WO2019116772A1 - 細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置 - Google Patents

細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置 Download PDF

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WO2019116772A1
WO2019116772A1 PCT/JP2018/040709 JP2018040709W WO2019116772A1 WO 2019116772 A1 WO2019116772 A1 WO 2019116772A1 JP 2018040709 W JP2018040709 W JP 2018040709W WO 2019116772 A1 WO2019116772 A1 WO 2019116772A1
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analysis
cell
screening
metabolic
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啓介 渋谷
憲一郎 岡
近藤　健之
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株式会社日立製作所
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    • C12M41/48—Automatic or computerized control

Definitions

  • the present invention relates to a method of screening cell lines and culture conditions, and an apparatus therefor.
  • Target substances produced using cells are applied to food / beverage, chemicals / fibers, pharmaceuticals, cosmetics, energy-intensive industrial fields and research support fields (research devices / reagents, DNA synthesis etc.) It is done.
  • the culture mode of cell culture is classified into batch culture, fed-batch culture (or semi-batch culture), and continuous culture (or perfusion culture).
  • Batch culture is a culture method in which a new culture medium is prepared each time, a cell line is planted there, and the culture medium is not added until harvest. Batch culture is characterized in that although the quality varies from culture to culture, it can disperse and reduce the risk of contamination.
  • the fed-batch culture is a culture method in which the medium itself or a specific component in the medium is added during the culture, and the product is not extracted until the end of the culture.
  • Continuous culture is a culture method in which the culture system is continuously supplied with the medium, and at the same time the culture solution of the same amount as the supplied medium is withdrawn. Continuous culture is characterized in that the culture environment can be easily kept constant and the productivity is stabilized.
  • culture conditions such as temperature at which productivity becomes high and dissolved oxygen concentration are determined with respect to the culture method.
  • the mechanism of synthesis of useful substances in cells is very complicated and has not been fully elucidated. Therefore, in the conventional screening of appropriate culture conditions, the state of culture cells that affect productivity and quality is grasped, the causal relationship between the culture conditions and the state of cells is grasped, and culture that makes productivity and quality optimal. It was necessary to search for the condition.
  • screening of conventional appropriate culture conditions is performed by trial and error in which cells are actually cultured under various culture conditions.
  • This patent describes a method for whole cell manipulation of novel or modified phenotypes using real time metabolic flux analysis.
  • the method comprises the steps of (a) creating a modified cell by modifying the genetic makeup of the cell. (B) culturing the modified cells to generate a plurality of modified cells. (C) measuring at least one metabolic parameter of the cells by monitoring the cell culture of step (b) in real time. And (d) analyzing the real-time metabolic flux analysis by analyzing the data of step (c) to determine if the measured parameters differ from comparable measurements in unmodified cells under similar conditions. Including the step of using it to identify an engineered phenotype in said cell.
  • Patent Document 1 According to the method described in Patent Document 1, it is possible to efficiently select modified cells. However, as described above, the number of conditions of the culture environment is very large, and it is necessary to carry out a large number of culture experiments to construct a manufacturing process. Therefore, the situation of requiring a great deal of time and cost for screening culture conditions has not changed. That is, the method described in Patent Document 1 can not screen for optimal culture conditions.
  • the present invention has been made in view of the above situation, and an object of the present invention is to provide a method of screening cell lines and culture conditions, and a device therefor, which can easily perform screening of cell lines and culture conditions.
  • a target intracellular metabolic reaction is set, and in the cells to be used, a correlation model between culture conditions (culture environment factors such as temperature and pH) and respective metabolic reaction rates is constructed. Then, by using this correlation model and calculating the culture condition that is closest to the set intracellular metabolic reaction model (that is, the target value), it is possible to realize the intracellular metabolic reaction close to the target. And, it has been found that this makes it possible to obtain high productivity and stable quality of the target substance.
  • the present invention has been completed by finding these findings.
  • the “correlation model” in the present invention refers to a model representing a correlation between a metabolic reaction, a metabolic reaction equation relating to the metabolic reaction, and a culture environment factor affecting the metabolic reaction or the metabolic reaction equation. That is, the correlation model has a metabolic rate equation depending on the number of metabolic reactions being elucidated.
  • the above-mentioned subject concerning the present invention is solved by the following means.
  • the method of screening cell lines and culture conditions according to the present invention comprises a target value setting step of setting a target value for a metabolic reaction of cultured cells, and a first culture step of culturing cultured cells under preset culture conditions;
  • the analysis step of analyzing the culture solution containing the cultured cells, the metabolic analysis based on the analysis result obtained in the analysis step, the analysis value calculating step of calculating an analysis value, and the correlation model A culture condition calculating step of calculating culture conditions closest to the target value from the analysis value and changing the culture conditions set in the first culture step to the calculated culture conditions, and the culture conditions changed in the changed culture conditions.
  • the screening apparatus for cell lines and culture conditions comprises: target value setting means for setting a target value related to a metabolic reaction of cultured cells; culture means for culturing cultured cells under the set or changed culture conditions; Using an analysis means for analyzing the culture solution containing the cultured cells cultured by the means, an analysis value calculation means for performing analysis of the metabolism based on the analysis result obtained by the analysis means, and a correlation model Culture condition calculation means for calculating the culture condition which is closest to the target value from the analysis value and changing the culture condition set by the culture means to the calculated culture condition, a plurality of culture cells and culture conditions And screening means for screening a cell line and culture conditions closest to the target value among the analysis values obtained by performing.
  • screening method the method of screening cell lines and culture conditions according to the present invention and an apparatus therefor (hereinafter sometimes simply referred to as “screening method” and “screening apparatus”) according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings. explain.
  • the characteristics of the cell line required for the production of the target substance will be described, and then the construction of a correlation model between the culture conditions and the metabolic reaction rate will be described.
  • embodiments of the screening apparatus will be described, and then embodiments of the screening method will be described.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating transmission and expression of genetic information (central dogma) and expression of cell functions.
  • FIG. 2 is a schematic view showing a cell line that produces a target substance by intracellular metabolism.
  • FIG. 3A is a conceptual diagram showing an example of intracellular metabolism before genetic recombination.
  • FIG. 3B is a conceptual diagram showing an example of intracellular metabolism after genetic recombination.
  • FIG. 3C is a conceptual diagram showing another example of intracellular metabolism prior to gene recombination.
  • FIG. 3D is a conceptual diagram showing another example of intracellular metabolism after genetic recombination.
  • a cell takes in the raw material used as a nutrient component in a cell, synthesize
  • the production efficiency of the target substance involves the metabolic reaction rate which is one of the cell functions, and the metabolic reaction rate depends on the culture conditions.
  • an enzyme protein that promotes a metabolic reaction in cells needs to be expressed in all metabolic pathways. Referring to FIG. 1, the flow until the enzyme protein is expressed and acts as a cell function is as follows.
  • the gene of the enzyme protein is encoded in the genomic DNA in the cell.
  • MRNA is transcribed from genomic DNA, and proteins such as enzyme proteins are translated from mRNA and expressed.
  • the enzyme protein thus expressed is activated by forming a higher-order structure, undergoing modification, etc., and acting as a cell function, whereby the metabolic reaction rate is improved. Since factors involved in the activity and metabolic reaction of these mRNAs and enzyme proteins depend on culture conditions, the metabolic reaction rate and productivity of substance production also depend on culture conditions.
  • the amount and kinetics of transcription from genomic DNA to mRNA can be grasped by performing transcriptome analysis.
  • expression levels and kinetics of proteins expressed from genomic DNA and mRNA can be grasped by performing proteome analysis.
  • the flow from when a cell takes in a raw material that becomes a nutrient component, synthesizes and modifies in a metabolic pathway in the cell to produce a target substance is shown in FIG.
  • the target substance OS is produced from the cells C producing the target substance OS via the metabolism Me (synthetic reaction) in the cell C using the nutrient component NC in the culture solution M as a raw material.
  • a by-product BP may be produced in the production of the target substance OS.
  • Arrows “ ⁇ ” in FIG. 1 indicate metabolic pathways.
  • Examples of cells C that can be used in the present embodiment include Chinese hamster ovary cells (CHO cells), baby hamster kidney cells, mouse myeloma cells and the like.
  • CHO cells Chinese hamster ovary cells
  • baby hamster kidney cells baby hamster kidney cells
  • mouse myeloma cells and the like.
  • the cell C is an adherent cell
  • spinner culture by attaching it to a carrier such as a microcarrier and suspending it.
  • the cell C that can be used in the present embodiment not only cells derived from animals but also plant cells, photosynthetic bacteria, microalgae, cyanobacteria, insect cells, bacteria, yeast, fungi, algae, E. coli, yeast etc. Can be mentioned.
  • any cells can be used as long as they can produce the target substance OS, and the present invention is not limited to those described above.
  • a physiologically active substance for example, a physiologically active substance is mentioned, and in particular, an antibody is mentioned.
  • Antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and immunoglobulins.
  • physiologically active substances are not limited to antibodies, and tissue-type plasminogen activator used as a thrombolytic agent, biopharmaceuticals such as erythropoietin and interferon, and other industrially useful proteins are also targeted, and ⁇ -carotene and Also included are carotenoids such as astaxanthin, and proteins bound with pigments such as chlorophyll and bacteriochlorophyll.
  • the target substance OS for example, phycobilin proteins such as phycocyanin used for coloring of food, cosmetics and the like can also be mentioned.
  • the medium used for the culture is not particularly limited, and any conventional medium can be used as long as it is effective for the growth of the cells C to be cultured and the production of the target substance OS.
  • the target substance OS may be a secondary metabolite such as an antibiotic in addition to the protein, and is not particularly limited as long as it is produced by metabolism in the cell C.
  • Cell C is often genetically modified to enhance the productivity of the target substance OS.
  • the natural cell line in the present embodiment means a cell line which has not been genetically modified to introduce a gene for producing the target substance, and specifically, it is isolated from the natural world or a living body by the limiting dilution method Cell lines that have been cloned).
  • the metabolic reaction rate is controlled by increasing or decreasing an enzyme protein or the like involved in the metabolic reaction.
  • genetic recombination for example, as shown in FIG. 3A, the cell C 0 that do not produce a target substance OS, genes (e.g., the enzyme protein according to the metabolic pathway MP to produce a target substance OS from other cells Introduce the gene).
  • genes e.g., the enzyme protein according to the metabolic pathway MP to produce a target substance OS from other cells Introduce the gene.
  • FIG. 3B in the cell C capable of producing the target substance OS produced by genetic recombination, the intracellular metabolism is modified by the introduced gene, and from the nutrient component NC to the target substance Be able to produce OS.
  • FIG. 3C for example, as shown in FIG. 3C, gene recombination related to the inefficient metabolic pathway is deleted from the cell C 1 capable of producing the target substance OS as shown in FIG. Or introduce genes that produce substances that inhibit such metabolic pathways.
  • FIG. 3D since the inefficient metabolic pathway is inhibited, it is possible to create a cell C with an increased ability to produce the target substance OS from the nutrient component NC.
  • the arrow is displayed thick in FIG. 3D. This shows that productivity is increasing.
  • "x" is attached to the metabolic pathway. This indicates that the metabolic pathway is inhibited.
  • FIG. 3D there is one in which a circle is displayed by a broken line. This indicates that the production of the by-product BP being produced was inhibited, and was not produced, or the production amount was reduced.
  • each metabolic reaction rate in cells in culture is also changed by culture environment factors such as temperature, pH, dissolved oxygen, dissolved carbon dioxide, air bubbles due to in-liquid aeration, shear stress due to stirring, and the like. This is because the activity of the enzyme protein or coenzyme expressed in the cell C is affected by the factors of the culture environment.
  • the cell line required for the production of the target substance OS requires the following two characteristics.
  • An appropriate metabolic pathway (a metabolic pathway without excess or deficiency) capable of producing the target substance OS exists.
  • the activity of an enzyme protein that promotes a reaction in each metabolic pathway or an inhibitor that inhibits a reaction is optimized throughout the metabolic pathway.
  • the above (1) can be performed by genetic recombination or genome editing as described above, and the (2) can be performed by optimization of culture conditions.
  • genome editing refers to a technique of modifying (cutting and editing) any gene on the genome.
  • FIG. 4 shows a part of the metabolic pathway of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells.
  • CHO cells are one of the cells frequently used in antibody drug production.
  • the target substance OS is produced according to the metabolic pathway as shown in FIG.
  • the metabolic reaction rate of the metabolic pathway from the nutrient component NC serving as the raw material to the target substance OS is high, and the metabolic reaction rate of the branched metabolic pathway (byproduct BP) is It is desirable to be low.
  • reaction No. 1 in the metabolic pathway of CHO cells shown in FIG. (Eg, R1 etc.) and metabolic reaction formulas are shown.
  • “ ” indicates that the enzyme protein is metabolized reversibly or irreversibly mainly.
  • Reaction No. shown in FIG. And metabolic reaction formula> Reaction No.
  • Gluc Glucose G6P: Glucose-6-phosphate (glucose 6-phosphate)
  • F6P Fructose -6-phosphate (fructose -6-phosphate)
  • DHAP Dihydroxyacetone phosphate (dihydroxyacetone phosphate)
  • GAP Glyceraldehyde-3-phosphate (glyceraldehyde-3-phosphate)
  • 3PG 3-phosphoglycerate (3-phosphoglycerate) Pyr: Pyruvate Lac: Lactic acid
  • P5P Pyridoxyl-5-phosphate (pyridoxyl-5-phosphate)
  • X5P Xylulose-5-phosphate (xylulose-5-phosphate)
  • R5P Ribose-5-phosphate (ribose-5-phosphate)
  • EC2 2 enzyme-bound carbons CO
  • the metabolic reaction formulas for the metabolic pathway shown in FIG. 4 are the culture conditions (culture environment factors: temperature (Tem), pH, dissolved oxygen (DO), dissolved carbon dioxide, bubbles due to in-liquid aeration, shear stress due to agitation, etc.) to be influenced. Therefore, it is necessary to know which culture environmental factor affects each metabolic reaction rate.
  • the influence of culture conditions can reflect published documents and findings such as articles, magazines, books, experimental data, and conditions obtained by experiments. That is, the above-mentioned reaction No. And, the metabolic reaction equation, and further, the findings published so far can be expressed by correlation, and from the correlation, each metabolic reaction rate can be expressed by a function of culture environment factor. An example of these is shown below.
  • each metabolic reaction rate can be expressed as a function by culture environment factor.
  • the metabolic reaction rate expressed as a function of culture environmental factors is, for example, fR1 (pH, DO, Tem %) fR2 (pH, DO, Tem %) fR3 (pH, DO, Tem %) ⁇ ⁇ ⁇ fR53 (pH, DO, Tem %) And so on.
  • the culture is performed multiple times by changing the setting as described later.
  • the culture environment factors such as pH, DO, Tem...
  • the functions fR1... FR53 apply to the same conditions each time.
  • the nutrient substrate consumption rate and the production rate of the target substance under the set culture conditions can be estimated from the balance between the metabolic reaction rate and the mass balance.
  • the correlation and the function differ from cell to cell, and there may be a case where information is lacking with the knowledge obtained so far.
  • the cells to be used are cultured under specific culture conditions, and metabolic analysis is performed. Then, the result of the culture experiment is compared with the correlation model, and if they do not match, the parameters of the correlation model are corrected so as to approach the result of the culture experiment. Then, using the correlation model after correction, culture conditions to be a target value (for example, a target metabolic reaction rate) are calculated. Then, the culture is performed under the culture conditions determined by calculation, and the metabolic reaction rate by the culture is compared with the reaction rate calculated by the previous calculation, and the parameters of the correlation model are corrected again if they do not match. By repeating this series of operations, the experimental metabolic reaction rate and the calculated metabolic reaction rate become consistent.
  • a target value for example, a target metabolic reaction rate
  • the accuracy of the correlation model when the experimental metabolic reaction rate matches the calculated metabolic reaction rate is high, and at the same time, becomes the optimal culture condition.
  • the term "coincidence" as used herein includes not only that the numerical values to be compared are the same, but also includes being within a range considered to be able to obtain the same effect.
  • the range in which the same effect is considered to be obtained may be, for example, the target value ⁇ 20%, more preferably the target value ⁇ 10%, but it is not limited to these and can be set arbitrarily.
  • the optimal culture conditions can be obtained more surely and steadily, and therefore, compared with the conventional method performed based on the rule of thumb, The number of culture experiments can be significantly reduced. Further, as described later, if a plurality of culture means 3 are provided (see culture tanks 37a to 37h in FIG. 9), it is possible to evaluate many culture conditions at once by the screening method according to the present embodiment. Therefore, in this case, optimal culture conditions can be screened in a shorter period of time as compared to the conventional case.
  • FIG. 5 is a schematic view showing an example of the screening device according to the present embodiment.
  • the screening apparatus 1 includes a target value setting unit 2, a culture unit 3, an analysis unit 4, an analysis value calculation unit 5, a culture condition calculation unit 61, and a screening unit 62. Further, the screening device 1 has a control means 7 and a metabolism database DB. Each means will be described below.
  • the target value setting means 2 is an apparatus for setting a target value regarding the metabolic reaction of cultured cells.
  • the target value setting means 2 includes input means and output means (both not shown).
  • the input means is a device for inputting a target value related to a target metabolic reaction for efficiently producing a target substance. Examples of the input means include a keyboard and a mouse for data input.
  • the input data is stored in a storage device such as a hard disk drive provided in the culture condition calculation means 61 in FIG.
  • the output unit is configured to display an input value or the like input by the input unit so as to be visible. Examples of the output unit include a monitor and a device (printer) that outputs to a paper medium.
  • the target value may be any value as far as it relates to the metabolic reaction of cultured cells, and is not particularly limited, and examples thereof include a metabolic pathway model for efficiently producing a target substance, and a metabolic reaction rate.
  • a metabolic pathway model a model constructed based on a biochemical pathway that has been elucidated and proposed can be applied.
  • metabolic pathways include glycolysis, gluconeogenesis, citric acid cycle, glyoxylate cycle, oxidative phosphorylation, pentose phosphate cycle, reductive pentose phosphate cycle, urea cycle, ⁇ oxidation, amino acid biosynthesis, nucleotide metabolism, These include, but are not limited to, glycogen synthesis, lipid biosynthesis, fatty acid biosynthesis, cholesterol biosynthesis, purine synthesis system, pyrimidine synthesis system, shikimic acid pathway and the like.
  • the culture means 3 is an apparatus (culture tank) for culturing cultured cells under set or changed culture conditions.
  • the culture means 3 performs a first culture step S20 and a second culture step S60 described later (see FIG. 12).
  • the changed culture conditions will be described later.
