方式中，所述组合物用于在接受免疫效应细胞治疗的受试者接 受免疫效应细胞之前，优选在接受免疫效应细胞治疗的受试者每次接受免疫效应细胞之前，给予所述组合物。
在具体的实施方式中，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或白蛋白结合型紫杉醇给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
在具体的实施方式中，在给予免疫细胞治疗前约30天给予预处理；优选地，为约20天；更优选地，为约12天；最优选地，为约7天。
在具体的实施方式中，所述环磷酰胺、氟达拉滨和/或白蛋白结合型紫杉醇连续使用不超过4天；优选地，所述白蛋白结合型紫杉醇给予一次。
在具体的实施方式中，用于抗肿瘤治疗；优选地，用于抗肿瘤的靶向治疗；最优选地，用于抗肿瘤的嵌合抗原受体靶向治疗。
在具体的实施方式中，所述的免疫效应细胞为CAR T细胞。
在具体的实施方式中，所述的CAR T细胞特异性识别CLD18A2。
在具体的实施方式中，所述的肿瘤为CLD18A2阳性消化道肿瘤；更优选地，所述消化道肿瘤为腺癌；最优选地，所述消化道肿瘤为胰腺癌、胃腺癌。
在本发明的第五方面，还给出了一种免疫效应细胞联合治疗肿瘤的方法，包括：在给予受试者免疫效应细胞治疗前，先给予环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物进行预处理。
在优选的实施方式中，所述肿瘤为实体瘤。
在优选的实施方式中，所述的实体瘤为乳腺癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺癌，胃癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，子宫癌，卵巢癌，肛区癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌。
在优选的实施方式中，所述紫杉烷类化合物选自紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、或多西他赛。
在优选的实施方式中，所述紫杉烷类化合物选自白蛋白结合型紫杉醇。
在具体实施方式中，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或白蛋白结合型紫杉醇给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
在具体实施方式中，在给予免疫细胞治疗前约30天给予预处理；优选地，为约20天；更优选地，为约12天；最优选地，为约7天。
在具体实施方式中，所述环磷酰胺、氟达拉滨和/或白蛋白结合型紫杉醇连续使用不超过4天；优选地，所述白蛋白结合型紫杉醇给予一次。
在具体实施方式中，所述的免疫效应细胞为嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，如CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-NKT细胞等。
在本发明的第六方面，还给出了一种包含CLD18A2-CAR的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物含有所述细胞和环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物(优选紫杉醇，更优选白蛋白结合型紫杉醇)，用于治疗CLD18阳性肿瘤，其中所述细胞和环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物配制成能提供比所述试剂各自的效果之和更大的治疗效果。
在具体实施方式中，包括将首剂量的所述免疫效应细胞给予有此需要的受试者，所述首剂量不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约2x10 9细胞。
在具体实施方式中，给予所述首剂量的免疫效应细胞后，再给予至少一次的后续剂量所述免疫效应细胞,所述后续剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约5x10 9细胞。
在具体实施方式中，在所述首剂量给予后约21至80天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；优选的，在所述首剂量给予后约25至60天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；更优选地，在所述首剂量给予后约25至50给予所述的后续剂量的免疫效应细胞。
在具体实施方式中，所述环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物在给予免疫效应细胞前4-12天实施。
在具体实施方式中，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或
环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或
紫杉烷类化合物给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
在具体实施方式中，所述环磷酰胺和/或所述氟达拉滨连续使用不超过4天，所述紫杉烷类化合物给予一次。
在具体实施方式中，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32任一所示氨基酸序列；优选的，为SEQ ID NO：24、25或26所示的序列。。
对应于第六方面，本发明还提供一种用于治疗CLD18阳性肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
1)包含CLD18A2-CAR的免疫效应细胞；
2)环磷酰胺；
3)氟达拉滨；
4)紫杉烷类化合物，优选紫杉醇，更优选白蛋白结合型紫杉醇；
5)用于包含以上1)-4)所述物质的容器；和
6)利用所述试剂盒治疗CLD18阳性肿瘤的给药说明书；
其中，所述细胞和环磷酰胺、氟达拉滨及紫杉烷类化合物配制成能提供比所述试剂各自的效果之和更大的治疗效果。
在具体实施方式中，所述给药说明书中记载了将首剂量的所述免疫效应细胞给予有此需要的受试者，所述首剂量不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约2x10 9细胞。
在具体实施方式中，所述给药说明书中记载了给予所述首剂量的免疫效应细胞后，再给予至少一次的后续剂量所述免疫效应细胞,所述后续剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约5x10 9细胞。
在具体实施方式中，所述给药说明书中记载了在所述首剂量给予后约21至80天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；优选的，在所述首剂量给予后约25至60天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；更优选地，在所述首剂量给予后约25至50给予所述的后续剂量的免疫效应细胞。
在具体实施方式中，所述给药说明书中记载所述环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉 烷类化合物在给予免疫效应细胞前4-12天给予。
在具体实施方式中，所述给药说明书中记载了：
氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或
环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或
紫杉烷类化合物给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
在具体实施方式中，所述给药说明书中记载了：
所述环磷酰胺和/或所述氟达拉滨连续使用不超过4天，所述紫杉烷类化合物给予一次。
在具体实施方式中，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32任一所示氨基酸序列；优选的，为SEQ ID NO：24、25或26所示的序列。
本领域技术人员知晓，试剂盒中可以包含与给药说明书的记载相适应剂量的各组分。
在本发明的一个方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和微管蛋白抑制剂，所述免疫效应细胞表达有识别肿瘤抗原的受体。在一些实施方式中，本发明提供一种降低癌细胞生长、存活或活力或全部的方法，包括对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和微管蛋白抑制剂，所述免疫效应细胞表达有识别肿瘤抗原的受体。在一些实施方式中，所述微管蛋白抑制剂为紫杉烷类化合物。在一些实施方式中，所述紫杉烷类化合物选自：紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel,Abraxane)、多西他赛(docetaxel)以及具有紫杉烷骨架结构的衍生物。
在另一实施方式中，所述的特异性识别肿瘤抗原的抗体具有SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：7所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、 SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：9或68所示的HCDR2、SEQ ID NO：10所示的HCDR3、SEQ ID NO：11所示的LCDR1、SEQ ID NO：12所示的LCDR2、SEQ ID NO：13所示的LCDR3。
在另一实施方式中，所述的特异性识别肿瘤抗原的抗体具有SEQ ID NO：14所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：20所示的轻链可变区；或者
SEQ ID NO：53所示的重链可变区和SEQ ID NO：52所示的轻链可变区。
在另一实施方式中，所述的特异性识别肿瘤抗原的抗体具有SEQ ID NO：54、56、57、或58所示的序列所示的氨基酸序列，优选的，为SEQ ID NO：54所示的序列。
在另一实施方式中，对所述的受试者不进行预处理或者淋巴细胞清除。本发明还提供一种表达有识别肿瘤抗原的受体的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物含有所述免疫效应细胞和紫杉烷类化合物，所述药物用于治疗肿瘤。在一些实施方式中，所述药物中包含的所述免疫效应细胞和紫杉烷类化合物提供比其各自的效果之和更大的治疗效果。在本发明的一个方面，提供了一种用于治疗肿瘤的试剂盒，其包含：1)表达有识别肿瘤抗原的受体的免疫效应细胞；2)紫杉烷类化合物；3)用于包含以上1)和2)所述物质的容器；和4)利用所述试剂盒治疗肿瘤的给药说明书。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示CAR-T的拷贝数检测。
图2A显示了首剂量CAR-T注射(第一疗程)后受试者体内C反应蛋白(CRP)的变化；图2B显示了后续剂量CAR-T注射(第二疗程)后受试者体内的CRP变化。
图3A显示了胰腺癌受试者CAR-T治疗过程中的肿瘤病灶变化；图3B显示了胰 腺癌受试者CAR-T治疗过程中的肿瘤标志物变化。
图4A显示了胃腺癌受试者CAR-T治疗过程中的肿瘤病灶变化；图4B显示了胃腺癌受试者CAR-T治疗过程中的新发病灶变化；图4C显示了胃腺癌受试者CAR-T治疗过程中的胸腹水变化；图4D显示了胃腺癌受试者CAR-T治疗过程中的CA125水平变化；图4E显示了胃腺癌受试者CAR-T治疗过程中的CA199水平变化。
图5.为重组载体MSCV-8E5-2I-mBBZ质粒图。
图6A和图6B分别为CCK8实验检测Abraxane对胰腺癌细胞及CAR-T细胞的毒性作用。
图7A和B显示了体内实验观察Abraxane与CAR-T细胞联用对小鼠胰腺癌的抑制效果和小鼠的体重变化图。
图8A至8C显示了在小鼠中采用本发明方法治疗后的存活期。
图9为小鼠模型中采用本发明方法治疗后的体重变化曲线。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将表达嵌合抗原受体(CAR)或其它转基因受体如T细胞受体(TCR)的免疫效应细胞以特定量和根据特定时间参数给予，显著提高了利用免疫效应细胞进行肿瘤治疗的疗效，从而提高了免疫效应细胞在实体瘤中的应用效果。本发明至少部分地基于该发现。
除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用的目的对具有所常规理解的含义的术语加以进一步限定，本文中包括的此类进一步限定不应理解为表示与本领域常规理解的有实质上的差异。
本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据库，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或其它情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代受试者，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种或一个”或“一种(个)或多种(个)”。
本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解， 范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内，所述范围的上下限也属于请求保护的主题的范围。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。无论范围宽窄，该原则均适用。
本文使用的术语“约”是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。本文中述及“约”值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的实施方式。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。例如，“约”可意指按照在该领域中的实际的标准偏差在1以内或多于1。或者“约”可意指至多10％(即±10％)的范围。例如，约5mg可包括在4.5mg与5.5mg之间的任何数目。当在申请案与申请专利范围中提供特定值或组成时，除非另外指出，否则“约”应假定为在该特定值或组成的可接受误差范围内。
在描述氨基酸或者核酸序列时，“具有”特定序列应当被理解为涵盖了特定序列的变体。在一些实施方式中，氨基酸或者核酸序列具有某特定序列是指所述氨基酸或者核酸序列与所述特定序列具有超过80％、85％、90％、95％或者99％的序列同一性。
本文中所述任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括在所述范围内的任何整数，以及在合适情况下，其分数(例如整数的十分之一与百分之一)的数值，除非另外指出。
本文中所述的“给药间隔”是指对个体给予多个疗程的免疫效应细胞治疗(如包括给予首剂量的免疫效应细胞以及给予后续剂量的免疫效应细胞的多个疗程)之间以及与给予预处理药物之间所经过的时间。所以，给药间隔可被指示为范围。在本发明的一些方面，本发明包括对个体给予多个疗程的免疫效应细胞治疗，每个疗程给予由医师所确定的剂量(如首剂量和后续剂量)。在本发明的一些方面，根据本发明的免疫效应细胞治疗的特定剂量可分为两次或者两次以上给予，分次给予的总剂量等于由医师所确定的所述疗程中总剂量。
本文中所述的“剂量”，可以是以重量为基础计算的剂量或以体表面积(BSA)为基础计算的剂量表示。以重量为基础计算的剂量是以患者体重为基础所计算出的对 于患者给予的剂量，例如mg/kg，免疫效应细胞个数/kg等。以BSA为基础计算的剂量是以患者的表面积为基础所计算出的对患者给予的剂量，例如mg/m 2，以及免疫效应细胞个数/m 2等。
本文中所述的“给药次数”是指给定时间内给予免疫效应细胞或预处理药物剂量的频率。给药次数可被指示为每给定时间内剂量数。例如，可以按照下列来给予氟达拉滨：连续4日每日给予一次剂量、连续3日每日给予一次剂量、连续2日每日给予一次剂量、或1日给予一次剂量。可以按照下列来给予环磷酰胺：连续4日每日给予一次剂量、连续3日每日给予一次剂量、连续2日每日给予一次剂量、或1日给予一次剂量。可以按照下列来给予白蛋白结合型紫杉醇：连续4日每日给予一次剂量、连续3日每日给予一次剂量、连续2日每日给予一次剂量、或1日给予一次剂量。
本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
本文中所用的，“细胞或细胞群针对具体标志物呈“阳性””是指，所述细胞上或细胞中具体标志物(通常是表面标志物)的可检测的存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体。其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或显著高于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
本文中所用的，“细胞或细胞群针对具体标志物呈“阴性”指，所述细胞上或细胞中不具有具体标志物如表面标志物或者尽管具有但基本检测不到。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测不到表面表达，或者尽管检测到存在表面表达，例如，当通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体来检测表面表达时，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著低于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
本文所用术语“载体”指一种核酸分子，所述核酸分子能够增殖其连接的另一核酸。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，以及被导入已将其导入的宿主细胞基因组的载体。某些载体能够引导与其操作性连接的核酸的表达。所述载体在本文中也被称为“表达载体”。
本申请涉及过继细胞或免疫效应细胞治疗实体肿瘤，包括给予多剂量或重复剂量的细胞，及其使用的方法、组合物和制品。细胞一般表达嵌合抗原受体(CAR)或其他转基因受体如T细胞受体(TCR)。
密蛋白18(Claudin 18，CLD18)分子(Genbank登记号：剪接变体1(CLD18A1)：NP_057453、NM016369，以及剪接变体2(CLD18A2)：NM_001002026、NP_001002026)是分子量约为27.9/27.72kD的内在跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和内皮的紧密连接中的内在膜蛋白。紧密连接在相邻细胞之间组织膜内颗粒互联链的网。在紧密连接中，闭合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白组分。由于其强胞间粘附特性，它们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的一级屏障。形成紧密连接的蛋白质关键性地参与了组织上皮组织结构。
CLD18A1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，而CLD18A2仅在胃细胞中表达。并且，CLD18A2局限在已分化的胃上皮短寿细胞中，但在胃干细胞区中不存在。两种变体在若干癌症类型中强烈表达，包括胃、食管、胰腺和肺的肿瘤以及人癌症细胞系。表达主要是在这些适应症的腺癌亚型中。
本发明的提供用于治疗与CLD18表达相关的疾病(例如肿瘤)的治疗方法及组合物。
本发明提供了采用表达遗传工程改造(重组)的嵌合受体的过继细胞或免疫效应细胞治疗受试者的肿瘤、特别是实体肿瘤的方法。该方法包括过继细胞或免疫效应细胞的单疗程回输、或多疗程回输。就本文而言，“剂量”是指对于在一个疗程内给药或者回输的过继细胞或者免疫效应细胞的总量。在一些实施方式中，在根据本文所述的方法包括多个疗程的情况下，每个疗程的剂量是相同的。在一些实施方式中，在根据本文所述的方法包括多个疗程的情况下，每个疗程的剂量不同的。“分剂量”是指在一个疗程内，在将整个疗程的剂量分为多次给予受试者的情况下，单次给药的剂量。在一些实施方式中，在一个疗程内的剂量被分为多次给予受试者的情况下，每次给药的分剂量是相同的。在一些实施方式中，在一个疗程内的剂量被分为多次给予受试者的情况下，每次给药的分剂量是不同的。就本文而言，若非特别指明，剂量均指在一个疗程内给药或者回输的过继细胞或者免疫效应细胞的总量。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括在单疗程中回输所述过继细胞或者免疫效应细胞。单疗程是指在一定时间段内，回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，在所述疗程内一次回输一定总量的过继细胞或者免疫 效应细胞。在一些实施方式中，分两次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分三次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分四次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分五次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分六次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分七次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分八次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分九次次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，分十次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞是所要回输的过继细胞或者免疫效应细胞的等分量。在一些实施方式中，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞是所要回输的过继细胞或者免疫效应细胞的非等分量。在一些实施方案中，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量由医师根据受试者的具体情况确定。受试者的具体情况例如可以是受试者的整体健康情况、疾病的严重程度、对同疗程前次给药量的反应、对先前疗程的反应、受试者联合用药情况、毒性反应程度或可能性、并发症、癌症转移情况、以及医师所认为会影响到受试者适于回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量的任何其他因素。在一些实施方式中，在所述多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞中，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量呈递增趋势。在一些实施方式中，在所述多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞中，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量呈递减趋势。在一些实施方式中，在所述多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞中，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量呈先递增后递减的趋势。在一些实施方式中，在所述多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞中，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量呈先递减后递增的趋势。
多疗程回输是指具有多个所述时间段，在每个时间段内回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个时间段的长度是一致的。在一些实施方式中，所述多个时间段的长度是不等的。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少两个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少三个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少四个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少五个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少六个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少七个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少八个所述时 间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少九个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有至少十个所述时间段。在一些实施方式中，所述多疗程是指具有十个以上所述时间段。
在一些实施方式中，在所述多个疗程中的一个疗程内一次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分两次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分三次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分四次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分五次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分六次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分七次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分八次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分九次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，所述多个疗程中的一个疗程内分十次或更多次回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的一个疗程内，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞是所要回输的过继细胞或者免疫效应细胞的等分量。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的一个疗程内，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞是所要回输的过继细胞或者免疫效应细胞的非等分量。在一些实施方案中，在所述多个疗程中的一个疗程内，每次回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量由医师根据受试者的具体情况确定。受试者的具体情况例如可以是受试者的整体健康情况、疾病的严重程度、对同疗程前次给药量的反应、对先前疗程的反应、受试者联合用药情况、毒性反应程度或可能性、并发症、癌症转移情况、以及医师所认为会影响到受试者适于回输的过继细胞或者免疫效应细胞的量的任何其他因素。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程中以相同的次数回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程中以不同的次数回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程中以相同的次数回输一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程中回输相同的一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程中回输不同的一定总量的过继细胞或者免疫效应细胞。
在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程内所述过继细胞或者免疫效应细胞的总量呈递增趋势。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程内所述过继细胞或者免疫效应细胞的总量呈递减趋势。在一些实施方式中，在所述多个疗程中的每个疗程内所述过继细胞或者免疫效应细胞的总量呈先递增后递减的趋势。在所述多个疗程中的每个疗程内所述过继细胞或者免疫效应细胞的总量呈先递减后递增的趋势。
在一些实施方式中，首剂量是较低剂量和/或是调节或减量剂量和/或后续剂量是巩固剂量和/或是调节或减量剂量。还提供可用于这类方法的细胞、组合物和制品。在一些实施方式中，嵌合受体是遗传工程改造的抗原受体，如功能性非-TCR抗原受体，例如，嵌合抗原受体(CAR)和其他重组抗原受体如遗传工程改造的T细胞受体(TCR)。受体还包括其他重组嵌合受体，如含特异性结合至配体或受体或其他结合伴侣的胞外部分和胞内部分，如CAR的胞内信号转导部分的那些受体。在一些实施方式中，剂量包括较低的首剂量。
在一些实施方式中，该方法包括(a)给予患有肿瘤的受试者单疗程的表达嵌合抗原受体(例如，CAR)的细胞；和(b)给予受试者多疗程的表达嵌合抗原受体(例如，CAR)的细胞。在其他实施方式中，可给予一个或多个后续剂量。
术语“CLD18”指密蛋白-18，并包括细胞天然表达的或转染了CLD18基因的细胞所表达的任何CLD18的变体(包括CLD18A1和CLD18A2)、构象、同工型(isoform)和种间同源物(specieshomologs)。优选地，“CLD18”指人CLD18，特别是CLD18A2(SEQ ID NO:1、2)和/或CLD18A1(SEQ ID NO:7、8)，更优选CLD18A2。
术语“CLD18A1”包括细胞天然表达的或转染了CLD18A1基因的细胞所表达的任何人CLD18A1的翻译后修饰变体、同工型和种间同源物。
术语“CLD18A2”包括细胞天然表达的或转染了CLD18A2基因的细胞所表达的任何人CLD18A2的翻译后修饰变体、同工型和种间同源物。
术语“CLD18变体”应包括(i)CLD18剪接变体，(ii)CLD18翻译后修饰变体，特别是包括N糖基化状态不同的变体，(iii)CLD18构象变体，特别是包括CLD18-构象-1、CLD18-构象-2和CLD18-构象-3，(iv)位于胞间紧密连接处的游离CLD18和同型/异型相关联变体，(v)CLD18癌症相关变体和CLD18非癌症相关变体。
利用表达嵌合抗原受体的细胞治疗肿瘤的方法
本发明提供了用于细胞治疗，用于治疗包括各种实体肿瘤的疾病或病症的方法、组合物和制品。该方法涉及给予表达嵌合受体的免疫效应细胞，所述嵌合受体 靶向识别和/或特异性地结合肿瘤抗原并激活免疫效应细胞。所述受体包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞融合蛋白(T cell fusion protein，TFP)和T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)。
在一些实施方式中，所述方法包括给予受试者一个或多个后续剂量的细胞。剂量通常以特定量和根据特定时间参数给予。在一些实施方式中，该方法通常包括给予首剂量的细胞，之后在相对于首剂量的特定时间窗口期间给予后续剂量的细胞。在一些实施方式中，给予的细胞数量和多次剂量的时间经设计以改善一种或多种结果，例如降低受试者的毒性程度或可能性，和/或改善治疗功效。
