WO2019103529A2 - 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법 - Google Patents

세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법 Download PDF

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WO2019103529A2
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
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    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
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    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time

Definitions

  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • One aspect provides a composition for cell freezing preservation.
  • Another aspect provides a cell freezing preservation method comprising the step of adding a cell to a preservative solution comprising the composition.
  • One aspect provides a composition for cell freezing preservation.
  • the composition may comprise glycols, glucose, ascorbic acid, glutamine, tetramethylchromancarboxylic acid or tocopherol.
  • the composition may comprise glycols, glucose, ascorbic acid, glutamine, and tetramethylchromancarboxylic acid or tocopherol.
  • the composition may comprise glycols, glucose, ascorbic acid, glutamine and tetramethylchromancarboxylic acid.
  • the composition may comprise glycols, glucose, ascorbic acid, glutamine and tocopherol.
  • the above composition for cryopreservation functions as a cryoprotectant.
  • the glycols may be those having 1 to 6 carbon atoms or glycol repeating units having 1 to 6 carbon atoms.
  • the glycols may be ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, polypropylene glycol, hexylene glycol, or a combination thereof.
  • the glycols may be ethylene glycol, polyethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, polypropylene glycol, hexylene glycol or combinations thereof.
  • the glycols may be included in the composition at about 0.14% to about 70%.
  • the ethylene glycol may be included in the composition in an amount of about 0.4 to 20%.
  • the polyethylene glycol may be contained in about 1 to 50% of the composition.
  • % means v / v%.
  • the glucose as a kind of sugar, provides an energy source necessary for cell division, survival, or differentiation, and may be contained in the composition at about 0.0025M to about 1.0M, or about 0.005M to about 0.5M.
  • the glucose may be, for example, D - (+) - glucose (Dextrose).
  • Ascorbic Acid has antioxidant function and may be contained in the composition at about 5 uM to about 2000 uM, or about 10 uM to about 1000 uM.
  • the glutamine maintains cell volume and moisture, and may be comprised in the composition at about 0.1 mM to about 40 mM, or about 0.2 mM to about 20 mM.
  • the glutamine may be, for example, L-glutamine.
  • the above-mentioned tetramethylchroman-2-carboxylic acid, trolox, and tocopherol each have an antioxidative function, and the tetramethylchromanecarboxylic acid or 6-hydroxy-2,5,7,8- Tocopherol may be included in the composition at about 5 uM to about 2000 uM or at about 10 uM to about 1000 uM.
  • the composition may comprise phosphate buffered saline (PBS).
  • the composition may be one which does not contain dimethyl sulfoxide (DMSO). Since the composition does not contain DMSO, there is no DMSO toxicity occurring at room temperature, and even when a large scale batch is produced, cells can be preserved without damaging the cells.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the composition may be one which does not contain animal-derived serum.
  • the composition can prevent the formation of ice crystals outside the cells, which is a role of the serum protein during cryopreservation, without containing the serum.
  • cell contamination by serum proteins can be prevented during cryopreservation.
  • the cells may be undifferentiated cells, differentiated cells, or differentiated cells.
  • the cell may be a stem cell.
  • stem cell means a cell having potency and self-renewal ability. Stem cells are divided into pluripotency, multipotency, or unipotency depending on the differentiation ability.
  • the stem cells include embryonic stem cells (ESCs), adult stem cells (undifferentiated cells present in each tissue and organs), and stem cells (induced a pluripotent stem cell (iPSC) (a cell in which a gene and / or a protein is inserted into somatic cells to induce differentiation, or an induced pluripotent stem cell).
  • ESCs embryonic stem cells
  • adult stem cells undifferentiated cells present in each tissue and organs
  • iPSC induced a pluripotent stem cell
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cell MSC
  • MSC mesenchymal stem cell
  • the mesenchymal stem cells are cells that aid in the production of fat, cartilage, bone, bone marrow stroma, muscle, nerve, etc. and can differentiate into various cells such as adipocytes, cartilage cells, skin cells and bone cells .