  • Batch culture is a culture method in which a new culture medium is prepared each time, a cell line is planted there, and the culture medium is not added until harvest.
  • the fed-batch culture is a culture method in which the medium itself or a specific component in the medium is added during the culture, and the product is not withdrawn until the end of the culture.
  • Continuous culture is a culture method in which the medium is supplied to the culture system continuously and at the same time the culture medium M is withdrawn in the same amount as the supplied medium.
  • temperature, pH, dissolved oxygen concentration (DO), dissolved carbon dioxide concentration (DCO 2 ), bubbles due to in-liquid aeration, shear stress due to stirring, etc. examples include, but are not limited to.
  • culture environment parameters include, but are not limited to.
  • the culture apparatus in each culture system will be described below.
  • FIG. 6 is a schematic view of a batch culture type culture apparatus.
  • the batch culture type culture apparatus 3A which is an example of the culture means 3 measures culture environment factors such as pH, DO, temperature and the like of the culture solution M by the on-line monitoring means 31.
  • the gas phase oxygen concentration adjusting means 32, the pH adjusting means 33, the dissolved oxygen concentration adjusting means 34, the stirring means 35 Control is performed by the control means 7 independently for each means such as the temperature control means 36. The operation in each step of the control flow to each target value by the control means 7 will be described below.
  • Measured values are obtained by measuring means (on-line monitoring means 31), such as pH, DO, temperature, etc., installed in the culture tank 37.
  • the control means 7 determines whether or not each measured value matches a preset control value. If they match, the process returns to (1). If they do not match, proceed to (3). (3) If it is determined in (2) that the control value does not match, the control means 7 transmits an operation signal to each of the means 32 to 36 so as to converge to the control value. , Change the amount of operation.
  • the control method for the means 32 to 36 is not particularly limited, and known methods such as an ON / OFF control method, a proportional control method, and a PID control method can be used. After changing the operation amount, return to (1).
  • (a) to (c) are used as the operation amounts of the means 32 to 36.
  • (C) Temperature If the temperature control means 36 is a water jacket etc., increase or decrease of feed water temperature, increase or decrease of cooling water supply rate, and if the temperature control means 36 is a heating electric heater, heating electric heater supply power Increase or decrease of the amount, increase or decrease of the steam supply amount for heating when the temperature control means 36 uses steam for heating.
  • the above (1) to (3) are repeatedly performed until an end command of the screening method is issued.
  • the repetition cycle is appropriately determined based on the characteristics of the cell C to be cultured and the dynamic characteristics of the culture means 3, but it is carried out generally in the range of 1 second to 10 minutes.
  • FIG. 7 is a schematic view of a fed-batch culture apparatus.
  • the fed-batch culture apparatus 3B which is an example of the culture means 3 has a configuration in which medium adding means 38 for adding fresh medium is added to the batch culture apparatus 3A described above.
  • the fed-batch culture apparatus 3B measures pH, DO, temperature and the like by the on-line monitoring means 31 in the same manner as the batch culture type culture apparatus 3A, and converges to predetermined control values based on the respective measurement values.
  • the control means 7 independently performs control on each of the means 32 to 36.
  • fresh medium is added to the culture solution M while controlling the flow rate and flow rate of the fresh medium from the addition medium tank (not shown) containing fresh medium to the culture tank 37 by pumping or pumping. Added.
  • the control means 7 sets and adjusts the flow rate and the flow rate.
  • FIG. 8 is a schematic view of a continuous culture type culture apparatus.
  • a continuous culture type culture apparatus 3C which is an example of the culture means 3 has, for example, a culture tank 37, a medium addition means 38, and a cell separation means 39.
  • the continuous culture type culturing apparatus 3C has a configuration in which the cell separation means 39 is added to the fed-batch culture type culturing apparatus 3B.
  • Cell culture means from the medium addition means 38 to the culture vessel 37 with the pipe T1 through the valve V, from the culture vessel 37 to the cell separation means 39 with the pipe T2, from the cell separation means 39 to the recovery container 40 with the pipe T3 39 is connected to the culture tank 37 by a pipe T4.
  • pumps P1 to P3 are installed at arbitrary positions of the pipes T1, T2 and T3.
  • the culture vessel 37 of the continuous culture type culture apparatus 3C is provided with a stirring means 35 for stirring the culture solution M.
  • the culture vessel 37 is provided with an air diffusion pipe 34a for aeration in the liquid, a temperature control means 36, and an online monitoring means 31 for measuring pH, DO, DCO 2 , temperature and the like.
  • the sensor of the on-line monitoring means 31 is separately provided for every measurement object.
  • the culture tank 37 is provided with piping for adding an alkaline solution in order to control pH and DO to set values. Also, although not shown in FIG.
  • the culture tank 37 controls alkali addition and gas aeration to maintain the culture environment within a predetermined setting range based on the value obtained by the sensor described above. It also has a device.
  • gas phase oxygen concentration adjusting means (not shown in FIG. 8)
  • pH adjusting means (shown in FIG. 8)
  • Control is performed independently by the control means 7 for each means such as the dissolved oxygen concentration adjustment means (not shown in FIG. 8), the stirring means 35, the temperature adjustment means 36, etc.
  • the culture environment can be easily kept constant, and the productivity can be stabilized.
  • the medium addition means 38 shown in FIG. 8 is an apparatus for adding a fresh liquid medium to the culture tank 37 in order to supplement the nutrient components NC in the liquid medium consumed by the cells C in the culture tank 37.
  • the medium addition means 38 has a tank (container) capable of temporarily storing fresh medium. Any vessel may be used as the vessel as long as it can temporarily store fresh culture medium.
  • the fresh medium can be appropriately selected and prepared according to the cells C to be cultured.
  • the cell separation means 39 illustrated in FIG. 8 is an apparatus for separating cultured cells, and a solution containing a target substance such as an antibody protein and waste products from the culture solution M in the culture vessel 37.
  • the cell separation means 39 returns the cultured cells to the culture tank 37 through the pipe T4, and transfers the product and the waste to the collection container 40 through the pipe T3.
  • a gravity sedimentation method, a centrifugal separation method, an ultrasonic agglutination method, a filtration separation method and the like can be mentioned, and any method may be used in this embodiment.
  • the recovery container 40 illustrated in FIG. 8 is a tank for temporarily storing the products and wastes separated by the cell separation means 39.
  • any tank (container) capable of temporarily storing products and waste products can be used.
  • FIG. 9 is a schematic view showing a screening apparatus provided with a plurality of culture vessels.
  • the screening apparatus 1A shown in FIG. 9 includes culture vessels 37a to 37h having a volume of, for example, 100 mL as the culture means 3.
  • the screening apparatus 1A is provided with medium addition means, cell separation means, collection containers and the like individually connected to the culture vessels 37a to 37h.
  • the culture vessels 37a to 37h shown in FIG. 9 have the culture means 3 configured as shown in any of FIG. 6, FIG. 7 and FIG. Therefore, each of the culture vessels 37a to 37h can use stirring rotation speed, temperature, pH, DO, DCO 2 and the like as culture control parameters, and these can be measured and controlled.
  • the culture vessels 37a to 37h each have a circulation control rate from the culture vessels 37a to 37h to the culture vessels 37a to 37h as culture control parameters, and a liquid transfer from the cell separation means to the collection container The rate, the addition rate at which fresh medium is added to the culture vessels 37a to 37h from the medium addition means, the medium composition of the medium, and the like can be mentioned, and these can be measured and controlled.
  • the culture vessels 37a to 37h can use these culture control parameters as screening targets for culture conditions.
  • screening apparatus 1A shown in FIG. 9 not only can culture cell lines of one line in each of eight culture vessels 37a to 37h, but also changes control values of culture conditions of the cell lines of one line to It can be cultured under the culture conditions of
  • the analysis means 4 shown in FIG. 5 is an apparatus for analyzing the culture solution M containing the cultured cells cultured by the culture means 3.
  • the analysis by the analysis means 4 is performed to obtain data (analysis result) necessary for performing the metabolic analysis by the analysis value calculation means 5 described later.
  • analysis by the analysis means 4 is performed to confirm whether or not the cell state is stable.
  • the analysis means 4 aseptically samples the culture solution M containing the cells cultured by the culture means 3 in performing the analysis.
  • Sterile sampling of the culture solution M can be performed by the sampling means 41 shown in FIG. 5 to FIG.
  • the sampling means 41 can be performed by suctioning with a pump P2 (see FIG. 8) or the like such as a peristaltic pump through a sampling port 41a provided in the culture tank 37. it can.
  • a pump P2 see FIG. 8
  • the pretreatment means 42 to be described later, and various pipes connecting them are materials having pressure resistance and heat resistance such as pressure glass and stainless steel, the inside of these is steam sterilized before and after sampling (121 C., for more than 20 minutes).
  • a sterile connection connector may be used as the port 41a, and piping for sampling may be connected for each sample.
  • the transfer of the culture solution M from the culture tank 37 to the pretreatment means 42 can be performed by a pump P2 (see FIG. 8) such as a peristaltic pump or pumping.
  • the pretreatment means 42 shown in FIG. 5 is an apparatus for performing pretreatment suitable for various analysis methods performed by the analysis means 4 in analyzing the components of the culture solution M and the state of cultured cells by the analysis means 4.
  • the pretreatment means 42 differs in the pretreatment method according to the target cell and analysis method.
  • An example (flow chart) of the pre-processing performed by the pre-processing means 42 is shown in FIGS. 10A to 10D.
  • FIG. 10A shows an example of pretreatment that is carried out before obtaining yeast cell extract and performing analysis.
  • sampling is performed from the culture solution M (step S1011).
  • step S1012 For sampling, for example, 5 mg of dry biomass is collected.
  • quenching is performed (step S1012). Quenching is performed, for example, by injecting the sampled substance into methanol at -50 ° C. (eg, 60% methanol, pH 7.5 in 10 mM HEPES (4- (2-HydroxyEthyl) -1-piperazineEthaneSulfonic acid)).
  • cells are collected (step S1013).
  • step S1014 Metabolite extraction is performed, for example, by incubating in 2 mL of boiling water (100 ° C.) for 15 minutes.
  • step S1015 The removal of solids is performed, for example, by centrifugation at 10000 ⁇ g for 5 minutes.
  • step S1016 lyophilization is performed, for example, for 8 hours.
  • step S1017 derivatization is performed.
  • step S1018 N, N-dimethylformamide (DMF) (0.1% pyridine) and 50 ⁇ L of N- (tert-butyldimethylsilyl) -N-methyl-trifluoroacetamide (MBDSTFA) Contact at 80 ° C. for 30 minutes.
  • step S1018 The removal of solids is performed, for example, by centrifugation at 10000 ⁇ g for 5 minutes.
  • analysis is performed (step S1019). The analysis is performed using, for example, a gas chromatograph mass spectrometer or the like, but can be performed by any method depending on the object of analysis.
  • FIG. 10B shows an example of pretreatment that is performed before obtaining a bacterial cell extract and performing analysis.
  • sampling is performed from the culture solution M (step S1021).
  • rapid filtration is performed (step S1022). Rapid filtration is performed, for example, by washing twice with a nitrocellulose membrane filter (pore size 0.2 ⁇ m).
  • extraction of metabolites step S1023), removal of solids (step S1024), lyophilization (step S1025), derivatization (step S1026), removal of solids (step S1027), analysis (step S1028) are sequentially performed.
  • the extraction of metabolites (step S1023) to the analysis (step S1028) can be performed in the same manner as the extraction of metabolites (step S1014) to the analysis (step S1019) described with reference to FIG. 10A.
  • FIG. 10C shows an example of the pretreatment carried out from the culture supernatant of culture fluid M to analysis.
  • sampling is performed from the culture solution M (step S1031).
  • 50 ⁇ L of culture solution is collected.
  • the culture solution M is recovered (step S1032).
  • the collection of the culture solution M is performed, for example, by centrifugation at 10000 ⁇ g for 5 minutes.
  • lyophilization step S1033), derivatization (step S1034), removal of solids (step S1035), and analysis (step S1036) are sequentially performed.
  • the lyophilization (step S1033) to the analysis (step S1036) can be performed in the same manner as the lyophilization (step S1016) to the analysis (step S1019) described with reference to FIG. 10A.
  • FIG. 10D shows an example of pretreatment that is carried out until biomass (protein) hydrolyzate is obtained and analyzed.
  • sampling is performed from the culture solution M (step S1041). For sampling, for example, 1 mg of dry biomass is collected.
  • cells are collected (step S1042).
  • Cell recovery is performed, for example, by centrifugation at 10000 ⁇ g for 5 minutes.
  • the cells are washed (step S1043).
  • the cells are washed, for example, by centrifuging twice with distilled water at 10000 ⁇ g for 5 minutes.
  • the cells are hydrolyzed (step S1044).
  • Hydrolysis of cells is carried out, for example, by placing the pellet (pellet) obtained by centrifugation and 50 ⁇ L of a 6 M HCl solution in a tube and treating at 105 ° C. for 24 hours.
  • a neutralization reaction is performed (step S1045).
  • the neutralization reaction is performed, for example, using a 6 M NaOH solution.
  • filtration is performed (step S1046). The filtration is performed, for example, by centrifugation at 10000 ⁇ g for 5 minutes using a centrifugal ultrafiltration filter with a pore size of 0.2 ⁇ m.
  • lyophilization step S1047), derivatization (step S1048), removal of solids (step S1049), and analysis (step S1050) are sequentially performed.
  • the lyophilization (step S1047) to the analysis (step S1050) can be performed in the same manner as the lyophilization (step S1016) to the analysis (step S1019) described with reference to FIG. 10A.
  • the processes of mixing of reagents, incubation by temperature control, centrifugation, and drying are fundamental.
  • the necessary devices are a mixer, a temperature controller, a centrifuge, a dryer, and a combination of processes using these devices.
  • the above process can be performed by a procedure, it is preferable to perform the process by each device and the transfer of the sample between the devices by automation using a robot or the like. In this way, the certainty of the pre-processing can be improved, and the shortening of time and labor saving can be achieved.
  • the culture medium M is prepared from culture medium M at an appropriate timing.
  • the analysis means 4 reflects the state of the analyzed cell, for example, information such as product production rate, nutrient substrate consumption rate, by-product secretion rate such as waste products, cell growth rate, intracellular metabolic reaction rate, etc. Is analyzed by an appropriate method, and the obtained analysis value is transmitted to the analysis value calculation means 5.
  • the analysis method regarding these analysis targets that can be analyzed by the analysis means 4 is, for example, as follows.
  • the concentration of the product in the culture means 3 is analyzed.
  • the protein concentration can be analyzed as follows.
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • the concentration of the protein to be measured is calculated from the fluorescence or enzyme activity of the bound antibody using an antibody that exhibits an antigen-antibody reaction with the protein to be measured.
  • ELISA methods include direct methods, indirect methods, sandwich methods, competitive methods and the like, and any method may be used.
  • the product production rate can be determined by measuring the change over time of the concentration of protein in culture and converting it to the amount produced per unit time and per unit number of cells.
  • a nutrient substrate means what is required for the growth of a cell, or production of a product among culture medium components, for example, an inorganic component, a carbon source, vitamins, amino acids etc. are mentioned.
  • by-products are those produced as by-products in the process of cell growth and production of products, and examples include carbon dioxide, lactic acid, ammonia, pyruvic acid, citric acid and the like.
  • nutrient substrate concentration and by-product concentration for example, high performance liquid chromatograph (HPLC), liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS), liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS-MS),
  • HPLC high performance liquid chromatograph
  • LC / MS liquid chromatograph mass spectrometer
  • LC / MS-MS liquid chromatograph-tandem mass spectrometer
  • GC / MS gas chromatograph mass spectrometer
  • GC / MS-MS gas chromatograph-tandem mass spectrometer
  • Any of these analysis methods can measure multiple components in the culture solution M at one time.
  • the nutrient substrate consumption rate and by-product secretion rate can be determined by measuring the time-dependent changes in nutrient substrate concentration and by-product concentration in culture and converting them into consumption and production per unit time, respectively.
  • the number of cells in the culture means 3 is analyzed. Measurement of the number of cells can be performed by trypan blue staining and microscopic observation using a hemocytometer. The cell number can also be measured using other methods such as dry cell weight method, turbidity method, capacitance method, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) measurement, flow cytometry method and the like.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • the specific growth rate can be determined using Equation 1.
  • the culture medium M growing logarithmically is sampled over time, and more data are obtained.
  • the specific growth rate may be estimated based on that. For example, the culture time is plotted on a scatter plot with the abscissa representing the logarithmic value of the number of living cells as the ordinate, and the slope thereof calculated by the least squares method. If this graph can not be obtained as a straight line, it means that the cells of interest are not growing exponentially, and that some restriction factor is present during the culture period.
  • the analysis of the metabolic reaction rate may be carried out by analyzing the sample treated by the pretreatment means 42 by GC / MS, LC / MS, nuclear magnetic resonance (NMR) equipment, etc. Analyze body proportions.
  • cell culture is performed using an isotope-labeled substrate in the first culture step S20 (see FIG. 12) as described later. Is preferred.
  • the intracellular metabolic reaction rate can be determined by measuring the time-dependent change in the isotope ratio of the intermediate metabolite in cells in culture and converting it to the isotope ratio of the intermediate metabolite per unit time.
  • Analysis target VI cell respiration rate
  • the analysis of cell respiration rate can be performed by measuring the oxygen consumption rate over time using a phosphorescent probe that is quenched by oxygen (eg, MitoXpress, etc.).
  • the analysis results obtained for the analysis targets I to VI described above are sent to the analysis value calculation means 5 and used as input values.
  • the analysis value calculation means 5 shown in FIG. 5 is a device that performs a metabolic analysis based on the analysis result obtained by the analysis means 4 and calculates an analysis value. That is, the analysis value calculation means 5 is a device for calculating the metabolic rate in the cell C.
  • Methods of metabolic analysis include a method using an isotope-labeled substrate and a method not using an isotope-labeled substrate, and any method can be employed in this embodiment.
  • an isotope-labeled substrate e.g., 13 C metabolic flux analysis method
  • 13 C-metabolic flux analysis 13 C-MFA 13 C-metabolic flux analysis 13 C-MFA
  • FBA flux balance analysis
  • the FBA can measure the time-dependent changes in metabolite concentration in cells in culture, and can determine metabolic reaction rates that can not be measured from metabolite rates and mass balances.
  • the analysis value calculation means 5 the analysis method of the metabolic flux which performs a metabolic analysis using an isotope label substrate is demonstrated below.
  • FIG. 11 is an explanatory view showing the concept of a method of analyzing metabolic flux.
  • random metabolic flux values (metabolic reaction initial values (random numbers)) (R1 to R8 in FIG. 11) are given, and based on the metabolic pathway model, intracellular C in steady state is obtained.
  • the ratio of the number of isotopic carbons contained in each metabolite A, B, C, X, Y, Z of This calculated value is compared with the isotope carbon number ratio of the metabolites A, B, C, X, Y, and Z in the cell C analyzed (measured) by the analysis means 4.
  • the value of isotope number carbon ratio in the metabolite by simulation is the isotope carbon number ratio in the metabolite by experiment Correct the metabolic flux value by simulation so that the mean square error with the value of is minimized. This correction can be performed, for example, by applying the QP (Quadratic Programming) subproblem method.
  • the QP subproblem method is based on the isotope carbon number ratio of the specific metabolites A, B, C, X, Y, Z generated and the specific metabolites A, B, C, X, Y, Z by simulation. If there is a statistically significant difference between the isotope and the carbon number ratio, the metabolism previously obtained by simulation is performed so that the mean square error between the two falls within a predetermined range set in advance and becomes minimum. Among the values of the metabolic fluxes in the pathways R1 to R8, the values of the metabolic fluxes in the metabolic pathways R1 to R8 related to the error are corrected.