在一些实施方式中，所提供的方法是基于本文观察到的受试者对所给予的细胞的暴露增加(例如，随时间增加的细胞数或持续时间)可以改善免疫效应细胞治疗中的功效和治疗结果。在多个临床试验中向患有各种CLD18A2阳性癌症的受试者给予不同的靶向CLD18A2的CAR-T细胞之后进行的初步分析显示更高和/或更长的与CAR-T细胞的暴露程度与治疗结果之间存在相关性。这些结果包括患者的生存、缓解或病情的稳定。在一些实施方式中，本文所述的方法包括监控受试者对所述过继细胞或免疫效应细胞的暴露程度，并根据所述暴露程度确定后续分次给药或者后续疗程的给药剂量和间隔时间。在一些实施方式中，本文所述的方法包括监控受试者对所述过继细胞或免疫效应细胞的暴露程度，并根据所述暴露程度达到或者超过一定程度来维持或者降低后续分次给药或者后续疗程的给药剂量和/或维持或延长后续分次给药或者后续疗程之间的间隔时间。在一些实施方式中，本文所述的方法包括监控受试者对所述过继细胞或免疫效应细胞的暴露程度，并根据所述暴露程度低于一定程度来维持或者增加后续分次给药或者后续疗程的给药剂量和/或维持或缩短后续分次给药或者后续疗程之间的间隔时间。
在一些实施方式是中，本文所述的方法包括监控受试者对所述过继细胞或免疫效应细胞的毒性反应程度或者风险，并根据所述毒性程度或者风险确定后续分次给药或者后续疗程的给药剂量和间隔时间。在一些实施方式中，所述毒性反应程度或者风险包括但不限于例如CRS、神经毒性、巨噬细胞活化综合征和肿瘤裂解综合征等。
在一些实施方式中，通常在给予首剂量或者前一剂量之后当毒性反应或其症状或生物化学指标(例如CRS或神经毒性、巨噬细胞活化综合征或肿瘤裂解综合征)的风险等于或低于可接受水平的情况下给予后续剂量。在一些实施方案中，所述毒性反应或其症状或生物化学指标包括发热、低血压、缺氧、神经障碍、炎性细胞因子、C反应性蛋白(CRP)的血清水平中的一种或多种。在一些实施方案中，所述毒 性反应或其症状或生物化学指标的风险的可接受的水平是指在给予首剂量或者前一剂量之后的峰值水平的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、或者10％。
在一些实施方案中，在给予首剂量或者前一剂量之后毒性反应达到峰值并且正在降低的情况下给予后续剂量。在一些实施方案中，在给予首剂量或者前一剂量之后毒性反应降至等于或低于可接受水平之后给予后续剂量。在一些实施方案中，在给予首剂量或者前一剂量之后，当毒性反应或其症状或生物化学指标的风险等于或者低于在给予首剂量或者前一剂量之后出现的峰值水平的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％之时给予后续剂量。因此，在一些实施方式中，在给予首剂量或前一剂量至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、80天之后，给予后续剂量。在一些实施方式中，通过监测和/或评估与毒性事件相关的一种或多种症状或风险的存在并在确定症状或风险等于或低于可接受水平之后输注后续剂量来确定适当的时间。
在一些实施方式中，在基于首剂量之后，在受试者中指示细胞因子-释放综合征(CRS)的因子的血清水平不超过该受试者在给予首剂量之前的血清水平的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30倍的情况下给予后续剂量。
在一些实施方式中，选择给予后续剂量的时机，以避免已经给予的首剂量或者前一剂量所产生的宿主免疫应答可能诱导使得后续剂量的功效降低。在一些方面，在出现宿主免疫应答，例如针对给予的细胞和/或其表达的嵌合抗原受体的适应性或特异性，例如体液或细胞介导的免疫应答之前给予后续剂量。在一些实施方式中，在例如通过一种或多种专门的检测方法可以检测到这种响应之前给予后续剂量。通常在针对细胞的宿主适应性免疫应答未被检测到、尚未建立和/或尚未达到一定水平或程度或阶段时给予一个或多个后续剂量。因此，在一些实施方式中，在给予首剂量或前一剂量最多30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99天之后，给予后续剂量。
因此，在一些实施方式中所提供的方法涉及在毒性风险的窗口之后，在用首剂量稳定或减少肿瘤负荷后，但在适应性宿主免疫应答(即，机体对CAR-T细胞产生的免疫排斥反应)产生之前，给予一个或多个后续剂量。在这种条件下，后续剂量可以安全有效地提供免疫监测、清除或预防残留肿瘤细胞的增殖或转移。因此，在一些实施方案中，后续剂量是疾病巩固剂量。
所谓肿瘤负荷，包括，肿瘤体积大小或分化程度，或转移类型、阶段，和/或中晚期癌症常见的并发症的出现与消失，例如癌性胸腹水，和/或肿瘤标志物出现或表达水平的变化，和/或受试者发生毒性结果的可能性或发生率，例如CRS，巨噬细胞活化综合征，肿瘤溶解综合征，神经毒性和/或针对给予的细胞和/或嵌合抗原受体的宿主免疫应答。在一些实施方案中，肿瘤的大小通过PET(正电子发射型计算机断层显像)和CT(计算机X线断层扫描)自带的标尺进行测量。
所述肿瘤标志物又称肿瘤标记物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到，包括甲胎蛋白(AFP)、CA125、CA15-3、鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19的可溶性片段(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、CA199、CA724等。
在一些实施方式中，首剂量包括足以降低受试者肿瘤负荷的量的细胞，并且在受试者中指示细胞因子-释放综合征(CRS)的因子的血清水平不超过该受试者在给予首剂量之前的血清水平的10倍或25倍时，和/或在受试者中CRS相关结果峰值水平并且在给予首剂量后开始下降，并且受试者没有由首剂量的细胞表达的嵌合受体特异的可检测的适应性宿主免疫应答时，给予后续剂量。
在一些实施方式中，首剂量包含少于约2.5×10 8个细胞/千克受试者体重，或少于约1×10 12个细胞，并且后续剂量在开始给予首剂量之后超过约21天并且不到约80天的时间给予。
在免疫效应细胞治疗中给予细胞
本发明提供的方法包括向表达肿瘤抗原的实体肿瘤受试者给予多剂量的表达识别所述肿瘤抗原的嵌合抗原受体，如CAR、TCR、TFP、TAC的免疫效应细胞。
本文中所述的“肿瘤抗原”包括但不限于促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD 138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6； B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa light chain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白 sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原为EGFR、EGFRvIII，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、claudin 18.2或BCMA。
本文中所用的“受试者”是哺乳动物，例如人或其它动物，并且通常是人。在一些实施方式中，在给予首剂量和/或在给予后续剂量之前，受试者已经采用肿瘤化学治疗或放射治疗。在一些方面中，受试者对于其他治疗剂是难治性的或非响应性的。
在一些实施方式中，肿瘤具有持续性或复发性，例如，在用另一种治疗介入之后，包括化疗、放射。在一些实施方式中，所述给予有效地治疗受试者，无论该受试者是否已对另一种疗法具有抗性。
在一些实施方式中，受试者对其他治疗剂有响应性并且用治疗剂治疗降低了肿瘤负荷。在一些方面中，受试者初始对治疗剂有响应性，但是随着时间显示出肿瘤的复发。在一些这类实施方式中，所述受试者经测定具有复发风险，例如处于复发高风险中，并且由此预防性地给予细胞，例如，以减小复发可能性或预防复发。
所述疾病包括肿瘤，或其它增殖性疾病或病症。所述肿瘤包括但不限于：结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。
在一些实施方式中，剂量的大小和回输时间由受试者的初始肿瘤负荷决定。例如，在一些情况中，一般给予受试者的首剂量的细胞数量较低，在较低肿瘤负荷的情况下，如实体肿瘤可以通过肿瘤标志物检测来评估肿瘤负荷大小和/或微小残 留病灶，初始剂量可能较高。在其他情况中，在较高肿瘤负荷的受试者中，可采用首剂量分针连续输注，所述首剂量分为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次给药，优选的，为1-5次给药，更优的，为2-3次给药。每次给药之间间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或不间隔。在一些情况中，后续剂量可能与首剂量相同或高于首剂量或低于首剂量。
本文中所用的术语“治疗”指完全或部分减轻或减少肿瘤或与其相关的症状。所需的治疗效果包括但不限于，预防肿瘤的发生或复发、减轻症状、减少肿瘤的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓肿瘤进展速率、改善或减轻肿瘤状态，和减轻或改善预后。本文中所用的“延迟肿瘤的发展"表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、遏制和/或拖延所述肿瘤的发展。该延迟可具有不同的时间长度，这取决于疾病史和/或待治疗的个体。本领域技术人员应理解，充分或显著的延迟可涵盖预防(对于未发展所述肿瘤的个体而言)。例如，晚期癌症，例如转移的发展，可被延迟。
在一些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延迟肿瘤发展或减缓肿瘤进展。
本文中所用的“抑制”功能或活性意指，在与其它情况下的相同病症相比时或者相较于另一病症，功能或活性的减少。
试剂，例如，药物制剂、细胞或组合物，在给予情况下的“有效量”，指某一个量，其在一定剂量下且作用必要的时间长度时，有效于实现所需结果，例如治疗或预防结果。
试剂，例如，药物制剂或细胞的“治疗有效量”，指某一个量，其在剂量上和必需时程上，有效于实现所需治疗结果，例如肿瘤的治疗，和/或该治疗的药物动力学或药代动力学效果。治疗有效量可根据多种因素变化，例如，疾病状态、年龄、性别，和受试者体重，以及给予的细胞群。在一些实施方式中，所提供的方法涉及给予有效量(例如，治疗有效量)的所述细胞和/或组合物。
“预防有效量”指某一个量，其对于一定剂量和必要时程而言，有利于实现所需预防结果。通常而言，由于预防剂量在疾病的早期或之前用于受试者，预防有效量将小于治疗有效量。在较低肿瘤负荷的情况中，在一些方面中，预防有效量可能高于治疗有效量。
用于给予用于免疫效应细胞治疗的细胞的方法是已知的，并可与本文提供的方法和组合物联用。
在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继T细胞或免疫效应细胞治疗， 通过如下方式进行：自体回输。因此，在一些方面中，所述细胞源自需要治疗和所述细胞的受试者，并在分离和处理之后给予同一受试者。
在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继T细胞或免疫效应细胞治疗，通过如下方式进行：同种异体回输，其中，所述细胞分离和/或在其它情况中从供者体内提取和制备，供者和回输细胞的受试者不同。在此类实施方式中，然后将所述细胞给予遗传学组织相容性高的受试者。在一些实施方式中，所述供者和受者是遗传学相同的。在一些实施方式中，所述供者和受者是遗传学相似的。在一些实施方式中，所述受者和供者相同的HLA类别或超类型。
所述细胞可通过任何合适的方式给予，例如，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼底注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、反间隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、巩膜上腔注射、球后注射、眼周注射或球周递送。在一些实施方式中，它们通过胃肠外、肺内的和鼻内，以及如果希望局部治疗，病灶内给予。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方式中，通过单次推注给予细胞来给予给定剂量。在一些实施方式中，通过多次推注给予细胞，例如，在不超过20天多次给药，或通过连续输注给予细胞来给予。
对于预防或治疗疾病，合适剂量可取决于治疗的疾病类型，嵌合抗原受体或细胞类型，疾病的严重程度和疾病病程、该细胞是否给予用于预防性或治疗性目的、先前治疗、受试者的临床史和对所述细胞的响应，以及主治医师的判断。在一些实施方式中，所述组合物和细胞适合在一个时间点或以一系列治疗来给予受试者。
在一些实施方式中，所述免疫效应细胞作为联合治疗的一部分，例如，与另一干预性治疗，例如与另一治疗剂如抗体、经工程改造的免疫效应细胞、受体或试剂、细胞毒性药物或其他治疗方法联合，同时或依次地，以任何顺序给予。在一些实施方式中，免疫效应细胞与一种或多种其它治疗方法联用，或与另一干预性治疗方法联合，同时或以任何顺序依次进行。在一些情况中，所述免疫效应细胞与另一治疗在足够接近的时间共同给予，从而产生治疗作用大于上述免疫效应细胞群或者一种或多种其它治疗药物或者方法，反之亦然。在一些实施方式中，在一种或多种其它治疗剂之前给予所述免疫效应细胞。在一些实施方式中，在一种或多种其它治疗剂之后给予所述免疫效应细胞。在一些实施方式中，一种或多种其他治疗药物包括细胞因子，如IL-2、IL-12，以增强持久性。
所述另一治疗剂可通过任何合适的方式给予，例如，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼底注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、反间隔注射、 巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、巩膜上腔注射、球后注射、眼周注射或球周递送。在一些实施方式中，它们通过胃肠外、肺内的和鼻内递送，以及如果希望局部治疗，可以在病灶内给予。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方式中，通过单次推注给予所述治疗剂来给予给定剂量。在一些实施方式中，通过多次推注给予，例如，在不超过20天多次给药，或通过连续输注给予。
在一些实施方式中，本发明的方法包括向受试者给予微管蛋白抑制剂以及所述过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在一个疗程内向受试者给予微管蛋白抑制剂和免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括向受试者给予微管蛋白抑制剂然后再给于免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括向所述受试者先给予免疫效应细胞，然后再给予微管蛋白抑制剂。在一些实施方式中，本发明的方法包括向所述受试者基本上同时给予微管蛋白抑制剂和免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括向所述受试者交替给予微管蛋白抑制剂和免疫效应细胞。在多个疗程内，所述微管蛋白抑制剂和免疫效应细胞可以相同或者不同。
本文所述的微管蛋白抑制剂包括微管蛋白聚合促进剂和微管蛋白聚合抑制剂。微管蛋白聚合促进剂包括但不限于例如紫杉烷类、埃坡霉素类、海绵内酯类以及Laulimalide等。微管蛋白聚合抑制剂包括但不限于例如秋水仙碱、Combretastatin A-4、BPR0L075、Plinabulin(NPI-2358)、Nakiterpiosin、长春新碱类、Nocodazole、鬼臼毒素、Dolastatins10、Indibulin(D-24851)以及Eribulin等。
紫杉烷(taxanes)类化合物包括紫杉醇((paclitaxel,商品名:taxol)、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel,Abraxane)、多西他赛(docetaxel)等以及它们的衍生物。紫杉烷类微管蛋白抑制剂可促进微管蛋白装配成微管并抑制微管的解聚，导致微管束的排列异常、形成星状体，从而使纺锤体失去正常功能，最终导致细胞死亡。
在一些实施方式中，本发明的方法包括在一个疗程内向受试者给予紫杉烷类药物和免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在一个疗程内向受试者给予紫杉烷类药物然后再给于免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在一个疗程内向所述受试者先给予免疫效应细胞，然后再给予紫杉烷类药物。在一些实施方式中，本发明的方法包括在一个疗程内向所述受试者基本上同时给予紫杉烷类药物和免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在一个疗程内向所述受试者交替给予紫杉烷类药物和免疫效应细胞。
在一些实施方式中，本发明的方法包括在多个疗程内向受试者给予紫杉烷类药物和免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在多个疗程内向受试者给予紫杉烷类药物然后再给于免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在多个疗程内向所述受试者先给予免疫效应细胞，然后再给予紫杉烷类药物。在一些实施方式中，本发明的方法包括在多个疗程内向所述受试者基本上同时给予紫杉烷类药物和免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在多个疗程内向所述受试者交替给予紫杉烷类药物和免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在不同的疗程内，向所述受试者给予相同剂量的紫杉烷类药物和/或免疫效应细胞。在一些实施方式中，本发明的方法包括在不同的疗程内，向所述受试者给予不同剂量的紫杉烷类药物和/或免疫效应细胞。术语“紫杉烷类(taxanes)药物”指主要成分含有紫杉烷类化合物的药物，所述的紫杉烷类化合物具有与紫杉烷类似的桥亚甲基苯并环癸烯母核结构。在一些实施方式中，所述紫杉烷类化合物的所述桥亚甲基苯并环癸烯母核结构中含有不饱和键。在一些实施方式中，所述紫杉烷类化合物的所述桥亚甲基苯并环癸烯母核结构中不含不饱和键。在一些实施方式中，所述紫杉烷类的所述桥亚甲基苯并环癸烯母核结构上的碳原子被选自N、O、S、P的杂原子取代。在一些实施方式中，所述紫杉烷类化合物的给药方式为注射给药。在一些实施方案中，本发明方法在癌症治疗过程中，可以增加、增强或延长免疫细胞的活性和/或数目，或产生医学有效应答。术语“增加”或者“增强”免疫细胞的活性是指允许受试者或肿瘤细胞改善其响应本文公开的治疗的能力。例如，增强的应答可以包含应答性中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多的增加。如本文使用的，“增强”还可以指增加响应治疗例如免疫效应细胞疗法的受试者数目。例如，增强的应答可以指响应治疗的受试者总百分比，其中百分比是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％更多。在某些实施方案中，紫杉烷类化合物如Abraxane的给药剂量不高于300mg/m 2/次、或不高于约200mg/m 2/次，优选的，为100mg/m 2/次-200mg/m 2/次。在某些实施方案中，紫杉烷类化合物如Abraxane的给药剂量约为200、195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、 40、35、30、25、20、15、10、8、6、4、3、2或1mg/m 2/次，优选的，为100mg/m 2/次-200mg/m 2/次。在某些实施方案中，紫杉烷类化合物如Abraxane约每6周、5周、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或者1天静脉输注一次。在一些实施方案中，紫杉烷类化合物如Abraxane每个疗程静脉输注一次。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在紫杉烷类化合物给予之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在紫杉烷类化合物给予之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。
在一些实施方式中，本发明的方法包括在首剂量或后续剂量给予之前给予预处理，例如，化学治疗药物(化疗剂)、全身辐射、局部辐射治疗等或其组合。在一些实施方式中，所述方法包括采用一种或多种化疗剂对受试者进行预处理。在一些实施方式中，所述方法包括采用微管蛋白抑制剂与一种或多种其他化疗剂对受试者进行预处理。不受理论所限，预处理的作用被认为包括但不限于，淋巴细胞清除、降低肿瘤负荷等。在一些实施方式中，本文所述的方法包括在首剂量或后续剂量给予之前不进行所述预处理。在一些实施方式中，不进行所述预处理包括不给予淋巴细胞清除剂、全身辐射治疗或其组合或其他手段进行预处理的情形，以及在进行所述预处理后受试者体内淋巴细胞清除率仍低于50％、55％、60％、65％或者70％的情形。
在一些实施方式中，本文所述的化疗剂，是指化学治疗使用的药物，是指对微生物感染、寄生虫病及恶性肿瘤有防治作用的化学药物。化疗剂包括但不限于合成抗菌药、杭生素、抗寄生虫药、抗真菌药、抗病毒药、烷化剂、抗代谢物、抗结核药及抗肿瘤药。例如，二萜生物碱类化合物(如紫杉烷)、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、美法仑、苯达莫司汀、天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，羟基脲，甲氨蝶呤，利妥昔单抗，长春碱，和/或长春新碱等。在一些实施方式中，所述抗代谢物例如包括但不 限于抗代谢物如卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、fosteabine钠水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林(tiazofurin)、诺拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨(nelzarabine)、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰基氨基]-L-甘油-B-L-甘露糖-吡喃庚糖基]腺嘌呤、aplidine、海鞘素、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基(thienoyl)-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四碳-2,4,6-三烯-9-基醋酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿糖呋喃糖基(arabinofuranosyl)胞嘧啶和3-氨基吡啶-2-醛缩氨基硫脲等。在一些实施方式中，所述烷化剂例如包括但不限于达卡巴嗪、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、替莫唑胺、苯丁酸氮芥、白消安、氮芥和亚硝基脲等。
用首剂量或后续剂量给予之前的预处理受试者可改善免疫效应细胞治疗的效果。将每个疗程中给予免疫效应细胞(例如CAR T细胞)第一次输注之日定为第0日。在给予免疫效应细胞输注前给予预处理。在一些实施方式中，在过继细胞或者免疫效应细胞给予前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天进行预处理。在一些实施方式中，采用一种化疗剂进行预处理。在一些实施方式中，采用两种或更多种化疗剂进行预处理。在一些实施方式中，采用一种微管抑制剂与一种或多种另外的化疗剂进行预处理。在一些实施方式中，采用两种微管抑制剂与一种或多种另外的化疗剂进行预处理。在一些实施方式中，采用一种微管抑制剂如微管蛋白聚合促进剂与一种或多种烷化剂和一种或多种抗代谢物进行预处理。在一些实施方式中，采用一种或多种紫杉醇类与一种或多种烷化剂和一种或多种抗代谢物进行预处理。在一些实施方式中，采用一种微管抑制剂(例如紫杉醇特别是白蛋白结合型紫杉醇)与两种另外的化疗剂(例如氟达拉滨和环磷酰胺)进行预处理。出于方便陈述的目的，以下将以氟达拉滨和环磷酰胺作为代表性化疗剂，并以(白蛋白结合型)紫杉醇作为代表性微管抑制剂阐述在采用一种微管抑制剂和两种另外的化疗剂进行预处理时的具体实施方式。例如，在一些实施方式中，采用氟达拉滨、或环磷酰胺以及白蛋白结合型紫杉醇单独、两两组合或三者联合作为预处理在CAR-T细胞输注前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，优选地，至少1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，更优选地，至少2、3、4、5、6、7或8天给予受试者。在一些实施方式中，预处理包括在CAR-T细胞输注前6天给予氟达拉滨和环磷酰胺。在一些实施方式中，预处理包括在CAR-T细胞输注前7天给予氟达拉滨和环磷酰胺。在一些实施方式中，预处理包括在CAR-T细胞输注前5天给予氟达拉滨和环磷酰胺。在一些实施方式中，预处理包括在CAR-T细胞输注前6天给予氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，预处理包括在CAR-T细胞输注前4天给予白蛋白结合型紫杉醇。
如上所述，将对患者每个疗程给予CAR T细胞疗法之日指定为第0日。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞疗法之前的任何时候可给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前至少7天、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天、至少1天开始给予氟达拉滨、环磷酰胺或白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前至少12天、至少11天、至少10天、至少9天、至少8天开始给予氟达拉滨、环磷酰胺或白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前7天开始给予氟达拉滨、环磷酰胺或白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前6天开始给予氟达拉滨、环磷酰胺或白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前12天开始给予氟达拉滨、环磷酰胺或白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前5天开始给予氟达拉滨、环磷酰胺或白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前4天开始给予氟达拉滨、环磷酰胺或白蛋白结合型紫杉醇。
在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前7天开始给予氟达拉滨，在CAR T细胞输注前7天开始给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前6天开始给予氟达拉滨，在CAR T细胞输注前6天开始给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前5天开始给予氟达拉滨，在CAR T细胞输注前5天开始给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前12天开始给予氟达拉滨，在CAR T细胞输注前12天开始给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前5天开始给予氟达拉滨，在CAR T细胞输注前5天开始给予环磷酰胺，以及在CAR T细胞输注前4天开始给白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前6天开始给予氟达拉滨，在CAR T细胞输注前6天开始给予环磷酰胺，以及在CAR T细胞输注前5天开始给白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予CAR T细胞输注前12天开始给予氟达拉滨，在CAR T细胞输注前12天开始给予环磷酰胺，以及在CAR T细胞输注前11天开始给白蛋白结合型紫杉醇。
可以调整预处理的成分的给予时机是CAR T治疗疗效达到最大。通常，可每日给予氟达拉滨、环磷酰胺，和/或白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇给予约1日、约2日、约3日、约4日、约5日、约6日或约7日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予4日，和每日给予环磷酰胺给予2日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予2日，和每日给予环磷酰胺给予3日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予2日，和每日给予环磷酰胺给予4日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予1日，和每日给予环磷酰胺给予3日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予1日，和每日给予环磷酰胺给予4日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予4日，和每日给予环磷酰胺给予2日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予1日，和每日给予环磷酰胺给予3日，以及每日给予白蛋白结合型紫杉醇给予1日。在一些实施方式中，每日给予氟达拉滨给予1日，和每日给予环磷酰胺给予4日，以及每日给予白蛋白结合型紫杉醇给予1日。
如上所述，将对患者每轮给予CAR T细胞疗法之日指定为第0日。在一些实施方式中，在第0日前的第4日(即第-4日)对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-5日对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-6日对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-12日对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-6和-5日对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-5和-4日对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-6、-5、-4和-3日对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-7、-6、-5和-4日对患者给予氟达拉滨。在一些实施方式中，在第-6、-5、-4和-3日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-6、-5和-4日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-5、-4和-2日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-5、-4和-3日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-12、-11和-10日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-7和-6日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-6和-5日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-4日对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在第-5日对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在第-11日对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在第-5和-4日对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。
