WO2019098179A1 - 安定同位体標識化合物 - Google Patents
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Abstract
アンドロゲンの測定に有用な新規の内部標準物質、前処理を簡略化し得る液体クロマトグラフィー質量分析法を用いた高選択性かつ高感度(正確)なアンドロゲンの測定方法、及び当該アンドロゲンの測定方法を用いる疾患の鑑別法を提供する。 特定の溶媒で還元反応を行うことにより新規な安定同位体標識化合物を合成する。この新規の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用することにより、アンドロゲンを測定する。
Description
本発明は、新規安定同位体標識化合物、当該化合物を内部標準物質として使用するアンドロゲンの測定方法、当該測定方法を用いる疾患の鑑別法、当該鑑別法のためのバイオマーカー、及び当該化合物の製造方法に関するものである。
アンドロゲンは、男性ホルモン及びこれと同じ生理作用をもつ物質の総称であり、生殖器官の機能維持、胎生期の性分化、雄の第二次性徴の発現、及びタンパク質同化作用の促進などの作用を持つとされている。
化学構造としては、ステロイド誘導体であり、天然にある主なアンドロゲンとして、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、その硫酸抱合体(DHEAS)、テストステロン(T)、及びアンドロステンジオン(A4)などがあるが、アンドロゲン作用の最も強いのはTの代謝物であるジヒドロテストステロン(DHT)である。
ステロイドホルモンの合成・分泌は視床下部-下垂体-副腎(生殖腺)系の内分泌系で調節され、副腎、精巣、及び卵巣などの器官でステロイド生合成酵素によって厳密に調節されている。
化学構造としては、ステロイド誘導体であり、天然にある主なアンドロゲンとして、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、その硫酸抱合体(DHEAS)、テストステロン(T)、及びアンドロステンジオン(A4)などがあるが、アンドロゲン作用の最も強いのはTの代謝物であるジヒドロテストステロン(DHT)である。
ステロイドホルモンの合成・分泌は視床下部-下垂体-副腎(生殖腺)系の内分泌系で調節され、副腎、精巣、及び卵巣などの器官でステロイド生合成酵素によって厳密に調節されている。
しかし、なぜ特定臓器で特定のステロイドホルモンが産生・分泌されるのか、また触媒酵素がどのようにして発現・調節されているかについては不明な点が多く残されている。
特に、内因性のアンドロゲンである11-ケトテストステロン(11-KT)は、その存在意義については不明な点が多い。近年、11-KTがユニークな性質を持っており、ヒトでも検出される。また前立腺がん等種々の疾患のバイオマーカーになる可能性が示唆されている(非特許文献1~5)。
特に、内因性のアンドロゲンである11-ケトテストステロン(11-KT)は、その存在意義については不明な点が多い。近年、11-KTがユニークな性質を持っており、ヒトでも検出される。また前立腺がん等種々の疾患のバイオマーカーになる可能性が示唆されている(非特許文献1~5)。
アンドロゲンの生体内濃度の評価には、液体クロマトグラフィー質量分析法、例えば、高速液体クロマトグラフ(HPLC)とタンデム四重極型質量分析計(MS/MS)とを組み合わせたLC-MS/MSが広く利用されているが、その際、検量線試料と実試料との間のマトリックスの違いに起因するレスポンスの差を補正することを目的に、内部標準物質が使用されている。このような内部標準物質として、例えば、外因性の化合物である安定同位体標識化合物のプロゲステロン-2,2,4,6,6,17α,21,21,21-d9(PROG-d9)、4-プレグネン-17α-オール-3,20-ジオン-2,2,4,6,6,21,21,21-d8(17OHPROG-d8)、テストステロン-1,2-d2(T-d2)、コルチゾール-9,11,12,12-d4(Cortisol-d4)、ドロスピレノン(Drospirenone)、及びゲストデン(Gestodene)が使用されている(非特許文献6)。
なお、内部標準物質を用いた内因性のアンドロゲンの測定においては、前処理において固相抽出や誘導体化が必要であった。また、固相抽出にはコストがかかるといった問題があった(非特許文献7)。
J. Steroid Biochem Mol. Biol. 166 (2017) 54-67
J Clin Endocrinol Metab. 101 (10) (2016) 3582-3591
PLoS One 11(7): e0159867. Doi:10.1371/journal.pone.0159867
J. Steroid Biochem Mol. Biol. 138 (2013) 312-142
Molecular and Cellular Endocrinology 441 (2017) 76-85
J. Chromatography B, 1013, 131-138(2016)
J. Clin. Endocrinol Metab. 98:1182-1188(2013)
従来は、アンドロゲンについては、テストステロン及びジヒドロテストステロンを測定することで十分であると考えられてきた。しかし、本発明者らは、これらの測定に加えて、アンドロゲン活性を有する代謝物11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)、その前駆体である11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)及び11-ケトテストステロン(11-KT)、ならびに一過性代謝物(中間代謝物)である11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)の生体内濃度の評価も、アンドロゲンに関連する疾患の解明や薬剤の薬理効果のより正確な判定につながることを見出し、これらの測定方法の開発を試みた。
前記の11-KDHT、11-KA4、及び11-KTなどの11-oxyganated C19 steroid(11-ox C19)は、11位が酸化されたアンドロゲンの総称であるが、これまで魚類において研究され、近年ヒトを含む哺乳類の生体内での存在が確認され、その役割が注目されている。しかしながら、これまでにLC-MS/MS及びUPLC-MS/MSを用いた測定法が報告されているが、これらの測定法は内部標準物質に安定同位体標識体を使用していないため、11-ox C19を正確に定量していない懸念があった。
また、内部標準物質として安定同位体標識化合物を使用する場合、前述のPROG-d9、17OHPROG-d8、T-d2、Cortisol-d4、Drospirenone、及びGestodeneは、測定対象物質との保持時間が異なるため、内因性の測定対象物質に対するマトリックス効果を十分に補正することができていなかった。
また、内部標準物質として安定同位体標識化合物を使用する場合、前述のPROG-d9、17OHPROG-d8、T-d2、Cortisol-d4、Drospirenone、及びGestodeneは、測定対象物質との保持時間が異なるため、内因性の測定対象物質に対するマトリックス効果を十分に補正することができていなかった。
また、11-KA4、11-KT、及び11-OHTについては、それらの測定に有用な内部標準物質が存在しておらず、それらの安定同位体標識化合物の入手が困難であった。そのため、それらの製造を本発明者らは試みたが、非常に困難であった。すなわち、本発明者らは、測定すべきアンドロゲンを重水素化して、当該アンドロゲンの安定同位体標識化合物を製造しようと試みたが、アンドロゲンの特定の位置を重水素化するのが困難であった。また、あらかじめ重水素化した化合物を出発物質として、当該アンドロゲンの安定同位体標識化合物を製造することも試みたが、途中で、重水素が脱落したり、立体異性体が生じたりして、容易に合成することはできなかった。特に、[2,2,4,6,6,16,16-D7]11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4-d7)から[2,2,4,6,6,16,16-D7]11-ケトテストステロン(11-KT-d7)を得る還元反応では、通常の条件では立体異性体が現れ、所望の収率で11-KT-d7を得ることができなかった。本発明者らは、立体異性体を生じさせない方法として、ラット精巣ミクロソームを利用した生合成も試みたが、前記の方法に比べて収率は低く、一回の反応に使用できる量も少量であった(化学合成の1/10000程度)。
安定同位体標識した誘導体化試薬を用いて、誘導体化反応により測定対象物質の安定同位体標識誘導体を作製する方法もあるが、前処理操作が煩雑になること、また全ての測定対象物質の構造に共通するカルボニル基に対するオキシム誘導体化は、立体異性を持つ誘導体を生じさせ、生成するピークが複数に分裂するため、m/zや構造が近い測定対象物質の場合、オキシム誘導体化により他の測定対象物質やマトリックス中のその他の内因性ステロイドとのスペクトルグラム上でのピーク分離が複雑化することで解析が煩雑又は不可能であった。
本発明の課題は、アンドロゲンの測定に有用な新規の内部標準物質を提供することにある。
本発明の課題は、また、前処理を簡略化し得る、液体クロマトグラフィー質量分析法、特にLC-MS/MSを用いた、高選択性かつ高感度(正確)なアンドロゲンの測定方法を提供することにもある。
本発明の課題は、さらに、上記アンドロゲンの測定方法を用いる疾患の鑑別法を提供することにもある。
本発明の課題は、また、前処理を簡略化し得る、液体クロマトグラフィー質量分析法、特にLC-MS/MSを用いた、高選択性かつ高感度(正確)なアンドロゲンの測定方法を提供することにもある。
本発明の課題は、さらに、上記アンドロゲンの測定方法を用いる疾患の鑑別法を提供することにもある。
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、アンドロゲンを測定するための内部標準物質として使用し得る新規な安定同位体標識化合物を、特定の溶媒で還元反応を行うことで、効率よく合成することに成功した。本発明者らは、この新規の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用することにより、前処理を簡略化することや、高選択的にかつ高感度(正確)にアンドロゲンを測定することが可能となることを見出した。また、本発明者らは、この測定方法を用いて、健常者、ならびに前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、又は糖尿病性腎症の患者のアンドロゲンを測定したところ、健常者と比較して、これら患者において11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンが低値又は高値(特に、高値)を示すことも見出した。
以上の知見をもとに、本発明者らは本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
以上の知見をもとに、本発明者らは本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔1〕