  • the types and origins of the stem cells are not limited as long as they have the ability to differentiate and self-regenerate.
  • the stem cells may be derived from, for example, mammals, humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice or rabbits.
  • the stem cells may be derived from isolated umbilical cord, placenta, fat, bone marrow, umbilical cord blood or amniotic fluid.
  • isolated means that it is present in an environment different from that of a naturally occurring cell or tissue. Separation of umbilical cord, placenta, fat, bone marrow, umbilical cord blood or amniotic fluid and obtaining stem cells therefrom may be performed by conventional anatomical methods and known methods.
  • the cell may be a CHO cell, a HEK cell, an MCF-7 cell, a MDCK cell, a Vero cell, a bone marrow cell, a peripheral blood cell, a primary cell, a hepatocyte, , Colon, kidney, brain, pancreas, and the like.
  • the composition may be to inhibit damage due to freezing / thawing of cells.
  • freezing and thawing for long-term preservation of cells, cells undergo damage due to temperature changes.
  • the moisture outside the cell first freezes, and as a result, the environment outside the cell forms a salt state rather than the inside of the cell.
  • moisture migration occurs inside the cell, Plasmolysis occurs.
  • cryopreservatives are used. Cryopreservation agents are classified into two categories: cell protective cryoprotectants (colligative cryoprotectants) and cell penetration cryopreservation agents.
  • the cytoprotective cryoprotectants function to inhibit the formation of ice crystals outside the cell, and the cell penetration cryopreservative acts to penetrate the cell membrane and replace the intracellular water and inhibit the formation of ice crystals during freezing do.
  • Cell-infiltrating cryopreservation agents such as DMSO or glycerol have been conventionally used for cryopreservation of cells.
  • toxicity can be imparted to cells when the concentration is high.
  • the composition for cryopreservation of the present invention is used as a cryopreserving agent, the survival rate of the cells can be increased without harmful effect in the cell permeation-type cryopreservation agent.
  • Another aspect provides a cell freezing preservation method comprising the steps of:
  • the method comprising: adding cells to a preservative solution comprising the composition; And a step of cryopreserving the preservation solution to which the cell has been added at -50 ° C to -300 ° C.
  • preservative solution of the present invention means various media generally used for culturing cells.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimum Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10 , F-12, DMEM / F12, MEM- ⁇ , G-MEM
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium MacCoy's 5A medium, AmnioMax complete medium, AminoMaxII complete medium
  • the medium is selected from the group consisting of EBM (Endothelial Basal Medium) medium, Chang's Medium, MesenCult-XF medium, Dulbecco's modified Eagle's medium high glucose medium, and MCDB + DMEM / LG medium (MCDB + Dulbecco's Modified Eagle's medium low glucose medium) And may include one or more.
  • the preservation may be performed in a liquid nitrogen tank or a deep freezer.
  • the liquid nitrogen tank may be maintained at about -100 DEG C to about -300 DEG C, about -150 DEG C to about -250 DEG C, or about -170 DEG C to about -220 DEG C, and the cryogenic refrigerator may be maintained at about -50 DEG C To about -100 < 0 > C, or about-60 < 0 > C to about-90 < 0 > C.
  • the preservation may be 1 day, 2 days, 3 days, 5 days, 10 days, 15 days, 30 days, 2 months, 3 months, 6 months, or more than 1 year.
  • the cells may be undifferentiated cells, differentiated cells, or differentiated cells.
  • the cell may be a stem cell.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or degenerated stem cells.
  • the cells may be in the range of about 0.5 x 10 4 cells to about 1 x 10 8 , about 0.5 x 10 5 cells to about 1 x 10 7 cells, about 1.0 x 10 5 cells to about 0.5 x 10 7 cells, About 2.0 x 10 5 cells to about 2.5 x 10 6 cells, or about 5.0 x 10 5 cells to about 1.0 x 10 6 cells.
  • the cells can be safely protected during cryopreservation and the cell survival rate after thawing can be high.
  • the cell survival rate refers to an individual exhibiting physiological function inherent to the cell. For example, it can be confirmed by counting cells showing green color without being stained blue by trypan blue staining .
