WO2019135566A1 - 피부노화 특이적 후성유전자 마커 및 이를 이용한 피부노화의 탐지방법 - Google Patents

피부노화 특이적 후성유전자 마커 및 이를 이용한 피부노화의 탐지방법 Download PDF

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methylation
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methylated
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김태억
김동현
김아람
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의료법인 성광의료재단
차의과학대학교 산학협력단
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a skin aging-related haplotype gene marker and a skin aging detection method using the same, and more particularly to a skin aging-specific biomarker comprising a methylated 5'-UTR of an Involucrin gene,
  • the present invention relates to a composition for detecting skin aging or skin aging progression stage comprising an agent for measuring the level of a biomarker.
  • Heterogeneous DNA methylation is a phenomenon in which a methyl group binds to the cytosine of the CpG isl and CpG isl at the gene promoter site, and the DNA methylation inhibits the binding of the gene promoter of the transcription factor And the expression of the gene is inhibited.
  • DNA methylation in the CpG islands of CpG islands at the gene promoter site binds to the corresponding promoter base sequence and inhibits the binding of the promoter base sequence of the transcription factor that regulates the expression of the corresponding gene, Has been reported to be suppressed.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-0122529 discloses a method for detecting the methylation of the CpG island region of a bladder cancer biomarker gene.
  • the methylation level of the CpG region of the ZFP37 gene promoter is Of ovarian cancer patients with platinum-based anticancer drugs 2019/135566 1 »(: 1 ⁇ ⁇ 2018/016907
  • RTI ID 0.0 > information < / RTI >
  • the present invention provides a kit for detecting, detecting, evaluating or diagnosing a skin senescence or skin senescence stage and a kit comprising the same, which comprises an agent for measuring the methylation of methylated 5'-170? do.
  • the present invention also relates to a method for producing methylated 5 ' And a method for providing information necessary for diagnosing skin aging or skin aging progression stage comprising measuring the level of methylation.
  • the present inventors have first, to extract from the skin tissue of induce photoaging rat 6 -) 11 5 (1 ⁇ 1 61;] 1 1 6 (1 ⁇ 1 ⁇ 11101 ⁇ 6 ( ⁇ 1) 31; subjected to ®) analysis were selected for gene candidates regulated by epigenetic.
  • the present invention provides a biomarker for measuring skin senescence, comprising a methylated at 5 '-UTR (Untranslated region) region of Involucrin gene .
  • Involucrin is known as a protein constituting mammalian skin. It is known that expression of genes and proteins encoding Involucrin by photo-induced induction is increased.
  • the Involucrin protein is derived from mammals such as primates, including humans (Homo sapiens), rodents including Mus musculus, rat (Rattus norvegius), and amphibians such as frogs (Xenopus l aevi s)
  • mammals such as primates, including humans (Homo sapiens), rodents including Mus musculus, rat (Rattus norvegius), and amphibians such as frogs (Xenopus l aevi s)
  • human Involucrin Accession No. NP_005538.2. (Gene: NM_005547.3.)
  • NP_005538.2 Gene: NM_005547.3.
  • the methylated Involucrin gene is shown in SEQ ID NO. 1, < / RTI > but not limited to, the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 represents the entire nucleotide sequence of the Involucr in gene.
  • CG in bold type indicates the CpG island region where methylation occurs during UV irradiation, and the bold ATG is the initiation codon.
  • the underlined part is the 5'-UTR part of Involucr in gene.
  • SEQ ID NO: 2 represents the entire nucleotide sequence of the Involucr in gene of SEQ ID NO: 1,
  • SEQ ID NO: 3 shows the 5 '-UTR site in the nucleotide sequence of the Involucr in gene of SEQ ID NO: 1, and the CG in bold type indicates a CpG island site where methylation occurs during UV irradiation, and the bold ATG is a codon to be.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of the CpG island region in which the methylation is likely to occur in the 5'-UTR region of SEQ ID NO: 3. More specifically, the nucleotide sequence of the CpG island- to be.
  • SEQ ID NO: 5 shows the sequence of the Exon2 site encoding Involucrin protein Base sequence, bold .
  • the methylated 5'-UTR of the Involucr in gene means that methylation has occurred in the CpG islands of the 5'-UTR regulating the expression of the Involucr in gene, and the 5'-UTR is based on the Involucr in gene promoter Can be present downstream or upstream, preferably downstream of the Involucr in gene promoter.
  • the Involucrin gene includes a promoter, a start codon (ATG), a stop codon (TGA) - (3 'UTR) -
  • Transciption Terminal structure, and the methylation site can be located between the start codon (ATG) sequence and the transciption start si te downstream of the promoter.
  • the 5 '_UTR portion of the Involucr in gene (Accession No. NP_005538.2.) That is methylated is located at the position of the 11'th nucleotide sequence of the Involucr in gene of the Involucr in gene of SEQ ID NO: To the ATG sequence starting from the nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 3),
  • the CpG site in the IVL nucleotide sequence was selected through the Methpr imer tool.
  • a portion of the 5'-UTR of SEQ ID NO: 4 When polynucleotides are integrated with CpG islands and skin aging by UV occurs, Methyl ation may occur in the CpG island of the region.
  • CpG island present in the nucleotides corresponding to nucleotides 1174, -1155, and -10 of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide of SEQ ID NO: and the CpG islands present in the 783rd nucleotide are methylated, and most preferably all of the CpG islands in the 680th, 699th, and 783th nucleotides may be methylated .
  • the methylation of the CpG island in the 5'-UTR region of the Involucrin gene in the cell is increased, and the Involucrin gene or Involucrin protein Expression increases.
  • the methylated 5'-UTR site of the Involucrin gene can be used as a biomarker for skin aging.
  • the term " skin aging " is primarily due to external and internal processes associated with increased wrinkling, sagging, and sagging, and external aging is most often caused by exposure to ultraviolet rays (UV) Therefore, it is generally called 'photoaging'.
  • Naturally aged skin is smooth, pale, and has fine wrinkles, but photoaged skin has thick wrinkles and causes pigmentation and capillary dilatation. Damage to collagen, a major structural component of the skin, is considered to be a major factor in skin aging and is found in both natural aging and photoaging skin. Collagen damage is partially mediated by matrix metalloproteinase (MMP).
  • MMP matrix metalloproteinase
  • MMP is a structurally related family of matrix-degrading enzymes and plays an important role in various degradation processes such as inflammation, tumor invasion and skin aging.
  • the level of MMP is increased by various stimuli such as ultraviolet light, oxidative stress and cytokine, and ultraviolet irradiation promotes DNA binding of activator protein-1 (AP-1), collagenase (MMP- 1), stromelysin (MMP-3), and gelatinase (MMP-9). Once collagen is degraded by MMP-1, it is further degraded by MMP-3 and MMP-9.
  • AP-1 activator protein-1
  • MMP-1 collagenase
  • MMP-3 stromelysin
  • MMP-9 gelatinase
  • the skin aging may mean aging of the skin or aging of the skin caused by UV, and the aging of the skin may be characterized by an increase in the wrinkle formation or an increase in the thickness of the skin epithelium, It can mean light skin aging.
  • the skin aging step refers to a step in which skin aging occurs due to an external and internal process, and specifically occurs through the following process.
  • keratin synthesis of keratinocyte is reduced, depletion of keratinocyte, keratohylanin, and various enzymes is worsened, and dead keratinocytes do not fall off and stagnate, thickening of keratinocytes, It can be confirmed that the phenomenon is deepened and the phenomenon of moisture transfer to the base layer is slowed down. Next, the production of sebum is reduced and the distribution of melanin pigment becomes irregular, and the skin becomes a whole face dull.
  • the skin aging step may mean all steps including the step of increasing the keratinocyte layer and lowering the skin elasticity, but the present invention is not limited thereto.