以下の化学構造式(I)~(III):
(前記式中、Dは重水素を示す)
からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される安定同位体標識化合物。
〔2〕
試料中のアンドロゲンを液体クロマトグラフィー質量分析により測定するための方法であって、前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔11〕に記載の式(IV)で表される安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する方法。
〔3〕
以下の手順:
(手順1)測定対象物質のアンドロゲンを溶媒に溶解して、測定対象標準溶液を作製する手順;
(手順2)前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔11〕に記載の式(IV)で表される安定同位体標識化合物を溶媒に溶解して、内標標準溶液を作製する手順;
(手順3)測定すべき試料と、前記手順2で作製された内標標準溶液及び溶媒とを合わせて、測定対象物質濃度測定用試料を作製する手順;
(手順4)測定すべき試料と、前記手順1で作製された測定対象標準溶液及び前記手順2で作製された内標標準溶液とを合わせて、添加回収試験用試料を作製する手順;及び
(手順5)前記手順3で作製された測定対象物質濃度測定用試料及び前記手順4で作製された添加回収試験用試料を、それぞれ、液体クロマトグラフィー質量分析で分析する手順
を含む、前記項目〔2〕に記載の方法。
〔4〕
前記アンドロゲンが、11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、11-ケトジヒドロテストステロン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンからなる群から選択される少なくとも一つである、前記項目〔2〕又は〔3〕に記載の方法。
〔5〕
前記手順1に記載の測定対象標準溶液中のアンドロゲンの濃度が0.01~20ng/mLである、前記項目〔3〕又は〔4〕に記載の方法。
〔6〕
前記手順2に記載の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度が10ng/mLである、前記項目〔3〕~〔5〕のいずれか一項に記載の方法。
〔7〕
前記項目〔2〕~〔6〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンの少なくとも一つを測定することを含む、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つの鑑別法。
〔8〕
前記項目〔2〕~〔6〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別法。
〔9〕
11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンのいずれかであることを特徴とする、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つを鑑別するためのバイオマーカー。
〔10〕
11-ケトアンドロステンジオンであることを特徴とする、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカー。
〔11〕
前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物を製造するための方法であって、以下の工程:
(工程1)以下の式(IV):
で表される化合物を、酸化反応に付して、以下の式(I):
で表される化合物を得る工程;
(工程2)前記式(I)の化合物を、超脱水溶媒に溶解させてから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(II):
で表される化合物を得る工程;及び
(工程3)前記式(IV)の化合物を、超脱水溶媒に溶解してから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(III):
で表される化合物を得る工程
からなる群から選択されるいずれか一つの工程を含む方法(前記式中、Dは重水素を示す)。
以下の化学構造式(I)~(III):
(前記式中、Dは重水素を示す)
からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される安定同位体標識化合物。
〔2〕
試料中のアンドロゲンを液体クロマトグラフィー質量分析により測定するための方法であって、前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔11〕に記載の式(IV)で表される安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する方法。
〔3〕
以下の手順:
(手順1)測定対象物質のアンドロゲンを溶媒に溶解して、測定対象標準溶液を作製する手順;
(手順2)前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔11〕に記載の式(IV)で表される安定同位体標識化合物を溶媒に溶解して、内標標準溶液を作製する手順;
(手順3)測定すべき試料と、前記手順2で作製された内標標準溶液及び溶媒とを合わせて、測定対象物質濃度測定用試料を作製する手順;
(手順4)測定すべき試料と、前記手順1で作製された測定対象標準溶液及び前記手順2で作製された内標標準溶液とを合わせて、添加回収試験用試料を作製する手順;及び
(手順5)前記手順3で作製された測定対象物質濃度測定用試料及び前記手順4で作製された添加回収試験用試料を、それぞれ、液体クロマトグラフィー質量分析で分析する手順
を含む、前記項目〔2〕に記載の方法。
〔4〕
前記アンドロゲンが、11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、11-ケトジヒドロテストステロン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンからなる群から選択される少なくとも一つである、前記項目〔2〕又は〔3〕に記載の方法。
〔5〕
前記手順1に記載の測定対象標準溶液中のアンドロゲンの濃度が0.01~20ng/mLである、前記項目〔3〕又は〔4〕に記載の方法。
〔6〕
前記手順2に記載の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度が10ng/mLである、前記項目〔3〕~〔5〕のいずれか一項に記載の方法。
〔7〕
前記項目〔2〕~〔6〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンの少なくとも一つを測定することを含む、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つの鑑別法。
〔8〕
前記項目〔2〕~〔6〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別法。
〔9〕
11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオンのいずれかであることを特徴とする、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つを鑑別するためのバイオマーカー。
〔10〕
11-ケトアンドロステンジオンであることを特徴とする、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカー。
〔11〕
前記項目〔1〕に記載の安定同位体標識化合物を製造するための方法であって、以下の工程:
(工程1)以下の式(IV):
で表される化合物を、酸化反応に付して、以下の式(I):
で表される化合物を得る工程;
(工程2)前記式(I)の化合物を、超脱水溶媒に溶解させてから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(II):
で表される化合物を得る工程;及び
(工程3)前記式(IV)の化合物を、超脱水溶媒に溶解してから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(III):
で表される化合物を得る工程
からなる群から選択されるいずれか一つの工程を含む方法(前記式中、Dは重水素を示す)。
本発明の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する液体クロマトグラフィー質量分析により、アンドロゲン、特に11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)の高選択性かつ高感度な測定を可能にする。本発明の安定同位体標識化合物によれば、アンドロゲンの生体内での代謝の流れ(産生速度及び消失速度)を明らかにすることができる。特に、本発明の安定同位体標識化合物は、重水素化された位置、すなわち標識位置が明確であるので、代謝物の構造予想に有利に働く。また、本発明の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用することで、簡便な前処理での測定も可能となった。
また、本発明によれば、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症、特に前立腺がん及び去勢抵抗性前立腺がんの鑑別も可能となった。
さらに、本発明の製造方法によれば、還元反応において超脱水の有機溶媒を用いることで、原料の重水素化化合物から重水素が脱離したり、立体異性体が生じたりすることが抑えられ、良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物を得ることができる。
また、本発明によれば、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症、特に前立腺がん及び去勢抵抗性前立腺がんの鑑別も可能となった。
さらに、本発明の製造方法によれば、還元反応において超脱水の有機溶媒を用いることで、原料の重水素化化合物から重水素が脱離したり、立体異性体が生じたりすることが抑えられ、良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物を得ることができる。
本発明の安定同位体標識化合物は、前記項目〔1〕の化学構造式からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される。前記の化学構造式で表される化合物の名称及び略称を以下の表に示す。
本発明の安定同位体標識化合物は、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)による試料中のアンドロゲンの測定に内部標準物質として使用することができる。
本発明の安定同位体標識化合物は、液体クロマトグラフィー質量分析において、慣用の手順、例えば、前記項目〔3〕の手順で使用することができる。
本発明の安定同位体標識化合物は、液体クロマトグラフィー質量分析において、慣用の手順、例えば、前記項目〔3〕の手順で使用することができる。
