WO2019103449A2 - 항암바이러스의 간동맥 투여를 이용한 간암 치료방법 - Google Patents

항암바이러스의 간동맥 투여를 이용한 간암 치료방법 Download PDF

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WO2019103449A2
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Definitions

  • the present invention relates to a method for treating liver cancer using hepatocarcinoma administration of an anti-cancer virus.
  • Liver cancer is a malignant tumor originating from hepatocytes. In a broad sense, it includes all types of malignant tumors of the liver, or metastatic liver cancer, which occurs when cancer of other organs is metastasized to the liver. Also, in a narrow sense, hepatocellular carcinoma is the most common hepatocellular carcinoma.
  • Hepatocellular carcinoma is one of the primary cancers in the liver. Hepatocellular carcinoma is caused by hepatitis B or hepatitis C virus infection or cirrhosis. Hepatocellular carcinoma (HCC) is treated according to the size of the tumor and the progression of the tumor, by selecting appropriate treatment methods such as surgical operation, chemical medication, and radiation therapy.
  • the anti-cancer virus is selectively replicable only in cancer cells and dissolves cancer cells through various action mechanisms.
  • Pexa-Vec JX-594
  • JX-594 is an excellent tumor-resistant anti-cancer virus that is injected into a tumor or injected intravenously.
  • intratumoral injection twice a week is safe and tolerable at 1 ⁇ 10 8 pfu and 1 ⁇ 10 9 pfu.
  • the median survival time of patients receiving high doses was longer than the median survival time of patients receiving low doses. This means that the larger the dose, the greater the anticancer effect and the longer the survival time of the patient.
  • the dose was limited to 3 ⁇ 10 9 pfu, and safe and effective treatment was more difficult than the 3 ⁇ 10 9 pfu dose.
  • anticancer viral therapy depends on factors such as dosage, route of administration, and distribution of liver cancer.
  • the method of administration of anticancer virus used in clinical trials for patients with HCC is intra-tumor and intravenous (Park et al ., Lancet, 533-42, 2008).
  • intravenous administration of anticancer virus is limited by neutralizing antibodies against the anti-cancer virus (Thorne SH et al ., Molecular Therapy vol. 18: 1698-705, 2010).
  • administration of the anti-cancer virus in a tumor is suitable for targeting liver cancer cells but is limited by factors such as tumor multiplicity, location, size, fibrous connective tissue, and the like.
  • the inventors of the present invention have studied to develop a method for treating liver cancer using a safe and effective anticancer virus. As a result, the present inventors have completed the present invention by confirming that there is no acute or chronic hepatotoxicity by optimizing the hepatic artery administration method of anticancer virus.
  • One aspect of the present invention provides a method for treating liver cancer comprising administering an anti-cancer virus to the hepatic artery of an individual.
  • compositions for hepatic artery administration comprising an anti-cancer virus as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the hepatic artery administration composition of the present invention for treating liver cancer.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the hepatic artery administration composition of the present invention for preparing a medicament for the treatment of liver cancer.
  • the hepatocarcinoma treatment method using the hepatocarcinoma administration of the anticancer virus according to the present invention can safely and safely optimize the hepatic artery administration conditions and maximize the anticancer effect by transferring a larger amount of the anticancer virus to the tumor while minimizing the exposure of the anticarcinogenic virus. Therefore, it can be useful for treating liver cancer.
  • FIG. 1 is a photograph showing the process of hepatic artery administration of anticancer virus to a normal rabbit model.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in body weight over 8 weeks after administering hepatocarcinoma virus to a normal rabbit model.
  • FIG. 3 is a graph showing blood total protein levels measured at the 1st, 2nd, 3rd, and 8th weeks after administration of hepatocarcinoma viruses to the normal rabbit model.
  • FIG. 4 is a graph showing blood albumin levels measured at the 1st, 2nd, 3rd, and 8th weeks after administration of hepatocarcinoma virus in the normal rabbit model.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of blood AST (GOT) values at 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 8 weeks after administration of anticancer virus to the normal rabbit model before hepatic artery administration.
  • GAT blood AST
  • FIG. 6 is a graph showing blood ALT (GPT) levels measured at the 1st, 2nd, 3rd and 8th weeks after administration of the hepatocarcinoma virus to the normal rabbit model.
  • FIG. 7 is a graph showing blood r-GTP levels measured at week 1, week 2, week 3, and day 8 after administration of anticancer virus to the normal rabbit model.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of measurement of blood BUN values at the 1st, 2nd, 3rd and 8th weeks after the administration of the hepatocellular carcinoma virus to the normal rabbit model.
  • FIG. 9 is a graph showing blood creatine levels measured at week 1, week 2, week 3, and day 8 after administration of hepatitis B virus (hepatocyte) to the normal rabbit model.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of measurement of uric acid levels at 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 8 weeks after administration of hepatitis B virus (hepatocarcinoma) virus in a normal rabbit model.
  • FIG. 11 is a graph showing blood glucose globulin levels measured at the first, second, third, and eighth weeks after administration of hepatocellular carcinoma virus in the normal rabbit model.
  • FIG. 12 is a graph showing blood CK (CPK) values measured at the 1st, 2nd, 3rd and 8th weeks after administration of hepatocarcinoma viruses to the normal rabbit model.
  • CPK blood CK
  • Fig. 13 is a photograph showing liver cirrhosis and regenerated nodule in liver tissue of a rat model in which cirrhosis was induced by administering N-nitroso morpholine.
  • FIG. 14 is a graph showing the average weight change for 25 weeks after administration of anticancer virus (VV-TK) or PBS to hepatic artery-induced rat model.
  • VV-TK anticancer virus
  • FIG. 15 is a graph showing the average survival rate over 25 weeks after administration of anticancer virus (VV-TK) or PBS to hepatic artery-induced rat model.