  • Another example of the present invention provides a composition for detecting skin aging or progression of skin aging comprising an agent for measuring the methylation of the 5'-UTR of Involucrin gene and a kit comprising the composition.
  • the agent for measuring the methylation of the 5'-seed of the Involucr in gene may be a PCR primer set for amplifying the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 including the methylated CpG island of the methylated 5'-UTR of Involucr in gene.
  • the PCR primer set includes at least one CpG sequence in the primer base sequence, and considering that the unmethylated cytosine is converted into uracil in the Bi sul fi te conversion step, the methylated and unmethylated primers are designed to have similar Tm values Means a primer set capable of accurately determining DNA methylation when PCR is performed using the above primer set.
  • the PCR primer set comprises a primer set comprising a first primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6 and the base sequence of SEQ ID NO: 7, and a second primer pair consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 and the base sequence of SEQ ID NO: .
  • methyl ation specif ic PCR uses a first primer pair consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 And a second primer pair consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 can be used as the unmethyl ation specif ic PCR.
  • the detection of the 5'UTR methylation of the Involucrin gene can be performed by PCR, methylation specific PCR, real-time methylation specific PCR, methylated DNA But are not limited to, PCR using a specific binding protein, quantitative PCR, DNA chip, pyrosequencing, and bisulfite sequencing.
  • primer &quot means a short nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template (templat e) with a short free 3-terminal hydroxyl group and functioning as a starting point for template strand copying .
  • Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for the polymerization reaction (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at appropriate buffer solutions and temperatures.
  • Sense and antisense nucleic acids having from 50 to 50 nucleotide sequences can incorporate additional features that do not alter the basic properties of primers that serve as a starting point for DNA synthesis.
  • the kit of the present invention may include an agent for measuring the methylation of the Involucr in gene 5'-UTR in which the expression is increased by aging of the skin.
  • the kit may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices as appropriate.
  • the kit also detects skin aging markers by measuring the methylation of the 5 '-UTR region of the Involucrin gene, Can be measured.
  • the skin aging may mean aging of the skin or aging of the skin caused by UV, and the aging of the skin may be an increase in the wrinkle formation or an increase in the thickness of the skin epithelium, .
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information necessary for diagnosis of a skin aging or skin aging process step comprising measuring the methylation of the 5'-UTR of Involucr in gene.
  • the above method can be used for monitoring UV-induced skin damage, developing biomarkers for skin aging diagnosis, and developing anti-aging skin cosmetics.
  • the 5 '-UTR methylated portion of the Involucr in gene may be methylated in the cytosine of a CpG island (CpG island) present in nucleotides 680, 699, and 783 in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, But is not limited thereto.
  • the measurement of the methylation can be carried out by PCR, methylation specific PCR (Methyl at i on speci fi c
  • the PCR primer set for amplifying the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 including the methylated CpG island of UTR may be used to generate amplified products or sequence analysis.
  • the PCR primer set for amplifying the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 comprises a first primer pair consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and the second primer pair comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: And a second primer pair consisting of a base sequence.
  • the present invention relates to detection of skin aging or skin aging progression stages comprising a skin aging specific biomarker comprising a methylated 5 ' -UTR of the Involucr ' s gene and an agent for measuring the level of said biomarker
  • the present invention relates to a composition for preventing skin aging and skin aging, It can also be applied to the monitoring of the process.
  • Fig. 1 shows the result of confirming Involucr in DNA methylation in a skin photo-visualization model according to Example 2-1 of the present invention.
  • Fig. 2 shows the results of analysis of in vinculin gene expression in a skin photo-visualization model according to Example 2-2 of the present invention.
  • Fig. 3 shows the relationship between DNA methylated wainbolculin gene expression in a skin photoengrave model according to Example 2-3 of the present invention.
  • Fig. 4 shows the change in the expression of inbolucurin mRNA in the skin photoaging model according to Example 3 of the present invention.
  • FIG. 5A is a graph showing the results of IVL of human-derived immortalized keratinocyte (HaCaT) according to Example 4-3 of the present invention. Gene methyl ation specif ic PCR results are shown.
  • FIG. 5B is a graph showing changes in fluorescence intensity after treatment with UV only and UV irradiation with Methyl at ion / Unmethyl ation (FIG. 5B) when DHPV was treated after treatment with UV alone for human immortalized keratinocytes (HaCaT) M / U) ratio.
  • 5C shows the CpG site of the IVL nucleotide sequence obtained by inserting the DNA of the 5'-UTR region of the inbolukreen gene into the Meth Pr imer tool and using this tool, and finally, five primer sets selected.
  • Fig. 6 shows the results of measurement of relative IVL mRNA expression levels when human-derived immortalized keratinocytes (HaCaT) were treated with UV only and DHPV treated with UV treatment according to Example 4-5 of the present invention .
  • FIG. 7 is a graph showing the change in the amount of IVL protein when treated with only UV in human-derived immortalized keratinocyte (HaCaT) and with UVN-treated DHPV at a concentration of 0.5 nM and InM according to Example 4-5 of the present invention The results of the measurement of the change of expression.
  • a skin photoaging mouse model was prepared as follows.
  • mice 6-week-old female albino hair less mice (Skh-1) (Pycnogenol, Pyc) at a dose of 625 mg / kg / day five times a week and received TL20W / 12RS UV (cocao powder, baba Cal lebaut, Lebbeke-Wieze, Belgium)
  • a photovoltaic mouse model was constructed by irradiating 100 ⁇ 200 mJ ⁇ : m2 UV using l amps (Phi lips, Eindhoven, The Nether lands).
  • UVB-only UVB-free mice The intensity of UV light was gradually increased to 100 mJ / cm2 in the second week, 150 mJ / cm2 in the second week, and 200 mJ / cm2 in the fourth week 8.
  • the photoautotization mouse model obtained tissue through Biopsy on the 8th week In order to select a skin aging marker gene, tissues were taken from a photoaging mouse produced by the above method, and the following experiment was conducted.
  • mice tissues were biopsied in the prepared photoautotrophic mouse, rapidly cooled using liquid nitrogen, and then genomic DNA was extracted using G-spinTM Total DNA Extraction Kit (Intron, Gyeonggi-do, Korea) The entire show was extracted using RNeasy Plus Mini Ki (Qiagen, Valencia, USA). The extracted total RNA was electrophoresed on 1% (w / v) agarose gel to confirm the 18S and 28S RNA bands and high quality whole RNA was extracted.
  • Example 2 Involucrin DNA methylation and
  • RNA-sequencing data analysis (TheragenEtex , Korea) were performed.
  • UV + CP mice received CP at 156.3 mg / kg / day after UV irradiation.
  • the expression of Involucr in mRNA was increased about 1.5 times by the UV treatment, and conversely, the amount of mRNA increased by UV was restored when treated with UV and cacao CP treatment or UV and Pyc treatment Respectively.
  • Example 3 Involucrin gene expression change in mouse skin photo-aging model To examine the Involucr in gene expression change in the mouse skin photo-aging model, tissues were taken from the photoautotated mouse prepared in the same manner as in Example 2-1, and the total RNA was extracted in the same manner as in Example 2-2, And q-PCR (quantitative RT-PCR) was performed in the same manner as described above.
  • cDNA was synthesized by applying total RNA extracted by the same method as in Example 2-2 to miScr ipt II RT Ki (Qi agen, Hi 1 den, Germany), and miScr ipt SYBR Green PCR Ki t (Qi agen , And the Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) were used for PCR amplification using the miScr ipt mi croRNA PCR Array (Qi agen, Hi lden, Germany) Q-PCR was performed using the mIVL_F, mIVL_R primer set (F: SEQ ID NO: 2 / R: SEQ ID NO: 3) in Table 2.