本発明の測定方法において測定対象物質となるアンドロゲンは、特に制限されず、内因性のものでも外因性のものでもよく、11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)、テストステロン(T)、ジヒドロテストステロン(DHT)、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)などが例示される。
特に、高選択的にかつ高感度(正確)な測定が行える点から、測定対象物質は、好ましくは11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)、テストステロン(T)、及びジヒドロテストステロン(DHT)であり、より好ましくは11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)である。
とりわけ、内部標準物質として11-KA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)が好ましく;内部標準物質として11-KT-d7が使用される場合は、測定対象物質は11-ケトテストステロン(11-KT)が好ましく;内部標準物質として11-OHT-d7が使用される場合は、測定対象物質は11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)が好ましく;内部標準物質としては11-OHA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)が好ましく;内部標準物質としてはT-d3が使用される場合は、測定対象物質はテストステロン(T)が好ましく;内部標準物質としてはDHT-d3が使用される場合は、測定対象物質はジヒドロテストステロン(DHT)が好ましい。
本発明においては、測定対象物質となるアンドロゲンは1種でもいいし、2種以上であってもよい。本発明においては、一度に、2種以上のアンドロゲンを測定することができる。また、このような際には、本発明の安定同位体標識化合物は、2種以上組み合わせて内部標準物質として使用してもよく、ならびに/あるいは他の内部標準物質、例えば、T-d3、DHT-d3、又は11-OHA4-d7と併用してもよい。
特に、高選択的にかつ高感度(正確)な測定が行える点から、測定対象物質は、好ましくは11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)、テストステロン(T)、及びジヒドロテストステロン(DHT)であり、より好ましくは11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)である。
とりわけ、内部標準物質として11-KA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)が好ましく;内部標準物質として11-KT-d7が使用される場合は、測定対象物質は11-ケトテストステロン(11-KT)が好ましく;内部標準物質として11-OHT-d7が使用される場合は、測定対象物質は11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)が好ましく;内部標準物質としては11-OHA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)が好ましく;内部標準物質としてはT-d3が使用される場合は、測定対象物質はテストステロン(T)が好ましく;内部標準物質としてはDHT-d3が使用される場合は、測定対象物質はジヒドロテストステロン(DHT)が好ましい。
本発明においては、測定対象物質となるアンドロゲンは1種でもいいし、2種以上であってもよい。本発明においては、一度に、2種以上のアンドロゲンを測定することができる。また、このような際には、本発明の安定同位体標識化合物は、2種以上組み合わせて内部標準物質として使用してもよく、ならびに/あるいは他の内部標準物質、例えば、T-d3、DHT-d3、又は11-OHA4-d7と併用してもよい。
前記手順1~3で使用される溶媒は、液体クロマトグラフィー質量分析用の試料作製に慣用されるものであれば、特に制限されず、アセトニトリル、アセトン、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン、1-プロパノール、2-プロパノールなどの有機溶媒が例示される。高選択的にかつ高感度(正確)な測定が行える点からアセトニトリルが好ましい。
前記手順1の測定対象物質標準溶液中のアンドロゲンの濃度は、特に限定されないが、高選択的にかつ高感度(正確)な測定が行える点から、好ましくは0.01~100ng/mL、より好ましくは0.01~50ng/mL、特に好ましくは0.01~20ng/mLである。
前記手順2の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度は、特に限定されないが、高選択的にかつ高感度(正確)な測定が行える点から、好ましくは10ng/mL、より好ましくは1ng/mL、特に好ましくは0.5ng/mLである。
本発明において、液体クロマトグラフィー質量分析によるアンドロゲンの測定には、アンドロゲンの検出及び/又は定量が含まれる。
本発明で使用される液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)とは、液体クロマトグラフと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表し、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS、LC-APCI-MS/MS等が例示され、好ましくはLC-MS/MSである。これらの測定自体は一般的な方法によることができる。
LC-MSにおけるイオン化は、例えば、大気圧化学イオン化法(Atmospheric Pressure Chemical Ionization)、ESI、APPI等が挙げられるが、中でも、正イオン検出ESIを用いることが望ましい。
また、質量分析部には、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、本発明では、定量性が良く、ダイナミックレンジも広く直線性も良好な四重極型を使用することが好ましい。
さらに、定量におけるイオンの検出としては、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリング(Selected Ion Monitoring)や、1つ目の質量分析部で生成したイオン種のうち1つを前駆イオンとして選択し、2つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング(Selected Reaction Monitoring:SRM)等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル/ノイズ比が向上するSRMによる測定が好ましい。
さらに、本発明の測定方法において、「測定すべき試料」とは、特に限定はなく、生物、環境、又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、汗、尿、糞、胆汁、組織、生体細胞、組織又は細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、食料品、医薬品等が挙げられる。中でも、生体由来試料として、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、組織及び生体細胞等が、環境由来試料としては、廃水、河川水等が、工業製品由来試料としては、医薬品等が好ましい。
本発明の測定方法は、試料中の11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(以下、総称して「本発明バイオマーカー」ともいう)の少なくとも一つ、好ましくは11-ケトアンドロステンジオンを測定することにより、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症(以下、総称して「鑑別対象疾患」ともいう)の少なくとも一つ、好ましくは前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別のために使用することができる。
具体的には、本発明の測定方法を用いて、被検体及び対照体からのそれぞれの試料中の本発明バイオマーカーの少なくとも一つを測定し、得られた被検体の測定値と対照体の測定値とを対比することにより、鑑別対象疾患の罹患の有無を鑑別することができる。例えば、被検体の測定値が対照体の測定値よりも、統計学的手法により有意に差があれば、例えば低いか又は高ければ、特に高ければ、当該被検体は鑑別対象疾患に罹患していると鑑別することができる。
本発明の鑑別法において、「被検体」とはヒトを含む動物をいい、また「対照体」とは鑑別対象疾患に罹患していないと診断されたヒトを含む動物をいう。「試料」としては、例えば、血液、唾液、涙液、汗、尿、糞、胆汁、組織、生体細胞、組織又は細胞培養液又は臓器から得られる調製物を挙げることができる。
本発明では、11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、及び11β-ヒドロキシアンドロステンジオン、特に11-ケトアンドロステンジオンは、鑑別対象疾患の少なくとも一つ、特に前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカーとして使用することができる。
本発明は、本発明の安定同位体標識化合物を含む、本発明の測定方法に使用するための測定用キットにも関する。
また、本発明は、本発明の安定同位体標識化合物を含む、本発明の鑑別法に使用するための鑑別用キットにも関する。
また、本発明は、本発明の安定同位体標識化合物を含む、本発明の鑑別法に使用するための鑑別用キットにも関する。
本発明の方法のために用いるキットは、本発明の安定同位体標識化合物を含むが、それ以外に、緩衝液、酸、塩基、アルコール、本発明のバイオマーカーなどのアンドロゲン、注射器、及び測定手順を記載した文書から選択される少なくとも1つを含むことができる。これらに加えて、本発明の鑑別法のために用いるキットは、さらに、判定基準を記載した文書を含むことができる。
より、詳細には、本発明の「鑑別用キット」には、被検体からの試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値と、対照体及び鑑別対象疾患患者の試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値とを対比して、鑑別対象疾患を鑑別するために必要な手段が含まれ、例えば、被検体からの試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定手段として、試料の採取用具、カラムカートリッジ等、及び、被検体からの試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値と対照体及び鑑別対象疾患患者の試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値とを対比する手段として、対照体及び鑑別対象疾患患者のそれぞれの測定値の対比表が挙げられる。中でも、当該対比表は、医師の判断によらなくとも鑑別対象疾患を鑑別することが可能となるものであり、特に有用である。
