WO2019168118A1 - マイクロ流路デバイス - Google Patents

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WO2019168118A1
WO2019168118A1 PCT/JP2019/007907 JP2019007907W WO2019168118A1 WO 2019168118 A1 WO2019168118 A1 WO 2019168118A1 JP 2019007907 W JP2019007907 W JP 2019007907W WO 2019168118 A1 WO2019168118 A1 WO 2019168118A1
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microchannel
flow path
reinforcing member
porous film
channel
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PCT/JP2019/007907
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隼人 三好
晃寿 伊藤
孝浩 大場
彰 若林
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富士フイルム株式会社
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Definitions

  • This disclosure relates to a microchannel device.
  • microchannel device A device having a micrometer order width channel called a microchannel (hereinafter referred to as “microchannel device”) is known.
  • microchannel device discloses an organ mimic device having a first central microchannel and a second microchannel partitioned by a porous membrane as a microchannel device.
  • the central portion of the upper first central microchannel and the lower second central microchannel overlap in the plan view, and the inlet port and the outlet port are separated from each other.
  • a step portion is formed at a joining portion where the first center microchannel and the lower second center microchannel join in plan view.
  • a cell suspension is allowed to flow through the first microchannel to form a cell layer on the surface of the porous membrane.
  • the porous membrane is bent by the fluid pressure of the cell suspension, so that a gap is generated between the stepped portion and the porous membrane.
  • a test solution for example, a liquid containing a blood diluent, a tracer such as FITC-microbead
  • the present disclosure suppresses the formation of a gap between the step formed between the first microchannel and the second microchannel and the porous membrane, and cells, red blood cells, or tracers flow into the gap.
  • a microchannel device capable of suppressing this.
  • the microchannel device is formed in the first microchannel and the second channel member formed in the first channel member, and at least a part of the microchannel device in the plan view is the first microchannel device.
  • a second micro-channel having a step formed between the first micro-channel and the first micro-channel, and a plurality of holes penetrating in the thickness direction.
  • a porous membrane disposed between the path members and partitioning the first microchannel and the second microchannel, and provided between the first channel member or the second channel member and the porous membrane, and more rigid than the porous membrane And a reinforcing member that reinforces at least a portion facing the step portion of the porous film.
  • the step is formed between the first microchannel and the second microchannel, and the portion facing the step of the porous film is reinforced by the reinforcing member. For this reason, when the cell suspension is caused to flow through the first microchannel or the second microchannel to form a cell layer on the surface of the porous membrane, the porous membrane is bent by the fluid pressure of the cell suspension and the step portion It can suppress that a clearance gap produces between a porous membrane and a cell, and can suppress that a cell flows into this clearance gap.
  • the porous film is bent by the liquid pressure of the test liquid, and a gap is generated between the step portion and the porous film. It is possible to suppress red blood cells or tracers from flowing into this gap.
  • the microchannel device according to the second aspect of the present disclosure is the microchannel device according to the first aspect, wherein the first microchannel and the second microchannel are partially separated in plan view, and the step portion Are formed at the junction where the first microchannel and the second microchannel merge in plan view.
  • the porous film is reinforced with the reinforcing member, whereby the step portion and the porous film are It can suppress that a clearance gap arises between them.
  • the microchannel device according to the third aspect of the present disclosure is the microchannel device according to the first aspect, in which the width of the first microchannel is narrower than the width of the second microchannel, and the stepped portion is the first microchannel device. It is formed by the difference in width between the channel and the second micro channel.
  • the gap is formed between the step portion and the porous membrane by reinforcing the porous membrane with the reinforcing member. It is possible to suppress the occurrence.
  • the microchannel device is the microchannel device according to any one of the first to third aspects, wherein the reinforcing member is sized to cover the entire porous membrane, In the part where the membrane faces the first microchannel or the second microchannel, a slit is formed in the reinforcing member.
  • the porous membrane can be further reinforced by covering the entire porous membrane with the reinforcing member. Further, by forming a slit in the reinforcing member, when the cell, red blood cell, or tracer moves between the first micro flow channel and the second micro flow channel through the porous film, the cell, red blood cell, or tracer Can be prevented from being inhibited by the reinforcing member.
  • the microchannel device according to the fifth aspect of the present disclosure is the microchannel device according to the fourth aspect, wherein the width of the slit of the reinforcing member is equal to or less than the width of the first microchannel and the second microchannel. Yes.
  • the width of the slit of the reinforcing member is equal to or less than the width of the first microchannel and the second microchannel. For this reason, compared with the case where the width
  • the microchannel device according to the sixth aspect of the present disclosure is the microchannel device according to any one of the first to fifth aspects, wherein the reinforcing member is a membrane member made of polyethylene terephthalate.
  • the reinforcing member is a membrane member made of polyethylene terephthalate that hardly influences cell culture
  • the components contained in the reinforcing member are cells in the first microchannel or the second microchannel. Etc. can be suppressed.
  • the microchannel device according to the seventh aspect of the present disclosure is the microchannel device according to any one of the first to fifth aspects, wherein the reinforcing member is a membrane member made of polypropylene.
  • the reinforcing member is a membrane member made of polypropylene that does not easily affect cell culture
  • the components contained in the reinforcing member are cells in the first microchannel or the second microchannel. Can be suppressed.
  • the microchannel device according to the eighth aspect of the present disclosure is the microchannel device according to any one of the first to seventh aspects, wherein the thickness of the reinforcing member is 12 ⁇ m or more.
  • the rigidity of the reinforcing member can be increased by setting the thickness of the reinforcing member made of polyethylene terephthalate to 12 ⁇ m or more compared to the configuration in which the thickness of the reinforcing member is less than 12 ⁇ m.
  • the porous film can be reinforced more strongly by the reinforcing member.
  • the microchannel device according to the ninth aspect of the present disclosure is the microchannel device according to any one of the first to eighth aspects, wherein the thickness of the reinforcing member is the first microchannel and the second microchannel. It is thinner than the depth of the flow path.
  • the thickness of the reinforcing member is made thinner than the depth of the first microchannel and the second microchannel. For this reason, compared with the case where the thickness of the reinforcing member is larger than the depth of the first microchannel and the second microchannel, the cell suspension is made to flow through the first microchannel or the second microchannel.
  • the cell layer is formed on the surface of the membrane, it is possible to suppress inhibition of cell seeding on the porous membrane by the reinforcing member.
  • a gap from being formed between the step portion formed between the first microchannel and the second microchannel and the porous membrane, and a cell, a red blood cell, or a tracer is formed in the gap. Can be prevented from flowing in.
  • FIG. 4 is a sectional view taken along line AA in FIG. 3.
  • FIG. 4 is a sectional view taken along line BB in FIG. 3.
  • FIG. 7 is a sectional view taken along line CC in FIG. 6. It is a disassembled perspective view which shows the whole structure of the microchannel device in 2nd Embodiment.
  • FIG. 10B is a sectional view taken along line DD in FIG. 10A. It is an enlarged plan view which shows the state which poured the cell suspension into the microchannel device of the comparative example.
  • FIG. 11B is a sectional view taken along line EE in FIG. 11A.
  • the microchannel device 10 of the present embodiment includes a channel unit 16 including a first channel member 12 and a second channel member 14 stacked in the thickness direction. ing.
  • the first flow path member 12 is made of a transparent material having elasticity such as PDMS (polydimethylsiloxane) as an example, and the second flow path member 14 has rigidity such as COP (cycloolefin polymer) as an example. It is preferable to be comprised with the transparent material which has.
  • epoxy-type resin epoxy-type resin
  • urethane-type resin urethane-type resin
  • styrene-type thermoplasticity examples thereof include elastomers, olefinic thermoplastic elastomers, acrylic thermoplastic elastomers, and polyvinyl alcohol.
  • a first microchannel 18 is formed on the lower surface of the first channel member 12, that is, the surface 12 ⁇ / b> A facing the second channel member 14.
  • the first microchannel 18 has an inlet 18A, an outlet 18B, and a channel 18C that communicates the inlet 18A and the outlet 18B and extends substantially linearly.