  • the isotope carbon ratio is calculated with the corrected metabolic flux, and isotope carbon in the experimental metabolite is eliminated until there is no statistically significant difference in isotope ratio distribution. Repeat the operation of comparing the value of the number ratio. If the simulation results are in agreement, the result determines the metabolic rate (metabolic flux).
  • the discriminant index of the steady state is a combination of any one or more of nutrient substrate consumption rate of cultured cells, by-product secretion rate of cultured cells, and cell respiration rate of cultured cells. Is preferred. In this way, it can be easily and reliably determined whether or not the cultured cells are in a steady state. It is preferable to determine whether the cultured cell is in a steady state based on the analysis result obtained by the analysis value calculation means 5 by the analysis means 4. As shown in FIG.
  • the analysis value calculation means 5 has a determination means 51 for performing such a determination, and after confirming that the cultured cell is in a steady state by the determination means 51, the analysis value is obtained. It is preferable to calculate the In this way, because it is possible to avoid the metabolic analysis performed on cultured cells that are not in a steady state, it is possible to save labor. The determination of the steady state will be described later.
  • the metabolism database DB shown in FIG. 5 is a device that collects the correlation between culture environmental factors such as DO, Tem, pH and the like and respective metabolic rate equations.
  • the metabolism database DB provides a correlation model stored in advance to the culture condition calculation means 61 when the culture condition calculation means 61 described later calculates the optimum culture condition.
  • the metabolic reaction example and the correlation model will be described with reference to FIG. 11 as follows.
  • A, B, C, and Z are metabolites
  • f is a reaction rate
  • pH, DO, and Tem are culture environment factors
  • DO is the dissolved oxygen concentration
  • Tem is the temperature.
  • Metabolic reaction No. R3 A ⁇ B Metabolic reaction No. R5: B ⁇ C Metabolic reaction No. R7: C ⁇ Z ⁇ ⁇ ⁇
  • Metabolic reaction rate formula R3 f A ⁇ B ⁇ pH, DO Metabolic reaction rate formula R5: f B ⁇ C ⁇ Tem Metabolic reaction rate formula R7: f C ⁇ Z ⁇ DO, Tem ⁇ ⁇ ⁇
  • the correlation model is configured using a metabolic reaction rate equation in which culture conditions are used as parameters.
  • a metabolic reaction rate the metabolic reaction formula in the above-mentioned ⁇ Reaction No. and metabolic reaction formula shown in FIG. 4> can be mentioned.
  • reaction rate in each metabolic reaction formula can be calculated
  • culture environmental factors include DO, DCO 2 , pH, temperature (Tem), shear stress, nutrient substrate concentration, metabolite concentration, osmotic pressure and the like.
  • the metabolic reaction rate and the culture environment factor are not limited to these.
  • the correlation model stored in the metabolism database DB is the metabolic reaction when papers, magazines, books, experimental data, etc. are newly published, or culture results in screening (eg, the analysis values described above) are obtained. It is possible to make repeated corrections by performing database creation in the form as shown in the example of and the example of the correlation.
  • the repetitive correction of this correlation model can be performed before the culture condition calculation means 61 described later is performed.
  • the repetitive correction of the correlation model can be performed, for example, by the correlation model correction means 60 of the culture condition simulator 6 shown in FIG.
  • the correlation model correction means 60 is one function of the culture condition simulator 6.
  • the correlation model correction means 60 compares the analysis value with the correlation model stored in the metabolism database DB, performs correction calculation as necessary, and corrects the correlation model as described above. Examples of the analysis value include the metabolic reaction formulas R3, R5, R7, etc. in the above [Example of correlation model].
  • the correction of the correlation model is performed, for example, when the correlation model stored in the metabolism database DB exceeds ⁇ 10% with respect to the culture result (specifically, the correlation model calculated from the culture result). Is preferred.
  • the culture condition calculation means 61 shown in FIG. 5 calculates the culture condition (optimum culture condition) which is closest to the target value from the analysis value using the correlation model which is set in advance or corrected by the correlation model correction means 60.
  • the culture conditions set in the culture means 3 are changed to the calculated culture conditions (optimum culture conditions).
  • the culture condition calculation means 61 is one function of the culture condition simulator 6.
  • the culture condition calculation means 61 applies a specific culture condition, that is, a specific culture environment factor, to the correlation model, for example, in order to approximate the target value related to the metabolic reaction of cultured cells set by the target value setting means 2 Set up an intracellular metabolic reaction model.
  • the culture condition calculation means 61 calculates culture conditions under which the intracellular metabolic reaction model is closest to the target value.
  • the specific culture condition is a constant value or a variable value set for the culture environmental factor described above, and can be determined based on the data stored in the metabolism database DB described above.
  • an integrated value of the value calculated by the metabolic reaction formula possessed by the correlation model can be mentioned, but it is not limited thereto.
  • the changed culture conditions are sent to the culture means 3, and the culture conditions set are changed to this. When the culture conditions are changed, the culture means 3 performs the next cell culture under the changed culture conditions.
  • the screening means 62 shown in FIG. 5 is an apparatus for screening a cell line and culture conditions that are closest to the target value among the analysis values obtained by performing a plurality of cultured cells and culture conditions.
  • the screening means 62 is one function which the culture condition simulator 6 has.
  • the screening unit 62 includes, for example, a selection unit 63 and a selection unit 64.
  • the selection means 63 is a means for selecting an optimal culture condition from among the analysis values obtained by carrying out the process under a plurality of culture cells and culture conditions.
  • the sorting means 64 is a means for sorting the cell line for cell culture by evaluating the metabolic reaction rate in the cells cultured under the optimal culture conditions and the amount of the target substance produced.
  • the screening means 62 selects the optimal culture conditions by the selection means 63 and selects the cell lines by the selection means 64, and the analysis values obtained by performing on a plurality of cultured cells and culture conditions as described above. Among them, cell lines and culture conditions that are closest to the target value can be screened.
  • the control means 7 shown in FIG. 5 is a general-purpose computer or a personal computer provided with a CPU and a storage medium such as a hard disk drive.
  • the control means 7 stores a predetermined program in the storage medium, and causes the control means 7 to function as the predetermined means by reading the program.
  • the control means 7 receives the values of various parameters of the culture conditions (optimum culture conditions) sent from the culture condition calculation means 61 and controls the operation of the culture means 3. For example, in the case of raising the temperature, heat is applied to the temperature control means 36 provided in the culture means 3, and in the case of lowering the temperature, the target temperature is adjusted by driving a water-cooling device.
  • an alkaline solution is added into the culture means 3, and in the case of lowering the pH, an acidic solution is added into the culture means 3.
  • the culture solution M in the culture means 3 is aerated with air or pure oxygen, and when the dissolved oxygen concentration is lowered, the culture solution M in the culture means 3 is aerated with nitrogen.
  • the shear stress is increased, the rotation speed of the stirring blade of the stirring means 35 is increased, and when the shear stress is decreased, the rotation speed of the stirring blade of the stirring means 35 is decreased.
  • the other parameters are also controlled in a manner appropriate to control of each parameter.
  • FIG. 12 is a flowchart for explaining the contents of the screening method according to the present embodiment.
  • the screening method includes a target value setting step S10, a first culture step S20, an analysis step S30, an analysis value calculation step S40, a culture condition calculation step S50, and a second culture step S60. And screening step S70.
  • the target value setting step S10 is a step of setting a target value regarding the metabolic reaction of the cultured cells.
  • the target value setting step S10 can be performed by the target value setting means 2 described above.
  • the first culture step S20 is a step of culturing the cultured cells under preset culture conditions. This first culture step S20 can be performed by the culture means 3 described above.
  • the analysis step S30 is a step of analyzing the culture solution containing the cultured cells cultured in the first culture step S10.
  • the analysis performed in the analysis step S30 is performed to obtain, for example, analysis values regarding indexes such as the product production rate, the concentration of the product, and the medium components, in order to determine whether or not the cultured cells are in a steady state.
  • This analysis step S30 can be performed by the analysis means 4 described above.
  • the analysis value calculation step S40 is a step of performing metabolism analysis based on the analysis result obtained in the analysis step S30 to calculate an analysis value.
  • the analysis value calculation step S40 can be performed by the analysis value calculation means 5 described above.
  • a determination step S41 for determining whether or not the cultured cell is in a steady state based on the analysis result obtained in the analysis step S30 see FIG. 12). (Not shown) (see FIG. 13).
  • analysis value calculation process S40 performs the said metabolic analysis, after a cultured cell will be in a steady state. In this way, because it is possible to avoid the metabolic analysis performed on cultured cells that are not in a steady state, it is possible to save labor.
  • the determination step S41 can be performed by the determination means 51 shown in FIG.
  • the steady state discrimination index in the analysis value calculation step S40 (specifically, the discrimination step S41) is the nutrient substrate consumption rate of cultured cells, the by-product secretion rate of cultured cells, and the cell respiration rate of cultured cells. It is preferable that any one or two or more of them are combined. In this way, it can be easily and accurately determined whether or not the cultured cells are in a steady state.
  • the culture condition which is closest to the target value is calculated from the analysis value using the correlation model, and the culture condition set in the first culture step S20 is changed to the culture condition calculated.
  • This culture condition calculation step S50 can be performed by the culture condition calculation means 61 described above.
  • a correlation model correction step S51 (not shown in FIG. 12, see FIG. 13) may be included as a pre-process of the culture condition calculation step S50.
  • the correlation model correction step S51 is a step of correcting the correlation model stored in the metabolism database DB based on the culture result in the screening, for example, the analysis value obtained in the analysis value calculation step S40.
  • the correlation model correction step S51 can be performed by the correlation model correction means 60 shown in FIG.
  • the second culture step S60 is a step of culturing the culture cells of the same cell line as the culture cells under the culture conditions changed in the culture condition calculation step S50, and sending the obtained culture solution M to the analysis step S30.
  • This second culture step S60 can be performed by the above-described culture means 3 as in the first culture step S20. That is, in the first culture step S20 and the second culture step S60, the cultured cells are cultured under the preset culture conditions or the cultured cells are cultured under the culture conditions changed in the culture condition calculation step S50. The contents of the process are substantially the same.
  • the analysis step S30 to the second culture step S60 are performed on a plurality of culture cells and culture conditions.
  • the screening step S70 is a step of screening a cell line and culture conditions closest to the target value among the analysis values obtained by performing. This screening step S70 can be performed by the screening means 62 described above.
  • FIG. 13 is a flowchart for explaining the contents of one more detailed aspect of the screening method according to the present embodiment.
  • the screening method includes a target value setting step S10, a first culture step S20, a sampling step S31, a pretreatment step S32, an analysis step S30, a determination step S41, and an analysis value calculation step.
  • S40, correlation model correction step S51, culture condition calculation step S50, second culture step S60, selection step S71, and selection step S72 are included.
  • the sampling step S31 to the second culture step S60 are performed under a plurality of culture cells and culture conditions.
  • the target value setting step S10, the first culture step S20, the analysis step S30, the analysis value calculation step S40, the culture condition calculation step S50 and the second culture step S60 are the same as the respective steps described above. Since there is, reference is made to the above explanation, and the explanation here is omitted.
  • the sampling step S31 is a step of aseptically sampling the culture solution M. This sampling step S31 is performed by the above-mentioned sampling means 41.
  • the pretreatment step S32 is a step of subjecting the sampled culture fluid M to pretreatment necessary for analysis. This pretreatment step S32 is performed by the above-mentioned pretreatment means 42.
  • Discrimination process S41 is a process of discriminating whether or not the cultured cells are in a steady state from the analysis value obtained in analysis process S30. As a result of the discrimination in the discrimination step S41, when the cultured cell is not in the steady state, the culture is carried out as it is (return to the first culture step S20). When the cultured cells are in the steady state as a result of the discrimination in the discrimination step S41, the process proceeds to the analysis value calculation step S40. As described above, the determination step S41 is performed by the determination unit 51 (see FIG. 5) of the analysis value calculation unit 5.
  • the correlation model correction step S51 is a step of correcting the correlation model with a culture result in screening. That is, the correlation model correction step S51 is a step of correcting the correlation model stored in the metabolism database DB based on the analysis value obtained in the analysis value calculation step S40, for example. As described above, the correlation model correction step S51 is performed by the correlation model correction means 60 (see FIG. 5) of the culture condition simulator 6. The correlation model correction step S51 changes the culture conditions each time screening is performed, that is, each time the second culture step S60, the analysis step S30, the analysis value calculation step S40, and the culture condition calculation step S50 is performed, the screening method The correlation model can be iteratively corrected until complete.
  • the selection step S71 and the selection step S72 are steps performed in the above-described screening step S70.
  • the selection step S71 is a step of selecting an optimal culture condition from among the analysis values obtained by carrying out a plurality of cultured cells and culture conditions. In the selection step S71, for example, it is preferable to select the optimal culture conditions based on the analysis result of at least one of the above-mentioned cell growth rate, cell cycle and metabolic flux.
  • the selection step S71 is performed by the selection means 63 described above.
  • the sorting step S72 is a step of sorting the cell line for cell culture by evaluating the metabolic reaction rate in the cells cultured under the optimal culture conditions, the production amount of the target substance, and the like.
  • the sorting step S72 is performed by the sorting means 64 described above.
  • FIG. 14 is a flowchart for explaining the contents of a further detailed aspect of the screening method according to the present embodiment.
  • the screening method first sets a metabolic pathway model and a target metabolic reaction rate (step S1401).
  • This step S1401 is performed in the target value setting step S10.
  • first culture conditions are set in the culture means 3 (culture condition setting, step S1402), and culture is started (step S1403).
  • the setting of the first culture conditions can be made into the standard conditions currently preset. Standard conditions can be set arbitrarily.
  • sampling is performed on a regular basis (step S1404).
  • the above-described steps S1402 and S1403 are performed in the first culture step S20, and the step S1404 is performed in the analysis step S30 (specifically, the sampling step S31).
  • step S1405 the concentration of the product, the medium component and the like are analyzed. Specifically, one or more of a product production rate, a nutrient substrate consumption rate, a by-product secretion rate, and the like reflecting the state of cells are analyzed in addition to the concentration of the product and the medium components.
  • This step S1405 is performed in the analysis step S30 after performing the above-described pre-processing step S32 as necessary.
  • the analysis value in step S1405 does not change with time and becomes a constant value, it is determined as the steady state ("steady" in step S1406).
  • steady state steady state
  • step S1406 the non-stationary period is analyzed in step S1407, and when the period exceeds a predetermined value, for example, when a steady state can not be obtained even after the set sampling frequency or culture time has elapsed, an alert is displayed. (Step S1408). Then, the non-stationary period is analyzed, and if the period is equal to or less than the predetermined value, the process returns to step S1403 to continue the culture.
  • the aforementioned step S1405 is performed in the analysis step S30 (and the pretreatment step S32), and the step S1406 is performed in the determination step S41.
  • step S1406 When the cultured cells are in a steady state ("steady" in step S1406), metabolic analysis such as product production rate, cell growth rate, metabolic flux, etc. is performed to obtain an analysis value (step S1409).
  • step S1409 it is preferable to determine the metabolic reaction rate (metabolic flux) by performing simulation by the QP partial problem method as needed.
  • the optimal value of the metabolic reaction rate is compared (step S1410).
  • the target value for example, target metabolic reaction rate etc.
  • step S1410 If the analysis value obtained in the metabolic analysis does not match the optimum value obtained in the N-1th calculation (“mismatched” in step S1410), the correlation model between the culture environment factor and the metabolic reaction rate, etc.
  • the correlation model is corrected to match the analyzed metabolic reaction rate (step S1411).
  • step S1412 the culture condition closest to the target value set in step S1401 is determined (step S1412).
  • step S1403 the culture conditions set previously are changed to the determined culture conditions
  • step S1410 when the analysis value obtained by the metabolic analysis and the optimum value obtained by the N-1th calculation coincide ("coincidence" in step S1410), the correlation model between the culture environment factor and the metabolic reaction rate is highly accurate.
  • the culture conditions at this time are optimized to be close to the set target value. If there are other candidate cell lines, finally the cell line and culture conditions closest to the target value (the best in productivity) are compared with the results of performing the same treatment as above with other candidate cell lines. Selection and selection (step S1413), and the screening is completed.
  • steps S1409 to S1410 are performed in the culture condition calculating step S50.
  • Steps S1411 and S1412 are performed in the correlation model correction step S51.
  • Culture after step S1412 and step S1402 (step S1403) is performed in the second culture step S60.
  • Step S1413 is performed in screening process S70 (specifically, selection process S71 and sorting process S72).
  • step S1409 instead of metabolic analysis using an isotope-labeled substrate, a method of estimating metabolic flux based on a metabolite in culture fluid M may be used. Absent. Alternatively, a method of estimating metabolic flux by measuring mRNA may be used. In such a case, since isotopes are not used, operations and disposal of the culture solution can be simplified and can be performed at low cost.
  • the analysis value calculation means 5, the culture condition simulator 6 and the control means 7 are illustrated as separate devices, but one device (computer) storing a program for realizing these means can do.
  • cell lines and culture conditions close to a target value can be conveniently screened.
  • a target value for example, metabolic reaction rate etc.
  • the relationship between culture environment factors and target values such as metabolic reaction rate can be formulated (modeled) in the process of screening.
  • the screening method for cell lines and culture conditions according to the present embodiment and the apparatus therefor can be screened at low cost because the most efficient metabolic reaction pathway can be found under less culture conditions.
  • a model of exhaustive metabolic pathway can be constructed, suppression of by-products etc. can be efficiently performed, and the screening method of cell lines and culture conditions according to the present embodiment, and the apparatus selected By using cell lines, it is possible to obtain the target substance with high productivity and less variation in quality.
  • Target value setting process S10 Target value setting process S20 First culture process S30 Analysis process S40 Analysis value calculation process S50 Culture condition calculation process S60 Second culture process S70 Screening process 1, 1A Screening device 2 Target value setting means 3 Culture means 4 Analysis means 5 Analysis value Calculation means 6 Culture condition simulator 61 Culture condition calculation means 62 Screening means 7 Control means DB metabolism database