  • VV-TK anticancer virus
  • FIG. 16 shows the results of AST for 24 hours after hepatectomy-induced rat model of hepatocellular carcinoma, 3 days, 2 days, 1 day, 1 day, 3 days, 5 days, and 7 days after administration of hepatic artery Fig.
  • FIG. 17 is a graph showing changes in serum ALT levels at day 3, day 1, day 1, day 3, day 5, and day 7 after administration of hepatocyte-induced hepatocellular carcinoma Fig.
  • the present invention provides a method of treating liver cancer comprising administering an anti-cancer virus to the hepatic artery of an individual.
  • hepatic artery means an artery which is located beneath the diaphragm and which is clefted to the right from the body-artery leading from the abdominal aorta and into the liver.
  • the hepatic artery feeds oxygen and nutrients in the liver.
  • the anticancer virus may be a poxvirus.
  • poxvirus refers to a brick virus of about 200x300 nm in size surrounded by a double envelope with DNA.
  • the above-mentioned poxviruses belong to the DNA virus group 1, and include viruses that cause Fox disease in vaccinia virus, pox virus, and lower animal.
  • the above described poxvirus may be vaccinia virus.
  • the vaccinia virus may be selected from the group consisting of Western Reserve (WR), New York Vaccinia Virus (NYVAC), Wyeth (NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, May be selected from the group consisting of Tian Tan, USSR, TashKent, Evans, IHD-J, International Health Division-White (IHD-W)
  • the anticancer virus may be Wyeth vaccinia virus.
  • the anticancer virus may be one in which the thymidine kinase (TK) gene is partially inactivated by deletion or substitution.
  • TK thymidine kinase
  • " TK " as used in the present invention means thymidine kinase.
  • the thymidine kinase is an enzyme involved in the biosynthesis of nucleotides.
  • the thymidine carnase encoded by the TK gene can bind to thymidine at the gamma ( ⁇ ) position of ATP to make nucleotides constituting the viral DNA.
  • the preferable dosage of the anticancer virus varies depending on the condition and the weight of the individual, the degree of disease, the drug form, the administration route and the period, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the anti-cancer virus can be administered to an individual at a dose of 5 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 11 pfu.
  • 5x10 4 Preferably 5x10 4, 1x10 5, 2x10 5 , 5x10 5, 1x10 6, 2x10 6, 5x10 6, 1x10 7, 2x10 7, 5x10 7, 1x10 8, 2x10 8, 5x10 8, 1x10 9, 2x10 9, 5x10 9 , 1x10 10, 2x10 10, 5x10 10, 1x10 11, 2x10 11, or may be administered as 3x10 11 pfu dose, can include a variety of levels and the range between the.
  • the hepatic artery administration can be administered at least once every 1 to 30 weeks. Preferably, this can be done at intervals of 24 weeks. It may also be administered once, twice, three times or four times during the period. In one embodiment of the present invention, hepatic artery was administered twice at intervals of 24 weeks.
  • the method for treating liver cancer of the present invention may include the step of intravenously administering the antibiotic after the hepatic artery administration.
  • the antibiotic may be any one selected from the group consisting of kanamycin, penicillin, ampicillin, streptomycin, tetracycline and bencomycin. Specifically, the antibiotic may be kanamycin.
  • the antibiotic can be administered intravenously for 1 to 7 days. Specifically, the antibiotic can be administered intravenously for 4 days.
  • the subject may be an animal in need of liver cancer treatment.
  • the animal may be a mammal.
  • the subject may be a non-human mammal.
  • the liver cancer may be all kinds of malignant tumors occurring in the liver or metastatic liver cancer which is caused by metastasis of cancer of other organs.
  • the liver cancer may be any one selected from the group consisting of hepatocarcinoma, cholangiocarcinoma, and hepatoblastoma.
  • the present invention also provides a composition for hepatic artery administration comprising an anti-cancer virus as an active ingredient.
  • the anticancer virus may be a poxvirus.
  • the above described poxvirus may be vaccinia virus.
  • the vaccinia virus may be selected from the group consisting of Western Reserve (WR), New York Vaccinia Virus (NYVAC), Wyeth (NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, Tian Tan, USSR, TashKent, Evans, IHD-J, International Health Division-White and variants thereof. But is not limited thereto.
  • the poxvirus may be Wyeth vaccinia virus.
  • the anticancer virus may be one in which the thymidine kinase (TK) gene is partially inactivated by deletion or substitution.
  • TK thymidine kinase
  • " TK " as used in the present invention means thymidine kinase.
  • the thymidine kinase is an enzyme involved in the biosynthesis of nucleotides.
  • the thymidine carnase encoded by the TK gene can bind to thymidine at the gamma ( ⁇ ) position of ATP to make nucleotides constituting the viral DNA.
  • the anticancer virus may be vaccinia virus.
  • the vaccinia virus may be selected from the group consisting of Western Reserve (WR), New York Vaccinia Virus (NYVAC), Wyeth (NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, May be selected from the group consisting of Tian Tan, USSR, TashKent, Evans, IHD-J, International Health Division-White (IHD-W)
  • the present invention is not limited thereto.
  • the preferred dosage of the composition for hepatic artery administration of the present invention varies depending on the condition and body weight of the individual, the degree of disease, the type of the drug, the route of administration and the period of time, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the anti-cancer virus can be administered to an individual at a dose of 5 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 11 pfu.
  • 5x10 4 Preferably 5x10 4, 1x10 5, 2x10 5 , 5x10 5, 1x10 6, 2x10 6, 5x10 6, 1x10 7, 2x10 7, 5x10 7, 1x10 8, 2x10 8, 5x10 8, 1x10 9, 2x10 9, 5x10 9 , 1x10 10, 2x10 10, 5x10 10, 1x10 11, 2x10 11, or may be administered as 3x10 11 pfu dose, can include a variety of levels and the range between the.
  • composition for hepatic artery administration of the present invention may further comprise a physiologically acceptable carrier.
