WO2019129741A1 - Utilisation de derives de trehalose pour stimuler les defenses naturelles de plantes - Google Patents

Utilisation de derives de trehalose pour stimuler les defenses naturelles de plantes Download PDF

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WO2019129741A1
WO2019129741A1 PCT/EP2018/086739 EP2018086739W WO2019129741A1 WO 2019129741 A1 WO2019129741 A1 WO 2019129741A1 EP 2018086739 W EP2018086739 W EP 2018086739W WO 2019129741 A1 WO2019129741 A1 WO 2019129741A1
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WO
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trehalose
dideoxy
group
plant
wheat
Prior art date
Application number
PCT/EP2018/086739
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English (en)
Inventor
Roger Durand
Isabelle MALLARD
Béatrice RANDOUX
Abderrakib ZAHID
Original Assignee
Université Du Littoral Côte D’Opale
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom

Definitions

  • the present invention relates to the agricultural field and, more particularly, the use of derivatives of trehalose or a process using these derivatives, to stimulate the natural defenses of plants.
  • Renard-Merlier et al. (Phytochemistry, 2007, 68, 1156-1164) and Randoux et al. (Phytopathology, 2010, 100, 1352-1363) tested the SDP effect potential of trehalose, experimentally under controlled conditions, to improve control of the powdery mildew fungus, Blumeria graminis f sp. tritici.
  • An effective% protection of about 38% of trehalose has been achieved by induction of wheat's defense mechanisms against powdery mildew (Tayeh et al., Phytopathology, 2014, 104, 293-305). ).
  • the inventors have synthesized difunctionalized trehalose derivatives in 6.6 '.
  • they have surprisingly demonstrated that these particular trehalose derivatives more effectively protect a plant, particularly wheat, against pathogens by stimulating its natural defenses.
  • the present invention therefore relates to a use of a compound of formula (I):
  • R 1 represents a group chosen from:
  • R 3 being a group chosen from:
  • a C1-C10 alkyl group optionally substituted by at least one phenyl or a carboxyl group, or
  • R 4 and R 5 being independently hydrogen or C 1 -C 6 alkyl
  • R 6 being a phenyl optionally substituted by a hydroxyl or a C 1 -C 6 alkyl group
  • Ri represents a group chosen from:
  • R 3 being a group chosen from:
  • a C1-C10 alkyl group optionally substituted with at least one carboxyl group, or
  • R 6 being an alkyl group
  • the compound of formula (I) or a salt thereof used in the present invention is chosen from:
  • Another subject of the invention relates to a method for stimulating the natural defenses of a plant, comprising the application of a composition comprising a compound of formula (I) or a salt thereof as defined above, to said plant.
  • the composition is an aqueous or hydro-alcoholic composition.
  • the composition is applied by foliar spraying, by coating the seeds, or by watering and infiltration of the soil.
  • the plant is a cereal and more particularly wheat.
  • Another particular object of the invention is a method for stimulating the natural defenses of a plant, as defined above, against a fungal pathogen, preferably Zymoseptoria tritici, and Blumeria graminis.
  • the composition used in the process as defined above is applied at a dose of between 1 and 60 kg per hectare of fields, preferably between 1 and 50, between 1 and 20. , between 1 and 10 kg and between 1.5 and 6 kg per hectare of fields, and even more preferably at a rate of about 1.75, 3.5, or 5.25 kg per hectare of fields.
  • Another subject of the invention also relates to a compound or a salt thereof chosen from:
  • A Peroxidase activity measured 24 hours (J1) and 48 hours (J2 after treatment.
  • B Peroxidase activity measured 48 hours after treatment (D2), 1 day after inoculation by the fungus B. graminis (J2 + 1) or without inoculation (J2 + lni).
  • FIG. 2 Lipoxygenase activity measured in wheat leaves after treatment with ICB11 and ICB21 compounds at 1.5 g / L or without treatment (ELO):
  • A Lipoxygenase activity measured 24 hours (D1) and 48 hours (D2) after treatment.
  • B Lipoxygenase activity measured 48 hours after treatment (D2), 1 day after inoculation by the fungus B. graminis (J2 + 1) or without inoculation (J2 + lni).
  • Figure 3 Distribution of the different germination events of spores of the B. graminis mushroom observed by category (ungerminated spores, spores with a Appressorial small germ tube (TGA), spores with long TGA, spores with several TGA, spores with aborted TGA) 24 hours after treatment with ICB5, ICB8, ICB11 and ICB21 compounds at 1.5 g / L or without treatment ( H 2 O).
  • category ungerminated spores, spores with a Appressorial small germ tube (TGA), spores with long TGA, spores with several TGA, spores with aborted TGA
  • Figure 4 Observation of necrotic surfaces (brown spots) due to septoria in wheat seedlings treated with different compounds.
  • A Graphical representation of the percentage of necrotic surfaces according to different treatments with ICB5, ICB8, ICB11, or ICB21 in comparison with Vacciplant and native trehalose
  • Figure 5 Percentage comparison of pycnidia in wheat seedlings (Alixan cultivar) treated with Vacciplant (Laminarine 37 g / L), compared to treatment with native trehalose, or ICB5, ICB8, ICB11, and ICB21 at 1 , 5 g / L, and without treatment (Control).
  • Figure 6 Evaluation of the percentage of pycnidia in wheat seedlings (Pakito cultivar) treated with ICB5, ICB8, ICB11, and ICB21 at 1.5 g / L, and without treatment (Control).
  • Figure 7 Photographs of microscopic observations of pycnidia after bleaching of wheat leaves (A: wheat leaf inoculated with Z. tritici, B: Wheat leaf treated with ICB11 at 1.5 g / F and inoculated with Z. tritici; C: Wheat leaf treated with ICB21 at 1.5 g / F and inoculated with Z. tritici).
  • Figure 8 Evaluation of the percentage of pycnidia in wheat leaves (Alixan cultivar) inoculated with Z. tritici and treated with ICB11, and ICB21 at 1.5 g / F, and without treatment (Control).
  • Figure 9 Evaluation of the callose accumulation on wheat leaves treated with ICB11, and ICB21 at 1.5 g / F and without treatment (FLO) (48h after treatment (J2)), inoculated or not with Z. tritici (at 2, 9 and 11 days after inoculation).
  • A Peroxidase activity measured 24 hours (J1) and 48 hours (J2 after treatment.
  • B Peroxidase activity measured 48 hours after treatment (J2), 1 day after inoculation with the Z. tritici mushroom (J2 + 1I) or without inoculation (J2 + lni).
  • F Peroxidase activity measured 48 hours after treatment, 13 days after inoculation with the fungal Z. tritici (J2 + 13I) or without inoculation (J2 + 13n).
  • FIG. 11 Measurement of lipoxygenase activity in wheat leaves after treatment with ICB11 and ICB21 compounds at 1.5 g / l or without treatment (H 2 0):
  • A Lipoxygenase activity measured 24 hours (J1) and 48 hours (J2 after treatment.
  • F Lipoxygenase activity measured 48 hours after treatment, 13 days after inoculation with the Z. tritici mushroom (J2 + 13I) or without inoculation (J2 + 13n).
  • the compounds of formula (I) and their salts described in the present application make it possible to stimulate the natural defenses of a plant, in particular wheat, thus providing it with an effective protection against pathogenic agents, such as fungi, by reducing the surface of necrosis, development of pustules and pycnidia. More particularly, the inventors have demonstrated that the compounds of the invention presented all the characteristics of the SDP products by inducing the expression of enzymes and genes characteristic of the defenses of the plants, as well as the accumulation of a deposit of callose.
  • Trehalose is a sugar, and more specifically, a disaccharide composed of two glucose molecules linked by a l, l-a-glycosidic bond. It is of natural origin and can be found in certain plants and mushrooms. Trehalose would be involved in the ability of some plants to withstand prolonged periods of desiccation. In addition, trehalose also has a high SDP effect in wheat as illustrated by the work of Tayeh et al. (Phytopathology, 2014, 104, 293-305).
  • the compounds of formula (I) and their salts as defined in the present application and used to stimulate the natural defenses of plants are trehalose derivatives functionalized on the Ri group (positions 6 and 6 'of native trehalose).
  • R 1 represents a group chosen from:
  • R3 being a group chosen from:
  • a C1-C10 alkyl group optionally substituted by at least one phenyl or a carboxyl group, or
  • Rr being a phenyl optionally substituted with a hydroxyl or a C1-C alkyle alkyl group;
  • alkyl refers to a linear or branched, saturated or initiated hydrocarbon radical having more particularly from 1 to 10, preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms. Mention may be made, for example, of methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl and decyl radicals.
  • halogen refers to a fluorine, chlorine, bromine, or iodine atom, and is preferably a chlorine or iodine atom.
  • azide corresponds to a group N3.
  • carboxyl corresponds to a COOH group.
  • substituted by at least means that the radical is substituted by one or more groups in the list.
  • salt refers to all salts of the compound of interest of formula (I). They include salts of acidic or basic groups present in the specified compound.
  • the acid addition salts include, but are not limited to, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, nitrate, sulfate, bisulfate, phosphate, acid phosphate, isonicotinate, acetate, lactate, salicylate, citrate, tartrate, pantothenate, bitartrate salts.
  • an acidic salt is the hydrochloride or the hydrobromide.
  • Suitable base salts include, but are not limited to, aluminum, calcium, lithium, magnesium, potassium, sodium, zinc, and diethanolamine.
  • a basic salt is sodium.
  • Ri represents a group chosen from:
  • R3 being a group chosen from:
  • a C1-C10 alkyl group optionally substituted with at least one carboxyl group, or
  • R 6 being an alkyl group
  • R 1 represents a group chosen from:
  • R 3 being a group chosen from:
  • a C 1 -C 7 alkyl group optionally substituted with at least one carboxyl group, or
  • Rr being a C1-C4 alkyl group, preferably a methyl.
  • a compound of formula (I) or a preferred salt thereof, used in the present invention is a compound selected from:
  • An object of the invention also relates to a compound or a salt thereof chosen from:
  • the invention relates to the use of a compound of formula (I) or a salt thereof as described above for stimulating the natural defenses of a plant.
  • the invention also relates to a method for stimulating the natural defenses of a plant, comprising the application of a composition comprising a compound of formula (I) or a salt thereof as described above, on said plant.
  • a composition comprising a compound of formula (I) or a salt thereof as described above, on said plant.
  • the stimulation of the natural defenses of the plants can also be induced externally, that is to say without the plant having been in contact with a pathogen but on which an elicitor has been applied.
  • the compounds of formulas (I) are products having elicitric properties, thereby stimulating the natural defenses of plants.
  • pathogen is meant any organism capable of causing disease in plants.
  • a pathogen may be a bacterium, a parasite, a virus, or a fungus.
  • a pathogen is preferably a fungus.
  • stimulating the natural defenses of a plant is meant here the induction or the increase of at least one of the following biological modifications: a production of antibiotic molecule (s) and / or antifungal (s) cell wall enhancement illustrated by callose deposition, increased expression of one or more defense genes such as Pall, LOX1, PR1, POX2, CHI4, NPR1, and OXO, and an increase in enzymatic activities, such as as peroxidase and lipoxygenase.