  • GAPDH_F and GAPDH_R primer sets (F: SEQ ID NO: 4 / R: SEQ ID NO: 5) in Table 2 were used as a house keeping gene for gene expression, that is, a control group. All reactions were performed on a 96-well plate and relative mRNA expression levels were calculated using mean values.
  • a human skin photoaging cell model was prepared as follows.
  • Immortalized human kerat inocytes 5 x 105 cells of HaCaT cells were dispensed into a 100-mm di dish containing DMEM (5% FBS) medium and incubated for 48 hours at 37 ° C C02 incubator. The cells were removed from the incubator and replaced with serum-free medium. After 12 hours, the cells were washed with PBS, and 4 mL of PBS was added to di sh. The cells were washed with UV cross-linker (UVP, CA, USA) And UV of 100 mJ / cm < 2 > was applied thereto.
  • UV cross-linker UV cross-linker
  • DMEM 5% FBS
  • DMEM 5% FBS
  • keratinocyte HaCaT
  • DHPV 5- (3 ', 4' -19 di hy dr oxypheny 1) -gamma- c alero lactone
  • DHPV is used as a positive control for cacao powder.
  • the cacao powder containing various substances is ingested or treated, the physical properties of the cacao powder are changed by the metabolism in the body, and the cacao powder of the changed physical properties produces an effect in the actual body.
  • HaCaT cells can not model the metabolism that occurs in vivo. Therefore, it is possible to measure the effect of cacao powder more clearly when treating DHPV, which is a product obtained by metabolizing cacao powder in vivo, and to accurately determine the substance exhibiting the effect of preventing photoaging among the metabolites of cacao powder.
  • Example 4-1 The human photoaged skin cells prepared in Example 4-1 were harvested, The show was extracted using the NucleoSin® Tissue Kit (Macherey-Nagel, Germany). The extracted DNA was quantitated using Nano Drop and the quality was confirmed. Next, the unmethylated cytosine residues were converted to uracil residues by bisulfite treatment using EZ DNA Methylation-Lightning TM Kit Uymoresearch, CA, USA for methylation analysis of extracted DNA.
  • methylation-specific PCR primer In preparing the methylation-specific PCR primer, at least one CpG sequence was included in the primer and the methylated and non-methylated primer had a similar Tm value. In the bisulfite conversion process, the unmethylated cytosine was transformed into uracil, The methylation of the gene was accurately measured by measuring the amount of the methylated gene relative to the unmethylated gene in the same gene sequence that could be expressed in the entire gene pool. IVL_MF / IVL_ ⁇ primer pair (F: SEQ ID NO: 6 / R: SEQ ID NO: 7) was prepared and used to perform methylation specific PCR in consideration of the above matters (Table 2). ⁇
  • the untranslated region 5'-UTR site between the transcription start site and the start codon that is, the first to 1853th sequence from the 5 'end of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 (-lbp- 1853bp) was inserted into the Meth Primer tool program.
  • the Meth Primer tool selects methylated and unmethylated primer sequences to select one or more CpG sites in each primer by screening the CpG sites in the input sequence.
  • the IVL nucleotide sequence corresponding to the 673th to the 783rd nucleotides from the 5'end of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 was selected as the CpG site, and a total of 5 Thereby obtaining a primer set (Fig. 5C).
  • the experiment was carried out using the primer sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9 of Table 2 above.
  • the methyl-ion specific PCR was performed using the IVL_MF (SEQ ID NO: 6) and IVL_ (SEQ ID NO: 7) primer sets for the -1179 to -1065 sites from the initiation codon ATG in the Involucr in polynucleotide sequence (SEQ ID NO: Respectively.
  • the -1181 to -1067 sites from ATG correspond to IVLJF (SEQ ID NO: 8) and
  • Unmethyl ation specif ic PCR was performed using IVL_UR (SEQ ID NO: 9).
  • the methylated region of the IVL was the 5'-UTR portion of the IVL, and the methylation in the CpG island at the 680th, 699th, and 783th positions from the 5'end of the polynucleotide of SEQ ID NO: .
  • the skin prepared by the UV irradiation prepared in Example 4-1 and the skin treated with UV and the DHPV treated cells were subjected to IVL_MF (SEQ ID NO: 6) and IVL_MR (SEQ ID NO: 7) primers were used to perform methyl ation specif ic PCR under the same conditions as the PCR method described in Example 4-2, and IVL_UF (SEQ ID NO: 8) and IVL_UR No. 9) was used to perform unmethylat ion specific PCR, and the level of methylation occurring at the IVL gene site was confirmed from the results (FIGS. 5A and 5B).
  • hIVL_F SEQ ID NO: 10
  • hIVL_R SEQ ID NO: 11
  • the GAPDH_F and GAPDH_R primer sets (F: SEQ ID NO: 4 / R: SEQ ID NO: 5) were used as a house keeping gene for gene expression, that is, a control.

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Abstract

본 발명은 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 메틸화된 5' -UTR을 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용 조성물에 관한 것이다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
피부노화 특이적 후성유전자 마커 및 이를 이용한 피부노화의 탐지방법
【기술분야】
본 발명은 피부노화 관련 후성 유전자 마커 및 이를 이용한 피부 노화의 탐지 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 인볼루크린 (Involucr in) 유전자의 메틸화된 5’ -UTR을 포함하는， 피부노화특이적인 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화진행단계의 탐지용조성물에 관한것이다.
【배경기술】
후성유전자 DNA 메틸화는 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬 (CpG i s l and)의 시토신 (cytosine)에 메틸기가 결합하는 현상으로， 상기 유전자 DNA 메틸화로 인해서 전사 인자 (transcr ipt ion factor)의 유전자 프로모터의 결합이 저해되어 해당 유전자의 발현이 저해되는 것으로 알려져있다.
최근, 후생유전자 (Epigenet ic) , DNA메틸화 (DNA Methylat ion)측정을 통해 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있고. 유전자프로모터 부위의 CpG 섬 (CpG i s land)의 시토신 (cytosine)에서 일어나는 DNA 메틸화에 의해서 해당 프로모터 염기서열에 결합하여 해당 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 프로모터 염기서열에 대한 결합이 저해되어 특정 유전자의 발현이 억제됨이 보고되고있다.
특히， 종양억제유전자의 메틸화에 대한연구는암의 치료제 개발에 중요한 단초를 제공할 수 있고， 이러한 이유로 종양 관련 유전자의 메틸화를조사하여 각종암진료에 사용하려는시도가활발하게 이루어지고 있으나 (Estel ler， M. et al . , Cancer Res. , 59:67, 1999； Sanchez-
Cespedez, M. et al . , Cancer Res. , 60:892, 2000； Ahlqui st , D.A. et al . , Gastroenterol . , 119: 1219， 2000)， 현재까지는피부노화와관련된 유전자의 메틸화에 대한연구는초기단계에 머물러 있는실정이다.
대한민국 공개특허공보 제 2014-0122529호에는 방광암 바이오마커 유전자의 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 방법에 대해 개시되어 있고， 대한민국 등록특허공부 제 10-1597812호에는 ZFP37 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화수준을측정하여 난소암환자의 백금 기반의 항암제에 대한 2019/135566 1»（：1^1{2018/016907
반응성 예측정보를제공하는조성물에 대해 개시되어 있다.
그러나， 피부노화와 관련된 유전자의 후성유전자 쇼 메틸화와의 상관관계 및 이를 이용한피부노화진단 방법에 대해서는 아직까지 알려진 바가없다.
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
본 발명은 인볼루크린 (1^01110· ) 유전자의 메틸화된 5’ -1111? 부위를포함하는피부노화측적용바이오마커를제공한다.
또한, 본발명은 인볼루크린 유전자의 메틸화된 5’ -170?의 메틸화를 측정하는제제를포함하는 , 피부노화또는피부노화진행단계의 탐지， 검출， 평가또는진단용조성물및 이를포함하는키트를제공한다.