本発明は、本発明の測定方法を用いて、試料中の本発明バイオマーカーの少なくとも一つ、特に11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、鑑別対象疾患、特に前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの治療又は予防剤のスクリーニング方法にも関する。
本発明は、特に、本発明の測定方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの治療又は予防剤のスクリーニング方法にも関する。
本発明は、特に、本発明の測定方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの治療又は予防剤のスクリーニング方法にも関する。
本発明の安定同位体標識化合物は、前記項目〔11〕の方法で効率よく合成することができる。すなわち、前記項目〔11〕の方法では、還元反応において超脱水の有機溶媒を用いることにより、原料の重水素化化合物から重水素が脱離したり、立体異性体が生じたりすることが抑えられ、良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物を得ることができる。
前記項目〔11〕の工程1での酸化反応は、ヒドロキシル基をカルボニル基に変換させる酸化反応であれば、特に制限されず、デス・マーチン酸化、ジョーンズ酸化、スワン酸化が例示される。好ましくはデス・マーチン酸化である。
デス・マーチン酸化は慣用の手法で行い得るが、例えば以下の方法で行ってもよい。
先ず、式(IV)の化合物:[2,2,4,6,6,16,16-D7]11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4-d7)を溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。この11-OHA4-d7溶液にデス・マーチン酸化用試薬を添加して、例えば室温にて、適切な時間、例えば約10~約60分間、好ましくは約30分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(I)の化合物(11-KA4-d7)を単離する。
上記のデス・マーチン酸化用試薬は、慣用の試薬を使用してもよく、例えば、デス・マーチン過ヨウ素酸と呼ばれる1,1,1-トリアセトキシ-1,1-ジヒドロ-1,2-ベンズヨードキソール-3(1H)-オンを使用することができる。
また、上記の溶媒は、デス・マーチン酸化に慣用されるものであれば特に制限されず、例えば、有機溶媒、好ましくはジクロロメタンを使用することができる。
デス・マーチン酸化は慣用の手法で行い得るが、例えば以下の方法で行ってもよい。
先ず、式(IV)の化合物:[2,2,4,6,6,16,16-D7]11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4-d7)を溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。この11-OHA4-d7溶液にデス・マーチン酸化用試薬を添加して、例えば室温にて、適切な時間、例えば約10~約60分間、好ましくは約30分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(I)の化合物(11-KA4-d7)を単離する。
上記のデス・マーチン酸化用試薬は、慣用の試薬を使用してもよく、例えば、デス・マーチン過ヨウ素酸と呼ばれる1,1,1-トリアセトキシ-1,1-ジヒドロ-1,2-ベンズヨードキソール-3(1H)-オンを使用することができる。
また、上記の溶媒は、デス・マーチン酸化に慣用されるものであれば特に制限されず、例えば、有機溶媒、好ましくはジクロロメタンを使用することができる。
前記項目〔11〕の工程2及び3での還元反応は、カルボニル基をヒドロキシル基に変換させる還元反応であれば、特に制限されず、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を還元剤として用いる還元、接触還元、水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)が例示される。好ましくは水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として用いる還元である。
これらの工程で使用される超脱水溶媒は、水分含有量が0.001%(10ppm)以下まで抑えられた溶媒であれば特に制限されず、メタノール、エタノールなどのアルコール;ならびにベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレンなどの芳香族炭化水素から選択された有機溶媒を超脱水したものが例示される。良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物が得られることから、超脱水メタノール及び超脱水ベンゼンが好ましく、特に原料の重水素化化合物を超脱水芳香族炭化水素、とりわけ超脱水ベンゼンに溶解させるのが好ましく、還元剤を超脱水アルコール、とりわけ超脱水メタノールに溶解させるのも好ましい。
これらの工程で使用される超脱水溶媒は、水分含有量が0.001%(10ppm)以下まで抑えられた溶媒であれば特に制限されず、メタノール、エタノールなどのアルコール;ならびにベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレンなどの芳香族炭化水素から選択された有機溶媒を超脱水したものが例示される。良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物が得られることから、超脱水メタノール及び超脱水ベンゼンが好ましく、特に原料の重水素化化合物を超脱水芳香族炭化水素、とりわけ超脱水ベンゼンに溶解させるのが好ましく、還元剤を超脱水アルコール、とりわけ超脱水メタノールに溶解させるのも好ましい。
また、前記の工程2及び3での還元反応では、超脱水していない溶媒を超脱水溶媒と併用してもよい。特に、超脱水していない溶媒は、原料の重水素化化合物を超脱水溶媒で溶解する際に併用されるのが好ましい。
超脱水していない溶媒としては、ピリジンが挙げられる。
超脱水していない溶媒としては、ピリジンが挙げられる。
前記項目〔11〕の工程2及び3において水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として用いる還元は、慣用の手法で行い得るが、以下の方法によって行ってもよい。
すなわち、工程2は、先ず、式(I)の化合物(11-KA4-d7)を超脱水溶媒に溶解して11-KA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してNaBH4溶液を得る。そして、11-KA4-d7溶液にNaBH4溶液を、例えば約1~約10分間、好ましくは約5分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約10~約60分間、好ましくは約30分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(II)の化合物(11-KT-d7)を単離する。
工程3は、先ず、式(IV)の化合物(11-OHA4-d7)を超脱水溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してNaBH4溶液を得る。そして、11-OHA4-d7溶液にNaBH4溶液を、例えば約5~約30分間、好ましくは約15分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約10~約100分間、好ましくは約1時間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(III)の化合物(11-OHT-d7)を単離する。
すなわち、工程2は、先ず、式(I)の化合物(11-KA4-d7)を超脱水溶媒に溶解して11-KA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してNaBH4溶液を得る。そして、11-KA4-d7溶液にNaBH4溶液を、例えば約1~約10分間、好ましくは約5分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約10~約60分間、好ましくは約30分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(II)の化合物(11-KT-d7)を単離する。
工程3は、先ず、式(IV)の化合物(11-OHA4-d7)を超脱水溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してNaBH4溶液を得る。そして、11-OHA4-d7溶液にNaBH4溶液を、例えば約5~約30分間、好ましくは約15分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約10~約100分間、好ましくは約1時間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式(III)の化合物(11-OHT-d7)を単離する。
以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、実施例に用いた装置及び材料は以下の通りである。
試薬は特級又はHPLC用規格品もしくはそれと同等以上のものを用いた。また、水には精製水を「超純水製造装置(M/EQM/717)」で処理したものを用いた。
(3) 製造
実施例1 11-KA4-d7の製造
11-OHA4-d7を15mg秤取し、ジクロロメタン5mLに溶解した。得られた溶液にデス-マーチン過よう素酸1mLを加えて、室温で30分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和NaHCO3を3mL加えた。次に、この溶液にジクロロメタン5mLを加えて抽出し有機層を得た。ジクロロメタン5mLの抽出をさらに2回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を窒素気流下溶媒留去し残渣を得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣10.75mgを得た(11-KA4-d7として収率71.2%)。これをNMR分析に供した。
実施例1 11-KA4-d7の製造
11-OHA4-d7を15mg秤取し、ジクロロメタン5mLに溶解した。得られた溶液にデス-マーチン過よう素酸1mLを加えて、室温で30分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和NaHCO3を3mL加えた。次に、この溶液にジクロロメタン5mLを加えて抽出し有機層を得た。ジクロロメタン5mLの抽出をさらに2回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を窒素気流下溶媒留去し残渣を得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣10.75mgを得た(11-KA4-d7として収率71.2%)。これをNMR分析に供した。