可在同日或不同日给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇。如果在同日给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇，则可在氟达拉滨前或后给予环磷酰胺和/或白蛋白结合型紫杉醇；或在环磷酰胺前或后给予氟达拉滨和/或白蛋白结合型紫杉醇；或在白蛋白结合型紫杉醇前或后给予环磷酰胺和/或氟达拉滨。 在一些实施方式中，在第-6、-5、-4和-3日对患者给予氟达拉滨，在第-6和-5日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-7、-6、-5和-4日对患者给予氟达拉滨，在第-7和-6日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-5和-4日对患者给予氟达拉滨，在第-5、-4和-2日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-6和-5日对患者给予氟达拉滨，在第-6、-5、-4和-3日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-5日对患者给予氟达拉滨，在第-5、-4和-3日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-6日对患者给予氟达拉滨，在第-6、-5和-4日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-6日对患者给予氟达拉滨，在第-6、-5、-4和-3日对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在第-5日对患者给予氟达拉滨，在第-5、-4和-3日对患者给予环磷酰胺，以及在-4日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在第-6日对患者给予氟达拉滨，在第-6、-5和-4日对患者给予环磷酰胺，以及在-5日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在第-12日对患者给予氟达拉滨，在第-12、-11和-10日对患者给予环磷酰胺，以及在-11日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在第-6日对患者给予氟达拉滨，在第-6、-5、-4和-3日对患者给予环磷酰胺，以及在-5日给予白蛋白结合型紫杉醇。
在某些实施方式中，可同时给予或依次给予氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予氟达拉滨前对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在给予氟达拉滨后对患者给予环磷酰胺。在一些实施方式中，在给予氟达拉滨前对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予氟达拉滨后前对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予环磷酰胺前对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在给予环磷酰胺后对患者给予白蛋白结合型紫杉醇。
可利用任何途径(包括静脉注射(IV))给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，在下列时间内利用IV给予氟达拉滨：约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约90分钟、约120分钟。在一些实施方式中，在下列时间内利用IV给予环磷酰胺：约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约90分钟、约120分钟。在一些实施方式中，在下列时间内利用IV给予白蛋白结合型紫杉醇：约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约90分钟、约120分钟。
在一些实施方式中，在给予氟达拉滨和环磷酰胺，或氟达拉滨、环磷酰胺和 白蛋白结合型紫杉醇对患者给予T细胞疗法。在一些实施方式中，该T细胞疗法包括过继细胞疗法或免疫效应细胞疗法。在一些实施方式中，过继细胞疗法或免疫效应细胞疗法选自肿瘤浸润淋巴球(TIL)免疫疗法、自体细胞疗法、工程化自体细胞疗法(eACT)、与同种异体T细胞移植法。在一些实施方式中，eACT包含给予工程化抗原特异性嵌合抗原受体(CAR T)阳性T细胞。在一些实施方式中，eACT包含给予工程化抗原特异性T细胞受体(TCR)阳性T细胞。在一些实施方式中，工程化T细胞治疗患者中的肿瘤。
在一些实施方式中，预处理包括给予氟达拉滨不高于约500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、85、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1mg/m 2/日；和/或给予环磷酰胺不高于约1000、950、900、850、800、750、700、690、680、670、660、650、640、630、620、610、600、595、590、585、580、579、578、576、575、574、573、572、571、570、569、568、567、566、565、564、563、562、561、560、559、558、557、556、555、554、553、552、551、550、549、548、547、546、545、544、543、542、541、540、539、538、537、536、535、534、533、532、531、530、529、528、527、526、525、524、523、522、521、520、519、518、517、516、515、514、513、512、511、510、509、508、507、506、505、504、503、502、501、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10mg/m 2/日；和/或给予白蛋白结合型紫杉醇不高于约500、450、400、350、300、290、280、270、265、260、255、250、245、240、235、230、225、220、215、210、205、200、195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、35、30、25、20、15、10、5或1mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约10mg/m 2/日至50mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约300至700mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约10mg/m 2/日至50mg/m 2/日，和环磷酰胺给予剂量在约300至700mg/m 2/日，和白蛋白结合型紫杉醇给予剂量不高于约300mg/m 2/日、不高于约200mg/m 2/日、不高于约150mg/m 2/日、100mg/m 2/日、不高于80mg/m 2/日或不高于70mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约15mg/m 2/日至40mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约400至650mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约15mg/m 2/日至40mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约400至650mg/m 2/日，和白蛋白结合型紫杉醇给予剂量不高于约300mg/m 2/日、不高于约200mg/m 2/日、不高于约150mg/m 2/日、100mg/m 2/日、不高于80mg/m 2/日或不高于70mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约15mg/m 2/日至30mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约450至600、450至550或490至550mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约15mg/m 2/日至30mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约450至600、450至550或490至550mg/m 2/日，和白蛋白结合型紫杉醇给予剂量不高于约300mg/m 2/日、不高于约200mg/m 2/日、不高于约150mg/m 2/日、100mg/m 2/日、不高于80mg/m 2/日或不高于70mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约20mg/m 2/日至30mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约450至600、450至550或490至550mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约20mg/m 2/日至30mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约450至600、450至550或490至550mg/m 2/日，和白蛋白结合型紫杉醇给予剂量不高于约300mg/m 2/日、不高于约200mg/m 2/日、不高于约150mg/m 2/日、100mg/m 2/日、不高于80mg/m 2/日或不高于70mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约20mg/m 2/日至25mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约450至600、450至550或490至550mg/m 2/日。
在一些实施方式中，预处理包括氟达拉滨给予剂量在约15mg/m 2/日至25mg/m 2/日和环磷酰胺给予剂量在约450至600、450至550或490至550mg/m 2/日，和白蛋白结合型紫杉醇给予剂量不高于约300mg/m 2/日、不高于约200mg/m 2/日、不高于约150mg/m 2/日、100mg/m 2/日、不高于80mg/m 2/日或不高于70mg/m 2/日。
在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约500mg/m 2/日的环 磷酰胺，其中在第-6、-5、-4和-3日给予氟达拉滨，和在-6和-5日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约514mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-7、-6、-5和-4日给予氟达拉滨，和在-7和-6日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约514mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-5和-4日给予氟达拉滨，和在-5、-4和-2日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约514mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-6、和-5日给予氟达拉滨，和在-6、-5、-4和-3日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约510mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-6、和-5日给予氟达拉滨，和在-6、-5、-4和-3日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约500mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-5日给予氟达拉滨，和在-5、-4和-3日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约540mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-6日给予氟达拉滨，和在-6、-5和-4日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约500mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-6日给予氟达拉滨，和在-6、-5和-4日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约500mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-6日给予氟达拉滨，和在-6、-5、-4和-3日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨和剂量约500mg/m 2/日的环磷酰胺，其中在第-12日给予氟达拉滨，和在-12、-11和-10日给予环磷酰胺。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨、剂量约500mg/m 2/日的环磷酰胺和剂量约100mg/m 2/日的白蛋白结合型紫杉醇，其中在第-5日给予氟达拉滨，和在-5、-4和-3日给予环磷酰胺，以及在-4日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该 患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨、剂量约540mg/m 2/日的环磷酰胺和剂量约71mg/m 2/日的白蛋白结合型紫杉醇，其中在第-6日给予氟达拉滨，和在-6、-5和-4日给予环磷酰胺，以及在-5日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨、剂量约500mg/m 2/日的环磷酰胺和剂量约71mg/m 2/日的白蛋白结合型紫杉醇，其中在第-12日给予氟达拉滨，和在-12、-11和-10日给予环磷酰胺，以及在-11日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨、剂量约500mg/m 2/日的环磷酰胺和剂量约100mg/m 2/日的白蛋白结合型紫杉醇，其中在第-6日给予氟达拉滨，和在-6、-5和-4日给予环磷酰胺，以及在-5日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约20mg/m 2/日的氟达拉滨、剂量约507mg/m 2/日的环磷酰胺和剂量约68mg/m 2/日的白蛋白结合型紫杉醇，其中在第-6日给予氟达拉滨，和在-6、-5、-4和-3日给予环磷酰胺，以及在-5日给予白蛋白结合型紫杉醇。在一些实施方式中，本发明包括一种给予免疫效应细胞输注前的预处理方法，该方法包含对该患者给予剂量约137mg/m 2/日的白蛋白结合型紫杉醇，其中在-4日给予白蛋白结合型紫杉醇。
在此处所述的方法中可包括各种其他干预。例如，环磷酰胺与氟达拉滨在给予后可能引起患者的不良时间。本发明的范围包括对患者给予组成物以使这些不良事件中的某些事件减少。在某些实施方式中，该方法包含对患者给予生理盐水。可在给予环磷酰胺和/或氟达拉滨前或后，或在给予环磷酰胺和/或氟达拉滨前与后对患者给予生理盐水。在一些实施方式中，在每个输注日给予环磷酰胺和/或氟达拉滨前，及在给予环磷酰胺和/或氟达拉滨后对患者给予生理盐水。另外，还可对患者给予佐剂与赋形剂。例如，美司钠(2-巯基乙烷磺酸钠)。此外，还可对患者给予外源性细胞激素。
在一些实施方式中，在输注首剂量或后续剂量之前给予预处理改善了治疗的结果。例如，在一些方面，预处理改善了用首剂量或后续剂量治疗的功效，或增加了受试者中嵌合抗原受体-表达免疫效应细胞(例如CAR-表达免疫效应细胞，如CAR-表达T细胞)的持久性。在一些实施方式中，预处理治疗增加疾病稳定期。
一旦向受试者(例如，人)给予免疫效应细胞，在一些方面中，通过多种已知方法中的任一种来测量工程改造的免疫效应细胞群的生物活性。用以评估的参数包括：工程改造的或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如， 通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的免疫效应细胞破坏靶细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，Kochenderfer等，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，也可通过测定某些细胞因子，例如CD107a，IFNγ，IL-2和TNF的表达和/或分泌，来测量免疫效应细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减少。在一些方面中，评估肿瘤标志物的降低。在一些方面，评估细胞的毒性结果、持久性和/或增殖，和/或存在或不存在宿主免疫应答。
给药
本发明中，多个剂量的免疫效应细胞的给予时间和大小通常经设计以降低风险或最小化毒性结果和/或提高功效，例如通过随时间提供受试者对免疫效应细胞的暴露增加。该方法包括通常在一个或多个后续剂量之前，在不同剂量之间的特定时间范围内给予首剂量。
在免疫效应细胞治疗的情况下，给予给定的“剂量”包括以单一组合物和/或单次不间断给药，例如以单次注射或连续输注给予给定量或数量的免疫效应细胞，并且还包括在不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天特定时间段内，以分剂量，在多个单独组合物或输注物中提供，给予给定量或数量的免疫效应细胞。因此，首剂量或后续剂量是在单个时间点给予或开始的指定数量的免疫效应细胞的单次或连续给予。然而，在一些情况下，首剂量或后续剂量在不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天的时间段内进行多次注射或输注，例如每天一次持续三天或两天，或通过在一天时间内的多次输注。在一些方面，首剂量的免疫效应细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方案中，后续剂量的免疫效应细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方式中，首剂量的免疫效应细胞以总体含有首剂量的免疫效应细胞的多个组合物给予。在一些实施方式中，后续剂量的免疫效应细胞以总体含有后续剂量的免疫效应细胞的多个组合物给予。在一些方面，可以在不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天的时间内以多个组合物给予额外的后续剂量。
术语“分剂量”是指单一剂量中分次给予所述单一剂量的一部分，使所述单一剂量在超过一天的时间内向受试者给予的给予方式。在一些实施方式中，首剂量和 /或每个后续剂量均可以两次或者更多次分剂量给予。例如，在一些实施方式中，可在3天、5天、14天或15天内向受试者给予该剂量(该剂量为首剂量的总剂量或后续剂量的总剂量)。分开给药的示例性方法包括在(将对患者每轮给予CAR T细胞疗法之日指定为第0日)第0天给予总剂量的50％的分剂量，并在第2天给予总剂量的50％的分剂量。在其他实施方式中，总剂量的10％可以在第0天给予，在第2天给予总剂量的30％，在第4天给予总剂量的60％。在一些实施方式中，在第0天给予总剂量的10％的分剂量，在第1天给予总剂量的30％的分剂量，并且在第2天给予总剂量的60％的分剂量。在一些实施方式中，在第0天给予总剂量的1/3的分剂量，在第11天给予总剂量的1/3的分剂量，并且在第14天给予总剂量的1/3的分剂量。在一些实施方式中，在第0天给予总剂量的46％的分剂量，在第1天给予总剂量的18％的分剂量，并且在第2天给予总剂量的36％的分剂量。在一些实施方式中，在第0天给予总剂量的25％的分剂量，在第2天给予总剂量的25％的分剂量，在第9天给予总剂量的25％的分剂量，及在第13天给予总剂量的25％的分剂量。在一些实施方式中，单一剂量分次给予的总时间扩展不超过15天。
如本文所用，“首剂量”用于描述根据本文所述的方法进行治疗所进行的首个疗程中所给予的总剂量。该剂量等于单疗程给药中该疗程中给药的总剂量，或者多疗程给药中首个疗程中给药的总剂量。该术语并不一定意味着受试者在接受本文所述方法治疗之前从未接受过免疫效应细胞治疗，或者受试者之前还没有接受表达相同嵌合抗原受体或靶向相同抗原的相同免疫效应细胞的剂量。
相对于首剂量，术语“后续剂量”是指在多疗程的给药中首剂量之后的每个疗程中所给予的单一剂量或者每个疗程中的总剂量。在一些实施方式中，所述方法包括多疗程给药，即给予一个或多个后续剂量，其中第一个后续剂量也叫做第二疗程剂量，第二个后续剂量也叫做第三疗程剂量，以此类推。并且，在系列剂量中，在先的剂量为紧随其后的后续剂量的前一剂量。在一些实施方式中，使用与首剂量类似的给予时间和方式给予后续剂量。在一些实施方式中，首剂量与第一个后续剂量或者第二疗程剂量之间的间隔以及多个后续剂量之间的间隔可以相同或者不同，如前文所详述。
剂量的量或大小
通常设计首剂量和/或一个或多个后续剂量的剂量大小以提供改善的功效和/或降低的毒性风险。在一些实施方式中，首剂量或者单个后续剂量中的免疫效应细胞的数量为高于、低于或者等于约1x10 6细胞/kg受试者体重至约3x10 7细胞/kg受试者体重，如高于、低于或者等于约1×10 5、1.5×10 5、2×10 5、2.5×10 5、3×10 5、3.5×10 5、 4×10 5、4.5×10 5、5×10 5、5.5×10 5、6×10 5、6.5×10 5、7×10 5、7.5×10 5、8×10 5、8.5×10 5、9×10 5、9.5×10 5、1×10 6、1.5×10 6、2×10 6、2.5×10 6、3×10 6、3.5×10 6、4×10 6、4.5×10 6、5×10 6、5.5×10 6、6×10 6、6.5×10 6、7×10 6、7.5×10 6、8×10 6、8.5×10 6、9×10 6、9.5×10 6、1×10 7、1.5×10 7、2×10 7、2.5×10 7、3×10 7、3.5×10 7、4×10 7、4.5×10 7、5×10 7、6×10 7、6.5×10 7、7×10 7、7.5×10 7、8×10 7、8.5×10 7、9×10 7、9.5×10 7、1×10 8、1.5×10 8、2×10 8、2.5×10 8、3×10 8、3.5×10 8、4×10 8、4.5×10 8、5×10 8、5.5×10 8、6×10 8、6.5×10 8、7×10 8、7.5×10 8、8×10 8、8.5×10 8、9×10 8、9.5×10 8、1×10 9、1.5×10 9、2×10 9、2.5×10 9、3×10 9、3.5×10 9、4×10 9、4.5×10 9、5×10 9、5.5×10 9、6×10 9、6.5×10 9、7×10 9、7.5×10 9、8×10 9、8.5×10 9、9×10 9、9.5×10 9、1×10 10、1.5×10 10、2×10 10、2.5×10 10、3×10 10、3.5×10 10、4×10 10、4.5×10 10、5×10 10、5.5×10 10、6×10 10、6.5×10 10、7×10 10、7.5×10 10、8×10 10、8.5×10 10、9×10 10、9.5×10 10、1×10 11细胞/kg受试者体重。
在具体实施方式中，免疫效应细胞的数量和/或浓度是指嵌合抗原受体(例如CAR)-表达免疫效应细胞的数量。在其他实施方式中，免疫效应细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些实施方式中，首剂量中的免疫效应细胞、嵌合抗原受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量大于约1×10 6个此类细胞/千克受试者体重，例如约或至少约1×10 6、1.1×10 6、2×10 6、2.9×10 6、3×10 6、3.3×10 6、5×10 6、1×10 7、1.3×10 7、1.6×10 7、2.6×10 7、2.8×10 7、3x10 7、5×10 7、2.5×10 8、1×10 9、1×10 10、5×10 10个此类细胞/千克体重，或任何两个前述值之间的范围。
在一些实施方式中，以后续剂量给予的免疫效应细胞数量与本文的任何实施方式中在首剂量中给予的免疫效应细胞数量相同或类似或大于，例如等于或约1×10 6，等于或约1×10 7，等于或约1.3×10 7，等于或约1.6×10 7，等于或约1.9×10 7，等于或约2×10 7，等于或约2.2×10 7，等于或约3.7×10 7，等于或约5×10 7，或等于或约5.1×10 7，或等于或约1×10 8、或等于或约2.5×10 8、或等于或约1×10 9，或等于或约1×10 10、或等于或约5×10 10个此类细胞/千克受试者体重，或在任何两个上述值之间的范围内的值。
关于免疫效应细胞数量，在一些实施方式中，这些值是指嵌合抗原受体-表达(例如CAR-表达)细胞的数量；在其它实施方式中，它们是指给予的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
在一些方面，后续剂量大于或等于或小于首剂量。例如，在一些实施方式中，后续剂量含有超过约1×10 6个细胞、嵌合抗原受体(例如CAR)-表达细胞、T细胞和/或PBMC/千克受试者体重，例如约或至少约1×10 6、1×10 7、1.3×10 7、1.6×10 7、1.9×10 7、 2×10 7、2.2×10 7、3.7×10 7、5×10 7、5.1×10 7、1×10 8、2.5×10 8、1×10 9、1×10 10、5×10 10个此类细胞/千克受试者体重，或在任何两个上述值之间的范围内的值，各自包括端值。
在一些实施方式中，后续剂量的量或大小足以减少肿瘤负荷或其指标，和/或疾病或病症的一种或多种症状。在一些实施方式中，剂量具有有效改善受试者生存的大小，例如，改善受试者存活，例如，诱导受试者存活、无复发存活或无事件存活持续至少1个月或至少1、2、3、4或5年。
在一些实施方式中，与给予首剂量或后续剂量之前时刻相比，在后续剂量后，肿瘤负荷，包括肿瘤大小、肿瘤体积和/或肿瘤质量减少至少等于或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多。
在其他实施方式中，以后续剂量给予的免疫效应细胞的数量低于在首剂量中给予的免疫效应细胞的数量。
在一些方面，基于一个或多个标准来确定首和/或后续剂量的大小，例如受试者对在先治疗的反应，例如，化疗，受试者的肿瘤负荷，例如肿瘤体积，大小或度，程度，或转移类型，阶段和/或中晚期癌症常见的并发症，例如癌性胸腹水和/或受试者发生毒性结果的可能性或发生率，例如CRS，巨噬细胞活化综合征，肿瘤溶解综合征，神经毒性和/或针对给予的细胞和/或嵌合抗原受体的宿主免疫应答。
基于本发明的教导，本领域技术人员应该理解，本发明具体公开的剂量是本发明人经过研究得到是安全有效的剂量，本领域技术人员，例如临床医师可以根据各种实际情况，例如患者的肿瘤负荷、患者本身的身体状况等因素决定具体的首剂量；如果需要进一步给予后续剂量，本领域技术人员可以根据，例如给予免疫效应细胞之后的肿瘤负荷变化来决定后续剂量。
本领域技术人员还应理解，本发明的免疫效应细胞，例如CLD18A2-CAR-T细胞可以与其它CAR-T联用。例如，患者的肿瘤可以表达几个肿瘤抗原，那该患者可以在前期接受靶向其它肿瘤抗原的CAR-T细胞，然后再接受本发明的CLD18A2-CAR-T细胞治疗；该患者也可以在前期接受其它不同于本发明的CLD18A2-CAR-T细胞治疗，在出现抗体特异性不强或抗体为鼠源性排斥反应等情况下，转而使用本发明的CLD18A2-CAR-T细胞治疗。因此，在上述情况下，本领域技术人员，例如临床医师可以根据在先治疗的情况决定本发明的CLD18A2-CAR-T细胞的给予次数以及剂量。例如，可以参考本文公开的安全而有效的剂量以及给予次数，即，不超过约2x10 10细胞/千克受试者体重或总量不超过约 1x10 12细胞；优选地，不超过约2x10 9细胞/千克受试者体重或总量不超过约2x10 11细胞；更优选地，不超过约2.5x10 8细胞/千克受试者体重、或5x10 7细胞/千克受试者体重、或3x10 7细胞/千克受试者体重、或总量不超过5x10 9或约1x10 10细胞。
在一些方面，首剂量和/或后续剂量的大小由受试者中疾病或病症的负荷决定。例如，在一些方面，基于在给予首剂量之前时刻存在于受试者中的肿瘤负荷来确定以首剂量给予的免疫效应细胞的数量。在一些实施方式中，首剂量和/或后续剂量的大小与肿瘤负荷成反比。
在一些方面，基于在给予首剂量之前存在于受试者中的肿瘤负荷来确定以后续剂量给予的免疫效应细胞的数量。在一些实施方式中，例如，其中首剂量导致肿瘤负荷减少或降低，或已经低于特定阈值量或水平，例如高于其表示毒性结果的风险增加，后续剂量增加，例如，超过约1x10 7个细胞(例如，总细胞、受体-表达细胞、T细胞或PBMC)/千克体重，例如，大于约2.0x10 7、2.5x10 7、3.0x10 7、5.0x10 7、1.0x10 8、2.5x10 8个细胞/kg，和/或大于首剂量。
在一些情况下，即使在接受首剂后受试者的肿瘤负荷没有降低，后续剂量可以增加，例如，超过约1×10 7个细胞(例如，总细胞、受体-表达细胞，T细胞或PBMC)/千克体重，例如超过约2.0x10 7、2.5x10 7、3.0x10 7、5.0x10 7、1x10 8、2.5x10 8个细胞/kg，和/或大于首剂量。
可利用任何途径(包括静脉注射(IV))给予T细胞(例如CAR T细胞)。在一些实施方式中，在下列时间内利用IV给予CAR T细胞：约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟。
在一些实施方式中，首剂量包括不引起或降低毒性或毒性结果的可能性的量的免疫效应细胞，例如细胞因子释放综合征(CRS)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、持续三天或更多天的至少38摄氏度或约38摄氏度的发热，CRP血浆水平至少等于约20mg/dL，和/或神经毒性。在一些方面，基于在给予细胞后受试者将显示毒性或毒性结果(例如CRS，sCRS和/或CRS相关结果)的可能性来确定在首剂量中给予的细胞的数量。例如，在一些实施方式中，基于肿瘤负荷预测受试者中发展毒性结果的可能性。在一些实施方式中，该方法包括在给予剂量之前检测或评估毒性结果和/或肿瘤负荷。
在一些实施方式中，受试者被给予后续剂量，当给予首剂量之后的毒性结果 的生物化学指示物或其他指示物，例如，CRS指示物的血清水平没有增加到高于给定水平，例如可接受的水平，例如大于或等于或约10、15、20、25、50、75或100倍的给予首剂量之前时刻的指示物的血清水平，或者已经增加到可接受水平之上，但已经下降到等于或低于可接受水平时。在某些方面，如果指示物在给予首剂量的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或40天内下降至可接受水平以下，则给予后续剂量，但如果指示物的水平不在该时间段内降低到可接受水平以下，则不给予后续剂量。
在一些实施方式中，如果在发生细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征或肿瘤溶解综合征或神经毒性的临床风险不存在或已过去或在首次给药后已经消退，则给予后续剂量，如在这种事件通常已经消退和/或不太可能发生的关键窗口之后，例如在约60％、70％、80％、90％或95％的具有特定疾病或病症的受试者中。