또한, 본 발명은 인볼루크린 유전자의 메틸화된 5’
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메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 진단에 필요한정보의 제공방법을제공한다.
본 발명의 추가 목적은 피부노화 특이적 바이오마커인 인볼루크린 유전자의 메틸화된 5’ -［凡!?을 이용한 피부노화 억제 약물의 스크리닝 방법을제공하는것이다. 、
【기술적 해결방법】
본 발명은 인볼루크린 (1^0111(:1· ) 유전자의 메틸화된 5’ -［凡묘을 포함하는， 피부노화 특이적 바이오마커와 상기 바이오마커의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행.단계의 탐지용 조성물， 및 이를 이용한 피부노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한것이다. 본발명자들은우선, 광노화를유도한쥐의 피부조직으로부터 를 추출하여 6［)115(1\161；］1 1 6(1 ^1^11101江6(^1) 31； ®) 분석법을 실시하여 후생유전학적으로조절되는유전자후보군을선별하였다 .
일반적으로 후성유전자 · 메틸화가 일어날 경우， 전사 인자 (七대113(：01)1^011 군크(：1；01· )의 유전자 프로모터의 결합이 저해되어 해당 유전자의 발현이 저해되는 것으로 알려져 있다. 종래에는 피부 광노화에 의해서 111^0111(:1·^ 유전자 및 단백질의 발현이 증가함이 밝혀졌으며., 따라서 1^0111(:1^11 유전자의 메틸화는 광노화에 의해서 감소될 것이라 예상되어 왔다. 그러나 본 발명자들은 기존에 추측된 것과 상반되는 결과로써, 광노화유도에 의해 발현이 증가된 인볼루크린 (Involucr in) 유전자의 5’ - UTR부분， 특히 5’ -UTR의 CpG섬의 메틸화가증가됨을새로이 밝힘으로써 본발명을완상하였다.
이하본발명을더욱자세히 설명하고자한다. 본 발명은 인볼루크린 (Involucr in) 유전자의 메틸화 (Methyl at ion)된 5’ -UTR( Untrans lated region) 부위를 포함하는, 피부노화 측정용 바이오마커를제공한다.
상기 인볼루크린 (Involucr in)은 포유류의 피부를 구성하는 단백질로 알려져 있으며, 광노화유도에 의해서 Involucr in을 암호화하는유전자 및 단백질의 발현이 증가하는것으로알려져 있다.
Involucr in 단백질은 인간 (Homo sapiens) 등을 포함하는 영장류, 마우스 (Mus musculus) , 래트 (Rattus norvegi cus) 등을 포함하는 설치류 등의 포유류， 개구리 (Xenopus l aevi s) 등의 양서류 등으로부터 유래한 것일 수 있으며， 예컨대， 인간 Involucr in (Accession no. NP_005538.2. (유전자: NM_005547.3. ))일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.
상기 메틸화된 Involucr in 유전자는 표 1의 서열번호 . 1의폴리뉴클레오타이드서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
표 1의 서열번호 1은 Involucr in유전자의 전체 염기서열을 나타낸 것이며, 굵은 글씨로 나타낸 CG는 UV조사시 메틸화가 일어나는 CpG 섬 부위를 나타나며， 굵은 글씨 ATG는 개시코돈이다. 밑줄로 표시한 부분은 Involucr in유전자의 5 ' -UTR부분을표시한것이다.
서열번호 2는서열번호 1의 Involucr in유전자의 전체 염기서열 중，
Transcr ipt ion si te를포함하는 Exonl부위의 염기서열을나타낸것이다. 서열번호 3은서열번호 1의 Involucr in유전자의 잔체 염기서열 중, 5' -UTR부위를나타낸 것이며， 굵은글씨로나타낸 CG는 UV조사시 메틸화가 일어나는 CpG섬 부위를나타나며 , 굵은글씨 ATG는개시코돈이다.
서열번호 4는 서열번호 3의 5' -UTR 부위 중 메틸화가 일어날 가능성이 큰 CpG 섬 부위 의 염기서열을 나타낸것으로, 구체적으로 Meth pr imer tool을통해 IVL염기서열중 CpG섬 집약부위를선별한부분이다.
서열번호 5는 Involucr in 단백질을 코딩하는 Exon2 부위의 염기서열이며， 굵은글씨
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나타낸다.
[표 1]
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상기 Involucr in유전자의 메틸화된 5’ _UTR은 Involucr in유전자의 발현을 조절하는 5’ -UTR의 CpG 섬 (Is land)에 메틸화가 일어난 것을 의미하며， 상기 5’ -UTR은 Involucr in 유전자 프로모터 기준으로 다운스트림 (downstream) 또는 업스트림 (upstream)에 존재할 수 있으며， 바람직하게는 Involucr in 유전자 프로모터의 다운스트림에 존재한다 . 구체적으로 상기 Involucr in 유전자는 (Promoter )-(Transcr ipt ion start si te)-(5’ UTR)-(start codon, ATG)-(stop codon , TGA)-(3’ UTR)-
(Transcr ipt ion Terminal ) 구조를 가지며， 메틸화 부위는 프로모터의 다운스트림의 Transcr ipt ion start si te와 시작코돈 (ATG) 서열 사이에 위치할수있다.
본 발명의 일 예에 따르면， 상기 메틸화되는 Involucr in 유전자 (Access ion no. NP_005538.2. )의 5’ _UTR 부분은 서열번호 1의 Involucr in 유전자의 시작 코돈 (ATG) 서열을 기준으로 -1189 번째에 해당하는 뉴클레오타이드 서열로부터 시작 코돈인 ATG 서열까지 포함한다 (서열번호 3)，
또 다른 본 발명의 일 예에 따르면, 상기 Involucr in 유전자의 메틸화된 5’ -UTR 부위는 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열의 5’ 말단으로부터 673번째 내지 812번째 뉴클레오타이드로 이루어진 군 (서열번호 4)에서 선택된 하나 이상의 염기가 메틸화된 것일 수 있다. 상기 범위는하기 실시예에서 확인한바와 같이, Meth pr imer tool을통해 IVL 염기서열 중 CpG부위를선별한 것이다. 서열번호 4의 5’ -UTR의 일부 폴리뉴클레오타이드에 CpG island가 집약되어 있으며， UV에 의한 피부노화가 발생할 경우， 상기 부위의 CpG island에서 Methyl at ion이 일어날수있다.