  • This stimulation of the natural defenses thus effectively protects the plant from any disease such as septoria by reducing the surface of necrosis and / or the development of pycnidia, and powdery mildew by reducing the development of pustules.
  • the invention also relates to a method or a method for reinforcing the cell wall and / or expressing one or more plant defense genes and / or increasing the enzymatic activity, in particular peroxidase and / or lipoxygenase, in a plant, comprising the application of a composition comprising a compound of formula (I) or a salt thereof as described above, on said plant.
  • the plant is a cereal, for example barley, oats, millet, maize, rice, rye, wheat, etc.
  • the plant is wheat.
  • the wheat comprises all wheat varieties known to those skilled in the art and in particular wheat cultivars Alixan and Pakito.
  • wheat can develop a considerable number of diseases. For example, powdery mildew, fusarium, septoria, troglodyte, and brown rust, crowned, yellow, and black. The most common diseases include powdery mildew and septoria.
  • powdery mildew The symptoms of powdery mildew can be observed on the leaves, stems and ears, but it is the leaves that are most often attacked. Generally, white pustules develop, and produce a mass of spores with a powdery appearance. As they grow, powdery mildew pustules darken and turn gray or brown in color. In the long term, organs containing black spores (cleistothecia) are found incorporated into the pustules of powdery mildew. Fungi responsible for the appearance of powdery mildew in wheat include fungi belonging to the Erysiphaccac family, such as Blumeria graminis forma specialis tritici (Blumeria graminis fsp tritici).
  • septoria Symptoms of septoria can be seen early in the growth phase. In young plots of fall-seeded wheat, watery patches, which rapidly become brown and necrotic, are already visible at the beginning of December, as well as throughout the winter on the lower leafy levels. These contain apparent black pycnidia which characterize the presence of the fungus Mycosphaerella graminicola (anamorph Zymoseptoria tritici), responsible for the septoria of wheat.
  • a preferred object of the invention is a method or method as described above for stimulating the natural defenses of a plant against a fungal pathogen, preferably Zymoseptoria tritici, and Blumeria graminis.
  • the composition comprising a compound of formula (I) or a salt thereof and used in the method or method for stimulating the natural defenses of a plant may be formulated in a form known to those skilled in the art for application on a plant.
  • the composition is in the form of a powder or a solution, and is advantageously a solution.
  • the composition is an aqueous or hydro-alcoholic solution.
  • the compound of formula (I) or a salt thereof is dissolved in water at a given concentration.
  • the compound of formula (I) or a salt thereof is dissolved in a mixture comprising water and an alcoholic solvent, such as methanol, ethanol, propylene glycol, propanol, butanol, etc.
  • the concentration or the dose of the compound of formula (I) or a salt thereof in the composition used in the method or process of the invention depends, of course, on the species of plant to be treated and its stage of development. .
  • the composition is applied at a dose of between 1 and 60 kg per hectare of fields, preferably between 1 and 50, between 1 and 20, between 1 and 10 kg and between 1.5 and 6 kg per hectare of fields. and even more preferably at a rate of about 1.75, 3.5, or 5.25 kg per hectare of field.
  • a minimum concentration of 0.5 g / l of a compound of the invention was sufficient to ensure a satisfactory percentage of protection in wheat.
  • a volume of 15 mL of a solution comprising a compound of the invention is typically applied to a 0.0429 m 2 ground application surface.
  • the compound has a concentration of 0.5 g / L, it is therefore applied 7.5 mg (0.5 gx 15 mL) over 0.0299 m 2 , which corresponds to 1.748 kg per 100 m 2. that is, about 1.75 kg per hectare of fields.
  • a concentration of 1 g / L of a compound of the invention corresponds to a dose of about 3.5 kg per hectare of field.
  • a concentration of 1.5 g / L of a compound of the invention corresponds to a dose of approximately 5.25 kg per hectare of fields and a concentration of 15 g / l of a compound of the invention corresponds to a dose of approximately 52.5 kg per hectare of fields.
  • those skilled in the art will take into account the standards applicable for a field application and will take care not to use doses higher than the standards established per hectare of fields.
  • composition comprising a compound of formula (I) or a salt thereof and implemented in the method or method for stimulating the natural defenses of a plant
  • the composition can be applied directly to the plant by foliar spraying or on the seed of the plant by coating the seeds.
  • a foliar spray consists of spraying a solution in the form of droplets on the leaves of the plant.
  • Seed coating consists of covering the seed with a film comprising the composition.
  • the composition can also be applied directly to the soil on which the plant grows, by watering and infiltration.
  • the composition is applied by foliar spraying, by coating the seeds, or by watering and infiltration of the soil.
  • Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectra were recorded on a Brucker Avance II 400 spectrometer operating at 400 MHz for the proton and 100 MHz for the carbon.
  • the high resolution mass spectra were recorded on an Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC-MS Spectrometer in direct insertion mode. equipped with an electrospray source in positive or negative mode with a variable value depending on the molecules.
  • Mass spectra were recorded on a Bricker Daltonics Ultraflex II Maldi-TOF / TOF Spectrometer in positive reflectron mode with 2.5 DHB matrix.
  • MALDI-TOF (m / z): calculated for CUFUNaOi i [M + Na] + 589.3564 experimental 589.3433. 6,6'-di-Q-carboxymethyl-aa-trehalose (ICB9 and ICB10)
  • PI1 3 P and Ph3PO were filtered and washed with water (2x50 mL) and the aqueous phases combined were washed with dichloromethane (2x5LmL). The aqueous phase was then evaporated and dried under vacuum. A cream powder with a yield of 80% was obtained after recrystallization in ethanol.
  • PI13P and PI13PO were removed by filtration.
  • the solid obtained was put in 50 ml of xylene and left stirring for several hours and then filtered. The solid was washed several times with dichloromethane and butanol to remove traces of diode and DMF. A yellow powder with a yield of 61% was obtained.
  • Wheat grains were imbibed in water for 24 hours and then staggered in plastic trays filled with potting soil at a rate of 24 seedlings per tray.
  • the culture was done in growth cabinet, with 12 hours of day at 18 ° C and 12 hours of night at 12 ° C.
  • the relative humidity was 70%.
  • the seedlings were sprayed with 10 mL of an ICB compound of the invention at 15 g / L or 1.5 g / L.
  • the seedlings were inoculated with a suspension of B. graminis at 250,000 spores / ml of Fluorinert FC43 (heptacosafluorotributylamine, 3M, Cergy-Pontoise, France).
  • the symptoms were read 12 days after inoculation.
  • the infection rate was evaluated on the first leaves formed from the base of the plants (collar).
  • the percentage of infection obtained after treatment of the wheat plants by the various ICB compounds is defined with respect to the control (wheat plants sprayed with distilled water and inoculated) and is calculated according to the following formula:
  • % infection (number of whitish pustules on the first leaf of plants treated with ICB X 100) / number of whitish pustules on the first leaf of the control plant
  • ICB11 and ICB21 After infection (inoculation) by the B. graminis fungus, ICB11 and ICB21 also induced an increase in lipoxygenase activity in treated and inoculated wheat leaves compared to untreated and inoculated wheat leaves and treated wheat leaves. and non-inoculated ( Figures 2B and 2C).
  • ICB5, ICB8, ICB11, and ICB21 The direct effect of ICB5, ICB8, ICB11, and ICB21 on the germinability of B. graminis spores was assessed by sprinkling a fresh (10-day) inoculum over Peri boxes containing a solid medium consisting of of 12% agar in sterile distilled water and one of ICB5, ICB8, ICB11, or ICB21 at a concentration of 1.5 g / L. The Petri dishes were incubated in the light for 24 hours and the germination of B. graminis spores was observed under a light microscope.
  • Wheat grains were imbibed in water for 24 hours and then staggered in plastic trays filled with potting soil at a rate of 24 seedlings per tray.
  • the culture was done in growth cabinet, with 16 hours of day at 20 ° C and 8 hours of night at 16 ° C. The relative humidity was 70%.
  • the seedlings were sprayed with 15 mL of an ICB compound of the invention at 15 g / L or 1.5 g / L.
  • J2 After 48 hours (J2), the seedlings were inoculated with a spore suspension of Z. tritici at 1.10 6 spores / mL of distilled water containing 0.025% Citowett (BASF, Levallois-Perret, France). The symptoms were read about 3 weeks after inoculation.
  • the septoria of wheat caused by Mycosphaerella graminicola (anamorph Zymoseptoria tritici), is manifested by the appearance of brownish spots on the wheat leaves, which correspond to necrosis of the tissues and thus to the death of the cells of the leaves of wheat in the infected area.
  • the percentage of necrotic leaf area is visually assessed on the second (F2) and third (F3) leaves formed from the base of the wheat plant.
  • the evaluation of the disease also involves the observation of the appearance of pycnidia, structures of formation of pycnidiospores, which are units of dissemination of the fungus, responsible for the spread of the disease.
  • the protocol used in the Pakito wheat cultivar inoculated with the strain T01193 was identical to the protocol used in the Alixan wheat cultivar inoculated with the strain T02596.
  • the seedlings were incubated in 10% NaOH at 37 ° C for 1h to clarify the tissues, and then incubated with 150mM K1HP04 0.01% aniline blue, pH 10 for several hours.
  • the callose deposits were observed under a confocal microscope with an excitation wavelength of 405 nm and an emission wavelength of 523 nm.
  • the plants were grown according to the protocol described in 1.1.
  • the peroxidase and lipoxygenase activity were measured on the third leaf of each plant:
  • the ICB11 and ICB21 compounds After infection (inoculation) by the Z. tritici fungus, the ICB11 and ICB21 compounds also induced a significant increase in peroxidase activity in treated and inoculated wheat leaves compared to untreated and inoculated wheat leaves and wheat leaves. treated and non-inoculated ( Figures 10B-10F) up to 13 days after inoculation.
  • FIGS. 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, and 11F The results concerning the assay of lipoxygenase activity are illustrated by FIGS. 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, and 11F.
  • ICB11 and ICB21 After infection (inoculation) by the Z. tritici fungus, ICB11 and ICB21 also induced an increase in lipoxygenase activity in treated and inoculated wheat leaves compared to untreated and inoculated wheat leaves and treated wheat leaves. and non-inoculated ( Figures 11B-11F), up to 13 days after inoculation.
  • QRT-PCR was performed in an ABI PRISM 7300 qRT-PCR instrument to measure the effect of trehalose products on the expression of the following genes: POX2, PR1, PAL1, LOX1 and CHI4. Relative gene expression was calculated according to the AACt method (Livak and Schmittgen, Methods, 2001, 4, 402-408). Plants treated with water were used as a negative control.
  • the expression product of the PR1 gene is a basic protein with fungicidal properties.
  • the expression of CHI4 gene coding for a chitinase capable of degrading the fungal wall increases by 1.5 to 2 times after treatment with ICB11 and ICB21 products compared to treatment with water.
  • Expression of the POX2 gene increases sharply after treatment and inoculation. A strong induction of this gene contributes to a strong enzymatic activity of peroxidase, known for its role in the use of peroxides, toxic for the plant.
