WO2019066446A2 - 3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물 - Google Patents

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윤철호
응우옌응억안
레티엔킴
강형식
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising a mutant of bacterial cytochrome P450 to produce 3-hydroxyl phloretin from phloretin and a method for producing 3-hydroxyfloretin .
  • Phloretin a kind of dihydrochalcones, a kind of phenolic compounds found in nature, is contained in large quantities in apples and pears, and is used as a pharmaceutical or cosmetic ingredient as a natural extract.
  • phloretin is known to have antioxidant, anti-cancer, anti-aging, anti-inflammatory and anti-obesity effects, and Korean Patent Publication No. 10-2016-0101492 discloses anti-acne and anti-inflammatory use using floretine.
  • Korean Patent Publication No. 10-2016-0101492 discloses anti-acne and anti-inflammatory use using floretine.
  • the metabolism of phloretin has not yet been elucidated, and studies on the metabolic pathways and metabolism of phloretin are needed.
  • the cytochrome P450 enzyme is an enzyme found throughout the organism, ranging from archaea to bacteria, fungi, plants, animals and mammals, and catalyzes a variety of oxidative reactions. Cytochrome P450 can be widely used as a biological catalyst for the production of specific compounds because of its wide variety and wide range of substrates capable of catalysis. However, cytochrome P450 has a wide range of substrates to catalyze, making it difficult to selectively produce only desired compounds.
  • the present invention relates to a variant of cytochrome P450 enzyme capable of selectively producing metabolites which are difficult to chemically synthesize among the metabolites of phloretin to study the metabolites of phloretin and to develop therapeutic agents using the metabolites of phloretin, Provide the technology to be able to.
  • cytochrome P450 enzyme mutant capable of producing a large amount of 3-hydroxyfructin, which is difficult to chemically synthesize among the metabolites of floretine.
  • the present invention provides a composition for the production of 3-hydroxyflorethin comprising a cytochrome P450 enzyme mutant and at least one enzyme selected from the group consisting of mutants of CYP102A1, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a composition for the production of 3-hydroxyflorethin, which comprises at least one enzyme in the group consisting of mutants of CYP102A1 and produces 3-hydroxyfructin from floretine, wherein the group consisting of mutants of CYP102A1 comprises the wild type CYP102A1 R47L / F87V / L188Q, R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V, R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V / A474V / E558D / T664A / P675L / A678E / E687A / A741G / K813E / E870N / I881V / E887G / P894S / S954N / M967V / Q981R / A1008D / H1021Y
  • the present invention relates to a method for producing 3-hydroxyfloretin, which comprises the step of reacting with a substrate of floretine, which comprises at least one enzyme in the group consisting of a mutant of CYP102A1, wherein the group consisting of mutants of CYP102A1 is wild-type CYP102A1 R47L / F87V / L188Q, R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V, R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V / A474V / E558D / T664A / P675L / A678E / E687A / A741G / K813E / E870N / I881V / E887G / P894S / S954N / M967V / Q981R / A1008D / H10
  • the present invention can selectively mass-produce 3-hydroxy phloretin (3-OH phloretin) chemically synthesized among phloretin metabolites using cytochrome P450 mutants.
  • Figure 1 is a schematic representation of the structural formula (A) of floretine and the reaction scheme (A) showing the production of 3-hydroxyfructin from floretine by a mutant of wild-type CYP102A1 in the presence of NADPH.
  • Figure 2 shows an HPLC chromatogram (measuring the UV absorbance at 285 nm) of the floretine metabolites produced by the wild-type CYP102A1 of the present invention and its mutants (Peak: Metabolites produced by mutants of wild-type CYP102A1 Peaks and residence times, arrow: indicating substrate floretin and the major product, 3-hydroxyflorethyne).
  • Figure 3 shows the LC-MS elution profile of the metabolites produced by the mutants of phloretin and wild-type CYP102A1 according to the invention.
  • FIG. 4 shows the metabolite produced by the mutant of wild-type CYP102A1 analyzed by NMR analysis, indicating that the metabolite is 3-hydroxyflorethine (NMR is Varian VNMRS 600 MHz NMR spectrometer).
  • FIG. 5 shows the results of analysis of the substrate, floretine, by NMR analysis (NMR using a Varian VNMRS 600 MHz NMR spectrometer).
  • FIG. 7 shows kinetic parameter analysis results comparing the production efficiency of 3-hydroxyfloretin by wild-type CYP102A1 (WT) and mutants (M10, M16, M16V3) of wild-type CYP102A1 (80 to 100 ⁇ M concentration at 10 ⁇ M Of floretine was used and allowed to react for 60 minutes).
  • the present invention provides a mutant of the cytochrome P450 enzyme capable of selectively mass-producing 3-hydroxyl phloretin from the metabolite of phloretin.
  • the mutant of the cytochrome P450 enzyme of the present invention can produce 3-hydroxyfloretin in a stable and highly efficient manner by using phloretin as a substrate and mediating the oxidation of phloretin.
  • the mutant of the cytochrome P450 enzyme in the present invention is a mutant of CYP102A1, a bacterial cytochrome P450 BM3.
  • the CYPP102A1 mutant may refer to the entirety of CYP102A1 having a sequence altered by natural or artificial substitution, deletion, addition and / or insertion of an amino acid based on the wild type CYP102A1.
  • the mutant fused to the different domains of CYP102A1 may contain all of the chimeric fusions, based on the amino acid sequence of the wild-type CYP102A.
  • the CYP102A1 mutant can be produced by a known mutagenesis method.
  • a deletion-mutation method a PCT method, a Kunckel method, a point mutation method, a DNA shuffling, a staggered extension process, and an error-prone PCR method can be used.
  • the CYP102A1 mutant may include a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 50% or more, preferably 70% or more, and more preferably 90% or more identity with the wild-type CYP102A1 amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • a chimera may include two or more different binding domains.
  • the two binding domains may be derived from different wild-type proteins or mutants, and both binding domains may be from the same wild-type protein or mutant.
  • Chimeric CYP102A1 can include CYP102A1 chimeric and CYP102A1 chimeric point mutants that fuse the heme domain of the wild-type CYP102A1 mutant with the reductase domain of the natural variants of wild-type CYP102A1.
  • the natural variant refers to a variant existing in nature in addition to the known CYP102A1 as a result of confirming the nucleotide sequence of the CYP102A1 gene of Bacillus sp.
  • the chimeric CYP102A1 was prepared by mass expression of wild-type CYP102A1 mutants in E. coli, selecting a mutant having a high catalytic activity on the substrate, selecting the heme region of the selected CYP102A1 mutant and the reducing enzyme region of wild type CYP102A1 Can be prepared by fusing.
  • a mutant of chimeric CYP102A1 can be selected by mass-expressing the produced point mutants of chimeric CYP102A1 in E. coli and selecting a substance having a high catalytic activity.
  • the CYP102A1 mutant can be represented by a substituted amino acid in which a position or a mutation of an amino acid or an amino acid occurs before a mutation occurs.
  • R47L refers to a CYP102A1 mutant in which arginine (R), the 47th amino acid of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of wild-type CYP102A1, is replaced by leucine (L) by natural or artificial mutagenesis. If there is more than one amino acid substituted by the mutation in the mutant, it can be represented as '/'.
  • arginine (R), which is the 47th amino acid of SEQ ID NO: 1 is replaced by leucine (L)
  • phenylalanine (F) which is the 87th amino acid of SEQ ID NO: 11 is substituted by valine
  • Such a display method can be used in the present invention to express a mutant variant of chimeric CYP102A1 or chimeric CYP102A1.
