WO2019066442A2 - 제2형 당뇨병 치료를 위한 락토페린 기반의 유전자 전달체 - Google Patents

제2형 당뇨병 치료를 위한 락토페린 기반의 유전자 전달체 Download PDF

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WO2019066442A2
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gcs
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diabetes
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이동윤
이창우
이승아
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한양대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a lactoferrin-based oral administration type gene carrier for the treatment of type 2 diabetes.
  • Diabetes can be classified into type 1 diabetes caused by insulin secretion in the pancreatic beta cells (beta cell) and type 2 diabetes caused by insulin resistance but increased by insulin resistance.
  • type 2 diabetes insulin resistance is caused by prolonged hyperglycemia.
  • insulin resistance is increased, the proliferation of beta cells is increased, so that a large amount of insulin is produced and overload occurs.
  • insulin secretion in beta cells becomes insufficient and hyperglycemia occurs, leading to various complications such as diabetic retinopathy, dyslipidemia, and cardiovascular disease.
  • Methods for treating type 2 diabetes include oral administration of a drug for stimulating the pancreas to promote secretion of insulin or inhibition of glucose uptake and neogenesis, and direct insulin administration.
  • this method has limitations in showing continuous effects, and there are various side effects such as vomiting and diarrhea.
  • FGF21 fibroblast growth factor 21
  • FGF21 fibroblast growth factor 21
  • fibroblast growth factor 21 is a protein mainly expressed in the liver and pancreas and acts as a hormone in the circulatory system and is known as a powerful regulator of blood glucose, lipid metabolism and energy homeostasis. It is also known to lower insulin resistance, reduce blood glucose and triglyceride levels, and reach various tissues through the blood to improve the symptoms of type 2 diabetes.
  • FGF21 has a half-life of about 2 hours in the body, there is a limit that can not show a long-term therapeutic effect on type 2 diabetes.
  • FGF21 and polystyrene-labeled polypeptides have been conjugated to overcome the short half-life.
  • a complex process is required for purification such as polypeptide library construction and gene screening.
  • An object of the present invention is to provide a gene transfer complex comprising (a) a biocompatible polymer and (b) a pegylated lactoferrin covalently linked to the biocompatible polymer.
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising a target gene fragment to be delivered into the body; And a gene delivery complex comprising the gene transfer complex.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of type 2 diabetes comprising the gene carrier as an active ingredient.
  • one aspect of the present invention provides a gene transfer complex comprising (a) a biocompatible polymer and (b) a pegylated lactoferrin covalently linked to the biocompatible polymer.
  • biocompatible polymer &quot refers to a substance that does not induce harmful reactions such as inflammatory reaction and / or immune response when introduced into a living body, and includes biodegradable and biostable materials And serves as a backbone capable of binding multiple pegylated lactoferrin.
  • the biocompatible polymer is selected from the group consisting of glycol chitosan, poly lactic acid, poly (lactic-co-glycolic acid), alginate alginate, hyaluronic acid, poly-L-lysine, gelatin and collagen.
  • glycol chitosan is water-soluble, it can be easily dissolved in water and easily moved to the esophagus-stomach-intestine in the body, and has positive charge, so that it can perform ionic bonding with a negative charge gene.
  • there is an adsorption power in the intestinal membrane of the body so that there is an advantage that the possibility of absorption by oral absorption can be increased.
  • lactoferrin' is a protein present in breast milk, saliva, tears and the like, and is most abundant in colostrums and exhibits activities such as antibacterial activity, immunity and anti-inflammatory activity.
  • Lactoferrin is a ligand capable of binding to one of the cell membrane proteins, LRP (low-density lipoprotein receptor-related protein) receptor.
  • LRP receptor lactoferrin receptor
  • LRP receptor lactoferrin receptor
  • the pegylated lactoferrin means that lactoferrin is linked to a polyethylene glycol (PEG) polymer and can be synthesized by heterobifunctional PEG.
  • PEG polyethylene glycol
  • the heterobifunctional PEG refers to PEG in which both ends of the PEG are substituted with different functional groups, which are different from each other.
  • it may contain a maleimide substituent at one end and an NHS ester substituent at the other end.
  • the maleimide substituent is a substituent capable of forming a chemical bond by reacting with a sulfhydryl (-SH) group
  • the NHS ester substituent is a substituent capable of forming a chemical bond by reacting with an amine group.
  • the NHS ester substituent can react with the amine group of the biocompatible polymer and react with lactoferrin having a sulfhydryl (-SH) substituent to synthesize pegylated lactoferrin.
  • the amine group of lactoferrin can be replaced with a sulfhydryl group using Traut's reagent.
  • the conjugate of pegylated lactoferrin covalently linked to the biocompatible polymer and the biocompatible polymer is absorbed into the body by the lactoferrin receptor, and thus can be used to deliver the desired gene into the body.
  • Another aspect of the present invention is a vector comprising a target gene fragment to be delivered into the body; And a gene carrier comprising the gene transfer complex.
  • the target gene refers to a gene to be introduced into and expressed in the body of a subject, and any gene necessary for prevention, improvement, or treatment of a disease can be used without limitation.