  • composition for cryopreservation and the cell cryopreservation method using the same genetic variation or generation variation can be minimized in long-term preservation of cells, and cell survival rate is excellent at freezing and thawing.
  • FIG. 1 is an image showing the shape, survival rate and proliferation rate of stem cells after freezing / thawing the stem cells using the composition for cryopreservation of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the survival rate and proliferation rate of stem cells after freezing / thawing the stem cells using the composition for cryopreservation of the present invention.
  • FIG 3 is a graph showing the size of stem cells after freezing / thawing the stem cells using the composition for cryopreservation of the present invention.
  • Example 1 Preparation of composition for cryopreservation and cell freezing / thawing, cell survival rate, cell proliferation rate, and cell size analysis
  • Ethylene Glycol, Polyethylene Glycol, Glucose, Ascorbic acid, Trolox or a-Tocopherol are added to phosphate buffered saline (PBS) ) And L-glutamine were added thereto, and the mixture was filtered through a filter having a diameter of 0.22 ⁇ to prepare a composition for cell cryopreservation.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the obtained stem cells were added to about 5.0 x 10 5 cells or about 1.0 x 10 6 cells per 1 ml of the composition of 1 to prepare a cell suspension.
  • the prepared suspension was transferred to one vial and stored in a freezer.
  • the frozen container containing isopropanol was used and the vial was stored in a freezer for one day while lowering the temperature to -80 ° C at a rate of about -1 ° C / minute. Thereafter, the frozen containers were transferred to a liquid nitrogen environment at about -196 ° C and frozen and preserved.
  • control 1, w / DMSO commercially available cell freezing preservation compositions
  • control 2, w / o DMSO commercial cell freezing preservation compositions
  • FIG. 1 is an image showing the shape, survival rate and proliferation rate of stem cells after freezing / thawing the stem cells using the composition for cryopreservation of the present invention.
  • the composition for cryopreservation of the present invention when used, it can be seen that the cell shape, survival rate and degree of propagation are similar to those in the case of using a commercially available cryopreservation composition.
  • FIG. 2 is a graph showing the survival rate and proliferation rate of stem cells after freezing / thawing the stem cells using the composition for cryopreservation of the present invention.
  • the composition for cryopreservation of the present invention is used for cryopreservation for a short term and / or a long term (1 week, 4 weeks and 16 weeks), the case of using a commercially available cryopreservation composition, The degree of propagation is similar.
  • FIG. 3 is a graph showing the size of stem cells after freezing / thawing the stem cells using the composition for cryopreservation of the present invention. As shown in Fig. 3, when the composition for cryopreservation of the present invention is used, it can be seen that the size of the cells is similar to that in the case of using a commercially available cryopreservation composition.

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Abstract

세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법에 관한 것으로, 이에 따르면, 세포의 장기간 보존에 있어서 유전적인 변이나 세대적 변이를 최소화할 수 있고, 동결 및 해동시에 세포 생존율이 우수하다.

Description

세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법
세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법에 관한 것이다.
세포를 보존하기 위해 배양하는 경우, 유전적인 변이나 세대적 변이에 의해 그 특성이 변화될 가능성이 높은 것으로 알려져 있으며, 주변 환경 요인에 의해 원치 않는 오염이 발생할 수도 있다. 이러한 유전적 변이나 세대적 변이를 최소화하고, 주변 환경 요인에 의한 오염을 차단하면서 세포를 보존하기 위해 종래 초저온 냉동(ultra freezing) 보존법이 이용되어 왔다. 세포에 대한 초저온 냉동 보존법은 -195℃ 정도의 낮은 온도 조건을 요하고, 세포의 동결/해동(freezing/thawing) 손상을 방지하기 위한 동결 보존제를 필요로 한다. 종래, 15% 글리세롤이 일반적인 동결 보존제로 사용되어 왔으나, 동결/해동 과정에서 완충 기능이 완전하지 않아 세포 손상이 따르는 문제점이 종종 발생할 수 있다. 종래, 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide: DMSO) 또한 동결 보존제로 사용되고 있으나, 고가이며, 과량을 사용하는 경우, 세포에 독성을 줄 수 있다. 따라서, 세포의 보존 효과가 우수하면서도, 세포 동결/해동에 의한 손상을 최소화할 수 있는 동결 보존제의 필요성이 대두되어 왔다.
