WO2019138571A1

WO2019138571A1 - 細胞解析装置及び細胞解析システム

Info

Publication number: WO2019138571A1
Application number: PCT/JP2018/000796
Authority: WO
Inventors: 靖展伊賀; 峯　泰治; 喜信赤堀
Original assignee: オリンパス株式会社
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2019-07-18

Abstract

細胞解析装置（２００）は、画像取得部（２１２）と、コロニー特定部（２１４）と、距離算出部（２２２）と、出力データ作成部（２４２）とを備える。画像取得部（２１２）は、観察画像のデータを取得する。コロニー特定部（２１４）は、観察画像に写った培養細胞のコロニーと、前記コロニーのコロニー内領域とコロニー外領域とを特定する。距離算出部（２２２）は、少なくとも１つのコロニーのコロニー内領域を含む領域の各位置から最近傍のコロニー外領域までの距離を算出する。出力データ作成部（２４２）は、距離に基づく出力データを作成する。

Description

細胞解析装置及び細胞解析システム

　本発明は、細胞解析装置及び細胞解析システムに関する。

　細胞培養又は培養細胞を用いた各種応用において、培養中の細胞が形成するコロニーの大きさは、有益な情報となる。例えば、国際公開第２０１５／１９３９５１号は、培養細胞が写った画像に基づいて、コロニーの領域を特定し、コロニーの大きさを表す１つの指標であるコロニーの領域の面積を算出することを開示している。コロニーの大きさを示す指標は面積に限らず、種々あり得る。

　本発明は、画像中のコロニーの大きさに係るデータを作成する細胞解析装置及びそれを備える細胞解析システムを提供することを目的とする。

　本発明の一態様によれば、細胞解析装置は、観察画像のデータを取得する画像取得部と、前記観察画像に写った培養細胞のコロニーと、前記コロニーのコロニー内領域及びコロニー外領域とを特定するコロニー特定部と、少なくとも１つのコロニーのコロニー内領域を含む領域の各位置から最近傍のコロニー外領域までの距離を算出する距離算出部と、前記距離に基づく出力データを作成する出力データ作成部とを備える。

　本発明によれば、画像中のコロニーの大きさに係るデータを作成する細胞解析装置及びそれを備える細胞解析システムを提供できる。

図１は、一実施形態に係る細胞解析システムの構成例の概略を示すブロック図である。図２は、一実施形態に係る細胞解析装置の動作の一例について説明するためのフローチャートである。図３は、細胞解析装置の出力データについて説明するための図である。図４は、細胞解析装置の出力データについて説明するための図である。図５は、細胞解析装置の出力データについて説明するための図である。図６は、比較例について説明するための図である。図７は、比較例について説明するための図である。

　［細胞解析システムの概要］
　本実施形態は、細胞培養において用いられる細胞解析システムに関する。細胞培養又は培養細胞を用いた各種応用において、培養中の細胞が形成するコロニーの大きさは、有益な情報となる。本実施形態に係る細胞解析システムは、培養細胞の画像を取得して、当該画像に基づいて培養細胞が形成するコロニーの大きさに係る情報を取得する。

　［細胞解析システムの構成］
　本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。本実施形態に係る細胞解析システム１の構成例の概略を図１に示す。図１に示すように、細胞解析システム１は、培養細胞を拡大観察して、その画像を取得する顕微鏡システム３００を備える。顕微鏡システム３００は、顕微鏡３１０と撮像装置３２０とを備える。顕微鏡３１０は、培養細胞の観察に適した、光学顕微鏡などの各種顕微鏡であり得る。撮像装置３２０は、顕微鏡で拡大した像を撮影するための例えば顕微鏡用カメラである。撮像装置３２０は、顕微鏡３１０のカメラポート等に取り付けられ、撮影によって顕微鏡像に係る観察画像を生成するように構成されている。細胞解析システム１において、顕微鏡システム３００は、培養細胞の画像を取得できれば、どのような形態の装置であってもよい。例えば、培養中の細胞の画像を定期的に取得する場合には、培養装置と組み合わされた撮像装置等であってもよい。