  • the induction of the POX2 gene can thus indicate the synthesis of a peroxidase which would allow a reinforcement of the cell wall, by the accumulation of lignin for example, preventing the penetration of the pathogenic agents.
  • treatment alone with the products does not induce a strong expression of genes. Indeed, at 3 and 4 days after treatment, there is no mobilization of the metabolism of the plant towards the expression of defense genes. However, the plant remains alert because the inoculation by the pathogen Z. tritici triggers an important expression of the markers of defense.
  • Table 7 gene expression after treatment in inoculated or non-inoculated plants.
  • the compounds of the invention are SDP compounds that are effective in:

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un dérivé de tréhalose de formule (I) ou un de ses sels pour stimuler les défenses naturelles d'une plante. L'invention concerne également un procédé pour stimuler les défenses naturelles d'une plante, comprenant l'application d'une composition comprenant un composé de formule (I) sur ladite plante.

Description

UTILISATION DE DERIVES DE TREHALOSE POUR STIMULER LES DEFENSES
NATURELLES DE PLANTES
La présente invention concerne le domaine agricole et, plus particulièrement, l’utilisation de dérivés de tréhalose ou un procédé mettant en œuvre ces dérivés, pour stimuler les défenses naturelles des plantes.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE 1TNVENTION
De nos jours, l’augmentation du rendement dans la culture des plantes est devenue primordiale pour satisfaire les besoins de notre société. De manière générale, ce rendement dépend de la bonne santé et de l’intégrité de la plante, permettant ainsi de lui assurer un bon développement et une bonne croissance. Pendant leur croissance, les plantes sont soumises aux agressions d’agents pathogènes, tels que les champignons. Pour lutter contre ces agressions, l’utilisation massive des produits phytosanitaires ou pesticides est conventionnellement utilisée malgré les impacts importants qu’ils présentent sur l’environnement et la santé. Ainsi, dans le cadre du développement d’une agriculture durable et plus respectueuse de l’environnement, l’utilisation des pesticides, tels que les fongicides, doit être diminuée. Toutefois, toute diminution de l’utilisation de pesticides doit s’accompagner de la mise en place de nouvelles stratégies de lutte contre les agents pathogènes, de façon à maintenir une production de qualité en quantité suffisante pour répondre aux besoins alimentaires croissants.
L’une des stratégies développées consiste à stimuler les défenses des plantes pour qu’elles se défendent par elles-mêmes plus efficacement, permettant ainsi une réduction des quantités de pesticides appliquées sur les cultures. Dans ce contexte, diverses molécules ont été développées pour leur effet stimulateur des défenses des plantes (SDP). Toutefois très peu de produits ou principes actifs sont aujourd’hui homologués et commercialisés en tant que « SDP ». En ce qui concerne plus particulièrement le blé (première culture céréalière Française), seuls le Iodus 2® Céréales et la Vacciplant®, comprenant la laminarine en tant que principe actif, sont homologués en tant que SDP contre la septoriose et l’oïdium. Cependant, l’efficacité au champ de ces SDP, en particulier le Iodus 2® Céréales, reste assez faible et G efficacité obtenue en conditions de culture contrôlée au laboratoire est rarement retrouvée en plein champ. Le développement de nouveaux produits SPD plus efficaces contre la septoriose et l’oïdium, maladies majeures des cultures de blé, est donc nécessaire.
Dans ce contexte, Renard-Merlier et al. (Phytochemistry, 2007, 68, 1156-1164) et Randoux et al. (Phytopathology, 2010, 100, 1352-1363) ont testé le potentiel effet SDP du tréhalose, à l’état expérimental en conditions contrôlées, pour améliorer la lutte contre le champignon responsable de l’oïdium, Blumeria graminis f sp. tritici. Un pourcentage de protection efficace d’environ 38 % du tréhalose a été obtenu grâce à l’induction des mécanismes de défense du blé vis-à-vis de l’oïdium (Tayeh et al., Phytopathology, 2014, 104, 293-305). Toutefois, cette protection est très variable selon le mode d’application du tréhalose et une infiltration de tréhalose dans les feuilles de blé s’est montrée être plus efficace qu’une pulvérisation foliaire. En outre, la dose utilisée de 15 g/L pour obtenir ce pourcentage de protection le plus efficace est trop élevée pour envisager une application en champs.
Ainsi, il existe aujourd’hui un réel besoin de développer de nouvelles molécules efficaces pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, en particulier contre un agent pathogène, tels que les champignons responsables de l’oïdium et de la septoriose chez le blé.
RESUME DE L’INVENTION
Devant cette problématique, les inventeurs ont synthétisé des dérivés de tréhalose difonctionnalisés en 6,6’. En outre, ils ont démontré, de manière surprenante, que ces dérivés particuliers de tréhalose permettaient de protéger plus efficacement une plante, en particulier le blé, contre des agents pathogènes en stimulant ses défenses naturelles.
La présente invention concerne donc sur une utilisation d’un composé de formule (I) :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle Ri représente un groupe choisi parmi :
un groupe -OR3, avec R3 étant un groupe choisi parmi :
• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un phényle ou un groupe carboxyle, ou
• un groupe acétyle ou tosyle,
un azoture ou un groupe -NR4R5, avec R4 et R5 étant indépendamment un hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6,
un halogène,
r un hydrogène, ou
un groupe -O-CO-Rr, ou -NH-CO-Re, avec R6 étant un phényle optionnellement substitué par un hydroxyle ou un groupe alkyle en Ci- C6 ;
ou un de ses sels pour stimuler les défenses naturelles d’une plante.
Selon un mode préféré de l’invention, Ri représente un groupe choisi parmi :
un groupe -OR3, avec R3 étant un groupe choisi parmi :
• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un groupe carboxyle, ou
un azoture ou un groupe -NH-CO-Re, avec R6 étant un groupe alkyle en
Ci-C6.
Selon un mode plus préféré, le composé de formule (I) ou un de ses sels utilisé dans la présente invention est choisi parmi :
- 6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; - 6,6’-di-0-octyl-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-di-0-carboxymethyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-toluene-p-sulfonyl-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-diazido-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6,-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-diiodo-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-dichloro-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-dibromo-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-difluoro-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; et
- 6,6,-di-(2-hydroxybenzoylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose.
Un autre objet de l’invention concerne un procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, comprenant l’application d’une composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que défini ci-dessus, sur ladite plante.
Selon un mode particulier, la composition est une composition aqueuse ou hydro- alcoolique. Selon un autre mode particulier, la composition est appliquée par pulvérisation foliaire, par enrobage des graines, ou par arrosage et infiltration du sol. De préférence, la plante est une céréale et, plus particulièrement du blé.
Un autre objet particulier de l’invention est un procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, tel que défini ci-dessus, contre un agent pathogène fongique, de préférence Zymoseptoria tritici, et Blumeria graminis.
Selon un mode préféré de l’invention, la composition mise en œuvre dans le procédé tel que défini ci-dessus est appliquée à une dose comprise entre 1 et 60 kg par hectare de champs, de préférence entre 1 et 50, entre 1 et 20, entre 1 et 10 kg et entre 1,5 et 6 kg par hectare de champs, et de manière encore plus préférée à une dose d’environ 1,75, 3,5, ou 5,25 kg par hectare de champs.
Un autre objet de l’invention concerne aussi un composé ou un de ses sels choisi parmi :
- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-trehalose ;
- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-trehalose ;
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose;
- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ;et
- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-trehalose.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Mesure de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/L ou sans traitement (ELO):
A : Activité peroxydase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2 après traitement.
B : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon B. graminis (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).
C : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon B. graminis (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).
Figure 2 : Activité lipoxygénase mesurée dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/L ou sans traitement (ELO) :
A : Activité lipoxygénase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2) après traitement.
B : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon B. graminis (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).
C: Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon B. graminis (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).
Figure 3 : Répartition des différents évènements de germination des spores du champignon B. graminis observés par catégorie (spores non germées, spores avec un petit tube germinatif appressorial (TGA), spores avec un long TGA, spores avec plusieurs TGA, spores avec des TGA avortés) 24 heures après traitement avec les composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L ou sans traitement (H20).
Figure 4 : Observation des surfaces nécrosées (taches brunes) dues à la septoriose chez les plantules de blé traitées avec différents composés.
A : Représentation graphique du pourcentage de surfaces nécrosées selon différents traitements avec ICB5, ICB8, ICB11, ou ICB21 en comparaison avec le Vacciplant et le tréhalose natif
B : Photographies de feuilles de plantules de blé traitées avec ICB5, ICB8, ICB11, ou ICB21 à 1,5 g/L, et sans traitement (Contrôle).
Figure 5 : Comparaison du pourcentage de pycnides chez des plantules de blé (cultivar Alixan) traitées avec du Vacciplant (Laminarine à 37 g/L), par rapport au traitement avec du tréhalose natif, ou ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 à 1,5 g/L, et sans traitement (Contrôle).
Figure 6 : Evaluation du pourcentage de pycnides chez des plantules de blé (cultivar Pakito) traitées avec ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 à 1,5 g/L, et sans traitement (Contrôle).
Figure 7 : Photographies d’observations microscopiques des pycnides après décoloration des feuilles de blé (A : Feuille de blé inoculée avec Z. tritici ; B : Feuille de blé traitée par ICB11 à 1,5 g/F et inoculée avec Z. tritici ; C : Feuille de blé traitée par ICB21 à 1,5 g/F et inoculée avec Z. tritici ).
Figure 8 : Evaluation du pourcentage de pycnides chez des feuilles de blé (cultivar Alixan) inoculées avec Z. tritici et traitées avec ICB11, et ICB21 à 1,5 g/F, et sans traitement (Contrôle).
Figure 9 : Evaluation de l’accumulation de callose sur des feuilles de blé traitées avec ICB11, et ICB21 à 1,5 g/F et sans traitement (FLO) (48h après traitement (J2)), inoculées ou non avec Z. tritici (à 2, 9 et 11 jours après inoculation).
Figure 10 : Mesure de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/F ou sans traitement (FLO):
A : Activité peroxydase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2 après traitement. B : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).
C : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).
D : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 9 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+9Î) ou sans inoculation (J2+9ni).
E : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 11 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1 li) ou sans inoculation (J2+1 lni).
F : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 13 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+13Î) ou sans inoculation (J2+l3ni).
Figure 11 : Mesure de l’activité lipoxygénase dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/L ou sans traitement (H20):
A : Activité lipoxygénase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2 après traitement.
B : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).
C : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).
D : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 9 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+9Î) ou sans inoculation (J2+9ni).
E : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 11 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1 li) ou sans inoculation (J2+1 lni).
F : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 13 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+13Î) ou sans inoculation (J2+l3ni).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les composés de formule (I), et leurs sels décrits dans la présente demande permettent de stimuler les défenses naturelles d’une plante, notamment le blé, lui assurant ainsi une protection efficace contre des agents pathogènes, tels que les champignons, en réduisant la surface de nécroses, le développement des pustules et des pycnides. Plus particulièrement, les inventeurs ont démontré que les composés de l’invention présentaient toutes les caractéristiques des produits SDP en induisant notamment l’expression d’enzymes et de gènes caractéristiques des défenses des plantes, ainsi que l’accumulation d’un dépôt de callose. Composés de formule (I)
Le tréhalose est un sucre, et plus précisément, un disaccharide composé deux molécules de glucose liées par une liaison l,l-a-glycosidique. Il est d’origine naturelle et peut se trouver dans certaines plantes et champignons. Le tréhalose serait impliqué dans la capacité qu’auraient certaines plantes à résister à des périodes prolongées de dessiccation. En outre, le tréhalose présente également, à forte concentration, un effet SDP chez le blé tel qu’illustré par les travaux de Tayeh et al. (Phytopathology, 2014, 104, 293-305). Les composés de formule (I) et leurs sels tels que définis dans la présente demande et utilisés pour stimuler les défenses naturelles des plantes sont des dérivés de tréhalose fonctionnalisés sur le groupement Ri (positions 6 et 6’ du tréhalose natif).
Plus spécifiquement, les composés et leurs sels répondent à la formule générale (I) suivante :
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dans laquelle Ri représente un groupe choisi parmi :
un groupe -OR3, avec R3 étant un groupe choisi parmi :
• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un phényle ou un groupe carboxyle, ou
• un groupe acétyle ou tosyle, un azoture ou un groupe -NR4R5, avec R4 et R5 étant indépendamment un hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6,
un halogène,
un hydrogène, ou
un groupe -O-CO-Rr, ou -NH-CO-Re, avec Rr, étant un phényle optionnellement substitué par un hydroxyle ou un groupe alkyle en Ci-
C6.
Dans le cadre de la présente invention, les termes ci-dessous ont les définitions suivantes :
Le terme « alkyle » désigne un radical hydrocarboné saturé ou instauré, linéaire ou ramifié, ayant plus particulièrement de 1 à 10, de préférence 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 atomes de carbones. On peut citer, par exemple, les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, hexyle, heptyle, octyle, nonyle, décyle.
Le terme « halogène » correspond à un atome de fluor, de chlore, de brome, ou d’iode, et est de préférence un atome de chlore ou d’iode.
Le terme « azoture » correspond à un groupe N3.
Le terme « carboxyle » correspond à un groupe COOH.
L’expression « substitué par au moins » signifie que le radical est substitué par un ou plusieurs groupes de la liste.
Le terme « sel » désigne tous les sels du composé d’intérêt de formule (I). Ils comprennent des sels de groupes acides ou basiques présents dans le composé spécifié. Les sels d'addition acide comprennent, mais ne sont pas limités, à des sels de chlorhydrate, bromhydrate, iodhydrate, nitrate, sulfate, bisulfate, phosphate, phosphate acide, isonicotinate, acétate, lactate, salicylate, citrate, tartrate, pantothénate, bitartrate, ascorbate, succinate, maléate, gentisinate, fumarate, gluconate, glucaronate, saccharate, formate, benzoate, glutamate, méthanesulfonate, éthanesulfonate, benzènesulfonate, ptoluènesulfonate et le pamoate (c'est-à-dire, 1,1'- méthylène-bis-(2-hydroxy-3- naphtoate)). De préférence, un sel acide est le chlorhydrate ou le bromhydrate. Des sels de base adaptés comprennent, mais ne sont pas limités, à des sels d'aluminium, calcium, lithium, magnésium, potassium, sodium, zinc, et diéthano lamine. De préférence, un sel basique est le sodium.
Selon un mode particulier de l’invention, Ri représente un groupe choisi parmi :
un groupe -OR3, avec R3 étant un groupe choisi parmi :
• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un groupe carboxyle, ou
un azoture ou un groupe -NH-CO-Re, avec R6 étant un groupe alkyle en
Ci-C6.
De préférence, Ri représente un groupe choisi parmi :
un groupe -OR3, avec R3 étant un groupe choisi parmi :
• un groupe alkyle en C1-C7, optionnellement substitué par au moins un groupe carboxyle, ou
un groupe -NH-CO-Re, avec Rr, étant un groupe alkyle en Ci -CY,, de préférence un méthyle .
Un composé de formule (I) ou un de ses sels préféré, utilisé dans la présente invention, est un composé choisi parmi :
- 6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-octyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxymethyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-toluene-p-sulfonyl-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-diazido-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-diiodo-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; - 6,6’-dichloro-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-dibromo-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-difluoro-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6,-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; et
- 6,6,-di-(2-hydroxybenzoylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
de préférence, choisi parmi :
- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-octyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ; et
- 6,6,-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
et de manière encore plus préférée, choisi parmi :
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ; et
- 6,6,-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose. Un objet de l’invention concerne aussi un composé ou un de ses sels choisi parmi :
- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ; et
- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose.
Application
L’invention concerne l’utilisation d’un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que décrits ci-dessus pour stimuler les défenses naturelles d’une plante. L’invention concerne également un procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, comprenant l’application d’une composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que décrits ci-dessus, sur ladite plante. Dans le cas d’une plante ayant eu un premier contact avec un agent pathogène, la stimulation des défenses naturelles se traduit par un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante une présensibilisation (« résistance systémique acquise »). L’agent pathogène provoque en réaction chez la plante la production de molécules élicitrices (couramment appelées « éliciteurs ») qui induisent et stimulent les défenses naturelles. La plante devient ainsi capable de réagir plus efficacement face à une nouvelle attaque. La stimulation des défenses naturelles des plantes peut également être induite de manière externe, c’est-à-dire sans que la plante ait été en contact avec un agent pathogène mais sur laquelle un éliciteur a été appliqué. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, les composés de formules (I) sont des produits présentant des propriétés élicitrices, stimulant ainsi les défenses naturelles des plantes.
Par « agent pathogène », on entend ici tout organisme capable de causer une maladie chez les plantes. Par exemple, un agent pathogène peut être une bactérie, un parasite, un virus, ou un champignon. Dans le cadre de la présente invention, un agent pathogène est de préférence un champignon.
Par « stimuler les défenses naturelles d’une plante », on entend ici l’induction ou l’augmentation d’au moins une des modifications biologiques suivantes : une production de molécule(s) antibiotique(s) et/ou antifongique(s), un renforcement de la paroi cellulaire illustré par un dépôt de callose, une expression accrue d’un ou plusieurs gènes de défense tels que Pall, LOX1, PR1, POX2, CHI4, NPR1, et OXO, et une augmentation des activités enzymatiques, telles que la peroxydase et la lipoxygénase. Cette stimulation des défenses naturelles permet ainsi de protéger efficacement la plante de toute maladie telle que la septoriose en réduisant la surface de nécroses et/ou le développement des pycnides, et l’oïdium en réduisant le développement des pustules.
L’invention concerne aussi un procédé ou une méthode pour renforcer la paroi cellulaire et/ou exprimer un ou plusieurs gènes de défense d’une plante et/ou augmenter l’activité enzymatique, en particulier la peroxydase et/ou la lipoxygénase, chez une plante, comprenant l’application d’une composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que décrits ci-dessus, sur ladite plante. Selon un mode particulier de l’invention, la plante est une céréale, par exemple l’orge, l’avoine, le millet, le maïs, le riz, le seigle, le blé, etc. De préférence la plante est du blé. Dans le contexte de l’invention, le blé comprend toutes les variétés de blé connues de l’homme du métier et notamment les cultivars de blé Alixan et Pakito.
Au cours de sa croissance et de son développement, le blé peut développer un nombre considérable de maladies. On peut citer par exemple l’oïdium, la fusariose, la septoriose, le piétin-verse, et la rouille brune, couronnée, jaune, et noire. Les maladies les plus communes sont notamment l’oïdium et la septoriose.
Les symptômes de l’oïdium peuvent être observés sur les feuilles, les tiges et les épis, mais ce sont les feuilles qui sont les plus souvent attaquées. Généralement, des pustules blanches se développent, et produisent une masse de spores ayant une apparence poudreuse. Au fur et à mesure de leur croissance, les pustules d’oïdium foncent et prennent une couleur grise ou brune. À terme, des organes contenant des spores noires (les cleistothèces) sont retrouvés incorporés dans les pustules de l’oïdium. Des champignons responsables de l’apparition de l’oïdium chez le blé sont notamment des champignons appartenant à la famille des Erysiphaccac, tels que Blumeria graminis forma specialis tritici (Blumeria graminis f. sp. tritici).
Les symptômes de la septoriose peuvent être observés dès les premières phases de croissance. Dans les jeunes parcelles de blé à semis automnal, des plaques aqueuses, qui prennent rapidement une apparence brune et nécro tique, sont déjà observables début décembre, ainsi que tout au long de l’hiver sur les étages foliaires inférieurs. Celles-ci contiennent des pycnides noires apparentes qui caractérisent la présence du champignon Mycosphaerella graminicola (anamorphe Zymoseptoria tritici), responsable de la septoriose du blé.
Ainsi, un objet préféré de l’invention est un procédé ou une méthode tel que décrit ci- dessus pour stimuler les défenses naturelles d’une plante contre un agent pathogène fongique, de préférence Zymoseptoria tritici, et Blumeria graminis. La composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels et mise en œuvre dans la méthode ou le procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante peut être formulée sous une forme connue de l’homme du métier pour être appliquée sur une plante.
De préférence, la composition se présente sous forme de poudre ou de solution, et est avantageusement une solution. Selon un mode préféré de l’invention, la composition est une solution aqueuse ou hydro-alcoolique. Lorsque la composition est une solution aqueuse, le composé de formule (I) ou un de ses sels est dissous dans de l’eau à une concentration donnée. Lorsque la composition est une solution hydro-alcoolique, le composé de formule (I) ou un de ses sels est dissous dans un mélange comprenant de l’eau et un solvant alcoolique, telle que le méthanol, l’éthanol, le propylène glycol, le propanol, le butanol, etc.
La concentration ou la dose en composé de formule (I) ou un de ses sels dans la composition mise en œuvre dans la méthode ou le procédé de l’invention dépendent bien entendu de l’espèce de plante à traiter et de son stade de développement. De préférence, la composition est appliquée à une dose comprise entre 1 et 60 kg par hectare de champs, de préférence entre 1 et 50, entre 1 et 20, entre 1 et 10 kg et entre 1,5 et 6 kg par hectare de champs, et de manière encore plus préférée à une dose d’environ 1,75, 3,5, ou 5,25 kg par hectare de champs.