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Abstract

細胞株及び培養条件のスクリーニングを簡便に行うことができる細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置を提供する。スクリーニング方法は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定工程（Ｓ１０）と、第１培養工程（Ｓ２０）と、分析工程（Ｓ３０）と、前記分析工程（Ｓ３０）で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出工程（Ｓ４０）と、相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記第１培養工程（Ｓ２０）で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算工程（Ｓ５０）と、前記変更した培養条件で培養する第２培養工程（Ｓ６０）と、を複数の培養細胞及び培養条件について実施し、前記実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング工程（Ｓ７０）を含む。

Description

細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置
　本発明は、細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置に関する。
　微生物、動物細胞、植物などの細胞の生命活動によって自然界で微量に作られる有用物質を、合成生物学の適用により大量製造が可能となっている。これら有用物質の大量製造では、目的とする有用物質（以下、「目的物質」という）を産生する細胞を適切な培養環境で培養し、産生された目的物質を精製等で回収することで製造される。細胞を利用して製造した目的物質は、食品・飲料、化学・繊維、医薬品、化粧品、エネルギーを中心とする産業分野やそれを支える研究支援分野（研究用機器・試薬、ＤＮＡ合成など）に適用されている。
　目的物質の大量生産のための製造プロセス構築では、合成生物学的手法として分子生物学アプローチによる高効率生産可能な新規細胞株の創成や、代謝システムの人工的構築が行われる。細胞のスクリーニングによって新奇な二次代謝産物を作る細胞が発見されると、その化合物を生産する遺伝子クラスターを発見し、クラスター内の各遺伝子の機能を明らかにした上で、生産性を上げるために、細胞に遺伝子組換えを行う。すなわち、（１）発見⇒（２）解析⇒（３）設計⇒（４）遺伝子組換え⇒（５）試験⇒（６）学習⇒（３）設計⇒…というサイクルを繰り返す。その後、前記により選定された細胞株候補に対して培養方式や培養条件等の最適化により、製造プロセスを構築する。
　細胞培養の培養方式は、回分培養、流加培養（若しくは半回分培養）、連続培養（若しくは灌流培養）に分類される。
　回分培養は、一回ごとに新たな培地を用意し、そこに細胞株を植えて収穫まで培地を加えない培養法である。回分培養には、培養ごとに品質はバラつくが、コンタミネーションのリスクを分散・低減できるという特徴がある。
　流加培養は、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時まで生産物を抜き取らない培養法である。
　連続培養は、培養系に連続的に培地を供給すると同時に、供給した培地と同じ量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養には、培養環境を一定に保ち易く、生産性が安定するという特徴がある。
　前記した製造プロセスの構築にあたっては、前記培養方式に対して、生産性が高くなる温度、溶存酸素濃度などの培養条件を決定する。しかし、細胞内での有用物質の合成メカニズムは非常に複雑であり、充分に解明されていない。そのため、従来の適切な培養条件のスクリーニングは、生産性や品質に影響する培養細胞の状態を把握し、培養条件と細胞の状態の因果関係を把握して、生産性や品質を最適とする培養条件を探索する必要があった。また、そのため、従来の適切な培養条件のスクリーニングは、様々な培養条件で実際に細胞を培養するという試行錯誤でなされる。検討すべき培養環境のパラメータは、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度など多数あり、それぞれのパラメータに対して条件を変えた場合、パラメータの組合せによる培養環境の条件数は指数的に増える。従って、製造プロセスを構築するにあたって非常に多くの培養実験を行う必要があり、培養条件のスクリーニングのために膨大な時間とコストを必要としていた。
　なお、細胞株候補の選定に関して、例えば、特許文献１に記載の方法が提案されている。この特許文献１には、リアルタイム代謝フラックス分析を用いた新規又は改変表現型の全細胞操作の方法が記載されている。当該方法は、（ａ）細胞の遺伝子構成を改変することによって、改変細胞を作成する工程を含んでいる。（ｂ）前記改変細胞を培養して、複数の改変細胞を生成する工程を含んでいる。（ｃ）工程（ｂ）の細胞培養をリアルタイムでモニタリングすることによって、前記細胞の代謝パラメータの少なくとも一つを測定する工程を含んでいる。そして、（ｄ）工程（ｃ）のデータを分析して、測定したパラメータと同様な条件下の非改変細胞における比較可能な測定値とが異なるかどうかを決定することによって、リアルタイム代謝フラックス分析を用いて前記細胞における操作された表現型を同定する工程を含んでいる。
特表２００５－５０６８４０号公報
　特許文献１に記載の方法によれば、改変細胞の選定を効率的に行い得る。しかしながら、前記したように培養環境の条件数が非常に多く、製造プロセスを構築するために非常に多くの培養実験を行う必要がある。そのため、培養条件のスクリーニングのために膨大な時間とコストを必要とするという状況は変わっていない。つまり、特許文献１に記載の方法では、最適な培養条件のスクリーニングを行うことはできない。
　本発明は前記状況に鑑みてなされたものであり、細胞株及び培養条件のスクリーニングを簡便に行うことができる細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置を提供することを課題とする。
　前記課題を解決するため本発明者等が鋭意検討した結果、次のようにすることで、前記目標に近い細胞内代謝反応を実現することができ、目的物質の生産について生産性が高く、且つ品質が安定した目的物質を得ることができることを見出した。すなわち、目標とする細胞内代謝反応を設定し、使用する細胞において、培養条件（温度、ｐＨなどの培養環境因子）と各代謝反応速度との相関モデルを構築する。そして、この相関モデルを用いて、設定した細胞内代謝反応モデル（すなわち、目標値）に最も近くなる培養条件を計算することで、前記目標に近い細胞内代謝反応を実現することができる。そして、これにより、目的物質について生産性が高く、且つ安定した品質を得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見を見出すことにより完成するに至ったものである。なお、本発明における「相関モデル」とは、代謝反応と、当該代謝反応に関する代謝反応速度式と、代謝反応や代謝反応速度式に影響を与える培養環境因子との相関を表したモデルをいう。つまり、相関モデルは、解明している代謝反応の数に応じた代謝反応速度式を有する。
　本発明に係る前記課題は以下の手段により解決される。
　本発明に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定工程と、予め設定されている培養条件で培養細胞を培養する第１培養工程と、培養した前記培養細胞を含む培養液を分析する分析工程と、前記分析工程で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出工程と、相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記第１培養工程で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算工程と、前記変更した培養条件で前記培養細胞と同じ細胞株の培養細胞を培養し、得られた培養液を前記分析工程に送る第２培養工程と、を含み、前記分析工程から前記第２培養工程までを複数の培養細胞及び培養条件について実施し、前記実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含む。
　本発明に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング装置は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定手段と、設定又は変更された培養条件で培養細胞を培養する培養手段と、前記培養手段で培養した培養細胞を含む培養液を分析する分析手段と、前記分析手段で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出手段と、相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記培養手段で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算手段と、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング手段と、を有する。
　本発明によれば、細胞株及び培養条件のスクリーニングを簡便に行うことができる細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置を提供できる。
遺伝情報の伝達・発現と細胞機能の発現を説明するフローチャートである。 細胞内代謝により目的物質を生産する細胞株を示す概念図である。 遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の一例を示す概念図である。 遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の一例を示す概念図である。 遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。 遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。 Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ）細胞の代謝経路の一部を示す図である。 本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング装置の一例を示す概略図である。 回分培養型培養装置の概略図である。 流加培養型培養装置の概略図である。 連続培養型培養装置の概略図である。 培養槽を複数備えたスクリーニング装置を示す概略図である。 前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。 前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。 前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。 前処理手段で行われる前処理の一例を示すフローチャートである。 代謝フラックスの分析方法の概念を示す説明図である。 本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法の内容を説明するフローチャートである。 本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法のより詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。 本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法のさらに詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。
　以下、適宜図面を参照して本発明に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置（以下、それぞれ単に「スクリーニング方法」及び「スクリーニング装置」ということがある）の一実施形態について詳細に説明する。以下の説明では、まず、目的物質の生産で必要とされる細胞株の特性について説明し、次いで、培養条件と代謝反応速度との相関モデルの構築について説明する。その後、スクリーニング装置の実施形態について説明し、次いで、スクリーニング方法の実施形態について説明する。
［１．目的物質の生産で必要とされる細胞株の特性］
　図１は、遺伝情報の伝達・発現（セントラルドグマ）と細胞機能の発現を説明するフローチャートである。図２は、細胞内代謝により目的物質を生産する細胞株を示す概念図である。図３Ａは、遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の一例を示す概念図である。図３Ｂは、遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の一例を示す概念図である。図３Ｃは、遺伝子組換えを行う前の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。図３Ｄは、遺伝子組換えを行った後の細胞内代謝の他の一例を示す概念図である。
　細胞は、栄養成分となる原料を細胞内に取り込み、細胞内の代謝経路で合成、修飾を行って目的物質を生産する。目的物質の生産効率は細胞機能の１つである代謝反応速度が関与し、代謝反応速度は培養条件に依存する。物質生産では細胞内における代謝反応を促進する酵素タンパク質が全ての代謝経路で発現している必要がある。図１を参照して、酵素タンパク質が発現し、細胞機能として働くまでの流れを説明すると次のようになる。細胞内のゲノムＤＮＡに酵素タンパク質の遺伝子がコードされている。ゲノムＤＮＡからｍＲＮＡが転写され、ｍＲＮＡから酵素タンパク質などのプロテインが翻訳され、発現する。そして、このようにして発現した酵素タンパク質が高次構造を形成したり、修飾を受けたりするなどして活性化され、細胞機能として働くことで代謝反応速度が向上する。これらｍＲＮＡや酵素タンパク質の活性及び代謝反応に関与する因子は培養条件に依存するため、代謝反応速度及び物質生産の生産性も培養条件に依存することになる。なお、ゲノムＤＮＡからｍＲＮＡへの転写量や動態などは、トランスクリプトーム解析を行うことによって把握することができる。また、ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡから発現するプロテインの発現量や動態などは、プロテオーム解析を行うことによって把握することができる。
　また、細胞が栄養成分となる原料を取り込み、細胞内の代謝経路で合成、修飾を行って目的物質を生産するまでの流れを図に示すと図２のようになる。図２に示すように、目的物質ＯＳは、目的物質ＯＳを生産する細胞Ｃが培養液Ｍ中の栄養成分ＮＣを原料として細胞Ｃ内の代謝Ｍｅ（合成反応）を経由して産生される。なお、このとき、目的物質ＯＳの産生にあたって副生成物ＢＰが産生されることがある。図１中の矢印「→」は、代謝経路を示している。
　本実施形態で用いることのできる細胞Ｃとしては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベイビーハムスター腎臓細胞、マウス骨髄腫細胞などが挙げられる。細胞Ｃが付着性細胞である場合は、マイクロキャリアなどの担体に付着させて浮遊化させることで撹拌培養を行うことができる。また、本実施形態で用いることのできる細胞Ｃとしては、動物由来の細胞だけでなく、植物細胞、光合成細菌、微細藻類、ラン藻類、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌、藻類、大腸菌、酵母などが挙げられる。なお、本実施形態においては、目的物質ＯＳを生産できるものであればどのような細胞も用いることができ、前記したものに限定されない。
　また、目的物質ＯＳとしては、例えば、生理活性物質が挙げられ、特に抗体が挙げられる。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫グロブリンを含む。また、生理活性物質は抗体に限らず、血栓溶解剤として利用される組織型プラスミノーゲン活性化因子やエリスロポエチン、インターフェロンなどのバイオ医薬品、その他工業的に有用なタンパク質も対象となり、β－カロテンやアスタキサンチンなどのカロチノイド、クロロフィルやバクテリオクロロフィルなどの色素を結合したタンパク質も対象となる。さらに、目的物質ＯＳとしては、例えば、食品や化粧品などの着色等に使用されるフィコシアニンなどのフィコビリンタンパク質なども挙げることができる。また、培養に用いる培地については特に限定されるものではなく、培養対象とする細胞Ｃの増殖、目的物質ＯＳの生産に有効なものであれば、従来のあらゆる培地が使用可能である。目的物質ＯＳとしては、タンパク質以外に抗生物質のような二次代謝物であってもよく、細胞Ｃ内の代謝で産生されるものであれば、特に限定されない。
　細胞Ｃは、目的物質ＯＳの生産性を高めるため、遺伝子組換えが行われることが多い。遺伝子組換えを行う場合、細胞Ｃに対して目的物質ＯＳの合成に必要な代謝経路の追加や、元の細胞株（例えば、天然細胞株）の代謝経路の反応速度を増大又は減少させて目的物質の生産性を高めるように設計する。なお、本実施形態における天然細胞株とは、目的物質を生産する遺伝子を導入する遺伝子組換えを行っていない細胞株をいい、具体的には、限界希釈法などにより自然界や生体から単離（クローニング）された細胞株をいう。遺伝子組換えでは、代謝反応に関与する酵素タンパク質などを増加又は減少させることで、代謝反応速度を制御する。