  • the second micro-channel 20 is formed on the upper surface of the second channel member 14, that is, the surface 14A facing the first channel member 12.
  • the second microchannel 20 has an inflow port 20A, an outflow port 20B, and a channel portion 20C that communicates the inflow port 20A and the outflow port 20B and extends substantially linearly.
  • the inlet 18A and the outlet 18B of the first microchannel 18 are provided at positions separated from the inlet 20A and the outlet 20B of the second microchannel 20 in plan view.
  • the channel portion 18C of the first microchannel 18 is provided at a position overlapping the channel portion 20C of the second microchannel 20 in plan view.
  • the merged portion of the first microchannel 18 and the second microchannel 20, that is, between the inlets 18 ⁇ / b> A and 20 ⁇ / b> A and the channels 18 ⁇ / b> C and 20 ⁇ / b> C, and the flow Step portions 22 are respectively formed between the outlets 18B and 20B and the flow path portions 18C and 20C.
  • the width of the flow path portion 18C of the first micro flow path 18 is narrower than the width of the flow path section 20C of the second micro flow path 20, and the flow path section 18C.
  • the step portion 24 is formed by the difference in the width of the flow path portion 20C.
  • the first channel member 12 penetrates the first channel member 12 in the thickness direction, and the lower end communicates with the inlet 18A and the outlet 18B of the first microchannel 18. Holes 26A and 26B and through holes 28A and 28B whose lower ends communicate with the inlet 20A and the outlet 20B of the second microchannel 20 are formed, respectively.
  • a holding plate 30 having a size covering the entire upper surface of the first flow path member 12 is provided on the upper side of the first flow path member 12.
  • a plurality (eight in this embodiment) of bolt holes 32 penetrating in the thickness direction are formed at positions corresponding to each other of the holding plate 30 and the second flow path member 14.
  • a recess 34 is formed on the outer peripheral surface of the first flow path member 12 at a position corresponding to the bolt hole 32, and the holding plate 30 and the second flow are formed outside the recess 34 of the flow path unit 16.
  • a plurality (eight in this embodiment) of spacers 36 that define the distance from the path member 14 are provided.
  • the spacer 36 is a cylindrical member having an inner diameter that is substantially the same as the inner diameter of the bolt hole 32, and is disposed at a position corresponding to the bolt hole 32. Further, the holding plate 30 and the second flow path member 14 are joined together with a reinforcing member 54 described later by a plurality of bolts 40 inserted through the bolt holes 32 and the spacers 36 and fixed by the nuts 38.
  • the holding plate 30 is formed with through holes 42A, 42B, 44A, and 44B that communicate with the through holes 26A, 26B, 28A, and 28B of the first flow path member 12, respectively.
  • Tubes (not shown) are connected to the through holes 42A, 42B, 44A, and 44B, respectively, and a solution, a cell suspension, or the like flows into the first microchannel 18 and the second microchannel 20 through the tubes.
  • a solution, a cell suspension, or the like flows out from the 1 microchannel 18 and the second microchannel 20.
  • a porous film 46 is disposed between the facing surfaces 12A and 14A of the first flow path member 12 and the second flow path member 14.
  • the porous film 46 is made of a hydrophobic polymer that can be dissolved in a hydrophobic organic solvent.
  • the hydrophobic organic solvent is a liquid having a solubility in water of 25 ° C. of 10 (g / 100 g water) or less.
  • Hydrophobic polymers include polystyrene, polyacrylate, polymethacrylate, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinylidene fluoride, polyhexafluoropropene, polyvinyl ether, polyvinyl carbazole, polyvinyl acetate, polytetra Fluoroethylene, polyester (eg, polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, polyethylene succinate, polybutylene succinate, polylactic acid, poly-3-hydroxybutyrate, etc.), polylactone (eg, polycaprolactone, etc.), polyamide or polyimide (eg, , Nylon, polyamic acid, etc.), polyurethane, polyurea, polybutadiene, polycarbonate, polyaromatics, polysulfo , Polyethersulfone, polysiloxane derivatives, cellulose acylate (e.g., triacetyl
  • These polymers may be homopolymers, copolymers, polymer blends, or polymer alloys as necessary from the viewpoints of solubility in solvents, optical properties, electrical properties, film strength, elasticity, and the like. These polymers may be used alone or in combination of two or more.
  • the material of the porous film 46 is not limited to a hydrophobic polymer, and various materials can be selected from the viewpoint of cell adhesiveness.
  • the upper surface 46A and the lower surface 46B of the porous film 46 are the channel portions of the first microchannel 18 and the second microchannel 20.
  • the first microchannel 18 and the second microchannel 20 are separated from each other.
  • the upper surface 46A of the porous film 46 faces the first microchannel 18, and the lower surface 46B of the porous film 46 faces the second microchannel 20.
  • a plurality of holes 48 penetrating in the thickness direction are formed in the porous film 46, and openings 48 ⁇ / b> A of the holes 48 are formed on the upper surface 46 ⁇ / b> A and the lower surface 46 ⁇ / b> B of the porous film 46, respectively.
  • the opening 48A has a circular shape in plan view.
  • the openings 48A are provided apart from each other, and a flat portion 50 extends between the adjacent openings 48A.
  • the opening 48A is not limited to a circular shape, and may be a polygonal shape or an elliptical shape.
  • the plurality of openings 48A are regularly arranged, and in this embodiment, as an example, the openings 48A are arranged in a honeycomb shape.
  • the honeycomb arrangement is an arrangement in which a parallel hexagon (preferably a regular hexagon) or a shape close thereto is used as a unit, and the center of the opening 48A is located at the intersection of a vertex and a diagonal line of these figures.
  • the “center of the opening” means the center of the opening 48A in plan view.
  • the arrangement of the openings 48A is not limited to a honeycomb shape, and may be a lattice shape or a face-centered lattice shape.
  • the grid-like arrangement is an arrangement in which a parallelogram (including, of course, a square, a rectangle, and a rhombus is included. Preferably, a square) or a shape close thereto is used as a unit, and the center of the opening is located at the apex of these figures. is there.
  • the face-centered lattice arrangement includes parallelograms (including, of course, squares, rectangles, and rhombuses, preferably squares) or a shape close to this, and an opening at the intersection of the vertices and diagonals of these figures. It is an arrangement where the center is located.
  • the hole 48 of the porous film 46 has a spherical base shape with the upper end and the lower end of the sphere cut off.
  • the adjacent holes 48 communicate with each other through the communication holes 52 inside the porous film 46.
  • one hole 48 communicates with all adjacent holes 48.
  • one hole 48 is The six communication holes 52 communicate with the six adjacent holes 48 respectively.
  • the hole 48 may have a barrel shape, a cylindrical shape, a polygonal column shape, or the like, and the communication hole 52 may be a cylindrical gap that connects adjacent holes 48.
  • the cells on the main surface of the porous membrane 46 are seeded with fibronectin, collagen (for example, type I collagen, type IV collagen, or type V collagen), laminin, vitronectin, gelatin, perlecan, nidogen, proteoglycan, It is preferably coated with at least one selected from the group consisting of osteopontin, tenascin, nephronectin, basement membrane matrix and polylysine. Moreover, it is preferable that the pores 48 of the porous film 46 are also covered with at least one of these. By covering the porous film 46, it becomes possible to enhance the adhesion of cells.
  • the porous membrane 46 is a scaffold in which cells adhere and proliferate.
  • At least one of cell-cell interaction with cells that is, information transmission by humoral factors and cell-cell contact is activated.
  • the cell-cell interaction in the cell culture on the main surface of the porous membrane 46 becomes more active, it becomes possible to manufacture a model having a function that approximates the tissue in the living body.
  • Examples of a method for producing the porous film 46 in which the holes 48 are formed include an etching method, a sand blasting method, a press molding method and the like in addition to a nanoprinting method and a dew condensation method.
  • the nanoprint method is a method for producing the holes 48 by pouring a material constituting the porous film 46 into a mold having an uneven shape, or pressing the mold against the material constituting the porous film 46.
  • the dew condensation method is a method in which the surface of the material constituting the porous film 46 is dewed and the holes 48 are formed by using water droplets as a mold.