実施例2 11-KT-d7の製造
11-OHA4-d7を40mg秤取し、ジクロロメタン10mLに溶解した。得られた溶液にデス-マーチン過よう素酸1mLを加えて、室温で30分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和NaHCO3を6mL加えた。次に、この溶液にジクロロメタン6mLを加えて有機層を得た。ジクロロメタン10mLを用いてさらに抽出し、有機層を得た。ジクロロメタン10mLを用いた抽出をさらに2回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を減圧下溶媒留去し残渣63.2mgを得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣37.5mgを得た(11-KA4-d7として収率94.69%)。
このようにして得られた残渣を3mLのベンゼン(超脱水)と2mLのピリジンに溶解し11-KA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方で、5mgのNaBH4を5mLのメタノール(超脱水)に溶解し、得られた溶液を上記の11-KA4-d7溶液に5分間かけて滴下し、続けて氷冷下30分間撹拌して反応させた。反応終了後、反応液に氷酢酸2mLを加えて過剰のNaBH4を分解した。減圧下、反応液の溶媒を留去し残渣63.2mgを得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下、溶媒留去し残渣37.1mgを得た(11-KA4-d7を原料とし、11-KT-d7として収率98.4%)。これをNMR分析に供した。
11-OHA4-d7を40mg秤取し、ジクロロメタン10mLに溶解した。得られた溶液にデス-マーチン過よう素酸1mLを加えて、室温で30分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和NaHCO3を6mL加えた。次に、この溶液にジクロロメタン6mLを加えて有機層を得た。ジクロロメタン10mLを用いてさらに抽出し、有機層を得た。ジクロロメタン10mLを用いた抽出をさらに2回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を減圧下溶媒留去し残渣63.2mgを得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣37.5mgを得た(11-KA4-d7として収率94.69%)。
このようにして得られた残渣を3mLのベンゼン(超脱水)と2mLのピリジンに溶解し11-KA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方で、5mgのNaBH4を5mLのメタノール(超脱水)に溶解し、得られた溶液を上記の11-KA4-d7溶液に5分間かけて滴下し、続けて氷冷下30分間撹拌して反応させた。反応終了後、反応液に氷酢酸2mLを加えて過剰のNaBH4を分解した。減圧下、反応液の溶媒を留去し残渣63.2mgを得た。得られた残渣をクロロホルム:アセトン(10:1)のTLCで精製し、11-KT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下、溶媒留去し残渣37.1mgを得た(11-KA4-d7を原料とし、11-KT-d7として収率98.4%)。これをNMR分析に供した。
実施例3 11-OHT-d7の製造
11-OHA4-d7の15mgを1.5mLのベンゼン(超脱水)と1mLのピリジンに溶解し11-OHA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方、5mgのNaBH4を5mLのメタノール(超脱水)に溶解し、得られた溶液を上記の11-OHA4-d7溶液に15分間かけて滴下した。1時間氷冷下で撹拌して反応させ、反応終了後、氷酢酸2mLを加えて過剰のNaBH4を分解した。減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をベンゼン:アセトン(3:1)のTLCで精製し、11-OHT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出させた。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下溶媒留去し残渣16.7mgを得た(11-OHT-d7として収率110.6%)。これをNMR分析に供した。
11-OHA4-d7の15mgを1.5mLのベンゼン(超脱水)と1mLのピリジンに溶解し11-OHA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方、5mgのNaBH4を5mLのメタノール(超脱水)に溶解し、得られた溶液を上記の11-OHA4-d7溶液に15分間かけて滴下した。1時間氷冷下で撹拌して反応させ、反応終了後、氷酢酸2mLを加えて過剰のNaBH4を分解した。減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をベンゼン:アセトン(3:1)のTLCで精製し、11-OHT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出させた。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下溶媒留去し残渣16.7mgを得た(11-OHT-d7として収率110.6%)。これをNMR分析に供した。
(4) NMR分析
実施例1~3で製造された化合物について、1H-NMR及び13C-NMR測定ならびに精密質量測定を行った。その結果を以下の表に示す。
実施例1~3で製造された化合物について、1H-NMR及び13C-NMR測定ならびに精密質量測定を行った。その結果を以下の表に示す。
表6及び7に示した結果から、実施例1~3で製造された化合物の構造、標識位置、及び標識化率を確認した。その結果、実施例1~3において、目的とする安定同位体標識化合物11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7が製造されたことを確認することができた。いずれもD0体の混入はみられなかった。
2.アンドロゲンの測定(1)
LC-MS/MSを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1) 試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1 測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン(T)、ジヒドロテストステロン(DHT)、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)を使用した。
(1)-2 内部標準物質
内部標準物質(IS)として、市販のT-d3(CDN ISOTOPES製)、DHT-d3(CDN ISOTOPES製)、及び11-OHA4-d7(CDN ISOTOPES製);ならびに前記実施例1~3で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3 測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ISをそれぞれアセトニトリルに溶解して1mg/mL保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ISの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL IS混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を0.01~20ng/mLの濃度で調製した。また、上記のIS混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を10ng/mLの濃度で調製した。
(1)-4 ヒト血漿
ヒト血漿として、KAC(BIOPREDIC)より購入した個体別ヒト血漿(男女各3検体)を等量混合したプール血漿を使用した。
(1)-5 試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は特級又はHPLC用規格品もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。
LC-MS/MSを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1) 試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1 測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン(T)、ジヒドロテストステロン(DHT)、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)を使用した。
(1)-2 内部標準物質
内部標準物質(IS)として、市販のT-d3(CDN ISOTOPES製)、DHT-d3(CDN ISOTOPES製)、及び11-OHA4-d7(CDN ISOTOPES製);ならびに前記実施例1~3で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3 測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ISをそれぞれアセトニトリルに溶解して1mg/mL保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ISの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL IS混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を0.01~20ng/mLの濃度で調製した。また、上記のIS混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を10ng/mLの濃度で調製した。
(1)-4 ヒト血漿
ヒト血漿として、KAC(BIOPREDIC)より購入した個体別ヒト血漿(男女各3検体)を等量混合したプール血漿を使用した。
(1)-5 試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は特級又はHPLC用規格品もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。
(2) 試験方法
(2)-1 ブランク試料
アセトニトリル100μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2 ゼロ試料
アセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3 検量線用標準試料