  • the target gene may be a gene encoding FGF21 (fibroblast growth factor 21, fibroblast growth factor 21), and the target gene fragment may include a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 .
  • the vector may further comprise additional sequences necessary for the expression of the target gene fragment, for example, a promoter sequence necessary for gene expression.
  • the gene carrier may comprise a vector and a gene transfer complex in a binding ratio of 1: 2 to 1:15.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of type 2 diabetes comprising the gene carrier as an active ingredient.
  • &quot type 2 diabetes melitus " is also referred to as non-insulin dependent diabetes mellitus, and it is known that insulin is not normally functioning when insulin is secreted or secreted from the pancreas, It means a state in which it is kept in a high state continuously.
  • the gene carrier may comprise the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • pharmacologically acceptable carriers are those conventionally used in pharmaceutical preparations such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose But are not limited to, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like may be further included.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) depending on the intended method.
  • composition of the present invention can be easily administered orally since it is easily absorbed by interaction with the LRP receptor expressed in small intestinal endothelial cells.
  • binders such as gum arabic, corn starch, microcrystalline cellulose or gelatin
  • Excipients such as calcium or lactose, disintegrants such as alginic acid, corn starch or potato starch, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose or saccharin and flavors such as peppermint, methyl salicylate or fruit flavor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment.
  • the effective dose level will depend on the type of disease, severity, The sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and can be administered singly or in multiple doses. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • biocompatible polymer backbone disclosed in the present invention and the gene transfer complex comprising pegylated lactoferrin covalently linked to the biocompatible polymer backbone can be orally administered to an individual and absorbed into the body through a lactoferrin receptor, And can be expressed in vivo.
  • FIG. 1 shows a process of synthesizing gCS-PEG-hydrolyzed MAL by reacting glycol chitosan (gCS) with NHS-PEG-MAL ( N -hydroxylsuccinimide polyethylene glycol maleimide) Lf) to synthesize thiolated Lf (Lf-SH), and C shows the process of synthesizing gCS-PEG-Lf by reacting gCS-PEG-hydrolyzed MAL with Lf-SH.
  • gCS glycol chitosan
  • NHS-PEG-MAL N -hydroxylsuccinimide polyethylene glycol maleimide
  • FIG. 2A shows the ATR-FTIR (attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy) analysis results of gCS, NHS-PEG-MAL and gCS-PEG-hydrolyzed MAL.
  • ATR-FTIR attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy
  • FIG. 2B shows the results of ATR-FTIR analysis of Lf and Lf-SH.
  • FIG. 2C shows the results of ATR-FTIR analysis of gCS-PEG-hydrolyzed MAL, Lf-SH and gCS-PEG-Lf.
  • FIG. 3 (A) shows Caco-2 cells treated with gCS-PEG-Lf, and B and C were treated with gCS-PEG-Lf in Caco-2 cells, 8 (cell counting kit-8).
  • FIG. 4 shows the result of confirming endocytosis of gCS-PEG-Lf by a lactoferrin receptor by a TEEP (transepithelial electrical resistance) test.
  • FIG. 5 shows the results of performing a gel retardation experiment after changing the binding ratio of GFP gene to gCS-PEG-Lf.
  • FIG. 6A shows the results of measuring the Zeta potential of the reaction solution after changing the binding ratio of the GFP gene to gCS-PEG-Lf.
  • FIG. 6B shows the result of measuring the Zeta size of the reaction solution after changing the binding ratio of GFP gene to gCS-PEG-Lf.
  • FIG. 7 shows the result of oral administration of GFP / gCS-PEG-Lf to mice, followed by isolation of each tissue, staining with hematocylline and eosin, and detection of GFP expression level.
  • FIG. 8 shows the result of orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to mice and then separating each tissue to confirm the expression level of FGF21 (fibroblast growth factor 21) and insulin.
  • FIG. 9A shows the results of measuring the blood levels of FGF21 protein after oral administration or intraperitoneal injection of FGF21 / gCS-PEG-Lf in a mouse.
  • FIG. 9B shows the results of measuring blood levels of insulin after oral administration or intraperitoneal injection of FGF21 / gCS-PEG-Lf in mice.
  • FIG. 10 shows the result of confirming the level of GFP expression after treating GFP / gCS-PEG-Lf in Langerhans islets of rats.
  • Fig. 11 shows the results of insulin tolerance test (ITT) for induction of type 2 diabetes after supplying a high fat diet to mice.
  • ITT insulin tolerance test
  • FIG. 12A shows the result of measuring body weight over time while orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to a model mouse of type 2 diabetes.
  • FIG. 12B shows the result of measuring body weight over time while orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to a model mouse of type 2 diabetes.
  • FIG. 12c shows the results of measuring the average feed intake over time while orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to model mice of the type 2 diabetes mellitus.
  • FIG. 13A shows the result of measuring the non-fasting blood glucose over time while orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to a model mouse of type 2 diabetes.