　なお、遺伝子組換えは、例えば、図３Ａに示すように、目的物質ＯＳを生産しない細胞Ｃ０に、他の細胞由来の目的物質ＯＳを生産する代謝経路ＭＰに係る遺伝子（例えば、酵素タンパク質の遺伝子）を導入する。このようにすると、図３Ｂに示すように、遺伝子組換えによって作出された目的物質ＯＳを生産することのできる細胞Ｃは、導入された遺伝子によって細胞内代謝が改変され、栄養成分ＮＣから目的物質ＯＳを生産できるようになる。
　また、遺伝子組換えは、例えば、図３Ｃに示すように、目的物質ＯＳを生産する能力を有する細胞Ｃ１に対して、図３Ｄに示すように、効率の悪い代謝経路に関する遺伝子を欠失させたり、そのような代謝経路を阻害する物質を生産する遺伝子を導入したりする。このようにすると、図３Ｄに示すように、効率の悪い代謝経路が阻害されるので、栄養成分ＮＣから目的物質ＯＳを生産する能力が高まった細胞Ｃを作出することができる。なお、図３Ｄにおいて矢印が太く表示されている。これは、生産性が高まっている様子を示している。また、図３Ｄにおいて代謝経路に「×」が付されている。これは、代謝経路が阻害されていることを示している。また、図３Ｄにおいて○が破線で表示されているものがある。これは、生産されていた副生成物ＢＰの産生が阻害され、生成されなくなったり、生成量が低下したりしたことを示している。
　ここで、培養中の細胞内の各代謝反応速度は、例えば、温度、ｐＨ、溶存酸素、溶存二酸化炭素、液中通気による気泡、攪拌によるせん断応力などの培養環境因子によっても変化する。これは、細胞Ｃ内で発現した酵素タンパク質や補酵素などの活性が、前記培養環境各因子によって影響を受けるためである。
　そのため、目的物質ＯＳの生産で必要とされる細胞株は以下の２つの特性が必要であると言われている。
（１）目的物質ＯＳを生産できる適切な代謝経路（過不足のない代謝経路）が存在すること。
（２）各代謝経路において反応を促進する酵素タンパク質、又は反応を阻害する阻害因子の活性が代謝経路全体で適正化されていること。
　前記（１）に関しては、前記したような遺伝子組換えやゲノム編集により行うことができ、（２）に関しては、培養条件の最適化により行うことができる。なお、ゲノム編集とは、ゲノム上で任意の遺伝子を改変する（切断し、編集する）技術をいう。
　目的物質ＯＳの大量生産においては、前記（１）と（２）を同時に最適化することが重要である。そのためには、遺伝子組換えやゲノム編集を行った複数の細胞株の候補それぞれに対して細胞内代謝反応が培養条件（培養環境因子）に対して、どのような相関があるかを把握し、代謝反応速度と培養環境因子の相関を定式化（モデル化）するのが好適であると考えられる。そして、それぞれの細胞株で前記モデル化を行った相関モデルを構築し、その相関モデルを用いて、最適化された培養条件での生産性を比較することで、最適な細胞株及び培養条件の組合せを提供することが可能となる。
［２．培養条件と代謝反応速度との相関モデルの構築］
　図４は、Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ）細胞の代謝経路の一部を示す図である。なお、ＣＨＯ細胞は、抗体医薬品製造でよく使用される細胞の一つである。
　目的物質ＯＳは、図４に示すような代謝経路に従って生産される。目的物質ＯＳの生産効率を上げるためには、原則、原料となる栄養成分ＮＣから目的物質ＯＳまでの代謝経路の代謝反応速度が高く、分岐する代謝経路（副生成物ＢＰ）の代謝反応速度が低くなることが望ましい。
　下記に、図４に示すＣＨＯ細胞の代謝経路における反応Ｎｏ．（例えば、Ｒ１など）及び代謝反応式を示す。なお、下記の例示の中で、「＝」は主に酵素タンパク質によって可逆的に、又は不可逆的に代謝されることを示している。
＜図４に示す反応Ｎｏ．及び代謝反応式＞
反応Ｎｏ．：代謝反応式
Ｒ１　　　：Ｇｌｕｃext＝Ｇ６Ｐ
Ｒ２　　　：Ｇ６Ｐ＝Ｆ６Ｐ
Ｒ３　　　：Ｆ６Ｐ＝ＤＨＡＰ＋ＧＡＰ
Ｒ４　　　：ＤＨＡＰ＝ＧＡＰ
Ｒ５　　　：ＧＡＰ＝３ＰＧ
Ｒ６　　　：３ＰＧ＝Ｐｙｒ
Ｒ７　　　：Ｐｙｒ＝Ｌａｃ
Ｒ８　　　：Ｌａｃ＝Ｌａｃext
Ｒ９　　　：Ｇ６Ｐ＝Ｐ５Ｐ＋ＣＯ２
Ｒ１０　　：Ｐ５Ｐ＝Ｘ５Ｐ
Ｒ１１　　：Ｐ５Ｐ＝Ｒ５Ｐ
Ｒ１２　　：Ｘ５Ｐ＝ＥＣ２＋ＧＡＰ
Ｒ１３　　：Ｆ６Ｐ＝ＥＣ２＋Ｅ４Ｐ
Ｒ１４　　：Ｓ７Ｐ＝ＥＣ２＋Ｒ５Ｐ
Ｒ１５　　：Ｆ６Ｐ＝ＥＣ３＋ＧＡＰ
Ｒ１６　　：Ｓ７Ｐ＝ＥＣ３＋Ｅ４Ｐ
Ｒ１７　　：Ｐｙｒ＋ＣＯ２＝ＯＡＡ
Ｒ１８　　：ＭＡＬ＝Ｐｙｒ＋ＣＯ２
Ｒ１９　　：Ｇｌｕ＝Ａｋｇ
Ｒ２０　　：ＯＡＡ＝Ａｓｐ
Ｒ２１　　：Ｐｙｒ＝ＡｃＣｏＡ＋ＣＯ２
Ｒ２２　　：ＯＡＡ＋ＡｃＣｏＡ＝Ｃｉｔ
Ｒ２３　　：Ｃｉｔ＝Ａｋｇ＋ＣＯ２
Ｒ２４　　：Ａｋｇ＝０．５Ｓｕｃ＋０．５Ｓｕｃ＋ＣＯ２
Ｒ２５　　：Ｓｕｃ＝Ｆｕｍ
Ｒ２６　　：Ｆｕｍ＝ＭＡＬ
Ｒ２７　　：ＭＡＬ＝ＯＡＡ
Ｒ２８　　：Ｃｉｔ＝ＯＡＡ＋ＡｃＣｏＡCyt
Ｒ２９　　：ＡｃＣｏＡCyt＝ＦＡＭ
Ｒ３０　　：Ｓｅｒ＝Ｐｙｒ
Ｒ３１　　：Ｓｅｒ＝Ｇｌｙ＋ＭＥＥＴＨＦ
Ｒ３２　　：Ｐｙｒ＝Ａｌａ
Ｒ３３　　：Ｇｌｎext＝Ｇｌｎ
Ｒ３４　　：Ｇｌｎ＝Ｇｌｕ
Ｒ３５　　：Ｇｌｕ＝Ｇｌｕext
Ｒ３６　　：Ｐ５Ｐ＝ＮＴＰ
Ｒ３７　　：ＤＨＡＰ＝ＧＬＰ
Ｒ３８　　：ＡＳＰprot＝Ａｓｐ
Ｒ３９　　：Ｓｅｒ＝ＳＥＲ＿ＤＩＬ
　また、下記に図４で用いた略語の説明を示す。
＜図４で用いた略語の説明＞
Ｇｌｕｃ　　　：Glucose（グルコース）
Ｇ６Ｐ　　　　：Glucose-6-phosphate（グルコース－６－リン酸）
Ｆ６Ｐ　　　　：Fructose-6-phosphate（フルクトース－６－リン酸）
ＤＨＡＰ　　　：Dihydroxyacetone phosphate（ジヒドロキシアセトンリン酸）
ＧＡＰ　　　　：Glyceraldehyde-3-phosphate（グリセルアルデヒド－３－リン酸）
３ＰＧ　　　　：3-phosphoglycerate（３－ホスホグリセリン酸）
Ｐｙｒ　　　　：Pyruvate（ピルビン酸）
Ｌａｃ　　　　：Lactic acid（乳酸）
Ｐ５Ｐ　　　　：Pyridoxyl-5-phosphate（ピリドキシル－５－リン酸）
Ｘ５Ｐ　　　　：Xylulose-5-phosphate（キシルロース－５－リン酸）
Ｒ５Ｐ　　　　：Ribose-5-phosphate（リボース－５－リン酸）
ＥＣ２　　　　：2 enzyme-bound carbons
ＣＯ２　　　　：Carbon dioxide（二酸化炭素）
Ｅ４Ｐ　　　　：Erythrose-4-phosphate（エリトロース－４－リン酸）
ＯＡＡ　　　　：Oxaloacetate（オキサロ酢酸）
Ｓ７Ｐ　　　　：Sedoheptulose-7-phosphate（セドヘプツロース－７－リン酸）
ＭＡＬ　　　　：Malate（リンゴ酸）
Ａｋｇ　　　　：α-Ketoglutarate（α－ケトグルタル酸）
Ａｓｐ　　　　：Aspartic acid（アスパラギン酸）
ＡＳＰprot　　 ：Aspartic acid protein（タンパク質由来アスパラギン酸）
ＡｃＣｏＡ　　：Acetyl-CoA（アセチルコエンザイムＡ）
ＡｃＣｏＡcyt ：Acetyl-CoA cytosol（細胞質基質アセチルコエンザイムＡ）
ＦＡＭ　　　　：Fatty acid metabolism（脂肪酸代謝）
Ｃｉｔ　　　　：Citric acid（クエン酸）
Ｓｕｃ　　　　：Succinate（コハク酸）
Ｆｕｍ　　　　：Fumarate（フマル酸）
Ｓｅｒ　　　　：Serine（セリン）
ＳＥＲ＿ＤＩＬ：Serine dilution（希釈セリン）
Ｇｌｙ　　　　：Glycine（グリシン）
ＭＥＥＴＨＦ　：Methylentetrahydrofolate（メチレンテトラヒドロ葉酸）
Ａｌａ　　　　：Alanine（アラニン）
Ｇｌｎ　　　　：Glutamine（グルタミン）
Ｇｌｎext　　 ：External Glutamine（細胞外グルタミン）
Ｇｌｕ　　　　：Glutamic acid（グルタミン酸）
Ｇｌｕext　　 ：External Glutamic acid（細胞外グルタミン酸）
ＮＴＰ　　　　：Nucleotide tri-phosphate（ヌクレオシド三リン酸）
ＧＬＰ　　　　：Glycerophosphate（グリセロール３－リン酸）
　図４に示す代謝経路に関する各代謝反応式は、培養条件（培養環境因子：温度（Ｔｅｍ）、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、溶存二酸化炭素、液中通気による気泡、攪拌によるせん断応力など）の影響を受ける。そのため、各代謝反応速度がどの培養環境因子の影響を受けるか知る必要がある。培養条件による影響は、論文、雑誌、書籍、実験データなどの公開された文献・知見や、実験で得られた条件などを反映させることができる。つまり、前記した反応Ｎｏ．及び代謝反応式、さらに、これまでに公開された知見を相関関係で表すことができ、当該相関関係から、各代謝反応速度を培養環境因子による関数で表現することができる。これらの一例を下記に示す。
＜前記した反応Ｎｏ．及び代謝反応式、さらにこれまでに公開された知見の相関関係の一例＞
　相関関係としては、例えば、
Ｒ１∝ＤＯ，Ｔｅｍ（文献ａ、ｂ）
Ｒ２∝Ｔｅｍ（文献ｃ）
Ｒ３∝ｐＨ，ＤＯ（文献ｄ、ｅ）
　　　　　　　　・
　　　　　　　　・
　　　　　　　　・
Ｒ５３∝ｐＨ，Ｔｅｍ（文献ｆ、ｇ）
　などが挙げられる（但し、ＤＯ：溶存酸素濃度、Ｔｅｍ：温度）。
　つまり、反応Ｎｏ．Ｒ１は、文献ａ、ｂによればＤＯ及びＴｅｍと相関関係があり、反応Ｎｏ．Ｒ２は、文献ｃによればＴｅｍと相関関係があり、反応Ｎｏ．Ｒ３は、文献ｄ、ｅによればｐＨ及びＤＯと相関関係があり、反応Ｎｏ．Ｒ５３は、文献ｆ、ｇによればｐＨ及びＴｅｍと相関関係があると表すことができる。
＜培養環境因子による関数で表現した代謝反応速度の一例＞
　そして、前記相関関係から、各代謝反応速度は培養環境因子による関数で表現することができる。培養環境因子による関数で表現した代謝反応速度は、例えば、
ｆＲ１（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・）
ｆＲ２（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・）
ｆＲ３（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・）
　　　　　　　　・
　　　　　　　　・
　　　　　　　　・
ｆＲ５３（ｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・）
　などと表すことができる。なお、本実施形態においては後述するように設定を変更して複数回培養を行う。言うまでもなく、前記各関数ｆＲ１…ｆＲ５３におけるｐＨ，ＤＯ，Ｔｅｍ・・・などの培養環境因子は、各回において同一の条件があてはまることになる。
　そして、前記代謝反応速度と物質収支のバランスより、設定した培養条件における栄養基質消費速度及び目的物質の生産速度を推定することができる。
　但し、前記相関関係及び関数（相関モデル）は細胞ごとに異なり、またこれまでの知見だけでは情報が不足する場合がある。
　そこで、本実施形態では後述するように、使用する細胞を特定の培養条件で培養し、代謝解析を行う。そして、培養実験結果と相関モデルを比較し、一致しない場合、培養実験結果に近づくように相関モデルのパラメータを補正する。そして、補正後の相関モデルを用いて、目標値（例えば、目標とする代謝反応速度）となる培養条件を計算する。そして、計算によって求めた培養条件で培養を行い、培養による代謝反応速度と先ほど計算で求めていた反応速度とを比較し、一致しなければ相関モデルのパラメータを再度補正する。
　この一連の操作を繰り返すと、実験による代謝反応速度と計算による代謝反応速度が一致するようになる。実験による代謝反応速度と計算による代謝反応速度が一致したときの相関モデルの精度は高く、同時に最適な培養条件となる。なお、ここでいう一致とは、対比する数値等が同一になることだけでなく、同等の効果を得ることができると考えられる範囲内になることを含む。同等の効果を得ると考えられる範囲としては、例えば、目標値±２０％、より好ましくは目標値±１０％などとすることができるが、これらに限定されず、任意に設定することができる。
　このように、本実施形態によれば前記した操作を行うことによって、より確実かつ着実に最適な培養条件を得ることができるので、経験則に基づいて行っていた従来の手法と比較して、培養実験数を大幅に削減できる。また、後述するように、培養手段３を複数有していれば（図９の培養槽３７ａ～３７ｈ参照）、本実施形態に係るスクリーニング方法によって一度に多くの培養条件を評価することができる。従って、このようにした場合は、従来に比して、より短期間で最適な培養条件をスクリーニングすることができる。
［３．スクリーニング装置の実施形態］
　図５は、本実施形態に係るスクリーニング装置の一例を示す概略図である。
　図５に示すように、スクリーニング装置１は、目標値設定手段２と、培養手段３と、分析手段４と、解析値算出手段５と、培養条件計算手段６１と、スクリーニング手段６２とを有する。また、スクリーニング装置１は、制御手段７及び代謝データベースＤＢを有する。以下、各手段について述べる。
（目標値設定手段２）
　目標値設定手段２は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する装置である。目標値設定手段２は入力手段と出力手段を備えている（いずれも図示せず）。入力手段は、目的物質を効率的に生産するための目標とする代謝反応に関する目標値を入力する機器である。入力手段としては、例えば、データ入力用のキーボードやマウスなどが挙げられる。入力データは図５中の培養条件計算手段６１に設けられたハードディスクドライブなどの記憶装置に保存される。また、出力手段は、入力手段で入力された入力値などを視認できるように表示するものである。出力手段としては、例えば、モニタや紙媒体に出力する装置（プリンタ）などが挙げられる。
　前記目標値は、培養細胞の代謝反応に関するものであればどのようなものでもよく、特に限定されないが、例えば、目的物質を効率よく生産するための代謝経路モデルや代謝反応速度などが挙げられる。代謝経路モデルは、生化学的に解明・提唱されている代謝経路などに基づいて構築されたモデルなどを適用することができる。代謝経路としては、例えば、解糖系、糖新生、クエン酸回路、グリオキシル酸回路、酸化的リン酸化、ペントースリン酸回路、還元的ペントースリン酸回路、尿素回路、β酸化、アミノ酸生合成、ヌクレオチド代謝、グリコーゲン合成、脂質生合成、脂肪酸生合成、コレステロール生合成、プリン合成系、ピリミジン合成系、シキミ酸経路などが挙げられるが、これらに限定されない。
（培養手段３）
　培養手段３は、設定又は変更された培養条件で培養細胞を培養する装置（培養槽）である。培養手段３は、後述する第１培養工程Ｓ２０及び第２培養工程Ｓ６０を行う（図１２参照）。なお、変更された培養条件については後述する。培養手段３が採用し得る培養方式としては、例えば、回分培養、流加培養、連続培養の３種類が挙げられる。回分培養は、一回ごとに新たな培地を用意し、そこへ細胞株を植えて収穫まで培地を加えない培養法である。流加培養は、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時までその生成物を抜き取らない培養方法である。連続培養は、連続的に培養系に培地を供給すると同時に、供給した培地と同じ量の培養液Ｍを抜き取る培養法である。いずれの培養方式においても、培養環境のパラメータ（培養環境因子）として、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）、溶存二酸化炭素濃度（ＤＣＯ２）、液中通気による気泡、攪拌によるせん断応力などが挙げられるが、これらに限定されない。以下、各培養方式における培養装置を説明する。
（i．回分培養型培養装置）
　図６は、回分培養型培養装置の概略図である。図６に示すように、培養手段３の一例である回分培養型培養装置３Ａはオンラインモニタリング手段３１により、培養液ＭのｐＨ、ＤＯ、温度などの培養環境因子の計測を行う。モニタリングされた各培養環境因子はそれぞれの計測値に基づいて予め定めた目標値に収束させるために、気相酸素濃度調節手段３２、ｐＨ調節手段３３、溶存酸素濃度調節手段３４、攪拌手段３５、温度調節手段３６などの手段ごとに独立して制御手段７により制御が行われる。制御手段７による各目標値への制御フローの各ステップにおける動作を以下に説明する。
（１）培養槽３７に設置したｐＨ、ＤＯ、温度などの各計測手段（オンラインモニタリング手段３１）により、それぞれの計測値を得る。
（２）制御手段７において、それぞれの計測値が予め設定された制御値に一致するかどうか判定する。一致する場合は（１）に戻る。一致しない場合は（３）に進む。
（３）前記（２）において、制御値に一致していないと判断された場合には、制御値に収束するよう、制御手段７により前記手段３２～３６のそれぞれに対して動作信号を伝達し、操作量を変更する。前記手段３２～３６に対する制御手法としては特に限定するものではなく、ＯＮ／ＯＦＦ制御法、比例制御法、ＰＩＤ制御法などの公知の手法を用いることができる。操作量変更後、（１）に戻る。
　なお、前記手段３２～３６での操作量としては、例えば、下記（ａ）～（ｃ）が用いられる。
（ａ）ｐＨ：通気ガス中の炭酸ガス供給量の増減、及び酸性溶液又はアルカリ性溶液の注入量。
（ｂ）溶存酸素濃度及び気相酸素濃度：通気ガス中の酸素供給量の増減、培養液攪拌速度の増減、培養槽圧力の増減。