  • composition for hepatic artery administration of the present invention may further comprise suitable excipients and diluents conventionally used in the production of the composition.
  • composition for hepatic artery administration may further contain at least one selected from the group consisting of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • composition for hepatic artery injection when formulated, it can be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants and the like which are usually used.
  • TK thymidine kinase
  • ATCC American Type Culture Collection, VR-1536
  • Human leukocyte growth factor (hGM-CSF) was inserted into the TK gene region under the control of early promoter and late promoter.
  • lacZ gene was inserted into the viral TK gene under the control of the p7.5 promoter.
  • the wild type virus thymidine kinase gene was knocked out by homologous recombination and replaced with a reporter and therapeutic gene.
  • Hela cells were prepared in 6-well plates at 4 x 10 cells / well and in EMEM medium containing 10% fetal bovine serum to ensure recombinant virus. After 2 hours, the EMEM medium containing 2% fetal bovine serum was replaced with 4 ⁇ g of the recombinant vaccinia virus vector prepared in Preparation 1.1, and the cells were treated with Xfect TM reagent buffer (Takara ). After 4 hours of incubation, the cells were replaced with EMEM medium containing 2% fetal bovine serum, followed by further incubation for 72 hours.
  • the infected cells were recovered, and then the cells were lysed by three times of freezing and thawing and sonication, and the recombinant vaccinia virus isolated by the sucrose cushion method was obtained.
  • Recombinant vaccinia virus was identified by PCR and gene expression analysis.
  • the recombinant vaccinia virus was designated VV-TK.
  • Example 1 Administration of anticancer viral hepatic artery in normal rabbit model
  • New Zealand white rabbits (Samtako, Oh-san, Korea) were purchased and acclimatized for 6 weeks under standard conditions to achieve an average body weight of 3 kg at the start of the study. Three rabbits were randomly assigned to a low-dose group and a high-dose group for short-term follow-up for 3 weeks. In addition, two rabbits were randomly assigned and each group was followed for two months. Female and male rabbits were randomly assigned to each group.
  • anatomic rabbits were placed in a prone position and hepatic angiography was performed to determine which of the right or left central arteries was favorable.
  • the ear of the rabbit was rubbed with alcohol for sterilization.
  • an 18-gauge needle (Angiocath) was inserted in the retroperitoneal direction of the central auricular artery of one of the rabbits.
  • the inner probe needle was removed and the center of the plastic sheath was closed with a three-way stopcock.
  • the plastic sheath was fixed with a band-aid.
  • the guide wire was carefully inserted into the descending thoracic aorta, and the guidewire was placed in the left hepatic artery.
  • a microcatheter tip was inserted into the left hepatic artery (Fig. 1).
  • composition for hepatic artery administration in which 1 x 10 8 or 1 x 10 9 pfu was resuspended in 0.1 ml of PBS was administered to each rabbit of the low-dose group and the high-dose group, and the mice were administered with saline and recirculated.
  • Kanamycin was administered intramuscularly for 4 days after hepatic arterial injection to prevent microorganisms. All animal care, handling and research procedures adhered to the IACUC guidelines of the Food and Drug Administration.
  • Anti - cancer virus was administered to the normal rabbit model by hepatic artery, and then weight change was observed. Body weights were measured weekly until the eighth week of scheduled sacrifice.
  • the antitumor virus was administered to the normal rabbit model in the hepatic artery and the presence of viral infection was confirmed. Specifically, blood samples of rabbits sacrificed at 3 or 8 weeks were analyzed for the presence or absence of vaccinia virus through qPCR.
  • vaccinia virus was not detected in blood samples of rabbits sacrificed at 3 or 8 weeks.
  • Liver function indexes were analyzed after administration of hepatocarcinoma to the normal rabbit model.
  • Blood of all rabbits was collected in 10 ml blood vessels (BD Vacutainer EDTA, USA) prior to injection and at 1, 2, 3 and 8 weeks after injection. Serum of all rabbits was sampled at the same time, and the sampled serum was analyzed for general blood test (CBC) and neodyne tablets (NEODIN Vetlab, Korea) for hematology analysis. Data analysis was performed by a physician (PNUYH, Korea) in nurses, oncology and pathology departments.
  • ALT and ALT levels were temporarily increased and completely recovered after one week except for the two rabbits (# L-4 and # H-3) .
  • An elevated liver function index due to angiography has been reported, and a temporary increase in ALT and AST may be related to the course of the experiment and is not directly related to vaccinia virus administration.
  • Alkaline phosphatase (ALP) levels were generally within the normal range for all rabbits, but the low GTP level of the low-dose group was high ( Figures 5 to 7). But did not show severe toxicity due to hepatitis B virus hepatic artery administration.
  • BUN blood urea nitrogen
  • kidney disease such as creatinine and uric acid levels
  • LDH Lactate dehydrogenase
  • CK creatine kinase
  • NNM N-Nitrosomorpholine
  • the cirrhosis-inducing rats prepared in Preparation Example 2 were randomly divided into treatment groups of 15 rats, and 11 rats were randomly selected and classified as a PBS control group.
  • VV-TK pfu / ml VV-TK or the same volume of PBS was administered to the hepatic artery.
  • Secondary hepatic artery administration was performed with the same concentration of VV-TK or PBS at 24 weeks after the first hepatic arterial injection. Five rats survived in the VV-TK treated group after primary hepatic artery administration, and three rats survived in the PBS control group. The surviving rats underwent second hepatic artery administration.
  • the hepatocellular carcinoma was treated with hepatic artery administration to cirrhosis - induced rats.
  • Body weights were measured weekly for 25 weeks after primary hepatic artery administration.
  • the mean body weight of cirrhotic-induced rats was 244.90 g ⁇ 12.5 g in the VV-TK treated group and 241.6 ⁇ 12.3 g in the PBS control group.