  • the dew condensation method can reduce the film thickness of the porous film 46 and increase the porosity and the opening ratio of the opening 48A.
  • the communication hole 52 can be provided.
  • the porous film 46 is produced by the dew condensation method. Details of the condensation method are described in, for example, Japanese Patent No. 4945281, Japanese Patent No. 5422230, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-74140, and Japanese Patent No. 5405374.
  • a reinforcing member 54 having higher rigidity than the porous film 46 is disposed between the porous film 46 and the facing surface 14A of the second flow path member 14.
  • the reinforcing member 54 is a film member made of polyethylene terephthalate, and has a size covering the entire porous film 46.
  • the reinforcing member 54 has substantially the same size as the facing surface 14 ⁇ / b> A of the second flow path member 14, and is between the first micro flow path 18 and the second micro flow path 20 in the porous film 46. The portions facing the formed step portions 22 and 24 are covered.
  • the thickness of the reinforcing member 54 is preferably 12 ⁇ m or more and thinner than the depth of the first microchannel 18 or the second microchannel 20, and specifically, the thickness of the reinforcing member 54 is More preferably, it is 12 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, and further preferably 12 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the rigidity of the reinforcing member 54 can be evaluated by measuring the deformation amount of the reinforcing member 54 when a steel ball is placed on the reinforcing member 54. Specifically, a 3 mm thick SUS (stainless steel) plate with a 50 mm hole was prepared, and four sides of a 70 mm square reinforcing member 54 were fixed on the plate with double-sided tape (Nitto Denko No. 5000NS). To do.
  • a steel ball having a diameter of 11 mm and a weight of 5.5 g is placed on the central portion of the hole from above the reinforcing member 54, and the amount of deformation of the reinforcing member 54 in the downward direction at the central portion of the hole is measured by a laser displacement meter. (Measured by KEYENCE LK-G85) from below the plate.
  • the deformation amount of the reinforcing member 54 is preferably 3 mm or less, preferably 1 mm or less. Is more preferable.
  • the reinforcing member 54 only needs to be higher in rigidity than at least the porous film 46, and may be made of a material that hardly affects cell culture.
  • materials that hardly affect cell culture include polyethylene terephthalate, silicone materials such as PDMS (polydimethylsiloxane), polystyrene, PEN (polyethylene naphthalate), polypropylene, COP (cycloolefin polymer), PE ( Polyethylene).
  • the required thickness of the reinforcing member 54 is also appropriately determined depending on the material of the reinforcing member 54.
  • a plurality (eight in this embodiment) of bolt holes 56 are formed at positions corresponding to the bolt holes 32 of the second flow path member 14 in the reinforcing member 54. Are joined to the holding plate 30 and the second flow path member 14 by bolts 40.
  • through holes 57 are formed at positions corresponding to the inlet 20A and the outlet 20B of the second microchannel 20 in the reinforcing member 54, respectively.
  • a slit 58 is formed in the reinforcing member 54 at a portion where the porous film 46 faces the first microchannel 18 and the second microchannel 20. Specifically, as shown in FIG. 3, the slit 58 is provided at a position that overlaps the channel portion 18C of the first microchannel 18 and the channel portion 20C of the second microchannel 20 in plan view.
  • the width of the slit 58 is substantially the same as the width of the channel portion 18C of the first microchannel 18.
  • the width of the slit 58 may be at least equal to or smaller than the width of the channel portion 18C of the first microchannel 18.
  • the step portion 22 is formed at the joining portion of the first microchannel 18 and the second microchannel 20, and the channel portion 18C of the first microchannel 18 and the second microchannel 18
  • a step portion 24 is formed by the difference in the width of the flow path portion 20 ⁇ / b> C of the path 20.
  • the portions of the porous film 46 facing the step portions 22 and 24 are reinforced by being covered with the reinforcing member 54.
  • the reinforcing member 54 can suppress the porous film 46 from being bent toward the second microchannel 20 side. Thereby, it can suppress that a clearance gap produces between the step parts 22 and 24 and the porous membrane 46, and can suppress that a cell flows into this clearance gap.
  • the porous film is compared with a configuration in which the reinforcing member 54 is sized to cover only a part of the porous film 46. 46 can be further reinforced.
  • a slit 58 is formed in the reinforcing member 54 at a portion where the porous film 46 faces the first microchannel 18 and the second microchannel 20. For this reason, for example, when conducting a permeability test of cells, red blood cells, or a tracer, the gap between the first microchannel 18 and the second microchannel 20 via the slit 58 and the porous film 46 of the reinforcing member 54 is used. The cell, red blood cell, or tracer can move, and the movement of the cell, red blood cell, or tracer can be prevented from being inhibited by the reinforcing member 54.
  • the width of the slit 58 of the reinforcing member 54 is substantially the same as the width of the flow path portion 18C of the first micro flow path 18. For this reason, compared with the case where the width
  • the reinforcing member 54 is a membrane member made of polyethylene terephthalate or the like having biocompatibility. For this reason, it can suppress that the component contained in the reinforcement member 54 affects the cell etc. in the 1st microchannel 18 or the 2nd microchannel 20.
  • the thickness of the reinforcing member 54 is 12 ⁇ m or more, and is thinner than the depth of the first microchannel 18 or the second microchannel 20. For this reason, the rigidity of the reinforcing member 54 can be increased as compared with the configuration in which the thickness of the reinforcing member 54 is less than 12 ⁇ m, and the porous film 46 can be reinforced more strongly by the reinforcing member 54.
  • the cell suspension is added to the first microchannel 18 or the second microchannel 20.
  • the cell layer is formed on the surface of the porous membrane 46 by flowing the gas, it is possible to suppress inhibition of the seeding of cells on the porous membrane 46 by the reinforcing member 54.
  • the microchannel device 60 of the present embodiment is similar to the microchannel device 10 of the first embodiment in that the first channel member 62 in which the first microchannel 68 is formed and the first channel member 62 are formed. And a second flow path member 64 in which two micro flow paths 70 are formed.
  • the first micro flow path 68 and the second micro flow path 70 are partitioned by the porous film 46. Similarly to the first embodiment, the inlets 68A and 70A, the outlets 68B and 70B, and the inlets 68A and 70A The flow outlets 68B and 70B communicate with each other and have flow path portions 68C and 70C that extend substantially linearly, respectively.
  • the inlet 68A and the outlet 68B of the first microchannel 68 are provided at positions separated from the inlet 70A and the outlet 70B of the second microchannel 70 in plan view. Further, the channel portion 68C of the first microchannel 68 is provided at a position overlapping the channel portion 70C of the second microchannel 70 in plan view.
  • the merged portion of the first microchannel 68 and the second microchannel 70 that is, between the inlets 68A and 70A and the channel portions 68C and 70C, and the outlets 68B and 70B and the channel portion 68C, Step portions 72 are respectively formed between 70C and 70C.
  • the width of the channel portion 68C of the first microchannel 68 and the width of the channel portion 70C of the second microchannel 70 are substantially the same size.
  • a pair of reinforcing members 74 having higher rigidity than the porous film 46 are disposed between the porous film 46 and the facing surface 64A of the second flow path member 64.
  • the pair of reinforcing members 74 is, for example, a rectangular film member made of polyethylene terephthalate or the like, and the thickness of the pair of reinforcing members 74 is 12 ⁇ m or more, and the first microchannel 18 and the second microstream It is thinner than the depth of the path 20.
  • the pair of reinforcing members 74 are sized to cover portions of the porous film 46 facing the stepped portion 72 formed between the first microchannel 68 and the second microchannel 70. Further, the pair of reinforcing members 74 are arranged with a space therebetween, and the channel portion 68C of the first microchannel 68 and the channel portion 70C of the second microchannel 70 are disposed between the pair of reinforcing members 74. positioned.
  • the stepped portion 72 is formed at the joining portion of the first microchannel 68 and the second microchannel 70, and the portion facing the stepped portion 72 of the porous membrane 46 is a pair of reinforcements.
  • Each member 74 is reinforced by being covered.