　細胞解析システム１は、制御装置１００と、表示装置４２０と、入力装置４４０とを備える。制御装置１００は、例えばパーソナルコンピュータといったコンピュータによって構成され得る。表示装置４２０には、例えば液晶ディスプレイ、又は有機ＥＬディスプレイ等といった各種表示用の装置が用いられ得る。入力装置４４０は、例えばキーボード、マウス、又はタッチパネル等といった各種入力用の装置を含み得る。

　制御装置１００は、例えばCentral Processing Unit（ＣＰＵ）といった演算用の集積回路を含む。また、制御装置１００は、ＢＩＯＳ等を記録しているRead Only Memory（ＲＯＭ）、ＣＰＵの主記憶装置として機能するDynamic RAM（ＤＲＡＭ）、Static RAM（ＳＲＡＭ）等といったRandom Access Memory（ＲＡＭ）などを含むメモリ１２０を含む。また、制御装置１００は、ＣＰＵで用いられるプログラム、パラメータ等の各種情報、細胞の画像データや解析結果のデータなどを記録する記憶装置１３０を含む。記憶装置１３０には、例えば、Hard Disk Drive（ＨＤＤ）、Solid State Drive（ＳＳＤ）等が用いられ得る。

　制御装置１００は、細胞解析システム１の動作を制御する制御部として機能する。制御装置１００の例えばＣＰＵは、制御回路１１０として機能する。制御回路１１０は、各種演算を行い、各部に動作指令を出力する。制御装置１００は、入力装置４４０からユーザの指示を受け取り、その指示に基づいて各種動作を行い得る。また、制御回路１１０は、撮影制御部１１２、表示制御部１１４等としての機能を発揮する。撮影制御部１１２は、例えば顕微鏡システム３００の撮像装置３２０の動作を制御して、撮像装置３２０に例えば培養細胞の画像を取得させる。制御装置１００は、撮像装置３２０で得られた画像を撮像装置３２０から取得する。また、顕微鏡３１０が電動式の顕微鏡である場合、制御回路１１０は、顕微鏡３１０の動作を制御してもよい。表示制御部１１４は、例えば撮像装置３２０で得られた画像、当該画像に基づいて得られた解析結果、細胞解析システム１の状態などといった各種情報を表示装置４２０に表示させる。

　制御装置１００は、細胞解析装置２００としての機能を発揮する。細胞解析装置２００は、例えば制御装置１００のＣＰＵによって実現されてもよいし、ＣＰＵとは別に、制御装置１００に設けられた例えばApplication Specific Integrated Circuit（ＡＳＩＣ）、Field Programmable Gate Array（ＦＰＧＡ）、又はGraphics Processing Unit（ＧＰＵ）等といった集積回路によって実現されてもよい。細胞解析装置２００は、１つの集積回路等で構成されてもよいし、複数の集積回路等が組み合わされて構成されてもよい。細胞解析装置２００の動作は、例えば記憶装置１３０又は集積回路の記録領域に記録されたプログラムに従って行われる。

　細胞解析装置２００は、画像取得部２１２、コロニー特定部２１４、距離算出部２２２、ヒストグラム作成部２２４、ヒストグラム解析部２２６、画像作成部２２８、出力データ作成部２４２、データ出力部２４４としての機能を有する。

　画像取得部２１２は、例えば撮像装置３２０を用いて得られた培養細胞が写った観察画像のデータを取得する。または、画像取得部２１２は、例えば記憶装置１３０やサーバに記録された画像を読み出すことにより画像のデータを取得する。コロニー特定部２１４は、取得した画像中の解析対象領域について、画像に含まれるコロニーを特定し、コロニーの輪郭、コロニー内領域、コロニー外領域等を特定する。距離算出部２２２は、画像内の各位置、特にコロニー内の各位置から最近傍のコロニー外領域までの距離を算出する。すなわち、距離算出部２２２は、コロニー内の各位置からは最近傍のコロニー外領域までの距離を算出する。コロニー外の各位置では、算出される距離の値は０となる。