상기 UV에 의해 Involucr in 유전자 (Accession no . ’ NP_005538.2. )의 5’ -UTR 부분에서 메틸화된 염기는 서열번호 1의 시작코돈 (ATG)로부터 -
1174, -1155, -10기번째에 해당되는 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬 (CpG island)의 시토신 (cytosine)일 수 있다.바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5’ -말단으로부터 680번째， 699번째， 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG섬으로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 CpG섬이 메틸화된 것일 수 있으며,가장바람직하게는 680번째, 699번째， 783번째뉴클레오타이드에 존재하는 CpG섬 모두가메틸화된것일수있다. 하기 실시예에서 밝힌 바와 같이， 피부의 노화 또는 피부 노화가 진행된 경우， 세포내의 Involucr in 유전자의 5’ -UTR 부위의 CpG 섬 (Island)의 메틸화가 증가하게 되며， 세포 내의 Involucrin 유전자 또는 Involucrin 단백질의 발현이 증가한다. 따라서， Involucrin 유전자의 메틸화된 5’ -UTR부위를피부노화측적용바이오마커로사용할수있다. 본 명세서에서 용어， “피부노화”는 흔히 주름， 처짐 및 늘어짐의 증가와 관련된 외적 및 내적 (자연적)인 과정에 의한 것으로서， 외적 노화는 반복되는 자외선 (ultraviolet rays, UV) 노출에 의해 주로 발생하기 때문에 이를 일반적으로 '광노화가고 한다. 자연적으로 노화된 피부는 매끄럽고 창백하며 잔주름이 있으나, 광노화된 피부는 굵은주름이 생기며 색소침착 및 모세혈관 확장증을 야기한다. 피부의 주요 구조적 구성요소인 콜라겐의 손상은 피부 노화의 주된 요인으로 여겨지고 있으며 자연적인 노화 및 광노화 피부 모두에서 확인된다. 콜라겐 손상은 부분적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase;
■미의 유도와 관련된다. MMP는 매트릭스-분해 효소와 구조적으로 연관된 패밀리로서, 염증， 종양 침습 및 피부 노화와 같은 다양한 분해 과정에 중요한 역할을 수행한다. MMP의 수준은 자외선 광， 산화적 스트레스 및 사이토카인 등과 같은 다양한 자극에 의해 증가하고， 자외선 조사는 활성 단백질 (activator protein-1； AP-1)의 DNA 결합을 촉진시키고， 콜라게나제 (MMP-1), 스트로멜리신 (MMP-3), 및 젤라티나제 (MMP-9)와 같은 MMP를 유도한다. 콜라겐이 MMP-1에 의해 일단 분해되면 MMP-3및 MMP-9에 의해추가로분해된다. 본 발명에 있어서， 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를의미할수 있고， 상기 피부노화는주름 형성이 증가하거나피부 상피세포의 두께가 증가하는 특징을 갖는 것일 수 있으며， 바람직하게는 광피부노화를의미할수있다.
상기 피부노화 단계는 외적 및 내적인 과정에 의한 피부노화가 일어나는 단계를 말하며， 구체적으로 하기와같은 과정을 거쳐 일어난다. 표피의 경우 각질형성 세포의 케라틴 합성이 감소되며 필라그린， 케라토히알린 및 여러 효소의 감소로 탈수형상이 심해지고 죽은 각질세포들이 떨어져 나가지 못하고 정체되어 각질 세포층이 두터워 지며， 이 후 각질층의 수분 결핍 현상이 심화되고 기저층까지 수분 이동 현상이 둔화됨을 확인할 수 있다. 다음으로 피지 생산이 감소되며 멜라닌 색소의 분포가 불규칙해져 피부가 전체적으로 얼굴덜룩해 진다. 진피의 경우 콜라겐과 탄력섬유가 경화 및 불용성이 되며, 피부 탄성 관련 인자들의 가교화 과정을 거치게 된다. 다음으로 노화의 진행에 따라 기질 (ground substance)의 감소로 피부의 주름이 늘어나게 되며 히알루론산의 양이 점차로 감소하게 된다. 상기 피부노화단계는각질 세포층의 증가및 피부 탄력의 저하 단계를 포함하는 모든 단계를 의미할 수 있으나， 이에 제한되는것은아니다. 본 발명의 또 다른 일 예는， Involucr in 유전자의 5’ -UTR의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용조성물및상기 조성물을포함하는키트를제공한다.
상기 Involucr in 유전자의 5’ - 묘의 메틸화를 측정하는 제제는 Involucr in 유전자의 메틸화 5’ -UTR의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를증폭하기 위한 PCR프라이머 세트일 수 있다.
상기 PCR프라이머 세트는 프라이머 염기서열 내에 최소한 하나 이상의 CpG 서열을 포함하고， Bi sul f i te conversion 과정에서 비메틸화된 시토신이 우라실로 변형됨을 고려하여， 메틸화와 비메틸화 프라이머가 유사한 Tm값을갖도록제작된 것으로, 상기 프라이머 세트를사용해 PCR을 수행했을 때 DNA 메틸화를 정확히 즉정할 수 있는 프라이머 세트를 의미한다.
구체적으로, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를증폭하기 위한 PCR프라이머 세트는서열번호 6의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 쌍, 및 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로이루어진 제 2프라이머 쌍을포함하는프라이머 세트일 수 있다. 예를 들어， IVL ^-UTR부위에 메틸화된 CpG 섬의 위치를 파악하기 위해， methyl at ion speci f ic PCR은 서열번호 6 의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열 로 이루어진 제 1 프라이머쌍을 사용하고, unmethyl at ion speci f ic PCR은 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진제 2프라이머 쌍을사용할수있다.
상기 Involucr in 유전자의 5’_UTR의 메틸화를 측정하는 제제의 검출은 PCR, 메틸화특이 PCR (methyl at ion speci f i c PCR) , 실시간 메틸화 특이 PCR(real t ime methyl at ion speci f ic PCR) , 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩， 파이로시퀀싱 및 바이설파이트시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.
본발명의 용어， "프라이머”는짧은자유 3말단수산화기를가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (templ ate)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트가닥복사를위한시작지점으로기능을하는짧은핵산서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한， 프라이머는， 7개 내지 50개의 뉴클레오타아드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서， DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을변화시키지 않는추가의 특징을혼입할수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며， 충분히 상보적아어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는프라이머가혼성화하는표적 DNA절편을말한다. 본 발명의 키트는 피부노화에 따라 발현이 증가되는 Involucr in 유전자 5’ -UTR 의 메틸화를 측정하는 제제가 포함될 수 있으며, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를더 포함하여 구성될수 있다. 또한， 상기 키트는 Involucr in유전자 5’ -UTR 부위의 메틸화를 측정함으로써 피부노화 마커를 탐지하고, 피부노화정도를측정할수있다. 본 발명에 있어서， 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를의미할수 있고, 상기 피부노화는주름형성이 증가하거나피부 상피세포의 두께가 증가하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 광피부노화를 의미할수있다. 본발명의 또다른 일예는 Involucr in유전자의 5’ -UTR의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 UV에 의한 피부 손상부위를 모니터링, 피부노화 진단 바이오마커 개발, 및 피부노화 방지 화장품개발에 활용이 가능하다.
상기 Involucr in 유전자의 5’ -UTR 메틸화부분은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 680， 699， 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG섬 (CpG i sland)의 시토신 (cytosine)에서 메틸화가된 것일 수있으나, 이에 제한되는것은아니다.
상기 메틸화의 측정은 PCR, 메틸화특이 PCR (Methyl at i on speci f i c
PCR) , 실시간 메틸화 특이 PCR (Real t ime methyl at i on spec i f i c PCR) , 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해수행되는것일수있으나， 이에 제한되는것은아니다.
상기 메틸화를측정하는 단계는 Involucr in유전자의 메틸화된 5’ -
UTR의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 PCR 프라이머 세트를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는서열분석으로수행하는것일수있으나, 이에 제한되는것은아니다. 구체적으로， 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를증폭하기 위한 PCR프라이머 세트는서열번호 6의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 쌍， 및 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 제 2프라이머 쌍을포함하는프라이머 세트일 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명은 인볼루크린 ( Involucr in) 유전자의 메틸화된 5’ -UTR를 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용 조성물에 관한 것으로서， 이를 이용해 피부노화 특이적 피부노화 또는 피부노화 진행단계를 확인할 수 있고， 빛에 의한 피부의 환부부위 치료 과정의 모니터링에도적용할수있다.
【도면의 간단한설명】
도 1은 본 발명의 실시예 2-1에 따라， 피부 광노화 모델에서 인볼루크린 (Involucr in) DNA메틸화를확인한결과를나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 2-2에 따라, 피부 광노화 모델에서 인볼루크린유전자발현을분석한결과를나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 2-3에 따라， 피부 광노화 모델에서 DNA 메틸화와인볼루크린유전자발현의 관계를나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에 따라， 피부 광노화 모델에서 인볼루크린 mRNA발현변화를확인한것을나타낸다.
도 5a는 본 발명의 실시예 4-3에 따라， 인간유래 불멸화된 ᅳ 각질형성세포 (HaCaT)의 IVL. 유전자 methyl at ion speci f i c PCR 결과를 나타낸다.
