WO2019167962A1 - 高発現かつ高機能な二重特異性抗体 - Google Patents

高発現かつ高機能な二重特異性抗体 Download PDF

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WO2019167962A1
WO2019167962A1 PCT/JP2019/007363 JP2019007363W WO2019167962A1 WO 2019167962 A1 WO2019167962 A1 WO 2019167962A1 JP 2019007363 W JP2019007363 W JP 2019007363W WO 2019167962 A1 WO2019167962 A1 WO 2019167962A1
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WO
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bispecific antibody
variable region
chain variable
antigen
amino acid
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PCT/JP2019/007363
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English (en)
French (fr)
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晃一 金田
新造 黛
冷牟田　修一
竜太郎 浅野
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出光興産株式会社
国立大学法人東京農工大学
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Publication date
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the present invention relates to a technique for improving the expression level and function of a bispecific antibody useful as a medicine.
  • Bispecific antibodies are also called diabodies, and since they exhibit antigen specificity for two types of antigens, they are expected to be drugs that utilize the bispecificity.
  • Asano group one of the inventors, succeeded in producing a bispecific antibody having specificity for epidermal growth factor receptor (EGFR) and CD3. Have been improved (for example, Patent Documents 1 to 9).
  • Patent Document 10 discloses a peptide tag having a specific amino acid sequence, and discloses that when this peptide tag is added to the N-terminus or C-terminus of the protein, the expression level of the protein is improved.
  • this invention makes it a subject to provide the means which improves both the expression level and activity of a bispecific antibody.
  • the present inventors have found that the amino acid sequence represented by the following general formula (I) is present at the N-terminus and / or C-terminus of the bispecific antibody. It was found that the expression level was remarkably improved by adding a peptide tag having expression. Furthermore, it was surprisingly found that the bispecific antibody to which the peptide tag is added improves not only the expression level but also the activity (cancer cell killing effect). Based on such knowledge, the present invention has been completed.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a bispecific antibody having dual antigen specificity to the first antigen and the second antigen, the sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the antibody against the first antigen, and A peptide comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region derived from an antibody against the second antigen in any order, and the peptide tag represented by the following general formula (I) is N-terminal, C-terminal, or A bispecific antibody, characterized by having in both.
  • the bispecific antibody according to [1], wherein the peptide tag sequence is represented by any of SEQ ID NOs: 29 to 87.
  • each peptide linker has a length of 1 to 20 amino acids.
  • the sequences of the heavy chain variable region (5H) and light chain variable region (5L) derived from an antibody against human EGFR1 are the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8, or the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8, respectively.
  • the heavy chain variable region (OH) and light chain variable region (OL) sequences derived from an antibody against human CD3 are the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 4, or 1 to several amino acids in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 4
  • the bispecific antibody according to [8], wherein the bispecific antibody has one of the following structures.
  • a pharmaceutical composition comprising the bispecific antibody according to any one of [1] to [10].
  • a recombinant vector comprising the DNA according to [12].
  • the double-chain specific antibody of the present invention has an advantage that the expression level in the host cell is large.
  • the bispecific antibody of the present invention also has an advantage of high activity (such as cancer cytotoxic activity) compared to the case where no peptide tag is added. Therefore, according to the present invention, a highly active double-chain specific antibody can be efficiently produced, which contributes to the field of medicine and the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing the orientation of each variable region in a bispecific antibody.
  • FIG. 2 is a diagram showing the sequence of a bispecific antibody (ta6) for yeast expression. PG12 tag not added (ta6: SEQ ID NO: 25), PG12 tag N-terminal addition (N-ta6: SEQ ID NO: 26), PG12 tag C-terminal addition (C-ta6: SEQ ID NO: 27), PG12 tag both ends addition ( Each of NC-ta6: SEQ ID NO: 28) is shown.
  • FIG. 3 is a diagram (partial photograph) showing the expression result of a bispecific antibody (ta6) in yeast. Each group was evaluated with
  • FIG. 4 is a diagram showing the sequence of a bispecific antibody (sc1) for expression of E. coli.
  • PX12-20 tag not added sc1: SEQ ID NO: 9
  • PX12-20 tag N-terminal addition N-sc1: SEQ ID NO: 10
  • PX12-20 tag C-terminal addition C-sc1: SEQ ID NO: 11
  • NC-sc1 SEQ ID NO: 12
  • FIG. 5 is a graph showing the expression level of the bispecific antibody of FIG. 4 in E. coli. The expression level was examined in each of the culture supernatant, the disrupted supernatant, and the precipitated fraction.
  • FIG. 5 is a graph showing the expression level of the bispecific antibody of FIG. 4 in E. coli. The expression level was examined in each of the culture supernatant, the disrupted supernatant, and the precipitated fraction.
  • FIG. 5 is a graph showing the expression level of the bispecific antibody of FIG. 4 in E. coli. The
  • FIG. 6 shows the sequence of the bispecific antibody (ta2) for expression of E. coli.
  • PX12-20 tag not added ta2: SEQ ID NO: 13
  • PX12-20 tag N-terminal addition N-ta2: SEQ ID NO: 14
  • PX12-20 tag C-terminal addition C-ta2: SEQ ID NO: 15
  • NC-ta2 SEQ ID NO: 16
  • FIG. 7 is a graph showing the expression level of the bispecific antibody of FIG. 6 in E. coli. The expression level was examined in each of the culture supernatant, the disrupted supernatant, and the precipitated fraction.
  • FIG. 7 is a graph showing the expression level of the bispecific antibody of FIG. 6 in E. coli. The expression level was examined in each of the culture supernatant, the disrupted supernatant, and the precipitated fraction.
  • FIG. 8 is a diagram showing the sequence of a bispecific antibody (ta2, in which the second linker is STDGNT) for expression of E. coli.
  • PX12-20 tag not added ta2-STDGNT: SEQ ID NO: 17
  • PX12-20 tag N-terminal addition N-ta2-STDGNT: SEQ ID NO: 18
  • PX12-20 tag C-terminal addition C-ta2-STDGNT
  • PX12-20 tag both ends addition
  • NC-ta2-STDGNT SEQ ID NO: 20.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression level of the bispecific antibody of FIG. 8 in E. coli.
  • FIG. 10 is a view showing the sequence of a bispecific antibody (ta6, in which the second linker is STDGNT) for expression of E. coli.
  • ta6-STDGNT SEQ ID NO: 21
  • N-ta6-STDGNT SEQ ID NO: 22
  • PX12-20 tag C-terminal addition C-ta6-STDGNT : SEQ ID NO: 23
  • NC-ta6-STDGNT SEQ ID NO: 24
  • FIG. 11 is a graph showing the expression level of the bispecific antibody of FIG. 10 in E. coli. The expression level was examined in each of the culture supernatant, the disrupted supernatant, and the precipitated fraction.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of MTS assay examining the cytotoxic activity of a bispecific antibody (sc1) in which PX12-20 is added to the N-terminus, C-terminus or NC terminus. The concentration range from 1 fM to 0.01 nM was examined.
  • FIG. 13 is a view showing the results of MTS assay examining the cytotoxic activity of a bispecific antibody (sc1) in which PX12-20 is added to the N-terminus, C-terminus, or NC terminus.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of MTS assay examining the cytotoxic activity of a bispecific antibody (ta2) in which PX12-20 is added to the N-terminus, C-terminus, or NC terminus. The concentration range from 1 to fM to 0.01 nM was examined.
  • the bispecific antibody of the present invention is a bispecific antibody having dual antigen specificity to a first antigen and a second antigen, and is derived from an antibody against the first antigen in one molecule.
  • the combination of the antibody against the first antigen and the antibody against the second antigen is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a combination of antibodies against two types of antigens expressed on the target site of an antibody such as the surface of a cancer cell such as a human or a virus or pathogen
  • Examples of the antibody against the first antigen and the antibody against the second antigen include human antibodies and mouse antibodies, but may be humanized antibodies or chimeric antibodies.
  • sequences of the heavy chain and light chain variable regions derived from the antibody against the first antigen and the antibody against the second antigen may be known sequences, or may be sequences identified by sequence analysis for newly obtained monoclonal antibodies.
  • the sequences of the heavy and light chain variable regions may be known sequences themselves, but as long as the antigen recognition function is maintained (including improvement, the same applies hereinafter), 1 to several amino acids in each variable region sequence May be substituted, deleted, added or inserted.
  • the term “several” means, for example, 2 to 10, 2 to 5, or 2 to 3.
  • the substitution is preferably conservative substitution such as substitution between amino acids having similar properties such as acidic amino acids, basic amino acids, and neutral amino acids.