（ｃ）温度：温度調節手段３６がウォータージャケットなどの場合は、供給水温度の増減、冷却水供給速度の増減、温度調節手段３６が加熱用電気ヒーターなどの場合は、加熱用電気ヒーター供給電力量の増減、温度調節手段３６が加熱用蒸気を用いる場合は、加熱用蒸気供給量の増減。
　前記（１）～（３）は、スクリーニング方法の終了命令が発せられるまで反復して実行される。反復の周期は培養する細胞Ｃの特性、及び培養手段３の動特性をもとに適宜決定されるが、概ね１秒～１０分の範囲で実施される。
（ii．流加培養型培養装置）
　図７は、流加培養型培養装置の概略図である。図７に示すように、培養手段３の一例である流加培養型培養装置３Ｂは、前記した回分培養型培養装置３Ａに新鮮な培地を添加する培地添加手段３８が加わった構成となる。流加培養型培養装置３Ｂは、回分培養型培養装置３Ａと同様にｐＨ、ＤＯ、温度などをオンラインモニタリング手段３１で計測し、それぞれの計測値に基づいて予め定めた制御値に収束させるために、手段３２～３６ごとに独立して制御手段７により制御が行われる。また、培地添加手段３８に関しては、新鮮な培地が入った添加培地槽（図示せず）から培養槽３７にペリスタポンプや圧送により新鮮培地の流量や流速を制御しながら培養液Ｍに新鮮な培地を添加する。上記流量や流速は、制御手段７が設定し、調整される。
（iii．連続培養型培養装置）
　図８は、連続培養型培養装置の概略図である。図８に示すように、培養手段３の一例である連続培養型培養装置３Ｃは、例えば、培養槽３７、培地添加手段３８、細胞分離手段３９を有する。連続培養型培養装置３Ｃは、流加培養型培養装置３Ｂに細胞分離手段３９が加わった構成となる。培地添加手段３８から培養槽３７へはバルブＶを介して配管Ｔ１で、培養槽３７から細胞分離手段３９へは配管Ｔ２で、細胞分離手段３９から回収容器４０へは配管Ｔ３で、細胞分離手段３９から培養槽３７へは配管Ｔ４でそれぞれ接続されている。また、これらの配管のうち、配管Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の任意の箇所にポンプＰ１～Ｐ３が設置されている。
　連続培養型培養装置３Ｃの培養槽３７には、回分培養型培養装置３Ａ、流加培養型培養装置３Ｂと同様、培養液Ｍを攪拌する攪拌手段３５が設けられている。また、培養槽３７には、液中通気のための散気管３４ａ、温度調節手段３６、及びｐＨ、ＤＯ、ＤＣＯ２、温度などを計測するオンラインモニタリング手段３１が設けられている。なお、オンラインモニタリング手段３１のセンサは、計測対象ごとに個別に備えられている。また、図８において図示はしないが、培養槽３７は、ｐＨ、ＤＯを設定値に制御するためにアルカリ溶液添加用の配管を備えている。また、同じく図８において図示はしないが、培養槽３７は、前記したセンサで得られた値に基づいて前記培養環境を所定の設定範囲に維持するためにアルカリ添加やガス通気を制御するための装置も備えている。モニタリングされた前記各培養環境因子はそれぞれの計測値に基づいて予め定めた目標値に収束させるために、気相酸素濃度調節手段（図８に図示せず）、ｐＨ調節手段（図８に図示せず）、溶存酸素濃度調節手段（図８に図示せず）、攪拌手段３５、温度調節手段３６などの手段ごとに独立して制御手段７により制御が行われる。
　培養手段３として、このような連続培養型培養装置３Ｃを用いると、培養環境を常に一定に保ち易く、生産性を安定させることができる。
　なお、図８に示す培地添加手段３８は、培養槽３７内において細胞Ｃが消費した液体培地中の栄養成分ＮＣを補うため、新鮮な液体培地を培養槽３７に添加する装置である。培地添加手段３８は、新鮮な培地を一時的に貯留しておくことができる槽（容器）を有している。当該槽は、新鮮な培地を一時的に保存できる容器であればどのようなものも用いることができる。新鮮な培地は、培養しようとする細胞Ｃに応じて適宜に選択・調製することができる。
　図８に図示している細胞分離手段３９は、培養槽３７の培養液Ｍから培養細胞と、抗体タンパク質などの目的物質及び老廃物を含む溶液とを分離する装置である。細胞分離手段３９は、配管Ｔ４を通じて培養細胞を培養槽３７に戻し、配管Ｔ３を通じて生産物及び老廃物を回収容器４０へ移送する。細胞分離手段３９としては、例えば、重力沈降法、遠心分離法、超音波凝集法、ろ過分離法などが挙げられ、本実施形態ではいずれの手法を用いてもよい。
　図８に図示している回収容器４０は、細胞分離手段３９で分離された生産物及び老廃物を一時的に貯留しておく槽である。回収容器４０は、生産物及び老廃物を一時的に貯留しておくことができる槽（容器）であればどのようなものも用いることができる。
（複数の培養槽３７）
　図６から図８は、培養槽３７を１つだけ備えている様子を図示している。一般的に、遺伝子組換えを行った細胞は複数の候補細胞株（細胞株プール）として保存される。そのため、図５に示すスクリーニング装置１は、培養槽３７を複数備え、異なる培養条件で同時に培養できるようにするのが望ましい。なお、図９は、培養槽を複数備えたスクリーニング装置を示す概略図である。図９に示すスクリーニング装置１Ａは培養手段３として、例えば、容量が１００ｍＬである培養槽３７ａ～３７ｈを備えている。なお、図９において図示はしないが、スクリーニング装置１Ａは、培養槽３７ａ～３７ｈと個別に接続された培地添加手段、細胞分離手段及び回収容器などをそれぞれ備えている。
　図９に示す培養槽３７ａ～３７ｈは、図６、図７及び図８のうちのいずれかに示す構成の培養手段３を有している。従って、培養槽３７ａ～３７ｈはそれぞれが培養制御パラメータとして、攪拌回転数、温度、ｐＨ、ＤＯ、ＤＣＯ２などを用いることができ、これらを測定して制御することが可能である。また、培養槽３７ａ～３７ｈはそれぞれが培養制御パラメータとして、培養槽３７ａ～３７ｈから細胞分離手段を経由して培養槽３７ａ～３７ｈに戻る循環速度、細胞分離手段から回収容器に送液する送液速度、培地添加手段から培養槽３７ａ～３７ｈ内に新鮮な培地を添加する添加速度及び当該培地の培地組成などが挙げられ、これらを測定して制御することが可能である。
　また、培養槽３７ａ～３７ｈは、これらの培養制御パラメータを培養条件のスクリーニング対象とすることができる。生産性の高い細胞株を選別するには、候補細胞株とその細胞株に適した培養条件とをセットで検討する必要がある。そのため、本実施形態においては、図６～図８に示す培養槽３７は、１つの系統で１つの候補細胞株を種々の条件で培養することが望ましい。他方、図９に示すスクリーニング装置１Ａは、８つの培養槽３７ａ～３７ｈのそれぞれで１つの系統の細胞株を培養できるだけでなく、前記１つの系統の細胞株の培養条件の制御値を変えて種々の培養条件で培養することができる。
（分析手段４）
　図５に示す分析手段４は、培養手段３で培養した培養細胞を含む培養液Ｍを分析する装置である。分析手段４による分析は、後述する解析値算出手段５で代謝解析を行うのに必要なデータ（分析結果）を得るために行う。また、分析手段４による分析は、細胞の状態が安定しているか否かを確認するために行う。
　図５に示すように、分析手段４は、分析を行うにあたり、培養手段３で培養している細胞を含む培養液Ｍを無菌的にサンプリングする。培養液Ｍの無菌的なサンプリングは、図５～図８に示すサンプリング手段４１によって行うことができる。サンプリング手段４１は、図６～図８に示すように、培養槽３７に備えられたサンプリング用のポート４１ａを介して、ペリスタポンプなどのポンプＰ２（図８参照）などで吸引することによって行うことができる。培養槽３７、ポート４１ａ、後記する前処理手段４２、これらを結ぶ各種配管が耐圧ガラスやステンレスなどの耐圧性及び耐熱性を有する材料であれば、サンプリングの前後でこれらの内部を蒸気滅菌（１２１℃、２０分以上）するのが好ましい。シングルユース培養槽、シングルユースチューブなどを使用する場合は、ポート４１ａとして例えば無菌接続コネクタを使用し、サンプルごとにサンプリング用の配管を接続してもよい。培養槽３７から前処理手段４２への培養液Ｍの移送は、ペリスタポンプなどのポンプＰ２（図８参照）又は圧送で行うことができる。
　図５に示す前処理手段４２は、分析手段４で培養液Ｍの成分や培養細胞の状態を分析するにあたり、分析手段４で行われる各種の分析法に適した前処理を行う装置である。前処理手段４２は、対象とする細胞や分析法により前処理方法が異なる。前処理手段４２で行われる前処理の一例（フローチャート）を図１０Ａから図１０Ｄに示す。
　図１０Ａは、酵母細胞抽出物を得て分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ａに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０１１）。サンプリングは、例えば、乾燥バイオマス５ｍｇ分を採取する。次いで、クエンチングを行う（ステップＳ１０１２）。クエンチングは、例えば、サンプリングしたものを－５０℃のメタノール（例えば、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthaneSulfonic acid）中に６０％メタノール、ｐＨ７．５）へ注入することで行う。次いで、細胞の回収を行う（ステップＳ１０１３）。細胞の回収は、例えば、－２０℃中、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、代謝産物の抽出を行う（ステップＳ１０１４）。代謝産物の抽出は、例えば、２ｍＬの沸騰水（１００℃）中で１５分間、インキュベートして行う。次いで、固形物の除去を行う（ステップＳ１０１５）。固形物の除去は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、凍結乾燥を行う（ステップＳ１０１６）。凍結乾燥は、例えば、８時間行う。次いで、誘導体化を行う（ステップＳ１０１７）。誘導体化は、例えば、５０μＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．１％ピリジン）と５０μＬのＮ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－Ｎ－メチル－トリフルオロアセトアミド（ＭＢＤＳＴＦＡ）を用いて、３０分、８０℃で接触させることにより行う。次いで、固形物の除去を行う（ステップＳ１０１８）。固形物の除去は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、分析を行う（ステップＳ１０１９）。分析は、例えば、ガスクロマトグラフ質量分析計などを用いて行うが、分析対象に応じて任意の手法で行うことができる。
　また、図１０Ｂは、細菌性細胞抽出物を得て分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ｂに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０２１）。サンプリングは、例えば、乾燥バイオマス５ｍｇ分を採取する。次いで、急速ろ過を行う（ステップＳ１０２２）。急速ろ過は、例えば、ニトロセルロースメンブレンフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）を用いて２回洗浄することにより行う。そして、代謝産物の抽出（ステップＳ１０２３）、固形物の除去（ステップＳ１０２４）、凍結乾燥（ステップＳ１０２５）、誘導体化（ステップＳ１０２６）、固形物の除去（ステップＳ１０２７）、分析（ステップＳ１０２８）を順次行う。なお、代謝産物の抽出（ステップＳ１０２３）から分析（ステップＳ１０２８）は、図１０Ａを参照して説明した代謝産物の抽出（ステップＳ１０１４）から分析（ステップＳ１０１９）と同様にして行うことができる。
　図１０Ｃは、培養液Ｍの培養上清から分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ｃに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０３１）。サンプリングは、例えば、培養液５０μＬを採取する。次いで、培養液Ｍの回収を行う（ステップＳ１０３２）。培養液Ｍの回収は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。そして、凍結乾燥（ステップＳ１０３３）、誘導体化（ステップＳ１０３４）、固形物の除去（ステップＳ１０３５）、分析（ステップＳ１０３６）を順次行う。なお、凍結乾燥（ステップＳ１０３３）から分析（ステップＳ１０３６）は、図１０Ａを参照して説明した凍結乾燥（ステップＳ１０１６）から分析（ステップＳ１０１９）と同様にして行うことができる。
　図１０Ｄは、バイオマス（タンパク質）加水分解物を得て分析を行うまでに実施される前処理の一例を示している。図１０Ｄに示すように、まず、培養液Ｍからサンプリングを行う（ステップＳ１０４１）。サンプリングは、例えば、乾燥バイオマス１ｍｇ分を採取する。次いで、細胞の回収を行う（ステップＳ１０４２）。細胞の回収は、例えば、１００００×ｇで５分遠心して行う。次いで、細胞の洗浄を行う（ステップＳ１０４３）。細胞の洗浄は、例えば、蒸留水を用いて１００００×ｇで５分、２回遠心して行う。次いで、細胞の加水分解を行う（ステップＳ１０４４）。細胞の加水分解は、例えば、遠心して得られた沈殿物（ペレット）と６Ｍ　ＨＣｌ溶液５０μＬとをチューブに入れ、２４時間、１０５℃で処理する。次いで、中和反応を行う（ステップＳ１０４５）。中和反応は、例えば、６Ｍ　ＮａＯＨ溶液を用いて行う。次いで、ろ過を行う（ステップＳ１０４６）。ろ過は、例えば、ポアサイズ０．２μｍの遠心式限外ろ過フィルターを用い、１００００×ｇで５分遠心して行う。そして、凍結乾燥（ステップＳ１０４７）、誘導体化（ステップＳ１０４８）、固形物の除去（ステップＳ１０４９）、分析（ステップＳ１０５０）を順次行う。なお、凍結乾燥（ステップＳ１０４７）から分析（ステップＳ１０５０）は、図１０Ａを参照して説明した凍結乾燥（ステップＳ１０１６）から分析（ステップＳ１０１９）と同様にして行うことができる。
　なお、図１０Ａから図１０Ｄに示すいずれの前処理も、試薬の混合、温度制御によるインキュベーション、遠心分離、乾燥のプロセスが基本となる。また、必要な装置は、混合器、温調器、遠心分離機、乾燥機であり、これらの装置を用いたプロセスの組合せとなる。上記プロセスは手技で行うことが可能であるが、各ステップを実行する装置と、各装置の間のサンプルの移送とをロボットなどで操作する自動化で行うことが好ましい。このようにすると、前処理の確実性が向上し、短時間化及び省力化を図ることができる。
（分析手段４による分析）
　スクリーニング装置１では、例えば、細胞の細胞増殖期中や、細胞増殖期が過ぎて生産物生成期に入った後、つまり、定常状態に達した後など、適宜のタイミングで培養手段３から培養液Ｍをサンプリングし、分析手段４で細胞の状態を分析する。また、分析手段４は、分析した細胞の状態を反映する、例えば、生産物生成速度、栄養基質消費速度、老廃物などの副生成物分泌速度、細胞増殖速度、細胞内代謝反応速度などの情報を適宜の手法によって分析し、得られた分析値を解析値算出手段５に送信する。分析手段４で分析され得るこれらの分析対象に関する分析方法は、例えば以下のようなものである。
（分析対象Ｉ：生産物生成速度）
　生産物生成速度を求めるために、まず培養手段３内の生産物の濃度を分析する。例えば、目的とする生産物がタンパク質である場合におけるタンパク質の濃度は以下のようにして分析することができる。
　タンパク質の定量ではＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法を用いることができる。ＥＬＩＳＡ法は、測定対象のタンパク質と抗原抗体反応を示す抗体を用い、結合した抗体の蛍光又は酵素活性により、測定対象のタンパク質の濃度を算出する。ＥＬＩＳＡ法には、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などの方法があるが、いずれの方法で測定してもよい。
　培養におけるタンパク質の濃度の経時変化を測定し、単位時間、単位細胞数あたりの生成量に換算することで、生産物生成速度を求めることができる。
（分析対象ＩＩ：栄養基質消費速度）
（分析対象ＩＩＩ：副生成物分泌速度）
　栄養基質消費速度及び副生成物分泌速度（代謝物分泌速度）を求めるために、まず培養手段３内の栄養基質濃度及び副生成物濃度を分析する。なお、栄養基質とは、培地成分のうち、細胞の成長や生産物の生成に必要なものをいい、例えば、無機成分、炭素源、ビタミン類、アミノ酸類などが挙げられる。また、副生成物とは、細胞が成長したり、生産物を生成したりする過程において、副産物として生成されるものをいい、例えば、炭酸ガス、乳酸、アンモニア、ピルビン酸、クエン酸などが挙げられる。
　栄養基質濃度及び副生成物濃度の測定は、例えば、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフ－タンデム質量分析計（ＧＣ／ＭＳ－ＭＳ）などを用いて、細胞を除いた培養液Ｍ中の成分を測定する。これらの分析法はいずれも、培養液Ｍ中の多項目の成分を一度に測定することができる。
　培養における栄養基質濃度及び副生成物濃度の経時変化をそれぞれ測定し、単位時間あたりの消費量及び生成量に換算することで、栄養基質消費速度及び副生成物分泌速度をそれぞれ求めることができる。
（分析対象ＩＶ：細胞増殖速度）
　細胞増殖速度を求めるために、まず培養手段３内の細胞数を分析する。細胞数の測定は、トリパンブルー染色法及び血球計算盤を用いた顕微鏡観察により行うことができる。なお、細胞数の測定は、乾燥菌体重量法、濁度法、静電容量法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）測定、フローサイトメトリー法などの他の方法を用いて行うこともできる。
　ここで、生細胞数をＸ、比増殖速度（細胞増殖速度）をμ、時間をｔとすると、細胞増殖速度μＸは式１の関係になる。
 