　ヒストグラム作成部２２４は、距離算出部２２２が算出した距離のヒストグラムを作成する。ヒストグラム解析部２２６は、ヒストグラム作成部２２４が作成したヒストグラムの特徴量を算出する。この特徴量は、例えば、上述の距離の最大値であったり、ヒストグラムの傾きであったりする。画像作成部２２８は、細胞解析装置２００が出力する出力画像を作成する。画像作成部２２８は、例えば、距離算出部２２２が算出した最近傍のコロニー外領域までの距離を位置毎に色で表した画像、その画像を培養細胞の画像に重畳した画像などを作成する。

　出力データ作成部２４２は、細胞解析装置２００の出力としての出力データを作成する。例えば、出力データ作成部２４２は、ヒストグラム作成部２２４が作成したヒストグラム、ヒストグラム解析部２２６が算出した特徴量、画像作成部２２８が作成した画像などを含む出力データを作成する。データ出力部２４４は、出力データ作成部２４２が作成した出力データを出力する。出力データは例えば記憶装置１３０に記録されてもよいし、出力データに基づいた画像が表示装置４２０に表示されてもよい。

　［細胞解析システムの動作］
　細胞解析システム１は、例えば定期的に、又は、ユーザから指示されたタイミング等に、顕微鏡システム３００を用いて、培養細胞を撮影し、培養細胞の観察画像を取得する。すなわち、制御装置１００は、例えばユーザの操作に基づいて、顕微鏡３１０で拡大された培養細胞の顕微鏡像に係る画像を撮像装置３２０に撮影させる。制御装置１００は、撮影により得られた観察画像を記憶装置１３０に記憶させる。制御装置１００の細胞解析装置２００は、例えば新たな観察画像が得られる度に、撮影により得られた観察画像について解析を行う。制御装置１００は、撮影により得られた観察画像、細胞解析装置２００による解析結果等を適宜に表示装置４２０に表示させたり、記憶装置１３０に記憶させたりする。

　［細胞解析装置の動作］
　細胞解析装置２００の動作について、図２に示すフローチャートを参照して説明する。

　ステップＳ１において、細胞解析装置２００の画像取得部２１２は、例えば記憶装置１３０から、培養細胞に係る観察画像を取得する。ステップＳ２において、細胞解析装置２００のコロニー特定部２１４は、得られた画像を対象として、画像中の細胞のコロニーを特定する。例えば、コロニー特定部２１４は、画像中の細胞のコロニーの輪郭を抽出してもよい。また、コロニー特定部２１４は、画像中の各画素について順に、細胞のコロニーの内側であるか外側であるかを特定してもよい。また、コロニー特定部２１４は、必要に応じてコロニーを構成する各細胞の輪郭を特定してもよい。なお、解析対象は、画像内の全領域であってもよいし、画像内の一部の範囲であってもよい。

　ステップＳ３において、細胞解析装置２００の距離算出部２２２は、解析対象である画像中の各位置から最近傍のコロニー外領域までの距離を算出する。ここで、画像中の各位置は、例えば、観察画像の各画素に対応した位置であってもよいし、各細胞の位置であってもよい。細胞の位置が用いられるとき、解析対象となるのは細胞がある位置のみとなり、細胞がない位置は解析対象外となる。また、注目している各位置についての最近傍のコロニー外領域までの距離とは、文字通り、コロニー外領域の各位置のうち、注目する位置から最も近いコロニー外領域の位置までの距離であり得る。また、これと同等の値を、最近傍のコロニー外領域までの距離としてもよい。例えば、コロニー内領域については、当該コロニーの輪郭又は縁の各位置のうち、注目する位置から最も近い輪郭又は縁の位置までの距離を最近傍のコロニー外領域までの距離としてもよい。コロニーの輪郭又は縁までの距離を最近傍のコロニー外領域までの距離とする場合には、コロニーの外側については、当該距離を算出しない又は０とする。