  • the mean body weights of the two rats in the VV-TK treated group and the PBS control group were 285.3 ⁇ 12.5 g and 292.8 ⁇ 42.0 g, respectively.
  • Body weight was not significantly different between the VV-TK treated group and the PBS control group (Fig. 14).
  • the hepatocellular carcinoma was treated with hepatic artery administration to cirrhosis - induced rats. Twelve and eight rats survived on the seventh day after hepatic artery administration among 15 rats receiving VV-TK and 11 rats administered with PBS.
  • Liver function indexes were analyzed after administration of hepatic anti - cancer virus to hepatic cirrhosis - induced rat model.
  • Five rats in the VV-TK-treated group and two sera from the PBS control group were collected after hepatic artery administration on day 3, day 1, day 2, day 1, day 3, day 5, AST and ALT levels were measured.
  • the OD values were measured to compare the AST and ALT values of the rats in the VV-TK treated group and the PBS control group.
  • AST and ALT were performed according to the manufacturer's manual using GPT and GOT kit (Asan BioPharm, Asan). Five rabbits of the surviving VV-TK treated group and two sera of the PBS control group surviving the hepatic artery administration were collected on day 1, three days before the second injection, one day, three days, five days, and seven days after the second injection And stored at -80 < 0 > C until use. AST and ALT substrates were placed in a warm bath for 5 minutes at 37 ⁇ ⁇ . The collected serum samples were thawed and vortexed immediately prior to use and then mixed with AST or ALT substrate and reacted at 37 ° C for 60 minutes (AST) or 30 minutes (ALT).
  • the peroxidase substrate solution was added to the serum sample and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • 10 N NaOH was added and reacted at room temperature for 10 minutes.
  • serum samples were loaded into 96-well plates and optical density (OD) was measured at a wavelength of 490 nm using a microplate reader.
  • ALT values between the two groups were statistically significant. ALT levels were lower in rats injected with VV-TK than those injected with hepatic artery of PBS. Therefore, hepatic toxicity in rats administered with VV-TK in hepatic artery need not be more worrisome than in rats injected with PBS. Also, all ALT values were lower than AST levels (Figs. 16 and 17). In this regard, studies have reported that AST levels are higher than ALT levels with the onset of cirrhosis.
  • Kaplan-Meier survival curves were generated using GraphPad Prism version 5.03 and analyzed statistically for weight changes through both sample t-tests. Body weight data are expressed as mean ⁇ standard deviation. ALT or AST levels were also statistically analyzed by means of both sample t-tests. The level of statistical difference was based on P value, and P value less than 0.05 was statistically significant.

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Abstract

본 발명은 항암바이러스의 간동맥 투여를 이용한 간암 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 항암바이러스의 간동맥 투여를 이용한 간암 치료방법은 간동맥 투여 조건을 최적화하여 안전하며, 항암바이러스의 노출을 최소화시키면서 종양에 더 많은 양의 항암바이러스를 전달하여 항암효과를 최대화할 수 있다. 따라서, 간암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암바이러스의 간동맥 투여를 이용한 간암 치료방법
본 발명은 항암바이러스의 간동맥 투여를 이용한 간암 치료방법에 관한 것이다.
간암이란 간세포에서 기원하는 악성 종양을 의미한다. 넓은 의미로는 간에 생기는 모든 종류의 악성 종양이나 다른 기관의 암이 간에 전이되어 발생하는 전이성 간암까지도 포함한다. 또한, 좁은 의미로는 간세포암종이 간암 중 가장 일반적이므로 간세포에서 발생하는 간세포암종만을 의미하기도 한다.
간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)은 간에서 발생하는 원발암(primary cancer) 중 하나이다. 간세포암종은 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스의 감염 또는 간경변증에 의해 발생한다. 간암세포종은 종양의 크기와 종양의 진행단계에 따라서 외과적 수술, 화학적 약물 치료, 방사선 치료 등의 적합한 치료방법을 선택하여 치료한다.
간세포암종이 전이성 간암으로 악화된 경우, 유일한 전신치료제인 소라페닙(Sorafenib)으로 치료방법이 제한된다. 최근 간세포암종 환자에게 소라페닙 치료에 대한 임상시험이 승인되었다. 소라페닙 치료를 받은 간세포암종 환자는 2개월 내지 3개월 정도 생존기간이 연장되었다.
한편, 항암바이러스는 암세포에서만 선택적으로 복제가 가능하고, 다양한 작용 기전을 통해 암세포를 용해시킨다. 구체적으로, 종양 내 주입 또는 정맥 내 주입하는 내약성이 우수한 항암바이러스인 펙사벡(Pexa-Vec, JX-594)이 있다. 진행성 간암 환자를 대상으로 진행한 펙사벡 치료 임상시험에서 3주 2회씩 종양 내 주사하는 것이 안전하고, 1x108 pfu 및 1x109 pfu에서 내약성이 우수하다는 연구결과가 보고된바 있다.
또한, 전반적으로 저용량을 투여받은 환자의 평균 생존기간보다 고용량을 투여받은 환자의 평균 생존기간이 길었다. 이는 용량을 늘리수록 항암효과가 더 커지고, 환자의 생존기간이 연장된다는 것을 의미한다. 하지만, 항암바이러스로 인한 독성으로 인해 3x109 pfu로 용량을 제한하였고, 3x109 pfu 용량보다 안전하고 효과적인 치료는 어려운 상황이다.
항암바이러스 치료의 안전성과 효과는 투여량, 투여경로, 간암의 분포 등의 요인에 따라 결정된다. 현재 간암세포종 환자를 대상으로 하는 임상시험에서 사용되는 항암바이러스의 투여방법은 종양 내 투여 및 정맥 내 투여하고 있다(Park B-H et al., Lancet Oncol, 533-42, 2008). 하지만, 항암바이러스의 정맥 내 투여는 항암바이러스에 대한 중화항체로 인해 제한된다(Thorne SH et al., Molecular Therapy vol. 18: 1698-705, 2010). 또한, 항암바이러스의 종양 내 투여는 간암세포를 표적하는데 적합하지만 종양의 다중성, 위치, 크기, 섬유성 결합조직 등의 요인에 따라 제한된다.