  • the reinforcing member 74 can suppress the porous film 46 from being bent toward the second microchannel 70 side. Thereby, it can suppress that a clearance gap produces between the step part 72 and the porous membrane 46, and can suppress that a cell, a red blood cell, or a tracer flows into this clearance gap.
  • the pair of reinforcing members 74 are disposed with a space therebetween, and the channel portion 68C of the first microchannel 68 and the second microchannel are interposed between the pair of reinforcing members 74. 70 channel portions 70C are located. For this reason, for example, when performing a permeability test of cells, red blood cells, or tracers, the movement of the cells, red blood cells, or tracers between the first micro flow path 68 and the second micro flow path 70 is caused by the reinforcing member 74. Inhibition can be suppressed.
  • the reinforcing members 54 and 74 are provided between the porous film 46 and the opposed surfaces 14A and 64A of the second flow path members 14 and 64, but the reinforcing members 54 and 74 are
  • the first flow path members 12 and 62 may be provided between the facing surfaces 12A and 62A and the porous film 46.
  • the holding plate 30 is provided above the first flow path members 12 and 62, and the holding plate 30 and the second flow path members 14 and 64 are joined by the bolts 40. .
  • the holding plate 30 may not be provided, and the first flow path members 12 and 62 and the second flow path members 14 and 64 are joined to each other by adhesion, welding, adsorption (self-adsorption), or the like. Also good.
  • a membrane member made of polycarbonate having pores arranged in a honeycomb shape was prepared as a porous membrane.
  • the porous membrane was coated with collagen, sterilized paper was pasted on both sides of the porous membrane.
  • the sterilized paper on the lower surface of the porous film is peeled off with tweezers, the porous film is placed on the second flow path member on which the second micro flow path is formed, and the porous film and the second flow path member are joined. did.
  • the sterilized paper on the upper surface of the porous film is peeled off with tweezers, the first flow path member and the second flow path member are aligned while confirming the microscope, and the first flow path member in which the first micro flow path is formed was placed on the porous membrane to join the porous membrane and the first flow path member.
  • a holding plate was placed on top of the first flow path member, and the holding plate and the second flow path member were tightened with bolts and nuts via a spacer, thereby producing a basic micro flow path device.
  • the width and depth of the first microchannel of the microchannel device are 200 ⁇ m, and the width and depth of the second microchannel are 400 ⁇ m.
  • Example 1 a microchannel device having the same configuration as that of the first embodiment described above was manufactured. Specifically, a microchannel device is produced in which a membrane member made of polypropylene having a slit formed in the center as a reinforcing member is sandwiched between the porous membrane of the microchannel device as a base and the second channel member. did.
  • the size of the reinforcing member is substantially the same as the opposing surface (main surface) of the second flow path member, the thickness of the reinforcing member is 100 ⁇ m, and the rigidity of the reinforcing member is the above steel ball.
  • the deformation amount is 0.5 mm by the evaluation method used.
  • Example 2 a microchannel device having the same configuration as that of the second embodiment described above was manufactured. Specifically, a microchannel device in which a pair of membrane members made of polyethylene terephthalate as a reinforcing member was sandwiched between the porous membrane of the microchannel device as a base and the second channel member was produced. The size of the reinforcing member is 3 mm square, the thickness of the reinforcing member is 12 ⁇ m, and the rigidity of the reinforcing member is 1 mm by the evaluation method using the steel balls described above. ing. In addition, the reinforcing member is disposed at the joining portion of the first microchannel and the second microchannel.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, the reinforcing member was not disposed, and the microchannel device as a base was used as it was.
  • Comparative Example 2 In Comparative Example 2, a microchannel device in which a pair of membrane members made of polyethylene terephthalate as a reinforcing member was sandwiched between the porous membrane of the microchannel device serving as a base and the second channel member was produced.
  • the size of the reinforcing members is 3 mm square, and the thickness of the reinforcing members is 2 ⁇ m.
  • the reinforcing member is disposed at the joining portion of the first microchannel and the second microchannel.
  • a suspension of iPS cell-derived vascular endothelial cells (CDI iCell EC) stained with CellTracker Orange (ThermoFischer) was prepared at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and 200 ⁇ L of the suspension was Injection into the first microchannel.
  • Example 1 the distribution of iPS cell-derived vascular endothelial cells injected into the first microchannel was observed using a fluorescence microscope, respectively. did.