일 양상은 세포 동결 보존용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 보존액에 세포를 첨가하는 단계를 포함하는 세포 동결 보존 방법을 제공한다.
일 양상은 세포 동결 보존용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 글리콜류, 글루코스, 아스코르브산, 글루타민, 테트라메칠크로만카복실산 또는 토코페롤을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 글리콜류, 글루코스, 아스코르브산, 글루타민, 및 테트라메칠크로만카복실산 또는 토코페롤을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 글리콜류, 글루코스, 아스코르브산, 글루타민 및 테트라메칠크로만카복실산을 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 글리콜류, 글루코스, 아스코르브산, 글루타민 및 토코페롤을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포 동결 보존용 조성물은 동결보존제(cryoprotectant)로서 기능한다.
상기 글리콜류는 탄소수 1 내지 6의 글리콜 또는 탄소수 1 내지 6의 글리콜 반복 단위를 갖는 것일 수 있다. 상기 글리콜류는 에틸렌 글리콜(Ethylene Glycol), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol), 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol), 폴리프로필렌 글리콜(Polyropylene Glycol), 헥실렌 글리콜(Hexylene Glycol) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 글리콜류는 조성물 중에 약 0.14% 내지 약 70%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 에틸렌 글리콜은 조성물 중에 약 0.4 내지 20%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 폴리에틸렌 글리콜은 조성물 중에 약 1 내지 50%로 포함되는 것일 수 있다. 여기서, %는 v/v%를 의미한다.
상기 글루코스는 당의 일종으로서 세포 분열, 생존, 또는 분화에 필요한 에너지원을 제공하며, 조성물 중에 약 0.0025M 내지 약 1.0M, 또는 약 0.005M 내지 약 0.5M로 포함되는 것일 수 있다. 상기 글루코스는 예를 들면 D-(+)-글루코스(Dextrose)인 것일 수 있다. 상기 아스코르브산(Ascorbic Acid)은 항산화 기능을 하며, 조성물 중에 약 5uM 내지 약 2000uM, 또는 약 10uM 내지 약 1000uM로 포함되는 것일 수 있다. 상기 글루타민은 세포의 부피와 수분을 유지시키며, 조성물 중에 약 0.1mM 내지 약 40mM 또는 약 0.2mM 내지 약 20mM로 포함되는 것일 수 있다. 상기 글루타민은 예를 들면 L-글루타민인 것일 수 있다. 상기 테트라메칠크로만카복실산(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, trolox, 트롤록스) 및 토코페롤(Tocopherol)은 각각 항산화 기능을 하며, 상기 테트라메칠크로만카복실산 또는 토코페롤은 조성물 중에 약 5uM 내지 약 2000uM 또는 약 10uM 내지 약 1000uM로 포함되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 인산염 완충 식염수 (phosphate buffered saline: PBS)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide: DMSO)를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 DMSO를 포함하지 않으므로, 상온에서 일어나는 DMSO 독성이 없어, 대규모 배치를 제작하는 경우에도, 세포에 손상을 주지 않으면서 세포를 보존할 수 있다.
상기 조성물은 동물 유래 혈청을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 혈청을 포함하지 않으면서도, 동결 보존시에 혈청 단백질의 역할인, 세포 외부의 얼음 결정이 형성되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 동결 보존시에 혈청 단백질에 의한 세포 오염을 방지할 수 있다.