한편, 항암바이러스를 이용한 치료에 있어서, 간세포암종 환자는 간염증 및/또는 간경변증과 같은 만성 간질환으로 인해 바이러스 감염에 취약한 상태이므로 안전성이 중요하다.
이에 본 발명자들은 안전하고 효과적인 항암바이러스를 이용한 간암 치료방법을 개발하기 위해 연구한 결과, 항암바이러스의 간동맥 투여방법을 최적화하여 급성 및 만성 간독성이 없음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, 항암바이러스를 개체의 간동맥에 투여하는 단계를 포함하는 간암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 항암바이러스를 유효성분으로 포함하는 간동맥 투여용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 간암을 치료하기 위한 본 발명의 간동맥 투여용 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 간암 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 간동맥 투여용 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 항암바이러스의 간동맥 투여를 이용한 간암 치료방법은 간동맥 투여 조건을 최적화하여 안전하며, 항암바이러스의 노출을 최소화시키면서 종양에 더 많은 양의 항암바이러스를 전달하여 항암효과를 최대화할 수 있다. 따라서, 간암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 2는 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여한 후, 8주 동안의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 총 단백질 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 알부민 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 AST(GOT) 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 ALT(GPT) 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 r-GTP 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 BUN 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 크레아틴(creatine) 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 요산(uric acid) 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 글로불린(globulin) 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 정상 토끼 모델에 항암바이러스를 간동맥 투여 전, 투여 후 1주차, 2주차, 3주차 및 8주차째의 혈중 CK(CPK) 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 N-니트로소모르폴린을 투여하여 간경변증을 유발시킨 래트 모델의 간조직에 간경변증 및 재생결절된 것을 보여주는 사진이다.
도 14는 간경변증 유발 래트 모델에 항암바이러스(VV-TK) 또는 PBS를 간동맥 투여한 후, 25주 동안의 평균 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 간경변증 유발 래트 모델에 항암바이러스(VV-TK) 또는 PBS를 간동맥 투여한 후, 25주 동안의 평균 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 16은 항암바이러스를 간경변증 유발 래트 모델에 1차 간동맥 투여한 후, 24주 후에 2차 간동맥 투여 3일전, 투여 1일전, 투여 후 1일, 3일, 5일, 7일째의 형중 AST 수치를 나타낸 그래프이다.
도 17은 항암바이러스를 간경변증 유발 래트 모델에 1차 간동맥 투여한 후, 24주 후에 2차 간동맥 투여 3일전, 투여 1일전, 투여 후 1일, 3일, 5일, 7일째의 혈중 ALT 수치를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 항암바이러스를 개체의 간동맥에 투여하는 단계를 포함하는 간암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "간동맥"이란, 횡경막의 아래에 위치해 있으며, 복부 대동맥의 앞에서 나온 체강동맥으로부터 오른쪽으로 갈라져 간으로 들어가는 동맥을 의미한다. 상기 간동맥은 간에 산소 및 영양을 공급한다.
상기 항암바이러스는 폭스바이러스일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "폭스바이러스"란, DNA를 가지며 2중의 엔벨로프(envelope)로 싸인 약 200x300 nm 크기의 벽돌형 바이러스를 의미한다. 상기 폭스바이러스는 DNA 바이러스 1군에 속하며, 백시니아 바이러스, 두창 바이러스 및 하등동물에 폭스질환을 일으키는 바이러스를 포괄한다.
또한, 상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J), IHD-W(International Health Division-White) 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 항암바이러스는 Wyeth 백시니아 바이러스일 수 있다.
상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 일부, 전부 결실 또는 치환에 의한 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “TK”는 티미딘 키나아제를 의미한다. 상기 티미딘 키나아제는 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소이다. 상기 TK 유전자에 의해 코딩된 티미딘 카나아제는 ATP의 감마(γ) 위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 바이러스 DNA를 구성하는 뉴클레오티드를 만들 수 있다.
본 발명의 간암 치료방법에서 항암바이러스의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 개체에게 5x104 내지 3x1011 pfu 용량으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 5x104, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 2x1010, 5x1010, 1x1011, 2x1011 또는 3x1011 pfu 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 사이에 다양한 수치 및 범위를 포함할 수 있다.
상기 간동맥 투여는 1주 내지 30주 간격으로 적어도 1회 투여할 수 있다. 바람직하게는, 24주 간격으로 할 수 있다. 또한, 그 기간 동안 1회, 2회, 3회 또는 4회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 24주 간격으로 2회 간동맥 투여하였다.
본 발명의 간암 치료방법은 상기 간동맥 투여 후 항생제를 혈관 내 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항생제는 카나마이신, 페니실린, 암피실린, 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 벤코마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 항생제는 카나마이신일 수 있다. 또한, 상기 항생제는 1일 내지 7일 동안 혈관 내 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 항생제는 4일 동안 혈관 내 투여할 수 있다.
상기 개체는 간암 치료를 필요로 하는 동물일 수 있다. 상기 동물은 포유류일 수 있다. 구체적으로, 상기 개체는 인간이 아닌 포유류일 수 있다.
상기 간암은 간에서 생기는 모든 종류의 악성 종양이나 다른 기관의 암이 간에 전이되어 발생하는 전이성 간암일 수 있다. 구체적으로, 상기 간암은 간암종(hepatocarcinoma), 담관암종(cholangiocarcinoma), 간모세포종(hepatoblastoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 항암바이러스를 유효성분으로 포함하는 간동맥 투여용 조성물을 제공한다.