在一些实施方式中，是否给予后续剂量，何时给予后续剂量，和/或后续剂量中给予的细胞数量基于受试者中针对首剂量的细胞或其表达的嵌合抗原受体的免疫应答或可检测免疫应答的存在、不存在或程度确定。在一些方面，含表达首剂量的细胞的受体的细胞的后续剂量将不会给予具有可检测的宿主适应性免疫应答或已经建立或达到一定水平、阶段或程度的免疫应答的受试者。
给药时间
在一些实施方式中，后续剂量给药的时间是从首剂量完成(首剂量的总剂量输注完成日定为0日)开始起算。
在一些实施方式中，在受试者中指示CRS的因子的血清水平不超过给予首剂量前时刻的受试者中该指示物的血清水平的约10倍、25倍、50倍或100倍时给予后续剂量。
在一些实施方式中，在受试者中与CRS相关的结果(例如与CRS相关或指示CRS的血清因子)或其临床迹象或症状如发热、缺氧、低血压或神经障碍已经达到峰值水平，并且在给予首剂量后开始下降之后时给予后续剂量。在一些实施方式中，在观察到给予后与这类结果的最高水平相比下降时，或在给予后达到结果的最大值或水平之后水平下降时给予后续剂量。
在一些实施方式中，当毒性结果的指示物(例如CRS的血清指示物)的水平下降到首剂量之前时刻的指示物水平的约25倍以下时，给予后续剂量。在一些方面，后续剂量在受试者不显示CRS或不显示严重CRS时给予。
在一些方面，后续剂量在与给予首剂量之前的肿瘤负荷相比患者中的肿瘤负荷下降的时间点给予。在一些实施方式中，后续剂量在给予首剂量后，在肿瘤负荷或其指示物，如受试者的血液、其他体液、器官或组织中的疾病(例如，肿瘤)细胞的体积或数量或百分比，或肿瘤大小已经减少了约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多时给予。
在一些实施方式中，在受试者的疾病或病症在对首剂量或在先剂量的应答降低后没有复发时给予后续剂量。在一些实施方式中，减轻肿瘤负荷由一个或多个因子的降低来指示，所述因子例如受试者或其体液或器官或组织中的肿瘤标志物的表达水平、肿瘤细胞的负荷或数量、肿瘤的质量或体积、转移的程度或度。在一些实施方式中，复发是一般或一个或多个因子，或在肿瘤负荷中。在一些方面，在受试者、疾病负担或其因子与在首次或在先给药之后测量或达到的最低点相比复发，但仍然低于首次剂量之前时刻时给予后续剂量。在一些实施方式中，在肿瘤负荷或其指示因子未发生变化时，例如，当已阻止肿瘤负荷增加时，给予受试者后续剂量。
在一些实施方式中，在宿主适应性免疫应答未被检测到、尚未建立、或尚未达到一定水平、程度或阶段时给予后续剂量。在一些方面，在受试者的记忆免疫应答发展之前给予后续剂量。
在一些方面，给予首剂量与给予后续剂量之间的时间为约21至约80天，约25至约60天，或25至55天。在一些实施方案中，给予后续剂量不超过给予首剂量后的约25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天。在一些实施方案中，给予后续剂量不超过给予首剂量后的约44天、45天、46天、47天或48天。
在一些实施方式中，在给予后续剂量(即第一后续剂量，或称为第二疗程剂量)后，给予额外或进一步的后续剂量，例如，第二后续剂量(第三疗程剂量)、第三后续剂量(第四疗程剂量)，以此类推。在一些方面，在给予在先后续剂量(例如第一后续剂量)后至少约21天且不到约80天时给予额外的后续剂量。在一些实施方式中，示例性剂量方案包括何时或大约何时给予嵌合抗原受体表达细胞(例如，CAR表达细胞，例如CAR T细胞)的时间表。在一些实施方式中，在第一后续剂量后约49天给予额外的剂量(第二后续剂量)，以此类推。在一些实施方案中，给予在后的后续剂量不超过给予相邻在前的后续量后的约21至约80天，约25至约60天， 或25至55天。在一些实施方案中，给予在后后续剂量不超过给予相邻在线后续剂量后的约25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天。
在任何实施方式中，在一些情况下，该方法包括给予首剂量或在先剂量和后续剂量，并且在其他情况下包括向先前已接受过首剂量或在先剂量的受试者给予后续剂量，该受试者在此以前接受了首剂量或在先剂量，但不包括给予首剂量或在先剂量本身。因此，在某些情况下，该方法涉及给予巩固治疗，例如通过对先前已经接受剂量(例如减灭剂量)的嵌合抗原受体-表达(例如CAR表达)细胞的受试者给予巩固性后续剂量。在一些方面，受体表达，例如CAR表达细胞的先前剂量已经足以减少受试者中的疾病或病症负荷，使得给予后续剂量的细胞的功效和/或安全性相对于给予没有接受首剂量的受试者的剂量得到改善。
在一些实施方式中，与给予首剂量或后续剂量之前时刻相比，在后续剂量后，肿瘤负荷，包括肿瘤标志物、肿瘤大小、肿瘤体积和/或肿瘤质量减少至少等于或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多。
针对回输的细胞的宿主免疫应答
在一些实施方式中，一个或多个剂量，例如后续剂量在受试者的免疫应答(例如对转基因受体或细胞的适应性或特异性免疫应答)不存在，不可检测，或在一定水平以上无法检测时给予。对转基因的特异性免疫应答的存在或程度通常与受体的免疫原性(例如由细胞表达的CAR或转基因TCR)和/或受试者暴露于细胞的时间有关。例如，在一些实施方式中，在受试者首次接触表达受体的细胞之后的28天、35天或42天之前，未检测到针对受体的免疫应答，例如特异性体液和/或细胞介导的免疫应答。因此，在一些实施方式中，在受试者中已经发展针对嵌合抗原受体或细胞的免疫应答，适应性或特异性免疫应答，可检测的免疫应答和/或记忆应答之前给予后续剂量。在这方面，与其他与在先或首剂量相比，在较晚时间点给予后续剂量的其它方法相比，后续剂量的细胞增殖和/或持续存在于受试者中的能力得到改善。该方法包括检测这种免疫应答或其指示物的存在或不存在或水平，例如，在给予首或后续的剂量之后和给予后续或下一个后续剂量之前。
在一些实施方式中，何时和/或是否给予后续剂量的决定取决于受试者是否表现出这样的免疫应答或其可检测的读数，例如对细胞或嵌合抗原受体特异的可检测的特异性或适应性宿主免疫应答，例如由首剂量的细胞表达的CAR，和/或是否在某一水平上检测到这样的反应。在一些实施方式中，在检测到这样的反应的情况下，不向受试者给予后续剂量。在受试者不表现出针对受体(例如由首剂量的细胞表达的CAR)的特异性或适应性(例如体液或细胞介导的)免疫应答时，或者不表现出在可检测水平或高于可接受水平的这种反应或指示物时给予后续剂量。在一些方面，在给予后续剂量时，与初始剂量较大时相比，受试者表现出减少的针对首剂量的细胞表达的CAR的体液或细胞介导的免疫应答。
在上述实施方式的任何一个中，可检测的免疫应答是指通过用于评估对特定抗原和细胞的特异性免疫应答的许多已知方法中的任何一种可检测到的量。例如，在一些实施方式中，通过在受试者的血清上进行ELISPOT、ELISA或基于细胞的抗体检测方法(例如，通过流式细胞术)以检测特异性结合和/或中和存在于细胞上的抗原，例如结合嵌合抗原受体的表位，例如CAR的抗体的存在来检测特定类型的免疫应答。在一些这样的测定中，确定检测到的抗体的同种型并且可以指示应答的类型和/或应答是否是记忆应答。
在一些方面，例如，在给予首剂量或后续剂量之后，检测或测量这种宿主免疫应答和/或其数量、程度或度的存在或不存在。
在一些实施方式中，与使用替代给药方案的比较方法观察到的减少，例如其中受试者接受单一剂量(例如，单个大剂量的细胞)，例如，以所提供的方法统一地以首剂量和后续剂量给予的细胞总数代替单个剂量，或者给予彼此间隔小于约21或超过约80天的多个大剂量或多个剂量相比，该方法在更大程度上减少疾病或病症负荷，例如肿瘤细胞的数目，肿瘤的大小，患者存活的持续时间或无事件的存活时间，以及更长的时间段。在一些方面，评估受试者的生存期，在一定时间段内的存活，存活范围，无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。
在一些方面，在给予首剂量之前，在给予首剂量之后但在给予后续剂量之前，和/或在给予后续剂量后，测量或检测疾病负荷。在多个后续剂量的情况下，一些实施方式中的疾病负荷可以在任何后续剂量之前或之后或在给予后续剂量之间时测量。
在一些实施方案中，在给予首剂量后，该负荷减少至少或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。在一些方面， 给予后续剂量会进一步降低疾病负荷，肿瘤负荷，例如与给予后续剂量之前时刻相比或与在首剂量之前时刻相比，有等于或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％的负荷减轻。
在一些实施方式中，与其他方法相比，通过该方法改善受试者的无事件存活率或总体存活率。例如，在一些实施方式中，在首剂量后1个月通过该方法治疗的受试者的无进展事件存活率或概率大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、或大于约95％。在一些方面，总存活率大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％，大于约50％，大于约60％，大于约70％，大于约80％，大于约90％或大于约95％。在一些实施方式中，用该方法治疗的受试者表现出无进展事件存活，无复发生存或存活至少约1个月，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月、或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方式中，改善进展的时间，例如大于或约1个月，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月、或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年的进展时间。
在一些实施方式中，通过该方法进行的治疗，与其它方法相比，复发的概率降低。例如，在一些实施方式中，首剂量后1个月复发或进展的概率小于约80％，小于约70％，小于约60％，小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，小于约10％，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％。
细胞暴露和持久性
在一些实施方式中，其剂量和/或其时间经设计为促进受试者暴露于细胞，例如通过随时间增加促进其增殖和/或持久性。
在一些实施方案中，所提供的方法增加受试者对所施用细胞的暴露(例如，随时间增加的细胞数量或持续时间)和/或改善免疫细胞疗法中的功效和治疗结果。在一些方面，该方法的优点在于，与其他方法相比，表达嵌合抗原受体的细胞(例如CAR-表达细胞)的暴露程度更大和/或更长程度地改善治疗结果。这些结果可包括患者的生存和缓解，甚至在具有严重肿瘤负荷的个体中。
在一些实施方式中，检测在首剂量和/或后续剂量之后在受试者中表达嵌合抗原受体的细胞(例如CAR-表达细胞)的存在和/或量。在一些方面，使用定量PCR(qPCR)来评估在受试者的血液或血清或器官或组织(例如疾病部位)中表达嵌合抗原受体的细胞(例如CAR-T)的量。在一些方面，持续性被定量为每微克DNA中 编码受体，例如CAR的DNA或质粒的拷贝，或作为每微升样品例如，血液或血清的受体表达，例如CAR表达细胞的数量，或每微升样品的外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数。
在一些实施方式中，在给予首剂量之后或至少在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，在受试者中检测到细胞。在一些方面，在或者至少在给予首次或后续剂量后2、4或6周，或者3、6或12、18或24、或30或36个月，或者1、2、3、4、5或更多年检测到细胞。
在一些实施方式中，与通过替代方法，诸如涉及给予单一剂量的方法，例如含有比首剂量更多的细胞的方法，将总和剂量的细胞作为单一剂量施用，向未接受首剂量的受试者给予的后续剂量的细胞，和/或在指定时间窗外的时间给予后续剂量，例如晚于受试者针对受体(例如CAR)的免疫应答出现所规定的时间或随后。
可以根据受试者暴露的细胞的最大数目，高于特定数量或百分比的可检测细胞的持续时间，随时间的细胞数曲线下面积和/或其组合以及其指标来表示例如指示细胞数、增殖和/或持续性的接触。与特定样品，例如血液或血清中的核酸或DNA的总量相比，可以使用已知的方法例如qPCR来评估这样的结果，以检测编码嵌合抗原受体的核酸的拷贝数，和/或通常使用对受体特异性的抗体来检测表达受体的细胞的流式细胞术测定法。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，例如能够结合和/或中和和/或诱导针对疾病或病症或表达被受体识别的抗原的细胞的应答(例如，细胞毒性应答)。
在一些方面，受试者对细胞的增加的暴露包括增加细胞的增殖。在一些实施方式中，在给予首剂量和/或给予后续剂量后，受体-(例如CAR-)表达细胞在受试者中增殖。在一些方面，与其他方法，例如涉及以单一剂量给予细胞，给予较大的首剂量，给予后续剂量而不给予首剂量的那些方法，和/或在指定的时间窗或时间点之前或之后给予后续剂量，使得例如在给予后续剂量之前产生免疫应答的方法相比，该方法导致更大的细胞增殖。
在一些方面，该方法导致所给予的细胞的高体内增殖，例如通过流式细胞术测量。在一些方面，检测到高峰比例的细胞。例如，在一些实施方式中，在首次或后续给药之后，在受试者的血液或疾病部位或其白细胞部分(例如PBMC部分或T细胞部分)中处于峰值或最大水平时，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％的细胞表达嵌合抗原受体，例如CAR。
在一些实施方式中，该方法导致在受试者的血液或血清或其他体液或器官或组织中至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、1500、2000、5000、10000或15000个拷贝的或编码受体的核酸的最大浓度，例如每微克DNA的CAR，或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的受体表达，例如CAR表达的细胞/外周血单个核细胞(PBMC)总数、单核细胞总数、T细胞总数或总微升数。在一些实施方式中，表达受体的细胞被检测为受试者血液中总PBMC的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，和/或在该水平在首次给药或后续给药后持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、或52周，或者这种给药后持续1、2、3、4或5年或更多年。
在一些方面，该方法导致例如，在受试者的血清中编码嵌合抗原受体，例如CAR的核酸的拷贝每微克DNA增加至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍。
在一些实施方式中，表达受体的细胞可在受试者的血液或血清中检测到，例如通过指定的方法，例如qPCR或基于流式细胞术的检测方法，给予首剂量后或在给予后续剂量后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60或更多天，或者在给予首剂量或后续剂量之后持续至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或更多周。
在一些方面，至少约1×10 2，至少约1×10 3，至少约1×10 4，至少约1×10 5，或至少约1×10 6或至少约5×10 6或至少约1×10 7或至少约5×10 7或至少约1×10 8或至少约2.5×10 8嵌合抗原受体-表达，例如CAR-表达细胞，和/或每微升至少10、25、50、100、200、300、400、或500、或1000个受体表达-细胞，例如每微升至少10个，可检测或存在于受试者或其流体、组织或其隔室中，例如在血液中，例如外周血或其疾病部位。在一些实施方式中，在给予首剂量后或给予后续剂量后，细胞数量或浓度在受试者中可检测持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约40天、或至少约60天、或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年。这样的细胞数可以通过基于流式细胞术或基于定量PCR的方法检测，并使用已知方法外推至总细胞数。
在一些方面，通过免疫组织化学、PCR和/或流式细胞术测量，每100个细胞中 编码嵌合抗原受体的核酸的拷贝数，例如载体拷贝数，例如在外周血或骨髓或其他隔室中，为至少0.01、至少0.1、至少1、或至少10，在给予细胞，例如，在首剂量或后续剂量后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、或至少约6周，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少2或3年时。在一些实施方式中，每微克基因组DNA中表达受体，例如，CAR的载体的拷贝数，在给予首剂量或后续剂量的受体表达，例如，CAR表达细胞后约1周、约2周、约3周或至少约4周时，或这种给药后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月，或至少2或3年时，为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、至少1000、至少5000、或至少10000、或至少15000、或至少20000。
在一些方面，由细胞表达的受体，例如CAR，可以通过定量PCR(qPCR)或通过流式细胞术检测在受试者，其血液和/或其疾病部位中检测的，在给予细胞后，例如在开始给予首剂量或后续剂量或后续后续剂量后至少约3天、至少约6天、至少约10天、至少约15天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天、至少约60天、至少约80天、3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年或超过3年时。
由细胞表达的嵌合抗原受体
细胞通常表达嵌合抗原受体，包括抗原受体，例如功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)和其它抗原结合受体如转基因T细胞受体(TCR)、T细胞融合蛋白(T cell fusionprotein，TFP)和T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)。
示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，包括例如在中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、国际专利申请公开号WO2018006882A1、WO2015172339A8中所述的那些。
所述嵌合受体包括嵌合抗原受体(CAR)。嵌合受体，例如CAR通常包括细胞外抗原结合结构域，例如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。在一些实施方式中，所述嵌合受体能识别密蛋白18(Claudin 18，CLD18)的剪接变体1(CLD18A1、CLD18.1)(登记号NP_057453、NM016369)或其变体，例如包含示于SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 34显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列，以及能识别剪接变体2(CLD18A2、CLD18.2)(登记号NM_001002026、NP_001002026)或其变体，例如包含表于SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:33显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述嵌合受体特异性识别CLD18A2，而不识别CLD18A1。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分包括scFv抗体片段，例如包含示于SEQ ID NO:1或2或3或4或5或6或7的HCDR或LCDR氨基酸序列或其变体，或与SEQ ID NO:1或2或3或4或5或6或7显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分包括scFv抗体片段，例如包含示于SEQ ID NO:8或9或10或11或12或13的HCDR或LCDR氨基酸序列或其变体，或与SEQ ID NO:8或9或10或11或12或13显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分包括scFv抗体片段，例如包含示于SEQ ID NO:8或9或10或11或12或13的HCDR或LCDR氨基酸序列或其变体，或与SEQ ID NO:8或9或10或11或12或13显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分包括scFv抗体片段，例如包含示于SEQ ID NO:14或15或16或17或18或19的重链或轻链可变区氨基酸序列或其变体，或与SEQ ID NO:14或15或16或17或18或19显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分包括scFv抗体片段，例如包含示于SEQ ID NO:20或21或22或23的重链或轻链可变区氨基酸序列或其变体，或与SEQ ID NO:20或21或22或23显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分包括scFv抗体片段，例如包含示于SEQ ID NO:20或21或22或23的重链或轻链可变区氨基酸序列或其变体，或与SEQ ID NO:20或21或22或23显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)，例如包含示于SEQ ID NO:24或25或26或27或28或29或30或31或32的氨基酸序列或其变体，或与SEQ ID NO:24或25或26或27或28或29或30或31或32显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分还包括连接序列，其可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或其修饰形式的至少一部分，例如铰链区，例如，IgG4铰链区和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方式中，所述恒定区或部分是人IgG的，例如IgG4或IgG1的。在一些方面中，恒定区的部分作为抗原-识别部分，例如，scFv，和跨膜结构域之间的连接序列。所述连接序列可具有这样的长度，相较于该连接序列不存在的情况，该长度在抗原结合之后提供增加细胞响应性。在一些实例中，连接序列长度为或约为12个氨基酸或长度不超过12个氨基酸。示例性的连接序列包括具有如下长度的那些：至少约10-229个氨基酸、约10-200个氨基酸、约10-175个氨基酸、约10-150个氨基酸、约10-125个氨基酸、约10-100个氨基酸、约10-75个氨基酸、约10-50个氨基酸、约10-40个氨基酸、约10-30个氨基酸、约10-20个氨基酸或约10-15个氨基酸，并且包括上述所列范围的任何端点之间的整数。在一些实施方式中，连接序列区具有约12个氨基酸或更短，约119个氨基酸或更短或约229个氨基酸或更短。示例性的连接序列包括单独IgG4铰链，连接至CH2和CH3结构域的IgG4铰链或连接至CH3结构域的IgG4铰链。
该抗原识别结构域一般连接至一个或多个胞内信号转导部分，例如在CAR的情况中，通过抗原受体复合物(例如TCR复合物)模拟活化的信号转导部分，和/或通过另一细胞表面受体的信号。因此，在一些实施方式中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号转导结构域连接。在一些实施方式中，所述跨膜结构域融合至所述胞外结构域。在一个实施方式中，使用天然关联受体(例如CAR)中的结构域之一的跨膜结构域。在一些情况中，所述跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免所述结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，在一些方面中，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD 16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD 154，和/或跨膜区包含其功能变体(例如基本保留其结构部分(例如，跨膜结构部分)、性质的那些)的那些(即包含至少它们的跨膜区域)。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是源自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，例如，CD8α或其功能变体。或者，在一些实施方式中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面中，所述合成跨膜结构域主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三聚体将出现在合成的跨膜结构域的各末端。在一些实施方式中，所述连接通过接头、间隔物和/或跨膜结构域发生。
所述胞内信号转导结构域包括模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体联合共刺激受体的信号，和/或通过单独共刺激受体的信号的那些。在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽接头，例如，长度为2-10个氨基酸的接头，例如包含甘氨酸和丝氨酸，例如，甘氨酸-丝氨酸双联体的接头，并在CAR的胞质信号转导结构域和跨膜结构域之间形成连接。
所述受体，例如，CAR，一般包括至少一种的一个或多个胞内信号转导部分。在一些实施方式中，所述受体包括TCR复合物的胞内组分，例如介导T-细胞活化和细胞毒性的TCRCD3+链，例如，CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接到一个或多个细胞信号转导模块。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号转导结构域，和/或其它CD跨膜结构域。在一些实施方式中，所述受体，例如，CAR，还包括一种或多种其它分子的部分，例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面，CAR或其它嵌合受体包括CD3ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方式中，在CAR或其它嵌合受体结合时，受体的细胞质结构域或细胞内信号转导结构域激活免疫细胞的正常效应功能或应答中的至少一种，例如经工程改造以表达CAR的T细胞。例如，在一些情况中，CAR诱导T细胞的功能，例如溶细胞活性或辅助性T细胞活性，例如细胞因子或其它因子的分泌。在一些实施方式中，采用抗原受体部分或共刺激分子的胞内信号转导结构域的截短部分来替代完整免疫刺激链，例如，如果其转导效应物功能信号的话。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面，还包括天然情况下存在的共受体的那些与这些受体一致作用以在抗原受体接合后启动信 号转导。
在天然TCR的情况中，完全活化一般不仅需要通过TCR的信号转导，而且需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，用于产生第二或共刺激信号的组分也包括在所述CAR中。在其他实施方式中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面中，其他CAR在同一细胞中表达并且提供用于生成第二或共刺激信号的组分。
在一些方面中，T细胞活化描述为通过两类胞质信号转导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性首活化的那些(首胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号转导序列)。在一些方面中，所述CAR包括此类信号转导组分之一或两者。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体(例如CAR)的抗体部分还包括信号肽，例如包括CD8或其变体的信号肽，例如包含示于SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些方面中，所述CAR包括主要胞质信号转导序列，其调节TCR复合物的初始活化。以刺激方式作用的首胞质信号转导序列可包含信号转导基序，其已知是免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM。ITAM的实例包括首胞质信号转导序列，其包括源自如下的那些：TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CDS，CD22，CD79a，CD79b，和CD66d。在一些实施方式中，CAR中的胞质信号转导分子包含胞质信号转导结构域，其部分或源自CD3ζ的序列。
在一些实施方式中，所述CAR包括共刺激受体的跨膜部分和/或信号转导结构域，例如CD28，CD137，OX40，DAP10，和ICOS。在一些方面中，同一CAR同时包括活化和共刺激部分。
在一些实施方式中，激活结构域包括在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一CAR提供。在一些实施方式中，所述CAR包括活化或刺激CAR、共刺激CAR，其均表达在同一细胞上(参见WO2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或活化CAR和/或共刺激C A R。在一些实施方式中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，例如识别除了与疾病或病症相关和/或特异性的CAR，由此通过所述疾病靶向CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其配体结合而减少或抑制，例如减少脱靶效应。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的胞内信号转导部分，例如CAR，包含CD3ζ胞内结构域和共刺激信号转导区。在某些实施方式中，所述胞内信号转导 结构域包含CD28跨膜和信号转导结构域，其连接至CD3(例如，CD3-ζ)胞内结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含嵌合CD28和/或CD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激结构域，其连接至CD3ζ胞内结构域。
在一些实施方式中，所述CAR涵盖一个或多个，例如，两个或更多个，共刺激结构域和活化结构域，例如，胞质部分中的初始活化结构域。示例性的CAR包括CD3-ζ、CD28和CD137的胞内部分。