  • the site into which substitution, deletion, addition or insertion is introduced may be a region other than the complementarity determining region (CDR) in the variable region, or may be in the CDR. This is because recently, many amino acid alterations within CDRs have been made using a display method such as phage display so as to maintain or improve the antigen specificity of the original antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • bispecific antibodies include, specifically, heavy chain variable regions and light chain variable regions derived from anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibodies, and heavy chain variable regions and light chains derived from anti-CD3 antibodies.
  • An antibody containing a chain variable region can be mentioned.
  • EGFR is preferably human EGFR, more preferably human EGFR1 (sometimes referred to as HER1).
  • CD3 is preferably human CD3.
  • the amino acid sequences of heavy chain variable region (5H) and light chain variable region (5L) derived from anti-human EGFR1 antibody, and heavy chain variable region (OH) and light chain variable region (OL) derived from anti-human CD3 antibody are patented.
  • the sequences described in known documents such as documents 1 to 9 can be employed.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the anti-human EGFR1 antibody preferably include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6 and 8, respectively, and the heavy chain variable region derived from the anti-human CD3 antibody and
  • the light chain variable region preferably includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2 and 4, respectively.
  • the antigen specificity of the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the anti-human EGFR1 antibody and the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the anti-human CD3 antibody are maintained as described above.
  • substitutions such as substitution, deletion, addition and insertion of one to several amino acids may be introduced.
  • the term “several” means, for example, 2 to 10, 2 to 5, or 2 to 3.
  • the substitution is preferably conservative substitution such as substitution with the same amino acid.
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the anti-human EGFR1 antibody, and the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the anti-human CD3 antibody maintain their respective antigen specificities. As long as it is, it may have an amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, or 98% or more identity with each of the above amino acid sequences.
  • % identity matches two amino acid sequences with respect to the total number of amino acids when gaps are inserted as necessary so that the number of matching amino acids is maximized. Defined as a percentage of the number of amino acids.
  • Each variable region sequence is preferably arranged via a peptide linker. That is, there are four variable region amino acid sequences: an antibody-derived heavy chain variable region and light chain variable region for the first antigen, and an antibody-derived heavy chain variable region and light chain variable region for the second antigen. However, there may be first, second and third peptide linkers between them.
  • the sequence of the peptide linker is not particularly limited as long as it does not adversely affect the antigen specificity of the bispecific antibody, but a peptide linker containing glycine and serine is preferable. Arginine and alanine may also be included.
  • the ratio of glycine and serine in the peptide linker sequence is, for example, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100%.
  • the length of the peptide linker is, for example, 1 to 20 amino acids.
  • the second peptide linker that is, the second linker counted from the N terminus may be another sequence such as STDGNT (SEQ ID NO: 88).
  • the alignment (orientation) of the four variable regions in the bispecific antibody is not particularly limited, but when the bispecific antibody takes a folded structure, the light chain variable region (1H) for the first antigen and the light chain variable region are light.
  • the sequence in which the chain variable region (1L), the heavy chain variable region (2H) for the second antigen and the light chain variable region (2L) are likely to associate with each other is preferable, and the following sequence is preferable.
  • the heavy chain variable region (1H) and the light chain variable region (1L) for the first antigen are counted from the N-terminal side in the first, second, third, first, fourth, second, third, third, The fourth arrangement is preferred.
  • a duplex comprising a heavy chain variable region (5H) and a light chain variable region (5L) from an anti-human EGFR1 antibody, and a heavy chain variable region (OH) and a light chain variable region (OL) from an anti-human CD3 antibody
  • the sequence shown in FIG. 1 is preferred.
  • the following arrangement is preferable.
  • the peptide tag added to the N-terminal side and / or C-terminal side of the bispecific antibody has the following sequence.
  • X, Y and Z are arginine (R), glycine (G), serine (S), lysine (K), threonine (T), leucine (L), asparagine (N), glutamine (Q), It is an amino acid residue independently selected from histidine (H).
  • X m means that m Xs are consecutive, and m Xs in this case are the same amino acid residues selected from R, G, S, K, T, L, N, Q, and H. It may be a different amino acid residue.
  • m is an integer of 0 to 5, preferably an integer of 1 to 5, more preferably an integer of 1 to 3.
  • PY n ) q means PY n , that is, n is 1, 2 or 3, and means that PY, PYY or PYYY continues q times (P indicates proline).
  • PY, PYY, and PYYY may be continuous q times in total.
  • each Y may be the same amino acid residue selected from R, G, S, K, T, L, N, and Q, or may be different amino acid residues, but q times It is preferable that at least one of Y contained in continuous PY n is K, L, N, Q, H, or R. More preferably, two or more of Y contained in q consecutive PY n are K, L, N, Q, H or R.
  • q is an integer of 1 to 10, preferably an integer of 2 to 10, more preferably an integer of 2 to 5, and further preferably an integer of 2 to 3.
  • PZ r means that after Z, there are r consecutive Z's, where r Z's are the same amino acid residues selected from R, G, S, K, T, L, N, Q There may be different amino acid residues.
  • r is an integer of 0 to 10, preferably an integer of 1 to 10, more preferably an integer of 1 to 5.
  • the peptide tag is preferably 6 to 50 amino acids in length, more preferably 6 to 40 amino acids, even more preferably 8 to 40 amino acids, still more preferably 10 to 30 amino acids, It is more preferably 12 to 25 amino acids, and particularly preferably 12 to 20 amino acids.
  • the total content of glycine and serine with respect to all amino acids is preferably less than 60%, more preferably less than 57%.
  • the peptide tag may be PG12 or PG17 described below.
  • RSPGSGPGSPRS ... PG12 SEQ ID NO: 29
  • RSPGSGPGSPRSPGSRS ... PG17 SEQ ID NO: 30
  • PG12 is preferable.
  • 1 to several (eg, 1 to 6, preferably 2 to 6) amino acids in the above PG12 or PG17 are K, L, N or Peptides having an amino acid sequence substituted with Q can be mentioned.
  • a peptide having an amino acid sequence in which one to several (for example, 1 to 5, preferably 2 to 5) amino acids other than P and R are substituted with R is exemplified. It is done.
  • the amino acid substituted in PG12 or PG17 is more preferably an amino acid between P and P.
  • a specific example of such a peptide tag is a peptide tag having an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 31 to 87, for example.
  • PX12-20 is preferable. RKPGKGPGKPRS ... PX12-20 (SEQ ID NO: 31)
  • the bispecific antibody of the present invention is obtained by binding the above peptide tag to a bispecific antibody.
  • a peptide tag may be bound to the N-terminus of the bispecific antibody, a peptide tag may be bound to the C-terminus of the bispecific antibody, or the N-terminus and C-terminus of the bispecific antibody.
  • a peptide tag may be bound to both.
  • the C terminus is sufficient if a peptide tag is added to the C terminus of the variable region on the most C-terminal side among the four variable regions in the bispecific antibody. Does not require the presence of a peptide tag.
  • a tag is added to the C-terminal side, and other sequences (for example, tag sequences necessary for detection and purification of His tags, HN tags, FLAG tags, etc.) are added to the C-terminal.
  • Other sequences for example, tag sequences necessary for detection and purification of His tags, HN tags, FLAG tags, etc.
  • Secretory signal peptide sequences, transport signal peptide sequences, etc. may be added.
  • the peptide tag may be directly bound to the N-terminus and / or C-terminus of the bispecific antibody, or may be bound via a sequence of 1 to several amino acids (eg, 1 to 5 amino acids).
  • the sequence of 1 to several amino acids may be any sequence as long as it does not adversely affect the function and expression level of the bispecific antibody.
  • secretion signal peptide examples include an invertase secretion signal, a P3 secretion signal, and an ⁇ factor secretion signal when yeast is used as a host, and a PelB secretion signal when E. coli is used as a host, and Brevibacillus is used as a host.
  • P22 secretion signal can be mentioned.
  • a secretion signal according to a host such as a plant or a mammal can be used.
  • the transport signal peptide can be selected according to the host, and examples thereof include an endoplasmic reticulum residual signal peptide and a vacuolar translocation signal peptide.
  • the bispecific antibody of the present invention can be synthesized chemically or can be produced by genetic engineering.
  • the DNA encoding the bispecific antibody of the present invention includes DNA encoding the heavy chain and light chain variable region sequences derived from the antibody against the first antigen and the antibody against the second antigen, respectively, and DNA encoding the peptide tag In addition, DNA encoding a linker or DNA encoding a signal sequence is included as necessary.
  • DNA encoding the bispecific antibody of the present invention includes Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), etc.