アセトニトリル50μL、測定対象標準溶液50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4 ヒト血漿試料
ヒト血漿を50μLずつ分取し、内標標準溶液50μL及びアセトニトリル50μLを加えて測定対象物質濃度測定用試料(測定対象物質濃度QC、n=3)を調製した。
また、ヒト血漿を50μLずつ分取し、内標標準溶液50μL及び測定対象標準溶液50μLを加えて添加回収試験用試料(低濃度QC:0.1ng/mL及び中濃度QC:1ng/mL、高濃度QC:10ng/mL、各n=3)を調製した。
(2)-5 液/液抽出(Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction)
前記の調製した各試料に5mol/L酢酸アンモニウム50μLを加えて攪拌したのち毎分12,000回転で2分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してLC-MS/MSで分析した。LC-MS/MSの条件は以下に示す。
(2)-1 ブランク試料
アセトニトリル100μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2 ゼロ試料
アセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3 検量線用標準試料
アセトニトリル50μL、測定対象標準溶液50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4 ヒト血漿試料
ヒト血漿を50μLずつ分取し、内標標準溶液50μL及びアセトニトリル50μLを加えて測定対象物質濃度測定用試料(測定対象物質濃度QC、n=3)を調製した。
また、ヒト血漿を50μLずつ分取し、内標標準溶液50μL及び測定対象標準溶液50μLを加えて添加回収試験用試料(低濃度QC:0.1ng/mL及び中濃度QC:1ng/mL、高濃度QC:10ng/mL、各n=3)を調製した。
(2)-5 液/液抽出(Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction)
前記の調製した各試料に5mol/L酢酸アンモニウム50μLを加えて攪拌したのち毎分12,000回転で2分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してLC-MS/MSで分析した。LC-MS/MSの条件は以下に示す。
(2)-6 LC-MS/MS
(a) LC部
装置:Nexera X2(島津製作所)
分析カラム:Kinetex 2.6μm EVO C18 (2.6μm、4.6mmI.D.×150mm)、(Phenomenex)
カラム温度:45°C
移動相:A 0.05vol%酢酸水溶液、B アセトニトリル(LC/MS用)(Wako)
(a) LC部
装置:Nexera X2(島津製作所)
分析カラム:Kinetex 2.6μm EVO C18 (2.6μm、4.6mmI.D.×150mm)、(Phenomenex)
カラム温度:45°C
移動相:A 0.05vol%酢酸水溶液、B アセトニトリル(LC/MS用)(Wako)
(c) データ解析部
制御コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (J3LPQ02 DELL)
解析コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (3XKPQ02 DELL)
解析ソフトウエア:Analyst1.6.2 (AB SCIEX)
制御コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (J3LPQ02 DELL)
解析コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (3XKPQ02 DELL)
解析ソフトウエア:Analyst1.6.2 (AB SCIEX)
(2)-7 解析
検量線はピーク面積比(測定対象物質/IS)を添加濃度に対してプロットし、重み付け1/x2の回帰直線を求めた。
検量線用標準試料の添加濃度に対する真度は以下の式から算出した。
添加濃度に対する真度(%)=検量線用標準試料の逆回帰濃度/添加濃度×100
精度は以下の式から算出した。
精度(%)=標準偏差/平均値×100
添加回収試験における理論値及び真度は以下の式から算出した。
理論値(ng/mL)=測定対象物質濃度の平均値+添加濃度
真度(%)=平均値/理論値×100
検量線はピーク面積比(測定対象物質/IS)を添加濃度に対してプロットし、重み付け1/x2の回帰直線を求めた。
検量線用標準試料の添加濃度に対する真度は以下の式から算出した。
添加濃度に対する真度(%)=検量線用標準試料の逆回帰濃度/添加濃度×100
精度は以下の式から算出した。
精度(%)=標準偏差/平均値×100
添加回収試験における理論値及び真度は以下の式から算出した。
理論値(ng/mL)=測定対象物質濃度の平均値+添加濃度
真度(%)=平均値/理論値×100
(3) 結果
実施例1~3で製造された安定同位体標識化合物を内部標準物質として用いて測定した結果を以下の表11~14に示す。
実施例1~3で製造された安定同位体標識化合物を内部標準物質として用いて測定した結果を以下の表11~14に示す。
前記の表11~14から、実施例1~3の安定同位体標識化合物を内部標準物質として用いると、前処理を簡略化し得る手法にて、高選択性かつ高感度なアンドロゲンの測定が可能であることが認められた。特に、再現性:Precision(精度)及びAccuracy(真度)をT-d3と比較すると、11-OHT-d7が高精度で高感度に測定可能であることが示された(表13及び14)。
3.アンドロゲンの測定(2)
LC-MS/MSを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1) 試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1 測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン(T)、ジヒドロテストステロン(DHT)、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)を使用した。
(1)-2 内部標準物質
内部標準物質(IS)として、市販のT-d3(Sigma-Aldrich製)、DHT-d3(Sigma-Aldrich製)、及び11-OHA4-d7(C/D/N ISOTOPES製);ならびに前記実施例1~3で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3 測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ISをそれぞれアセトニトリルに溶解して1mg/mL保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ISの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL IS混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を0.01~100ng/mLの濃度で調製した。また、上記のIS混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を2ng/mLの濃度で調製した。
(1)-4 ヒト血漿
健常ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー(BIOPREDIC)より購入した個体別ヒト血漿(男女各6検体)を使用した。
患者由来ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー(ProteoGenex)より購入した、前立腺肥大症患者(男性6検体)、前立腺がん患者(男性6検体)、去勢抵抗性前立腺がん患者(男性2検体)、多嚢胞性卵胞症候群患者(女性6検体)、糖尿病患者(男性5検体)、及び糖尿病性腎症患者(男性7検体)を使用した。
(1)-5 試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は、特級、又はHPLC用規格、分子生物学用規格、もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。
LC-MS/MSを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1) 試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1 測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン(T)、ジヒドロテストステロン(DHT)、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン(11-OHA4)、11β-ヒドロキシテストステロン(11-OHT)、11-ケトアンドロステンジオン(11-KA4)、11-ケトテストステロン(11-KT)、及び11-ケトジヒドロテストステロン(11-KDHT)を使用した。
(1)-2 内部標準物質
内部標準物質(IS)として、市販のT-d3(Sigma-Aldrich製)、DHT-d3(Sigma-Aldrich製)、及び11-OHA4-d7(C/D/N ISOTOPES製);ならびに前記実施例1~3で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3 測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ISをそれぞれアセトニトリルに溶解して1mg/mL保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ISの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して10μg/mL IS混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を0.01~100ng/mLの濃度で調製した。また、上記のIS混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を2ng/mLの濃度で調製した。
(1)-4 ヒト血漿
健常ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー(BIOPREDIC)より購入した個体別ヒト血漿(男女各6検体)を使用した。
患者由来ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー(ProteoGenex)より購入した、前立腺肥大症患者(男性6検体)、前立腺がん患者(男性6検体)、去勢抵抗性前立腺がん患者(男性2検体)、多嚢胞性卵胞症候群患者(女性6検体)、糖尿病患者(男性5検体)、及び糖尿病性腎症患者(男性7検体)を使用した。