μＸ＝ｄＸ／ｄｔ　　　・・・式１
 
　異なる時間の２点の生細胞数が分かれば、式１を用いて比増殖速度を求めることができる。なお、異なる時間の２点のデータから比増殖速度を求めた際に、誤差の影響が無視できなくなった場合は、対数増殖している培養液Ｍを経時的にサンプリングし、より多くのデータを基に比増殖速度を推定してもよい。例えば、培養時間を横軸、生細胞数の対数値を縦軸として散布図にプロットし、その傾きを最小二乗法により計算する。このグラフが直線で得られない場合は、対象の細胞は指数増殖しておらず、培養期間中に何らかの制限因子が存在することを意味している。
（分析対象Ｖ：細胞内代謝反応速度）
　代謝反応速度の分析は、前処理手段４２で処理したサンプルをＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳや核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance：ＮＭＲ）装置などで分析することで、細胞内の中間代謝物の同位体割合を分析する。なお、この細胞内代謝反応速度を分析するため、また、後記する代謝解析を行うため、後述するように、第１培養工程Ｓ２０（図１２参照）で同位体標識基質を用いて細胞培養を行うのが好ましい。
　培養における細胞内の中間代謝物の同位体割合の経時変化を測定し、単位時間あたりの中間代謝物の同位体割合に換算することで、細胞内代謝反応速度を求めることができる。
（分析対象ＶＩ：細胞呼吸速度）
　細胞呼吸速度の分析は、酸素により消光するリン光性プローブ（例えば、ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓなど）を用いて経時的に酸素消費速度を測定することで行うことができる。
　以上に説明した分析対象Ｉ～ＶＩで得られた分析結果は、解析値算出手段５に送信され、入力値として使用される。
（解析値算出手段５）
　図５に示す解析値算出手段５は、分析手段４で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する装置である。つまり、解析値算出手段５は、細胞Ｃ内の代謝速度を計算するための装置である。代謝解析を行う方法としては、同位体標識基質を用いる方法と同位体標識基質を用いない方法とがあり、本実施形態においてはいずれも採用することができる。なお、同位体標識基質を用いる方法を採用すると、（１）可逆反応での前向き、及び後ろ向き反応の反応速度の解析、（２）リサイクルを含む代謝経路の反応速度の解析、（３）分岐してまた合流するような代謝経路の反応速度の解析が可能であり、代謝解析の精度が上がるため好ましい。
　同位体標識基質を用いる方法としては、例えば、１３Ｃ代謝フラックス解析法（13C-metabolic flux analysis；１３Ｃ－ＭＦＡ）を好適に採用し得る。１３Ｃ－ＭＦＡは、１３Ｃで標識された供給炭素原子が細胞内で代謝された場合や代謝経路ネットワークの異なる経路を通った場合に、同位体分布が異なることを利用する方法であり、同位体の収支から代謝反応速度を求めることができる。
　同位体標識基質を用いない方法としては、例えば、代謝量論式に基づく代謝反応速度解析法（flux balance analysis；ＦＢＡ）を好適に採用し得る。ＦＢＡは、培養中の細胞の代謝物濃度の経時変化を計測し、代謝物速度と物質収支から測定できない代謝反応速度を求めることができる。
　解析値算出手段５の一例として、同位体標識基質を用いて代謝解析を行う代謝フラックスの分析方法について以下に説明する。
　図１１は、代謝フラックスの分析方法の概念を示す説明図である。
　図１１に示すシミュレーションでは、最初にランダムな代謝フラックスの値（代謝反応速度初期値（乱数））（図１１のＲ１～Ｒ８）を与え、代謝経路モデルを基に、定常状態での細胞Ｃ内の各代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚに含まれる同位体炭素の数の比を計算する。この計算値と、分析手段４で分析した（実測した）細胞Ｃ内の代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚの同位体炭素数比とを比較する。そして、同位体比率分布について統計学的に有意差がない場合（一致する場合）は、推定代謝フラックスと決定される。一方、同位体比率分布について統計学的に有意に差がある場合（不一致となる場合）は、シミュレーションによる代謝物質中の同位体数炭素比の値を実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値との平均自乗誤差が最小となるように、シミュレーションによる代謝フラックスの値を補正する。この補正は、例えば、ＱＰ（Quadratic Programming）部分問題法を適用することにより行うことができる。ＱＰ部分問題法は、生成された特定の代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚの同位体炭素数比と、シミュレーションによる特定の代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚの同位体炭素数比との間に統計学的な有意差が生じる場合に、両者間の平均自乗誤差が予め設定された所定範囲内に収まり、最小となるように、先にシミュレーションにより得た代謝経路Ｒ１～Ｒ８におけるそれぞれの代謝フラックスの値の中で、当該誤差に関係する代謝経路Ｒ１～Ｒ８における代謝フラックスの値を補正するというものである。前記したように、シミュレーションによる結果が不一致となる場合、補正した代謝フラックスで同位体炭素比を計算し、同位体比率分布について統計学的な有意差がなくなるまで実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値を比較するという操作を繰り返す。シミュレーションによる結果が一致する場合、その結果により代謝反応速度（代謝フラックス）を決定する。
　なお、解析値算出手段５による解析値の算出は、培養細胞が定常状態となった後に、前記代謝解析を行うことが好ましい。このようにすると、代謝解析を安定的に行うことができる。また、定常状態の判別指標が、培養細胞の栄養基質消費速度、培養細胞の副生成物分泌速度、及び培養細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ又は２つ以上を組み合わせたものであることが好ましい。このようにすると、培養細胞が定常状態であるか否かの判別を容易且つ確実に行うことができる。培養細胞が定常状態であるか否かの判別は、解析値算出手段５が分析手段４で得られた分析結果に基づいて行うのが好ましい。図５に示すように、解析値算出手段５はそのような判別を行うための判別手段５１を有し、当該判別手段５１によって培養細胞が定常状態であることを確認してから、前記解析値の算出を行うのが好ましい。このようにすると、定常状態でない培養細胞に対して行う代謝解析を避けることができるので、省力化を図ることができる。なお、定常状態の判別については後述する。
（代謝データベースＤＢ）
　図５に示す代謝データベースＤＢは、ＤＯ、Ｔｅｍ、ｐＨなどの培養環境因子と各代謝反応速度式との相関を収集した装置である。代謝データベースＤＢは、後記する培養条件計算手段６１が最適培養条件を計算する際に、予め保存されている相関モデルを当該培養条件計算手段６１に提供する。なお、図１１を参照して代謝反応の例及び相関モデルの例を説明すると、それぞれ以下のように示すことができる。ここで、以下に示す代謝反応の例及び相関モデルの例において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｚは代謝物であり、ｆは反応速度であり、ｐＨ、ＤＯ、Ｔｅｍは培養環境因子であって、ＤＯは溶存酸素濃度であり、Ｔｅｍは温度である。
〔代謝反応の例〕
　代謝反応Ｎｏ．Ｒ３：Ａ→Ｂ
　代謝反応Ｎｏ．Ｒ５：Ｂ→Ｃ
　代謝反応Ｎｏ．Ｒ７：Ｃ→Ｚ
　　　　　・
　　　　　・
　　　　　・
〔相関モデルの例〕
　代謝反応速度式Ｒ３：ｆＡ→Ｂ∝ｐＨ，ＤＯ
　代謝反応速度式Ｒ５：ｆＢ→Ｃ∝Ｔｅｍ
　代謝反応速度式Ｒ７：ｆＣ→Ｚ∝ＤＯ，Ｔｅｍ
　　　　　・
　　　　　・
　　　　　・
　このように、相関モデルは、培養条件をパラメータとする代謝反応速度式を用いて構成されていることが好ましい。このようにすると、培養条件計算手段６１で培養条件を計算する際に用いられる当該パラメータと、計算されて得られた培養条件との一致性を高くすることができる。
　代謝反応速度の例としては、前記「＜図４に示す反応Ｎｏ．及び代謝反応式＞」における代謝反応式が挙げられる。なお、各代謝反応式における反応速度は、前記「（分析対象Ｖ：細胞内代謝反応速度）」で述べた方法で求めることができる。また、培養環境因子の例としては、ＤＯ、ＤＣＯ２、ｐＨ、温度（Ｔｅｍ）、せん断応力、栄養基質濃度、代謝物濃度、浸透圧などが挙げられる。なお、代謝反応速度及び培養環境因子はこれらに限定されるものではない。
　代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルは、論文、雑誌、書籍、実験データなどが新たに公開されたり、スクリーニングにおける培養結果（例えば、前記解析値）が得られたりした場合に、前記代謝反応の例及び相関関係の例に示したような形式でデータベース化を行うことにより、繰り返し補正することができる。なお、この相関モデルの繰り返し補正は、後記する培養条件計算手段６１を行う前に行うことができる。この相関モデルの繰り返し補正は、例えば、図５に示す培養条件シミュレータ６の相関モデル補正手段６０で行うことができる。相関モデル補正手段６０は、培養条件シミュレータ６が有する一機能である。この相関モデル補正手段６０では、前記解析値と、代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルとを比較し、必要に応じて補正計算を行って、前記したように相関モデルの補正を行う。前記解析値としては、前記〔相関モデルの例〕における代謝反応式Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７…などが挙げられる。相関モデルの補正は、例えば、前記培養結果（具体的には、前記培養結果から算出される相関モデル）に対して、代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルが±１０％を超える場合に行うのが好ましい。
（培養条件計算手段６１）
　図５に示す培養条件計算手段６１は、予め設定された又は相関モデル補正手段６０で補正された相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件（最適培養条件）を計算し、前記培養手段３で設定されている培養条件を前記計算した培養条件（最適培養条件）に変更する装置である。なお、培養条件計算手段６１は、培養条件シミュレータ６が有する一機能である。培養条件計算手段６１は、例えば、目標値設定手段２で設定された培養細胞の代謝反応に関する目標値に近似させるため、前記相関モデルに対して特定の培養条件、つまり特定の培養環境因子を適用して細胞内代謝反応モデルを設定する。そして、培養条件計算手段６１は、この細胞内代謝反応モデルが前記目標値に最も近くなる培養条件を計算する。特定の培養条件は、前記した培養環境因子について設定された一定の値又は変動する値であり、前記した代謝データベースＤＢに保存されているデータに基づいて決定することができる。このようにして計算される計算値としては、相関モデルが有する代謝反応式によって算出される値の積算値などを挙げることができるが、これに限定されない。なお、前記変更した培養条件は培養手段３に送られ、設定されていた培養条件がこれに変更される。培養条件が変更されたら、培養手段３は、当該変更された培養条件で次回の細胞培養を行う。
（スクリーニング手段６２）
　図５に示すスクリーニング手段６２は、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングする装置である。なお、スクリーニング手段６２は、培養条件シミュレータ６が有する一機能である。スクリーニング手段６２は、例えば、選定手段６３及び選別手段６４を有している。
　選定手段６３は、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から最適な培養条件を選定する手段である。
　選別手段６４は、前記最適な培養条件で培養された細胞内の代謝反応速度や目的物質の生成量などを評価して細胞培養用細胞株を選別する手段である。
　スクリーニング手段６２は、選定手段６３による最適な培養条件の選定と、選別手段６４による細胞株の選別とにより、前記したように、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングすることができる。
（制御手段７）
　図５に示す制御手段７は、ＣＰＵ及びハードディスクドライブなどの記憶媒体を備えた汎用コンピュータやパーソナルコンピュータなどである。制御手段７は、当該記憶媒体に所定のプログラムを記憶させておき、これを読み出すことで制御手段７を所定の手段として機能させる。
　制御手段７は、培養条件計算手段６１から送られてきた培養条件（最適培養条件）の各種パラメータの値を受信し、培養手段３の運転制御を行う。例えば、温度を上げる場合、培養手段３が具備する温度調節手段３６に熱を加え、温度を下げる場合は、水冷装置を駆動することで、目的の温度に調整する。ｐＨを上げる場合は、アルカリ溶液を培養手段３内に添加し、ｐＨを下げる場合は、酸性溶液を培養手段３内に添加する。溶存酸素濃度を上げる場合は、培養手段３内の培養液Ｍに空気又は純酸素を通気し、溶存酸素濃度を下げる場合は、培養手段３内の培養液Ｍに窒素を通気する。せん断応力を上げる場合は、攪拌手段３５の攪拌翼の回転数を上げ、せん断応力を下げる場合は、攪拌手段３５の攪拌翼の回転数を下げる。その他のパラメータに関してもそれぞれのパラメータの制御に適切な方法で制御する。
［４．スクリーニング方法の実施形態］
　次に、スクリーニング方法の実施形態について説明する。なお、以下の説明において、スクリーニング装置１と同じ要素については同じ符号を付して詳細な説明は省略する。
　図１２は、本実施形態に係るスクリーニング方法の内容を説明するフローチャートである。
　図１２に示すように、スクリーニング方法は、目標値設定工程Ｓ１０と、第１培養工程Ｓ２０と、分析工程Ｓ３０と、解析値算出工程Ｓ４０と、培養条件計算工程Ｓ５０と、第２培養工程Ｓ６０と、スクリーニング工程Ｓ７０とを含む。
　目標値設定工程Ｓ１０は、培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する工程である。この目標値設定工程Ｓ１０は、前記した目標値設定手段２で行うことができる。
　第１培養工程Ｓ２０は、予め設定されている培養条件で培養細胞を培養する工程である。この第１培養工程Ｓ２０は、前記した培養手段３で行うことができる。
　分析工程Ｓ３０は、第１培養工程Ｓ１０で培養した培養細胞を含む培養液を分析する工程である。分析工程Ｓ３０で行う分析は、培養細胞が定常状態であるか否かを判別するために、例えば、生産物生成速度、生産物の濃度、培地成分などの指標に関する分析値を得るために行う。この分析工程Ｓ３０は、前記した分析手段４で行うことができる。
　解析値算出工程Ｓ４０は、分析工程Ｓ３０で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する工程である。この解析値算出工程Ｓ４０は、前記した解析値算出手段５で行うことができる。なお、本実施形態においては、この解析値算出工程Ｓ４０に先立って、分析工程Ｓ３０で得られた分析結果に基づいて培養細胞が定常状態であるか否かの判別を行う判別工程Ｓ４１（図１２において図示せず。図１３参照。）を有していてもよい。そして、解析値算出工程Ｓ４０は、培養細胞が定常状態となった後に、前記代謝解析を行うのが好ましい。このようにすると、定常状態でない培養細胞に対して行う代謝解析を避けることができるので、省力化を図ることができる。判別工程Ｓ４１は、図５に示す判別手段５１で行うことができる。
　なお、解析値算出工程Ｓ４０（具体的には、判別工程Ｓ４１）における定常状態の判別指標は、培養細胞の栄養基質消費速度、培養細胞の副生成物分泌速度、及び培養細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ又は２つ以上を組み合わせたものであるのが好ましい。このようにすると、培養細胞が定常状態であるか否かの判別を容易且つ正確に行うことができる。
　培養条件計算工程Ｓ５０は、相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記第１培養工程Ｓ２０で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する工程である。この培養条件計算工程Ｓ５０は、前記した培養条件計算手段６１で行うことができる。なお、本実施形態においては、この培養条件計算工程Ｓ５０の前工程として、相関モデル補正工程Ｓ５１（図１２において図示せず。図１３参照）を有していてもよい。相関モデル補正工程Ｓ５１は、スクリーニングにおける培養結果、例えば、解析値算出工程Ｓ４０で得られた解析値に基づいて代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルの補正を行う工程である。相関モデル補正工程Ｓ５１は、図５に示す相関モデル補正手段６０で行うことができる。
　第２培養工程Ｓ６０は、培養条件計算工程Ｓ５０で変更した培養条件で前記培養細胞と同じ細胞株の培養細胞を培養し、得られた培養液Ｍを前記分析工程Ｓ３０に送る工程である。この第２培養工程Ｓ６０は、第１培養工程Ｓ２０と同様、前記した培養手段３で行うことができる。つまり、第１培養工程Ｓ２０と第２培養工程Ｓ６０とは、予め設定されている培養条件で培養細胞を培養するか、培養条件計算工程Ｓ５０で変更した培養条件で培養細胞を培養するかという点で異なっているだけであり、工程の内容としては実質的に同様である。
　そして、本実施形態においては、前記分析工程Ｓ３０から前記第２培養工程Ｓ６０までを複数の培養細胞及び培養条件について実施する。
　スクリーニング工程Ｓ７０は、実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングする工程である。このスクリーニング工程Ｓ７０は、前記したスクリーニング手段６２で行うことができる。
（スクリーニング方法のより詳しい一態様）
　以下に、スクリーニング方法のより詳しい一態様について説明する。
　図１３は、本実施形態に係るスクリーニング方法のより詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。
　図１３に示すように、スクリーニング方法は、目標値設定工程Ｓ１０と、第１培養工程Ｓ２０と、サンプリング工程Ｓ３１と、前処理工程Ｓ３２と、分析工程Ｓ３０と、判別工程Ｓ４１と、解析値算出工程Ｓ４０と、相関モデル補正工程Ｓ５１と、培養条件計算工程Ｓ５０と、第２培養工程Ｓ６０と、選定工程Ｓ７１と、選別工程Ｓ７２とを含んでいる。この態様では、サンプリング工程Ｓ３１から第２培養工程Ｓ６０までを複数の培養細胞及び培養条件で実施する。
　なお、これらの工程のうち、目標値設定工程Ｓ１０、第１培養工程Ｓ２０、分析工程Ｓ３０、解析値算出工程Ｓ４０、培養条件計算工程Ｓ５０及び第２培養工程Ｓ６０は、前述した各工程と同様であるので前述した説明を参照し、ここでの説明は省略する。
　サンプリング工程Ｓ３１は、培養液Ｍを無菌的にサンプリングする工程である。このサンプリング工程Ｓ３１は、前記したサンプリング手段４１で行われる。
　前処理工程Ｓ３２は、サンプリングした培養液Ｍを分析するために必要な前処理を施す工程である。この前処理工程Ｓ３２は、前記した前処理手段４２で行われる。
　判別工程Ｓ４１は、分析工程Ｓ３０で得られた分析値から培養細胞が定常状態であるか否かを判別する工程である。判別工程Ｓ４１による判別の結果、培養細胞が定常状態でない場合は、そのまま培養を行う（第１培養工程Ｓ２０に戻る）。判別工程Ｓ４１による判別の結果、培養細胞が定常状態である場合は、解析値算出工程Ｓ４０に進む。この判別工程Ｓ４１は、前記したように、解析値算出手段５の有する判別手段５１（図５参照）で行われる。
　相関モデル補正工程Ｓ５１は、前記相関モデルをスクリーニングにおける培養結果で補正する工程である。つまり、相関モデル補正工程Ｓ５１は、例えば、解析値算出工程Ｓ４０で得られた解析値に基づいて代謝データベースＤＢに保存されている相関モデルの補正を行う工程である。この相関モデル補正工程Ｓ５１は、前記したように、培養条件シミュレータ６の有する相関モデル補正手段６０（図５参照）で行われる。相関モデル補正工程Ｓ５１は、培養条件を変更してスクリーニングを行う度に、つまり、第２培養工程Ｓ６０、分析工程Ｓ３０、解析値算出工程Ｓ４０、培養条件計算工程Ｓ５０を行う度に、スクリーニング方法を終了するまで相関モデルを繰り返し補正することができる。
　選定工程Ｓ７１及び選別工程Ｓ７２は、前記したスクリーニング工程Ｓ７０で行われる工程である。
　選定工程Ｓ７１は、複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から最適な培養条件を選定する工程である。選定工程Ｓ７１は、例えば、前記した細胞増殖速度、細胞周期及び代謝フラックスのうちの少なくとも１つの解析結果に基づいて最適な培養条件を選定するのが好ましい。この選定工程Ｓ７１は、前記した選定手段６３で行われる。
　選別工程Ｓ７２は、前記最適な培養条件で培養された細胞内の代謝反応速度や目的物質の生成量などを評価して、細胞培養用細胞株を選別する工程である。この選別工程Ｓ７２は、前記した選別手段６４で行われる。
（スクリーニング方法のさらに詳しい一態様）
　次に、図１４を参照してスクリーニング方法のさらに詳しい一態様を説明する。図１４は、本実施形態に係るスクリーニング方法のさらに詳しい一態様の内容を説明するフローチャートである。
　図１４に示すように、スクリーニング方法は、最初に、代謝経路モデルと目標の代謝反応速度を設定する（ステップＳ１４０１）。このステップＳ１４０１は目標値設定工程Ｓ１０で行う。
　次に、培養手段３に最初の培養条件を設定し（培養条件設定、ステップＳ１４０２）、培養を開始する（ステップＳ１４０３）。ここで、培養には同位体標識基質を用いるのが好ましい。このようにすると、後述する代謝解析をより正確に行うことができる。
　なお、最初の培養条件の設定は、予め設定されている標準条件とすることができる。標準条件は任意に設定することができる。また、培養開始直後の培養細胞は非定常状態であるため、定刻ごとにサンプリングを行う（ステップＳ１４０４）。前記したステップＳ１４０２、Ｓ１４０３は、第１培養工程Ｓ２０で行い、ステップＳ１４０４は分析工程Ｓ３０（具体的にはサンプリング工程Ｓ３１）で行う。
　そして、生産物の濃度や培地成分などを分析する（ステップＳ１４０５）。具体的には、生産物の濃度や培地成分などのほか、細胞の状態を反映する生産物生成速度、栄養基質消費速度、副生成物分泌速度などを１つ以上分析する。このステップＳ１４０５は、必要に応じて前記した前処理工程Ｓ３２を行った後、分析工程Ｓ３０で行う。
　ステップＳ１４０５における分析値について経時変化がなく、一定値となったときを定常状態と判別する（ステップＳ１４０６で“定常”）。一方、前回サンプリング時と比較して、生産物の濃度、培地成分、生産物生成速度、栄養基質消費速度、副生成物分泌速度、細胞内代謝フラックスなどの値が経時変化していれば、定常状態に達していないと判断する（ステップＳ１４０６で“非定常”）。そして、ステップＳ１４０７で非定常の期間を分析し、当該期間が所定値を超えている場合、例えば、設定したサンプリング回数又は培養時間を経過しても定常状態が得られない場合、アラートを表示する（ステップＳ１４０８）。そして、非定常の期間を分析し、当該期間が所定値以下である場合、ステップＳ１４０３に戻って培養を継続する。
　前記したステップＳ１４０５は分析工程Ｓ３０（及び前処理工程Ｓ３２）で行い、ステップＳ１４０６は判別工程Ｓ４１で行う。
　そして、培養細胞が定常状態である場合（ステップＳ１４０６で“定常”である場合）、生産物生成速度、細胞増殖速度、代謝フラックスなどの代謝解析を行い、解析値を得る（ステップＳ１４０９）。このステップＳ１４０９では、前記したように、必要に応じてＱＰ部分問題法などによりシミュレーションを行って、代謝反応速度（代謝フラックス）を決定するのが好ましい。
　そして、代謝解析で得られた解析値（例えば、代謝反応速度の解析値）を記録した後、当該解析値と、前回（Ｎ－１回目）の計算で求めた最適培養条件での最適値（例えば、代謝反応速度の最適値）とを比較する（ステップＳ１４１０）。但し、この比較が１回目である場合は、前記最適値の替わりに、ステップＳ１４０１で設定した目標値（例えば、目標の代謝反応速度など）とすることができる。
　代謝解析で得られた解析値とＮ－１回目の計算で求めた最適値とが一致しない場合（ステップＳ１４１０で“不一致”）、培養環境因子と代謝反応速度などとの相関モデルを培養実験から解析した代謝反応速度に合うように相関モデルを補正する（ステップＳ１４１１）。
　そして、補正後の相関モデルを用いて、ステップＳ１４０１で設定した目標値に最も近い培養条件を決定する（ステップＳ１４１２）。その後、ステップＳ１４０２に戻り、前回設定していた培養条件を前記決定した培養条件に変更して設定し（ステップＳ１４０２）、培養手段３で培養を開始する（ステップＳ１４０３）。
　一方、代謝解析で得られた解析値とＮ－１回目の計算で求めた最適値が一致する場合（ステップＳ１４１０で“一致”）、培養環境因子と代謝反応速度との相関モデルは精度が高く、このときの培養条件は設定した目標値に近いように最適化されていることになる。
　他の候補細胞株がある場合、さらに他の候補細胞株で上記と同様の処理を行った結果と比較し、最終的に目標値に最も近い（生産性が最も良い）細胞株及び培養条件を選定・選別し（ステップＳ１４１３）、スクリーニングを完了する。
　なお、前記したステップＳ１４０９～Ｓ１４１０は培養条件計算工程Ｓ５０で行う。ステップＳ１４１１、Ｓ１４１２は相関モデル補正工程Ｓ５１で行う。ステップＳ１４１２及びステップＳ１４０２後の培養（ステップＳ１４０３）は第２培養工程Ｓ６０で行う。ステップＳ１４１３はスクリーニング工程Ｓ７０（具体的には、選定工程Ｓ７１及び選別工程Ｓ７２）で行う。
（変形例）
　上記手順は一例である。他の変形例として、例えば、代謝解析において（ステップＳ１４０９）、同位体標識基質を用いた代謝解析の代わりに、培養液Ｍ中の代謝物を基に代謝フラックスを推定する方法を用いても構わない。また、ｍＲＮＡの計測により代謝フラックスを推定する方法であっても構わない。これらのようにすると、同位体元素を用いないので、操作や培養液の廃棄などが簡便であり、また、低コストで行うことができる。
　また、図５においては、解析値算出手段５と培養条件シミュレータ６と制御手段７とを別個の装置として図示しているが、これらの手段を実現するプログラムを格納した１つの装置（コンピュータ）とすることができる。
　以上に説明した本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置によれば、目標値（例えば、代謝反応速度など）に近い細胞株及び培養条件を簡便にスクリーニングできる。また、スクリーニングの過程で培養環境因子と代謝反応速度などの目標値の関係を定式化（モデル化）することもできる。本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置は、少ない培養条件で最も効率のよい代謝反応経路を見つけることができるため、低コストでスクリーニングできる。また、網羅的な代謝経路のモデル構築を行うため、副生成物等の抑制を効率的に行うことができ、本実施形態に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置で選別された細胞株を利用することで品質にばらつきが少なく、高い生産性で目的物質を得ることができる。
　以上、本発明に係る細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置について実施形態により詳細に説明したが、本発明の主旨はこれに限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　Ｓ１０　目標値設定工程
　Ｓ２０　第１培養工程
　Ｓ３０　分析工程
　Ｓ４０　解析値算出工程
　Ｓ５０　培養条件計算工程
　Ｓ６０　第２培養工程
　Ｓ７０　スクリーニング工程
　１、１Ａ　スクリーニング装置
　２　　　目標値設定手段
　３　　　培養手段
　４　　　分析手段
　５　　　解析値算出手段
　６　　　培養条件シミュレータ
　６１　　培養条件計算手段
　６２　　スクリーニング手段
　７　　　制御手段
　ＤＢ　　代謝データベース