  • DNA encoding the heavy chain and light chain variable region sequences derived from the antibody against the first antigen and the antibody against the second antigen, respectively By obtaining DNA encoding a peptide tag and, if necessary, DNA encoding a linker, DNA encoding a signal sequence, etc. by a known method such as PCR, and ligating them using PCR, DNA ligase, etc. Can be built. Each DNA is linked with the codon reading frame.
  • the DNA encoding the heavy chain and light chain variable region sequences derived from the antibody against the first antigen and the antibody against the second antigen, respectively, may be a known sequence or a newly obtained sequence.
  • DNA encoding heavy chain variable region and light chain variable region derived from anti-human EGFR1 antibody, and DNA encoding heavy chain variable region and light chain variable region derived from anti-human CD3 antibody are described in Patent Documents 1 to 9. Examples of the sequences are exemplified.
  • the DNAs encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the anti-human EGFR1 antibody are preferably base sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8, respectively.
  • DNA comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 7.
  • the DNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region derived from the anti-human CD3 antibody is preferably a base sequence encoding each of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 4, and more specifically, These are DNAs containing the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively.
  • the codons may be changed.
  • the variable region to be encoded maintains bispecificity, it may be a base sequence of DNA that hybridizes with a complementary strand of each of the above base sequences under stringent conditions.
  • stringent conditions refer to conditions in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • two DNAs with high identity preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, hybridize, but two DNAs with lower identity do not hybridize.
  • Conditions are mentioned.
  • 2 ⁇ SSC 330 mM NaCl, 30 mM citric acid
  • 42 ° C. are mentioned, and preferably 0.1 ⁇ SSC (330 mM NaCl, 30 mM citric acid) and conditions of washing at 60 ° C. are mentioned.
  • the DNA encoding the peptide tag is not particularly limited as long as it encodes the peptide tag, and examples thereof include sequences disclosed in Patent Document 10 and the like.
  • DNA having a base sequence deduced from an amino acid sequence encoding a DNA encoding a linker or a DNA encoding a signal sequence can be used, and DNA having a known base sequence can be used.
  • the DNA encoding the bispecific antibody of the present invention has a codon indicating the amino acid constituting the bispecific antibody so that the translation amount of the hybrid protein increases depending on the host cell that produces the protein. It is also preferable that is appropriately modified.
  • a method of selecting a codon frequently used in the host cell, selecting a codon having a high GC content, or selecting a codon frequently used in the housekeeping gene of the host cell can be mentioned.
  • the DNA of the present invention may contain an enhancer sequence that functions in a host cell in order to improve expression in the host cell.
  • Enhancers include the Kozak sequence and the 5'-untranslated region of a plant-derived alcohol dehydrogenase gene.
  • the recombinant vector of the present invention only needs to be inserted into the vector so that the DNA encoding the bispecific antibody of the present invention can be expressed in the host cell into which the vector is introduced.
  • the vector is not particularly limited as long as it can replicate in the host cell, and examples thereof include plasmid DNA and viral DNA.
  • the vector preferably contains a selection marker such as a drug resistance gene.
  • Specific plasmid vectors include, for example, pTrcHis2 vector, pUC119, pBR322, pBluescript II KS +, pYES2, pAUR123, pQE-Tri, pET, pGEM-3Z, pGEX, pMAL, pRI909, pRI910, pBI221, pBI121, pBI101, pIG121Hm, Examples include pTrc99A, pKK223, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Neo, p3 ⁇ FLAG-CMV-14, pCAT3, pcDNA3.1, and pCMV.
  • pTrcHis2 vector pUC119, pBR322, pBluescript II KS +, pYES2, pAUR123, pQE-Tri, pET, pGEM-3Z,
  • the promoter used in the vector can be appropriately selected depending on the host cell into which the vector is introduced.
  • GAL1 promoter, PGK1 promoter, TEF1 promoter, ADH1 promoter, TPI1 promoter, PYK1 promoter, etc. When expressed in plants, cauliflower mosaic virus 35S promoter, rice actin promoter, maize ubiquitin promoter, lettuce ubiquitin promoter, and the like can be used.
  • Examples of expression in E. coli include T7 promoter, and examples of expression in Brevibacillus include P2 promoter and P22 promoter.
  • CMV promoter, CAG promoter, EF-1 ⁇ promoter and the like can be mentioned.
  • Inducible promoters may be used.
  • lac tac, trc which are IPTG-inducible promoters, IAA-inducible trp, L-arabinose-inducible ara, tetracycline-inducible Pzt-1, P L promoter inducible at high temperature (42 ° C.), promoter of cspA gene which is one of cold shock genes, and the like can be used.
  • a terminator sequence can be included depending on the host cell.
  • the recombinant vector of the present invention can be inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of the vector by, for example, cleaving DNA encoding the bispecific antibody of the present invention with an appropriate restriction enzyme or adding a restriction enzyme site by PCR. It can produce by doing.
  • the transformed cell of the present invention is characterized by being transformed with the DNA or a recombinant vector containing the DNA.
  • the host cell used for transformation may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, but a prokaryotic cell is preferred.
  • the prokaryotic cells include E. coli (Escherichia coli), lactic acid bacteria (Lactobacillus), Bacillus subtilis (Bacillus), Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens), such as actinomycetes and the like.
  • yeast cells, mammalian cells, plant cells, insect cells and the like are preferably used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae , Candida utilis , Schizosaccharomyces pombe , and Pichia pastoris .
  • microorganisms such as Aspergillus can also be used.
  • plant cells include cells of the plants belonging to the genus Lactuca, such as Astaraceae, Solanaceae, Brassicaceae, Rosaceae, and Chenopodiaceae .
  • Mammalian cells include CHO cells, COS cells, Hela cells, HEK cells and the like.
  • the transformed cell of the present invention can be prepared by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell using a general genetic engineering technique.
  • electroporation method (Tada, et al., 1990, Theor. Appl. Genet, 80: 475), protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)), polyethylene glycol method (Lazzeri, et al. , 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 437), introduction method using Agrobacterium (Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2: 218, Hiei, et al., 1994 Plant J. 6 : 271), particle gun method (Sanford, et al., 1987, J.
  • the gene expression may be transient expression or stable expression integrated into a chromosome.
  • a transformant After introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell, a transformant can be selected according to the phenotype of the selection marker. Then, the bispecific antibody of the present invention can be produced by culturing the selected transformant.
  • the medium and conditions used for the culture can be appropriately selected according to the type of transformed cells.
  • the culture time may be a time for producing a sufficient amount, for example, 10 hours to 50 hours.
  • the host cell is a plant cell
  • the plant body can be regenerated by culturing the selected plant cell according to a conventional method, and the bispecific antibody can be regenerated inside the plant cell or outside the cell membrane of the plant cell. Can be accumulated.
  • the bispecific antibody of the present invention accumulated in the medium or cells can be separated and purified according to methods well known to those skilled in the art. For example, known appropriate methods such as salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, medium to high pressure liquid chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, etc. , Or a combination thereof can be separated and purified.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the bispecific antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the use of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined depending on the sequence of the variable region contained, but is preferably an anticancer agent.
  • a bispecific antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region derived from an anti-human EGFR1 antibody and a heavy chain variable region and a light chain variable region derived from an anti-human CD3 antibody is used as an active ingredient, Since the specific antibody has an action of significantly eliminating, killing, or damaging (positive) tumor cells expressing the epidermal growth factor receptor in vitro and in vivo, an anticancer agent against such cancer cells Can be used as
  • the effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art depending on, for example, the therapeutic purpose, the disease state in the subject of administration such as the type, site and size of the disease, various conditions of the patient, and the administration route. I can do it.
  • a typical single dose or daily dose is, for example, 0.01 mg / kg body weight to 1000 mg / kg body weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains various pharmaceutically acceptable pharmacological agents well known to those skilled in the art in addition to the active ingredient, depending on various conditions such as the type of active ingredient, pharmaceutical form, administration method / purpose, and pathological condition of the administration target.
  • Components eg, carriers, excipients, buffers, stabilizers, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a tablet, solution, powder, gel, spray, or microcapsule, colloidal distribution system (liposome, microemulsion, etc.), macroemulsion, etc., depending on the above various conditions.
  • colloidal distribution system liposome, microemulsion, etc.
  • macroemulsion etc.
  • administration methods include intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intraspinal, intramuscular, intraocular, intraarterial, especially intrabiliary or intralesional injection or injection, and sustained release system formulations. It is done.
  • the transformed single colony was plated on a YPD plate medium, and left to stand in an incubator for 24 hours for culturing.