在一些情况中，CAR被称为第一、第二和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这样的信号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(例如CD28或CD137)的细胞内信号转导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的胞外部分和细胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，所述抗体或片段包括scFv，且所述胞内结构域包含ITAM。在一些方面中，所述胞内信号转导结构域包括CD3-ζ链的ζ链的信号转导结构域。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括跨膜结构域，其连接胞外结构域和胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。在一些实施方式中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。胞外结构域和跨膜结构域可直接或间接相连。在一些实施方式中，所述胞外结构域和跨膜通过连接序列。在一些实施方式中，所述受体包含作为跨膜结构域的衍生来源的分子的胞外部分，例如CD28胞外部分。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含源自T细胞共刺激分子或其功能变体的胞内结构域，例如在跨膜结构域和胞内信号转导结构域之间。在一些方面中，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。例如，在一些实施方式中，CAR含有抗体，例如抗体片段，是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有CD28的信号转导部分或功能性变体的细胞内信号转导结构域，和CD3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些实施方式中，CAR含有抗体，例如抗体片段，是包含或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有CD137的信号转导部分或功能变体的细胞内信号转导结构域，以及CD3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些所述实施方式中，所述受体还包括连接序列，其包含Ig分子(例如人Ig分子)的部分，例如Ig铰链，例如IgG4铰链，例如仅铰链连接序列。在一些实施方式中，所述的嵌合抗原受体具有：(i)特异性识别肿瘤抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或(ii)特异 性识别肿瘤抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ；或(iii)特异性识别肿瘤抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包括人CD28(例如登录号P01747.1)或其变体的跨膜结构域，例如包含示于SEQ ID NO:39的氨基酸序列的跨膜结构域，或与SEQ ID NO:39显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包括人CD8或其变体的跨膜结构域，例如包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列的跨膜结构域，或与SEQ ID NO:45显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体(例如CAR)的胞内信号转导部分包含人CD28或其功能变体或部分的胞内共刺激信号转导结构域。例如，胞内信号转导结构域可包含示于SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:41显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述胞内结构域包含CD137(例如(登录号Q07011.1)或功能变体或其部分的胞内共刺激信号转导结构域，例如示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:47显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体(例如CAR)的胞内信号转导结构域包含人CD3ζ刺激信号转导结构域或其功能变体。例如，在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:43有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列相同性的氨基酸序列。
在一些方面中，所述嵌合抗原受体包含铰链,如CD8铰链。例如，在一些实施方案中，CD8铰链包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:37有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列相同性的氨基酸序列。
例如，在一些实施方式中，CAR包括抗体，例如抗体片段，包括scFv，连接序列，例如含有免疫球蛋白分子的一部分的连接序列，例如铰链区和/或一个或多个重链分子恒定区，例如含有Ig-铰链的连接序列，含有全部或部分CD28衍生的跨膜结构域的跨膜结构域，CD28衍生的细胞内信号结构域和CD3ζ信号转导结构域。在一些实施方式中，CAR包括抗体或片段，例如scFv，连接序列，例如任何含有Ig-铰链的连接序列，CD28衍生的跨膜结构域，CD137衍生的细胞内信号转导结构域和CD3ζ衍生信号转导结构域。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。包括提供的受体和其他多肽(例如接头或肽)的多肽可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面中，所述多肽可包含对原始或天然序列进行的修饰，只要该蛋白质保留所需活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变或者可以是意外的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或PCR扩增所致的误差。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括向所述受试者给予一种过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，本文所述的方法包括在不同的疗程中向所述受试者给予针对相同的肿瘤抗原的两种或者更多种过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，本文所述的方法包括在不同的疗程中向所述受试者给予针对不同的肿瘤抗原的两种或者更多种过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，本文所述的方法包括在不同的疗程中向所述受试者给予针对相同的肿瘤抗原的相同表位的两种或者更多种过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，本文所述的方法包括在不同的疗程中向所述受试者给予针对相同的肿瘤抗原的不同表位的两种或者更多种过继细胞或者免疫效应细胞。在一些实施方式中，本文所述的方法包括在不同的疗程中向所述受试者给予两种或者更多种过继细胞或者免疫效应细胞以治疗相同部位的肿瘤。在一些实施方式中，本文所述的方法包括在不同的疗程中向所述受试者给予两种或者更多种过继细胞或者免疫效应细胞以治疗不同部位的肿瘤。在一些实施方式中，本文所述的方法所采用的过继细胞或者免疫效应细胞中的至少一种是靶向CLD18A2的CAR-T细胞。在一些实施方式中，本文所述的方法所采用的过继细胞或者免疫效应细胞中的至少一种是本文所述的靶向CLD18A2的CAR-T细胞。
由以各种剂量给予受试者的细胞表达的嵌合抗原受体(例如CAR)通常识别或特异性结合被治疗的疾病或病症或细胞所表达的、与之相关的和/或特异性的分子。 在特异性结合分子例如抗原时，受体通常将免疫刺激信号(例如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方式中，首剂量中的细胞表达特异性结合由疾病或病症的细胞或组织表达的抗原或与疾病或病症相关的抗原的CAR。
以后续剂量由细胞表达的受体(例如CAR)通常特异性结合与首剂量的CAR相同的抗原，并且通常是与首剂量的细胞的受体相同的受体或极端相似的受体。在一些实施方式中，后续剂量的细胞上的受体与首剂量的细胞中的受体相同或者与该受体有大的相同性。
在一些实施方式中，由后续剂量的细胞表达的CAR包含与由首剂量的细胞表达的CAR相同的scFv，相同的信号转导结构域和/或相同的连接。在一些实施方式中，其还包含与首剂量相同的共刺激、刺激、跨膜和/或其它结构域。在一些实施方式中，后续剂量的CAR的一种或多种组分不同于首剂量的CAR。
免疫效应细胞
在本发明中，表达嵌合受体并通过本文所述的方法提供的细胞是免疫效应细胞。所述细胞一般是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方式中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其他示例性的细胞包括干细胞，如专能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。细胞一般是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位，和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或隔室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况，和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体和/或自体的。方法包括现成的方法。在一些方面中，如对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，如干细胞，如诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，该方法包括从受试者分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，并且在冷冻保存前或后将其再导入同一患者。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括：原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)、中心记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、或最终分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不 成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MAIT)细胞、天然产生的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞，和δ/γT细胞。
在一些实施方式中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方式中，所述细胞包括通过遗传工程改造导入的一种或多种核酸，并由此表达所述核酸的重组或经遗传工程改造的产物。在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，如从另一个生物体或细胞获得的样品，其例如通常不在工程改造中的细胞和/或这类细胞来源的生物体中发现。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如核酸不是自然中发现的，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。
用于遗传工程改造的方法和载体
本发明还提供了用于产生表达嵌合抗原受体的遗传工程改造的细胞的方法、组合物和试剂盒。遗传工程改造一般涉及将编码所述重组或经工程改造的部分的核酸导入细胞，例如，通过逆转录病毒转导、转染或转化进行。
在一些实施方式中，基因转移通过如下方式进行：首先，刺激细胞，例如，通过将其与刺激物合并，所述刺激物诱导响应，例如增殖、存活和/或活化，例如，通过细胞因子或活化标志物的表达来检测，然后转导该活化的细胞，并且在培养物中扩增至足以供于临床应用的数量。
在一些情况中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对受试者具有毒性。因此，在一些情况中，工程改造的细胞包括，例如在免疫效应治疗中给予之后，使细胞对体内负选择易感的基因区段。例如在一些方面中，所述细胞经工程改造，从而它们可因它们所给予的受试者的体内状况的变化而被消除。可负选择的表型可通过将提供对给予的试剂(例如，化合物)的敏感性的基因来产生。可负选择的基因包括：单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等，Cell II:223，I977)，其提供更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些方面中，细胞还经工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。用于 引入遗传工程改造的组分，例如，抗原受体(例如，CAR)的各种方法是熟知的，并可采用本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒，例如，逆转录病毒或慢病毒，转导，转座子，和电穿孔。
在一些实施方式中，采用重组感染性病毒颗粒将重组核酸转移进入细胞，例如，源自猿病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体。在一些实施方式中，采用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Koste等，(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等，(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等，(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等，Trends Biotechnol.2011年11月；29(11):550–557)。
在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)，骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，鼠胚胎干细胞病毒(MESV)，鼠干细胞病毒(MSCV)，脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，所述逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染数种物种(包括人类)的宿主细胞。慢病毒转导方法是已知的。示例性方法描述于，例如，Wang等，(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等，(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等，(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等，(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方式中，通过电穿孔将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Chicaybam等，(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等，(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，通过转位将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Manuri等，(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等，(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等，(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(Current Protocols inMolecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston，Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是描述于，例如，国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190的那些。
用于引入的其他核酸(例如基因)包括用以例如通过促进转移的细胞的活力和/ 或功能改善治疗功效的那些；用以提供遗传标志物以供选择和/或评价细胞的基因，例如以评估体内存活或定位；用以改善安全性的基因，例如，通过使细胞对体内负选择易感，如Lupton S.D.等，Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等，Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所述；也参见Lupton的公开号PCT/US91/08442和PCT/US94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因的应用。参见例如Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。
免疫效应细胞的制备
在一些实施方式中，经工程改造的细胞的制备包括一种或多种培养和/或一个或多个制备步骤。用于导入编码转基因受体(例如，CAR)的核酸的细胞可从样品(例如生物样品，例如获自或源自受试者的样品)分离。在一些实施方式中，从中分离细胞的受试者是患有一定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的受试者。在一些实施方式中，受试者是需要特定治疗性介入的人，例如，需要过继细胞疗法或效应效应细胞疗法的人，用于该疗法的细胞是经分离、加工和/或经工程改造的。在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自受试者的组织、体液和其它样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、遗传工程改造(例如采用病毒载体的转导)、清洗和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。
在一些方面中，从中衍生或分离细胞的样品是血液或血液源性的样品或者，是或源自单采或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(例如，过继细胞治疗或免疫效应细胞治疗)的情况中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类，和猪。
在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种物质的存在下经清洗、离心和/或 孵育，例如，以移除不需要的组分，富集所需组分，裂解或移除对具体物质敏感的细胞。在一些实例中，细胞基于一种或多种性质，例如密度、粘附性质、尺寸、对具体组分的敏感性和/或抗性被分离。在一些实例中，例如，通过单采或白细胞去除术，获得来自受试者循环血液的细胞。在一些方面中，所述样品包括淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、血红细胞，和/或血小板，和，在一些方面中包括与血红细胞和血小板不同的细胞。
在一些实施方式中，从所述受试者收集的血液细胞经清洗，例如，以移除血浆部分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在一些实施方式中，清洗溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过半自动化的“流通”离心法(例如，COBE 2991细胞处理器，百特公司(BaXter))完成。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过内切流过滤(TFF)完成。在一些实施方式中，在清洗后，所述细胞在多种生物相容缓冲液中重悬，例如，无Ca++/Mg++PBS。在某些实施方式中，移除血液细胞样品组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方式中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如，通过裂解血红细胞或者不裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心外周血或者单采样品或白细胞去除术样品制备获得外周血单个核细胞(PBMC)。
在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如，表面蛋白质、胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用基于此类标志物进行分离的任何已知方法。在一些实施方式中，所述分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，在一些方面中，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合至此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，和从尚未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离已结合所述抗体或结合伴侣的细胞。
此类分离步骤可基于正选择，其中已结合所述试剂的细胞被保留用于进一步应用，和/或，负选择，其中尚未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞被保留。在一些实例中，两种部分均保留用于进一步应用。在一些方面中，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，从而分离最好基于通过与所需群不同的细胞表达的标志物进行。
所述分离不需导致具体细胞群或表达具体标志物的细胞的100％的富集或移 除。例如，正选择或富集具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，增加所述细胞的数量或百分数，但不需要导致不表达所述标志物的细胞完全不存在。同样地，负选择、移除或消耗具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，减少所述细胞的数量或百分数，但不需要导致所有此类细胞的完全移除。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的部分进行另一分离步骤，例如后续正或负选择。在一些实例中，单一分离步骤同时消耗表达多重标志物的细胞，例如通过孵育使细胞与各自对负选择靶向的标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣孵育。同样地，可通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣孵育来对多重细胞类型进行同时正选择。
例如，在一些方面中，T细胞的特定亚群，例如一种或多种表面标志物阳性细胞或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，例如，CD3+、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞，通过正或负选择技术分离。
例如，CD3+、CD28+T细胞可以采用CD3/CD28连接的磁珠(例如，DYNA珠M-450CD3/CD28T细胞扩增器)来正选择。
在一些实施方式中，分离通过如下方式进行：通过正选择富集具体细胞群或通过负选择消耗具体细胞群。在一些实施方式中，正或负选择通过将细胞与特异性地结合至一种或多种表面标志物的一种或多种抗体或其它结合试剂孵育来完成，所述一种或多种表面标志物分别在正选择或负选择的细胞上表达(标志物+)或以相对较高水平表达(标志物高)。
在一些实施方式中，T细胞通过对在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(例如CD14)进行负选择来从PBMC样品分离分离。在一些方面中，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离辅助性CD4+和CD8+细胞毒性T细胞。通过针对一种或多种原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标志物进行正或负选择，可将此类CD4+和CD8+群进一步分选成亚群。
在一些实施方式中，CD8+细胞针对原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞进行进一步富集或消耗，例如通过基于与对应亚群相关联的表面抗原进行正或负选择。在一些实施方式中，进行针对中心记忆T(TCM)细胞的富集，以增加功效，例如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，在一些方面中，其在此类亚群中特别强健。参见Terakura等，(2012)Blood.1:72–82；Wang等，(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方式中，将TCM-富集的CD8+T细胞与CD4+T细胞合并以进一步增强功效。
在实施方式中，记忆T细胞在CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚组中存在。PBMC可以针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分进行富集或消耗，例如采用抗CD8和抗CD62L抗体。
在一些实施方式中，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、和/或CD127阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于CD45RA和/或粒酶B表达或高度表达的细胞进行负选择。在一些方面中，针对TCM细胞富集的CD8+群的分离通过如下方式进行：消耗表达CD4、CD14、CD45RA的细胞，和正选择或针对表达CD62L的细胞进行富集。一方面，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集通过如下方式进行：由基于CD4表达选择的细胞的阴性部分起始，其基于CD14和CD45RA的表达进行负选择，和基于CD62L进行正选择。在一些方面中，此类选择同时进行，且在其它方面中，此类选择以某一顺序依次进行。在一些方面中，相同的基于CD4表达的选择步骤用于制备CD8+细胞群或亚群，也用以产生CD4+细胞群或亚群，从而保留来自基于CD4分离的阳性和阴性部分，并任选地在一种或多种进一步正或负选择步骤之后，用于所述方法的后续步骤。
在具体实例中，对PBMC样品或其它血液白细胞样品进行CD4+细胞选择，其中保留阴性和阳性部分。然后，基于CD14和CD45RA或CD19的表达对阴性部分进行负选择，并基于中心记忆T细胞特征性标志物，例如CD62L或CCR7、进行正选择，其中，所述正和负选择以某一顺序进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助性CD4+T细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方式中，中心记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个实例中，为了通过负选择对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR，和CD8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质，例如磁珠或顺磁珠，以允许分离用于正和/或负选择的细胞。
在一些实施方式中，制备方法包括：冷冻步骤，例如，在分离、孵育和/或工程改造之前或之后，冻存所述细胞。在一些实施方式中，所述冷冻和后续融化步骤移除粒细胞，并且，在某种程度上，移除细胞群中的单核细胞。在一些实施方式中，例如，在清洗步骤以移除血浆和血小板之后，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面中，可采用任何各种已知冷冻溶液和参数。一个实例涉及采用包含20％ DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS或其它合适的细胞冷冻培养基。然后，其用培养基1:1稀释，从而DMSO和HSA的终浓度分别是10％和4％。然后，一般以程控降温装置按照既定的程序或者原理如1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃或者-90℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。
在一些实施方式中，提供的方法包括培育、孵育、培养，和/或遗传工程改造步骤。例如，在一些实施方式中，提供了用于对消耗的细胞群和培养起始组合物进行孵育和/或工程改造的方法。
在一些实施方式中，所述细胞群在培养起始组合物中孵育。可在培养器皿，如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其它容器中进行孵育和/或工程改造。
在一些实施方式中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、活化，和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激性试剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成在群中诱导细胞增殖、繁殖、活化，和/或存活以模拟抗原接触，和/或引发细胞用于遗传工程改造，如用于导入重组抗原受体的那些。
所述条件可包括如下一种或多种：具体培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和经设计可以维持活化细胞状态的任何其他物质。
在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种物质，例如，配体，其能够活化TCR复合物的胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述物质开启或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号转导级联反应。此类物质可包括抗体，例如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如，抗CD3、抗CD28，例如，其结合至固体支持物，例如珠，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体。在一些实施方式中，刺激剂包括1L-2和/或IL-15和/或IL-7和/或IL-21，例如，至少约10单位/mL浓度的IL-2。
在一些方面中，孵育按照一些技术，例如授予Riddell等的美国专利号6,040,177，Klebanoff等，(2012)J Immunother.35(9):651-660,Terakura等，(2012)Blood.1:72-82和/或Wang等，(2012)J Immunother.35(9):689-701中所述的那些进行。
在一些实施方式中，T细胞群通过如下方式扩增：添加至培养起始组合物饲养 层细胞，例如非分裂型外周血单核细胞(PBMC)，(例如，从而针对待扩增的初始群中的各T淋巴细胞，所得细胞群包含至少约5、10、20或40或更多PBMC饲养层细胞)；并孵育所述培养物(例如足以扩增所述数量的T细胞的时间)。在一些方面中，所述非分裂型饲养层细胞可包括γ射线辐照的PBMC饲养层细胞。在一些实施方式中，所述PBMC用约3000-3600拉德范围内的γ射线辐照以防止细胞分裂。在一些方面中，所述饲养层细胞在添加T细胞的群之前添加至培养基。
在一些实施方式中，所述刺激条件包括适于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。任选地，孵育还可包括添加非分裂型EBV-转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养层细胞。LCL可以用约6000-10000拉德范围内的γ射线辐照。在一些方面中，LCL饲养层细胞以任何合适的量提供，例如LCL饲养层细胞与初始T淋巴细胞的比率是至少约10:1。