도 5b는 본 발명의 실시예 4-3에 따라， 인간유래 불멸화된 각질형성세포 (HaCaT)에 UV만을처리했을때와， UV처리 후 DHPV를처리했을 때의 Methyl at ion/Unmethyl at i on(M/U)비율즉정결과를나타낸다 .
도 5c는 인볼루크린 유전자의 5’ -UTR부위 DNA를 Meth Pr imer툴에 삽입하고 이 툴을 이용하여 확보한 IVL 염기서열의 CpG부위와최종선발된 5개의 프라이머 세트를나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 4-5에 따라, 인간유래 불멸화돤 각질형성세포 (HaCaT)에 UV만을처리했을때와， UV처리 후 DHPV를처리했을 때의 상대적인 IVL mRNA발현수치 측정 결과를나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예 4-5에 따라， 인간유래 불멸화된 각질형성세포 (HaCaT)에 UV만을 처리했을 때와， UV 처리 후 DHPV를 농도 0.5nM, InM로처리했을때의 IVL단백질의 발현변화를측정한결과이다.
【발명의 실시를위한형태】
이하， 본발명을실시예에 의해상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본발명을예시하는것일 뿐， 본발명이 하기 실시예에 의해 한정되는것은 아니다.
<실시예 1>피부광노화마우스모델의 제작
피부 광노화 모델에서 Involucr in 프로모터 메틸화를 확인하기 위해서 , 하기와같은방법으로피부광노화마우스모델을제작하였다.
구체적으로， 6주령의 암컷 albino hair less mice (Skh-1)에 주 5회 156.25 mg八 igAlay으로 카카오 파우더 (cacao powder , baba Cal lebaut , Lebbeke-Wieze, Belgium) 또는 주 5회 625 mg/kg/day으로 피크노제놀 (Pycnogenol , 이하 Pyc)을 섭취시키고， 주 3회 TL20W/12RS UV l amps (Phi l ips, Eindhoven, The Nether lands)를 이용하여 100 ~ 200 mJ八: m2의 UV를조사하여 광노화마우스모델을 만들었다. 대조군의 경우 8주에 걸쳐 동일 조건에서 마우스를 키우되， UVB조사와 카카오 파우더 (이하， 는 섭취시키지 않았다. CP를 먹어지 않고 UVB만 조사한 마우스는 UV 마우스로서 실험군에 포함시켰다. UV는 1주차에 100 mJ/cm2, 2 - 3주차에 150 mJ/cm2, 4 8주차에 200 mJ/cm2로 점차 UV의 강도를올려 조사했다. 광노화마우스모델은 8주차에 생검 (Biopsy)을통해조직을획득하였다. 피부 노화 마커 유전자를 선별하기 위해서, 상기 방법으로 제작한 광노화마우스에서조직을채취하여 하기와같은실험을수행하였다.
구체적으로， 상기 제작한광노화마우스에서 마우스조직을생검하고 액체 질소를 이용해 급속냉각시킨 뒤, G-spinTM Total DNA Extract ion Ki t (Intron, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 유전체 DNA를 추출하거나， RNeasy Plus Mini Ki t (Qiagen, Valenci a, USA)를 이용하여 전체 쇼를 추출하였다. 추출한 전체 RNA는 1% (w/v) agarose gel에 전기영동하여 18S와 28S RNA밴드를확인하여 양질의 전체 RNA가추출되었음을확인했다. <실시예 2> 파부 광노화 모델에서 Involucrin DNA 메틸화와
Involucrin유전자발현의 관계
2-1. 쇼메틸화패턴분석
피부 광노화 모델에서 Involucr in DNA 메틸화를 분석하기 위해서 실시예 1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하여 유전체 DNA를 추출하고, Hi seq 2000 (i l lumina, USA)을 이용하여 유전자의 염기서열을 분석하였으며， bowt ie2 프로그램을 이용하여 마우스 지놈 (genome) 지도 분석을 수행하였다. 다음으로 feng 그의 논문을 참조하여
(geng J et al . , Nat Protoc. 2012, 7, 1728-40) Mode-based analysi s of Chip-seq (MACS)을 통한 유전자 전체 서열 중 메틸화 서열 분석을 진행하였다. 이 후 GeneSpring 7.3 (si l i con. Genet i cs, USA)을 이용하여 메틸화된 유전자 서열의 표준화， 통계 분석 및 군집 분석을 시행하였으며 마지막으로 WashU genome browser를통해 분석된 유전자 메틸화 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1에 나타난것과같이， 피부광노화마우스의 경우 염색체 3번에 위치한 Involucr in의 프로모터를 포함하는 프로모터의 업스트림 부위, 즉 엑손 부위와 프로모터 부위의 특정 염기에서 메틸화가 일어나며 특히， 프로모터 부분에서 메틸화가 강하게 나타났다. 상기 메틸화는 UV 조사에 의해서 증가하지만， UV 조사 후 항노화 물질인 CP를 처리하면 메틸화가 감소하고, 또한 Pyc 처리에 따라 전체적으로 메틸화가감소함을 확인할수 있었다.
따라서， 이를 통해 마우스에 UY 조사시 염색체 3번에 위치한 Involucr in의 프로모터를포함하는프로모터의 업스트림 부위에서 메틸화가 증가됨을알수있었다.
2-2. Involucr in유전자발현분석
마우스 피부 광노화 모델에서 Involucr in 유전자 발현을 분석하기 위해서 실시예 1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하고， 전체 RNA를 추출하였으며, 상기 추출한 전체 쇼를 사용하여 RNA-sequencing데이터 분석 (TheragenEtex, Korea)을수행하였다. UV + CP 실험군마우스는 UV조사후 156.3 mg/kg/day로 CP를섭취하도록하였다. 도 2에 나타난 것과 같이， UV 처리에 의해서 Involucr in mRNA의 발현이 약 1.5배 증가했고， 반대로 UV와 카카오 CP처리군 또는 UV와 Pyc 처리시， UV에 의해서 증가된 mRNA의 양이 다시 회복됨을확인하였다.
2-3. 마우스 피부 광노화 모델에서 Involucr in DNA 메틸화와 Involucr in유전자발현과의 관계
마우스 피부 광노화 모델에서 _ Involucr indvl ) DNA 메틸화와 Involucr in(Ivl)유전자발현의 관계를분석하기 위해서， 실시예 2-1및 2 - 2에서 얻은결과를 이용하고 correlat ion plot을통해 RNA발현양과유전자 메틸화의 상관관계를파악하였으며 , 이 결과를도 3에 나타냈다.
도 3에 나타낸 것과 같이 x축의 상대적인 Ivl 유전자 메틸화가 증가할수록, y축에 해당하는 Ivl 유전자 발현이 정비례하여 증가함을 확인하였다.
<실시예 3> 마우스 피부 광노화 모델에서 Involucrin 유전자 발현 변화 마우스 피부 광노화 모델에서 Involucr in 유전자 발현 변화를 확인하기 위해서, 실시예 2-1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하고， 실시예 2-2와 같은 방법으로 전체 RNA를 추출하고， 하기와같은방법으로 q-PCR(quant i tat ive PCR)을수행하였다.
구체적으로， 실시예 2-2와 같은 방법으로 추출한 전체 RNA를 miScr ipt I I RT Ki t (Qi agen, Hi 1 den, Germany)에 적용하여 cDNA를 합성하고, miScr ipt SYBR Green PCR Ki t (Qi agen, Hi lden, Germany)와 miScr ipt mi croRNA PCR Array(Qi agen, Hi lden, Germany) 및 Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR System(Appl ied Biosystems , Foster Ci ty, CA, USA)를 사용하였으며， 하기 표 2의 mIVL_F, mIVL_R프라이머세트 (F: 서열번히 2 / R: 서열번히 3)를사용해 q-PCR을수행하였다. 또한 하기 표 2의 GAPDH_F와 GAPDH_R 프라이머세트 (F: 서열번히 4 / R： 서열번히 5)는 유전자 발현의 house keeping 유전자 즉， 대조군으로 사용하였다. 모든 반응은 96-wel l plate에서 수행하였고， 평균값을 사용해 상대적인 mRNA 발현 수치를 계산하였다.