  • the mutant of wild type CYP102A1 may comprise a mutant that has undergone point mutation in wild type CYP102A1. Specifically, R47L / F87V / L188Q or R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V of the wild type CYP102A1.
  • the mutant of wild type CYP102A1 may comprise a chimeric CYP102A1 fused with a ham region of the wild-type CYP102A1 point mutant and a reducing region of a native variant of wild type CYP102A1.
  • wild-type CYP102A1 R47L / F81I / F87V / E143G / F87I / F87V / E143G / F87I / F87V / E143G / F87V / F87V / E143G / L188Q / E267V / A474V / E558D / T664A / P675L / A678E / E687A / A741G / K813E / R825S / R836H / E870N / I881V / E887G / P894S / S954N / M967V / Q981R / A1008D / H1021Y / Q1022E.
  • the mutant of wild type CYP102A1 may comprise a point mutant of chimeric CYP102A1.
  • the chimeric CYP102A1 and its point mutant bg can also be included in mutants of the wild-type CYP102A1 as substitutions in the amino acid sequence of wild-type CYP102A1 based on the amino acid sequence of wild-type CYP102A1.
  • the mutant of the wild-type CYP102A1 is a mutant of the wild-type CYP102A1, a chimeric CYP102A1 fused with a heme region of a point mutant of the wild-type CYP102A1 and a reductase region of a natural mutant of the wild- And point mutants of chimeric CYP102A1.
  • mutants of the wild-type CYP102A1 are R47L / F87V / L188Q, R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V, R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V / A474V of the wild type CYP102A1 shown in SEQ ID NO: / E558D / T664A / P675L / A678E / E687A / A741G / K813E / R825S / R836H / E870N / I881V / E887G / P894S / S954N / M967V / Q981R / A1008D / H1021Y / Q1022E, R47L / K59N / F81I / F87V / E143G / L188Q
  • wild-type CYP102A1, wild-type CYP102A1 point mutants, chimeric CYP102A1 and chimeric CYP102A1 point mutants can be produced by methods known in the art. For example, genetic engineering techniques, peptide synthesis methods using solid-phase techniques (see Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963) Digestion with a peptidase, and the like.
  • the enzyme can be produced as a natural protein and can be produced by a recombinant method in which cells transformed with DNA encoding wild-type CYP102A1, a point mutant of wild type CYP102A1, a point mutant of chimeric CYP102A1 and chimeric CYP102A1 are cultured and recovered .
  • a transformant prepared by inserting a nucleic acid molecule encoding the enzyme of the present invention into an appropriate expression vector and transferring the expression vector to a suitable cell is cultured, and then the enzyme expressed by the transformant is purified, Can be produced.
  • the vector may be in the form of a plasmid, a cosmid, a virus particle or a phage.
  • Host cells for cloning or expressing DNA in the vector may include prokaryotes, yeast, and higher eukaryotes.
  • the culture conditions such as medium, temperature, pH and the like can be suitably selected without undue experimentation in the field to which the present invention belongs. For example, principles, protocols, and techniques for maximizing the productivity of cell culture can be referred to various known methods.
  • Expression and cloning vectors in the present invention may generally include a promoter operably linked to a nucleic acid sequence encoding a wild-type CYP102A1 that induces mRNA synthesis, a point mutant of wild-type CYP102A1, a chimeric CYP102A1 and a point mutant of chimeric CYP102A1 .
  • Various promoters recognized by host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include the? -Lactamase and lactose promoter systems, alkaline phosphatase, tryptophan promoter systems, and hybrid promoters such as the tac promoter.
  • Promoters used in bacterial systems may include Shine-Dalgarno (SD) sequences operably linked to DNA encoding SISP-1.
  • SD Shine-Dalgarno
  • Promoter sequences suitable for use in yeast hosts may include 3-phosphoglycerate kinase or other glycosylase enzymes.
  • the present invention can provide a method for producing 3-hydroxyflorethin, which comprises reacting at least one enzyme selected from the group consisting of mutants of wild-type CYP102A1 with phloretin as a substrate.
  • the present invention relates to a method for producing 3-hydroxyflorethin, which comprises reacting at least one enzyme selected from the group consisting of mutants of wild type CYP102A1 with a substrate of phloretin, wherein the group consisting of mutants of wild type CYP102A1 is wild type
  • the process for producing 3-hydroxyflorethin in the present invention may further comprise an NADPH-producing system.
  • the NADPH-generating system can use a system known in the art to which the present invention belongs.
  • glucose 6-phosphate, NADP-, and glucose 6-phosphate dehydrogenase may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the present invention provides a kit comprising at least one enzyme selected from the group consisting of mutants of CYP102A1 chimera and CYP102A1 chimera; And an NADPH-producing system. ≪ Desc / Clms Page number 2 >
  • the kit according to the present invention may further comprise reagents necessary for carrying out the reaction for producing 3-hydroxyflorethyne.
  • the composition, kit and production method for producing 3-hydroxyflorethin of the present invention can produce 3-hydroxyflorethine, which is a metabolite of phloretin, which can not be chemically synthesized, in an economical and highly efficient manner, . ≪ / RTI >
  • the CYP102A1 mutant can efficiently produce 3-hydroxyfloretin metabolites from floretine, and these metabolites can further be used in the development of functional biomaterials and drugs to improve the efficacy, toxicity, pharmacokinetics And can be used to make metabolite derivatives that can be lead compounds in the development of functional materials.
  • mutant P450 BM3 (CYP102A1) by point mutation induction
  • the primers used to introduce BanHI / SacI restriction sites and the PCR primers to generate mutations are shown in Table 1.
  • the codons for amino acid substitution are shown in italics and underlined.
  • the gene encoding the CYP102A1 mutant was amplified from pCWBM3 by PCR using a primer designed to facilitate cloning into the expression vector pCWori (Dr.
  • oligonucleotide assembly was performed using the primers described in Table 1.
  • the amplified gene was cloned into the BamHI / SacI recognition site of the pCWBM BamHI / SacI vector.
  • These plasmids were used to transform Escherichia coli DH5 ⁇ F'-IQ (Invitrogen), which was also used to express the CYP102A1 mutant protein.
  • DNA sequencing was commissioned (Xenotech, Korea) to determine whether the desired mutation occurred.
  • the wild type CYP102A1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) used for the construction of the CYP102A1 mutant is shown in FIG. 8, and according to convention, the first amino acid methionine (M) is not included in the amino acid sequence and threonine (T) is calculated as the first amino acid do.
  • Point mutants of wild-type CYP102A1 Point mutants of wild-type CYP102A1
  • the amino acid substitution site of wild-type CYP102A1 (SEQ ID NO: 1) references M10 R47L / F87V / L188Q van Vugt-Lussenburg BM et al., 2007 M16 R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267V Kim DH et al., 2008
  • the chimeric CYP102A1 chimeric protein M16V3 (SEQ ID NO: 13) was fused with the heme domain of the wild-type CYP102A1 point mutant and the reductase domain of the natural variant V3 of wild type CYP102A1 , And [Table 4]).
  • the point mutants of the wild-type CYP102A1 used M16 see Table 2
  • the natural variants used the natural variants of the Bacillus megaterium species Table 3).