  • FIG. 13B shows the results of indicating the non-fasting blood glucose level as a percentage over time while orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to a model mouse of type 2 diabetes.
  • FIG. 13C shows the result of measuring fasting blood glucose over time while orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to a model mouse of type 2 diabetes.
  • FIG. 13D shows the results of expressing fasting blood glucose as a percentage over time while orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to a model mouse of type 2 diabetes.
  • FIG. 14A shows the result of measuring the level of FGF21 in serum after oral administration of FGF21 / gCS-PEG-Lf to a mouse model of type 2 diabetes for a short period or organs.
  • FIG. 14B shows the results of measuring insulin levels in serum after oral administration of FGF21 / gCS-PEG-Lf to a mouse model of type 2 diabetes for a short period or organs.
  • FIG. 15 shows the results of confirming the expression levels of FGF21 and insulin by orally administering FGF21 / gCS-PEG-Lf to a mouse of type 2 diabetes mellitus in a short or long term.
  • Glycol chitosan (hereinafter referred to as gCS) was dissolved in PBS (phosphate buffered saline; pH 8.0), and then reacted with NHS-PEG-MAL ( N- hydroxylsuccinimide polyethylene glycol maleimide) for 20 minutes.
  • the reaction solution was dialyzed for more than 12 hours, and the dialysis solution was lyophilized to obtain a powdery reaction product (gCS-PEG-hydrolyzed MAL).
  • Figure 1 schematically illustrates the process for the synthesis of glycol chitosan-PEG-lactoferrin.
  • GCS and PEG-PEG-Lf were analyzed by ATR-FTIR (attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy), and gCS-PEG-PEG-MAL and gCS-PEG-hydrolyzed MAL were synthesized.
  • the peak corresponding to newly formed COOH by the hydrolysis reaction of MAL was confirmed at 1696 ⁇ 1729 cm -1 .
  • Caco-2 cells were treated with gCS-PEG-Lf for 24 hours and cell viability was confirmed by CCK-8 (cell counting kit-8). As a result, as shown in FIG. 3C, the survival rate of Caco-2 cells decreased quantitatively as the concentration of gCS-PEG-Lf increased. It was also confirmed that the IC 50 value of gCS-PEG-Lf was 3.7308 mg / ml.
  • Example 3 by lactoferrin receptor gCS -PEG- Of Lf Endocytosis confirmation
  • Caco-2 cells were cultured in a 0.4 ⁇ m pore size transwell plate to form a monolayer, and TEEP (Transepithelial electrical resistance) experiments were performed.
  • TEEP Transepithelial electrical resistance
  • GFP gene and gCS-PEG-Lf were mixed at different ratios. After reacting for 30 minutes, 0.2 mg / ml of reaction solution was added to a disposable cuvette and mixed well. The Zeta potential and Zeta size of the GFP / gCS-PEG-Lf solution were measured using dynamic light scattering (DLS) equipment.
  • DLS dynamic light scattering
  • Example 5 Confirmation of targeting of gCS-PEG-Lf by oral administration
  • the gCS-PEG-Lf synthesized to treat type 2 diabetes is absorbed into the body after oral administration and delivered to the tissues. During the process of reaching each tissue, the acidic pH environment and the proteolytic enzyme were encountered, and thus it was confirmed that gCS-PEG-Lf was stably transferred to the tissue in this environment.
  • GFP / gCS-PEG-Lf was orally administered at a concentration of 100 ⁇ g / 500 ⁇ g per mouse. After 3 days, the mouse was sacrificed and the brain, heart, duodenum, jejunum, kidney, liver, pancreas, spleen, and lungs in the liver and kidneys. The dissected tissue was embedded in an OCT compound to make a tissue block, and the tissue block was frozen in a cryocooler for 24 hours. The tissue block was then cryosectioned to perform hematocylin & eosin staining and observed with an optical microscope. The degree of GFP expression was also confirmed by fluorescence microscopy.
  • IHC Immunohistochemistry
  • Example 8 Endocytosis of GFP / gCS-PEG-Lf by pancreatic beta cells
  • Langerhans islets of the pancreas were isolated and purified from rats and cultured. 5 ⁇ g of GFP and 25 ⁇ g of gCS-PEG-Lf were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes. Then, the reaction product (GFP / gCS-PEG-Lf) was treated for 4 hours in Langerhans islets. After 4 hours, the medium was changed, and the Langerhans is further cultured for 48 hours. After the incubation, the expression of GFP was observed under a fluorescence microscope.
  • Example 9 Improvement of type 2 diabetes mellitus by administration of FGF21 / gCS-PEG-Lf
  • FGF21 gene was used at 500 ⁇ g per mouse.
  • 500 F of FGF21 gene and 2500 g of gCS-PEG-Lf were reacted at room temperature for 30 minutes to obtain FGF21 / gCS-PEG-Lf.
  • HFD mice were divided into a control group (HFD control), an FGF21 short-term administration group (HFD + FGF21 short term) and a long-term administration group of FGF21 (HFD + FGF21 long term).
  • FGF21 / gCS-PEG-Lf was administered orally every 4 days.