  • FIGS. 10A and 10B The observation results of Example 1 are shown in FIGS. 10A and 10B, and the observation results of Comparative Example 1 are shown in FIGS. 11A and 11B.
  • FIGS. 10A, 10B, 11A, and 11B only iPS cell-derived vascular endothelial cells are illustrated.
  • Example 1 As shown in FIGS. 10A and 10B, it was confirmed that iPS cell-derived vascular endothelial cells S remained in the first microchannel.
  • Comparative Example 1 As shown in FIGS. 11A and 11B, a part of iPS cell-derived vascular endothelial cell S is located in the second microchannel, so that it is as if iPS cell-derived vascular endothelial cell. It was confirmed that S seemed to leak into the second microchannel.
  • Example 2 iPS cell-derived vascular endothelial cells S remained in the first microchannel, whereas in Comparative Example 2, a part of iPS cell-derived vascular endothelial cells S was present. It was confirmed that the iPS cell-derived vascular endothelial cells S located in the second microchannel seemed to leak into the second microchannel.

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Abstract

第１流路部材に形成された第１マイクロ流路と、第２流路部材に形成され、平面視で少なくとも一部が前記第１マイクロ流路に重なり、かつ、前記第１マイクロ流路との間に段部が形成された第２マイクロ流路と、厚さ方向に貫通する複数の孔を有し、前記第１流路部材と前記第２流路部材の間に配置されて前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路を仕切る多孔膜と、前記第１流路部材又は前記第２流路部材と前記多孔膜との間に設けられ、前記多孔膜より剛性が高く、前記多孔膜の少なくとも前記段部に面する部分を補強する補強部材と、を有するマイクロ流路デバイス、が提供される。

Description

マイクロ流路デバイス
　本開示は、マイクロ流路デバイスに関する。
　マイクロ流路と呼ばれるマイクロメートルオーダーの幅の流路を有するデバイス（以下、「マイクロ流路デバイス」と呼ぶ。）が知られている。例えば特許第５４１５５３８号公報には、マイクロ流路デバイスとして、多孔質膜で仕切られた第一中央マイクロチャネル及び第二マイクロチャネルを有する臓器模倣装置が開示されている。
特許第５４１５５３８号公報
　特許第５４１５５３８号公報に開示されている臓器模倣装置において、上側の第一中央マイクロチャネルと下側の第二中央マイクロチャネルは、平面視で中央部分が重なり、かつ、入口ポート及び出口ポートが離間しており、第一中央マイクロチャネルと下側の第二中央マイクロチャネルが平面視で合流する合流部分に段部が形成されている。
　第一中央マイクロチャネルと下側の第二中央マイクロチャネルとの間に段部が形成されていることにより、例えば第１マイクロチャネルに細胞懸濁液を流して多孔質膜の表面に細胞層を形成する際に、細胞懸濁液の液圧によって多孔質膜が撓むことで段部と多孔質膜との間に隙間が生じる。また、細胞層の形成後にも同様に、第一中央マイクロチャネルに試験液（例えば血液希釈液、ＦＩＴＣ－マイクロビーズ等のトレーサーを含む液体）を流して試験を行う際に、試験液の液圧によって段部と多孔質膜との間に隙間が生じる。
　このとき、段部と多孔質膜との間の隙間に細胞懸濁液中の細胞、又は試験液中の赤血球、トレーサーが流れ込んで挟まり、細胞層、赤血球、又はトレーサーの一部が下側の第二中央マイクロチャネル内に位置してしまう虞がある。この場合、臓器模倣装置を用いて例えば細胞、赤血球、又はトレーサーの透過性試験を行う際、隙間に挟まった細胞、赤血球、又はトレーサーがあたかも第一中央マイクロチャネルから多孔質膜を通って第二中央マイクロチャネルへ漏れ出たように見えるため、透過性試験を正確に行うことが難しかった。
　本開示は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に形成された段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制し、この隙間に細胞、赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができるマイクロ流路デバイスを提供する。
　本開示の第１態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１流路部材に形成された第１マイクロ流路と、第２流路部材に形成され、平面視で少なくとも一部が第１マイクロ流路に重なり、かつ、第１マイクロ流路との間に段部が形成された第２マイクロ流路と、厚さ方向に貫通する複数の孔を有し、第１流路部材と第２流路部材の間に配置されて第１マイクロ流路と第２マイクロ流路を仕切る多孔膜と、第１流路部材又は第２流路部材と多孔膜との間に設けられ、多孔膜より剛性が高く、多孔膜の少なくとも段部に面する部分を補強する補強部材と、を有する。
　上記構成によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に段部が形成されており、多孔膜の段部に面する部分が補強部材によって補強されている。このため、第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に細胞懸濁液を流して多孔膜の表面に細胞層を形成する際に、細胞懸濁液の液圧によって多孔膜が撓んで段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に細胞が流れ込むことを抑制することができる。
　同様に、第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に試験液を流して試験を行う際に、試験液の液圧によって多孔膜が撓んで段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができる。
　本開示の第２態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路は平面視で一部が離間しており、段部は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路が平面視で合流する合流部分に形成されている。
　上記構成によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路が平面視で合流する合流部分に形成された段部において、多孔膜を補強部材で補強することによって段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができる。
　本開示の第３態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、第１マイクロ流路の幅は第２マイクロ流路の幅より狭く、段部は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の幅の差によって形成されている。
　上記構成によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の幅の差によって形成された段部において、多孔膜を補強部材で補強することによって段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制することができる。
　本開示の第４態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１～第３態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材は、多孔膜全体を覆う大きさとされており、多孔膜が第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に面する部分において、補強部材にはスリットが形成されている。
　上記構成によれば、補強部材によって多孔膜全体を覆うことで、多孔膜をより補強することができる。また、補強部材にスリットを形成することで、細胞、赤血球、又はトレーサーが多孔膜を介して第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間を移動する際に、細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材によって阻害されることを抑制することができる。
　本開示の第５態様に係るマイクロ流路デバイスは、第４態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材のスリットの幅は、第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の幅以下とされている。
　上記構成によれば、補強部材のスリットの幅が第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の幅以下とされている。このため、補強部材のスリットの幅が第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の幅より大きい場合と比較して、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に形成された段部と多孔膜との間に隙間ができることをより抑制することができる。
　本開示の第６態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１～第５態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材は、ポリエチレンテレフタレートから成る膜部材である。
　上記構成によれば、補強部材が細胞培養に影響を及ぼし難いポリエチレンテレフタレートから成る膜部材とされているため、補強部材に含まれる成分が第１マイクロ流路内又は第２マイクロ流路内の細胞等に影響を及ぼすことを抑制することができる。
　本開示の第７態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１～第５態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材は、ポリプロピレンから成る膜部材である。
　上記構成によれば、補強部材が細胞培養に影響を及ぼし難いポリプロピレンから成る膜部材とされているため、補強部材に含まれる成分が第１マイクロ流路内又は第２マイクロ流路内の細胞等に影響を及ぼすことを抑制することができる。
　本開示の第８態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１態様～第７態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材の厚さは１２μｍ以上とされている。
　上記構成によれば、ポリエチレンテレフタレートから成る補強部材の厚さを１２μｍ以上とすることで、補強部材の厚さが１２μｍ未満とされている構成と比較して、補強部材の剛性を高めることができ、補強部材によって多孔膜をより強固に補強することができる。