  • Chimeric CYP102A1 M16V3 which was constructed using BamHI / SacI and SacI / XhoI for the heme domain and reductase domain, was cloned into an expression vector pCW vector (Table 4). This mutation was repeated to produce five mutants C7, D8, F7, G1 and H1 of Kymeta CYP102A1 (Table 5) (Kang JY, Ryu SH, Park SH, Cha GS, Kim DH, Kim KH (7): 1313-1322 (1984) Chimeric cytochromes P450 engineered by domain swapping and random mutagenesis for human metabolites of drugs. Biotechnology and Bioengineering 111 (7): 1313-1322 .
  • An oligonucleotide assembly was performed using the primers described in Table 1.
  • the amplified gene was cloned into the BamHI / SacI recognition site of the pCWBM BamHI / SacI vector. These plasmids were used to transform Escherichia coli DH5 ⁇ F'-IQ (Invitrogen), which was also used to express wild-type CYP102A1 mutant proteins. After mutagenesis, DNA sequencing was commissioned (Xenotech, Korea) to determine whether the desired mutation occurred.
  • Point mutants of chimeric CYP102A1 Point mutants of wild-type CYP102A1
  • the amino acid substitution site of wild-type CYP102A1 references C7 R47L / K59N / F81I / F87V / E143G / L188Q / G240E / E267V / S383R / A474V / E558D / T664A / P675L / A678E / E687A / A741G / K813E / R825S / R836H / E870N / I881V / E887G / P894S / S954N / M967V / Q981R / A1008D / H1021Y / Q1022E Kang et al., 2014 D8 R47L / F81I / F87V / E143G / L188Q / E267
  • Escherichia coli DH5 ⁇ F'-IQ was transformed with a plasmid containing wild-type CYP102A1 and a wild-type CYP102A1 mutant gene (Kim et al., Protein Expr Purif . 57: 188-200., 2008).
  • One colony was inoculated with 5 ml of Luria-Bertani medium supplemented with ampicillin (100 ug / ml) and cultured at 37 ° C. The culture was inoculated into 250 ml of Terrific Broth medium (100 ug / ml) supplemented with ampicillin .
  • the cells were incubated at 37 ° C with shaking at 250 rpm, followed by incubation at an OD 600 of 0.8, and isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 0.5 mM to induce gene expression.
  • ⁇ -Aminolevulinic acid (0.1 mM) was added. After expression was induced, the cells were further cultured at 30 ° C. for an additional 36 hours and harvested by centrifugation (15 min, 5000 g, 4 ° C.).
  • the cell pellet was resuspended in TES buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.6, 500 mM sucrose, 0.5 mM EDTA) and the cells were lysed by sonication (sonicator; Misonix, Inc., Farmingdale, NY). Cell lysates were centrifuged at 100,000 g for 90 minutes at 4 ° C, and soluble cytosolic fractions were collected and assayed for activity. The cytosol fraction was dialyzed in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), stored at -80 ° C, and used within 1 month after the preparation.
  • TES buffer 100 mM Tris-HCl, pH 7.6, 500 mM sucrose, 0.5 mM EDTA
  • the concentration of CYP102A1 was determined from the CO-difference spectrum, where ⁇ was 91 mM / cm (Omura et al. J Biol Chem 239: 2379-2385, 1964). Both wild type and mutant strains were routinely obtained with 300-700 nM P450. The expression level of mutants of wild-type CYP102A1 and wild-type CYP102A1 ranged from 1.0 to 2.0 nmol P450 / mg cytosolic protein.
  • M16V3 and its point mutations C7, D8, F7, G1 and H1 which have a high catalytic activity on several human substrates, were selected (Kang JY, Ryu SH, Park (2014) Chimeric cytochromes P450 engineered by domain swapping and random mutagenesis for human metabolites of drugs. Biotechnology. and Bioengineering 111 (7): 1313-1322).
  • a typical steady-state reaction was performed by adding 100 pmol of CYP102A1 and phloretin (final concentration 200 ⁇ M) to 0.25 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4).
  • an NADPH-producing system (10 mM glucose 6-phosphate, 0.5 mM NADP + and 1 IU yeast glucose 6-phosphate per 1 ml final concentration) was added.
  • 50mM solution of phloretin was prepared with dimethylsulfoxide and diluted with the enzyme reaction solution so that the final organic solvent concentration was 1% (v / v) or less (Fig. 1).
  • reaction solution was reacted at 37 DEG C for 60 minutes and the reaction was terminated with 0.6 mL of ice-cold ethyl acetate.
  • CYP102A1 can oxidize phloretin
  • BM3 wt wild type CYP102A1
  • mutants M10, M16, M16V3, C7, D8, F7, G1, H1
  • Metabolites of phloretin produced by human CYP1A2, bacterial wild type CYP102A1 and its mutants were investigated using an HPLC chromatogram (measuring UV absorbance at 285 nm).
  • LC-MS analysis was performed by comparing the LC profile and the fragmentation pattern of the floretine and metabolites, in order to identify the metabolites of the floretine produced from mutants of the wild-type CYP102A1.
  • the CYP102A1 mutant M10 was reacted at 37 ⁇ ⁇ for 20 minutes in the presence of 200 ⁇ ⁇ of phloretin and an NADPH-producing system.
  • the reaction was quenched by the addition of 2x ethyl acetate cooled in ice. After centrifugation, the organic solvent layer was separated and dried under a nitrogen gas.
  • the reaction was reconstituted with 200 ⁇ l of mobile phase by vortex mixing and sonicated for 20 seconds. An appropriate amount (10 ⁇ l) of the prepared solution was injected into the LC column.
  • LC-MS analysis was performed in an electro spray ionization (positive) mode using a Shimadzu LCMS-2010 EV system (Shimadzu, Kyoto, Japan) equipped with LCMS software.
  • the reaction was carried out in a Shim-pack VP-ODS column (250 mm x 2.0 mm id, Shimadzu co., Japan) with water containing 0.1% trifluoroacetic acid and acetonitrile (70:30, v / v) at a flow rate of 0.2 ml / .
  • the mass spectra were recorded in the electro spray ionization (positive) mode and the SIM mode.
  • the interface and detector bolts were 4.4 kV and 1.5 kV, respectively.
  • the nebulization gas velocity was set at 1.5 ml / min, the interface, the curve desolvation line (CDL) and the heat block temperature were set to 250, 230 and 200 ° C, respectively.
  • Enzymes of three CYP102A1 mutants (M10, M16, M16V3) were selected and the efficiency of producing metabolites was compared using a hypothetical parameter (FIG. 7, [Table 7]).
  • sequence listing is attached separately to the sequence listing file.
  • SEQ ID NO: 1 is the wild type CYP102A1 amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 2 is a BamH I forward primer.
  • SEQ ID NO: 3 is a Sac I reverse primer.
  • SEQ ID NO: 4 is the R47L primer.
  • SEQ ID NO: 5 is the F81I primer.
  • SEQ ID NO: 6 is an F87V primer.
  • SEQ ID NO: 7 is an E143G primer.
  • SEQ ID NO: 8 is the L188Q primer.
  • SEQ ID NO: 9 is an E267V primer.
  • SEQ ID NO: 10 is a wild type CYP102A1 DNA sequence.
  • SEQ ID NO: 11 is a wild type CYP102A1 mutant M16 DNA sequence.
  • SEQ ID NO: 12 is a wild type CYP102A1 mutant M16V3 DNA sequence.
  • SEQ ID NO: 13 is a wild type CYP102A1 mutant M10 amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 14 is the wild type CYP102A1 mutant M16 amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 15 is a wild type CYP102A1 mutant M16V3 amino acid sequence.