　ステップＳ４において、細胞解析装置２００のヒストグラム作成部２２４は、ステップＳ３で算出された各位置についての距離の度数分布を表すヒストグラムを作成する。ステップＳ５において、細胞解析装置２００のヒストグラム解析部２２６は、ステップＳ４で作成されたヒストグラムについて必要な解析を行う。ヒストグラム解析部２２６は、解析結果として、コロニーのサイズに係る情報である特徴量を算出する。

　ステップＳ６において、細胞解析装置２００の画像作成部２２８は、出力画像を作成する。例えば、画像作成部２２８は、距離算出部２２２が算出した最近傍のコロニー外領域までの距離を位置毎に色で表した画像（ヒートマップ）を作成する。画像作成部２２８は、このような画像を出力画像としてもよいし、当該画像を、元となった培養細胞が写った画像に重畳することで得られる画像を出力画像としてもよい。

　ステップＳ７において、細胞解析装置２００の出力データ作成部２４２は、出力データを作成する。出力データは、例えば、ステップＳ４で作成されたヒストグラム、ステップＳ５で算出された特徴量、ステップＳ６で作成された画像などを含む出力データを作成する。ステップＳ８において、細胞解析装置２００のデータ出力部２４４は、ステップＳ７で作成された出力データを細胞解析装置２００の外部に出力する。

　出力データの一例について、図３を参照して説明する。図３において、１行目の画像（１－１）、（１－２）、（１－３）は、画像取得部２１２が取得する細胞の画像の例を示す。２行目の画像（２－１）、（２－２）、（２－３）は、最近傍のコロニー外領域までの距離を色で表した画像の例を示す。ここで、黒色は、最近傍のコロニー外領域までの距離が小さい領域を示す。コロニー外領域は、コロニー外領域の各位置からコロニー外領域までの距離が０であるので、黒色となる。白色は、最近傍のコロニー外領域までの距離が大きい領域を示し、コロニーの中心部は、最近傍のコロニー外領域までが遠いため、白色となる。３行目のグラフ（３－１）、（３－２）、（３－３）は、位置毎の最近傍のコロニー外領域までの距離の度数を表すヒストグラムの例を示す。ヒストグラム中の破線は、ヒストグラムの傾きを特定するための近似直線である。

　図３において、各列は、ｔ１、ｔ２、ｔ３の各時刻の結果を示す。１列目のｔ１、２列目のｔ２、３列目のｔ３と順に時間が経過している。したがって、細胞の画像を見ると、画像（１－１）、画像（１－２）、画像（１－３）と順に、細胞数が増えてコロニーが大きくなっている。また、このとき画像（２－１）、画像（２－２）、画像（２－３）のように、コロニーが大きくなるに従って、最近傍のコロニー外領域までの距離は全体的に大きくなる傾向にある。一方で、最近傍のコロニー外領域までの距離は、コロニーが大きくなることに伴って発生し得る隣り合うコロニー同士の接触による影響を受けにくい。

　また、ヒストグラム（３－１）、（３－２）、（３－３）を見ると、細胞数が増えるに従って、上述のとおり、距離の最大値は当然大きくなる。一方で、距離分布の幅は広がるので、破線で示した近似直線を用いて得られたヒストグラムの傾きの絶対値は、ヒストグラム（３－１）、ヒストグラム（３－２）、ヒストグラム（３－３）と順に小さくなる。また、隣り合うコロニー同士の接触によって、距離の値が小さかったコロニーの縁の近傍について、接触個所に近い部分は、コロニーの内部に入ることになるので、距離の値が大きくなる。したがって、ヒストグラムの傾きの絶対値は、コロニー同士が接触することによっても小さくなる。このように、ヒストグラムの傾きの絶対値は、コロニーの大きさ、コロニー同士の接触等を表す値と言える。ヒストグラムの傾きは、小さなコロニーが多数ある場合と大きなコロニーが少数ある場合との判別にも有効である。