在某实施方式中，通过用抗原刺激天然或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，抗原特异性T细胞系或克隆可针对巨细胞病毒抗原产生，通过从感染的受试者分离T细胞并采用相同抗原体外刺激细胞来进行。
组合物和制剂
本发明还提供了用于本发明方法的药物组合物和制剂。在一些实施方式中，本发明的药物组合物和制剂包括用于给药的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，如来自包含给定剂量或其部分的用于给药的细胞数量的单位剂型组合物。所述药物组合物和制剂一般包括一种或多种任选的药学上可接受的运载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述组合物包括至少一种其它治疗剂。
术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含具有待给予该制剂的受试者不可接受的毒性的额外成分。
“药学上可接受的运载体”指，药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对于受试者无毒性。药学上可接受的运载体包括但是不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面中，运载体的选择部分由特定细胞和/或给药方法来确定。因此，存在多种合适的配方。例如，所述药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》 (Remington's Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol,A.编(1980)。在所用剂量和浓度下，药学上可接受的运载体通常是对受者无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面中，所述组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在一些方面中，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如，《雷明顿：药物科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，LWW公司(Lippincott Williams&Wilkins)；第21版(2005年5月1日)。
该制剂可包含水溶液。所述制剂或组合物还可包含多于一种活性成分，该活性成分可用于待用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选对所述细胞具有补充活性的那些，其中相应活性剂彼此不产生负面影响。这类活性成分适合以有效用于所需目的用量联合存在。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，和/或长春新碱。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量，如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的受试者来监测治疗或预防性功效。所需剂量可以通过单药丸给予所述细胞，通过多药丸给予所述细胞或通过连续输注给予细胞来递送。
在一些实施方式中，该组合物包含有效降低疾病或病症负荷的量，和/或在受试者中不导致CRS或严重CRS的量和/或实现本文所述的方法的任何其他结果的量的细胞。
该细胞和组合物可采用标准给予技术、制剂和/或装置给予。所述细胞的给予 可以是自体同源或异源的。例如，免疫抑制细胞或祖细胞可获自一个受试者，并给予相同受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫抑制细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射、或胃肠外给药。当给予治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫抑制细胞的药物组合物)时，其通常被配制成单位剂型的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。本文所用的术语“胃肠外”，包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞通过静脉内，腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予受试者。
在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如，等渗水性溶液、悬液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面中可缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物多少更便于给药，尤其是通过注射。在另一方面，粘性组合物可在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物。可通过将所述细胞纳入溶剂中，如与合适运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等来制备无菌可注射溶液。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、和/或色素，取决于所需的给药和制备途径。在一些方面中，可查阅标准教科书来制备合适制备物。
可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、和山梨酸确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质，如单硬脂酸铝和明胶演唱可注射药物形式的吸收。
用于体内给药的制剂一般为无菌的。无菌可例如通过无菌滤膜过滤来容易地实现。
制品
本发明还提供了制品，如试剂盒和装置，用于按照提供的用于过继细胞治疗 或免疫效应细胞治疗的方法向受试者给予细胞，并用于储存和给予该细胞和组合物。
制品包括一个或多个容器，一般是多个容器，包装材料，和与一个或多个容器和/或包装结合或其上的标签或包装插页，一般包括向受试者给予细胞的说明。
容器一般含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。制品一般包括多个容器，各自含有单个单位剂量的细胞。单位剂量可以是以首剂量的待给予受试者的细胞的量或数量或两倍(或更多)于待以首或后续剂量给予的细胞的数量。其可以是与给药方法相关的给予受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。在一些实施方式中，单位剂量是将按照本发明的方法以单位剂量给予具有特定疾病或病症的任何受试者或任何受试者的细胞数量或细胞最小数量。例如，在一些方面，单位剂量可包括将给予较低体重和/或较低疾病负荷的受试者的细胞的最小量，如以首剂量向给定受试者给予一个或在一些情况中超过一个单位剂量并且在一个或多个后续剂量中向给定受试者给予一个或超过一个单位剂量，例如，按照提供的方法。在一些实施方式中，单位剂量中的细胞数是需要以首剂量给予特定受试者，如细胞衍生的受试者的嵌合抗原受体-表达或CAR-表达的数量或细胞数。在一些实施方式中，细胞衍生自待通过本文提供的方法治疗或有此需要的受试者。
在一些实施方式中，各容器单独包含单位剂量的细胞，例如，包括相同或基本相同数量的细胞。因此，在一些实施方式中，各容器包含相同或大约或基本相同数量的细胞或嵌合抗原受体-表达细胞。在一些实施方式中，单位剂量包括小于约1x10 10、小于约1x10 9、小于约1x10 8或小于约1x10 7个工程改造的细胞、总细胞、T细胞或PBMC/千克待治疗和/或细胞衍生的受试者。
合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、和柔性袋如冷冻袋。在特定实施方式中，容器是袋，例如，柔性袋，如适于向受试者输注细胞的那些，例如，柔性塑料或PVC袋或者EVA或者ULPDE，和/或IV溶液袋。在一些实施方式中，袋是可密封和/或能够灭菌的，以提供无菌溶液以及细胞和组合物的递送。在一些实施方式中，容器，例如，袋的容积等于或约或至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、或1000ml容积，如等于或约10至等于或约100mL或者等于或约10至等于或约500mL容积。在一些实施方式中，容器，例如，袋是和/或由在一个或多个不同温度下稳定和/或提供细胞的稳定储存和/或维持的材料制成，如在低温下，例如，低于或约或等于或约-20℃、-80℃、-120℃、135℃、-196℃和/或适于冷冻保存的温度，和/或其他温度，如适于冻融细胞的温度和体温，如等于或约37℃或-38℃、或-39℃、或-40℃，以允许在治疗前立即冻融，例如，在受 试者的地点或治疗地点，例如，在床边。
该容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。在一些实施方式中，容器具有一个或多个端口，例如，无菌浸入端口，例如，用于通过管或导管连接至一个或多个管，例如，用于静脉内或其他输注和/或用于出于从其他容器和向其他容器转移的目的连接，如细胞培养和/或储存袋或其他容器。示例性的容器包括冷冻袋、静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可通过注射用针头穿破的塞盖的那些。
制品还可包括包装插页或标签，其一片或多片显示使用信息和/或说明。在一些实施方式中，信息或说明显示可以或应该用于治疗特定疾病或病症的内容，和/或提供其说明。标签或包装插页可显示待用于治疗疾病或病症的制品的内容。在一些实施方式中，标签或包装插页提供了治疗受试者的说明，例如，细胞已衍生的受试者，通过包括给予首和一个或多个后续剂量的细胞，例如，按照提供的方法的实施方式中的任一个的方法。在一些实施方式中，说明指定了在首剂量中，给予一个单位剂量，例如，制品的单个单独容器的内容物，之后在指定时间点或指定时间窗内和/或检测到受试者中的一个或多个因子或结果的存在或缺失或量或程度之后给予一个或多个后续剂量。
在一些实施方式中，说明指定了通过进行首次给药和连续给药向受试者给予多个单位剂量。在一些实施方式中，首次给药包括向受试者递送所述单位剂量之一并且后续给药包括向受试者给予所述单位剂量中的一个或多个。
在一些实施方式中，说明指定了待在首次给药后，例如在首次给药或在先给药开始后约21天至约80天或约25天至约60天，例如，等于或约50天的时间上进行的后续给药。在一些实施方式中，说明指定后续剂量将在确定受试者中指示细胞因子释放综合征(CRS)的因子的血清水平比所述首次给予之前即刻的所述受试者的指示物的血清水平低约10倍、低约25倍、和/或低约50倍，和/或CRS的指标已经达到峰值并且正在下降，和/或所述受试者不表现出对由细胞表达的受体(例如CAR)特异的可检测的适应性宿主免疫应答之后给予。
在一些实施方式中，标签或包装插页或包装包含标识符，以指示从其衍生细胞的受试者和/或将待给予的受试者的身份。在自体移植的情况下，细胞衍生自的受试者的身份与待给予细胞的受试者的身份相同。因此，识别信息可以指定将细胞给予特定患者，例如细胞原始来源的细胞。这样的信息可以以条形码或其他编码标识符的形式存在于包装材料和/或标签中，或者可以指示受试者的姓名和/或其他识别特征。
在一些实施方式中，制品包括一个或多个，通常为含有包含细胞的组合物的 多个容器，例如其单独的单位剂量形式，并且还包括其中包含组合物的一个或多个其他容器，其该组合物包含其他试剂，例如细胞毒性或其它治疗剂，其例如将与细胞组合，例如，同时或以任何顺序一次给予。或者或此外，所述制品还可包括包含药学上可接受的缓冲剂的另一或相同容器。其还可包括其它材料，例如其它缓冲剂、稀释剂、滤器、管、针头，和/或注射器。
术语“包装插页”指治疗性产品的商品包装中常包括的说明书，所述说明书包含关于这类治疗性产品使用的说明、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
用首剂量和后续剂量的表达CAR的自体同源T细胞治疗癌症患者
本发明的方法可以总结为：
通过基于“去单个核细胞分离术”从患有癌症的人类受试者的外周血单个核细胞(PBMC)或者T细胞，并且用编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体培养和转导细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)特异性结合受试者中由癌症表达的抗原，其是肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。细胞在单独的柔性冷冻袋中的输注介质中冷冻保存，每个包含单个单位剂量的细胞，其为约1×10 6个细胞至5×10 7个细胞。每个受试者输注的首剂量不高于约1×10 12个细胞，优选地，不高于约1×10 11个细胞，更优选地，不高于约1×10 10个细胞或约5x10 9或约2x10 9。在输注之前，将细胞保持在约低于-130℃或约低于-175℃的温度下。
在开始细胞治疗之前，从受试者获得血液，并且任选地通过ELISA和/或MSD和/或CBA的方法评估血清中指示细胞因子释放综合征(CRS)的一种或多种血清因子的水平，例如肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、IL-10和IL-6。在治疗开始之前，可以通过例如通过PET或CT扫描测量实体肿瘤的大小或质量来任选地评估肿瘤负荷。
通过升温至约38℃进行复苏，并且受试者通过多次输注给予首剂量的细胞。每次输注为约3-30分钟时间内连续输注静脉内(IV)给予。
在给予首剂量后，受试者接受身体检查，并监测任何毒性或毒性结果的症状，例如发热、低血压、缺氧、神经障碍或炎性细胞因子或C反应蛋白(CRP)的血清水平升高。任选地，在给予首剂量后，在一次或多次的情况下，从患者获得血液，并通过ELISA和/或MSD和/或CBA的方法评估指示CRS的血清因子的水平。将血清因子的水平与刚好给予首剂量之前获得的血清因子的水平进行比较。如有必要，给予抗IL6或其他CRS治疗以减少CRS的症状。
在给予首剂量后，例如在给药开始后1、2、3和/或4周，任选地检测受试者中抗CAR免疫应答的存在或不存在，例如，通过qPCR、ELISA、ELISPOT、基于细胞的抗体测定和/或混合淋巴细胞反应。
通过首剂量实现的肿瘤负荷减少百分比可任选地在通过扫描(例如PET和CT扫描)在实体瘤患者中给予首剂量后一次或多次进行测量，和/或通过量化在血液或肿瘤部位疾病阳性细胞。
给予后续剂量。在一些受试者中，在开始给予首剂量后约80天内给予后续剂量，优选地，约60天，更优选地，约50天。在一些情况下，仅在经测试的CRS相关结果或血清因子水平低于可接受水平并且在首次给药后约60天在受试者中没有检测到抗CAR免疫应答时才给予后续剂量。在其他受试者中，在首剂量给予后超过30天的时间，并且将受试者视为不具有CRS或严重CRS，或者所有测试的指示CRS的血清因子的水平低于首剂量给药后在峰值时观察到的CRS的20％，并且认为受试者没有可检测到的抗-CAR免疫应答时给予后续剂量。在一些实施方式中，给予一个或多后续剂量的细胞。每次剂量给药时间间隔在21-80天，优选地，25-60天，更优选地，25-55天。
后续剂量的大小是患者特异性的，并且基于肿瘤负荷，抗CAR免疫应答的存在和CRS相关结果的水平。一些受试者被给予含有1、2、3或甚至更多单位剂量的细胞的后续剂量。每个受试者输注的后续剂量不高于约1×10 12个细胞，或不高于约1×10 11个细胞，或不高于约1×10 10个细胞，或不高于约5×10 9、或不高于约2×10 9。通过连续静脉输注在约3至30分钟内给予后续剂量。
从首剂开始并持续长达数年，定期监测受试者。在随访期间，测量肿瘤负荷、和/或通过流式细胞术和定量聚合酶链反应(qPCR)检测CAR-表达细胞，以测量所给予的细胞的体内增殖和持久性、和/或评估抗-CAR免疫应答的发展。
本发明的优点：
1.本发明显著提高利用表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞进行肿瘤治疗的疗效：肿瘤数量减少或体积缩小，和/或转移的数量和/或程度降低，和/或肿瘤标志物降低，和/或中晚期癌症常见的并发症的消失或减弱表示。
2.对实体瘤的抗肿瘤效果显著，提供了一种安全有效，能稳定甚至治愈CLA18A2阳性的中晚期消化道腺癌的治疗手段。
3.提供一种提高免疫效应细胞抗肿瘤治疗的预处理组合物，在给予免疫效应细胞之前给予氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇组合物，能显著促进免疫效 应细胞的抗肿瘤疗效，大幅降低患者的肿瘤负荷、提高患者的生活质量，以及延长生存期。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法：
材料：
本发明采用的各种材料，包括试剂均可自商业渠道购得。
本发明的示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，参考例如中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、国际专利申请公开号WO2018006882A1、WO2015172339A8中公开的全文内容。
本发明下述实施例中，嵌合抗原受体的scFv部分具有SEQ ID NO：14所示的重链可变区以及SEQ ID NO：18所示的轻链可变区，嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24所示的序列，scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示，核酸序列如SEQ ID NO：55所示，具有的CDR区为SEQ ID NO：1所示的HCDR1，SEQ ID NO：7所示的HCDR2，SEQ ID NO：3所示的HCDR3，SEQ ID NO：4所示的LCDR1，SEQ ID NO：5所示的LCDR2，SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
CAR-T细胞的构建方法：首先构建CAR基因，如hu8E5-2I-BBZ的构建从5’端到3’端依次包括：CD8α信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示)、hu8E5-2I scFV(核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示)、CD8hinge(核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示)、CD8跨膜区(核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示)和CD137的胞内信号传导结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示)以及CD3ξ的胞内信号传导结构域CD3ξ(核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示)。然后将CAR基因克隆至穿梭质粒，获得含有CAR基因的目的质粒。将构建好的目的质粒和包装质粒共转染293T细胞，制备得到慢病毒载体，将慢病毒载体转导从患者外周血获得的T细胞，得到CAR-T细胞。作为示例性的，下述实施例中采用了hu8E5-2I-BBZ。
实施例1：用首剂量和后续剂量的CAR-表达自体同源T细胞治疗癌症患者
给予CLD18A2阳性的消化道肿瘤(例如胃腺癌、胰腺癌)患者表达抗-CLD18A2嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞。在给予细胞之前，患者接受“去单个核细胞分离术”的单采分离技术，并进行预处理治疗。为了获得自体CAR-表达T细胞，通过基于来自个体受试者的单采样品的分离获得PBMC，通过编码抗CLD18A2CAR的病毒载体转导，随后大量扩增后制剂自体CAR-表达T细胞于单独的柔性冷冻袋的输注介质中冷冻保存。每个受试者输注的首剂量不高于约1×10 12个细胞，优选地，不高于约1×10 11个细胞，优选地，不高于约1×10 10个细胞、或不高于约5×10 9个细胞、或不高于2×10 9个细胞。在输注之前，将细胞保持在低于-175℃的温度下。
在开始细胞治疗之前，从受试者获得血液，并且任选地通过ELISA和/或MSD和/或CBA的方法评估血清中指示细胞因子释放综合征(CRS)的一种或多种因子的水平，例如肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、IL-10和IL-6。在治疗开始之前，可以通过例如PET或CT扫描测量实体肿瘤的大小或性状来任选地评估肿瘤负荷，且还可以通过检测肿瘤标志物和/或观察肿瘤并发症发生及严重程度来评估肿瘤负荷。
通过升温至38℃左右进行复苏，并且受试者通过多次输注给予首剂量的细胞。不超过20天的时间内分成多次，例如1-6次，优选1-5次，优选1-4次，优选1-3次，更优为2-3次给予首剂量。每次输注为约3-30分钟，优选5-25分钟时间内静脉(IV)滴注给予。
在给予首剂量后，受试者接受身体检查，并监测任何毒性或毒性结果的症状，例如发热、低血压、缺氧、神经障碍或炎性细胞因子或C反应蛋白(CRP)的血清水平升高。任选地，在给予首剂量后，在一次或多次的情况下，从患者获得血液，并通过ELISA和/或MSD和/或CBA的方法评估指示CRS的血清因子的水平。将血清因子的水平与刚好给予首剂量之前获得的血清因子的水平进行比较。如有必要，给予抗IL6或其他CRS治疗以减少CRS的症状。
在给予首剂量后，例如在给药开始后1、2、3和/或4周，任选地检测受试者中抗CAR免疫应答的存在或不存在，例如，通过qPCR、ELISA、ELISPOT、基于细胞的抗体测定和/或混合淋巴细胞反应。
通过首剂量实现的肿瘤负荷减少百分比可任选地在通过扫描(例如PET和CT扫描)在实体瘤患者中给予首剂量后一次或多次进行测量，和/或通过量化在血液或肿瘤部位疾病阳性细胞。
给予后续剂量。在一些受试者中，在开始给予首剂量后约80天内给予后续剂量，优选地，约60天，更优选地，约50天。在一些情况下，仅在经测试的CRS相关结果或血清因子水平低于可接受水平并且在首次给药后约60天在受试者中没有检测到抗CAR免疫应答时才给予后续剂量。在其他受试者中，在首剂量给予后超过30天的时间，并且将受试者视为不具有CRS或严重CRS，或者所有测试的指示CRS的血清因子的水平低于首剂量给药后在峰值时观察到的CRS的20％，并且认为受试者没有可检测到的抗-CAR免疫应答时给予后续剂量。在一些实施方式中，给予一个或多个后续剂量的细胞。每次剂量给药时间间隔在21-80天，优选地，25-60天，更优选地，25-55天。
后续剂量的大小是患者特异性的，并且基于肿瘤负荷，抗CAR免疫应答的存在和CRS相关结果的水平。一些受试者被给予含有1、2、3、4或甚至更多次数的后续剂量。每个受试者输注的后续剂量不高于约1×10 12个细胞，优选地，不高于约1×10 11个细胞，更优选地，不高于约1×10 10个细胞,更优选地，不高于约5×10 9个细胞或不高于约2×10 9个细胞。后续剂量在不超过约20天的时间内分成多次，例如1-5次，优选1-4次，优选1-3次，更优为2-3次给药。每次输注为约3-30分钟，优选5-25分钟时间内连续输注静脉内(IV)给予。
从首剂量开始并持续长达数年，定期监测受试者。在随访期间，测量肿瘤负荷、和/或通过流式细胞术和定量聚合酶链反应(qPCR)检测CAR-表达细胞，以测量所给予的细胞的体内增殖和持久性、和/或评估抗-CAR免疫应答的发展。
实施例2：评估治疗前具有形态学疾病的受试者中的CAR-T细胞治疗的神经毒性
通过影像学检测靶病灶对治疗前的肿瘤负荷进行评估，并确定靶病灶的数目及大小，疗效评价标准如表1。
表1.靶病灶的疗效评价标准
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在大约3-30分钟内，通过单次、两次或三次静脉内(IV)连续输注，以总量为约 1.1×10 6个CAR-T细胞/KG至约2.8×10 7个CAR-T/KG向受试者给予CAR-表达T细胞。将氟达拉滨、或环磷酰胺、或白蛋白结合型紫杉醇、或氟达拉滨联合白蛋白结合型紫杉醇、或环磷酰胺联合白蛋白结合型紫杉醇、或氟达拉滨联合环磷酰胺、或氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇三者联合化疗作为预处理化学治疗在CAR-T细胞输注前1-30天，优选地1-20天，更优选地4-12天给予受试者。
在给予CAR-T细胞后评估受试者的疾病状态以评估对治疗的反应。治疗后，对受试者进行评估并监测神经毒性(神经系统并发症，包括混乱症状，失语症，癫痫发作，抽搐，嗜睡和/或改变的精神状态)，根据严重程度分级(使用1-5级量表例如，Guido Cavaletti和Paola Marmiroli Nature Reviews Neurology 6，657-666(2010年12月)，其中3级(严重症状)，4(危及生命的症状)或5(死亡)被认为是严重的神经毒性。
(一)确定并监测细胞因子释放综合征(CRS)：
1级(轻微)-不威胁生命，仅需要全身治疗如退热剂和止吐剂(例如，发热、恶心、疲劳、头痛、肌痛、不适)；
2级(中等)-需要并响应中等介入：
氧气需求<40％，或
相应体液或低剂量单一血管升压类药物的低血压，或
2级器官毒性(通过CTCAE v4.0)；
3级(严重)-需要并响应积极介入：
氧气需求≥40％，或
需要高剂量单一血管升压类药物(例如，去甲肾上腺素≥20ug/kg/分钟，多巴胺≥10ug/kg/分钟，苯肾上腺素≥200ug/kg/分钟，或肾上腺素≥10ug/kg/分钟)的低血压，或
需要多种血管升压类药物(例如，抗利尿素+上述试剂之一，或等于≥20ug/kg/分钟去甲肾上腺素的血管升压类药物的组合)的低血压，或
3级器官毒性或4级转氨酶炎(通过CTCAE v4.0)；
4级(威胁生命)-需要通气机支持，或
4级器官毒性(排除转氨酶炎)；
5级(致命)-死亡。
(二)神经毒性的示例性分级标准：
1级(无临床症状或轻微)-轻微或无临床症状；
2级(中等)-存在限制日常积极活动(ADL)的症状，如做饭、买菜或买衣服、使 用电话、管理钱；
3级(严重)-存在限制性自我管理ADL,如洗澡、穿衣或脱衣、进食、使用厕所、服用药物的症状；
4级(威胁生命)-威胁生命，需要紧急介入的症状；
5级(致命)-死亡。
在治疗前基于疾病负荷分离的受试者组中评估了与剂量相比，用单次输注不同剂量的CAR-T细胞的治疗后的响应、严重CRS的存在、以及严重的神经毒性的存在。结果如表2所示。表2列出了以各种多剂量给予的细胞的特定剂量，并且首剂量和后续剂量、相邻在先后续剂量与相邻在后后续剂量之间的间隔时间。表2还列出了根据实施例2所述的标准，在给予首剂量之前时刻作为肿瘤负荷基线，来评估的每轮CAR T细胞治疗后的响应。表2还列出了6例患者对每次给药的响应的结果(在“应答”一栏列出了给予后的肿瘤负荷，其与肿瘤负荷基线相比，表明对治疗的响应)，存在或不存在(Y/N)严重CRS和严重神经毒性。如表2所示，无论治疗前的疾病负荷如何，在测试的所有剂量下，在用CAR-T细胞治疗的受试者中观察到SD。观察到接受各种剂量水平的CAR-T细胞的受试者均未发生严重CRS、严重神经毒性。
这些结果提示为了最小化毒性和最大化功效，使用剂量方案，其包括向具有形态学疾病的受试者给予首次低剂量CAR-T细胞以减轻疾病负荷，随后在肿瘤负荷稳定或已经减少或进展后给予后续细胞剂量，可以给予更高的剂量的后续剂量，没有严重CRS或具有严重的神经毒性风险。首次剂量也可以给予较高剂量CAR-T细胞以减轻疾病负荷，随后在肿瘤负荷稳定或已经减少后给予后续细胞剂量，可以给予较低的剂量的后续剂量，没有严重CRS或具有严重的神经毒性风险。
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Figure PCTCN2019077529-appb-000003
Figure PCTCN2019077529-appb-000004
表2中的结果表明，首剂量治疗中没有发生严重CRS、严重神经毒性，因此首剂量的细胞对于所有受试者是安全的。
观察到一些受试者处于疾病稳定(SD)。在给予首剂量或后续剂量的细胞后通过影像学手段观察到肿瘤没有改变或是略有减少(参见患者编号：1、2、3、5、6号受试者首剂量疗程，4、5、6号受试者的后续剂量(第二)疗程)，4号受试者的后续剂量(第三、四)疗程。所有受试者在任何剂量下均未显示严重CRS、严重神经毒性。
在某些情况下，表2表明一些受试者对首剂量不具有反应性(NR)(参见患者编号：2、4号受试者首剂量疗程)，从而未能实现疾病或肿瘤负荷水平的稳定或降低。此外，结果表明，在首剂量输注后不能实现临床缓解也没有增加受试者的严重CRS、神经毒性的风险或频率的情况下，在接受后续较高剂量后这些受试者中也未检测到严重CRS、严重神经毒性。
在一些实施方式中，受试者中缺乏(或相对较低)的反应性或毒性程度表明受试者可能不能对CAR-T细胞治疗作出良好反应，但是在另一次输注时也不具有某些毒性不良事件的风险，否则可能表明后续给药需要避免更高剂量。因此，与首剂量相比，这些结果支持剂量方案(例如，如果需要或最大化或改善功效所必需)，即通过首次低剂量给药后后续给药使用较高剂量。即使某些受试者没有对首次给药产生反应，给予后续剂量后严重神经毒性的风险也较低。
为了进一步评估在首剂量和后续剂量中给予的细胞的功效，通过检测CAR-T细胞在体内持续存活期，即CAR-T细胞“植入”体内持续存活的期间。从初次输注(为第0天)结束后起每个访视点采用Q-PCR的方法(所用探针为：FAM-5’-CTGAGCAGCGTGACCGCCGC-3’TAMRA(SEQ ID NO:49)；上游引物序列为：5’-TGGAGTGGATCGGCTACATC-3’(SEQ ID NO:50)；下游引物序列为：5’-AGTAGTAGATGGCGGTGTCG-3’(SEQ ID NO:51))检测外周血中含有CAR-CLD18DNA的拷贝数，直到任何2次连续的检测为阴性，记录为CAR-CLD18T细胞持续存活期。结果如图1所示，CAR-T细胞在所有受试者中增殖。基于采用C反应蛋白(CRP)的血清水平测量的峰值水平，比较所给予的CAR-T细胞的生物学活性。血清中CRP升高峰值水平也作为输注后T细胞增殖的证据。结果如图2A,2B所示,输注首剂量和后续剂量的T细胞后细胞在所有受试者中增殖。
实施例3.用于胰腺癌治疗的CAR-T细胞多重剂量方案
参照前述材料和方法中的描述，制备CAR-T细胞。
在示例性剂量方案中，用重复剂量的CAR-T细胞治疗具有复发性或难治性胰腺癌受试者，每次剂量给药时间间隔在约21-80天，优选地，约25-60天，更优选地，约25-55天。任选地，受试者接受氟达拉滨联合环磷酰胺或氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇三者联合化疗或白蛋白结合型紫杉醇单独化疗，其在首剂量和后续剂量的CAR-T细胞之前至少两天给予并在给予细胞前一般不超过约15天或不超过约12天。
受试者接受小于或等于约2.5×10 8个细胞/kg患者体重，例如约1.1×10 6个细胞/kg至约2.83×10 7个细胞/kg的CAR-T细胞的首剂量，包括端值。在给予首剂量后80天内和/或在受试者发展针对CAR的免疫应答之前，向受试者输注较低、相等或更高剂量的细胞。在一些实施方式中，在首剂量后约44天以高于或低于首剂量的剂量给予后续剂量的CAR-T细胞，例如约1.1×10 7个细胞/kg(总剂量约为5×10 8)至约1.9×10 7个细胞/kg(总剂量约为1×10 9)，给予一个或多后续剂量的细胞。每次剂量给药时间间隔在约21-80天，优选地，约25-60天，更优选地，约25-55天。任选地，受试者接受氟达拉滨联合环磷酰胺或氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇三者联合化疗或白蛋白结合型紫杉醇单独化疗，其在每次剂量的CAR-T细胞之前至少两天给予并在给予细胞前一般不超过约15天或不超过约20天。