　本開示の第９態様に係るマイクロ流路デバイスは、第１～第８態様のいずれか１つの態様に係るマイクロ流路デバイスにおいて、補強部材の厚さは、第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の深さより薄くされている。
　上記構成によれば、補強部材の厚さが第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の深さより薄くされている。このため、補強部材の厚さが第１マイクロ流路及び第２マイクロ流路の深さより大きい場合と比較して、第１マイクロ流路又は第２マイクロ流路に細胞懸濁液を流して多孔膜の表面に細胞層を形成する際に、補強部材によって多孔膜への細胞の播種が阻害されることを抑制することができる。
　本開示によれば、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路との間に形成された段部と多孔膜との間に隙間が生じることを抑制し、この隙間に細胞、赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができる。
第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスの全体構造を示す斜視図である。 第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスの全体構造を示す分解斜視図である。 第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスを平面視した状態を示す透視図である。 図３におけるＡ－Ａ線断面図である。 図３におけるＢ－Ｂ線断面図である。 第１実施形態におけるマイクロ流路デバイスの多孔膜を示す平面図である。 図６におけるＣ－Ｃ線断面図である。 第２実施形態におけるマイクロ流路デバイスの全体構造を示す分解斜視図である。 第２実施形態におけるマイクロ流路デバイスを平面視した状態を示す透視図である。 実施例のマイクロ流路デバイスに細胞懸濁液を流した状態を示す拡大平面図である。 図１０ＡにおけるＤ－Ｄ線断面図である。 比較例のマイクロ流路デバイスに細胞懸濁液を流した状態を示す拡大平面図である。 図１１ＡにおけるＥ－Ｅ線断面図である。
（第１実施形態）
　以下、本開示の第１実施形態について図１～７を用いて説明する。なお、以下の実施形態は本開示を例示するものであり、本開示の範囲を制限するものではない。また、各構成の説明を容易にするため、図中の各構成の寸法を適宜変更している。このため、図中の縮尺は実際とは異なっている。
＜流路ユニット＞
　図１に示すように、本実施形態のマイクロ流路デバイス１０は、厚さ方向に積層された第１流路部材１２と第２流路部材１４とで構成された流路ユニット１６を有している。第１流路部材１２は、一例としてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の弾性を有する透明な材料で構成されており、第２流路部材１４は、一例としてＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等の剛性を有する透明な材料で構成されていることが好ましい。
　なお、第１流路部材１２及び第２流路部材１４を構成する材料としては、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）の他、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、スチレン系熱可塑性エラストマー、オレフィン系熱可塑性エラストマー、アクリル系熱可塑性エラストマー、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
　図２に示すように、第１流路部材１２の下面、すなわち第２流路部材１４との対向面１２Ａには、第１マイクロ流路１８が形成されている。第１マイクロ流路１８は、流入口１８Ａ、流出口１８Ｂ、及び流入口１８Ａと流出口１８Ｂとを連通し、略直線状に延びる流路部１８Ｃを有している。
　同様に、第２流路部材１４の上面、すなわち第１流路部材１２との対向面１４Ａには、第２マイクロ流路２０が形成されている。第２マイクロ流路２０は、流入口２０Ａ、流出口２０Ｂ、及び流入口２０Ａと流出口２０Ｂとを連通し、略直線状に延びる流路部２０Ｃを有している。
　ここで、図３に示すように、第１マイクロ流路１８の流入口１８Ａ及び流出口１８Ｂは、第２マイクロ流路２０の流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂと平面視で離間した位置に設けられている。一方、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃは、第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃと平面視で重なる位置に設けられている。
　これにより、図３、図４に示すように、第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との合流部分、すなわち流入口１８Ａ、２０Ａと流路部１８Ｃ、２０Ｃとの間、及び流出口１８Ｂ、２０Ｂと流路部１８Ｃ、２０Ｃとの間に段部２２がそれぞれ形成されている。
　また、図３、図５に示すように、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅は、第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃの幅より狭くなっており、流路部１８Ｃと流路部２０Ｃの幅の差によって段部２４が形成されている。
　図２に示すように、第１流路部材１２には、第１流路部材１２を厚さ方向に貫通し、下端が第１マイクロ流路１８の流入口１８Ａ及び流出口１８Ｂに連通する貫通孔２６Ａ、２６Ｂと、下端が第２マイクロ流路２０の流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂに連通する貫通孔２８Ａ、２８Ｂと、がそれぞれ形成されている。
　また、第１流路部材１２の上側には、第１流路部材１２の上面全体を覆う大きさの保持プレート３０が設けられている。保持プレート３０及び第２流路部材１４の互いに対応する位置には、厚さ方向に貫通する複数（本実施形態では８つ）のボルト孔３２がそれぞれ形成されている。
　一方、第１流路部材１２の外周面には、ボルト孔３２に対応する位置に凹部３４がそれぞれ形成されており、流路ユニット１６の凹部３４の外側には、保持プレート３０と第２流路部材１４との間隔を規定する複数（本実施形態では８つ）のスペーサ３６がそれぞれ設けられている。
　スペーサ３６は、内径がボルト孔３２の内径と略同じ大きさとされた円筒形状の部材であり、ボルト孔３２に対応する位置にそれぞれ配置されている。また、保持プレート３０と第２流路部材１４は、ボルト孔３２及びスペーサ３６に挿通されてナット３８で固定された複数のボルト４０により、後述する補強部材５４とともに接合されている。
　なお、保持プレート３０には、第１流路部材１２の貫通孔２６Ａ、２６Ｂ、２８Ａ、２８Ｂにそれぞれ連通する貫通孔４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂがそれぞれ形成されている。貫通孔４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂには、図示しないチューブがそれぞれ接続されており、チューブを通して第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０に溶液や細胞懸濁液等が流入し、第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０から溶液や細胞懸濁液等が流出する。
＜多孔膜＞
　第１流路部材１２及び第２流路部材１４の対向面１２Ａ、１４Ａ間には、多孔膜４６が配置されている。多孔膜４６は、一例として疎水性の有機溶媒に溶解可能な疎水性ポリマーから成る。なお、疎水性の有機溶媒は、２５℃の水に対する溶解度が１０（ｇ／１００ｇ水）以下の液体である。
　疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸、ポリ－３－ヒドロキシブチレート等）、ポリラクトン(例えば、ポリカプロラクトン等)、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロン、ポリアミド酸等）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、セルロースアシレート（例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート）などのポリマーが挙げられる。
　これらのポリマーは、溶剤への溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンド又はポリマーアロイとしてよい。また、これらのポリマーは、１種単独で又は２種以上を混合して使用してよい。なお、多孔膜４６の素材は疎水性ポリマーには限られず、細胞の接着性の観点等から種々の素材を選択することが可能である。
　多孔膜４６の上面４６Ａ及び下面４６Ｂ（以下、上面４６Ａ及び下面４６Ｂを合わせて「主面」と呼ぶことがある。）は、第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０の流路部１８Ｃ、２０Ｃを略覆う大きさとされており、第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０とを仕切っている。具体的には、多孔膜４６の上面４６Ａが第１マイクロ流路１８に面しており、多孔膜４６の下面４６Ｂが第２マイクロ流路２０に面している。
　図６、図７に示すように、多孔膜４６には、厚さ方向に貫通する複数の孔４８が形成されており、多孔膜４６の上面４６Ａ及び下面４６Ｂには孔４８の開口４８Ａがそれぞれ設けられている。また、図６に示すように、開口４８Ａは平面視で円形状とされている。開口４８Ａ同士は互いに離間して設けられており、隣合う開口４８Ａの間には平坦部５０が延在している。なお、開口４８Ａは円形状には限られず、多角形状や楕円形状とされていてもよい。
　複数の開口４８Ａは規則的に配置されており、本実施形態では一例として、ハニカム状に配置されている。ハニカム状の配置とは、平行六辺形（好ましくは正六角形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口４８Ａの中心が位置する配置である。ここで「開口の中心」とは、開口４８Ａの平面視における中心を意味する。
　なお、開口４８Ａの配置はハニカム状に限られず、格子状又は面心格子状とされていてもよい。格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点に開口の中心が位置する配置である。面心格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口の中心が位置する配置である。
　図７に示すように、多孔膜４６の孔４８は球体の上端及び下端を切り取った球台形状とされている。また、互いに隣合う孔４８同士は、多孔膜４６の内部において連通孔５２によって連通している。
　１つの孔４８は、隣合う全部の孔４８と連通していることが好ましく、本実施形態のように複数の孔４８の開口４８Ａがハニカム状に配置されている場合、１つの孔４８は、６つの連通孔５２によって隣合う６つの孔４８とそれぞれ連通している。なお、孔４８はバレル形状や円柱形状、又は多角柱形状等とされていてもよく、また、連通孔５２は隣合う孔４８同士を繋ぐ筒状の空隙とされていてもよい。
　なお、多孔膜４６の主面の少なくとも細胞が播種される領域は、フィブロネクチン、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、又はＶ型コラーゲン）、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネイシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス及びポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種によって被覆されていることが好ましい。また、多孔膜４６の孔４８内も、これらの少なくとも１種によって被覆されていることが好ましい。多孔膜４６を被覆することで、細胞の接着性を高めることが可能となる。