  • Sodium borate buffer was orally administered before oral administration of FGF21 / gCS-PEG-Lf.
  • FGF21 / gCS-PEG-Lf was administered three times in the short-term administration group of FGF21 and nine times in the long-term administration group of FGF21.
  • body weight, food intake and non-fasting blood glucose levels were measured every 2 days and fasting blood glucose levels were measured at 4 days was measured immediately before administration of FGF21 / gCS-PEG-Lf.
  • FIGS. 12A and 12B it was confirmed that the body weight was decreased in the FGF21-administered group (short-term and long-term) over time.
  • the body weight was increased after the oral administration of FGF21 / gCS-PEG-Lf was discontinued.
  • FIGS. 12c and 12d there was no significant difference in feed intake between the control and FGF21 treated groups (short term and long term) (FIGS. 12c and 12d).
  • Figs. 13A to 13D blood glucose also showed similar tendency to body weight. It was found that the effect of FGF21 / gCS-PEG-Lf was effective in the treatment of type 2 diabetes.
  • the blood was collected from the mice and plasma was separated and the level of FGF21 and insulin was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the FGF21 concentration was about 0.5 ng / ml in the normal group not fed with HFD, and the FGF21 concentration in the control group (HFD Con) .
  • the concentration of FGF21 in the blood was remarkably higher than that of the other experimental groups.
  • the blood insulin concentration also showed a trend similar to that of FGF21.
  • the lowest concentration was observed in the normal group and the control group and the FGF21 short term group showed higher concentration.
  • Insulin concentration was the highest in the long-term group of FGF21.
  • the results of the FGF21 short-term treatment group and the control group are similar because the FGF21 gene is clearance after a long time after oral administration of FGF21 / gCS-PEG-Lf.
  • FGF21 / gCS-PEG-Lf can be administered orally to increase the concentration of FGF21 protein and insulin in the blood.
  • mice of each experimental group were sacrificed to separate brain, duodenum, plant, ileum, heart, kidney, liver, lung, Immunohistochemical staining was performed with organs isolated according to the method of Example 5 and observed with a microscope.

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Abstract

본 발명은 생체적합성 고분자 백본 및 상기 생체적합성 고분자 백본에 공유결합으로 연결된 페길화된 락토페린(pegylated lactoferrin)을 포함하는 유전자 전달용 복합체에 관한 것으로, 상기 유전자 전달용 복합체는 개체 내에 경구로 투여되어 락토페린 수용체를 통하여 체내로 흡수될 수 있으며, 표적 유전자를 생체 내로 전달하여 발현시킬 수 있다.

Description

제2형 당뇨병 치료를 위한 락토페린 기반의 유전자 전달체
본 발명은 제2형 당뇨병의 치료를 위한 락토페린 기반의 경구 투여형 유전자 전달체에 관한 것이다.
전 세계적으로 성인의 8.3%가 당뇨병 질환을 앓고 있으며, 당뇨병 환자는 매년 약 4~6% 증가하고 있다. 당뇨병은 췌장의 베타 세포(β cell)에서 인슐린이 분비되지 않아 발생하는 제1형 당뇨병과 인슐린은 분비되지만 인슐린 저항성이 증가하여 발생하는 제2형 당뇨병으로 구분할 수 있다. 제2형 당뇨병에서 인슐린 저항성은 장기간 고혈당 상태가 지속됨으로써 발생하며, 인슐린 저항성이 증가하면 베타 세포의 증식이 증가하므로 인슐린이 많이 생성되어 과부하가 발생한다. 결과적으로 베타세포에서의 인슐린 분비가 불충분하게 되고, 고혈당증이 발생하여 당뇨병성 망막증, 이상 지혈증, 심혈관 질환 등과 같은 여러 가지 합병증을 유발하게 된다.
제2형 당뇨병을 치료하기 위한 방법으로는 췌장을 자극하여 인슐린의 분비를 촉진하거나 포도당의 흡수 및 신생 합성을 억제하는 경구용 약물 투여 방법과 직접 인슐린을 투여하는 인슐린 주사법이 이용되고 있다. 그러나 이러한 방법은 지속적인 효과를 나타내는데 한계가 있으며, 구토나 설사 등의 여러 가지 부작용이 존재한다.
한편, FGF21(fibroblast growth factor 21)은 간과 췌장에서 주로 발현되는 단백질로 순환계에서 호르몬으로 작용하며 혈당, 지질 대사 및 에너지 항상성의 강력한 조절 인자로 알려져 있다. 또한, 인슐린 저항성을 낮추고, 혈중 포도당과 트리글리세리드(triglyceride)의 농도를 감소시키며, 혈액을 통해 다양한 조직에 도달하여 제2형 당뇨병의 증상을 개선시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 FGF21은 체내에서의 반감기가 약 2시간이므로 제2형 당뇨병에 대하여 장시간 치료 효과를 나타낼 수 없는 한계가 있다. 상기 한계를 극복하기 위하여 FGF21과 폴리스티렌이 표지된 폴리펩티드를 접합시켜 짧은 반감기를 극복하였으나, 폴리펩티드 라이브러리 구축 및 유전자 스크리닝(screening) 등 정제에 복잡한 과정이 필요하다.