  • scrape the cells from the cultured plate medium with a sterile disposable loop inoculate into a 14 ml tube made of sterile polystyrene into which 3 ml of preculture medium (BMGY) has been dispensed, and shake culture at 30 ° C., 150 ⁇ rpm for 48 hours. went.
  • the preculture was centrifuged at 1,500 g and room temperature for 10 minutes, and after removing the supernatant, the precipitate was suspended in 3 mL of induction medium (BMMY) and cultured with shaking at 200 rpm and 25 ° C.
  • methanol corresponding to 0.5% of the culture volume was added every 12 hours.
  • TBS-T in which anti-Mouse IgG, AP-linked antibody (Cell Signaling Technology, 7056) was dissolved was added and incubated for 1 hour. Washing was performed with TBS-T, and color development with alkaline phosphatase was detected with a detection reagent containing nitroblue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate.
  • the culture method and expression confirmation method are as follows.
  • 50x 5052 composition Glycerol 25g, Glucose 2.5 g, Lactose monohydrate 10.4 g, DW up to 100 mL
  • E. coli BL21 star (DE3) was transformed with an E. coli expression vector and inoculated into 3 mL (Amp (+)) of LB medium for autoinduction. Cultivation was performed overnight at 28 ° C. and 170 rpm, and 1 mL of the culture solution was transferred to a microtube. Centrifugation was performed at 4 ° C. and 12000 rpm for 5 minutes, and the medium was separated into a culture supernatant and a precipitate.
  • the gel after electrophoresis was transferred to a nitrocellulose membrane, and the gel after transfer was stained with CBB.
  • the nitrocellulose membrane was blocked with 5% skimmed milk / PBS-T for 30 minutes to 1 hour, washed with PBS-T, and PBS-T in which HRP conjugate anti-His tag antibody was dissolved was added and incubated for 30 minutes. . After washing with PBS-T, chemiluminescence was detected with a detection reagent containing luminol and hydrogen peroxide.
  • E. coli BL21 star (DE3) was transformed, and 1 mL of LB medium was added to the colonies that had grown and mixed, and 50 ⁇ L was collected to obtain 3 mL of LB medium. (Amp (+)) was inoculated. Pre-culture was performed at 28 ° C. and 170 rpm for 17 hours. 1 mL of the preculture was added to 100 mL or 200 mL of autoinduction medium, or 200 mL of 2x YT medium, and incubated at 20 ° C. and 170 rpm for 46 hours. For 2x YT medium, IPTG induction was applied after 22 hours (final concentration 1 mM).
  • Results E. coli transformed with DNA encoding the sequence of FIG. 4 was cultured in 200 mL of 2x YT medium.
  • Western blotting using an anti-His tag antibody draw a calibration curve based on the fluorescence intensity of multitope tags (including His tags) with known concentrations, and express the expression level of each recombinant protein based on the calibration curve
  • the calculated results are shown in FIG. As a result, when the PX12-20 tag was added to the N-terminus or both ends of sc1, the expression level in the precipitate fraction was improved.
  • E. coli transformed with DNA encoding the sequence of FIG. 6 was cultured in 200 ⁇ mL of an autoinduction medium.
  • Western blotting using anti-His tag antibody draw a calibration curve based on the fluorescence intensity of multitope tag (including His tag) with known concentration, and express the expression level of each recombinant protein based on the calibration curve
  • the calculated results are shown in FIG. As a result, when the PX12-20 tag was added to the N-terminal, C-terminal, or both terminals of ta2, the expression level in the precipitate fraction was improved.
  • FIG. 9 shows the results of performing Western blotting using an anti-His tag antibody and calculating the relative value of the expression level based on the respective fluorescence intensities.
  • FIG. 11 shows the results of performing Western blotting using an anti-His tag antibody and calculating the relative value of the expression level based on the respective fluorescence intensities.
  • Example 2 the cytotoxic activity against cancer cells was examined by the following procedure for a molecule in which PX12-20 expressed in E. coli was added to the N-terminus, C-terminus, and NC terminus of sc1 or ta2.
  • Cytotoxic activity 96-well plates were seeded with TFK-1 cells, which are target cells, at 5000 cells / 100 ⁇ L per well. Incubation was performed overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration, and the supernatant was removed by aspiration. Next, 100 ⁇ L of MQ was added to 4 wells as a control with 0% cell viability, and 100 ⁇ L of animal cell culture medium RPMI was added to 4 wells as a control with 100% cell viability. Subsequently, T-LAK cells, which are effector cells, were seeded in other wells at 25000 cells / 50 ⁇ L per well.
  • MTS reagent CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega
  • the plate was incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration for about 30 minutes to 1 hour, and the absorbance at 490 nm was measured using a plate reader. Incubation was performed until the absorbance at 490 nm of wells added with RPMI alone (control with 100% cell viability) reached about 0.8, and the detected data was used to calculate cancer cytotoxic activity.
  • MTS reagents include tetrazolium salts that are converted to colored formazan products that are soluble in the medium when reduced and PES, an electron acceptor.
  • the tetrazolium salt is reduced by NADH or NADPH derived from the dehydrogenase of living cells and replaces the colored formazan product having an absorption at 490 nm. Therefore, there is a proportional relationship between the number of living cells and the amount of formazan product.
  • Quantification method of sample used for cytotoxic activity Quantification was performed based on the absorbance at 280 nm and the value of the extinction coefficient calculated from the amino acid sequence.

Abstract