상기 항암바이러스는 폭스바이러스일 수 있다. 또한, 상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스일 수 있다. 상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J), IHD-W(International Health Division-White) 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 폭스바이러스는 Wyeth 백시니아 바이러스일 수 있다.
상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 일부, 전부 결실 또는 치환에 의한 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “TK”는 티미딘 키나아제를 의미한다. 상기 티미딘 키나아제는 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소이다. 상기 TK 유전자에 의해 코딩된 티미딘 카나아제는 ATP의 감마(γ) 위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 바이러스 DNA를 구성하는 뉴클레오티드를 만들 수 있다.
상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J), IHD-W(International Health Division-White) 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 간동맥 투여용 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 개체에게 5x104 내지 3x1011 pfu 용량으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 5x104, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 2x1010, 5x1010, 1x1011, 2x1011 또는 3x1011 pfu 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 사이에 다양한 수치 및 범위를 포함할 수 있다.
본 발명의 간동맥 투여용 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 간동맥 투여용 조성물은 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 간동맥 투여용 조성물은 담체, 부형제 및 희석제로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함할 수 있다. 상기 간동맥 투여용 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 항암바이러스 제조
제조예 1.1. 재조합 백시니아 바이러스 벡터 제조
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 항암바이러스를 제조하기 위해, ATCC(American Type Culture Collection, VR-1536)에서 야생형 폭스 바이러스(NYC Department of Health strain)를 구입하였다. 인간 백혈구 증식인자(hGM-CSF)는 초기 프로모터(early promoter) 및 후기 프로모터(late promoter)의 제어 하에 TK 유전자 영역에 삽입시켰다. 또한, lacZ 유전자는 p7.5 프로모터의 제어 하에 바이러스성 TK 유전자 내로 삽입시켰다.
야생형 바이러스 티미딘 키나아제 유전자는 상동성 재조합에 의해 녹아웃(knock out)되고 리포터 및 치료 유전자로 대체하였다.
제조예 1.2. 재조합 백시니아 바이러스 생산
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Hela 세포(ATCC)를 6-웰 플레이트에 4x105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지 상태로 준비하였다. 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 상기 제조예 1.1.에서 제작된 재조합 백시니아 바이러스 벡터 4 ㎍을 XfectTM reagent buffer(Takara)를 이용하여 형질주입하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복과 초음파분쇄로 세포를 용해시키고, 수크로오스 쿠션 방법(sucrose cushion method)으로 분리된 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 PCR 및 유전자 발현 분석을 통해 확인하였다. 상기 재조합 백시니아 바이러스를 VV-TK로 명명하였다.
실시예 1. 정상 토끼 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여
뉴질랜드 흰 토끼(Samtako, Oh-san, Korea)를 구입하여 연구 시작 시 평균 체중이 3 kg이 되도록 표준 조건 하에서 6주간 순응시켰다. 저용량 그룹과 고용량 그룹에서 토끼 3마리를 무작위 배정하고 3주간 단기간 추적하였다. 또한, 토끼 2마리를 무작위로 나누어 각 그룹에 2개월 동안 추적 관찰했다. 암컷과 수컷 토끼를 무작위로 각 그룹에 지명했다.
주사 당일에, 자일라진(xylazine, Rompun, Bayer Korea, Seoul, Korea)과 틸레타민(tiletamine)/ 졸라제팜(zolazepam, Zoletil, Virbac, Carros, France)의 2:3 혼합물 2.5 내지 3 ㎖를 허벅지 뒤쪽 근육 내 주사하여 토끼를 마취시켰다. 간동맥 주사는 중심 동맥에 형광 투시기(Integris H5000F, Philips, USA) 사용하여 수행되었다.
먼저, 마취된 토끼를 엎드린 자세에서 간동맥 혈관조영술을 시행하는데 오른쪽 또는 왼쪽 중추 동맥 중 어느 쪽이 유리한지 결정하였다. 토끼의 귀는 멸균을 위해 알코올로 문질러 닦았다. 그 후, 토끼의 한쪽 귀의 중앙 귓바퀴 동맥에 역행 방향으로 18 게이지 바늘(Angiocath)을 삽입하였다. 상기 바늘의 플라스틱 외장(plastic sheath)을 전진시킨 후, 내부의 탐침 바늘을 제거하고 플라스틱 외장의 중심을 삼방활전(three-way stopcock)으로 막았다. 플라스틱 외장은 반창고를 붙여 고정하였다.
그 후, 조영제(Omnipaque; GE Healthcare, Seoul, Korea)를 주사하고, 간동맥 혈관조영술을 이용해 2.0-F 마이크로 카테터(Progreat, Terumo, Tokyo, Japan)와 0.016 인치 가이드 와이어(Meister, Asahi intec, Aichi, Co, Ltd)를 방사선 전문의 중재 하에 귓바퀴 동맥에 도입하였다. 가이드 와이어를 하강 흉부 대동맥으로 조심스럽게 넣고, 가이드 와이어를 조작하여 좌측 간동맥에 위치시켰다. 좌측 간동맥에 마이크로 카테터 팁을 삽입하였다(도 1).
저용량 그룹과 고용량 그룹의 각각의 토끼에 1x108 또는 1x109 pfu를 0.1 ㎖의 PBS에 재현탁한 간동맥 투여용 조성물을 간동맥 투여한 후, 생리 식염수로 투여하여 재순환시켰다. 카나마이신은 미생물 방지를 위해 간동맥 투여 후 4일 동안 근육 주사로 투여하였다. 모든 동물 관리, 취급 및 연구 절차는 식품 의약품 안전부의 IACUC 지침에 준수하였다.
실험예 1. 정상 토끼 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 독성 평가
실험예 1.1. 정상 토끼 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 체중 변화 확인
항암바이러스를 정상 토끼 모델에 간동맥 투여 한 후 체중 변화를 관찰하였다. 체중 측정은 예정된 희생 날짜인 8주째까지 매주 측정하였다.