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Abstract

본 발명은 플로레틴의 대사산물 중 3-하이드록시 플로레틴 제조를 위한 야생형 CYP102A1 돌연변이체에 관한 것으로, 박테리아 시토크롬 P450 효소인 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체, 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체의 헴 영역과 야생형 CYP102A1의 자연적 변이체의 환원효소를 융합한 키메라 CYP102A1 및 키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체를 촉매로 이용하여 플로레틴을 산화시켜 3-하이드록시 플로레틴을 대량 생산할 수 있다.

Description

3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물
본 발명은 플로레틴(phloretin)으로부터 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxyl phloretin)을 제조하기 위한 박테리아 시토크롬 P450(cytochrome P450)의 돌연변이체를 포함하는 조성물 및 3-하이드록시 플로레틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
자연에서 발견되는 페놀화합물의 한 종류인 디하이드로찰콘(dihydrochalcones)의 한 종류인 플로레틴(phloretin)은 사과나 배에서 다량 포함되어 있고 천연 추출물로서 약제나 화장품 성분으로 사용되고 있다.
구체적으로 플로레틴은 항산화, 항암, 항노화, 항염증, 항비만 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 한국 공개특허 제10-2016-0101492호에서 플로레틴을 이용한 항여드름 및 항염증 용도를 개시하고 있다. 그러나, 플로레틴의 대사과정에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없어 플로레틴의 대사경로 및 대사물질에 관한 연구가 필요하다.
시토크롬(cytochrome) P450 효소는 고세균에서부터 박테리아, 곰팡이, 식물, 동물 및 포유류에 이르기까지 생물 전반에 존재하는 효소로 다양한 산화반응을 촉진하는 촉매 기능을 수행한다. 시토크롬 P450은 종류가 다양하고 촉매 작용을 할 수 있는 대상 기질의 범위가 넓어 특정 화합물을 생산하기 위한 생물학적 촉매로 널리 이용될 수 있다. 그러나 시토크롬 P450이 촉매 작용을 하는 기질의 범위가 넓어 목적하는 화합물만을 선택적으로 생산하는데 어려움이 있다.
본 발명은 플로레틴의 대사물질을 연구하고 플로레틴의 대사산물을 이용한 치료제를 개발하기 위해 플로레틴의 대사산물 중 화학적으로 합성되기 어려운 대사산물을 선택적으로 생산할 수 있는 시토크롬 P450 효소의 변이체 및 이를 응용할 수 있는 기술을 제공한다.
플로레틴의 대사산물 중 화학합성이 어려운 3-하이드록시 플로레틴을 대량으로 생산할 수 있는 시토크롬 P450 효소 변이체를 제공하고자 한다.
본 발명은 시토크롬 P450 효소 변이체로 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군 중 적어도 하나 이상의 효소를 포함하는 3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물 및 제조방법을 제공한다.
본 발명은 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군에서 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 플로레틴으로부터 3-하이드록시 플로레틴을 생성하는 3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물로, CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군은 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E로 구성된 군인 3-히드록시 플로레틴 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명은 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군에서 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 플로레틴을 기질로 하여 반응시키는 단계를 포함하는 3-하이드록시 플로레틴 생산방법으로, CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군은 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E로 구성된 군인 3-하이드록시 플로레틴 생산방법을 제공한다.
본 발명은 시토크롬 P450 돌연변이체를 이용하여 플로레틴 대사산물 중 화학적으로 합성된 바 없는 3-하이드록시 플로레틴(3-OH phloretin)을 선택적으로 대량 생산할 수 있다.
도 1은 플로레틴의 구조식(A) 및 NADPH 존재 하에 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 의한 플로레틴으로부터 3-하이드록시 플로레틴의 생산을 보여주는 반응식(A)이다.
도 2는 본 발명의 야생형 CYP102A1과 이의 돌연변이체에 의하여 생성된 플로레틴 대사산물의 HPLC 크로마토그램(285nm 에서의 UV 흡광도를 측정)을 보여주는 것이다(피크: 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 의해 생성된 대사산물 피크와 체류 시간을 비교하여 확인한 것, 화살표: 기질인 플로레틴 및 주요 산물인 3-하이드록시 플로레틴을 표시).
도 3은 본 발명에 따른 플로레틴 및 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 의하여 생성된 그의 대사산물의 LC-MS 용출 프로파일을 보여주는 것이다[(A): NADPH가 있을 때와 없을 때 야생형 CYP102A1의 돌연변이체 M10을 사용하여 제조한 시료를 LC-MS 방법으로 분석한 Total Ion Chromatogram(TIC), B: 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 의해 NADPH 존재 하에 생성된 산화물의 분자량 측정(M+H: 291), C: 기질(substrate)인 플로레틴의 분자량 측정(M+H: 275)].
도 4는 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 의해 생성된 대사산물을 NMR 분석 기법으로 분석한 결과로, 대사산물이 3-하이드록시 플로레틴임을 보여준다(NMR은 Varian VNMRS 600 MHz NMR spectrometer를 이용).
도 5는 기질인 플로레틴을 NMR 분석 기법으로 분석한 결과이다(NMR은 Varian VNMRS 600 MHz NMR spectrometer를 이용).
도 6은 야생형 CYP102A1(WT) 및 야생형 CYP102A1의 돌연변이체(M10, M16, M16V3, C7, D8, F7, G1, H1)에 의한 3-하이드록시 플로레틴의 생성속도를 보여준다.
도 7은 야생형 CYP102A1(WT) 및 야생형 CYP102A1의 돌연변이체(M10, M16, M16V3)에 의한 3-하이드록시 플로레틴의 생성효율을 비교한 속도론적 매개변수 분석 결과를 보여준다(10μM에서 80~100μM 농도의 플로레틴을 사용하였고, 60분간 반응시켰다).
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 플로레틴(phloretin)의 대사산물 중 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxyl phloretin)을 선택적으로 대량 생산할 수 있는 시토크롬 P450(cytochrome) 효소의 돌연변이체를 제공한다.
본 발명의 시토크롬 P450 효소의 돌연변이체는 플로레틴을 기질로 하고, 플로레틴의 산화를 매개하여 3-하이드록시 플로레틴를 안정적이며 고효율로 생산할 수 있다.
본 발명에서 시토크롬 P450 효소의 돌연변이체는 박테리아 시토크롬 P450 BM3인 CYP102A1의 돌연변이체이다.
본 발명에서 CYPP102A1 돌연변이체는 야생형 CYP102A1을 기준으로 아미노산의 자연적이거나 인위적인 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의하여 변화된 서열을 가지는 CYP102A1 전체를 의미할 수 있다. 바람직하게는 야생형 CYP102A의 아미노산 서열을 기준으로 점 돌연변이가 일어난 개체, CYP102A1의 서로 다른 도메인을 융합 키메라를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 CYP102A1 돌연변이체는 공지의 돌연변이 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 결실-돌연변이 방법, PCT 방법, 쿤켈법, 점 돌연변이 방법, DNA 셔플링, StEP(staggered extension process), 오류유발(error-prone) PCR 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 CYP102A1 돌연변이체는 서열번호 1로 이루어진 야생형 CYP102A1 아미노산 서열과 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 키메라(chimera)는 서로 다른 두 개 이상의 결합 도메인(domain)을 포함할 수 있다. 두 결합 도메인은 상이한 야생형 단백질 또는 돌연변이체에서 유래할 수 있고, 두 결합 도메인은 동일한 야생형 단백질 또는 돌연변이체에서 유래할 수도 있다. 키메라 CYP102A1은 야생형 CYP102A1 돌연변이체의 헴 영역(heme domain)과 야생형 CYP102A1의 자연적 변형체(nature variants)의 환원효소 영역(reductase domain)을 융합한 CYP102A1 키메라 및 CYP102A1 키메라의 점 돌연변이체를 포함할 수 있다. 자연적 변형체는 자연계에서 채집되어 기탁된 바실러스 종(Bacillus sp.)의 CYP102A1 유전자의 염기서열을 확인한 결과 기존에 알려진 CYP102A1외에 자연계에 존재하는 변이체를 의미한다. 키메라 CYP102A1은 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체들을 대장균에서 대량 발현시켜 돌연변이체들 중 기질(substrate)에 대한 촉매 활성이 큰 것을 선택하고, 선택한 CYP102A1 돌연변이체의 헴 영역과 야생형 CYP102A1의 자연적 변형체의 환원효소 영역을 융합하여 제조할 수 있다. 그리고, 제조한 키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체들을 대장균에서 대량 발현시켜 촉매 활성이 큰 것을 선택하여 키메라 CYP102A1의 돌연변이체를 선정할 수 있다.