Les doses décrites ci-dessus et appliquées pour un traitement en champs, peuvent être extrapolées des tests réalisés en laboratoire. En effet, les inventeurs ont démontré dans les exemples ci-après qu’une concentration minimale de 0,5 g/L d’un composé de l’invention était suffisante pour assurer un pourcentage de protection satisfaisant chez le blé. En conditions de laboratoire, il est généralement appliqué un volume de 15 mL d’une solution comprenant un composé de l’invention sur une surface d’application au sol de 0,0429 m2. Dans le cas où le composé à une concentration de 0,5 g/L, il est donc appliqué 7,5 mg (0,5 g x 15 mL) sur 0 ,0429 m2, ce qui correspond à 1,748 kg pour 100 m2, c’est-à-dire environ 1,75 kg par hectare de champs. De manière similaire, une concentration de 1 g/L d’un composé de l’invention correspond à une dose d’environ 3,5 kg par hectare de champs. Une concentration de 1,5 g/L d’un composé de l’invention correspond à une dose d’environ 5,25 kg par hectare de champs et une concentration de 15 g/L d’un composé de l’invention correspond à une dose d’environ 52,5 kg par hectare de champs. Bien entendu, l’homme du métier tiendra compte des normes applicables pour une application en champs et veillera à ne pas utiliser des doses supérieures aux normes établies par hectare de champs.
La composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels et mise en œuvre dans la méthode ou le procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante peut être appliquée par tout moyen connus de l’homme du métier. Par exemple, la composition peut être appliquée directement sur la plante par pulvérisation foliaire ou sur la semence de la plante par enrobage des graines. Une pulvérisation foliaire consiste à vaporiser une solution sous forme de gouttelettes sur les feuilles de plante. L’enrobage des graines consiste à recouvrir la graine d’un film comprenant la composition. La composition peut aussi être appliquée directement sur le sol sur lequel pousse la plante, par arrosage et infiltration. Dans un mode de réalisation particulier, la composition est appliquée par pulvérisation foliaire, par enrobage des graines, ou par arrosage et infiltration du sol.
D’autres aspects et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des composés ICB
Les composés synthétisés selon les méthodes décrites ci-dessous ont été analysés par RMN et/ou spectrométrie de masse.
Les spectres de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ont été enregistrés sur un spectromètre Brucker Avance II 400 opérant à 400 MHz pour le proton et à 100 MHz pour le carbone.
Les spectres de masse haute résolution ont été enregistrés sur un Spectromètre Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC-MS en mode introduction directe équipé d’une source électrospray en mode positif ou négatif avec une valeur variable suivant les molécules.
Les spectres de masse ont été enregistrés sur un Spectromètre Maldi-TOF/TOF Brucker Daltonics Ultraflex II en mode réflectron positif avec pour matrice le 2.5 DHB.
- 6,6’-di-0-trityl-a,q-tréhalose (ICB1)
20 g de tréhalose anhydre et 45,56 g de chlorure de trityle ont été dissous dans 400 mL de pyridine. Le mélange réactionnel a été agité pendant 1 nuit à température ambiante. Le solvant a été évaporé. Le tréhalose n’ayant pas réagi, a été éliminé par un lavage à l’eau. Le solide obtenu a été agité avec du toluène pendant une nuit et filtré sous vide. Cette opération a été répétée une fois puis le produit a été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 95% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 7,42-7,22 (m, H arom. du trityle, 30H), 5,12 (d, J=3,6Hz, 2H), 4,89 (d, J=4,9Hz, 2H), 4,83 (d, J=5,3Hz, 2H), 4,77 (d, J=6,4Hz, 2H), 4,03-4,01 (m, 2H), 3,61-3,59 (m, 2H), 3,37-3,35 (m, 2H), 3,19 (app d, J=8,2Hz, 2H), 3,16-3,14 (m, 2H).
13C-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 144,5 ; 128,8 ; 128,3 ; 127,3 (C sur cycle de trityle), 93,6 (Cl) ; 73,8 ; 72,1 ; 71,6 ; 71,0 (C2-C5) ; 7,0 (C6).
- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB5)
a) synthèse du l^^l’^’^’-hexa-O-acétyl-ô^’-di-O-trityl-o^a-tréhalose
20 g de 6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 200 mL de pyridine anhydre et 200 mL d’anhydride acétique. Le mélange réactionnel a été laissé sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Celui-ci a ensuite été versé dans de l’eau froide et placé au froid pendant une nuit. Le solide a été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 91% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, CDCL) d (ppm): 7,43-7,25 (m, H arom. du trityle, 30H), 5,48 (t, J=9,8Hz, 2H), 5,46 (d, J=3,6Hz, 2H), 5,22-5,17 (t, dd, J=l0,8Hz, J=4,4Hz, 4H), 4,16- 4,12 (m, 2H), 3,13 (d, J=3,0Hz, 4H), 2,01 (s, 6H, Ac), 1,92 (s, 6H, Ac), 1,77 (s, 6H, Ac). 13C-RMN (400 MHz, CDCb) d (ppm) : 170,2 ; 169,7 ; 169,2 (C=0 Ac) ; 143,4 ; 128,6 ; 127,9 (C sur cycle de trityle) ; 92,7 (Cl) ; 70,6 ; 69,8 ; 69,7 ; 68,9 (C2-C5) ; 61,8 (C6) ; 20,7 ; 20,6 ; 20,4 (CH3 Ac). b) synthèse 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-a,a-tréhalose
1 g de 2,3,4,2,,3,,4,-hexa-0-acétyl-6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL d’acide acétique à 80% aqueux. Le mélange a été laissé sous agitation à 75°C pendant 20h puis refroidi à température ambiante. Le trityl déprotégé a été précipité par ajout d’eau distillée. La phase aqueuse a ensuite été extraite avec de l’éther diéthylique puis évaporée et séchée sous vide. Une poudre crème avec un rendement de 85% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 5,51 (dd, J=9,4Hz, J=l0,3Hz, 2H), 5,28 (d, J=3,9Hz, 2H), 4,99 (dd, J=9,4Hz, J=lO,4Hz, 2H), 4,96 (dd, J=l0,3Hz, J=4,0Hz, 2H), 3,94-3,92 (m, 2H), 3,63-3,61 (m, 4H), 2,07 (s, 6H, Ac), 2,06 (s, 6H, Ac), 2,02 (s, 6H, Ac).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 162,8 ; 162,4 ; 162,1 (C=0 Ac); 93,1 (Cl); 72,4 ; 72,0 ; 70,9 (C2-C5) ; 60,4 (C6) ; 20,7 ; 20,2 (CH3 Ac).
HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci6H26NaOi3 + [M+ Na]+ 449,1266, expérimental 449,1262.
c) Synthèse du 6,6’-diéthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose
1 g de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6’-diéthyl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 96% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,16 (d, J=3,6Hz, 2H), 3,84 (t, J=4,5Hz, 2H), 3,81 (t, J=4,6Hz, 2 H), 3,76 (d, J=6,3Hz, 2H), 3,63-3,62 (m, 2H), 3,44-3,42 (m, 4H), 2,70 (q, J=6,9Hz, 4H, CH2), 1,17 (t, J=6,8Hz, 6H, CH3).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,2 ; 71,1 ; 69,7 (C2-C5) ; 60,6 (C6) ; 30,4 (CH20) ; 25,4 (CH3). MALDI-TOF (m/z) : calculé pour CAFLoNaOi i [M+Na]+42l,l686 expérimental 421,1636.
- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy- tréhalose (ICB6)
Figure imgf000019_0001
lg de 2,3,4,2,,3,,4,-hexa-0-acétyl-6,6’-dibutyl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 73% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,14 (d, J=4,9Hz, 2H), 3,86 (t, J=3,7Hz, 2H), 3,81 (t, J=6,2Hz, 2H), 3,73 (d, J=3,9Hz, 2H), 3,66-3,62 (m, 2H), 3,43-3,40 (m, 4H), 3,13 (m, 4H, CH2), 1,33 (qi, J=7,4Hz, 8H, CH2), 0,91 (t, J=7,4Hz, 6H, CH3).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,2 ; 71,1 ; 69,7 (C2-C5) ; 60,6 (C6) ; 36,5 (CH20) ; 28,7 ; 26,4 (CH2) ; 25,5 (CH3).
MALDI-TOF (m/z) : calculé pour C2oH3sNaOn+ [M-Na]+477,2 expérimental 477,1.
- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB7)
lg de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6’-dihexyl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 59% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 5,11 (d, J=5Hz, 2H), 3,83-3,30 (m, 14H), 1,48-1,40 (m, 4H, OCH2CH2), 1,28-1,15 (m, 8H, CH2), 0,90 (t, J=6,7Hz, 6H, CH3).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,3 ; 71,2 ; 69,8 (C2-C5) ; 60,7 (C6) ; 40,2 (CH20) ; 37,1 ; 34,8 ; 31,1 ; 29,2 ; 28,4 ; 25,4 (CH2) ; 25,5 (CH3).
MALDI-TOF (m/z): calculé pour C24H46NaOn+ [M-Na]+5l0,3 expérimental 533,1. - 6,6’-di-Q-octyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB8)
lg de 2,3,4,2’,3’,4’-hcxa-0-acétyl-6,6’-dioctyl-a,a-tréhalosc ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 74% a été obtenue.
‘H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,00 (dd, J=2,8Hz, J=3,6Hz, 2H), 3,85-3,35 (m, 14H, H2, H3, H4, H5, H6, OCH2), 1,49-1,44 (m, 4H, OCH2CH2), 1,32-1,14 (m, 10H, CH2), 0,80 (t, J=6,8Hz, 6H, CH3).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,3 ; 71,2 ; 69,8 (C2-C5) ; 60,7 (C6) ; 40,2 (CH20) ; 37,1 ; 34,8 ; 31,1 ; 29,2 ; 28,4 ; 27,1 ; 25,4 (CH2) ; 25,5 (CH3).
MALDI-TOF (m/z) : calculé pour CUFUNaOi i [M+Na]+589,3564 expérimental 589,3433. - 6,6’-di-Q-carboxyméthyl-a-a-tréhalose (ICB9 et ICB10)
5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30 mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-2-chloroacétique ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec 15 mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 66% a été obtenue.
‘H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 5,11 (s, 2H), 3,97 (s, 4H), 3,79-3,70 (m, 8H), 3,57 (d, J=7,2Hz, 2H), 3,37 (t, J=8,8Hz, 2H).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): d 174,9 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,5 ; 72,1 ; 71,0 ; 69,6 (C2- C5) ; 60,5 (C6) ; 43,8 (CH2 C=0).
MALDI-TOF (m/z): calculé pour C ir,H24Na20i 3 [M]+502,l expérimental 502,9.
La même synthèse a été réalisée en utilisant de l’acide 2-bromoacétique avec un rendement de 22,5%. - 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose de sodium (ICBll)
5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-3-bromopropionique ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec l5mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 85% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,21 (t, J=3,5Hz, 2H), 3,90-3,76 (ps. m, 8H), 3,69- 3,63 (ps.m, 6H), 3,47 (t, J=9,2Hz, 2H), 2,80 (t, J=6,4Hz, 4H).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 174,3 (C=0) ; 93,3 (Cl) ; 72,5 ; 72,2 ; 71,1 ; 69,7 (C2-C5) ; 60,6 (C6) ; 40,0 (CH20) ; 29,4 (CH2CO).
HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour CisH2xNaOi5 [M+ Na]+ 509,1482, expérimental 509,1462.