그 결과, 항암바이러스 간동맥 투여 7일 후에 저용량 그룹의 토끼 한 마리(#L-4)를 제외한 모든 토끼의 평균 체중이 230 g 감소한 것을 확인하였다. 일시적으로 항암바이러스 간동맥 투여 후 약 7% 체중이 감소하였다. 하지만, 저용량 그룹의 토끼 한 마리(#L-4)를 제외한 모든 토끼는 간동맥 투여 후 14일만에 원래 체중을 회복하였으며, 3주 또는 8주에 희생될 때까지 체중이 증가하였다. 암컷과 수컷 토끼 사이의 유효한 체중 변화는 없었다(도 2).
실험예 1.2. 정상 토끼 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 바이러스 감염 확인
항암바이러스를 정상 토끼 모델에 간동맥 투여 한 후 바이러스 감염 유무를 확인하였다. 구체적으로, 3주 또는 8주에 희생시킨 토끼의 혈액샘플을 qPCR을 통해 백시니아 바이러스 감염 유무를 분석하였다.
그 결과, 3주 또는 8주에 희생시킨 토끼의 혈액샘플에서 백시니아 바이러스는 검출되지 않았다.
실험예 1.3. 정상 토끼 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 간 기능 확인
항암바이러스를 정상 토끼 모델에 간동맥 투여 한 후 간 기능 지표들을 분석하였다. 모든 토끼의 혈액을 주사 전과 주사 후 1주, 2주, 3주 및 8주에 10 ㎖ 채혈관(BD Vacutainer EDTA, USA)에 채취하였다. 모든 토끼의 혈청을 동일한 시점에서 샘플링 하였으며, 샘플링한 혈청을 일반혈액검사(CBC) 및 혈액학 분석을 위해 네오딘뱃랩(NEODIN Vetlab, Korea)에 분석을 의뢰하였다. 데이터 분석은 간호사, 종양학 및 병리학 부서에서 의사(PNUYH, 한국)가 수행하였다.
그 결과, 항암바이러스 투여 21일 후, 고용량 군의 토끼 한 마리(#H-2)를 제외하고는 총 단백질 및 알부민 수치는 대조군의 정상 수치범위 내에 있었다(도 3 내지 도 4).
또한, 투여량에 상관없이 AST(aspartate transaminase), ALT(alanine transferase) 수준이 일시적으로 증가하였으며, 각 그룹의 두 토끼(#L-4, #H-3)를 제외하고는 일주일 후에 완전히 회복되었다. 혈관조영술로 인한 간 기능 지표의 상승이 보고된 바 있었고, ALT 및 AST의 일시적인 증가는 실험 과정과 관련이 있을 수 있으며, 백시니아 바이러스 투여와는 직접적인 관계가 없다. ALP(Alkaline phosphatase) 수치는 전반적으로 모든 토끼가 정상 범위 내에 있었으나, 저용량 군의 저체중인 한 마리 토끼의 GTP 수치가 높았다(도 5 내지 도 7). 함암바이러스 간동맥 투여로 인한 심각한 독성을 나타내지 않았다.
또한, 항암바이러스 투여 21일 후, 고용량 군의 토끼 두 마리(#H-2, #H-4)를 제외하고는 BUN(blood urea nitrogen) 수치는 대조군의 정상 수치범위 내에 있었다(도 8).
또한, 크레아티닌과 요산 수치와 같은 신장 질환을 나타내는 추가요인도 정상 범위였다. 나아가, 조직손상이나 근이영양증을 나타내는 LDH(Lactate dehydrogenase)와 CK(creatine kinase)도 항암바이러스 간동맥 투여 후에 급격히 증가했지만 한 마리의 토끼(#L-2)를 제외하고는 8주차에 정상 범위로 돌아왔다(도 9 내지 도 12).
제조예 2. 간경변증 유발 래트 모델 제조
8주령의 암컷 Sprague-Dawley 흰래트를 샘타코바이오(Samtako, Korea)에서 구입하였다. 시험을 시작할 때 래트의 체중은 200 g 내지 230 g이었다. N-니트로소몰폴린(N-Nitrosomorpholine, 이하 NNM)을 도쿄 화학공업(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. NNM은 4주 동안 120 ㎎/L의 농도로 음용수에 첨가하여 경구투여 하였고, 나머지 4주 동안 200 ㎎/L 농도로 음용수에 첨가하여 경구투여 하였다. 그 후, 2주 동안 일반 음용수를 주었다.
섬유증 및 기타 조직 손상을 확인하는데 사용되는 Masson trichrome 염색법을 이용해 간경변증뿐만 아니라 정상 간 조직이 재생결절된 것을 확인하였다(도 13).
실시예 2. 간경변증 유발 래트 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여
상기 제조예 2.에서 제조한 간경변증 유발 래트를 무작위로 15마리의 래트를 선별하여 처리군으로 분류하고, 무작위로 11마리의 래트를 선별하여 PBS 대조군으로 분류하였다.
각각의 간경변증 유발 래트의 배를 개복한 후, 1x108 pfu/㎖ VV-TK 또는 동일 용량의 PBS를 간동맥에 투여하였다. 2차 간동맥 투여는 1차 간동맥 투여 후 24주 후에 동일한 농도의 VV-TK 또는 PBS를 투여하였다. 1차 간동맥 투여 후 VV-TK 처리군은 5마리의 래트가 생존하였고, PBS 대조군은 3마리의 래트가 생존하였다. 상기 생존한 래트들은 2차 간동맥 투여를 진행하였다.