　また、多孔膜４６は細胞が接着して増殖する足場であるところ、多孔膜４６の開口率が高いほど、また、多孔膜４６の膜厚が薄いほど、一方の面の細胞と他方の面の細胞との間の細胞間相互作用（cell-cell interaction）、即ち、液性因子による情報伝達及び細胞どうしの接触（cell-cell contact）の少なくとも一方が活発になる。多孔膜４６の主面での細胞培養時における細胞間相互作用が活発になるほど、生体内の組織に近似した機能を有するモデルを製造することが可能となる。
　孔４８が形成された多孔膜４６を作製する方法としては、例えばナノプリント法や結露法の他、エッチング法、サンドブラスト法、プレス成形等の方法が挙げられる。ナノプリント法とは、凹凸形状を有する型に多孔膜４６を構成する素材を流し込む、又は型を、多孔膜４６を構成する素材に押し当てることにより、孔４８を作製する方法である。また、結露法とは、多孔膜４６を構成する素材の表面を結露させ、水滴を型として孔４８を形成する方法である。
　結露法は、他の方法と比較して、多孔膜４６の膜厚を薄くすることができるとともに、空隙率や開口４８Ａの開口率を大きくすることが可能であり、また、多孔膜４６内に連通孔５２を設けることが可能である。このため、本実施形態では、多孔膜４６を結露法によって作製している。結露法の詳細は、例えば、特許第４９４５２８１号公報、特許第５４２２２３０号公報、特開２０１１－７４１４０号公報、特許第５４０５３７４号公報に記載されている。
＜補強部材＞
　図１～図５に示すように、多孔膜４６と第２流路部材１４の対向面１４Ａとの間には、多孔膜４６より剛性が高い補強部材５４が配置されている。補強部材５４は、一例として、ポリエチレンテレフタレートから成る膜部材とされており、多孔膜４６全体を覆う大きさとされている。具体的には、補強部材５４は、第２流路部材１４の対向面１４Ａと略同じ大きさとされており、多孔膜４６における第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との間に形成された段部２２、２４に面する部分を覆っている。
　また、補強部材５４の厚さは、１２μｍ以上、かつ第１マイクロ流路１８又は第２マイクロ流路２０の深さより薄くされていることが好ましく、具体的には、補強部材５４の厚さは、１２μｍ以上４００μｍ以下であることがより好ましく、１２μｍ以上２００μｍ以下であることがさらに好ましい。
　また、補強部材５４の剛性は、補強部材５４の上に鋼球を載せた際の補強部材５４の変形量を測定することで評価可能である。具体的には、Φ５０ｍｍの穴があいた厚さ３ｍｍのＳＵＳ（ステンレス）製のプレートを準備し、７０ｍｍ角の補強部材５４の４辺を両面テープ（日東電工製Ｎｏ．５０００ＮＳ）によってプレート上に固定する。そして、補強部材５４の上から穴の中心部に直径１１ｍｍ、重さ５．５ｇの鋼球を載せ、その際の穴の中心部における補強部材５４の下方向への変形量を、レーザー変位計（キーエンス製ＬＫ－Ｇ８５）によってプレート下から測定する。
　上記の評価方法では、補強部材５４の剛性が高いほど変形量は小さくなり、上記の評価方法を用いた場合に、補強部材５４の変形量は３ｍｍ以下であることが好ましく、１ｍｍ以下であることがより好ましい。
　なお、補強部材５４は、少なくとも多孔膜４６より剛性が高くされていればよく、また、細胞培養に影響を及ぼし難い材料で構成されていればよい。細胞培養に影響を及ぼし難い材料としては、例えばポリエチレンテレフタレートの他、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコーン系の材料、ポリスチレン、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）、ポリプロピレン、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、ＰＥ（ポリエチレン）等が挙げられる。また、補強部材５４の必要とされる厚さも、補強部材５４の材質によって適宜定められる。
　図２に示すように、補強部材５４における第２流路部材１４のボルト孔３２に対応する位置には、複数（本実施形態では８つ）のボルト孔５６が形成されており、補強部材５４はボルト４０によって保持プレート３０及び第２流路部材１４に接合されている。また、補強部材５４における第２マイクロ流路２０の流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂに対応する位置には、貫通孔５７がそれぞれ形成されている。
　また、多孔膜４６が第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０に面する部分において、補強部材５４にはスリット５８が形成されている。具体的には、図３に示すように、スリット５８は、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃ及び第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃと平面視で重なる位置に設けられており、スリット５８の幅は、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅と略同じ幅とされている。なお、スリット５８の幅は、少なくとも第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅以下とされていればよい。
＜作用及び効果＞
　本実施形態によれば、第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との合流部分に段部２２が形成されており、第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃと第２マイクロ流路２０の流路部２０Ｃの幅の差によって段部２４が形成されている。また、多孔膜４６の段部２２、２４に面する部分が、補強部材５４によって覆われることによって補強されている。
　このため、例えば第１マイクロ流路１８に細胞懸濁液を流して多孔膜４６の上面４６Ａに細胞層を形成する際に多孔膜４６に細胞懸濁液の液圧が加わった場合であっても、多孔膜４６が第２マイクロ流路２０側に撓むことを補強部材５４によって抑制することができる。これにより、段部２２、２４と多孔膜４６との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に細胞が流れ込むことを抑制することができる。
　また、本実施形態では、補強部材５４が多孔膜４６全体を覆う大きさとされているため、補強部材５４が多孔膜４６の一部のみを覆う大きさとされている構成と比較して、多孔膜４６をより補強することができる。
　さらに、多孔膜４６が第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０に面する部分において、補強部材５４にはスリット５８が形成されている。このため、例えば細胞、赤血球、又はトレーサーの透過性試験等を行う際に、補強部材５４のスリット５８及び多孔膜４６を介して第１マイクロ流路１８と第２マイクロ流路２０との間を細胞、赤血球、又はトレーサーが移動することができ、細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材５４によって阻害されることを抑制することができる。
　特に本実施形態では、補強部材５４のスリット５８の幅が第１マイクロ流路１８の流路部１８Ｃの幅と略同じ幅とされている。このため、補強部材５４のスリット５８の幅が流路部１８Ｃの幅より大きい場合と比較して、段部２４と多孔膜４６との間に隙間ができることをより抑制することができる。また、補強部材５４のスリット５８の幅が流路部１８Ｃの幅より小さい場合と比較して、細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材５４によって阻害されることをより抑制することができる。
　また、本実施形態によれば、補強部材５４が生体適合性を有するポリエチレンテレフタレート等から成る膜部材とされている。このため、補強部材５４に含まれる成分が第１マイクロ流路１８内又は第２マイクロ流路２０内の細胞等に影響を与えることを抑制することができる。
　また、補強部材５４の厚さは、１２μｍ以上、かつ第１マイクロ流路１８又は第２マイクロ流路２０の深さより薄くされている。このため、補強部材５４の厚さが１２μｍ未満とされている構成と比較して、補強部材５４の剛性を高めることができ、補強部材５４によって多孔膜４６をより強固に補強することができる。
　さらに、補強部材５４の厚さが第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０の深さより大きい場合と比較して、第１マイクロ流路１８又は第２マイクロ流路２０に細胞懸濁液を流して多孔膜４６の表面に細胞層を形成する際に、補強部材５４によって多孔膜４６への細胞の播種が阻害されることを抑制することができる。
（第２実施形態）
　次に、本開示の第２実施形態について図８、図９を用いて説明する。なお、各構成の説明を容易にするため、図中の各構成の寸法を適宜変更している。このため、図中の縮尺は実際とは異なっている。また、第１実施形態と同様の構成については同じ符号を付して説明を省略する。
　図８に示すように、本実施形態のマイクロ流路デバイス６０は、第１実施形態のマイクロ流路デバイス１０と同様に、第１マイクロ流路６８が形成された第１流路部材６２と第２マイクロ流路７０が形成された第２流路部材６４とを有している。
　第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０は多孔膜４６によって仕切られており、第１実施形態と同様に、流入口６８Ａ、７０Ａ、流出口６８Ｂ、７０Ｂ、及び流入口６８Ａ、７０Ａと流出口６８Ｂ、７０Ｂとを連通し、略直線状に延びる流路部６８Ｃ、７０Ｃをそれぞれ有している。
　図９に示すように、第１マイクロ流路６８の流入口６８Ａ及び流出口６８Ｂは、第２マイクロ流路７０の流入口７０Ａ及び流出口７０Ｂと平面視で離間した位置に設けられている。また、第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃは、第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃと平面視で重なる位置に設けられている。
　これにより、第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との合流部分、すなわち流入口６８Ａ、７０Ａと流路部６８Ｃ、７０Ｃとの間、及び流出口６８Ｂ、７０Ｂと流路部６８Ｃ、７０Ｃとの間に段部７２がそれぞれ形成されている。一方、本実施形態では、第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃの幅と、第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃの幅は略同じ大きさとなっている。
　多孔膜４６と第２流路部材６４の対向面６４Ａとの間には、多孔膜４６より剛性が高い一対の補強部材７４が配置されている。一対の補強部材７４は、一例として、ポリエチレンテレフタレート等から成る矩形状の膜部材とされており、一対の補強部材７４の厚さは、１２μｍ以上、かつ第１マイクロ流路１８及び第２マイクロ流路２０の深さより薄くされている。
　また、一対の補強部材７４は、多孔膜４６における第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との間に形成された段部７２に面する部分をそれぞれ覆う大きさとされている。さらに、一対の補強部材７４は、互いに間隔をあけて配置されており、一対の補強部材７４間に第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃ及び第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃが位置している。