- 6,6’-di-Q-carboxypropyl-a-a-tréhalose de sodium (ICB12)
5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-4-bromobutanoïque ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec l5mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 41% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,13 (d, J=3,8Hz, 2H), 3,80-3,69 (m, 8H), 3,59- 3,58 (m, 2H), 3,52 (t, J=6,7Hz, 4H), 3,35 (t, J=9,3Hz, 2H), 2,16 (t, J=7,8Hz, 4H), 1,72 (q, J=7,3Hz, 4H).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 183,1 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,2 ; 72,1 ; 71,1 ; 66,5 (C2-C5) ; 61,5 (C6) ; 48,9 (CH20) ; 34,0 (CH2CO) ; 28,4 (C-CTL-C).
MALDI-TOF (m/z): calculé pour C2oH32Na2On+ [M-Na]+58l,2 expérimental 581,8.
- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose de sodium (ICB13 et ICB14)
5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30 mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-5-chloropentanoïque ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec 15 mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 45% a été obtenue. La même synthèse a été réalisée en utilisant de l’acide 5-bromopentanoïque, avec un rendement de 12,8%.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,04-5,00 (m, 2H), 3,73-3,45 (m, 16H), 3,50-3,45 (m, 2H), 2,07 (t, J=7,4Hz, 4H), 1,64-1,54 (m, 8H).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm): 183,4 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,5 ; 72,1 ; 71,0 ; 69,6 (C2-C5) ; 60,5 (C6) ; 45,2 (CH20) ; 36,7 (CH2CO) ; 31,6 ; 23,2 (C-CTL-C).
MALDI-TOF (m/z): calculé pour C22H½Na20i5 [M-Na]+609,l expérimental 609,0.
- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose de sodium (ICB15 et ICB16)
5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30 mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-6-chlorohexanoïque ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec l5mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 32% a été obtenue.
La même synthèse a été réalisée en utilisant de l’acide 6-bromohexanoïqueavec un rendement de 8,0%
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,11 (d, J=3,4Hz, 2H), 3,82-3,55 (m, 12H), 3,42- 3,38 (m, 4H), 2,11 (t, J=7,3Hz, 4H), 1,81-1,77 (m, 4H), 1,51-1,46 (m, 4H), 1,39-1,33 (m, 4H).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 183,8 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,4 ; 72,2 ; 71,0 ; 69,6 (C2-C5) ; 60,5 (C6) ; 37,4 (CH20) ; 35,1 (CH2CO) ; 31,8 ; 27,3 ; 24,9 (C-CTL-C).
MALDI-TOF (m/z) : calculé pour CAFLoNaOi [M-H]+477,4 expérimental 478,5.
- 6,6’-di-0-toluene-n-sulfonyl-a,q-tréhalose (ICB18)
lg de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6'-di-0-toluène-/?-sulfonyl-a,a-tréhalose a été dissout dans 20 mL de méthanol. Sous agitation, quelques grammes de sodium ont été ajoutés jusqu’à obtenir un pH de 9. Le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant 48h. Ensuite, de l’acide chlorhydrique à 0.1M a été ajouté jusqu’à avoir un pH de 4-5. Le mélange a été évaporé. La poudre obtenue a été mise en contact avec de l’éthanol et le milieu a été laissé reposer 24h. La poudre a été filtrée et séchée. Une poudre blanche avec un rendement de 98% a été obtenue. 'H-RMN (400 MHz, CDCb) : d 7.67 (d, J=7.64Hz, 4H, arom. H ortho de C-SO2), 7.35 (d, J=7.52Hz, 4H, arom. H ortho de C-CH3), 5.50 (s, 2H), 4.41-4.34 (m, 6H), 4.29-4.26 (m,6H), 2.37 (s, 6H, Me de Ts)
13C-RMN (400 MHz, CDCI3) : d 142.61 ; 139.36 ; 129.53 ; 125.40 (C sur cycle de Ts), 95.12 (Cl) ; 75.86 ; 71.08 ; 70.12 ; 69.80 (C2-C5) ; 68.86 (C6) ; 20.58 (Me de Ts)
- 6,6’-diazido-6,6’-dideoxy-a,g-tréhalose (ICB20)
Dans un ballon de 50mL, 1,25 g de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6'-diazido-6,6’- dideoxy-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 97% a été obtenue.
1H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,14 (d, J=3,6Hz, 2H), 3,92-3,90 (m, 2H), 3,77 (t, J=9,4Hz, 2H), 3,61 (dd, J=9,2Hz, J=3,0Hz, 2H), 3,51 (d, J=5,7Hz, 2H), 3,48 (d, J=5,7Hz, 2H), 3,40 (t, J=9,3Hz, 2H).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 93,8 (Cl) ; 72,3 ; 71,0 ; 70,9 ; 70,5 (C2-C5) ; 51,0 (C6).
HRMS (ESI-) (m/z) : calculé pour CUFLoGNf.Oy [M+ Cl]- 427,0986, expérimental 427,0985.
- 6,6’-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB21)
a) Synthèse du 2,3,4,2’,3,,4,-hexa-0-acétyl-6,6'-di-0-toluène-p-sulfonyl-a,a- tréhalose
20 g de tréhalose sec ont été dissous dans 300 mL de pyridine. Puis, sous agitation vigoureuse, 50g de chlorure de tosyle ont été ajoutés très lentement. Après 35 min, 300 mL d’anhydride acétique ont été ajoutés et la solution a été laissée sous agitation pendant une nuit. Le milieu réactionnel a été alors placé dans un mélange d’eau et de glace puis mis au froid pendant une nuit. Après précipitation du composé, celui-ci a été filtré. Le précipité blanc a ensuite été filtré puis mis une nuit sous agitation avec du méthanol. Le précipité a ensuite été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 50 % a été obtenue. 'H-RMN (400 MHz, CDCb) d (ppm) : 7,71 (d, J=8,2Hz, 4H, arom. H ortho de C-SO2), 7,36 (d, J=8,0Hz, 4H, arom. H ortho de C-CH3), 5,33 (t, J=4,7Hz, 2H), 4,96-4,80 (m, 6H), 4,13-3,96 (m, 6H), 2,45 (s, 6H, CH3 du tosyle), 2,02 (s, 6H, Ac), 2,00 (s, 6H, Ac), 1,99 (s, 6H, Ac).
13C-RMN (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 169,9 ; 169,5 ; 169,5 (C=0 Ac) ; 145,3 ; 132,4 ; 129,8 ; 128,0 (C sur cycle de Ts) ; 92,8 (Cl) ; 69,8 ; 69,2 ; 68,5 ; 68,1 (C2-C5) ; 67,5 (C6) ; 21,6 (CH3 du tosyle) ; 20,6 ; 20,5 (CH3 Ac).
b) Synthèse du l^^^’^’^’-hexa-O-acét l-ô^'-diazido-ô^’-dideox -a^- tréhalose
2g de 2,3,4,2’,3’,4’-hcxa-0-acétyl-6,6'-di-0-toluènc-/?-sulfonyl-a,a-tréhalosc et 308 mg d’azide de sodium ont été dissous dans 14 mL de DMF. Le mélange a été laissé sous agitation à 90°C pendant l6h. Par la suite, il a été refroidi à température ambiante et précipité dans de l’eau distillée. Après avoir filtré le mélange, une recristallisation dans 20 mL d’éther ou éthanol a été réalisée. Le précipité a ensuite été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 88% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 5,50 (t, J=5,5Hz, 2H), 5,35 (d, J=3,8Hz, 2H), 5,11 (d, J=4,0Hz, 2H), 5,01 (t, J=5,0Hz, 2H), 4,11-4,09 (m,2H), 3,39 (dd, J=7,3Hz, 2H), 3,20 (dd, J=l2,9Hz, J=2,4Hz, 2H), 2,15 (s, 6H, Ac), 2,09 (s, 6H, Ac), 2,05 (s, 6H, Ac). 13C-RMN (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 169,9 ; 169,6 ; 169,6 (C=0, Ac) ; 93,8 (Cl) ; 69,9; 69,8 ; 69,7 ; 69,6 (C2-C5) ; 50,9 (C6) 20,6 (CH3, Ac).
HRMS (ESI+) (m/z): calculé pour C24H32N6NaOi5+ [M+ Na]+ 667,1818, expérimental 667,1817.
c) Synthèse du ô^'-di-ÎN-acétylaminoj-l^l’^’-tétra-O-acétyl-ô^’-dideoxy- a,a-tréhalose
2 g de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6'-diazido-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ont été placés dans 20 mL de dioxane et 4 mL de méthanol. Sous N2, 4,5g de triphénylphosphine ont été ajoutées lentement et le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant lh. Ensuite, 14 mL d’ammoniac (30%) ont été ajoutés et le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant l6h. Le solvant a été évaporé sous vide et le résidu a été trituré avec de l’eau. La suspension résultante a été acidifiée jusqu’à un pH de 4 avec de l’acide chlorhydrique à 1N et 0,1N. PI13P et Ph3PO résultants ont été filtrés et lavés avec de l’eau (2x50 mL) et les phases aqueuses combinées ont été lavées avec du dichlorométhane (2x5 OmL). La phase aqueuse a ensuite été évaporée et séchée sous vide. Une poudre crème avec un rendement de 80% a été obtenue après recristallisation dans l’éthanol.
'H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,09 (t, J=4Hz, 2H), 3,84-3,76 (ps. m,4 H), 3,66- 3,54 (ps. m, 4H), 3,41-3,27 (ps. m, 4H), 2,00 (s, 9H, Ac).
13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 177,4 (C=0, Ac) ; 174,4 (C=0, Ac) ; 93,3 (Cl) ; 72,3 ; 71,0; 70,9 ; 70,6 (C2-C5) ; 39,8 (C6) ; 21,7 ; 21,1 (CH3, Ac).
HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour C24H36N2NaOi5+ [M+ Na]+ 592,2116, expérimental 425,1771 (hydrolyse des acétyles).
d) Synthèse du 6,6’-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a -tréhalose (ICB21)
Dans un ballon de 50mL, l,34g de 6,6'-di-(N-acétylamino)-2,3,2’,3’-tétra-0- acétyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose a été dissout dans 20mL de méthanol. Sous agitation, quelques milligrammes de sodium ont été ajoutés jusqu’à un pH 9. Le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant 48h. La solution a été acidifiée avec des solutions HCl à 1N et 0,lN, filtrée et évaporée. Le produit a été recristallisé dans de l’éthanol, filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 87% a été obtenue.
1H-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 5,22 (d, J=4Hz, 2H), 3,95-3,89 (ps. m,4H), 3,75- 3,66 (ps.m, 4H), 3,54-3,49 (ps.m, 2H), 3,42 (ps.t, J=9,6Hz, 2H), 2,12 (s, 6H, CH3). 13C-RMN (400 MHz, D20) d (ppm) : 174,50 (C=0); 93,4 (Cl); 72,4 ; 71,1 ; 71,0 ; 70,6, (C2-C5) ; 39,8 (C6); 21,8 (CH3).
HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci6H28N2NaOii+ [M+ Na]+ 447,1585, expérimental 447,1590.