본 발명에서 CYP102A1 돌연변이체는 변이가 일어나기 전 아미노산, 아미노산의 위치, 변이가 일어나 치환된 아미노산으로 표시할 수 있다. 예를 들어, R47L은 야생형 CYP102A1의 아미노산 서열인 서열번호 1의 47번째 아미노산인 아르기닌(R)이 류신(L)으로 자연적 또는 인위적으로 변이 유도에 의해 치환된 CYP102A1 돌연변이체를 의미한다. 돌연변이체에서 변이에 의해 치환된 아미노산이 하나 이상인 경우 '/'로 나타낼 수 있다. 예를 들어, R47L/F87V/L188Q는 서열번호 1의 47번째 아미노산인 아르기닌(R)이 류신(L)로로 치환되고 서열번호 11의 87번째 아미노산인 페닐알라닌(F)이 발린(V)으로 치환되고 서열번호 1의 188번째 아미노산인 류신(L)이 글루타민(Q)로 치환된 야생형 CYP102A1의 돌연변이체를 의미한다. 이와 같은 표시 방법은 본 발명에서 키메라 CYP102A1 또는 키메라 CYP102A1의 돌연변이체 변이를 나타내는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 야생형 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1에서 점 돌연변이가 일어난 돌연변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q 또는 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 야생형 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체의 햄 영역과 야생형 CYP102A1의 자연적 변형체의 환원 영역을 융합한 키메라 CYP102A1를 포함할 수 있다. 구체적으로, 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체인 야생형 CYP102A1의 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V의 헴 영역과 야생형 CYP102A1의 자연적 변형체의 환원 영역이 융합된, 야생형 CYP102A1의 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E이다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 야생형 CYP102A1의 돌연변이체는 키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 키메라 CYP102A1인 야생형 CYP102A1의 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E에서 점 돌연변이가 일어난 돌연변이체로, 야생형 CYP102A1의 R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E 또는 I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E이다. 키메라 CYP102A1 및 이의 점 돌연변이체도 야생형 CYP102A1의 아미노산 서열을 기준으로보면 야생형 CYP102A1의 아미노산에서 치환이 일어난 개체로서 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 포함될 수 있다.
이상의 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 대한 설명을 종합하면, 야생형 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체, 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체의 헴 영역과 야생형 CYP102A1의 자연적 변이체의 환원효소 영역을 융합한 키메라 CYP102A1 및 키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 야생형 CYP102A1의 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 야생형 CYP102A1, 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체, 키메라CYP102A1 및 키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체는 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어 유전공학적 기법, 고체상기술(solid-phase technique)을 사용하는 펩티드 합성방법(Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85 : 2149-2154(1963) 참조) 또는 본 발명의 효소를 적당한 펩티다아제로 절단하는 등의 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에서 효소는 천연 단백질로서 제조할 수 있고, 야생형 CYP102A1, 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체, 키메라 CYP102A1 및 키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체를 암호화하는 DNA로 형질전환시킨 세포를 배양하여 회수하는 재조합 방법에 의해 제조할 수도 있다. 구체적으로, 본 발명의 효소를 암호화하는 핵산 분자를 적절한 발현 벡터로 삽입하고 발현 벡터를 적합한 세포로 전달하여 만든 형질 전환체를 배양한 후 형질전환체에 의해 발현된 효소를 정제함으로써 본 발명의 효소를 생산할 수 있다.
본 발명에서 벡터는 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid), 바이러스 입자 또는 파지(phage) 형태일 수 있다. 벡터내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 숙주세포는 원핵세포, 효모, 고등진핵세포를 포함할 수 있다. 배지, 온도, pH 등의 배양 조건은 본 발명이 속하는 분야에서 과도한 실험 없이 적합하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 세포배양의 생산성을 최대로 하기 위한 원리, 프로토콜, 테크닉 등은 여러 공지된 방법을 참조할 수 있다.
본 발명에서 발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 유도하는 야생형 CYP102A1, 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체, 키메라 CYP102A1 및 키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하도록 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 숙주세포에 의해 인식되는 다양한 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터로 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리 포스타파제, 트립토판 프로모터 시스템, 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 있다. 세균 시스템에서 사용되는 프로모터로는 SISP-1을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 포함할 수 있다. 효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터 서열로는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당 분해 효소들이 포함될 수 있다.
본 발명은 야생형 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 효소를 플로레틴을 기질로하여 반응시키는 단계를 포함하는 3-히드록시 플로레틴의 생산방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 야생형 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 효소를 플로레틴을 기질로하여 반응시키는 단계를 포함하는 3-히드록시 플로레틴의 생산방법으로, 야생형 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군은 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E로 구성된 군인 3-하이드록시 플로레틴의 생산방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 3-하이드록시 플로레틴의 생산방법은 NADPH-생성 시스템을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 NADPH-생성 시스템은 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 시스템을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 글루코스 6-포스페이트(glucose 6-phosphate), NADP- 및 효모 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나아제(glucose 6-phosphate dehydrogenase)를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 CYP102A1 키메라의 돌연변이체로 구성된 군 및 CYP102A1 키메라 중 적어도 하나 이상의 효소; 및 NADPH-생성 시스템을 포함하는 3-하이드록시 플로레틴 제조용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 3-하이드록시 플로레틴을 생산하기 위한 반응을 진행시키는데 필요한 시약을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물, 키트 및 생산방법은 화학적으로 합성할 수 없는 플로레틴의 대사산물인 3-하이드록시 플로레틴을 경제적이면서 고효율로 대량생산할 수 있어 신약 개발뿐만 아니라 다양한 연구에 유용하게 이용할 수 있다. 그리고, CYP102A1 돌연변이체가 효율적으로 플로레틴으로부터 3-하이드록시 플로레틴 대사산물을 생산할 수 있고, 이러한 대사산물은 나아가 기능성 바이오소재 및 약물의 개발 과정에서 3-하이드록시 플로레틴의 효능, 독성, 약물동력학 등을 평가하기 위하여 사용될 수 있으며, 기능성 소재개발의 리드 화합물이 될 수 있는 대사산물 유도체를 만드는데 사용될 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.
[실시예 1]
점 돌연변이 유발에 의한 P450 BM3(CYP102A1) 돌연변이체의 구축
야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체(site-directed mutants) 2 종류를 Kim 등이 제조한 방법과 같은 방법 (Kim DH, Ahn T, Jung HC, Pan JG, Yun CH.(2008) Generation of Human Metabolites of 7-Ethoxycoumarin by Bacterial Cytochrome P450 BM3. Drug Metabolism and Disposition 36(11):2166-2170. 논문의 두번째 page (page 2167) Materials and Methods 의 construction of BM3 Mutants by Site-directed Mutagenesis 참조)으로 제조하고, 각각 M10(서열번호 13) 및 M16(서열번호 14)으로 명명하였다(아래 [표 2] 참조).