한편, FGF21의 유사체(analog)인 LY2405319를 투여하는 방법도 사용되고 있으나, 체중 감소 및 포도당의 항상성에 대해서 유의미한 효과를 보이지는 못하고 있다. 또한, 체내에서의 반감기가 FGF21과 동일하여 지속적인 효과를 보이지 못한다는 단점이 존재한다.
따라서, 제2형 당뇨병을 개선하기 위해서는 FGF21의 효과를 유지하면서 체내에서의 반감기를 증가시킬 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명의 일 목적은 (a) 생체적합성 고분자 및 (b) 상기 생체적합성 고분자에 공유결합으로 연결된 페길화된 락토페린(pegylated lactoferrin)을 포함하는 유전자 전달용 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 체내로 전달하고자하는 목적 유전자 단편을 포함하는 벡터; 및 유전자 전달용 복합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 (a) 생체적합성 고분자 및 (b) 상기 생체적합성 고분자에 공유결합으로 연결된 페길화된 락토페린을 포함하는 유전자 전달용 복합체를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '생체적합성 고분자(biocompatible polymer)'는 생체 내에 도입되는 경우 염증 반응 및/또는 면역 반응과 같은 유해 반응을 유도하지 않는 물질을 의미하고, 생분해성 및 생체안정성 물질을 포함하며, 다수의 페길화된 락토페린과 결합할 수 있는 백본(backbone) 역할을 한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 생체적합성 고분자는 글리콜 키토산(glycol chitosan), 폴리락틱산(poly lactic acid), 폴리락틱-코-글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid)), 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리-L-리신, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는 글리콜 키토산일 수 있으며, 글리콜 키토산은 수용성이므로 물에 잘 녹아서 체내의 식도-위-장 등으로 쉽게 이동할 수 있고, 양전하를 갖고 있어서 음전하의 유전자와 이온결합을 할 수 있다. 또한, 체내의 장막에 흡착력이 있는 것으로 알려져 있어 경구 흡수시 흡수될 가능성을 높일 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '락토페린(lactoferrin)'은 모유, 타액, 눈물 등에 존재하는 단백질로 초유(colostrums)에 가장 많이 함유되어 있으며, 항균 작용, 면역력 증가, 항염 작용 등의 활성을 나타낸다. 또한, 락토페린은 세포막 단백질 중 하나인 LRP(Low-density lipoprotein receptor related protein) 수용체와 결합이 가능한 리간드이며, LRP 수용체(락토페린 수용체)는 소장 상피, 뇌혈관 내피세포 등에 다수 발현되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 페길화된 락토페린은 락토페린과 폴리에틸린 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 중합체가 연결된 것을 의미하며, 헤테로 이중기능성(heterobifunctional) PEG에 의하여 합성될 수 있다.
상기 헤테로 이중기능성 PEG는 PEG의 양 말단이 각각 서로 다른 적절한 기능기로 치환되어 있는 PEG를 의미한다. 예를 들어, 일 말단에 말레이미드(maleimide) 치환기를 포함하고, 다른 일 말단에 NHS 에스테르 치환기를 포함할 수 있다. 상기 말레이미드 치환기는 설프히드릴(-SH) 그룹과 반응하여 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기이고, NHS 에스테르 치환기는 아민 그룹과 반응하여 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 NHS 에스테르 치환기는 생체적합성 고분자의 아민 그룹과 1차로 반응하고, 설프히드릴(-SH) 치환기를 갖는 락토페린과 반응하여 페길화된 락토페린을 합성할 수 있다. 이 경우 트라웃 시약(Traut's reagent)을 이용하여 락토페린의 아민 그룹을 설프히드릴 그룹으로 치환시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 생체적합성 고분자 및 생체적합성 고분자에 공유결합으로 연결된 페길화된 락토페린의 복합체는 락토페린 수용체에 의하여 체내로 흡수되므로 목적하는 유전자를 체내로 전달하는 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 체내로 전달하고자하는 목적 유전자 단편을 포함하는 벡터; 및 상기 유전자 전달용 복합체를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 유전자는 개체의 체내로 도입하여 발현시키고자 하는 유전자를 의미하며, 질병의 예방, 개선 또는 치료에 필요한 유전자이면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 유전자는 FGF21(fibroblast growth factor 21, 섬유아세포 성장 인자 21)을 암호화하는 유전자일 수 있고, 상기 목적 유전자 단편은 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 벡터는 목적 유전자 단편의 발현에 필요한 부가적인 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 유전자 발현에 필요한 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 유전자 전달체는 벡터 및 유전자 전달용 복합체를 1:2 내지 1:15의 결합비로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '제2형 당뇨병(type 2 diabetes melitus)'은 인슐린 비의존성 당뇨병으로도 불리우며, 췌장에서 인슐린이 거의 또는 전혀 분비되지 않거나, 분비되더라도 인슐린이 정상적으로 작동하지 못하여 체내 혈당이 계속 높은 상태로 유지되는 상태를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 유전자 전달체는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 소장 내피세포에 발현되어 있는 LRP 수용체와의 상호작용에 의한 흡수가 용이하므로 바람직하게는 경구 투여할 수 있다. 경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제, 현탁제 등의 제제로 제형화하는 경우, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산마그네슘과 같은 활택제, 슈크로스 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 개시된 생체적합성 고분자 백본 및 상기 생체적합성 고분자 백본에 공유결합으로 연결된 페길화된 락토페린을 포함하는 유전자 전달용 복합체는 개체 내에 경구로 투여되어 락토페린 수용체를 통하여 체내로 흡수될 수 있으므로 목적 유전자를 생체 내로 전달하여 발현시킬 수 있다.