　ヒストグラムに基づいてヒストグラム解析部２２６で行われる解析について図４及び図５を参照して説明する。図４は、培養時間の経過に対する最近傍のコロニー外領域からの距離の最大値の変化を示す。距離の最大値は、培養時間が経過して細胞数が増え、コロニーが大きくなるのに伴って大きくなる。また、図５は、培養時間の経過に対するヒストグラムの傾きの絶対値の変化を示す。上述のとおり、ヒストグラムの傾きの絶対値は、培養時間が経過して細胞数が増え、コロニーが大きくなり、コロニーの縁から遠い位置ができるのに伴って、減少する。また、ヒストグラムの傾きの絶対値は、コロニー同士が接触することによっても減少する。本実施形態では、ヒストグラム解析部２２６は、距離の最大値、ヒストグラムの傾きの絶対値等を特徴量として算出する。

　比較例として、１つのコロニーの大きさを特徴量とする場合と比較して説明する。図６は、比較例を説明するための図であり、ハッチングを付した円等がコロニーを模式的に示す。図６は、時間経過に伴うコロニーの大きさの変化を模式的に示す。時刻ｔａ、時刻ｔｂ、時刻ｔｃと時間経過に伴って、２つのコロニーが徐々に大きくなっているものとする。ここで、時刻ｔｃにおいて、２つのコロニーは接触し、１つのコロニーと認識されるものとする。その後も、時刻ｔｄ、時刻ｔｅと時間経過に伴って、コロニーは大きくなるものとする。このときの培養時間の経過に伴う１つのコロニーの大きさの変化を考える。ここで、コロニーの大きさは、コロニーの面積、コロニーの輪郭を楕円近似したときの長軸又は短軸の長さ等で表現され得る。図７は、培養時間の経過に伴う１つのコロニーの面積の変化を示す。コロニーの輪郭を楕円近似したときの長軸の長さも、コロニーの面積と同様の傾向を示す。

　図７に示すように、細胞の増殖に伴って、１つのコロニーの面積は徐々に大きくなる。そして、図６に示すように時刻ｔｃにおいて２つのコロニーが接触する。このとき、接触して１つと認識されるコロニーの面積は、図７に示すように時刻ｔｃにおいて急激に大きくなる。このようなコロニー同士の接触は実際の培養中にはよく発生する。そのためこのように、１つのコロニーの面積を特徴量とすると、その特徴量は、時間に伴って徐々に変化するものである培養細胞の培養状況を適切に表さない。

　これに対して、本実施形態のようにして得られる距離の最大値、及びヒストグラムの傾き等の値は、細胞数の増加に伴って徐々に変化する値であり、コロニーのサイズ、細胞の成長等の状態を適切に表す指標となる。また、距離の最大値、ヒストグラムの傾き等の値は、１つのコロニーではなく多くのコロニーを含む試料全体の状態を表す指標となる。したがって、本実施形態で得られる値は、細胞培養又は培養細胞を用いた各種応用において、有益な情報となる。例えば、本実施形態で得られる値は、継代作業を行うタイミングであるか否かの判断にも用いられ得る。

　［変形例］
　上述の実施形態では、位置毎の最近傍のコロニー外領域までの距離の最大値について、ヒストグラムを作成する解析範囲全体についての最大値として説明した。しかしながらこれに限らず、細胞解析装置２００は、選択した所定のコロニーを解析対象として、当該コロニーにおける距離の最大値を特徴量としてもよい。同様に、ヒストグラムの傾きについても、所定のコロニーを解析対象として作成したヒストグラムの傾きであってもよい。このような解析結果は、解析対象としたコロニーの状態を表す指標として有用である。