- 6,6’-diiodo-6,6’-dideoxy-a,q-tréhalose (ICB24)
8 g de tréhalose anhydre ont été dissous dans 200 mL de DMF. Ensuite, 30.65 g de triphénylphosphine et 23.75 g de diiode ont été ajoutés. Le mélange a été chauffé à 80 °C pendant lh30 puis évaporé jusqu’à obtenir 1/3 du volume d’origine. Enfin, 300 mL de méthanol ont été additionnés. Quelques grammes de sodium solide ont été ajoutés jusqu’à pH 9. L’agitation à température ambiante a été laissée pendant 30 min puis le mélange a été neutralisé sous DOWEX 50W, 8, H+ form. La résine a été éliminée par filtration et lavée avec du méthanol. La solution a ensuite été filtrée à travers du charbon animal et concentrée pour obtenir un résidu. Le résidu a ensuite été trituré avec 250 mL d’eau. PI13P et PI13PO résultants ont été éliminés par filtration. Le solide obtenu a été mis dans 50 mL de xylène et laissé sous agitation pendant plusieurs heures puis filtré. Le solide a été lavé plusieurs fois avec du dichlorométhane et du butanol pour éliminer les traces de diode et de DMF. Une poudre jaune avec un rendement de 61% a été obtenue.
'H-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 4.99 (d, J=3.6Hz, 2H), 4.92 (t, J=3.5Hz, 4H), 3.64 (d, J=5.8Hz, 2H), 3.54-3.42 (m, 8H) 2.70 (s, 4H), 2.53 (m, 6H)
13C-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 93.41 (Cl) ; 73.64 ; 72.03 ; 71.05 ; 70.99 (C2- C5) ; 60.60 (C6)
HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci2H2oLNa09 + [M+ Na]+ 584,9089, expérimental 584,9092.
- 6,6’-dichloro-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB25)
2 g de tréhalose sec ont été dissous dans 10 mL de DMF et 3 mL de chlorure de thionyle. La réaction était exothermique. La solution a été laissée sous agitation pendant 2h à température ambiante et a été évaporée sous vide. 10 mL d’eau distillée ont été additionnés et une série d’extraction avec 10-15 mL de dichlorométhane a été effectuée jusqu’à obtenir une phase organique incolore. La phase aqueuse a été évaporée. Un liquide brun avec un rendement de 10% a été obtenu.
'H-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 4.89 (dd, J=5.8Hz, 4H), 3.70 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 3.61 (m, 2H), 3.59-3.52 (m, 4H), 3.28 (d, J= 3.4Hz, 2H), 3.22 (s, 4H)
13C-RMN (400 MHz, DMSO d (ppm) : d 93.90 (Cl) ; 73.24 ; 71.73 ; 71.30 ; 71.20 (C2- C5) ; 61.13 (C6)
HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci2H2oCl2Na09 + [M+ Na]+ 401,0377, expérimental 401,0360. Exemple 2 : Tests contre l’oïdium (Blumeria graminis f. sp. triticï)
1. Tests in planta
1.1. Conditions de culture du blé
Des grains de blé ont été imbibés dans de l’eau pendant 24 heures puis ont été semés en quinconce dans des barquettes en plastique remplies de terreau, à raison de 24 plantules par barquette. La culture a été faite en armoire de croissance, avec 12 heures de jour à 18 °C et 12 heures de nuit à 12 °C. L’humidité relative était de 70%. Lorsqu’elles étaient âgées de 10 jours, les plantules ont été pulvérisées avec 10 mL d’un composé ICB de l’invention à 15 g/L ou 1,5 g/L. Après 48 heures, les plantules ont été inoculées avec une suspension de B. graminis à 250 000 spores/mL de Fluorinert FC43 (heptacosafluorotributylamine, 3M, Cergy-Pontoise, France). La lecture des symptômes (pustules blanchâtres) a été réalisée 12 jours après l’inoculation.
1.2. Résultats de protection du blé
Le taux d’infection a été évalué sur les premières feuilles formées depuis la base des plantes (collet).
Le pourcentage d’infection obtenu après traitement des plants de blé par les différents composés ICB est défini par rapport au témoin (plants de blé pulvérisé avec de l’eau distillée et inoculés) et est calculé selon la formule suivante :
% infection = (nombre de pustules blanchâtres sur la première feuille des plants traités avec le composé ICB X 100) / nombre de pustules blanchâtres sur la première feuille du plant témoin
Le pourcentage de protection est calculé selon la formule suivante :
% de protection = 100 - % d’infection Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 :
Figure imgf000028_0001
Les meilleurs taux de protection contre l’oïdium du blé ont été obtenus avec les composés ICB8, ICB11, et ICB2l.
1.3. Validation de l’effet inducteur de défenses : dosages d’activités enzymatiques Les dosages de l’activité peroxydase et lipoxygénase ont été réalisés sur la première feuille formée à partir de la base des plants de blé âgés de 10 jours :
au moment du traitement par les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L (sans inoculation),
- à 24 heures (Jl) et 48 heures (J2) après traitement, et
- à 1 jour (J2+li ou J2+lni) et 2 jours (J2+2i ou J2+2ni) après inoculation (i) par le champignon B. graminis ou sans inoculation (ni).
Pour les feuilles de blés infectées, l’inoculation par le champignon B. graminis a été effectuée à J2. Les résultats concernant le dosage de l’activité peroxydase sont illustrés par la figure 1. Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité peroxydase, visible dès 24 h à 48 h après traitement, dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 1 A). Après infection (inoculation) par le champignon B. graminis, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation significative de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non- traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non-inoculées (Figures 1B et 1C).
Les résultats concernant le dosage de l’activité lipoxygénase sont illustrés par la figure 2.
Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité lipoxygénase 24 h et 48 h après traitement, dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 2A).
Après infection (inoculation) par le champignon B. graminis, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation de l’activité lipoxygénase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non-traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non-inoculées (Figures 2B et 2C).
2. Effet direct sur la sermination des spores de B. sraminis
L’effet direct des composés ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 sur le pouvoir germinatif des spores de B. graminis a été évalué en saupoudrant un inoculum frais (âgé de 10 jours) au-dessus de boites de Péri contenant un milieu solide constitué d’agar à 12% dans de l’eau distillée stérile et un des produits ICB5, ICB8, ICB11, ou ICB21 à une concentration de 1,5 g/L. Les boites de Pétri ont été mises à incuber à la lumière pendant 24 heures et la germination des spores de B. graminis a été observée au microscope photonique.
Les résultats sont illustrés par la figure 3.
Aucun effet sur le nombre et l’aspect des tubes germinatifs des spores de B. graminis n’a été observé, quel que soit le composé ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 testé. Ceci démontre que la protection observée est due à un effet SDP (stimulateur de défense des plantes) plutôt qu’à un effet antifongique ou fongistatique. Exemple 3 : Tests contre la septoriose ( Zymoseptoria triticï)
1. Tests in planta
1.1. Conditions de culture du blé
Des grains de blé ont été imbibés dans de l’eau pendant 24 heures puis ont été semés en quinconce dans des barquettes en plastique remplies de terreau, à raison de 24 plantules par barquette. La culture a été faite en armoire de croissance, avec 16 heures de jour à 20 °C et 8 heures de nuit à 16 °C. L’humidité relative était de 70%. Lorsqu’elles étaient âgées de 22 jours, les plantules ont été pulvérisées avec 15 mL d’un composé ICB de l’invention à 15 g/L ou 1,5 g/L. Après 48 heures (J2), les plantules ont été inoculées avec une suspension de spores de Z. tritici à 1.106 spores/mL d’eau distillée contenant 0,025% de Citowett (B.A.S.F., Levallois-Perret, France). La lecture des symptômes a été réalisée environ 3 semaines après l’inoculation.
1.2. Résultats de protection du blé
1.2.1. Protection obtenue chez le cultivar de blé Alixan inoculé par la souche T02596
La septoriose du blé, due à Mycosphaerella graminicola (anamorphe Zymoseptoria tritici), se manifeste par l’apparition de taches brunâtres sur les feuilles de blé, qui correspondent à des nécroses des tissus et donc à la mort des cellules des feuilles de blé dans la zone infectée.
Le pourcentage de surface foliaire nécrosée est évalué visuellement sur les deuxième (F2) et troisième (F3) feuilles formées depuis la base du plant de blé.
Le pourcentage d’infection obtenu après traitement des plants de blé par les différents composés ICB est défini par rapport au témoin (plants de blé pulvérisé avec de l’eau distillée et inoculés) et est calculé selon la formule suivante : % infection = (% de surface foliaire nécrosée sur les plants traités avec le composé ICB X 100) / % de surface nécrosée chez les plants témoin
Le pourcentage de protection est calculé selon la formule suivante :
% de protection = 100 - % d’infection
Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 :
Figure imgf000031_0001
Les meilleurs taux de protection contre le champignon Zymoseptoria tritici ont été obtenus avec les composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21.
Des tests de protection ont également été réalisés en réduisant la dose des composés ICB. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 :
Figure imgf000031_0002
Les résultats du tableau 3 montrent que la réduction de la concentration des composés ICB à 1 et 0,5 g/L permet d’obtenir une protection équivalente à la concentration 1,5 g/L. L’effet des composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21 a été comparé à celui du Vacciplant (laminarine) commercialisé par la société Arysta, utilisé à la dose préconisée au champ : 0,5 L/ha de la solution commerciale à 37 g/L de laminarine.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 :
Figure imgf000032_0001
Les résultats montrent un % de protection d’environ 5 fois supérieur pour les composés ICB11 et ICB21, par rapport au % de protection obtenu avec Vacciplant. Une réduction significative du pourcentage de surface nécrosée due à la maladie chez les plantules de blé traitées par les composés ICB 11 et ICB21, est également observée sur les photographies de la figure 4.
L’évaluation de la maladie passe également par l’observation de l’apparition de pycnides, structures de formation des pycnidiospores, qui sont des unités de dissémination du champignon, responsables de la propagation de la maladie.
Les résultats sont présentés dans la figure 5.
Ces résultats montrent une réduction significative du nombre de pycnides formées après traitement des plantules de blé avec ICB8 (environ 40 %), et plus fortement avec ICB11 et ICB21 (environ 50%) à 1,5 g/L, par rapport au contrôle. Cette réduction est également observée par rapport au traitement avec le Vacciplant (0,5 L/ha de la solution commerciale à 37 g/L de laminarine) et le tréhalose natif (1,5 g/L).
1.2.2. Protection obtenue chez le cultivar de blé Pakito inoculé par la souche TOI 192
Le protocole utilisé chez le cultivar de blé Pakito inoculé par la souche T01193 était identique au protocole utilisé chez le cultivar de blé Alixan inoculé par la souche T02596.
Les résultats concernant le pourcentage de protection des composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21 sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous, et les résultats concernant l’observation des pycnides est présentée dans la figure 6. Tableau 5 :
Figure imgf000033_0001
Les résultats montrent un taux de protection similaire chez le cultivar de blé Pakito à celui observé chez le cultivar de blé Alixan (réduction de la surface nécrosée et du nombre de pycnides formées) avec les composés ICB11 et ICB21.
1 3. Analyse microscopique des pycnides sur des feuilles traitées chez le cultivar de blé Alixan et inoculées avec Z. tritici
Les résultats sont présentés dans les figures 7 et 8.