상기 세포는 미분화 세포, 분화 중인 세포, 또는 분화가 완료된 세포인 것일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다. 용어 "줄기세포"는 분화능 (potency) 및 자기재생 (self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능 (pluripotency), 다분화능 (multipotency) 또는 단일분화능 (unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cell: ESC)(착상 전 배아의 내세포), 성체줄기세포 (adult stem cell) (각 조직 및 장기에 존재하는 미분화된 세포) 및 역분화 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)(체세포에 유전자 및/또는 단백질을 삽입하여 역분화가 유도된 세포, 또는 유도만능 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 용어 "중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell: MSC)"는 성체 줄기세포로서, 다분화능과 자기재생능을 갖고, 증식능이 우수하고 유전적으로 안정화되어 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 연골, 뼈, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포이며, 다양한 세포 예를 들면, 지방세포, 연골세포, 피부세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있다.
상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다. 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수를 분리하는 것 및 이로부터 줄기세포를 수득하는 것은 통상의 해부학적 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것 일수 있다.
또한, 상기 세포는 CHO 세포, HEK 세포, MCF-7 세포, MDCK 세포, Vero 세포, 골수 세포, 말초혈액 세포, Primary 세포, 간세포, 및 조직 유래 세포, 예를 들면, 간, 심장, 폐, 소장, 대장, 신장, 뇌, 췌장 유래의 세포인 것일 수 있다.
상기 조성물은 세포의 동결/해동(freezing/thawing)에 따른 손상을 억제하는 것일 수 있다. 세포의 장기간 보존을 위한 동결 및 재이용을 위한 해동 과정에서 세포는 온도 변화에 따른 손상을 입게 된다. 동결이 진행되면 세포 외부의 수분이 먼저 동결되고, 그 결과 세포 외부의 환경은 세포 내부보다 고염의 상태를 형성하게 되는데, 평형상태를 유지하기 위해 세포 내부의 수분의 이동이 발생하고, 그 결과 원형질 분리(plasmolysis)가 발생한다. 이를 방지하게 위해 동결보존제를 사용하게 되는데, 동결보존제는 세포보호형 속일성 동결보존제(colligative cryoprotectants)와 세포침투형 동결보존제 두가지로 구분된다. 세포보호형 속일성 동결보존제는 세포 밖의 얼음 결정이 형성되는 것을 억제하는 작용을 하고, 세포침투형 동결보존제는 세포막을 침투하여 세포 내 수분을 치환하고 냉동시 얼음 결정이 형성되는 것을 억제하는 역할을 한다. 세포의 냉동 보존에는 세포침투형 동결보존제, 예를 들면, DMSO, 또는 글리세롤이 종래 이용되어 왔다. 하지만, 세포침투형 동결보존제의 경우에는 농도가 높은 경우 세포에 독성을 가할 수 있다. 동결보존제로서 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 사용하는 경우, 세포침투형 동결보존제에서의 유해한 효과 없이도 세포의 생존율을 높일 수 있다.
다른 양상은 하기 단계를 포함하는 세포 동결 보존 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 조성물을 포함하는 보존액에 세포를 첨가하는 단계; 및 상기 세포를 첨가한 보존액을 -50℃ 내지 -300℃에서 동결 보존하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 "보존액"이란 세포의 배양에 일반적으로 쓰이는 각종 배지를 의미한다. 상기 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMaxⅡ complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose)배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB +Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 보존은 액체 질소 탱크 또는 초저온 냉장고(deep freezer)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 질소 탱크는 약 -100℃ 내지 약 -300℃, 약 -150℃ 내지 약 -250℃, 또는 약 -170℃ 내지 약 -220℃로 유지되는 것일 수 있으며, 상기 초저온 냉장고는 약 -50℃ 내지 약 -100℃, 또는 약 -60℃ 내지 약 -90℃로 유지되는 것일 수 있다.
상기 보존은 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 2개월, 3개월, 6개월, 또는 1년 이상 지속되는 것일 수 있다.
상기 세포는 미분화 세포, 분화 중인 세포, 또는 분화가 완료된 세포인 것일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 또는 역분화 줄기세포인 것일 수 있다.