　上述の実施形態では、制御装置１００、顕微鏡システム３００、表示装置４２０、入力装置４４０が全体として細胞解析システム１を構成する例を示したが、これに限らない。例えば、細胞解析装置２００が独立していてもよい。すなわち、顕微鏡システムで撮影によって得られた画像のデータは、各種の記憶媒体又はネットワーク上のサーバ等に保存され得る。細胞解析装置２００は、保存された画像データを取得して、解析を行い、解析結果である出力データを各種の記憶媒体又はネットワーク上のサーバ等に保存してもよい。

Claims

　観察画像のデータを取得する画像取得部と、
　前記観察画像に写った培養細胞のコロニーと、前記コロニーのコロニー内領域及びコロニー外領域とを特定するコロニー特定部と、
　少なくとも１つのコロニーのコロニー内領域を含む領域の各位置から最近傍のコロニー外領域までの距離を算出する距離算出部と、
　前記距離に基づく出力データを作成する出力データ作成部と
　を備える細胞解析装置。
　前記観察画像に含まれる所定の範囲についての前記距離のヒストグラムを作成するヒストグラム作成部をさらに備え、
　前記出力データ作成部は、前記ヒストグラムを含むデータを、前記範囲についての前記出力データとして作成する、
　請求項１に記載の細胞解析装置。
　前記観察画像に含まれる所定の範囲についての前記距離のヒストグラムを作成するヒストグラム作成部と、
　前記ヒストグラムの特徴量を算出するヒストグラム解析部と
　をさらに備え、
　前記出力データ作成部は、前記特徴量を含むデータを、前記範囲についての前記出力データとして作成する、
　請求項１に記載の細胞解析装置。
　前記特徴量は、前記ヒストグラムの傾き又は前記距離の最大値である、請求項３に記載の細胞解析装置。
　前記出力データ作成部は、前記観察画像に含まれるコロニーについての前記距離の最大値を含むデータを、当該コロニーについての前記出力データとして作成する、請求項１に記載の細胞解析装置。
　前記観察画像に含まれる所定の範囲について、前記観察画像内の各位置の前記距離の値を色で表した出力画像を作成する画像作成部をさらに備え、
　前記出力データ作成部は、前記出力画像を含むデータを、前記出力データとして作成する、
　請求項１に記載の細胞解析装置。
　前記画像作成部は、前記観察画像に、前記観察画像内の各位置の前記距離の値を色で表した画像を重畳した、前記出力画像を作成する、請求項６に記載の細胞解析装置。
　前記観察画像内の各位置は、前記観察画像の各画素に対応した位置である、請求項１乃至７のうち何れか１項に記載の細胞解析装置。
　前記観察画像内の各位置は、前記コロニーを構成する前記培養細胞の各々の位置である、請求項１乃至７のうち何れか１項に記載の細胞解析装置。
　前記距離算出部は、
　　前記距離として、前記コロニー内領域の各位置から前記コロニーの輪郭までの距離を算出する、又は、
　　前記距離として、前記観察画像内の所定の範囲内の全ての前記各位置から最近傍のコロニー外領域までの距離を算出する、
　請求項１乃至９のうち何れか１項に記載の細胞解析装置。
　請求項１乃至１０のうち何れか１項に記載の細胞解析装置と、
　画像を表示する表示装置と
　を備え、
　前記出力データ作成部は、前記表示装置に表示させる画像データを、前記出力データとして作成し、
　前記表示装置は、前記出力データに基づく画像を表示する、
　細胞解析システム。
　請求項１乃至１０のうち何れか１項に記載の細胞解析装置と、
　データを記録する記憶装置と
　を備え、
　前記出力データ作成部は、前記記憶装置に記録させるデータを、前記出力データとして作成し、
　前記記憶装置は、前記出力データを記録する、
　細胞解析システム。
　顕微鏡と、
　前記顕微鏡によって得られる前記培養細胞の像を撮影し画像データを生成する撮像装置と、
　請求項１乃至１０のうち何れか１項に記載の細胞解析装置と
　を備え、
　前記画像取得部は、前記撮像装置が生成した画像データを前記観察画像のデータとして取得する、
　細胞解析システム。