L’analyse microscopique montre et confirme une diminution du nombre des pycnides d’environ 50% après traitement avec les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L (Figure 8). Cette diminution du nombre des pycnides est également observée sur les photographies de la figure 7. En outre, une réduction de la taille des pycnides (surface noire) est également observée. 1.4. Effet des composés de l’invention sur l’induction de la callose
Des plants de blé de 3 semaines ont été traités avec les produits ICB21 et ICB11 et inoculés avec la souche T02596. Les plantes traitées avec de l’eau et inoculées ont été utilisées comme contrôles Les prélèvements suivants ont été effectués : J+lni, J+2ni, J2+ lni, J2+2ni, J2+39ni, J2+l lni, J2+li, J2+2i, J2+9i et J2+11Î. Les feuilles ont été fixées et décolorées pendant 2h avec une solution d’éthanol/acide acétique (3/1, v/v). Les plantes ainsi décolorées ont ensuite été rincées avec de l’éthanol à 70 %, 50 % puis 25 % pendant 2h chacun. Les plantes ont finalement été rincées dans de l’eau distillée une nuit.
Les plantules ont été incubées dans du NaOH 10 % à 37°C pendant lh pour clarifier les tissus, puis incubées avec le bleu d’aniline à 0,01 % K2HP04 150 mM, pH 10 pendant plusieurs heures.
Les dépôts de callose ont été observés au microscope confocal avec une longueur d’onde d’excitation de 405 nm et une longueur d’onde d’émission de 523 nm.
Les résultats sont présentés dans la figure 9.
Les résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L induisent l’accumulation d’un dépôt de callose sur les feuilles de blé inoculées avec Z. tritici (i) 2, 9, et 11 jours après traitement par rapport aux feuilles non inoculées (ni), empêchant ainsi la pénétration du pathogène Z. tritici.
1.5. Dosages d’activités enzymatiques
Les plantes ont été cultivées selon le protocole décrit au point 1.1.
Les dosages de l’activité peroxydase et lipoxygénase ont été réalisés sur la troisième feuille de chaque plante :
au moment du traitement par les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L (sans inoculation),
- à 24 heures (Jl) et 48 heures (J2) après traitement, et - à 1 jour (J2+1Î ou J2+lni), 2 jours (J2+2Î ou J2+2ni), 9 jours (J2+9Î ou J2+9ni), 11 jours (J2+1 li ou J2+1 lni), et 13 jours (J2+13Î ou J2+l3ni), après inoculation (i) par le champignon Z. tritici ou sans inoculation (ni).
Pour les feuilles de blés infectées, l’inoculation par le champignon Z. tritici a été effectuée à J2.
Les résultats concernant le dosage de l’activité peroxydase sont illustrés par les figures 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, et 10F.
Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité peroxydase 48 h après traitement dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 10A).
Après infection (inoculation) par le champignon Z. tritici, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation significative de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non-traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non- inoculées (Figures 10B-10F), et ce jusqu’à 13 jours après inoculation.
Fes résultats concernant le dosage de l’activité lipoxygénase sont illustrés par les figures 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, et 11F.
Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité lipoxygénase 48 h après traitement, dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 11 A).
Après infection (inoculation) par le champignon Z. tritici, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation de l’activité lipoxygénase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non-traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non- inoculées (Figures 11B-11F), et ce jusqu’à 13 jours après inoculation. 1.6. Analyses de l’expression de gènes de défense des plantes après traitement avec les composés de l’invention et inoculation avec Z tritici.
Protocole :
Les plantules de blé traitées avec les produits ICB11 et ICB21 à 1,5 g/l pendant 48h ont été inoculées avec la souche T02596, afin de suivre l’expression de gènes marqueurs de défense par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). L’ARN total a été extrait à partir des feuilles à 1, 2, 3 et 12 jours après inoculation (JAI) en utilisant le kit RNeasy plant Mini kit (Qiagen). Avant l’étape de qRT-PCR, TARN a été traité avec la RNase- Free DNase I (Qiagen) pour éliminer les l’ADN génomique résiduel. La synthèse d’ADNc s’est faite à partir de lpg d’ARN total en utilisant le kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). La qRT-PCR a été effectuée dans un appareil qRT-PCR ABI PRISM 7300 afin de mesurer l’effet des produits à base de tréhalose sur l’expression des gènes suivants : POX2, PR1, PAL1, LOX1 et CHI4. L’expression relative des gènes a été calculée selon la méthode AACt (Livak et Schmittgen, Methods, 2001, 4, 402-408). Des plantes traitées avec de l’eau ont été utilisées comme contrôle négatif.
Résultats :
Les résultats du tableau 7 montrent que le prétraitement des plantes avec les produits ICB11 et ICB21 suivi d’une inoculation avec le pathogène augmente fortement l’expression des gènes de défense PAL1, POX2, PR1 et CHI4. En effet, le traitement avec les produits potentialise l’expression des gènes de défense, puisque l’induction des gènes augmente 2 fois plus par rapport à celle observée chez des plantes traitées avec de l’eau. L’induction forte du gène PR1, caractéristique de la voie de l’acide salicylique (12 JAI), semble en totale corrélation avec l’expression du gène PAL1, plus précoce (1 et 2 JAI), gène codant pour une enzyme située très en amont de la voie des phénylpropanoïdes, conduisant notamment à la synthèse d’acide salicylique. Le produit d’expression du gène PR1 est une protéine basique possédant des propriétés fongicides. De même, l’expression du gène CHI4 codant pour une chitinase capable de dégrader la paroi de champignons, augmente de 1,5 à 2 fois après traitement avec les produits ICB11 et ICB21 par rapport au traitement avec de l’eau. L’expression du gène POX2 augmente fortement après traitement et inoculation. Une forte induction de ce gène contribue à une forte activité enzymatique de la peroxydase, connue pour son rôle dans rutilisation des peroxydes, toxiques pour la plante. L’induction du gène POX2 peut ainsi indiquer la synthèse d’une peroxydase qui permettrait un renforcement de la paroi cellulaire, par l’accumulation de lignine par exemple, empêchant la pénétration des agents pathogènes. Hors contexte infectieux, le traitement seul avec les produits n’induit pas une forte expression de gènes. En effet, à 3 et 4 jours après traitement, il n’y pas de mobilisation du métabolisme de la plante vers l’expression de gènes de défense. Toutefois, la plante reste en alerte puisque l’inoculation par l’agent pathogène Z. tritici déclenche une expression importante des marqueurs de défense.
Tableau 6 : séquence des amorces utilisées pour les expériences de qPCR.
(F : Forward, R : Reverse)
Figure imgf000037_0001
Tableau 7 : expression des gènes après traitement chez plantes inoculées ou non.
Figure imgf000038_0001
2. Effet direct sur la germination des spores de Z. tritici Les composés ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 ont été incorporées à un milieu gélosé stérile composé d’Agar à 12% dans de l’eau distillée à des concentrations finales variées (0,15 g/L, 0,5 g/L, 1 g/L, 1,5 g/L, 7,5 g/L, et 15 g/L). Une goutte de solution de spores du champignon Z. tritici à 1.106 spores/mL d’eau a été déposée à 5 emplacements sur le milieu gélosé. Après 8 et 12 jours d’incubation à l’obscurité, les diamètres des disques correspondant au développement du champignon ont été mesurés.
Les résultats ont montré que quelle que soit la concentration utilisée, les composés testés ne modifient pas la germination et le développement du champignon. Aucun effet fongicide ni fongistatique n’a été observé. Ceci démontre que la protection observée est due à un effet SDP (stimulateur de défense des plantes) plutôt qu’à un effet antifongique ou fongistatique.
En conclusion des exemples 2 et 3, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que les composés de l’invention, en particulier ICB11 et ICB21 étaient des composés SDP efficaces en :
- protégeant la plante de blé en réduisant la surface de nécroses responsables de la septoriose, et en réduisant le développement des pustules responsables de l’oïdium ;
- réduisant le développement des pycnides responsables de la propagation de la septoriose ;
- induisant l’expression des activités de la peroxydase et de la lipoxygénase après traitement et inoculation, permettant ainsi à la plante de répondre plus rapidement et plus efficacement, et donc de la rendre plus résistante ou tolérante lorsqu’elle est soumise à un agent pathogène ;
- induisant l’accumulation d’un dépôt de callose sur les feuilles des plantes ;
- induisant l’expression des gènes de défense des plantes ; et en
- ne présentant pas d’effet sur la germination et le développement des champignons responsables de l’oïdium et de la septoriose, démontrant ainsi que la protection des plantes était due à un effet SDP, et non à un effet antifongique ou fongistatique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d’un composé de formule (I) :
Figure imgf000040_0001
dans laquelle Ri représente un groupe choisi parmi :
un groupe -OR3, avec R3 étant un groupe choisi parmi :
• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un phényle ou un groupe carboxyle, ou
• un groupe acétyle ou tosyle,
r un azoture ou un groupe -NR4R5, avec R4 et R5 étant indépendamment un hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6,
un halogène,
un hydrogène, ou
un groupe -O-CO-Rr, ou -NH-CO-Re, avec R6 étant un phényle optionnellement substitué par un hydroxyle ou un groupe alkyle en Ci-
C6 ;
ou un de ses sels pour stimuler les défenses naturelles d’une plante.
2. Utilisation d’un composé de formule (I) ou un de ses sels selon la revendication 1 dans laquelle Ri représente un groupe choisi parmi :
un groupe -OR3, avec R3 étant un groupe choisi parmi :
• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un groupe carboxyle, ou
un azoture ou un groupe -NH-CO-Re, avec R6 étant un groupe alkyle en Ci-Ce.
3. Utilisation d’un composé de formule (I) ou un de ses sels selon la revendication 1, dans laquelle ledit composé ou un de ses sels est choisi parmi : - 6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-di-0-hcxyl-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-di-0-octyl-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-di-0-carboxymethyl-a-a-tréhalose;
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose;
- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose;
- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-toluene-p-sulfonyl-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-diazido-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6,-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-diiodo-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-dichloro-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-dibromo-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-difluoro-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;
- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; et
- 6,6,-di-(2-hydroxybenzoylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose.
4. Procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, comprenant l’application d’une composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que définis selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, sur ladite plante.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite composition est une composition aqueuse ou hydro-alcoolique.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel la composition est appliquée par pulvérisation foliaire, par enrobage des graines, ou par arrosage et infiltration du sol.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 6, dans lequel la plante est une céréale, de préférence du blé.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, pour stimuler les défenses naturelles d’une plante contre un agent pathogène fongique, de préférence Zymoseptoria tritici, et Blumeria graminis.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 8, dans lequel la composition est appliquée à une dose comprise entre 1 et 60 kg par hectare de champs, de préférence entre 1 et 50, entre 1 et 20, entre 1 et 10 kg et entre 1,5 et 6 kg par hectare de champs, et de manière encore plus préférée à une dose d’environ 1,75, 3,5, ou 5,25 kg par hectare de champs.
10. Composé ou un de ses sels choisi parmi :
- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;
- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ; et
- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose.
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