第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをＮ末端側、Ｃ末端側、またはその両方に有することを特徴とする、二重特異性抗体。 Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ） ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基であり、ｍは０～５の整数であり、ｎは１、２または３であり、ｑは１～１０の整数であり、ｒ＝０～１０の整数である。

Description

高発現かつ高機能な二重特異性抗体
　本発明は医薬として有用な二重特異性抗体の発現量および機能を向上させる技術に関する。
　二重特異性抗体はダイアボディとも呼ばれ、二種類の抗原に対して抗原特異性を示すため、その二重特異性を利用した医薬として期待されている。本発明者の一人である浅野のグループは、上皮細胞成長因子受容体（EGFR）とCD3に特異性を有する二重特異性抗体の作製に成功し、その後も抗体特性を上げるために構造や配列などについて改良を重ねてきた（例えば、特許文献１～９）。
　一方、特許文献１０には特定のアミノ酸配列を有するペプチドタグが開示され、このペプチドタグをタンパク質のN末端またはC末端に付加したところタンパク質の発現量が向上したことが開示されている。
特開2015-156836 特開2012-179051 特開2012-161324 特開2005-333993 特開2004-242638 WO2015/146438 WO2015/146437 WO2010/109924 WO2007/108152 WO2017/115853
　上記の通り、二重特異性抗体については改良が試みられてきたが、高分子であることから宿主における発現量は十分ではなく、また、活性についても改善の余地があった。そこで本発明は、二重特異性抗体の発現量および活性の両方を改善する手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、二重特異性抗体の発現量を上げるべく鋭意検討を行った結果、二重特異性抗体のN末端および／またはC末端に下記一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドタグを付加して発現させたところ、その発現量が顕著に向上することを見出した。さらに、驚くべきことに、ペプチドタグを付加した二重特異性抗体は発現量だけでなく活性（がん細胞殺傷効果）も向上することが判明した。このような知見に基づいて、本発明は完成に至った。
　すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
　［１］第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをN末端側、C末端側、またはその両方に有することを特徴とする、二重特異性抗体。
Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ）
　ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基であり、ｍは０～５の整数であり、ｎは１、２または３であり、ｑは１～１０の整数であり、ｒ＝０～１０の整数である。
　［２］前記ペプチドタグの配列が配列番号２９～８７のいずれかで表される、［１］に記載の二重特異性抗体。
　［３］前記ペプチドタグの配列が配列番号２９または３１のいずれかで表される、［１］に記載の二重特異性抗体。
　［４］第１の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（1H）および軽鎖可変領域（1L）の配列ならびに第２の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（2H）および軽鎖可変領域（2L）の配列の並びが以下のいずれかである、［１］～［３］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
　　1H-1L-2H-2L
　　1H-1L-2L-2H
　　1L-1H-2H-2L
　　1L-1H-2L-2H
　　1H-2L-1L-2H
　　1H-2L-2H-1L
　　1L-2H-2L-1H 
　　1L-2H-1H-2L
　［５］各可変領域の配列がペプチドリンカーを介して連結されている、［１］～［４］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
　［６］前記ペプチドリンカーの長さが、それぞれ１～２０アミノ酸である、［５］に記載の二重特異性抗体。
　［７］第１の抗原および第２の抗原がヒト上皮細胞成長因子受容体１（EGFR1）およびヒトCD3である、［１］～［６］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
　［８］ヒトEGFR1に対する抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）の配列が、それぞれ配列番号６および８のアミノ酸配列、または配列番号６および８のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトEGFR1に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列であり、
　ヒトCD3に対する抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）の配列が配列番号２および４のアミノ酸配列、または配列番号２および４のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトCD3に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列である、［７］に記載の二重特異性抗体。
　［９］前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、［８］に記載の二重特異性抗体。
　　OL-5H-5L-OH・・・sc1
　　OH-5L-5H-OL・・・sc2
　　5L-OH-OL-5H・・・sc3
　　5H-OL-OH-5L・・・sc4
　　5L-OH-5H-OL・・・sc5
　　OL-5H-OH-5L・・・sc6
　　5H-OL-5L-OH・・・sc7
　　OH-5L-OL-5H・・・sc8
　　5L-5H-OH-OL・・・ta1
　　OH-OL-5L-5H・・・ta2
　　5H-5L-OL-OH・・・ta3
　　OL-OH-5L-5H・・・ta4
　　5L-5H-OL-OH・・・ta5
　　OH-OL-5H-5L・・・ta6
　　OL-OH-5H-5L・・・ta7
　　5H-5L-OH-OL・・・ta8
　［１０］前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、［８］に記載の二重特異性抗体。
　　OH-OL-5L-5H・・・ta2
　　OH-OL-5H-5L・・・ta6
　　OL-5H-5L-OH・・・sc1
　［１１］［１］～［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
　［１２］［１］～［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードするDNA。
　［１３］［１２］に記載のDNAを含む組み換えベクター。
　［１４］［１２］に記載のDNAまたは［１３］に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
　［１５］前記細胞が、原核細胞であることを特徴とする、［１４］に記載の形質転換細胞。
　［１６］前記原核細胞が、大腸菌であることを特徴とする、［１５］に記載の形質転換細胞。
　［１７］［１４］～［１６］のいずれかに記載の形質転換細胞を培地で培養し、培地中または形質転換細胞中に［１］～［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体を蓄積させる工程を含む、［１］～［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体の製造法。
　本発明の二重鎖特異性抗体は宿主細胞における発現量が多いという利点がある。また、本発明の二重特異性抗体はペプチドタグを付加しない場合と比べて活性（がん細胞傷害活性など）が高いという利点もある。したがって、本発明によれば、活性の高い二重鎖特異性抗体を効率よく製造することができ、医薬等の分野において貢献するものである。
図１は、二重特異性抗体における各可変領域の配向性を示す図である。 図２は、酵母発現用の二重特異性抗体（ta6）の配列を示す図である。PG12タグを付加しないもの（ta6：配列番号２５）、PG12タグN末端付加（N-ta6：配列番号２６）、PG12タグC末端付加（C-ta6：配列番号２７）、PG12タグ両末端付加（NC-ta6：配列番号２８）、のそれぞれについて示した。 図３は、酵母における二重特異性抗体（ta6）の発現結果を示す図（一部写真）である。各群、ｎ＝３で評価した。 図４は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（sc1）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（sc1：配列番号９）、PX12-20タグN末端付加（N-sc1：配列番号１０）、PX12-20タグC末端付加（C-sc1：配列番号１１）、PX12-20タグ両末端付加（NC-sc1：配列番号１２）、のそれぞれについて示した。 図５は、図４の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。 図６は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（ta2）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（ta2：配列番号１３）、PX12-20タグN末端付加（N-ta2：配列番号１４）、PX12-20タグC末端付加（C-ta2：配列番号１５）、PX12-20タグ両末端付加（NC-ta2：配列番号１６）、のそれぞれについて示した。 図７は、図６の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。 図８は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（ta2、第２リンカーをSTDGNTとしたもの）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（ta2-STDGNT：配列番号１７）、PX12-20タグN末端付加（N-ta2-STDGNT：配列番号１８）、PX12-20タグC末端付加（C-ta2-STDGNT：配列番号１９）、PX12-20タグ両末端付加（NC-ta2-STDGNT：配列番号２０）、のそれぞれについて示した。 図９は、図８の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。 図１０は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（ta6、第２リンカーをSTDGNTとしたもの）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（ta6-STDGNT：配列番号２１）、PX12-20タグN末端付加（N-ta6-STDGNT：配列番号２２）、PX12-20タグC末端付加（C-ta6-STDGNT：配列番号２３）、PX12-20タグ両末端付加（NC-ta6-STDGNT：配列番号２４）、のそれぞれについて示した。 図１１は、図１０の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。 図１２は、PX12-20をN末端、C末端またはNC両末端に付加した二重特異性抗体（sc1）の細胞傷害活性をMTSアッセイで調べた結果を示す図である。1fM～0.01nMの濃度範囲で調べた。 図１３は、PX12-20をN末端、C末端またはNC両末端に付加した二重特異性抗体（sc1）の細胞傷害活性をMTSアッセイで調べた結果を示す図である。0.063 pM～1 pMの濃度範囲で調べた。 図１４は、PX12-20をN末端、C末端またはNC両末端に付加した二重特異性抗体（ta2）の細胞傷害活性をMTSアッセイで調べた結果を示す図である。1 fM～0.01 nMの濃度範囲で調べた。
　本発明の二重特異性抗体は、第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、一分子中に、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをN末端、C末端、またはその両方に有することを特徴とする。
　第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体の組み合わせは特に制限されず、目的に応じて適宜選択できる。例えば、抗体の標的部位（ヒトなどのがん細胞表面やウイルスまたは病原体表面など）に発現する２種類の抗原に対する抗体の組み合わせを選択することができる。第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体はヒト抗体、マウス抗体などが挙げられるが、ヒト化抗体やキメラ抗体でもよい。