(1)-5 試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は、特級、又はHPLC用規格、分子生物学用規格、もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。
(2) 試験方法
(2)-1 ブランク試料
アセトニトリル100μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2 ゼロ試料
アセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3 検量線用標準試料
前記の0.01~100ng/mLの濃度で調製した各測定対象標準溶液50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4 ヒト血漿試料
健常ヒト血漿及び患者由来ヒト血漿50μLにアセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLを添加して調製した。
(2)-5 液/液抽出(Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction)
前記の調製した各試料に5mol/L酢酸アンモニウム50μLを加えて攪拌した後、4℃、毎分13,000回転で5分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してLC-MS/MSで分析した。LC-MS/MSの条件は以下に示す。
(2)-1 ブランク試料
アセトニトリル100μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2 ゼロ試料
アセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3 検量線用標準試料
前記の0.01~100ng/mLの濃度で調製した各測定対象標準溶液50μL及び内標標準溶液50μLの入った1.5mL PPチューブに水50μLを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4 ヒト血漿試料
健常ヒト血漿及び患者由来ヒト血漿50μLにアセトニトリル50μL及び内標標準溶液50μLを添加して調製した。
(2)-5 液/液抽出(Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction)
前記の調製した各試料に5mol/L酢酸アンモニウム50μLを加えて攪拌した後、4℃、毎分13,000回転で5分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してLC-MS/MSで分析した。LC-MS/MSの条件は以下に示す。
(2)-6 LC-MS/MS
(a) LC部
装置:Nexera X2(島津製作所)
分析カラム:Kinetex 2.6μm EVO C18 (2.6μm、4.6mmI.D.×150mm)、(Phenomenex)
カラム温度:45°C
移動相:A 0.05vol%酢酸水溶液、B アセトニトリル(LC/MS用)(Wako)
(a) LC部
装置:Nexera X2(島津製作所)
分析カラム:Kinetex 2.6μm EVO C18 (2.6μm、4.6mmI.D.×150mm)、(Phenomenex)
カラム温度:45°C
移動相:A 0.05vol%酢酸水溶液、B アセトニトリル(LC/MS用)(Wako)
(c) データ解析部
解析コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (DELL)
解析ソフトウエア:Analyst1.6.2 (AB SCIEX)
解析コンピュータ:OPTIPLEX 9010 (DELL)
解析ソフトウエア:Analyst1.6.2 (AB SCIEX)
(2)-7 解析
(a) アンドロゲン濃度の算出
検量線はピーク面積比(測定対象物質/IS)を添加濃度に対してプロットし、重み付け1/x2の回帰直線を求めた。
(b) 検量線及び定量下限の評価
作成した検量線(各濃度n=1)の判断基準は、個々の検量線用標準試料の真度が定量下限において80.0~120.0%、それ以外で85.0~115.0%である試料が、全検量線用標準試料の3/4以上、定量下限及び上限を含む試料とした。
(a) アンドロゲン濃度の算出
検量線はピーク面積比(測定対象物質/IS)を添加濃度に対してプロットし、重み付け1/x2の回帰直線を求めた。
(b) 検量線及び定量下限の評価
作成した検量線(各濃度n=1)の判断基準は、個々の検量線用標準試料の真度が定量下限において80.0~120.0%、それ以外で85.0~115.0%である試料が、全検量線用標準試料の3/4以上、定量下限及び上限を含む試料とした。
(3) 結果
検討した測定対象の検量線は良好な直線性を示し、また、定量下限は、T、DHT、11-OHT、11-KA4、及び11-KTが0.01ng/mL、11-OHA4が0.02ng/mL、11-KDHTが0.1ng/mLだった(表18)。
ISに各測定対象の安定同位体標識体を使用した場合、ISにT-d3を使用した場合と比較して、前記項目「2.アンドロゲンの測定(1)」と同様に、精度及び真度の改善がみられた(但し、11-KDHTは安定同位体標識体がないため、11-KT-d7をISに使用して解析した)。血漿中アンドロゲン濃度を、各測定対象の安定同位体標識体をISに使用して求めた。
血漿中アンドロゲン濃度の平均値及び標準偏差は、Microsoft Excel 2016(Microsoft Corporation)により算出し、以下の表19に表示した。個体別値に定量下限未満(Lower limit of quantification, LLOQ)を含む場合は、以下のように平均値及び標準偏差を算出又は表示した。
・半数例未満がLLOQの場合には、LLOQを0として平均値のみを算出した。
・半数例以上がLLOQの場合には、平均値及び標準偏差を算出せずNC(not calculated)として表示した。
検討した測定対象の検量線は良好な直線性を示し、また、定量下限は、T、DHT、11-OHT、11-KA4、及び11-KTが0.01ng/mL、11-OHA4が0.02ng/mL、11-KDHTが0.1ng/mLだった(表18)。
ISに各測定対象の安定同位体標識体を使用した場合、ISにT-d3を使用した場合と比較して、前記項目「2.アンドロゲンの測定(1)」と同様に、精度及び真度の改善がみられた(但し、11-KDHTは安定同位体標識体がないため、11-KT-d7をISに使用して解析した)。血漿中アンドロゲン濃度を、各測定対象の安定同位体標識体をISに使用して求めた。
血漿中アンドロゲン濃度の平均値及び標準偏差は、Microsoft Excel 2016(Microsoft Corporation)により算出し、以下の表19に表示した。個体別値に定量下限未満(Lower limit of quantification, LLOQ)を含む場合は、以下のように平均値及び標準偏差を算出又は表示した。
・半数例未満がLLOQの場合には、LLOQを0として平均値のみを算出した。
・半数例以上がLLOQの場合には、平均値及び標準偏差を算出せずNC(not calculated)として表示した。
本測定法を用いて、健常男女の血漿、ならびに前立腺肥大症(BPH)、前立腺がん(PCa)、去勢抵抗性前立腺がん(CRPC)、多嚢胞性卵胞症候群(PCOS)、糖尿病(DM)及び糖尿病性腎症(DMN)の患者血漿中アンドロゲン濃度を測定した(表19及び図1~4)。健常者の血漿と比較して、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中では11-KA4が高濃度に検出され、特にCRPCで高かった。また、11-OHA4濃度も健常者の血漿と比較して、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中で高かった。
BPH、PCa、及びCRPC患者の血漿中11-KT濃度は健常男性の1.6~2.1倍高かった。PCOS患者の血漿中T及び11-KT濃度はそれぞれ健常女性の2.0倍及び1.8倍高く、PCOSのアンドロゲン過剰症状を反映した結果が得られた。DM及びDMN男性患者の血漿中T濃度は健常男性と比較して低値を示した。
以上の結果から、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中では11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が上昇しており、これらの疾患のバイオマーカーとして11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が利用できる可能性が示唆された。特に、11-KA4がバイオマーカーとして有効であり、とりわけ、CRPC(去勢抵抗性前立腺癌)とPCa(前立腺癌)を差別化することが可能と考えられた。
BPH、PCa、及びCRPC患者の血漿中11-KT濃度は健常男性の1.6~2.1倍高かった。PCOS患者の血漿中T及び11-KT濃度はそれぞれ健常女性の2.0倍及び1.8倍高く、PCOSのアンドロゲン過剰症状を反映した結果が得られた。DM及びDMN男性患者の血漿中T濃度は健常男性と比較して低値を示した。
以上の結果から、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中では11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が上昇しており、これらの疾患のバイオマーカーとして11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が利用できる可能性が示唆された。特に、11-KA4がバイオマーカーとして有効であり、とりわけ、CRPC(去勢抵抗性前立腺癌)とPCa(前立腺癌)を差別化することが可能と考えられた。
各測定対象の安定同位体標識体をISに使用することで、より正確な定量を可能とする血漿中アンドロゲン測定法が開発できたことが示された。本測定法を用いて健常ヒト血漿及び疾患別患者血漿を測定した結果、11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMNのバイオマーカーとして利用できる可能性が示された。
本発明の測定方法によれば、試料中のアンドロゲンの有無を検出したり、その量を定量したりすることができる。それによって、特定の疾患の診断又は鑑別のためのバイオマーカーとして使用できる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生、食品検査等の分野で利用できる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生、食品検査等の分野で利用できる。
Claims (11)
- 試料中のアンドロゲンを液体クロマトグラフィー質量分析により測定するための方法であって、請求項1に記載の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する方法。
- 以下の手順:
(手順1)測定対象物質のアンドロゲンを溶媒に溶解して、測定対象標準溶液を作製する手順;
(手順2)請求項1に記載の安定同位体標識化合物を溶媒に溶解して、内標標準溶液を作製する手順;