BanHI/SacI 인식부위(restriction sites)를 도입하기 위하여 사용된 프라이머 및 돌연변이를 일으키기 위한 PCR 프라이머(제노텍(XENOTECH), 한국)는 [표 1]과 같다. 아미노산 치환을 위한 코돈은 이탤릭체 및 밑줄로 표시하였다. CYP102A1 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 발현벡터 pCWori(Dr. F.W. Dahlquist, University of California, Santa Barbara, CA) 또는 pSE420(Invitrogen)로의 클로닝을 촉진할 수 있도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 pCWBM3로부터 증폭시켰다(Kang JY, Ryu SH, Park SH, Cha GS, Kim DH, Kim KH, Hong AW, Ahn T, Pan JG, Joung YH, Kang HS, Yun CH. (2014) Chimeric cytochromes P450 engineered by domain swapping and random mutagenesis for producing human metabolites of drugs. Biotechnology and Bioengineering 111(7):1313-1322. Page 1315 참조).
[표 1]에 기재된 프라이머를 사용하여 올리고뉴클레오티드 어셈블리를 실시하였다. 증폭된 유전자를 pCWBM BamHI/SacI 벡터의 BamHI/SacI 인식부위로 클로닝 하였다. 이러한 플라스미드로 Escherichia coli DH5α F'-IQ(Invitrogen)을 형질 전환시켰으며, 이는 CYP102A1 돌연변이 단백질을 발현시키기 위해서도 사용하였다. 돌연변이 유발 후, 목적하는 돌연변이가 일어났는지 여부를 DNA 시퀀싱을 의뢰하여(제노텍(XENOTECH), 한국) 확인하였다.
CYP102A1 돌연변이체의 구축을 위해 사용된 야생형 CYP102A1 아미노산 서열(서열번호 1)은 도 8과 같고, 관례에 따라 첫번째 아미노산 메티오닌(M)은 아미노산 순서에 포함되지 않으며, 트레오닌(T)을 첫번째 아미노산으로 계산한다.
돌연변이체를 제조하기 위해 사용한 프라이머들
프라이머(서열번호) 서열
BamHⅠ forward(서열번호 2) 5'-AGC GGA TCC ATG ACAATT AAA GAA ATG CCT C-3'
SacⅠ reverse(서열번호 3) 5'-ATC GAG CTC GTA GTT TGT AT-3'
R47L(서열번호 4) 5'-GCG CCT GGT CTG GTA ACG CG-3'
F81I(서열번호 5) 5'-GTA CGT GAT ATT GCA GGA GAC-3'
F87V(서열번호 6) 5'-GAC GGG TTA GTG ACA AGC TGG-3'
E143G(서열번호 7) 5'-GAA GTA CCG GGC GAC ATG ACA'3'
L188Q(서열번호 8) 5'-ATG AAC AAG CAG CAG CGA GCA A-3'
E267V(서열번호 9) 5'-T GCG GGA CAC GTG ACA ACA AGT-3'
야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체
야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체 야생형 CYP102A1(서열번호 1)의 아미노산 치환 부위 참고문헌
M10 R47L/F87V/L188Q van Vugt-Lussenburg BM et al., 2007
M16 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V Kim DH et al., 2008
* 참고문헌 *
: van Vugt-Lussenburg BM, Stjernschantz E, Lastdrager J, Oostenbrink C, Vermeulen NP, Commandeur JN. Identification of critical residues in novel drug metabolizing mutants of cytochrome P450 BM3 using random mutagenesis. J Med Chem 50:455-461, 2007
: Kim DH, Kim KH, Kim DH, Liu KH, Jung HC, Pan JG, Yun CH. Generation of human metabolites of 7-ethoxycoumarin by bacterial cytochrome P450 BM3. Drug Metab Dispos 36:2166-2170, 2008
[실시예 2]
키메라 CYP102A1의 구축
야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체의 헴 영역 (heme domain)과 야생형 CYP102A1의 자연적 변형체(natural variant V3)의 환원효소 영역(reductase domain)을 융합하여 선택적인 키메라 CYP102A1 단백질(chimeric protein)인 M16V3(서열번호 13, [표 4] 참조)을 구축하였다. 야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체는 M16([표 2] 참조)을 사용하였고, 자연적 변형체는 Bacillus megaterium 종의 자연적 변이체([표 3])을 사용하였다.
헴 영역(heme domain)과 환원효소 영역(reductase domain)을 위하여 BamHI/SacI 과 SacI/XhoI을 사용하여 만들어진 키메라 CYP102A1 M16V3을 발현 벡터 pCW vector로 클로닝하였다([표 4]). 이를 다시 돌연변이 시켜 5종의 키메타 CYP102A1의 점 돌연변이체 C7, D8, F7, G1, H1을 제조하였다([표 5])(Kang JY, Ryu SH, Park SH, Cha GS, Kim DH, Kim KH, Hong AW, Ahn T, Pan JG, Joung YH, Kang HS, Yun CH. (2014) Chimeric cytochromes P450 engineered by domain swapping and random mutagenesis for producing human metabolites of drugs. Biotechnology and Bioengineering 111(7):1313-1322. Page 1315 참조).
키메라 CYP102A1 및 이의 점 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 발현벡터 pCWori(Dr. F.W. Dahlquist, University of California, Santa Barbara, CA) 또는 pSE420(Invitrogen)로의 클로닝을 촉진할 수 있도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 pCWBM3로부터 증폭시켰다. [표 1]에 기재된 프라이머를 사용하여 올리고뉴클레오티드 어셈블리를 실시하였다. 증폭된 유전자를 pCWBM BamHI/SacI 벡터의 BamHI/SacI 인식부위로 클로닝 하였다. 이러한 플라스미드로 Escherichia coli DH5α F'-IQ(Invitrogen)을 형질 전환시켰으며, 이는 야생형 CYP102A1의 돌연변이체 단백질을 발현시키기 위해서도 사용하였다. 돌연변이 유발 후, 목적하는 돌연변이가 일어났는지 여부를 DNA 시퀀싱을 의뢰하여(제노텍(XENOTECH), 한국) 확인하였다.
본 발명에 사용된 야생형 CYP102A1의 자연적 돌연변이체
Accession Number
Strain Variant Name Genomic DNA 16S rRNA 16S-23S intergenic
KCCM 11745 102A1.1 (J04832) c FJ917385 FJ969781
IFO 12108 102A1.1 (J04832) c FJ969756 FJ969774
ATCC 14581 102A1.1 (J04832) c FJ969751 FJ969767
KCCM 41415 102A1.1 (J04832) c FJ969762 FJ969792
KCTC 3712 102A1.2 FJ899078 FJ969764 FJ969795
KCCM 12503 102A1.3 FJ899082 FJ969761 FJ969787
ATCC 15451 102A1.4 FJ899085 FJ969753 FJ969768
ATCC 10778 102A1.5 FJ899078 FJ969746 FJ969765
KCCM 11938 102A1.5 FJ899078 FJ969760 FJ969786
KCCM 11761 102A1.5 FJ899078 FJ969757 FJ969783
KCCM 11776 102A1.6 FJ899081 FJ969758 FJ969784
KCCM 11934 102A1.6 FJ899081 FJ969759 FJ969785
ATCC 14945 102A1.7 FJ899084 FJ969749 FJ969766
ATCC 21916 102A1.8 FJ899092 FJ969755 FJ969772
KCTC 2194 102A1.8 FJ859036 FJ969763 FJ969794
ATCC 19213 102A1.9 FJ899091 FJ969754 FJ969769
키메라 CYP102A1
키메라 CYP102A1 야생형 CYP102A1(서열번호 1)의 아미노산 치환 부위 참고문헌
M16V3 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/ A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/ E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/ A1008D/H1021Y/Q1022E Kang et al., 2014
* 참고문헌 *
: Kang JY, Ryu SH, Park SH, Cha GS, Kim DH, Kim KH, Hong AW, Ahn T, Pan JG, Joung YH, Kang HS, Yun CH (2014) Chimeric cytochromes P450 engineered by domain swapping and random mutagenesis for producing human metabolites of drugs. Biotechnol Bioeng. 111:1313-1322, 2014.