실험예 2. 간경변증 유발 래트 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 독성 평가
실험예 2.1. 간경변증 유발 래트 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 체중 변화 확인
항암바이러스를 간경변증 유발 래트에 간동맥 투여 한 후 체중 변화를 관찰하였다. 체중 측정은 1차 간동맥 투여 후 25주 동안 매주 측정하였다. 1차 주입 일주일 후, 간경변증 유발 래트의 평균 체중은 VV-TK 처리군에서 244.90 g ± 12.5 g이었고, PBS 대조군에서 241.6 ± 12.3 g이었다. 25주째에 VV-TK 처리군 및 PBS 대조군의 2마리의 래트의 평균 체중은 각각 285.3 ± 12.5 g 및 292.8 ± 42.0 g이었다. 체중은 VV-TK 처리군과 PBS 대조군에서 유의한 차이는 없었다(도 14).
실험예 2.2. 간경변증 유발 래트 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 생존율 확인
항암바이러스를 간경변증 유발 래트에 간동맥 투여한 후 체중 변화를 관찰하였다. VV-TK를 투여한 15마리의 래트들과 PBS 투여한 11마리의 래트들 중 간동맥 투여 후 7일째에 각각 12마리와 8마리의 래트가 생존하였다.
그 결과, VV-TK 처리군과 PBS 대조군의 생존율은 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 마지막 생존 관찰이 이루어진 25주째에 VV-TK 처리군의 5마리 및 PBS 대조군의 2마리의 래트가 생존하였다(도 15).
실험예 2.3. 간경변증 유발 래트 모델에서의 항암바이러스 간동맥 투여 후 간 기능 확인
항암바이러스를 간경변증 유발 래트 모델에 간동맥 투여 한 후 간 기능 지표들을 분석하였다. 2차 주사 3일전, 1일전, 2차 주사 후 1일, 3일, 5일, 7일에 간동맥 투여 후 생존한 VV-TK 처리군의 5마리 래트 및 PBS 대조군의 2마리의 혈청을 수집하여 AST 수치 및 ALT 수치를 측정하였다.
래트의 혈청이 너무 적어서 인간 혈청 분석 키트로 분석할 수 없기 때문에, O.D.값을 측정하여 VV-TK 처리군의 래트와 PBS 대조군의 래트의 AST 수치 및 ALT 수치를 비교하였다.
구체적으로, AST 및 ALT를 GPT 및 GOT 키트(아산 바이오팜, 아산)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 간동맥 투여 후 생존한 VV-TK 처리군의 5마리 래트 및 PBS 대조군의 2마리의 혈청을 1일째, 2차 주사 3일 전, 2차 주사 후 1일, 3일, 5일, 7일에 수집하고, 사용할 때까지 -80℃ 온도에서 보관하였다. AST 및 ALT 기질을 37℃ 온도에서 온탕기에 5분 동안 두었다. 수집된 혈청 샘플을 사용 직전에 해동 및 볼텍싱한 후, AST 또는 ALT 기질과 혼합하여 37℃ 온도에서 60분(AST) 또는 30분(ALT) 동안 반응시켰다.
상기 반응이 끝난 혈청 샘플에 페록시다아제(Peroxidase) 기질 용액을 넣고 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 10 N 농도의 NaOH를 첨가하고 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 혈청 샘플을 96-웰 플레이트에 로딩한 후, 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm 파장에서 광학밀도(O.D)를 측정하였다.
그 결과, 두 군간의 AST 수치는 통계적으로 차이가 없었다. 반면에, 두 군간의 ALT 수치는 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. ALT 수치는 VV-TK를 간동맥 투여한 래트에서 PBS를 간동맥 투여한 래트보다 더 낮았다. 따라서, VV-TK를 간동맥 투여한 래트에서의 간 독성은 PBS를 주사한 래트에서보다 우려할 필요가 없다. 또한, 모든 ALT 수치는 AST 수치보다 낮았다(도 16 및 도 17). 이와 관련하여 AST 수치는 간경변증의 발병과 함께 ALT 수치보다 높아진다는 연구가 보고된 바 있다.
실험예 3. 통계분석
GraphPad Prism version 5.03을 사용하여 카플란-마이어 생존 곡선을 작성하고, 양표본 t-검정을 통해 통계적으로 체중 변화를 분석하였다. 체중 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ALT 또는 AST 수치도 양표본 t-검정을 통해 통계적으로 분석하였다. 통계적 차이의 수준은 P값을 기준으로 하였으며, 0.05 미만의 P값은 통계적으로 유의하다고 보았다.

Claims (18)

  1. 항암바이러스를 개체의 간동맥에 투여하는 단계를 포함하는 간암 치료방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항암바이러스가 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는, 간암 치료방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 항암바이러스가 백시니아 바이러스인 것인, 간암 치료방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 것인, 간암 치료방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항암바이러스는 5x104 내지 3x1011 pfu 용량으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 간암 치료방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 간동맥 투여는 1주 내지 30주 간격으로 적어도 1회 투여하는 것을 특징으로 하는, 간암 치료방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 간동맥 투여 후 항생제를 혈관 내 투여하는 단계를 포함하는, 간암 치료방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 항생제는 카나마이신, 페니실린, 암피실린, 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 벤코마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 간암 치료방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 항생제는 1일 내지 7일 동안 혈관 내 투여하는 것인, 간암 치료방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 개체는 인간이 아닌 포유류인 것을 특징으로 하는, 간암 치료방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 간암은 간암종(hepatocarcinoma), 담관암종(cholangiocarcinoma), 간모세포종(hepatoblastoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 간암 치료방법.
  12. 항암바이러스를 유효성분으로 포함하는 간동맥 투여용 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 것인, 간동맥 투여용 조성물.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 항암바이러스가 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는, 간동맥 투여용 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스인 것인, 간동맥 투여용 조성물.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 항암바이러스가 5x104 내지 3x1011 pfu 용량으로 포함된 것인, 간동맥 투여용 조성물.
  17. 간암을 치료하기 위한 제12항의 간동맥 투여용 조성물의 용도.
  18. 간암 치료용 약제를 제조하기 위한 제12항의 간동맥 투여용 조성물의 용도.
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