(手順3)測定すべき試料と、前記手順2で作製された内標標準溶液及び溶媒とを合わせて、測定対象物質濃度測定用試料を作製する手順;
(手順4)測定すべき試料と、前記手順1で作製された測定対象標準溶液及び前記手順2で作製された内標標準溶液とを合わせて、添加回収試験用試料を作製する手順;及び
(手順5)前記手順3で作製された測定対象物質濃度測定用試料及び前記手順4で作製された添加回収試験用試料を、それぞれ、液体クロマトグラフィー質量分析で分析する手順
を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記アンドロゲンが、11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、11β-ヒドロキシテストステロン、11-ケトジヒドロテストステロン、テストステロン、及びジヒドロテストステロンからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記手順1に記載の測定対象標準溶液中のアンドロゲンの濃度が0.01~20ng/mLである、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記手順2に記載の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度が10ng/mLである、請求項3~5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項2~6のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、及び11β-ヒドロキシテストステロンの少なくとも一つを測定することを含む、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つの鑑別法。
- 請求項2~6のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の11-ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別法。
- 11-ケトアンドロステンジオン、11-ケトテストステロン、及び11β-ヒドロキシテストステロンのいずれかであることを特徴とする、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つを鑑別するためのバイオマーカー。
- 11-ケトアンドロステンジオンであることを特徴とする、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカー。
- 請求項1に記載の安定同位体標識化合物を製造するための方法であって、以下の工程:
(工程1)以下の式(IV):
で表される化合物を、酸化反応に付して、以下の式(I):
で表される化合物を得る工程;
(工程2)前記式(I)の化合物を、超脱水溶媒に溶解させてから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(II):
で表される化合物を得る工程;及び
(工程3)前記式(IV)の化合物を、超脱水溶媒に溶解してから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式(III):
で表される化合物を得る工程
からなる群から選択されるいずれか一つの工程を含む方法(前記式中、Dは重水素を示す)。
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---|---|---|---|---|
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US20150376225A1 (en) * | 2013-01-23 | 2015-12-31 | Sphaera Pharma Pvtd. Ltd. | Novel compounds of 11beta-hydroxy-steroids for use in mitochondria biogenesis and diseases associated with mitochondrial dysfunction or depletion |
WO2016013030A2 (en) * | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Sphaera Pharma Pvt. Ltd. | Hydroxysteroid compounds, their intermediates, process of preparation, composition and uses thereof |
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Non-Patent Citations (15)
Title |
---|
DU TOIT, T. ET AL.: "Profiling adrenal 11beta- hydroxyandrostenedione metabolites in prostate cancer cells, tissue and plasma: UPC2-MS/MS quantification of 11beta-hydroxytestosterone, 11keto- testosterone and llketo-dihydrotestosterone", JOURNAL OF STEROID BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 166, 21 June 2016 (2016-06-21), pages 54 - 67, XP029865494, ISSN: 0960-0760 * |
IMAMICHI, Y. ET AL.: "11-Ketotestosterone is a major androgen produced in human gonads", JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, vol. 101, no. 10, 18 July 2016 (2016-07-18) - October 2016 (2016-10-01), pages 3582 - 3591, XP055609438, ISSN: 0021-972X * |
J CLIN ENDOCRINOL METAB., vol. 101, no. 10, 2016, pages 3582 - 3591 |
J. CHROMATOGRAPHY B, vol. 1013, 2016, pages 131 - 138 |
J. CLIN. ENDOCRINOL METAB., vol. 98, 2013, pages 1182 - 1188 |
J. STEROID BIOCHEM MOL. BIOL., vol. 138, 2013, pages 312 - 142 |
J. STEROID BIOCHEM MOL. BIOL., vol. 166, 2017, pages 54 - 67 |
MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY, vol. 441, 2017, pages 76 - 85 |
PLOS ONE, vol. 11, no. 7, pages eO 159867 |
PRETORIUS, E ET AL.: "Anew dawn for androgens: Novel lessons from 11-oxygenated C19 steroids", MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY, vol. 441, 9 August 2016 (2016-08-09), pages 76 - 85, XP029879229, ISSN: 0303-7207, DOI: doi:10.1016/j.mce.2016.08.014 * |
PRETORIUS, E. ET AL.: "11-ketotestosterone and 11- ketodihydrotestosterone in castration resistant prostate cancer: potent androgens which can no longer be ignored", PLOS ONE, vol. 11, no. 7, 21 July 2016 (2016-07-21), pages e0159867/l - e0159867/17, XP055609441, ISSN: 1932-6203 * |
QUANSON, J. L. ET AL.: "High-throughput analysis of 19 endogenous androgenic steroids by ultra- performance convergence chromatography tandem mass spectrometry", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B, vol. 1031, 18 July 2016 (2016-07-18), pages 131 - 138, XP055609442, ISSN: 1570-0232 * |
See also references of EP3725795A4 |
SHOPPEE, C. W. ET AL.: "Line widths of nuclear magnetic resonance signals of tertiary methyl groups", TETRAHEDRON, vol. 22, no. 8, 1966, pages 421 - 442, XP028086921, ISSN: 0563-2072, DOI: doi:10.1016/S0040-4020(01)90952-4 * |
SWART, A. C. ET AL.: "IIbeta-Hydroxyandrostenedione, the product of androstenedione metabolism in the adrenal, is metabolized in LNCaP cells by 5 a- reductase yielding 11beta-hydroxy-5alpha-androstanedione", JOURNAL OF STEROID BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 138, 2013, pages 132 - 142, XP028766172, ISSN: 0960-0760, DOI: doi:10.1016/j.jsbmb.2013.04.010 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113061070A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-02 | 阿尔塔(天津)标准物质研究院有限公司 | 一种氘标记的美替诺龙稳定性同位素标记化合物 |
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