키메라 CYP102A1의 점 돌연변이체
야생형 CYP102A1의 점 돌연변이체 야생형 CYP102A1(서열번호 1)의 아미노산 치환 부위 참고문헌
C7 R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/ A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/ E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/ A1008D/H1021Y/Q1022E Kang et al., 2014
D8 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/ A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/ E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/ A1008D/H1021Y/Q1022E Kang et al., 2014
F7 R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/ A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/ E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/ A1008D/H1021Y/Q1022E Kang et al., 2014
G1 R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/ A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/ E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/ A1008D/H1021Y/Q1022E Kang et al., 2014
H1 I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/ A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/ E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/ A1008D/H1021Y/Q1022E Kang et al., 2014
* 참고문헌 *
: Kang JY, Ryu SH, Park SH, Cha GS, Kim DH, Kim KH, Hong AW, Ahn T, Pan JG, Joung YH, Kang HS, Yun CH (2014) Chimeric cytochromes P450 engineered by domain swapping and random mutagenesis for producing human metabolites of drugs. Biotechnol Bioeng. 111:1313-1322, 2014.
[실시예 3]
야생형 CYP102A1 및 야생형 CYP102A1의 돌연변이체의 발현 및 정제
야생형 CYP102A1과 야생형 CYP102A1 돌연변이체의 유전자를 포함하는 플라스미드로 Escherichia coli DH5α F'-IQ을 형질전환 시켰다(Kim et al., Protein Expr Purif. 57:188-200., 2008). 하나의 콜로니로부터 적정량을 암피실린(100 ug/ml)이 추가된 5 ml Luria-Bertani medium 에 접종하여 37℃에서 배양하고, 이 배양물을 암피실린(100 ug/ml)이 추가된 250 ml Terrific Broth medium에 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 흔들어 주며 OD 600에서 0.8정도 될 때까지 배양하고, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside를 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. δ-Aminolevulinic acid(0.1 mM)을 첨가하였다. 발현이 유도된 후, 30℃에서 추가로 36시간 더 배양하고 원심분리(15분, 5000 g, 4℃)하여 세포를 수확하였다. 세포 펠렛을 TES 완충액(100mM Tris-HCL, pH7.6, 500mM sucrose, 0.5 mM EDTA)에 재현탁시키고 초음파분해로 세포를 용해시켰다(sonicator; Misonix, Inc., Farmingdale, NY). 세포용해물을 100,000 g, 90분, 4℃에서 원심분리한 후, 가용성 시토졸 분액(soluble cytosolic fraction)을 모아 활성을 측정하였다. 시토졸 분액을 50 mM potassium phosphate 완충액(pH 7.4)에서 투석하여 -80℃에서 보관하였으며, 제조 후 1개월 이내의 것을 실험에 사용하였다.
CYP102A1의 농도는 CO-difference 스펙트럼으로부터 결정하였으며, 이때 사용한 ε는 91 mM/cm 이었다(Omura et al. J Biol Chem 239:2379-2385, 1964). 야생형 및 돌연변이체 모두 통상적으로 300-700 nM P450을 얻을 수 있었다. 야생형 CYP102A1 및 야생형 CYP102A1의 돌연변이체의 발현정도는 1.0~2.0 nmol P450/mg cytosolic protein의 범위였다. 제조된 야생형 CYP102A1의 돌연변이체들 중에서 사람에 있어서의 몇몇 기질(substrates)에 대한 촉매 활성이 큰 M16V3 및 이의 점 돌연변이체인 C7, D8, F7, G1, H1을 선택하였다(Kang JY, Ryu SH, Park SH, Cha GS, Kim DH, Kim KH, Hong AW, Ahn T, Pan JG, Joung YH, Kang HS, Yun CH. (2014) Chimeric cytochromes P450 engineered by domain swapping and random mutagenesis for producing human metabolites of drugs. Biotechnology and Bioengineering 111(7):1313-1322).
[실시예 4]
야생형 CYP102A1 및 야생형 CYP102A1의 돌연변이체에 의한 플로레틴 산화
야생형 CYP102A1(BM3 wt) 및 이의 돌연변이체들(M10, M16, M16V3, C7, D8, F7, G1, H1)이 플로레틴을 산화할 수 있는지 확인하였다.
100mM potassium phosphate 완충액(pH 7.4) 0.25㎖에 CYP102A1 100pmol과 플로레틴(최종농도 200 μM)을 넣어 전형적인 steady-state 반응을 시켰다.
반응을 시작하기 위하여 NADPH-생성 시스템(최종 농도: 1㎖ 당 10mM glucose 6-phosphate, 0.5mM NADP+ 및 1IU yeast glucose 6-phosphate)을 첨가하였다. dimethylsulfoxide로 플로레틴 50mM 용액을 제조하고, 효소 반응액으로 희석하여 최종 유기용매 농도가 1%(v/v) 이하가 되도록 하였다(도 1).
반응액을 37℃에서 60분간 반응시키고, 얼음으로 차갑게 한 에틸아세테이트(ethyl acetate) 0.6㎖로 반응을 종결시켰다.
HPLC 분석
반응혼합물을 원심분리한 후, 유기용매 층 180㎕을 분리하여 질소가스 하에서 증발시키고 HPLC로 분석하였다. 시료(30㎕)를 Gemini C18 컬럼(4.6mm x 150mm, 5㎛, Phenomenex, Torrance, CA)에 주입하였다. 이동상 A는 0.1% 개미산, 0.5% 메탄올을 함유하는 물, 이동상 B는 100% 아세토니트릴을 사용하였다. 이동상 A/B(60/40, v/v)를 그래디언트 펌프(LC-20AD, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 1㎖·min-1의 속도로 흘려주었다. 용출액을 285nm의 UV로 측정하였다.
CYP102A1이 플로레틴을 산화할 수 있는지 조사하기 위하여, 야생형 CYP102A1(BM3 wt) 및 이의 돌연변이체들(M10, M16, M16V3, C7, D8, F7, G1, H1)을 이용하여 플로레틴의 산화능을 기질의 농도 200μM로 고정시키고 측정하였다.
사람 CYP1A2, 박테리아 야생형 CYP102A1 및 이의 돌연변이체들에 의하여 생성된 플로레틴의 대사산물을 HPLC 크로마토그램(285 nm에서의 UV 흡광도를 측정)을 이용하여 조사하였다.