＜作用及び効果＞
　本実施形態によれば、第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との合流部分に段部７２が形成されており、多孔膜４６の段部７２に面する部分が、一対の補強部材７４によってそれぞれ覆われることによって補強されている。
　このため、例えば第１マイクロ流路６８に細胞懸濁液を流して多孔膜４６の上面４６Ａに細胞層を形成する際に多孔膜４６に細胞懸濁液の液圧が加わった場合であっても、多孔膜４６が第２マイクロ流路７０側に撓むことを補強部材７４によって抑制することができる。これにより、段部７２と多孔膜４６との間に隙間が生じることを抑制することができ、この隙間に細胞、赤血球、又はトレーサーが流れ込むことを抑制することができる。
　また、本実施形態によれば、一対の補強部材７４は、互いに間隔をあけて配置されており、一対の補強部材７４間に第１マイクロ流路６８の流路部６８Ｃ及び第２マイクロ流路７０の流路部７０Ｃが位置している。このため、例えば細胞、赤血球、又はトレーサーの透過性試験等を行う際に、第１マイクロ流路６８と第２マイクロ流路７０との間の細胞、赤血球、又はトレーサーの移動が補強部材７４によって阻害されることを抑制することができる。
（その他の実施形態）
　以上、本開示の実施形態の一例について説明したが、本開示は、上記に限定されるものでなく、上記以外にも、その主旨を逸脱しない範囲内において種々変形して実施可能である。
　例えば第１、第２実施形態では、補強部材５４、７４が多孔膜４６と第２流路部材１４、６４の対向面１４Ａ、６４Ａとの間に設けられていたが、補強部材５４、７４は、第１流路部材１２、６２の対向面１２Ａ、６２Ａと多孔膜４６との間に設けられていてもよい。
　また、第１、第２実施形態では、第１流路部材１２、６２の上側に保持プレート３０が設けられ、ボルト４０によって保持プレート３０と第２流路部材１４、６４とが接合されていた。しかし、保持プレート３０は設けられていなくてもよく、第１流路部材１２、６２と第２流路部材１４、６４とが、接着、溶着、吸着（自己吸着）等で互いに接合されていてもよい。
　以下、本開示の実施例及び比較例について説明する。なお、本開示は以下の実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
＜マイクロ流路デバイスの作製＞
　まず、多孔膜として、孔がハニカム状に配置されたポリカーボネートから成る膜部材を準備し、多孔膜をコラーゲンで被覆した後、多孔膜の両面に滅菌紙を貼り付けた。次に、多孔膜の下面の滅菌紙をピンセットによって剥がし、第２マイクロ流路が形成された第２流路部材の上に多孔膜を載置して多孔膜と第２流路部材とを接合した。
　次に、多孔膜の上面の滅菌紙をピンセットによって剥がし、顕微鏡を確認しながら第１流路部材と第２流路部材の位置を合わせ、第１マイクロ流路が形成された第１流路部材を多孔膜の上に載置して多孔膜と第１流路部材とを接合した。
　また、第１流路部材の上部に保持プレートを載置し、スペーサを介して保持プレートと第２流路部材とをボルト及びナットで締め付けることにより、基となるマイクロ流路デバイスを作製した。なお、マイクロ流路デバイスの第１マイクロ流路の幅及び深さは２００μｍ、第２マイクロ流路の幅及び深さは４００μｍとされている。
［実施例１］
　実施例１では、上述した第１実施形態と同様の構成のマイクロ流路デバイスを作製した。具体的には、基となるマイクロ流路デバイスの多孔膜と第２流路部材との間に、補強部材として中央部にスリットを形成したポリプロピレンから成る膜部材を挟み込んだマイクロ流路デバイスを作製した。なお、補強部材の大きさは第２流路部材の対向面（主面）と略同じ大きさとされており、補強部材の厚さは１００μｍとされ、補強部材の剛性は、前述の鋼球を用いた評価方法にて変形量が０．５ｍｍとされている。
［実施例２］
　実施例２では、上述した第２実施形態と同様の構成のマイクロ流路デバイスを作製した。具体的には、基となるマイクロ流路デバイスの多孔膜と第２流路部材との間に、補強部材としてポリエチレンテレフタレートから成る一対の膜部材を挟み込んだマイクロ流路デバイスを作製した。なお、補強部材の大きさはそれぞれ３ｍｍ四方とされており、補強部材の厚さはそれぞれ１２μｍとされ、補強部材の剛性は、前述の鋼球を用いた評価方法にて変形量が１ｍｍとされている。また、補強部材は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の合流部分にそれぞれ配置されている。
［比較例１］
　比較例１では、補強部材を配置せず、基となるマイクロ流路デバイスをそのまま用いた。
［比較例２］
　比較例２では、基となるマイクロ流路デバイスの多孔膜と第２流路部材との間に、補強部材としてポリエチレンテレフタレートから成る一対の膜部材を挟み込んだマイクロ流路デバイスを作製した。なお、補強部材の大きさはそれぞれ３ｍｍ四方とされており、補強部材の厚さはそれぞれ２μｍとされている。また、補強部材は、第１マイクロ流路と第２マイクロ流路の合流部分にそれぞれ配置されている。
＜細胞の観察＞
　上記の実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２のマイクロ流路デバイスの多孔膜に細胞を播種し、その細胞を観察した。具体的には、まず、骨髄由来間葉系幹細胞（Lonza社）の懸濁液を濃度３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで調整し、２００μＬの懸濁液を下側の第２マイクロ流路に注入した。次に、マイクロ流路デバイスを反転し、ＣＯ２インキュベータ内において３７℃で３時間静置した後、毎分０．７μＬの速度で培地を流し、一晩培養した。
　次に、CellTracker Orange（ThermoFischer社）で染色したｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞（ＣＤＩ社 iCell EC）の懸濁液を濃度１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで調整し、２００μＬの懸濁液を上側の第１マイクロ流路に注入した。
　その後、実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２のマイクロ流路デバイスにおいて、蛍光顕微鏡を用い、第１マイクロ流路に注入したｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞の分布をそれぞれ観察した。実施例１の観察結果を図１０Ａ、図１０Ｂに示し、比較例１の観察結果を図１１Ａ、図１１Ｂに示す。なお、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、及び図１１Ｂでは、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞のみを図示している。
　実施例１では、図１０Ａ、図１０Ｂに示すように、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第１マイクロ流路内に留まっていることが確認できた。一方、比較例１では、図１１Ａ、図１１Ｂに示すように、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓの一部が第２マイクロ流路内に位置し、このため、あたかもｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第２マイクロ流路内に漏れ出たように見えることが確認できた。
　なお、図示を省略するが、実施例２及び比較例２についても、実施例１及び比較例１の観察結果と同様の結果となった。具体的には、実施例２では、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第１マイクロ流路内に留まっていたのに対し、比較例２では、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓの一部が第２マイクロ流路内に位置し、ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞Ｓが第２マイクロ流路内に漏れ出たように見えることが確認できた。
　２０１８年３月２日に出願された日本国特許出願２０１８－０３７５１１号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
１０、６０ マイクロ流路デバイス
１２、６２ 第１流路部材
１２Ａ、６２Ａ 対向面
１４、６４ 第２流路部材
１４Ａ、６４Ａ 対向面
１６ 流路ユニット
１８、６８ 第１マイクロ流路
１８Ａ、６８Ａ 流入口
１８Ｂ、６８Ｂ 流出口
１８Ｃ、６８Ｃ 流路部
２０、７０ 第２マイクロ流路
２０Ａ、７０Ａ 流入口
２０Ｂ、７０Ｂ 流出口
２０Ｃ、７０Ｃ 流路部
２２、２４、７２ 段部
２６Ａ、２６Ｂ、２８Ａ、２８Ｂ 貫通孔
３０ 保持プレート
３２、５６ ボルト孔
３４ 凹部
３６ スペーサ
３８ ナット
４０ ボルト
４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂ 貫通孔
４６ 多孔膜
４６Ａ 上面
４６Ｂ 下面
４８ 孔
４８Ａ 開口
５０ 平坦部
５２ 連通孔
５４、７４ 補強部材
５７ 貫通孔
５８ スリット

Claims (9)

  1. 　第１流路部材に形成された第１マイクロ流路と、
    　第２流路部材に形成され、平面視で少なくとも一部が前記第１マイクロ流路に重なり、かつ、前記第１マイクロ流路との間に段部が形成された第２マイクロ流路と、
    　厚さ方向に貫通する複数の孔を有し、前記第１流路部材と前記第２流路部材の間に配置されて前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路を仕切る多孔膜と、
    　前記第１流路部材又は前記第２流路部材と前記多孔膜との間に設けられ、前記多孔膜より剛性が高く、前記多孔膜の少なくとも前記段部に面する部分を補強する補強部材と、
    　を有するマイクロ流路デバイス。
  2. 　前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路は平面視で一部が離間しており、
    　前記段部は、前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路が平面視で合流する合流部分に形成されている、
    　請求項１に記載のマイクロ流路デバイス。
  3. 　前記第１マイクロ流路の幅は前記第２マイクロ流路の幅より狭く、
    　前記段部は、前記第１マイクロ流路と前記第２マイクロ流路の幅の差によって形成されている、
    　請求項１に記載のマイクロ流路デバイス。
  4. 　前記補強部材は、前記多孔膜全体を覆う大きさとされており、
    　前記多孔膜が前記第１マイクロ流路又は前記第２マイクロ流路に面する部分において、前記補強部材にはスリットが形成されている、
    　請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
  5. 　前記補強部材の前記スリットの幅は、前記第１マイクロ流路及び前記第２マイクロ流路の幅以下とされている、請求項４に記載のマイクロ流路デバイス。
  6. 　前記補強部材は、ポリエチレンテレフタレートから成る膜部材である、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
  7. 　前記補強部材は、ポリプロピレンから成る膜部材である、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
  8. 　前記補強部材の厚さは１２μｍ以上とされている、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
  9. 　前記補強部材の厚さは、前記第１マイクロ流路及び前記第２マイクロ流路の深さより薄くされている、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載のマイクロ流路デバイス。
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