在示例性剂量方案中，用两种剂量的CAR-T细胞治疗具有CLD18A2阳性的复发性、难治性胰腺癌受试者1号，其包括给予首次低剂量的细胞和后续较高剂量的细胞。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体CAR-T细胞。受试者在首次给予CAR-T细胞前接受化疗预处理(将对患者每轮给予CAR T细胞疗法之日指定为第0日)，包括氟达拉滨约20mg/m 2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)，环磷酰胺约500mg/m 2/日×2日(-6日、-5日)。首剂量包括大约1.1×10 6个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量为5×10 7)，隔日注射一次，按照10％：30％：60％疗程总剂量，分3次输注。首剂量给予后，受试者中指示细胞因子-释放综合征(CRS)的因子的血清水平达到峰值水平并且开始下降到约首剂量输注前时刻水平，给予后续剂量(第二疗程)。第二次疗程中，给予氟达拉滨约20mg/m 2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)，环磷酰胺约500mg/m 2/日×2日(-6日、-5日)；输注约1.11×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为5×10 8)，按照10％：30％：60％疗程总剂量，分3次连续日输注。
监测受试者的治疗功效，包括通过腹部或其他部位(如转移)的影像学(包括核磁、CT等)和肿瘤标志物检查，以化疗预处理后，首剂量CAR-T细胞输注前的腹部或其他部位(如转移)的影像学(包括核磁、CT等)和肿瘤标志物检查结果为基线期检测来评估和监测疾病负荷，不良事件的证据，包括CRS和神经毒性，以及存活。
图3A可见1号受试者在接受总剂量约是5×10 7个CAR-T细胞的首疗程末次输注后2周：左腹脾区病灶稳定，短径略缩小；首疗程末次输注后6周：左腹脾区病灶稳定；接受总剂量约是5×10 8个CAR T细胞的第二次疗程输注后2周：左腹脾区病灶稳定；第二次疗程输注后5周：左腹脾区病灶稳定，肝新发病灶疾病进展。图3B为1号受试者肿瘤标志物CA125的检测，首剂量首次输注日为第0天。在首疗程输注后至第二次疗程开始前，受试者的左腹脾区病灶处于稳定状态，体内的CA125表达也略下降，所以该受试者处于疾病稳定期(SD)。在第二次疗程输注后，受试者的左腹脾区病灶处于稳定状态，但由于肝出现新病灶，从而退出治疗。这两个疗程中均没有严重的CRP及严重的神经毒性。患者一直用止痛药，未用止痛药前疼痛3-4分，用过止痛药后疼痛是1分；在连续剂量的第一次输后未再用止痛药，且没有疼痛感。
实施例4.用于胃腺癌治疗的CAR-T细胞重复给药方案、多重剂量方案
在示例性剂量方案中，用重复剂量的CAR-T细胞治疗具有复发性、难治性胃腺癌受试者，每次剂量给药时间间隔在约21-80天，优选地，约25-60天，更优选地，约25-55天。在治疗前，基本上如实施例2所述产生自体CAR-T细胞。任选地，受试者接受氟达拉滨联合环磷酰胺或氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇三者联合化疗或白蛋白结合型紫杉醇单独化疗，其在首剂量和后续剂量的CAR-T细胞之前至少两天给予并在给予细胞前一般不超过约15天或不超过约12天。
复发性或难治性胃腺癌受试者接受小于或等于约2.5×10 8个细胞/kg患者体重，例如约2.9×10 6个细胞/kg至约2.6×10 7个细胞/kg的CAR-T细胞的首剂量，包括端值。在给予首剂量后80天内和/或在受试者发展针对CAR的免疫应答之前，向受试者输注较低、相等或更高剂量的细胞。在一些实施方式中，在首剂量后约50天以高于或低于首剂量的剂量给予后续剂量的CAR-T细胞，例如约1.3×10 7个细胞/kg至约5.1×10 7个细胞/kg(总剂量约为2×10 9)，例如，约2.2×10 7个细胞/kg患者体重的剂量在一些实施方式中，给予一个或多后续剂量的细胞。每次剂量给药时间间隔在约21-80天，优选地，约25-60天，更优选地，约25-55天。任选地，受试者接受氟达拉滨联合环磷酰胺或氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇三者联合化疗或白蛋白结合型紫杉醇单独化疗，其在每次剂量的CAR-T细胞之前至少两天给予并在给予细胞前一般不超过约15天或不超过约12天。
复发性、难治性胃腺癌受试者4号为胃癌卵巢转移伴恶性胸腹水的患者，先接受预处理，包括氟达拉滨约30mg/日×4日(即约20mg/m 2/日×4日(-7日、-6日、-5日、-4日))，环磷酰胺0.75g/日×2日(即约514mg/m 2/日×2日(-7日、-6日)),再接受约 3.3×10 6个CAR-T细胞/kg(总剂量约是1.5×10 8个CAR-T细胞)首剂量注射的首疗程治疗。首剂量按照10％：30％：60％疗程总剂量，分连续3日，每日注射一次。首剂量给予后，受试者中指示CRS的因子的血清水平不超过该受试者在给予首剂量之前的血清水平的20倍(且在可接受的水平)时，其中，IL-10、TNFα已经开始下降，并且IL-6已经降到低于首剂量输注前时刻水平，给予后续剂量(第二疗程)。第二疗程中，预处理包括氟达拉滨约37mg/日×2日(即约25mg/m 2/日×2日(-5日、-4日))，环磷酰胺约0.75g/日×3日(即约514mg/m 2/日×3日(-5日、-4日、-2日))化疗；再给予输注约2.2×10 7个CAR-T细胞/kg(总剂量约1.0×10 9个CAR-T细胞)，按照50％：50％疗程总剂量分两次注射，隔日注射一次。第二疗程给予后，受试者中指示CRS的因子的血清水平达到峰值水平并且开始下降到约或低于第二疗程剂量输注前时刻水平，给予后续剂量(第三疗程)。第三次疗程的预处理包括给予白蛋白结合型紫杉醇约137mg/m 2/日×1日(-4)化疗；再输注约2.2×10 7个CAR-T细胞/kg(总剂量约1.0×10 9个CAR-T细胞)，按照50％：50％疗程总剂量分两次注射，隔日注射一次。第三疗程给予后6周，盆腔靶病灶最长径之和相对于第二次注射后6周无明显变化、盆腔新发病灶较前增大；少量腹水，盆腔少许积液；CA125为11.3U/ml。第三疗程给予后，受试者中指示CRS的因子的血清水平不超过该受试者在给予第三疗程剂量之前的血清水平的10倍(且在可接受的水平)时，且指示CRS的因子达到峰值水平并且开始下降到约或低于第三疗程剂量输注前时刻水平，给予后续剂量(第四疗程)。第四次疗程中预处理包括氟达拉滨约20mg/m 2/日×2日(-6日、-5日)，环磷酰胺约514mg/m 2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)化疗；再输注约3.7×10 7个CAR-T细胞/kg(总剂量约1.65×10 9个CAR-T细胞)，按照约46％：18％：36％疗程总剂量分三次注射(0日、1日、13日)。第四次疗程给予后6周，盆腔靶病灶最长径之和较前无明显变化；盆腔新发病灶较前无明显变化；胸腹水继续减少，提示CAR-CLD18T细胞治疗在控制恶性胸腹水中的也有着不错的效果。
图4A可见4号受试者在接受首剂量的首疗程末次输注后2周：右侧盆腔最大病灶最长径6.5cm，左侧盆腔最大病灶最长径5.2cm；首疗程末次输注后6周：右侧最大盆腔病灶最长径6.8cm，左侧最大盆腔病灶最长径5.3cm，盆腔新发病灶1.9cm(图4B),此次结果也作为第二次疗程基线；接受后续剂量的第二次疗程输注后2周：右侧盆腔最大病灶最长径6.8cm，左侧盆腔最大病灶最长径5.2cm，盆腔新发病灶1.9cm；第二次疗程末次输注后6周：右侧盆腔最大病灶最长径6.5cm；左侧盆腔最大病灶最长径5.1cm；盆腔新发病灶1.3cm。
图4C可见，在CAR-T治疗过程中受试者癌性胸腹水显著减少。图4D，4E分别 检测肿瘤标志物CA125和CA199,首剂量首次输注日为第0天。肿瘤标志物CA125、CA199显著下降，其中在首疗程中CA125从CAR-T注射前的106.7U/ml降低到第二疗程注射前的32.1U/ml(正常范围<35U/ml)，在第二疗程中CA125一直保持在较低水平。在首疗程中CA199从CAR-T注射前的99.41U/ml降低到第二疗程注射前的52.98U/ml(正常范围<37U/ml)，在第二疗程中CA199一直保持在正常范围。
上述结果说明4号受试者在首疗程中原有病灶处于稳定状态，但有新发病灶的出来，在第二疗程中，原有病灶处于稳定状态，而新发病灶明显缩小，缩小比例达到31.6％，同时受试者体内的肿瘤标志物CA125保持较低水平，CA199维持在正常水平。这两个疗程中均没有严重的CRS及严重的神经毒性。
复发性、难治性胃腺癌受试者5号在首次给予CAR-T细胞前接受化疗预处理，包括氟达拉滨约20mg/m 2/日×2日(-6日、-5日)，环磷酰胺约500mg/m2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)。首剂量包括大约1.6×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1×10 9)，隔日注射一次，按照50％：50％疗程总剂量，分2次输注。首剂量给予后，受试者中指示CRS的因子的血清水平达到峰值水平并且开始下降，或下降到约或低于首剂量输注前时刻水平，给予后续剂量(第二疗程)。在第二疗程中预处理包括输注氟达拉滨约20mg/m 2/日×1日(-5日)，环磷酰胺约500mg/m 2/日×3日(-5日、-4日、-3日)，白蛋白结合型紫杉醇约100mg/m 2/日×1日(-4日)化疗；再输注约1.6×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1×10 9)，隔日注射一次，按照50％：50％疗程总剂量，分2次输注。
复发性、难治性胃腺癌受试者6号在首次给予CAR-T细胞前接受化疗预处理，包括氟达拉滨约20mg/m 2/日×2日(-6日、-5日)，环磷酰胺约500mg/m 2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)。首剂量包括大约1.25×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1×10 9)，隔日注射一次，按照50％：50％疗程总剂量，分2次输注。首剂量给予后，受试者中指示CRS的因子的血清水平达到峰值水平并且开始下降到约或低于首程剂量输注前时刻水平，给予后续剂量(第二疗程)。在第二疗程中预处理包括给予氟达拉滨约20mg/m 2/日×1日(-5日)，环磷酰胺约500mg/m 2/日×3日(-5日、-4日、-3日)，白蛋白结合型紫杉醇约100mg/m 2/日×1日(-4日)；输注约1.25×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1×10 9)，隔日注射一次，按照50％：50％疗程总剂量，分2次输注。
实施例5 复发性、难治性胃腺癌受试者的治疗
复发性、难治性胃腺癌7号受试者贲门腺癌1.3年，接受胃切除术治疗后疾病进 展，肝脏多发转移瘤，后接受了替吉奥、多西他赛、奥沙利铂、卡培他滨等治疗，仍处于疾病进展状态。在该情况下，患者接收到了本发明的CAR-T细胞的治疗。
在首次给予CAR-T细胞前接受化疗预处理，包括氟达拉滨约20mg/m 2/日×1日(-12日)，环磷酰胺约500mg/m 2/日×3日(-12日、-11日、-10日)。首剂量包括大约2.6×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1×10 9)，隔日注射一次，按照50％：50％疗程总剂量，分2次输注。输注后，患者有发烧，最高39.3，仅物理降温即可控制。在首剂量给予2周后，癌胚抗原由12.49U/ml降低到5U/ml以下，糖类抗原CA199由12.17U/ml降低到4U/ml以下，在首剂量给予6周后，MR扫描显示，肝右后叶上段肿瘤缩小41％。
首剂量给予后，受试者中指示CRS的因子的血清水平达到峰值水平并且开始下降到约或低于首程剂量输注前时刻水平，给予后续剂量(第二疗程，为首剂量给予后第47天)。在第二疗程中预处理包括给予氟达拉滨约21mg/m 2/日×1日(-6日)，环磷酰胺约540mg/m 2/日×3日(-6日、-5日、-4日)，白蛋白结合型紫杉醇约71mg/m 2/日×1日(-5日)；再输注约5.1×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为2×10 9)，按照25％：25％：25％：25％疗程总剂量，分4次输注(0日、2日、9日、13日)。在第二疗程的后续剂量给予2周后，肝右后叶上段肿瘤缩小63％。
复发性、难治性胃腺癌9号受试者胃腺癌，接受胃癌双侧卵巢转移术后予8周期SOX方案化疗，2周期口服TS方案化疗5周期(多西他赛、替吉奥)等治疗，仍处于疾病进展状态。在该情况下，患者接收到了本发明的CAR-T细胞的治疗。
在首次给予CAR-T细胞前接受化疗预处理，包括氟达拉滨约20mg/m 2/日×1日(-6日)，环磷酰胺约500mg/m 2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)，白蛋白结合型紫杉醇约64mg/m 2/日×1日(-5日)。首剂量包括大约1.82×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1×10 9个CAR-T细胞)，按照50％：50％疗程总剂量分次输注,连续两日注射，每日注射一次。首次输注后，患者出现2级发热，采用吲哚美辛栓纳肛退热。
首剂量给予后，IL-2从输注后第3天即明显升高，约10天达到峰值水平并且开始下降到约或低于首程剂量输注前时刻水平，余细胞因子未见显著变化。给予后续剂量(第二疗程，为首剂量给予后第40天)。在第二疗程中预处理(同第一疗程的预处理)后再输注约2.73×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1.5×10 9个CAR-T细胞)，按照1/3：1/3：1/3疗程总剂量，分3次连续输注，每日注射一次。期间，发生与研究治疗相关的III淋巴细胞减少与白细胞减少，II低血钙、低血钾、恶心、，均经过对症支持治疗恢复。无SAE发生。
给予后续剂量(第三疗程，为第二疗程剂量给予后第25天)。第三次疗程的预处理(同第一疗程的预处理)后再输注约1.82×10 7个CAR-T细胞/kg(总剂量约1.0×10 9个CAR-T细胞)，按照50％：50％疗程总剂量分次输注,连续两日注射，每日注射一次。影像学检查，显示患者病灶消失，经影像专科医生评估为完全缓解(CR)。
实施例6 复发性、难治性胰腺癌受试者的治疗
复发性、难治性胰腺癌受试者8号，在接受CAR-T细胞治疗之前，曾接受胰体和胰尾切除术，术后出现PD，肠系膜淋巴结和肝脏均有转移，进行局部放疗处理后，仍然呈现疾病进展，肝脏新发4枚病灶。
在首次给予CAR-T细胞前接受化疗预处理，包括氟达拉滨约20mg/m 2/日×1日(-6日)，环磷酰胺约507mg/m 2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)，白蛋白结合型紫杉醇约68mg/m 2/日×1日(-5日)。首剂量包括大约2.83×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约1.5×10 9)，按照1/3：1/3：1/3疗程总剂量，分3次输注(0日、11日、14日)。首剂量CAR-T细胞注射后6周，基线时肝内2个靶病灶和盆腔1个靶病灶最长径缩小90％，CA 199从899.6U/ml降至56.79U/ml，经评估达到PR(部分缓解)。
首剂量给予后第44天给予后续剂量(第二次疗程)中，给予氟达拉滨约20mg/m 2/日×1日(-6日)，环磷酰胺约507mg/m 2/日×4日(-6日、-5日、-4日、-3日)，白蛋白结合型紫杉醇约68mg/m 2/日×1日(-5日)化疗；输注CAR-T细胞约1.887×10 7个CAR-T细胞/kg患者体重(总剂量约为1×10 9)，隔日注射一次，按照50％：50％疗程总剂量，分2次输注。给予第二疗程的连续剂量后9天，肝脏MR平扫显示肝内未见明确活性灶，盆腔CT平扫发现相比第一疗程6周的结果，盆腔软组织小结节明显缩小。
实施例7 患者的不良反应统计
将前述实施例中的9例患者进行了身体检查，并检测不良事件(AE)的症状，包括表3中列出的症状。将首剂量输注后的治疗急性AE(TEAE)定义为在接受首剂量后出现的任何AE。结果如表3所示：
表3.不良事件统计
不良事件 TEAE(n＝9)
全部 9
低白蛋白血症 4
低血钾 3
低血钙 4
发热 9
畏寒 2
关节痛 1
腹痛 1
皮肤紫绀 1
皮肤瘙痒 1
心动过速 1
CRS 0
实施例8 Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2、8E5-2I-mBBZ CAR T细胞建立
1.Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2细胞的构建
利用分子生物学常规手段建立过表达小鼠Claudin 18.2(SEQ ID NO:67)的Panc02胰腺癌细胞模型。以pWPT为载体，插入小鼠Claudin 18.2(SEQ ID NO:67)，构建了质粒pWPT-mClaudin 18.2。然后采用慢病毒包装感染方法建立过表达小鼠Claudin 18.2的胰腺癌细胞Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2。
2.表达嵌合抗原受体的T细胞的构建
(1)质粒构建
采用本领域常规分子生物学方法，本实施例采用的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示，核酸序列如SEQ ID NO：55所示，具有的CDR区为SEQ ID NO：1所示的HCDR1，SEQ ID NO：7所示的HCDR2，SEQ ID NO：3所示的HCDR3，SEQ ID NO：4所示的LCDR1，SEQ ID NO：5所示的LCDR2，SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
所采用的嵌合抗原受体为二代的嵌合抗原受体，包含CD8的跨膜域、4-1BB的胞内域、及CD3ζ。参照图5所示的质粒图，构建了质粒MSCV-8E5-2I-mBBZ。
以MSCV.pBABE 5为载体，构建了表达二代嵌合抗原受体的逆转录病毒质粒MSCV-8E5-2I-mBBZ。8E5-2I-mBBZ序列由鼠CD8α信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示)、靶向claudin18.2的scFv(SEQ ID NO：55)、鼠CD8hinge和跨膜区(氨基酸序列如SEQ ID NO：61所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示)和鼠4-1BB胞内信号传导结构域(氨基酸序列如SEQ ID NO：63所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:64所示)以及鼠CD3的胞内段CD3ζ(氨基酸序列如SEQ ID NO：65所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示)组成。
将MSCV-8E5-2I-mBBZ转染293T包装逆转录病毒，得到逆转录病毒。感染方法为本领域表达嵌合抗原受体的T细胞制备过程中常规的感染方法。
(2)CAR T细胞构建：取C57BL/6小鼠的脾脏T淋巴细胞，将纯化的小鼠CD3 +T淋巴细胞按1：1的体积比加入Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28，PBS清洗一次，活化，放培养箱培养，培养基为RPMI 1640完全培养基，添加10％FBS血清。
将活化24h的小鼠脾脏T淋巴细胞接种于重组人纤维蛋白片段包被的12孔板中，加入逆转录病毒感染12小时，随后培养扩增至需要的数量，得到小鼠的8E5-2I-mBBZ CAR T细胞。
实施例9 CCK8实验检测Abraxane对胰腺癌细胞及CAR-T细胞的毒性作用
将Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2细胞和实施例8制备的8E5-2I-mBBZ CAR T细胞分别铺于96孔板中，每孔10，000个细胞(Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2)或每孔100，000个细胞(hu8E5-2I-mBBZ CAR T)，100ul培基。分别取不同溶度的Abraxane分别加入到细胞中，做成十个梯度(最大浓度500μg/ml，2倍梯度稀释)，此外设立一组只有培养基的孔，为空白组。24h后每孔加入10ul CCK8试剂(Dojindo公司)37℃孵育2h后酶标仪测定450nm处吸光度，分别计算细胞活力。
计算公式为：细胞活力(％)＝【A(加药)-A(空白)】/【A(0加药)-A(空白)】
结果如图6A和6B所示，Abraxane对Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2细胞的IC50值为174.45±20.98μg/ml。Abraxane对8E5-2I-mBBZ CAR-T细胞的杀伤结果显示，即使500μg/ml浓度的Abraxane处理下，8E5-2I-mBBZ CAR-T细胞的存活率仍然高于50％。由此说明，Abraxane对8E5-2I-mBBZ CAR-T细胞的毒性比较小。
实施例10 同时给予Abraxane与CAR T细胞对小鼠胰腺癌的抑制效果
6周龄的C57BL/6小鼠胰腺原位接种2×10 5Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2细胞，肿瘤细胞接种日记为第0天(即Day 0)。
接种肿瘤后第2天(即Day2)，取小鼠T细胞并构建8E5-2I-mBBZ CAR T细胞。
接种肿瘤后第7天(即Day7)对小鼠给予1×10 6 8E5-2I-mBBZ CAR-T细胞尾静脉注射或Abraxane(60mg/kg)腹腔注射或二者联合，并于第14天重复注射1次同样剂量的CART和Abraxane一次，每周活体成像观察治疗效果。
结果如图7A所示：在CAR T细胞注射后19天(即Ddy26天)，可以观察到联合组的荧光素酶活性明显低于单CAR-T治疗组或单Abraxane治疗组(P<0.05，Two way ANOVA)。说明相对于8E5-2I-mBBZ CAR-T组、Abraxane治疗组，8E5-2I-mBBZ CAR-T联合Abraxane组的肿瘤生长速度最慢，对于胰腺原位肿瘤有很好的抑制生长的效果。上述结果说明Abraxane联用可以提高CAR-T细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用。
每周监测小鼠体重1～2次，结果如图7B所示，小鼠在经CAR-T细胞和Abraxane联合治疗期间及治疗后2个星期，与UT对照组相比较，体重没有减轻。小鼠也未出现其他异常，说明CAR-T细胞和Abraxane联合治疗对小鼠没有严重的毒副作用。
实施例11 先后给予Abraxane与CAR T细胞对小鼠胰腺癌的抑制效果
6周龄的C57BL/6小鼠胰腺原位接种2×10 5Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2细胞，肿瘤细胞接种日记为第0天(即Day0)。
接种肿瘤后第7天(即Day7)取小鼠脾脏T细胞，构建hu8E5-2I-mBBZ CAR T细胞。
接种肿瘤后第7天(即Day7)对小鼠给予Abraxane 60mg/kg腹腔注射(Abraxane组)，接种肿瘤后第10天(即Day10)给予小鼠3×10 6 8E5-2I-mBBZ CAR-T细胞尾静脉注射(8E5-2I-BBZ CAR-T组)或3×10 6对照UT细胞尾静脉注射(UT组)，或二者联合(接种肿瘤后第7天给予小鼠Abraxane 60mg/kg腹腔注射，然后在接种肿瘤后第10天再给予小鼠3×10 6 8E5-2I-mBBZ CAR-T细胞尾静脉注射，Abraxane+8E5-2I-BBZ CAR-T组)，记录小鼠生存期，结果如图8A、8B、8C所示，联合组(Abraxane+8E5-2I-BBZ)与对照UT组相比显著延长小鼠生存期(P<0.05)，联合组与Abraxane单药组相比显著延长小鼠生存期(P<0.05)。
每周监测小鼠体重1～2次，结果如图9所示，小鼠在经CAR-T细胞和Abraxane联合治疗期间及治疗后2个星期，与UT对照组相比较，体重没有减轻。小鼠也未出现其他异常，说明CAR-T细胞和Abraxane联合治疗对小鼠没有严重的毒副作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
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Figure PCTCN2019077529-appb-000006
Figure PCTCN2019077529-appb-000007
Figure PCTCN2019077529-appb-000008
Figure PCTCN2019077529-appb-000009

Claims (62)

  1. 一种治疗CLD18阳性肿瘤方法，所述方法包括将首剂量的免疫效应细胞给予有此需要的受试者，所述免疫效应细胞表达嵌合抗原受体(CAR)且特异性识别CLD18，所述首剂量包含不超过约2x10 10细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 12细胞，
    优选地，所述首剂量不超过约2x10 9细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 11细胞，
    优选的，所述首剂量不超过约2.5x10 8细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 10细胞，
    优选地，所述首剂量不超过约5x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 10细胞，
    更优选地，所述首剂量不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约2x10 9细胞。
  2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CLD18为CLD18A2。
  3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，给予所述首剂量的免疫效应细胞后，再给予至少一次的后续剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)且特异性识别CLD18的免疫效应细胞。
  4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述首剂量给予的免疫效应细胞在体内检测不到后，再给予所述后续剂量的免疫效应细胞。
  5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述首剂量给予后约21至80天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；优选的，在所述首剂量给予后约25至60天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；更优选地，在所述首剂量给予后约25至50给予所述的后续剂量的免疫效应细胞。
  6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述后续剂量高于首剂量；优选的，所述后续剂量是所述首剂量的2倍、5倍、7倍或10倍。
  7. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述后续剂量包含不超过约2x10 10细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 12细胞，
    优选地，所述后续剂量包含不超过约2x10 9细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 11细胞，
    优选的，所述后续剂量包含不超过约2.5x10 8细胞/千克受试者体重或所述细胞所述细胞总量不超过约1x10 10细胞，
    优选地，所述后续剂量包含不超过约5x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约1x10 10细胞，
    更优选地，所述后续剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约2x10 9细胞。
  8. 如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述首剂量或后续剂量在20天内，分成N次给药，N为不小于1的自然数，优选的，在3-15天内，分成N次给药。
  9. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，给予后续剂量时，所述受试者具有以下任一特征：
    (i)指示细胞因子释放综合征(CRS)的因子在受试者中血清水平倍数比在所述首剂量给予之前即刻的受试者中的水平小约10倍、小约25倍、和/或小约50倍；
    (ii)没有显示出3级或更高的神经毒性；
    (iii)神经毒性或CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞后的神经毒性或CRS水平的峰值水平相比，呈现降低；或者
    (iv)所述受试者没有显示出针对由所述首剂量的细胞表达的CAR的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。
  10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述(iii)中，CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞后的CRS的峰值水平相比，降低至少50％，优选的，降低至少20％，更优的，降低至少5％，或者CRS水平与给予首剂量的免疫效应细胞之前的CRS水平相当。
  11. 如权利要求1-10任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在给予所述的免疫效应细胞的之前进行预处理，所述预处理包括给予所述受试者化疗剂、或者对所述受试者进行全身辐射、或对所述受试者进行局部辐射治疗，或其组合。
  12. 如权利要求11中任一项所述的方法，其特征在于，所述预处理在给予免疫效应细胞前4-12天实施。
  13. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自以下任意一种或其组合：环磷酰胺、氟达拉滨、紫杉烷类化合物、嘧啶类抗肿瘤药物。
  14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述化疗剂为环磷酰胺和氟达拉滨；或者环磷酰胺、氟达拉滨以及白蛋白结合型紫杉醇。
  15. 如权利要求13或14任一项所述的方法，其特征在于，
    氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或
    环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或
    白蛋白结合型紫杉醇给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
  16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述化疗剂连续使用不超过4天。
  17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述环磷酰胺和/或所述氟达拉滨连续使用不超过4天，所述白蛋白结合型紫杉醇给予一次。
  18. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤为CLD18A2阳性消化道肿瘤；优选地，所述消化道肿瘤为腺癌；更优选地，所述消化道肿瘤为胰腺癌、胃腺癌。
  19. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括特异性结合CLD18A2的抗体或其片段、跨膜域及胞内域，所述抗体具有：
    SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
    SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：7所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2、SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
    SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：9或68所示的HCDR2、SEQ ID NO：10所示的HCDR3、SEQ ID NO：11所示的LCDR1、SEQ ID NO：12所示的LCDR2、SEQ ID NO：13所示的LCDR3。
  20. 如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗体或其片段具有：
    SEQ ID NO：14所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
    SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区；或者
    SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：20所示的轻链可变区；或者
    SEQ ID NO：53所示的重链可变区和SEQ ID NO：52所示的轻链可变区；
    优选的，所述抗体或其片段具有SEQ ID NO：54、56、57、或58所示的序列。
  21. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID  NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32任一所示氨基酸序列；优选的，为SEQ ID NO：24、25或26所示的序列。
  22. 如权利要求1-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫效应细胞是T淋巴细胞、NK细胞或者NKT淋巴细胞；优选是T淋巴细胞；优选地，所述T细胞来自所述受试者自体。
  23. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：
    给予两次以上的后续剂量的免疫效应细胞，每次给予后续剂量的免疫效应细胞的间隔时间是约21至约80天，或约25至约60天，或约25至50天，各自包括端值。
  24. 如权利要23所述的方法，其特征在于，每次给予的后续剂量的免疫细胞数量基本相同，或者后给的后续剂量的免疫效应细胞数量高于在先给的后续剂量的免疫细胞数。
  25. 如权利要求23所述的方法，其特征在于后给的后续剂量的免疫效应细胞数量低于在先给的后续剂量的免疫细胞数。
  26. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，给予所述免疫效应细胞之前，所述受试者没有接受过靶向CLD18的表达嵌合抗原受体的免疫细胞的治疗。
  27. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的后续剂量为足以稳定或降低所述受试者的肿瘤负荷的细胞数量。
  28. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在给予所述首剂量之前，所述受试者已经进行了手术治疗、化疗、或者不同于权利要求1所述的免疫治疗。
  29. 如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，在首剂量给予之前，或者在首剂量给予之后并在后续剂量给予之前，对所述受试者的指示CRS的因子、指示神经毒性的因子、指示肿瘤负荷的因子、和/或指示宿主抗-CAR免疫应答的因子的血清水平进行评价。
  30. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述的指示肿瘤负荷的因子为：所述受试者的肿瘤细胞总数、或者所述受试者的器官中肿瘤细胞总数、或者所述受试者的组织中的肿瘤细胞总数、或者肿瘤的质量或体积，或者肿瘤转移的程度、或者肿瘤数量。
  31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，包括：
    i)在给予后续剂量之前评价指示肿瘤负荷的因子；和
    ii)基于所述评价的结果，确定待给予所述受试者的细胞的后续剂量，并且
    iii)如果评价确定所述受试者的肿瘤质量或体积稳定或下降，给予所述受试者 包含少于或多于所述首剂量中的CAR表达细胞的数量或与其大约相同的CAR表达细胞的数量的后续剂量。
  32. 如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述首剂量或所述后续剂量给予的细胞的数量为约1.1x10 6细胞/kg受试者体重至2.8x10 7细胞/kg，约2.9x10 6细胞/kg至2.6x10 7细胞/kg或约3.3x10 6细胞/kg至1.3x10 7细胞/kg或约1.3x10 7细胞/kg至1.8x10 7细胞/kg，各自包括端值。
  33. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，后续剂量的CAR表达细胞给予的细胞的数量包含约1.1x10 7细胞/千克(细胞/kg)体重至约5.1x10 7细胞/kg，约1.3x10 7细胞/kg至约3.7x10 7细胞/kg，约1.6x10 7细胞/kg至约2.2x10 7细胞/kg，约1.9x10 7细胞/kg至约2.2x10 7细胞/kg，约2.2x10 7细胞/kg至约2.7x10 7细胞/kg，各自包括端值。
  34. 如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，在给予首剂量或后续剂量的免疫效应细胞之后，所述受试者没有显示出细胞因子释放综合征(CRS)，没有显示严重CRS，没有显示神经毒性，没有显示严重神经毒性，或没有显示超过3级的神经毒性。
  35. 如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，在给予首剂量或后续剂量免疫效应细胞之后，所述免疫效应细胞在所述受试者中增殖。
  36. 一种肿瘤治疗方法，所述方法包括给予权利要求1-35任一所述方法治疗之前，所述受试者接受了化疗、放疗、或者免疫治疗。
  37. 一种组合物，包括环磷酰胺和氟达拉滨或它们与紫杉烷类化合物和/或嘧啶类抗肿瘤药物的组合。
  38. 如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉醇。
  39. 如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括环磷酰胺、氟达拉滨和白蛋白结合型紫杉醇。
  40. 如权利要求39所述的组合物，其特征在于，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或白蛋白结合型紫杉醇给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
  41. 如权利要求37-40任一所述的组合物，其特征在于，在给予免疫效应细胞 治疗前约30天给予所述组合物；优选地，为约20天；更优选地，为约12天；最优选地，为约7天。
  42. 如权利要求37-41任一项所述的组合物，其特征在于，所述环磷酰胺、氟达拉滨和/或白蛋白结合型紫杉醇连续使用不超过4天；优选地，所述白蛋白结合型紫杉醇给予一次。
  43. 如权利要求37-42任一所述的组合物，其特征在于，用于抗肿瘤治疗；优选地，用于抗肿瘤的靶向治疗；最优选地，用于抗肿瘤的嵌合抗原受体靶向治疗。
  44. 如权利要求41-43任一所述的组合物，其特征在于，所述的免疫效应细胞为CAR T细胞。
  45. 如权利要求44所述的组合物，其特征在于，所述的CAR T细胞特异性识别CLD18A2。
  46. 如权利要求43-45任一所述的组合物，其特征在于，所述的肿瘤为CLD18A2阳性消化道肿瘤；更优选地，所述消化道肿瘤为腺癌；最优选地，所述消化道肿瘤为胰腺癌、胃腺癌。
  47. 包含CLD18A2-CAR的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物含有所述细胞和环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物(优选紫杉醇，更优选白蛋白结合型紫杉醇)，用于治疗CLD18阳性肿瘤，其中所述细胞和环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物配制成能提供比所述试剂各自的效果之和更大的治疗效果。
  48. 如权利要求47所述的应用，其特征在于，包括将首剂量的所述免疫效应细胞给予有此需要的受试者，所述首剂量不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约2x10 9细胞。
  49. 如权利要求47或48所述的应用，其特征在于，给予所述首剂量的免疫效应细胞后，再给予至少一次的后续剂量所述免疫效应细胞,所述后续剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约5x10 9细胞，优选地，所述细胞总量不超过约2x10 9细胞。
  50. 如权利要求47-49任一所述的应用，其特征在于，在所述首剂量给予后约21至80天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；优选的，在所述首剂量给予后约25至60天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；更优选地，在所述首剂量给予后约25至50给予所述的后续剂量的免疫效应细胞。
  51. 如权利要求47-50任一所述的应用，其特征在于，所述环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物在给予免疫效应细胞前4-12天给予。
  52. 如权利要求47-51任一项所述的应用，其特征在于，
    氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或
    环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或
    紫杉烷类化合物给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
  53. 如权利要求47-52任一所述的应用，其特征在于，所述环磷酰胺和/或所述氟达拉滨连续使用不超过4天，所述紫杉烷类化合物给予一次。
  54. 如权利要求47-53任一所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32任一所示氨基酸序列；优选的，为SEQ ID NO：24、25或26所示的序列。
  55. 一种用于治疗CLD18阳性肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
    1)包含CLD18A2-CAR的免疫效应细胞；
    2)环磷酰胺；
    3)氟达拉滨；
    4)紫杉烷类化合物，优选紫杉醇，更优选白蛋白结合型紫杉醇；
    5)用于包含以上1)-4)所述物质的容器；和
    6)利用所述试剂盒治疗CLD18阳性肿瘤的给药说明书；
    其中，所述细胞和环磷酰胺、氟达拉滨及紫杉烷类化合物配制成能提供比所述试剂各自的效果之和更大的治疗效果。
  56. 如权利要求55所述的试剂盒，其特征在于，所述给药说明书中记载了将首剂量的所述免疫效应细胞给予有此需要的受试者，所述首剂量不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约5x10 9细胞，优选地，所述细胞总量不超过约2x10 9细胞。
  57. 如权利要求55或56所述的试剂盒，其特征在于，所述给药说明书中记载了给予所述首剂量的免疫效应细胞后，再给予至少一次的后续剂量所述免疫效应细胞,所述后续剂量包含不超过约3x10 7细胞/千克受试者体重或所述细胞总量不超过约5x10 9细胞。
  58. 如权利要求55-57中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述给药说明书中记载了在所述首剂量给予后约21至80天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；优选的，在所述首剂量给予后约25至60天的时间点处给予所述的后续剂量的免疫效应细胞；更优选地，在所述首剂量给予后约25至50给予所述的后续剂量的免疫效应细胞。
  59. 如权利要求55-57任一所述的试剂盒，其特征在于，所述给药说明书中记载了所述环磷酰胺、氟达拉滨和紫杉烷类化合物在给予免疫效应细胞前4-12天给予。
  60. 如权利要求55-59任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述给药说明书中记载了：
    氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m 2/天、或约15-40mg/m 2/天、或约15-30mg/m 2/天、或约20-30mg/m 2/天；和/或
    环磷酰胺的给予量约为300-700mg/m 2/天、或约400-650mg/m 2/天、或约450-600mg/m 2/天、或约450-550mg/m 2/天、或约490-550mg/m 2/天；和/或
    紫杉烷类化合物给予量为不高于约300mg/m 2/天、或不高于约200mg/m 2/天、或不高于约150mg/m 2/天、或不高于约100mg/m 2/天、或不高于约80mg/m 2/天、或不高于约70mg/m 2/天。
  61. 如权利要求55-60任一所述的试剂盒，其特征在于，所述给药说明书中记载：
    所述环磷酰胺和/或所述氟达拉滨连续使用不超过4天，所述紫杉烷类化合物给予一次。
  62. 如权利要求55-61任一所述的试剂盒，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31、32任一所示氨基酸序列；优选的，为SEQ ID NO：24、25或26所示的序列。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021088927A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Lanova Medicines Limited Company Antibody-drug conjugates targeting claudin 18.2
WO2022028623A1 (zh) 2020-08-07 2022-02-10 佧珐药业有限公司 工程化改造的细胞以及工程化改造细胞的方法
WO2022214089A1 (zh) 2021-04-08 2022-10-13 克莱格医学有限公司 细胞免疫治疗的应用
WO2023274303A1 (zh) 2021-06-29 2023-01-05 科济生物医药（上海）有限公司 调控细胞生理活动的嵌合多肽
WO2023078386A1 (zh) * 2021-11-05 2023-05-11 正大天晴药业集团股份有限公司 抗cldn18.2抗体及其用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109790222B (zh) * 2016-07-08 2022-03-15 克莱格医学有限公司 抗密蛋白18a2的抗体及其应用
AU2022219922A1 (en) * 2021-02-09 2023-06-22 Obi Pharma, Inc. Globo series antigens-binding chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2023213280A1 (zh) * 2022-05-06 2023-11-09 上海先博生物科技有限公司 靶向cldn18.2的嵌合抗原t细胞受体及其应用

Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6040177A (en) 1994-08-31 2000-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center High efficiency transduction of T lymphocytes using rapid expansion methods ("REM")
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
WO2014055668A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
WO2015172339A1 (zh) 2014-05-14 2015-11-19 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN105194661A (zh) 2014-06-26 2015-12-30 科济生物医药（上海）有限公司 时空可调性抑制病理性靶细胞的系统
CN105315375A (zh) 2014-07-17 2016-02-10 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN105331585A (zh) 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
CN105713881A (zh) 2014-12-04 2016-06-29 科济生物医药（上海）有限公司 双靶向gpc3和asgpr1的转基因免疫效应细胞及其应用
US9405601B2 (en) 2012-12-20 2016-08-02 Mitsubishi Electric Corporation In-vehicle apparatus and program
CN106146666A (zh) 2015-03-26 2016-11-23 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cldn6的免疫效应细胞及其制备方法和应用
WO2016191756A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 Adrian Bot Methods of conditioning patients for t cell therapy
CN106397593A (zh) 2015-08-03 2017-02-15 科济生物医药（上海）有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白多糖‑3的抗体及其应用
CN106467573A (zh) 2015-08-21 2017-03-01 科济生物医药（上海）有限公司 抗间皮素全人抗体以及靶向间皮素的免疫效应细胞
CN106519037A (zh) 2015-09-11 2017-03-22 科济生物医药（上海）有限公司 可活化的嵌合受体
CN106554414A (zh) 2015-09-18 2017-04-05 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
CN107058354A (zh) 2013-04-01 2017-08-18 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN107106610A (zh) * 2014-10-20 2017-08-29 朱诺治疗学股份有限公司 用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法
WO2017165571A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Early intervention methods to prevent or ameliorate toxicity
CN107460201A (zh) 2013-05-08 2017-12-12 科济生物医药（上海）有限公司 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
WO2018006882A1 (zh) 2016-07-08 2018-01-11 科济生物医药（上海）有限公司 抗密蛋白18a2的抗体及其应用
CN107893052A (zh) * 2016-09-09 2018-04-10 科济生物医药（上海）有限公司 融合蛋白及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004006909A1 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Titan Pharmaceuticals, Inc. Combination of chemotherapeutic drugs for increasing antitumor activity
US20170335281A1 (en) * 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
CN107613993A (zh) * 2015-03-27 2018-01-19 南克维斯特公司 与癌症药物的联合治疗中的nk‑92细胞
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
CN108884459B (zh) * 2016-04-26 2024-04-02 科济生物医药（上海）有限公司 一种改善免疫应答细胞功能的方法
WO2019047932A1 (zh) * 2017-09-08 2019-03-14 科济生物医药（上海）有限公司 基因工程化的t细胞及应用

Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6040177A (en) 1994-08-31 2000-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center High efficiency transduction of T lymphocytes using rapid expansion methods ("REM")
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
WO2014055668A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
US9405601B2 (en) 2012-12-20 2016-08-02 Mitsubishi Electric Corporation In-vehicle apparatus and program
CN107058354A (zh) 2013-04-01 2017-08-18 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN107460201A (zh) 2013-05-08 2017-12-12 科济生物医药（上海）有限公司 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
WO2015172339A1 (zh) 2014-05-14 2015-11-19 科济生物医药（上海）有限公司 编码嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
CN105194661A (zh) 2014-06-26 2015-12-30 科济生物医药（上海）有限公司 时空可调性抑制病理性靶细胞的系统
CN105315375A (zh) 2014-07-17 2016-02-10 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN107106610A (zh) * 2014-10-20 2017-08-29 朱诺治疗学股份有限公司 用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法
CN105713881A (zh) 2014-12-04 2016-06-29 科济生物医药（上海）有限公司 双靶向gpc3和asgpr1的转基因免疫效应细胞及其应用
CN106146666A (zh) 2015-03-26 2016-11-23 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cldn6的免疫效应细胞及其制备方法和应用
WO2016191756A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 Adrian Bot Methods of conditioning patients for t cell therapy
CN106397593A (zh) 2015-08-03 2017-02-15 科济生物医药（上海）有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白多糖‑3的抗体及其应用
CN106467573A (zh) 2015-08-21 2017-03-01 科济生物医药（上海）有限公司 抗间皮素全人抗体以及靶向间皮素的免疫效应细胞
CN106519037A (zh) 2015-09-11 2017-03-22 科济生物医药（上海）有限公司 可活化的嵌合受体
CN106554414A (zh) 2015-09-18 2017-04-05 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
CN105331585A (zh) 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
WO2017165571A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Early intervention methods to prevent or ameliorate toxicity
WO2018006882A1 (zh) 2016-07-08 2018-01-11 科济生物医药（上海）有限公司 抗密蛋白18a2的抗体及其应用
CN107893052A (zh) * 2016-09-09 2018-04-10 科济生物医药（上海）有限公司 融合蛋白及其应用

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Genbank", Database accession no. NP 001002026
"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 1 May 2005, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1980, article "Remington's Pharmaceutical Sciences"
ALONSO-CAMINO ET AL., MOL THER NUCL ACIDS, vol. 2, 2013, pages e93
BRASH ET AL., MOL. CELL BIOL., vol. 7, 1987, pages 2031 - 2034
CARLENS ET AL., EXP HEMATOL, vol. 28, no. 10, 2000, pages 1137 - 46
CAVALIERI ET AL., BLOOD, vol. 102, no. 2, 2003, pages 1637 - 1644
CHICAYBAM ET AL., PLOS ONE, vol. 8, no. 3, 2013, pages e60298
FEDOROV ET AL., SCI. TRANSL. MEDICINE, vol. 5, December 2013 (2013-12-01), pages 215
GUIDO CAVALETTIPAOLA MARMIROLI, NATURE REVIEWS NEUROLOGY, vol. 6, December 2010 (2010-12-01), pages 657 - 666
HERMAN ET AL., J. IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 285, no. 1, 2004, pages 25 - 40
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning Experiment Guide", 2002, SCIENCE PRESS
JOHNSTON, NATURE, vol. 346, 1990, pages 776 - 777
KLEBANOFF ET AL., J IMMUNOTHER, vol. 35, no. 9, 2012, pages 651 - 660
KOCHENDERFER ET AL., J. IMMUNOTHERAPY, vol. 32, no. 7, 2009, pages 689 - 702
KOSTE ET AL., GENE THERAPY, 3 April 2014 (2014-04-03)
LUPTON S.D. ET AL., MOL. AND CELL BIOL., vol. 11, 1991, pages 6
MANURI ET AL., HUM GENE THER, vol. 21, no. 4, 2010, pages 427 - 437
MULLEN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 89, 1992, pages 33
PARK ET AL., TRENDS BIOTECHNOL, vol. 29, no. 11, November 2011 (2011-11-01), pages 550 - 557
RIDDELL ET AL., HUMAN GENE THERAPY, vol. 3, 1992, pages 319 - 338
See also references of EP3778649A4
SHARMA ET AL., MOLEC THER NUCL ACIDS, vol. 2, 2013, pages e74
SWARTS ET AL.: "Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy", CANCER RES, vol. 72, 2012, pages 2473 - 2480
TERAKURA ET AL., BLOOD, vol. 1, 2012, pages 72 - 82
VAN TEDELOO ET AL., GENE THERAPY, vol. 7, no. 16, 2000, pages 1431 - 1437
VERHOEYEN ET AL., METHODS MOL BIOL, vol. 506, 2009, pages 115 - 126
WANG ET AL., J. IMMUNOTHER., vol. 35, no. 9, 2012, pages 689 - 701
WIGLER ET AL., CELL, vol. 11, 1977, pages 223

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021088927A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Lanova Medicines Limited Company Antibody-drug conjugates targeting claudin 18.2
US11554177B2 (en) 2019-11-05 2023-01-17 Lanova Medicines Limited Company Antibody-drug conjugates targeting human Claudin 18.2
WO2022028623A1 (zh) 2020-08-07 2022-02-10 佧珐药业有限公司 工程化改造的细胞以及工程化改造细胞的方法
WO2022214089A1 (zh) 2021-04-08 2022-10-13 克莱格医学有限公司 细胞免疫治疗的应用
WO2023274303A1 (zh) 2021-06-29 2023-01-05 科济生物医药（上海）有限公司 调控细胞生理活动的嵌合多肽
WO2023078386A1 (zh) * 2021-11-05 2023-05-11 正大天晴药业集团股份有限公司 抗cldn18.2抗体及其用途

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