도 1의 A는 글리콜 키토산(glycol chitosan, gCS)과 NHS-PEG-MAL(N-hydroxylsuccinimide polyethylene glycol maleimide)을 반응시켜 gCS-PEG-hydrolyzed MAL을 합성하는 과정, B는 Traut's 용액과 락토페린(lactoferrin, Lf)을 반응시켜 티올화된 Lf(Lf-SH)를 합성하는 과정 및 C는 gCS-PEG-hydrolyzed MAL과 Lf-SH를 반응시켜 gCS-PEG-Lf를 합성하는 과정을 나타낸다.
도 2a는 gCS, NHS-PEG-MAL 및 gCS-PEG-hydrolyzed MAL의 ATR-FTIR(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy) 분석 결과를 나타낸다.
도 2b는 Lf와 Lf-SH의 ATR-FTIR 분석 결과를 나타낸다.
도 2c는 gCS-PEG-hydrolyzed MAL, Lf-SH 및 gCS-PEG-Lf의 ATR-FTIR 분석 결과를 나타낸다.
도 3의 A는 Caco-2 세포에 gCS-PEG-Lf 처리 후 광학 현미경으로 확인한 결과, B와 C는 Caco-2 세포에 gCS-PEG-Lf를 처리한 후 각각 Live and Dead Cell Kit와 CCK-8(cell counting kit-8)로 세포 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 락토페린 수용체에 의한 gCS-PEG-Lf의 엔도시토시스(endocytosis) 여부를 TEER(Transepithelial electrical resistance) 실험으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합비를 변경하여 반응시킨 후 젤 지연(gel retardation) 실험을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6a는 GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합비를 변경하여 반응시킨 후 반응액의 제타 전위(Zeta potential)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6b는 GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합비를 변경하여 반응시킨 후 반응액의 제타 크기(Zeta size)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 마우스에 GFP/gCS-PEG-Lf를 경구 투여한 후 각 조직을 분리하여 헤마토실린&에오신으로 염색한 결과 및 GFP의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여한 후 각 조직을 분리하여 FGF21(fibroblast growth factor 21)과 인슐린의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9a는 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여 또는 복강내 주사로 투여한 후 FGF21 단백질의 혈중 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9b는 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여 또는 복강내 주사로 투여한 후 인슐린의 혈중 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 랫트의 랑게르한스섬에 GFP/gCS-PEG-Lf를 처리한 후 GFP 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 마우스에 고지방 식이를 공급한 후 제2형 당뇨병의 유도 여부를 ITT(Insulin tolerance test)로 확인한 결과를 나타낸다.
도 12a는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하면서 시간 경과에 따른 체중을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12b는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하면서 시간 경과에 따른 체중을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12c는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하면서 시간 경과에 따른 평균 사료 섭취량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13a는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하면서 시간 경과에 따른 비공복 혈당을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13b는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하면서 시간 경과에 따른 비공복 혈당을 백분율로 표시한 결과를 나타낸다.
도 13c는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하면서 시간 경과에 따른 공복 혈당을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13d는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하면서 시간 경과에 따른 공복 혈당을 백분율로 표시한 결과를 나타낸다.
도 14a는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 단기 또는 장기로 경구 투여한 후 혈청 내 FGF21 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14b는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 단기 또는 장기로 경구 투여한 후 혈청 내 인슐린 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 제2형 당뇨별 모델 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf를 단기 또는 장기로 경구 투여한 후 각 조직을 분리하여 FGF21과 인슐린의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 글리콜 키토산-PEG-락토페린 합성
1-1. 글리콜 키토산-PEG-락토페린 합성
글리콜 키토산(glycol chitosan; 이하, gCS로 기재함)을 PBS(phosphate buffered saline; pH 8.0)에 용해시킨 후 NHS-PEG-MAL(N-hydroxylsuccinimide polyethylene glycol maleimide)를 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 반응액을 12시간 이상 투석(dialysis)하고, 투석액을 동결 건조시켜 파우더 형태의 반응물(gCS-PEG-hydrolyzed MAL)을 수득하였다.