상기 세포는 상기 조성물 1㎖에 대하여 약 0.5 x 104 세포 내지 약 1 x 108, 약 0.5 x 105 세포 내지 약 1 x 107 세포, 약 1.0 x 105 세포 내지 약 0.5 x 107 세포, 약 2.0 x 105 세포 내지 약 2.5 x 106 세포, 또는 약 5.0 x 105 세포 내지 약 1.0 x 106 세포로 첨가되는 것일 수 있다.
상기 조성물을 포함하는 보존액에 세포를 첨가하는 단계를 포함하는 세포 동결 보존 방법에 따르면, 동결 보존시 세포들을 안전하게 보호할 수 있고, 해동 후에도 세포 생존율이 높을 수 있다.
세포 생존율은 세포 본래의 생리학적인 특성(physiological function)을 나타내는 개체를 의미하고, 예를 들면, 트리판블루(trypan blue) 염색에 의해 파란색으로 염색되지 않고, 초록색을 나타내는 세포를 계수하여 확인할 수 있다.
상기 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법에 따르면, 세포의 장기간 보존에 있어서 유전적인 변이나 세대적 변이를 최소화할 수 있고, 동결 및 해동시에 세포 생존율이 우수하다.
도 1은 줄기세포를 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결/해동시킨 후, 줄기세포의 형상, 생존율 및 증식율을 나타내는 이미지다.
도 2는 줄기세포를 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결/해동시킨 후, 줄기세포의 생존율 및 증식율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 줄기세포를 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결/해동시킨 후, 줄기세포의 크기를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 동결 보존용 조성물 제작 및 세포 동결/해동 후, 세포 생존율, 세포 증식율, 및 세포 크기 분석
1. 세포 동결 보존용 조성물 제작
인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline:PBS)에 에틸렌 글리콜(Ethylene Glycol), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol), 글루코스(Glucose), 아스코르브산(Ascorbic acid), 트롤록스(Trolox) 또는 알파-토코페롤(a-Tocopherol), 및 L-글루타민 (L-glutamin)을 첨가한 후, 0.22 ㎛ 직경의 필터에 여과하여, 세포 동결 보존용 조성물을 제작하였다.
2. 1의 조성물을 이용한 세포 동결/해동 후, 세포 생존율, 세포 증식율 , 및 세포 크기 분석
(1) 1의 조성물을 이용한 세포 동결/해동
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만시에 수집된 태반으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 탯줄 각각을 Ca/Mg를 함유하지 않는 (free) 둘베코스 인산염 완충 식염수 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 탯줄에서 동맥과 정맥을 제거한 뒤 1 내지 5 ㎜ 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 탯줄을 배양 용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/㎖의 콜라게나아제 I을 가하여 탯줄 유래 줄기세포를 각각 분리하였다. 분리된 탯줄 유래 줄기세포는 37℃, 95%의 공기 및 5%의 CO2의 조건의 배양기에서 배양하였다.
수득된 줄기세포를 1의 조성물 1 ㎖에 대하여 약 5.0 x 105 세포 또는 약 1.0 x 106 세포가 되도록 첨가하여, 세포 부유액을 제작하였다. 제작된 부유액을 하나의 바이알(vial)에 옮긴 후, 동결 용기에 보관하였다. 이 때, 동결 용기는 이소프로판올을 포함하는 것을 사용하였으며, 바이알을 -80℃까지 약 -1℃/분의 속도로 온도를 낮추면서 하루 동안 동결 용기에서 보관하였다. 이후, 동결 용기를 약 -196℃의 액체 질소 환경으로 옮겨 동결 보존하였다.
동결 보존 약 16주 후, 37℃ 환경에서, 동결된 바이알을 해동하였다. 해동된 바이알에 보존된 세포를 10%의 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum: FBS)이 함유된 MEM alpha 배지에서 첨가하여 세포 부유액을 생성하였다. 생성된 부유액을 1200 rpm에서 4분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고, 새로운 배지에 세포를 부유시키고, 이를 세포 배양 플레이트에 분주하고, 37℃, 5%의 CO2의 조건에서 배양하였다.
이 때, 대조군은, DMSO를 포함하는 시판용 세포 동결 보존용 조성물 (대조군 1, w/DMSO) 및 DMSO를 포함하지 않는 시판용 세포 동결 보존용 조성물 (대조군 2, w/o DMSO)을 사용하였다.