［표到
Figure imgf000018_0002
도 4에 나타낸 것과 같이, 처리시 11^0111(^11 «볘植의 발현이 대조군에 비해 약 3배 가량 증가했고, 반대로 처리 후 카카오 0?를 처리한 실험군에서는 에 의해서 증가된
Figure imgf000018_0001
양이 다시 감소함을 확인하였다. <실시예 4> In vitro피부광노화모델에서 Involucrin유전자 5’ - UTR부위 메틸화와 Involucrin유전자발현의 관계
4-1. 인간피부광노화세포모델의 제작
인간 피부 광노화 세포 모델에서 Involucr in DNA에서 메틸화되는 부위를 확인하기 위해, 하기와 같은 방법으로 인간 피부 광노화 세포 모델을제작하였다.
인간유래불멸상피세포주 ( Immortal i zed human kerat inocyte) HaCaT 세포 (ATCC， USA) 5 x 105 cel l을 DMEM (5% FBS) 배지가들어있는 100-mm di sh에 분주하여 48시간 동안 37 °C C02 incubator에서 배양하였다. 이투 incubator에서 세포를 꺼내어 serum free medi a로 배지를 교체하였으며, 교체 후 12시간이 지난후 PBS로 washing하고, 다시 di sh에 4 mL의 PBS를 넣고 UV crossl inker (UVP, CA, USA)를 이용하여 100 mJ/cm2의 UV를 쪼여주었다. 다음으로， Di sh에서 PBS를 제거하고 8 mL의 DMEM (5 % FBS) 배지를채워 24시간동안재배양하여 피부광노화세포모델을제작하였다. 피부 광노화를 회복시킨 각질형성세포 (HaCaT)를 제조하기 위해， UV 조사 이후에 DMEM 배지에 Cacao powder 4 ug/mL 및 Cacao의 대사산물인 DHPV [5-(3' ,4' -19 d i hy dr oxypheny 1 ) -gamma- c alero lactone] 를 10 ng/mL를 포함시켜 24시간 동안 배양했다. UV 조사 및 상기 DHPV를 처리하지 않은 세포를대조군세포로사용하였다.
DHPV는 카카오 파우더에 대한 양성 대조군 (posi t ive control )으로 사용한다. 쥐 또는 인간의 경우, 다양한 물질이 조합되어 있는 카카오 파우더를 섭취 또는 처리 하였을 때， 생.체 내 대사 작용에 의해 카카오 파우더의 물성이 바뀌고 상기 바뀐 물성의 카카오파우더에 의해 실제 체내에서 효과가나타난다.
HaCaT 세포는 생체 내에서 일어나는 대사 작용을 모식할 수 없다. 따라서 실제 생체 내에서 카카오 파우더가대사되어 나오는산물인 DHPV를 처리할 경우 보다 명확한 카카오 파우더의 효과를 측정할 수 있으며, 카카오 파우더의 대사산물 중 광노화방지 효과를나타내는물질을 정확한 판단할수있다.
4-2. Involucr in DNA메틸화위치 분석
실시예 4-1에서 제작한 인간 광노화 피부세포를 harvest하고， NucleoSin® Tissue Kit (Macherey-Nagel , Germany)를 이용하여 쇼를 추출하였다. 추출한 DNA를 Nano Drop을 이용하여 정량하고 Quality를 확인하였다. 다음으로 추출한 DNA의 메틸화 분석을 위해 EZ DNA Methylation-LightningTM Kit Uymoresearch, CA, USA)를 이용하고 Bisulfite 를 처리하아 메틸화가 되지 않은 시토신 (Cytosine) 잔기를 우라실 (Uracil)잔기로변환하였다.
상기 Bisulfited DNA lOOng, 프라이머 쌍 (IVL_MF/IVL_MR) (20pmole)을각각 luL, TaKaRa EpiTaq HS (5U/ ) 0.25uL, 10X EpiTaq PCR Buffer (Mg2 + free) 5uL, 25mM MgC125uL, dNTP Mixture (2.5mM each) 6 uL 를 첨가하고 최종 볼륨이 50 uL가 되도록 증류수를 첨가한 후， 98°C에서 3분간 반응사킨 후， 40주기로 98°C에서 10초， 55°C에서 1분， 72°C에서 30초 과정을 반복하여 반응시켰다. 다음으로 72°C에서 5분간 신장 (elongation)시킨 다음 2 % (w/v) 아가로오스 겔에서 결과를 분석하였다.
메틸화특이 PCR프라이머를 제작함에 있어서 프라이머 내에 최소한 하나이상의 CpG서열을포함시키고， 메틸화와비메틸화프라이머가유사한 Tm 값을 갖도록 제작하였으며， Bisulfite conversion 과정에 있어 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되므로 이를 고려하며 프라이머를 제작하였다.한편,상기 유전자의 메틸화는전체 유전자풀의 0100%일 수 있으며, 이에 발현될 수 있는 동일 유전자 서열 전체에서 비메틸화 대비 메틸화 유전자의 양을 측정함으로써 DNA의 메탈화를 정확히 측정하였다. 상기 사항을 고려하여 메틸화 특이 PCR을 수행하기 위해 IVL_MF/IVL_· 프라이머 쌍 (F:서열번호 6 / R： 서열번호 7)을 제작하여 사용하였다 (표 2). ·
구체적으로， transcription start site와시작코돈사이에 위치하는 untranslated region 인 5’ -UTR 부위， 즉 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 1번째 내지 1853번째 서열까지를 (ATG를 기준으로 -lbp -1853bp에 해당) Meth Primer tool 프로그램에 삽입하였다. Meth Primer tool은 입력된 서열내의 CpG부위를 선별하여 각 프라이머에 하나 이상의 CpG 부위를 포함하도록 메틸화 및 비메틸화 프라이머 서열을 제공한다. 상기 Meth primer tool을 통해 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5’말단으로부터 673번째 내지 783번째에 해당하는 IVL 염기서열을 CpG 부위로 선별하였으며， 이 tool을 이용하여 총 5개의 프라이머 세트를 확보했다（도 5c）. 이 중 상기 표 2의 서열번호 6 내지 서열번호 9번까지의 프라이머 염기서열을 이용하여 실험을 수행하였다. Involucr in 폴리뉴클레오타이드 염기서열（서열번호 1） 중 개시코돈인 ATG로부터 -1179 내지 -1065부위는 IVL_MF（서열번호 6）， IVL_■（서열번호 7） 프라이머 세트를 사용해 methyl at ion speci f i c PCR을 수행하였으며，
ATG로부터 -1181 내지 -1067 부위는 IVLJF（서열번호 8） 및
IVL_UR（서열번호 9）을사용하여 unmethyl at ion speci f ic PCR을수행하였다.
Methyl at ion speci f ic PCR 수행결과， IVL의 메틸화가 된 부위가 IVL의 5’ -UTR 부분이며， 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5’ 말단으로부터 680. 699. 783번째 에 존재하는 CpG 섬에서 메틸화가 일어남을확인하였다.
4-3. Involucr in DNA메틸화수준분석
Involucr in DNA메틸화수준을분석하기 위해, 상기 실시예 4-1에서 제조한 UV를조사하여 광노화가유도된피부세포및 UV를처리하고 DHPV를 처리하여 피부 노화를 회복시킨 세포 각각에 대해서， IVL_MF（서열번호 6）， IVL_MR（서열번호 7） 프라이머를 사용해 상기 실시예 4-2에 기재한 PCR방법과 동일한 조건에서 methyl at ion speci f ic PCR을 수행하였으며, IVL_UF（서열번호 8） 및 IVL_UR（서열번호 9）을 사용하여 unmethyl at ion speci f i c PCR을 수행하였으며， 그 결과로부터 IVL 유전자 부위에 발생한 메틸화의 수준을확인하였다（도 5a및도 5b）.