　第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列は公知の配列でもよいし、新たに取得されたモノクローナル抗体について配列解析で同定される配列でもよい。なお、重鎖および軽鎖可変領域の配列は公知の配列そのものでもよいが、抗原認識機能が維持（向上を含む、以下同じ）される限り、各可変領域の配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入された配列でもよい。ここで、数個とは、例えば、２～１０個、２～５個、または２～３個である。なお、置換は酸性アミノ酸同士、塩基性アミノ酸同士、中性アミノ酸同士というように類似の性質を有するアミノ酸間での置換などの保存的置換が好ましい。置換、欠失、付加または挿入が導入される部位は、可変領域における相補性決定領域（CDR）以外の領域でもよいし、CDR内でもよい。最近は、ファージディスプレイなどのディスプレイ法を用いて、もとの抗体の抗原特異性を維持または向上させるようなCDR内のアミノ酸改変も数多く行われているからである。
　二重特異性抗体の一例としては、具体的には、抗上皮細胞成長因子受容体（EGFR）抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびに抗CD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体が挙げられる。EGFRはヒトEGFRが好ましく、ヒトEGFR1（HER1と呼ばれることもある）がより好ましい。CD3はヒトCD3が好ましい。
　抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）のアミノ酸配列は、特許文献１～９のような公知の文献に記載の配列を採用することができる。
　これらの中でも、後述の実施例で使用した配列を使用することが好ましい。
　具体的には、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号６および８で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号２および４で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
　ただし、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、上記の通り、抗原特異性が維持される限り、上記各アミノ酸配列において１～数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の改変が導入された配列でもよい。ここで、数個とは、例えば、２～１０個、２～５個、または２～３個である。なお、置換は同種のアミノ酸への置換などの保存的置換が好ましい。
　言い換えると、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれの抗原特異性が維持される限り、上記各アミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものでもよい。ここで、％同一性とは、２種類のアミノ酸配列を、両者で一致するアミノ酸の数が最大になるように必要に応じてギャップを挿入して並べたときの、全アミノ酸数に対する、一致するアミノ酸数の割合として定義される。
　各可変領域配列はペプチドリンカーを介して配列されていることが好ましい。
　すなわち、可変領域のアミノ酸配列は、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、の４つが存在するが、それらの間には第１、第２、第３のペプチドリンカーが存在することができる。
　ペプチドリンカーの配列は二重特異性抗体の抗原特異性に悪影響を与えない配列であれば特に制限されないが、グリシンとセリンを含むペプチドリンカーが好ましい。アルギニンやアラニンも含まれてよい。ペプチドリンカー配列におけるグリシンとセリンの割合は、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％である。
　ペプチドリンカーの長さは、例えば、１～２０アミノ酸である。
　また、第２のペプチドリンカー、すなわち、N末から数えて２番目のリンカーはSTDGNT（配列番号８８）等の他の配列であってもよい。
　二重特異性抗体における、４つの可変領域の並び（配向性）は特に限定されないが、二重特異性抗体が折り畳み構造を取った時に、第１の抗原に対する重鎖可変領域（1H）と軽鎖可変領域（1L）、第２の抗原に対する重鎖可変領域（2H）と軽鎖可変領域（2L）、とがそれぞれ会合しやすくなる並びが好ましく、以下のような並びが好ましい。
　　1H-1L-2H-2L
　　1H-1L-2L-2H
　　1L-1H-2H-2L
　　1L-1H-2L-2H
　　1H-2L-1L-2H
　　1H-2L-2H-1L
　　1L-2H-2L-1H 
　　1L-2H-1H-2L
　すなわち、第１の抗原に対する重鎖可変領域（1H）と軽鎖可変領域（1L）がＮ末側から数えて１、２番目、１、３番目、１、４番目、２、３番目、３、４番目に配置される並びが好ましい。
　例えば、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）を含む二重特異性抗体の場合は、図１に示される並びが好ましい。
　この中でも、以下の並びが好ましい。
　　OH-OL-5L-5H・・・ta2
　　OH-OL-5H-5L・・・ta6
　　OL-5H-5L-OH・・・sc1
　二重特異性抗体のN末端側および／またはC末端側に付加されるペプチドタグは下記の配列を有する。
　　Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ）
　ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基である。
　ＸmとはＸがｍ個連続することを意味し、この場合のｍ個のＸはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｈから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。ｍは０～５の整数であるが、好ましくは１～５の整数、より好ましくは１～３の整数である。
　(ＰＹn)qとはＰＹn、すなわち、ｎが１、２または３なので、ＰＹ、ＰＹＹまたはＰＹＹＹがq回連続することを意味する（Ｐはプロリンを示す）。ＰＹ、ＰＹＹとＰＹＹＹが合計でq回連続していればよい。
　ここで、それぞれのＹはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよいが、q回連続するＰＹnに含まれるＹのうち、少なくとも１つはＫ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＨまたはＲであることが好ましい。q回連続するＰＹnに含まれるＹのうち、２つ以上がＫ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＨまたはＲであることがより好ましい。ｑは１～１０の整数であり、好ましくは２～１０の整数、より好ましくは２～５の整数、さらに好ましくは２～３の整数である。
　ＰＺrとはＰの後にＺがｒ個連続することを意味し、この場合のｒ個のＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。ｒは０～１０の整数であるが、好ましくは１～１０の整数、より好ましくは１～５の整数である。
　ペプチドタグは、長さが６～５０アミノ酸であることが好ましく、６～４０アミノ酸であることがより好ましく、８～４０アミノ酸であることがさらに好ましく、１０～３０アミノ酸であることがいっそう好ましく、１２～２５アミノ酸であることがよりいっそう好ましく、１２～２０アミノ酸であることが特に好ましい。
　ペプチドタグにおいて、全アミノ酸に対するグリシンとセリンを合わせた含有率が６０％未満であることが好ましく、５７％未満であることがより好ましい。
　ペプチドタグは下記のPG12、またはPG17であってもよい。
　　RSPGSGPGSPRS・・・PG12（配列番号２９）
　　RSPGSGPGSPRSPGSRS・・・PG17（配列番号３０）
　これらのうち、好ましくは、PG12である。
　また、本発明で使用可能なペプチドタグの一態様としては、上記PG12またはPG17において、１～数個（例えば、１～６個、好ましくは２～６個）のアミノ酸がＫ、Ｌ、ＮまたはＱに置換されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。また、PG12またはPG17において、Ｐ、Ｒ以外のアミノ酸のうち、１～数個（例えば、１～５個、好ましくは２～５個）のアミノ酸がＲに置換されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。ここで、PG12またはPG17において置換されるアミノ酸はＰとＰの間のアミノ酸であることがより好ましい。
　このようなペプチドタグの具体例としては、例えば、配列番号３１～８７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドタグである。その中では、下記のPX12-20が好ましい。
　　RKPGKGPGKPRS・・・PX12-20（配列番号３１）
　本発明の二重特異性抗体は、二重特異性抗体に上記ペプチドタグが結合したものである。二重特異性抗体のN末端にペプチドタグが結合してもよいし、二重特異性抗体のC末端にペプチドタグが結合してもよいし、二重特異性抗体のN末端とC末端の両方にペプチドタグが結合してもよい。
　ここで、C末端とは、二重特異性抗体における４つの可変領域のうち、もっともC末側の可変領域のC末端にペプチドタグが付加されていればよく、必ずしも、タンパク質全体のC末端にペプチドタグが存在していることを要求しない。すなわち、二重特異性抗体においては、C末端側にタグが付加され、さらに、そのC末端に他の配列（例えば、Hisタグ、HNタグ、FLAGタグなどの検出や精製などに必要なタグ配列、分泌シグナルペプチド配列、輸送シグナルペプチド配列など）が付加されてもよい。
　N末端および両末端に付加される場合も同様に定義される。
　なお、二重特異性抗体のN末端および／またはC末端にペプチドタグが直接結合してもよいし、１～数アミノ酸（例えば、１～５アミノ酸）の配列を介して結合してもよい。１～数アミノ酸の配列は二重特異性抗体の機能や発現量に悪影響を及ぼさない配列であれば任意の配列でよい。
　上記分泌シグナルペプチドとしては、酵母を宿主とする場合は、インベルターゼ分泌シグナル、P3分泌シグナル、α因子分泌シグナルなどが挙げられ、大腸菌を宿主とする場合はPelB分泌シグナルが挙げられ、ブレビバチルスを宿主とする場合はP22分泌シグナルが挙げられる。また、植物や哺乳動物など宿主に応じた分泌シグナルが使用できる。
　上記輸送シグナルペプチドとしては、宿主に応じて選択することができるが、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等が例示される。
　本発明の二重特異性抗体は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。
　本発明の二重特異性抗体をコードするDNAは、第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれコードするDNA、ペプチドタグをコードするDNAおよび必要に応じてリンカーをコードするDNAやシグナル配列などをコードするDNAを含む。
　本発明の二重特異性抗体をコードするDNAは、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載された一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、例えば、第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれコードするDNA、ペプチドタグをコードするDNAおよび必要に応じてリンカーをコードするDNAやシグナル配列などをコードするDNA等をPCR等の公知の方法で取得し、それらをPCRやDNAリガーゼ等を用いて連結することで構築することができる。なお、各DNAはコドンの読み枠を合わせて連結される。
　第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれコードするDNAとしては、公知の配列でもよいし、新たにクローニングして得られる配列でもよい。例えば、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域コードするDNA、ならびに、抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするDNAは特許文献１～９に記載されている配列が例示される。
　抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域コードするDNAは、好ましくは、それぞれ、上記配列番号６および８のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、より具体的には、それぞれ、配列番号５および７の塩基配列を含むDNAである。
　また、抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域コードするDNAは、好ましくは、上記配列番号２および４のアミノ酸配列をそれぞれをコードする塩基配列であり、より具体的には、それぞれ、配列番号１および３の塩基配列を含むDNAである。
　ただし、これらの塩基配列は目的のアミノ酸配列をコードする限り、コドンを変更してもよい。また、コードされる可変領域が二重特異性を維持する限り、上記各塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列でもよい。