PBS(pH 8.0)에 나트륨 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt)를 용해시키고, 락토페린(lactoferrin; 이하, Lf로 기재함)과 Traut's 용액을 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 냉장고에서 12시간 이상 투석을 진행하였다. 상기 반응물 파우더(gCS-PEG-hydrolyzed MAL)를 PBS(pH 6.8)에 용해시키고, 투석한 상기 락토페린 반응액(SH-Lf 포함)을 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 12시간 이상 투석을 진행하고, 투석액을 동결 건조시킨 후 파우더 형태의 gCS-PEG-Lf를 수득하였다.
도 1에 글리콜 키토산-PEG-락토페린 합성 과정을 개략적으로 나타내었다.
1-2. 합성한 gCS-PEG-Lf 확인
합성 전 물질인 gCS와 NHS-PEG-MAL, 합성 물질인 gCS-PEG-hydrolyzed MAL, gCS-PEG-Lf를 ATR-FTIR(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy)로 분석하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 합성 물질인 gCS-PEG-hydrolyzed MAL에서 gCS에 해당하는 피크(peak)인 3382 ㎝-1, 3300 ㎝- 1와 NHS-PEG-MAL에 해당하는 피크인 2875 ㎝-1, 520 ㎝-1가 모두 존재하는 것을 확인할 수 있었다. MAL의 수화(hydrolysis) 반응에 의하여 새롭게 형성된 COOH에 해당하는 피크는 1696~1729 ㎝-1에서 확인할 수 있었다.
또한, 도 2b에 나타난 바와 같이 티올화(thiolation)된 Lf(SH-Lf)에서 기존 Lf에 해당하는 피크(1630 ㎝-1, 1525 ㎝- 1)가 존재하고, S-H에 대한 새로운 피크(2550 ㎝-1)가 형성된 것을 알 수 있었다.
또한, 도 2c에 나타난 바와 같이 gCS-PEG-Lf를 분석한 결과, 기존 Lf에 해당하는 피크(1630 ㎝-1, 1525 ㎝- 1)가 존재하고, gCS-PEG-MAL에 해당하는 피크 (1050 ㎝-1)를 갖는 것을 알 수 있었다.
실시예 2: gCS-PEG-Lf의 세포 독성 확인
소장 상피 유래 세포인 Caco-2 세포에 서로 다른 농도(0, 1, 2.5, 3.5, 5, 7.5, 10 및 12.5 ㎎/㎖)의 gCS-PEG-Lf를 처리한 결과, 도 3의 A에 나타난 바와 같이 gCS-PEG-Lf의 처리 농도가 높아질수록 Caco-2 세포가 사멸하는 것을 광학 현미경으로 확인할 수 있었다.
또한, 동일한 실험을 Live and Dead Cell Kit(Sigma-Aldrich, 미국)로 수행하였다. 그 결과, 도 3의 B에 나타난 바와 같이 gCS-PEG-Lf의 농도가 높아질수록 적색 형광이 증가하는 것을 확인하여 Caco-2 세포의 사멸이 증가하는 것을 알 수 있었다.
Caco-2 세포에 gCS-PEG-Lf를 24시간 동안 처리한 후 CCK-8(cell counting kit-8)로 세포 생존율(viability)을 확인하였다. 그 결과, 도 3의 C에 나타난 바와 같이 gCS-PEG-Lf의 농도가 상승할수록 Caco-2 세포의 생존율이 감소하는 것을 정량적으로 알 수 있었다. 또한, gCS-PEG-Lf의 IC50 값이 3.7308 ㎎/㎖인 것을 확인하였다.
실시예 3: 락토페린 수용체에 의한 gCS -PEG- Lf의 엔도시토시스 확인
0.4 ㎛ 공극(pore) 크기의 트랜스웰 플레이트(transwell plate)에서 Caco-2 세포를 배양하여 단일층(monolayer)을 형성시키고, TEER(Transepithelial electrical resistance) 실험을 수행하였다.
배양한 Caco-2 세포(2x104 세포/인서트)를 대조군(Con), gCS(1,000 ㎍/㎖) 처리군, gCS-PEG 처리군, gCS-PEG-Lf(1,000 ㎍/㎖) 처리군 및 Lf+gCS-PEG-Lf 처리군으로 나누고, 해당 처리를 한 후 시간에 따른 TEER 값을 측정하였다. Lf+gCS-PEG-Lf 처리군은 Lf(1,000 ㎍/㎖)로 Lf 수용체를 3시간 동안 포화시킨 후 gCS-PEG-Lf(1,000 ㎍/㎖)를 처리하였다.
측정 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 Lf가 결합되지 않은 처리군과 비교하여 gCS-PEG-Lf 처리군에서는 시간이 지남에 따라 TEER 값이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 Lf+gCS-PEG-Lf 처리군에서는 TEER 값이 감소하지 않는 것을 확인하여 gCS-PEG-Lf가 Lf 수용체에 의하여 엔도시토시스(endocytosis) 되는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: gCS-PEG-Lf과 DNA의 결합 비율 확인
4-1. 젤 지연(gel retardation) 실험
GFP 유전자 5 ㎍과 gCS-PEG-Lf(0, 5, 10, 15, 20, 35 및 50 ㎍)의 결합 비율을 다르게 하여 30분 동안 반응시켰다. 종료 후 결과물을 아가로스 젤(agarose gel)에 로딩(loading)하여 100V에서 40분 동안 전기영동하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 비율이 증가할수록 GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합 비율(질량비)이 4 이상일 때 가장 이상적으로 결합하는 것을 알 수 있었다.