도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이 , UV를 조사하여 광노화가 유도된 피부 세포에서 methyl at ion speci f i c PCR을 수행하였을 때 l ine）가 unmethyl at ion speci f ic PCR을수행했을때（U l ine）보다 IVL의 5- UTR에서 메틸화 （M）가 약 1.5배 증가하였고， 이러한 메틸화는· DHPV처리에 의해급격히 감소됨을확인할수있었다. 상기 결과로부터 UV 조사에 의한 피부 노화 세포에서 CpG 부위로 선별된 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5’ 말단으로부터 673번째 내지 783번째에 해당하는 IVL의 5’ -UTR 부위 서열의 메틸화 수준이 증가하며, 특히， 680 번째. 699번째 및 783번째 염기가 UV조사에 의해 메틸화되고, 상기 IVL의 메틸화된 5’ -UTR 부위의 피부 노화 특이적 마커로 사용 가능함을확인했다. 4 4. Involucr in유전자발현분석
광노화 유도 인간 피부 세포 모델에서 Involucr in 유전자 발현을 분석하기 위해서, 상기 실시예 4-1에서 제조한 광노화 유도 인간 피부 세포를 채취하고, 상기 실시예 2-2와동일한 방법을사용하여， Involucr in 유전자 발현 분석을 수행하였다. 이에 PCR 프라이머는 표 2의 hIVL_F (서열번호 10)， hIVL_R (서열번호 11)프라이머를 사용하였다.
GAPDH_F와 GAPDH_R프라이머세트 (F: 서열번히 4 / R： 서열번히 5)는유전자 발현의 house keeping유전자즉, 대조군으로사용하였다.
도 6에 나타난것과같이， UV에 의해성 Involucr in mRNA의 발현이 약
3배 증가하였으며， UV 처리 후 DHPV 처리시에 증가된 mRNA의 양이 다시 회복됨을확인하였다.
4-5. 인간피부광노화세포에서 Involucr in단백질발현수준분석 실시예 4-1에서 제작한 광노화 유도 인간 피부 세포에서 IVL 단백질의 발현 변화를 분석하기 위해， 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로， 인간 피부 광노화 세포에 대하여 면역블롯 분석을 수행하였으며， 세포를 protease inhibi tor cocktai l ki t (P3100-005； GenDEPOT , Barker , TX) , 및 phosphatase inhibi tor (sc_45065； Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함한 세포 용해 버퍼를 사용하여분해하였다 (#9803; Cel l Signal ingTechno logy, Danvers , MA) . 세포용해물 20 ug을포함하는부분표본을 SDS-polyacryl amide젤상에서 전기영동하여 분리한 후, transfer buf fer (25 mM Tr i s, 192 mM glycine, 20% [v/v] methanol [pH8.3] ) , 75 V, 40 °C 조건에서 180분 동안 니트로셀룰로즈 막
(Amersham, Buckinghamshi re, UK)으로 이동시켰다. 다음으로 막을상온에서 60분동안 0.1% (v/v) Tween-20를포함하는 3% (w/v) BSA의 PBS로블락킹한 후， 항- IVL(1: 1000, sc-28557, Santa Cruz) 항체와 함께 배양하였다. 이차 항체는 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG (1: 1000; sc 2005, SantaCruz)를 사용하였으며 , ECL lumi Femto solut ion A/B(Dogen, Seoul , Korea)를 사용하여 블롯들을현상하고분석하였고그결과를도 7에 나타냈다.
도 7에 나타낸 것과 같이, 인간피부 세포에 대하여 UV를 처리하여 광노화가 유도된 경우 IVL 단백질의 발현량이 UV를 처리하지 않았을 때에 2019/135566 1»（：1 1{2018/016907
비해서
Figure imgf000023_0001
약 3배 이상증가함을확인할수 있었다.다만， 를 처리했을 때 증가했던 의 단백질의 양이 카카오의 대사 산물 에 를 처리한경우， II단백질의,양이 어느정도회복됨을확인하였다.

Claims

2019/135566 1»（：1^1{2018/016907
【청구범위】
【청구항 11
인볼루크린（1^01110^11） 유전자의 메틸화（¾¾1：｝1 3 011）된 5’ -
1끄¾（11111 31131 6（1 용八）11）부위를포함하는, 피부노화측정용바이오마커 .
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 메틸화된
Figure imgf000024_0001
서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열의 5’ 말단으로부터 673번째 내지 783번째 뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 뉴클레오타이드가 메틸화된것인， 바이오마커.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 메틸화된 5’ - 1凡1?은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열의 5’ 말단으로부터 680번째, 699번째, 및 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는
Figure imgf000024_0002
섬으로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의
Figure imgf000024_0003
메틸화된것인， 바이오마커.
【청구항 4]
제 1항에 있어서, 상기 메틸화된 5’ - 11 은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열의 5’ 말단으로부터 680번째， 699번째， 및 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 ^ 섬이 메틸화가 된 것인， 바이오마커.
【청구항 5】
인볼루크린（1^0111（:^11） 유전자의 5’ - 1끄及（1]111:대1131 6（1 당 ）11）의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용조성물. .
【청구항 6]
제 5항에 있어서， 상기 피부노화는 광피부노화 또는 에 의한 피부노화인것인， 조성물.
【청구항 7]
제 5항 또는 제 6항에 있어서， 상기 피부노화는주름 형성 증가또는 피부상피세포의 두께가증가하는것인， 조성물.
【청구항 8]
. 제 5항에 있어서， 상기 5’ - 17 의 메틸화를 측정하는 제제는， 인볼루크린（11 0111（： 11） 유전자의 메틸화
Figure imgf000024_0004
메틸화된
Figure imgf000024_0005
섬을 포함하는서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한灰玉프라이머 세트인,조성물.
【청구항 9]
제 8항에 있어서， 상기 PCR프라이머 세트는
서열번호 6 의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 쌍， 및
서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 쌍을포함하는프라이머 세트인， 조성물.
【청구항 10】
제 5항에 있어서, 상기 인볼루크린 (Involucrin) 유전자의 5’ -UTR의 메틸화를 측정하는 제제의 검출은 PCR, 메틸화 특이 PCR (methyl at ion specific PCR) ,실시간 메틸화특이 PCR (real time methyl at ion specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩， 파이로시퀀싱 및 바이설파이트시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해수행되는것인， 조성물.
【청구항 11】
인볼루크린 (Involucrin) 유전자의 5’ -UTR(Unt r ans 1 at ed region)의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행 단계의 진단에 필요한정보를제공하는방법 .
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 5’ -UTR은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5’ 말단으로부터 680번째， 699번째， 및 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG섬이 메틸화된것인， 방법.
【청구항 13] ,
제 11항에 있어서， 상기 메틸화의 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR (Methyl at ion specific PCR) , 실시간 메틸화 특이 PCR (Real time methyl at ion specific PCR) ,메틸화 DNA특이적 결합단백질을이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩， 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는방법에 의해수행되는것인， 방법.
【청구항 14】
제 11항에 있어서, 상기 메틸화를 즉정하는 단계는 인볼루크린
(Involucrin) 유전자의 메틸화 5’ -UTR의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 서열분석으로 수행하는 것인， 2019/135566 1»（：1/10公018/016907
방법.
PCT/KR2018/016907 2018-01-03 2018-12-28 피부노화 특이적 후성유전자 마커 및 이를 이용한 피부노화의 탐지방법 WO2019135566A1 (ko)

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