　ここで、ストリンジェントな条件としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのＤＮＡ同士、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのＤＮＡがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのＤＮＡがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×ＳＳＣ（３３０ｍＭ　ＮａＣｌ、３０ｍＭ　クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは０．１×ＳＳＣ（３３０ｍＭ　ＮａＣｌ、３０ｍＭ　クエン酸）、６０℃で洗浄する条件が挙げられる。
　ペプチドタグをコードするDNAは上記ペプチドタグをコードする限り特に制限されないが、特許文献１０などに開示された配列が例示される。
　また、リンカーをコードするDNAやシグナル配列などをコードするDNAもコードするアミノ酸配列から推定される塩基配列を有するDNAとすることができ、公知の塩基配列を有するDNAを利用することができる。
　また、本発明の二重特異性抗体をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、二重特異性抗体を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
　本発明のDNAは、宿主細胞における発現を向上させるために、宿主細胞において機能するエンハンサー配列等を含むものであってもよい。エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域が挙げられる。
　本発明の組換えベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするDNAが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されているものであればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。具体的なプラスミドベクターとして、例えば、pTrcHis2ベクター、pUC119、pBR322、pBluescript II KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、 pKK223、pA1－11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等が例示される。
　ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、酵母で発現させる場合、GAL1プロモーター、PGK1プロモーター、TEF1プロモーター、ADH1プロモーター、TPI1プロモーター、PYK1プロモーターなどが使用可能である。植物で発現させる場合、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、レタスのユビキチンプロモーターなどが使用可能である。大腸菌で発現させる場合、T7プロモーターなどが挙げられ、ブレビバチルスで発現させる場合、P2プロモーターやP22プロモーターなどが挙げられる。哺乳動物細胞で発現させる場合、CMVプロモーター、CAGプロモーター、EF-1αプロモーターなどが挙げられる。
　誘導可能なプロモーターであってもよく、例えば、IPTGにより誘導可能なプロモーターであるlac、tac、trcの他、IAAで誘導可能なtrp、L-アラビノースで誘導可能なara、テトラサイクリンを用いて誘導可能なPzt-1、高温（42℃）で誘導可能なPLプロモーター、コールドショック遺伝子の一つであるcspA遺伝子のプロモーターなどが使用できる。
　また、必要に応じ、ターミネーター配列も宿主細胞に応じて含めることができる。
　本発明の組換えベクターは、例えば、本発明の二重特異性抗体をコードするDNAを適当な制限酵素で切断またはPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入することによって作製することができる。
　本発明の形質転換細胞は、前記DNAまたはそれを含む組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は原核細胞および真核細胞の何れでもよいが、原核細胞が好ましい。
　原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、乳酸菌（Lactobacillus）、枯草菌（Bacillus）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）、放線菌などが挙げられる。真核細胞としては、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが好ましく用いられる。酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeやCandida utilisやSchizosaccharomyces pombe、Pichia pastorisなどが挙げられる。さらに、麹菌（Aspergillus）等の微生物を用いることもできる。植物細胞としては、アキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Astaraceae）、ナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、バラ科（Rosaceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）に属する植物の細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞としては、CHO細胞、COS細胞、Hela細胞、HEK細胞などが挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.）などの方法を用いることが可能である。なお、遺伝子発現は一過的発現でもよく、染色体に組み込まれる安定的発現でもよい。
　本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって形質転換体を選抜することができる。そして、選抜した形質転換体を培養することにより、本発明の二重特異性抗体を生産することができる。培養に用いる培地および条件は、形質転換細胞の種類に応じて適宜選択することができる。培養時間は十分量生産される時間であればよく、例えば、１０時間～５０時間である。
　また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内または植物細胞の細胞膜外に前記二重特異性抗体を蓄積させることができる。
　培地や細胞内に蓄積した本発明の二重特異性抗体は、当業者によく知られた方法に従って分離精製することができる。例えば、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の医薬組成物の用途は含まれる可変領域の配列によって適宜定められるが、抗がん剤であることが好ましい。抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体を有効成分とする場合は、当該二重特異性抗体がインビトロおよびインビボで上皮細胞成長因子受容体を発現する（陽性）腫瘍細胞を有意に排除・殺傷・傷害する作用を有しているので、このようながん細胞に対する抗がん剤として使用することが出来る。
　本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、例えば治療目的、疾患の種類、部位および大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、および投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量または日用量は、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～１０００ｍｇ／ｋｇ体重である。
　本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
　本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、および、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、およびマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
　投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、または病変内経路による注入または注射、および持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。
＜実施例＞
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の態様は以下の実施例の態様には限定されない。
＜酵母での発現＞
　N末端および／またはC末端にペプチドタグを付加したEGFR1およびCD3に対する二重特異性を有する二重特異性抗体を発現させるためのDNAを構築し、Pichia酵母（Pichia pastoris，PPS-9010株，DNA2.0社）において発現させ、発現量に対するペプチドタグ付加の効果を調べた。
ペプチドタグ（PG-12）をta6のN末端、C末端およびNC両末端に付加し（図２）、これにKozak配列と分泌シグナル（α-Factor由来）を付加したうえで、制限酵素BsaIで線状化したPichia酵母用ベクター（pJ902-15，DNA2.0社）に結合させた。得られたプラスミドを制限酵素sacIで線状化し、エレクトロポレーションにてPichia酵母を形質転換した。
　形質転換後のシングルコロニーをYPDプレート培地に塗株し、30℃、24時間インキュベーター中に静置し培養を行った。次に、培養後のプレート培地より滅菌ディスポループで菌体をかきとり、3ml前培養培地（BMGY）を分注した滅菌ポリスチレン製14mlチューブに植菌し、30℃、150 rpm、48時間振盪培養を行った。前培養物を、1,500g・室温で10分間遠心分離を行い、上清を除去後、沈殿を3mLの誘導培地（BMMY）に懸濁し、200 rpm，25℃にて振盪培養を行った。誘導培養中、12時間ごとに培養量の0.5%相当量のメタノールを添加した。
　培養終了後、培養上清に等量の2xサンプルバッファー（ATTO，EzApply，AE-1430）を加え、95℃で10分間加温し、サンプルのSDS化を行った。このサンプルを用いてSDS-PAGEを行った。電気泳動後のゲルを、ニトロセルロースメンブレンに転写し、室温で1時間ブロッキング（ブロッキング溶液 TBS系, ナカライテスク)し、室温で1時間振盪後、TBS-Tでウォッシュし、anti c-myc, monoclonal antibody（wako, 017-21871） を溶解したTBS-Tを加えて1時間インキュベートした。TBS-Tでウォッシュしたのち、anti-Mouse IgG, AP-linked antibody（Cell Signaling Technology，7056）溶解したTBS-Tを加えて1時間インキュベートした。TBS-Tでウォッシュし、アルカリホスファターゼによる発色反応は、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸を含む検出試薬で発色を検出した。
結果
　結果を図３に示す。PG12タグをC末端または両末端に付加したときに発現量の向上が見られた。
＜大腸菌での発現＞
　N末端および／またはC末端にペプチドタグ（PX12-20）を付加したEGFR1およびCD3に対する二重特異性を有する二重特異性抗体を発現させるためのDNAを構築し、大腸菌（Escherichia coli）において発現させ、発現量に対するペプチドタグ付加の効果を調べた。
　配列は以下の通りとし、大腸菌発現ベクターでありT7プロモーターを有するpRAベクターに組み込んで発現させた。
　　PX12-20をsc1のN末端、C末端およびNC両末端に付加（図４）
　　PX12-20をta2のN末端、C末端およびNC両末端に付加（図６）
　　PX12-20をリンカー改変体ta2-STDGNTのN末端、C末端およびNC両末端に付加（図８）
　　PX12-20をリンカー改変体ta6-STDGNTのN末端、C末端およびNC両末端に付加（図１０）
　培養方法および発現確認方法は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
(50x 5052の組成:Glycerol 25g, Glucose 2.5 g, Lactose monohydrate 10.4 g, DW up to 100 mL)
(20x NPSの組成:(NH4)2SO46.6 g, KH2PO4 13.6 g, Na2HPO4 14.2 g, DW up to 100 mL) LB培地以外は培養を始めるときに添加
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
3 mLスケールでの発現確認
　大腸菌発現ベクターを用いて大腸菌BL21 star (DE3)の形質転換を行い、オートインダクション用のLB培地3 mL (Amp (+))に植菌した。28℃, 170 rpmで一晩浸とう培養を行い、培養液を1 mLずつマイクロチューブに取り分けた。4℃, 12000 rpmで5分間遠心し、培地上清(=Culture supernatant)、沈殿に分けた。沈殿にはPBSを200 μL加えたのち超音波破砕を行い、100 μL分のみマイクロチューブに取り分けて4℃, 15000 rpmで5分間遠心し破砕上清(=Intracellular soluble fraction)と破砕沈殿(=Insoluble fraction)に分離した。