CYP102A1에 의해 하나의 주요 대사물질이 생성되었다. 주된 대사물질의 화학적 구조를 LC-MS와 NMR 분석하였고, 3-하이드록시 플로레틴(3-OH phloretin)을 생산하는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
LC-MS 분석 및 NMR 분석
야생형 CYP102A1의 돌연변이체로부터 생산된 플로레틴의 대사산물을 동정하기 위하여, 플로레틴 및 대사산물의 LC 프로파일과 프레그멘테이션(fragmentation) 패턴을 비교하여 LC-MS 분석을 하였다.
CYP102A1 돌연변이체 M10을 200μM의 플로레틴과 NADPH- 생성 시스템의 존재하에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 얼음으로 식힌 2배의 에틸 아세테이트를 가하여 반응을 종결시켰다. 원심분리한 후, 유기용매층을 분리하여 질소 가스하에 건조하였다. 반응물을 200㎕의 이동상에 볼텍스 믹싱으로 재구성시키고 20초간 소니케이션하였다. 제조된 용액의 적정량(10㎕)을 LC 컬럼에 주입하였다.
LC-MS 분석은 LCMS 소프트웨어를 장착한 쉬마쯔 LCMS-2010 EV 시스템 (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 electro spray ionization(positive) mode에서 실시하였다. Shim-pack VP-ODS 컬럼(250mm x 2.0mm i.d.; Shimadzu co., Japan)에서 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물과 아세토니트릴(70:30, v/v)로 0.2 ㎖/min의 유속으로 분리하였다. 대사산물을 확인하기 위하여, mass 스펙트라를 electro spray ionization(positive) mode 및 SIM mode에서 기록하였다. 인터페이스와 디텍터 볼트는 각각 4.4 kV 및 1.5 kV 이었다. 네블라이제이션 가스 속도는 1.5㎖/min으로 설정하였으며, 인터페이스, curve desolvation line(CDL) 및 히트블록 온도는 각각 250, 230 및 200℃로 하였다.
그 결과, 반응샘플의 mass spectra은 39.7 min(3-하이드록시 플로레틴), 42.2 min(플로레틴)에서 피크를 나타냈다. 야생형 CYP102A1 돌연변이체(M10)에 의해 생성된 대사체 및 기질인 플로레틴의 mass spectrum은 [M+H]+로 계산하였을 때 각각 291및 275로 관찰되었다(도 3).
반응혼합물의 LC-MS 분석에 의하여 키메라 CYP102A1에 의한 3-하이드록시 플로레틴의 생산이 확인되었다.
야생형 CYP102A1 돌연변이체 M10에 의하여 생성된 대사산물의 화학구조를 확인한 결과 생성된 산물은 NMR분석 기법을 통하여 분석한 결과 3-하이드록시 플로레틴인 것을 확인하였다(Huang AC, Wilde A, Ebmeyer J, Skouroumounis GK, Taylor DK. Examination of the Phenolic Profile and Antioxidant Activity of the Leaves of the Australian Native Plant Smilax glyciphylla. J. Nat. Prod. 76: 19301936, 2013. Supporting Information p.13)(도 4, 도 5, 표 6).
주요 대사 산물 (3-OH phloretin)의 1H 및 13C NMR 케미컬 시프트(chemical shift)
*Position δ C 13C(δ), ppm δ H 1H(δ), ppm
1 134.9
2 116.7 6.666 (1H, d, J=2.0Hz, partially overlapped with a wing of 5'-H proton doublet)
3 146.3
4 144.5
5 116.4 6.662 (1H, d, J=8.0Hz)
6 120.8 6.541 (1H, dd, J =2.0Hz, 8.0 Hz)
1' 105.4
2', 6' 166.0
3', 5' 95.9 5.807 (2H, s)
4' 166.3
*Position은 도1A에 나타낸 탄소의 번호임
분자촉매활성(turnover number)의 결정
야생형 CYP102A1의 돌연변이체들(M10, M16, M16V3, C7, D8, F7, G1, H1)에 의한 플로레틴 산화물의 생성속도를 알아보기 위하여 200μM의 플로레틴을 사용한 반응에서 분자촉매활성(turnover number)을 결정하였다. 플로레틴의 생성속도를 위에 기재한 바와 같이 HPLC로 결정하였다.
플로레틴의 산화(산물의 생성)에 대한 8종의 돌연변이체(M10, M16, M16V3, C7, D8, F7, G1, H1)의 분자촉매활성은 넓은 범위에서 다양하였다. 반면 야생형 CYP102A1의 촉매활성을 보이지 않았다. 야생형 CYP102A1의 돌연변이체 중 M16, C7, G1은 낮은 활성을 보였으며, 상기 8종의 돌연변이체중 M10은 다른 돌연변이체에 비해 2~3배 높은 활성을 나타내었다(도 6).
CYP102A1 돌연변이체 3종류(M10, M16, M16V3)의 효소를 선택하여 대사산물을 생성하는 효율을 속도록적 매개변수를 이용하여 비교하였다(도 7, [표 7]).
야생형 CYP102A1 돌연변이체의 속도론적 매개변수
Formation of 3-OH phloretin
CYP102A1 k cat (min -1 ) K m (μM) k cat / K m (min -1·μM -1)
M10 20 ± 1 59 ± 8 0.34 ± 0.13
M16 6.5 ± 0.8 65 ± 16 0.10 ± 0.05
M16V3 6.9 ± 0.4 38 ± 6 0.18 ± 0.07
서열목록은 서열목록파일에 별도로 첨부하였다.
서열번호 1은 wild type CYP102A1 amino acid sequence이다.
서열번호 2는 BamH I forward primer이다.
서열번호 3은 Sac I reverse primer이다.
서열번호 4는 R47L primer이다.
서열번호 5는 F81I primer이다.
서열번호 6은 F87V primer이다.
서열번호 7은 E143G primer이다.
서열번호 8은 L188Q primer이다.
서열번호 9는 E267V primer이다.
서열번호 10은 wild type CYP102A1 DNA sequence이다.
서열번호 11은 wild type CYP102A1 mutant M16 DNA sequence이다.
서열번호 12는 wild type CYP102A1 mutant M16V3 DNA sequence이다.
서열번호 13은 wild type CYP102A1 mutant M10 amino acid sequence이다.
서열번호 14는 wild type CYP102A1 mutant M16 amino acid sequence이다.
서열번호 15는 wild type CYP102A1 mutant M16V3 amino acid sequence이다.

Claims (4)

  1. CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군에서 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 플로레틴으로부터 3-하이드록시 플로레틴을 생성하는 3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물로,
    상기 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군은 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E로 구성된 군인 3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    NADPH-생성 시스템을 더 포함하는 3-하이드록시 플로레틴 제조용 조성물.
  3. CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군에서 적어도 하나 이상의 효소를 포함하고, 플로레틴을 기질로 하여 반응시키는 단계를 포함하는 3-하이드록시 플로레틴 생산방법으로,
    상기 CYP102A1의 돌연변이체로 구성된 군은 야생형 CYP102A1의 R47L/F87V/L188Q, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/K59N/F81I/F87V/E143G/L188Q/G240E/E267V/S383R/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V/Y334C/A335V/D369G/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/Q206R/E267A/V297A/K336E/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, R47L/F81I/F87V/E143G/T152A/L188Q/E267V/Q403R/V413A/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E, I39V/R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/N213D/I259T/E267V/A474V/E558D/T664A/P675L/A678E/E687A/A741G/K813E/R825S/R836H/E870N/I881V/E887G/P894S/S954N/M967V/Q981R/A1008D/H1021Y/Q1022E로 구성된 군인 3-하이드록시 플로레틴 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    NADPH-생성 시스템을 더 포함하는 3-하이드록시 플로레틴 생산방법.
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