Claims (8)

  1. 　培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定工程と、
    　予め設定されている培養条件で培養細胞を培養する第１培養工程と、
    　培養した前記培養細胞を含む培養液を分析する分析工程と、
    　前記分析工程で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出工程と、
    　相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記第１培養工程で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算工程と、
    　前記変更した培養条件で前記培養細胞と同じ細胞株の培養細胞を培養し、得られた培養液を前記分析工程に送る第２培養工程と、
    　を含み、前記分析工程から前記第２培養工程までを複数の培養細胞及び培養条件について実施し、
    　前記実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング工程を含む
    　ことを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
  2. 　請求項１において、
    　前記第１培養工程及び前記第２培養工程で同位体標識基質を用いることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
  3. 　請求項１において、
    　前記解析値算出工程は、前記培養細胞が定常状態となった後に、前記代謝解析を行うことを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
  4. 　請求項３において、
    　前記定常状態の判別指標が、前記培養細胞の栄養基質消費速度、前記培養細胞の副生成物分泌速度、及び前記培養細胞の細胞呼吸速度のうちのいずれか１つ又は２つ以上を組み合わせたものであることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
  5. 　請求項１において、
    　前記相関モデルが、培養条件をパラメータとする代謝反応速度式を用いて構成されていることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
  6. 　請求項１において、
    　前記解析値算出工程と培養条件計算工程との間に、前記相関モデルをスクリーニングにおける培養結果で補正する相関モデル補正工程を含んでいることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング方法。
  7. 　培養細胞の代謝反応に関する目標値を設定する目標値設定手段と、
    　設定又は変更された培養条件で培養細胞を培養する培養手段と、
    　前記培養手段で培養した培養細胞を含む培養液を分析する分析手段と、
    　前記分析手段で得られた分析結果に基づいて代謝解析を行い、解析値を算出する解析値算出手段と、
    　相関モデルを用いて前記解析値から前記目標値に最も近くなる培養条件を計算し、前記培養手段で設定されている培養条件を前記計算した培養条件に変更する培養条件計算手段と、
    　複数の培養細胞及び培養条件で実施して得られた前記解析値の中から前記目標値に最も近くなる細胞株及び培養条件をスクリーニングするスクリーニング手段と、
    　を有することを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング装置。
  8. 　請求項７において、
    　前記培養手段が、連続培養であることを特徴とする細胞株及び培養条件のスクリーニング装置。
PCT/JP2018/040709 2017-12-12 2018-11-01 細胞株及び培養条件のスクリーニング方法、及びその装置 WO2019116772A1 (ja)

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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113994281A (zh) * 2019-07-03 2022-01-28 富士胶片株式会社 优化支援装置、方法及程序
WO2021166824A1 (ja) * 2020-02-19 2021-08-26 富士フイルム株式会社 細胞培養プロセス探索方法、細胞培養プロセス探索プログラム、細胞培養プロセス探索装置、及び、学習済みモデル
JPWO2022239479A1 (ja) * 2021-05-13 2022-11-17
EP4339958A1 (en) * 2021-05-13 2024-03-20 Shimadzu Corporation Antibody production assistance method and antibody production assistance program

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008178344A (ja) * 2007-01-24 2008-08-07 Hitachi Plant Technologies Ltd 細胞培養方法及び細胞培養装置
JP2009514532A (ja) * 2005-11-02 2009-04-09 ワイス 哺乳動物細胞を適応させるための方法
JP2014503220A (ja) * 2011-01-14 2014-02-13 ファクルダージ デ シエンシアス イ テクノロジア ダ ユニベルシダデ ノバ デ リスボア 最適の細胞培養培地組成の決定方法
JP2017511688A (ja) * 2014-01-30 2017-04-27 バリタセル リミテッド クローンに由来する産生株細胞のパネルの相対的な流加産生力価を予測する方法
WO2018235441A1 (ja) * 2017-06-21 2018-12-27 株式会社日立製作所 連続培養条件のスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4883067B2 (ja) * 2008-09-29 2012-02-22 株式会社日立プラントテクノロジー 培養装置及び培養方法
JP4824102B2 (ja) * 2009-07-13 2011-11-30 株式会社日立製作所 細胞培養装置
JP2013085516A (ja) * 2011-10-18 2013-05-13 Hitachi Plant Technologies Ltd 細胞培養制御方法、細胞培養制御装置及びこれを備える細胞培養装置
EP3303557B1 (en) * 2015-05-29 2021-05-05 Glycotope GmbH Small scale cultivation method for suspension cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009514532A (ja) * 2005-11-02 2009-04-09 ワイス 哺乳動物細胞を適応させるための方法
JP2008178344A (ja) * 2007-01-24 2008-08-07 Hitachi Plant Technologies Ltd 細胞培養方法及び細胞培養装置
JP2014503220A (ja) * 2011-01-14 2014-02-13 ファクルダージ デ シエンシアス イ テクノロジア ダ ユニベルシダデ ノバ デ リスボア 最適の細胞培養培地組成の決定方法
JP2017511688A (ja) * 2014-01-30 2017-04-27 バリタセル リミテッド クローンに由来する産生株細胞のパネルの相対的な流加産生力価を予測する方法
WO2018235441A1 (ja) * 2017-06-21 2018-12-27 株式会社日立製作所 連続培養条件のスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GADGIL, M.: "Development of a mathematical model for animal cell culture without pH control and its application for evaluation of clone screening outcomes in shake flask culture", JOURNAL OF CHEMICAL TECHNOLOGY & BIOTECHNOLOGY, vol. 90, 2015, pages 166 - 175, XP055690744, DOI: 10.1002/jctb.4302 *

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