　培地上清、破砕上清についてはTCA(トリクロロ酢酸)沈殿による濃縮を行った。1 mLの培地上清には100 μLのTCAを加え、100 μLの破砕上清には、900 μLのMQを加えることで液量を1 mLにした後に100 μLのTCAを加えた。これらを転倒混和して室温で10分間静置し、4℃, 15000 rpmで10分間遠心を行った。上清を捨て、MQを500 μL加え転倒混和して洗浄した後に再度4℃, 15000 rpmで5分間遠心を行い、上清を捨てた。さらに、デシケーターを用いて残った水を蒸発させ、SDS-PAGE用Sample Bufferを30 μLとMQを30 μLずつ加えて95℃で10分間熱処理を行った。
　これらのサンプルを用いてSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルを用いてニトロセルロースメンブレンに転写し、転写を終えたゲルをCBB染色した。ニトロセルロースメンブレンは5% skimmed milk/PBS-Tで30分～１時間ブロッキングを行った後、PBS-Tでウォッシュし、HRP conjugate抗Hisタグ抗体を溶解したPBS-Tを加えて30分間インキュベートした。PBS-Tでウォッシュした後、ルミノールと過酸化水素を含む検出試薬で化学発光を検出した。
フラスコを用いた培養とWestern blottingによる発現確認
　大腸菌BL21 star (DE3)を形質転換し、生えたコロニーに対して1 mLのLB培地を加えて混合し、50 μL分取して3 mLのLB培地(Amp (+))に植菌した。28℃, 170 rpmで17時間前培養を行った。1 mLの前培養液を100 mLまたは200 mLのオートインダクション用培地、または200 mL の2x YT培地に添加し、20℃, 170 rpmで46時間行った。2x YT培地については22時間後に、IPTG誘導をかけた(終濃度1 mM)。
　培養後、1 mLサンプリングし、3 mLスケールでの発現確認の方法と同様にWestern blottingを行った。
　また、200 mLスケールでの培養を行ったものについては、種々の濃度に希釈したmultitopeタグの蛍光強度から検量線を引き、定量を行った。
結果
　図４の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌を2x YT培地 200 mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、濃度既知のmultitopeタグ(Hisタグを含む)の蛍光強度をもとに検量線を引き、検量線をもとにそれぞれの組換えタンパク質の発現量を算出した結果を図５に示す。結果、PX12-20タグをsc１のN末端または両末端に付加した時に沈殿画分における発現量の向上が見られた。
　図６の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌をオートインダクション用培地200 mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、濃度既知のmultitopeタグ(Hisタグを含む)の蛍光強度をもとに検量線を引き、検量線をもとにそれぞれの組換えタンパク質の発現量を算出した結果を図７に示す。その結果、PX12-20タグをta2のN末端、C末端または両末端に付加した時に沈殿画分における発現量の向上が見られた。
　図８の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌をオートインダクション用培地 3 mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、それぞれの蛍光強度をもとに発現量の相対値を算出した結果を図９に示す。その結果、PX12-20タグをta2（STDGNTリンカー）のC末端または両末端に付加した時に沈殿画分および破砕上清における発現量の向上が見られた。
　図１０の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌をオートインダクション用培地 3 mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、それぞれの蛍光強度をもとに発現量の相対値を算出した結果を図１１に示す。その結果、PX12-20タグをta6（STDGNTリンカー）のN末端、C末端または両末端に付加した時に沈殿画分における発現量の向上が見られた。また、PX12-20タグをta6（STDGNTリンカー）のC末端に付加した時には破砕上清および培地上清においても発現量の向上が見られた。
＜細胞傷害活性＞
　実施例2において、大腸菌で発現させたPX12-20をsc1またはta2のN末端、C末端およびNC両末端に付加した分子について、以下の手順でがん細胞に対する細胞傷害活性を調べた。
細胞傷害活性
　96穴プレートにターゲット細胞であるTFK-1細胞を1 well あたり5000 cells/100 μLになるように播種した。37℃、5% CO2濃度で一昼夜インキュベートし、上清を吸引除去した。次に、細胞生存率0%のコントロールとしてMQ 100 μLを4 wellに加え、細胞生存率100%のコントロールとして動物細胞用培地RPMI100 μLを4 wellに加えた。続いてその他のウェルに対しエフェクター細胞であるT-LAK細胞を1 wellあたり25000 cells/50 μLになるように播種した。T-LAK細胞を加えたwellのうち8 wellには50 μLのRPMIを添加し、T-LAK細胞のみの基礎活性を測るためのコントロールとした。次に、T-LAK細胞を加えた残りの80 wellに対し、種々の濃度に希釈したサンプルを50 μLずつ加え(n=4)、37℃、5% CO2濃度で24時間または48時間インキュベートすることでT-LAK細胞からTFK-１細胞への細胞傷害を誘導した。上清を除去した後PBSを用いて3回ウォッシュし、MTS試薬(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)を培地11 mLに対し1 mL加え懸濁したものを1 wellあたり50 μLずつ加えた。37℃、5% CO2濃度で30分～1時間程度インキュベートし、プレートリーダーを用いて490 nmの吸光度を測定した。RPMIのみを加えたwell(細胞生存率100%のコントロール)の490 nmにおける吸光度が0.8程度になるまでインキュベートし、検出したデータを用いてがん細胞傷害活性を算出した。
　MTS試薬には還元されると培地に可溶な有色のホルマザン産物に変換されるテトラゾリウム塩と電子受容体であるPESが含まれる。テトラゾリウム塩は生細胞の脱水素酵素由来のNADHまたはNADPHにより還元され、490 nmに吸収をもつ有色のホルマザン産物にかわるため生細胞数とホルマザン産物の量には比例関係が生じる。この原理を利用して、以下の式を用いてがん細胞傷害活性を算出した。
　がん細胞傷害活性 (%) = (1－(サンプルを添加したウェルの吸光度の平均値－MQのみを添加したウェル)/(動物細胞用培地RPMIのみを添加したウェル－水のみを添加したウェル))×100
細胞傷害活性で用いたサンプルの定量方法
　280 nmにおける吸光度および、アミノ酸配列から算出される吸光係数の値をもとに定量を行った。
結果
　図１２～１４の結果から、PX12-20を付加した二重特異性抗体は、細胞傷害活性が顕著に向上することが分かった。

Claims (17)

  1. 第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをN末端側、C末端側、またはその両方に有することを特徴とする、二重特異性抗体。
    Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ）
    　ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基であり、ｍは０～５の整数であり、ｎは１、２または３であり、ｑは１～１０の整数であり、ｒ＝０～１０の整数である。
  2. 前記ペプチドタグの配列が配列番号２９～８７のいずれかで表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 前記ペプチドタグの配列が配列番号２９または３１のいずれかで表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  4. 第１の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（1H）および軽鎖可変領域（1L）の配列ならびに第２の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（2H）および軽鎖可変領域（2L）の配列の並びが以下のいずれかである、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
    　　1H-1L-2H-2L
    　　1H-1L-2L-2H
    　　1L-1H-2H-2L
    　　1L-1H-2L-2H
    　　1H-2L-1L-2H
    　　1H-2L-2H-1L
    　　1L-2H-2L-1H 
    　　1L-2H-1H-2L
  5. 各可変領域の配列がペプチドリンカーを介して連結されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  6. 前記ペプチドリンカーの長さが、それぞれ１～２０アミノ酸である、請求項５に記載の二重特異性抗体。
  7. 第１の抗原および第２の抗原がヒト上皮細胞成長因子受容体１（EGFR1）およびヒトCD3である、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  8. ヒトEGFR1に対する抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）の配列が、それぞれ配列番号６および８のアミノ酸配列、または配列番号６および８のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトEGFR1に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列であり、
    　ヒトCD3に対する抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）の配列が配列番号２および４のアミノ酸配列、または配列番号２および４のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトCD3に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列である、請求項７に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、請求項８に記載の二重特異性抗体。
    　　OL-5H-5L-OH・・・sc1
    　　OH-5L-5H-OL・・・sc2
    　　5L-OH-OL-5H・・・sc3
    　　5H-OL-OH-5L・・・sc4
    　　5L-OH-5H-OL・・・sc5
    　　OL-5H-OH-5L・・・sc6
    　　5H-OL-5L-OH・・・sc7
    　　OH-5L-OL-5H・・・sc8
    　　5L-5H-OH-OL・・・ta1
    　　OH-OL-5L-5H・・・ta2
    　　5H-5L-OL-OH・・・ta3
    　　OL-OH-5L-5H・・・ta4
    　　5L-5H-OL-OH・・・ta5
    　　OH-OL-5H-5L・・・ta6
    　　OL-OH-5H-5L・・・ta7
    　　5H-5L-OH-OL・・・ta8
  10. 前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、請求項８に記載の二重特異性抗体。
    　　OH-OL-5L-5H・・・ta2
    　　OH-OL-5H-5L・・・ta6
    　　OL-5H-5L-OH・・・sc1
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
  12. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするDNA。
  13. 請求項１２に記載のDNAを含む組み換えベクター。
  14. 請求項１２に記載のDNAまたは請求項１３に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
  15. 前記細胞が、原核細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の形質転換細胞。
  16. 前記原核細胞が、大腸菌であることを特徴とする、請求項１５に記載の形質転換細胞。
  17. 請求項１４～１６のいずれか一項に記載の形質転換細胞を培地で培養し、培地中または形質転換細胞中に請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を蓄積させる工程を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造法。
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