(2) 세포 동결/해동 후, 세포 생존율 및 세포 증식율 확인 1
(1)에 전술한 바와 같이, 1의 조성물, 대조군 1, 및 대조군 2 각각에서 동결 보존된 세포를 배양한 후, 줄기세포의 이미지를 수득하였다.
도 1은 줄기세포를 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결/해동시킨 후, 줄기세포의 형상, 생존율 및 증식율을 나타내는 이미지다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하는 경우, 시판되는 동결 보존 조성물을 이용하는 경우와, 세포 형상, 생존율 및 증식 정도가 유사한 것을 알 수 있다.
(3) 세포 동결/해동 후, 세포 생존율, 세포 증식율 확인 2
(1)에 전술한 바와 같이 동결 보존하고, 동결 보존 약 1주, 약 4주, 및 약 16주 후 (각각), 37℃ 환경에서, 동결된 바이알을 해동하였다. 해동된 바이알에 보존된 세포를 10%의 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum: FBS)이 함유된 MEM alpha 배지에서 첨가하여 세포 부유액을 생성하였다. 생성된 부유액을 1200rpm에서 4분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고, 새로운 배지에 세포를 부유시키고, 이를 세포 배양 플레이트에 분주하고, 37℃, 5%의 CO2의 조건에서 약 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포 생존율을 측정하여 세포 회수율을 확인하였다.
도 2는 줄기세포를 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결/해동시킨 후, 줄기세포의 생존율 및 증식율을 나타내는 그래프이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 단기간 및/또는 장기간 (1주, 4주 및 16주) 동결 보존시, 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하는 경우, 시판되는 동결 보존 조성물을 이용하는 경우와, 생존율 및 증식 정도가 유사한 것을 알 수 있다.
(4) 세포 동결/해동 후, 세포 크기 분석
(3)에서 세포의 크기를 이미지로 수득하고, 그 크기를 측정하였다. 도 3은 줄기세포를 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결/해동시킨 후, 줄기세포의 크기를 나타내는 그래프이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물을 이용하는 경우, 시판되는 동결 보존 조성물을 이용하는 경우와, 세포의 크기가 유사한 것을 알 수 있다.
종래 줄기세포의 보관을 위해서는 통상의 세포와 동일 유사한 보존 방법이 이용되어 왔다. 그러나, 세포는 기원, 및 채취 조직에 따라 생리학적 특성이 다르기 때문에, 각각의 세포를 냉동 보존 할 때에, 대상 세포에 적합한 냉동 보존 방법이 적용되어야 한다. 특히, 줄기세포의 경우는 고유의 재생능과 분화능을 유지하기 때문에, 최적화된 냉동 보존 조건이 요구되며, 상기 조성물을 이용하는 경우 해동시에 높은 생존율을 수득할 수 있다.

Claims (12)

  1. 글리콜류, 글루코스, 아스코르브산, 및 글루타민을 포함하는, 세포 동결 보존용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 토코페롤을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 테트라메칠크로만카복실산을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 글리콜류는 에틸렌 글리콜 (Ethylene Glycol), 폴리에틸렌 글리콜 (Polyethylene Glycol), 프로필렌 글리콜 (Propylene Glycol), 폴리프로필렌 글리콜 (Polyropylene Glycol), 헥실렌 글리콜 (Hexylene Glycol) 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide: DMSO)를 포함하지 않는 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 동물 유래 혈청을 포함하지 않는 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것인 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 또는 역분화 줄기세포인 것인 조성물.
  9. 하기 단계를 포함하는 세포 동결 보존 방법:
    청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 보존액에 세포를 첨가하는 단계; 및
    상기 세포를 첨가한 보존액을 -50℃ 내지 -300℃에서 동결 보존하는 단계.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 또는 역분화 줄기세포인 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 세포는 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 조성물 1㎖에 대하여 0.5 x 104 세포 내지 1 x 108 세포로 첨가되는 것인 방법.
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