4-2. 제타 크기 및 제타 전위 측정
GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합 비율을 다르게 하여 30분 동안 반응시킨 후 일회용 큐벳(cuvette)에 0.2 ㎎/㎖ 농도의 반응액을 넣고 잘 섞어주었다. 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS) 장비를 사용하여 GFP/gCS-PEG-Lf 용액의 제타 전위(Zeta potential)와 제타 크기(Zeta size)를 측정하였다.
그 결과, 도 6a에 제시된 제타 전위 그래프에 나타난 바와 같이 GFP 유전자에 존재하는 인산기에 의하여 음전하(negative charge)가 나타나고, gCS-PEG-Lf에 의하여 양전하(positive charge)가 나타나며, GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합 비율이 1:5일 때 가장 0에 가까운 전하가 나타나는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 6b에 제시된 제타 사이즈 그래프에서는 GFP 유전자와 gCS-PEG-Lf의 결합 비율이 1:3 또는 1:5일 때 가장 작은 사이즈를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 5: 경구 투여에 의한 gCS-PEG-Lf의 표적화 확인
제2형 당뇨병을 치료하기 위해 합성된 gCS-PEG-Lf는 경구 투여 후 체내로 흡수되어 조직으로 전달된다. 각 조직에 도달하는 과정 중 위에서 산성 pH 환경과 단백질 분해효소 등을 만나게 되므로 이러한 환경에서 gCS-PEG-Lf이 안정하게 조직으로 전달되는지 확인하였다.
GFP/gCS-PEG-Lf를 마우스 한마리당 100 ㎍/500 ㎍ 농도로 경구 투여하고, 3일 후에 마우스를 희생시켜 뇌(brain), 심장(heart), 십이지장(duodenum), 공장(jejunum), 회장(ileum), 신장(kidney), 간(liver), 췌장(pancreas), 지라(spleen) 및 폐(lung)를 분리하였다. 분리한 조직을 OCT 컴파운드(compound)에 포매(embedding)하여 조직 블록을 제작하고, 조직 블록은 24시간 동안 초저온 냉동고에서 동결시켰다. 이후 조직 블록을 동결절삭(cryosection)하여 헤마토실린&에오신 염색을 수행하고, 광학 현미경으로 관찰하였다. 또한, 형광 현미경으로 GFP 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 GFP/gCS-PEG-Lf를 경구 투여한 경우 각 조직에서 GFP 형광 신호를 확인할 수 있었다. 이는 GFP/gCS-PEG-Lf가 각 조직에 안정하게 전달된 것을 의미한다.
실시예 6: FGF21 유전자 투여량에 따른 FGF21과 인슐린의 발현 수준 비교
서열번호 1의 FGF21 유전자는 pCMV6-XL5 플라스미드 벡터(ORIGENE, 4.7 kb)의 EcoRI 및 SalI 부위에 삽입시켜 사용하였다. 다른 농도의 FGF21 유전자(200 또는 500 ㎍)를 포함하는 FGF21/gCS-PEG-Lf(FGF21 유전자:gCS-PEG-Lf=1:5)를 마우스에 경구 투여하고, 3일 후에 마우스를 희생시켜 간, 십이지장, 공장, 회장 및 췌장을 분리하였다. 분리한 장기를 파라핀으로 고정시킨 후 절단하여 조직 절편을 제작하고, FGF21 항체와 인슐린 항체로 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 염색을 수행하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 FGF21 유전자의 경구 투여량이 증가할수록 FGF21 단백질과 인슐린이 더 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 근거로 생체 내(in vivo) 실험에서 사용할 FGF21 유전자의 경구 투여량을 결정하였다.
실시예 7: FGF21 투여 방식에 따른 혈중 FGF21과 인슐린 농도 비교
FGF21 유전자의 투여량을 500 ㎍으로 설정하고, 10주령의 C57BL6J 마우스에 FGF21/gCS-PEG-Lf(FGF21 유전자:gCS-PEG-Lf=1:5)를 경구 투여하거나 또는 복강내(intraperitoneal, i.p)에 주사하였다. 3일 후 마우스를 희생시키고, 복대정맥을 통해 혈액을 채취하여 원심분리로 혈장(plsma)만 분리하였다. 분리한 혈장으로 FGF21과 인슐린에 대한 ELISA 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여한 경우보다 복강내 주사한 경우 혈중 FGF21 단백질 농도가 높은 것을 확인할 수 있었다. 그러나 혈중 인슐린 농도는 유의미한 차이가 나타나지 않았으며(도 9b), 이는 정상 마우스에서 진행한 실험이므로 제2형 당뇨병 모델에서 인슐린의 분비량에 영향을 주는 FGF21이 그 효과를 보이지 않았기 때문인 것으로 사료된다.
실시예 8: 췌장의 베타세포에 의한 GFP/gCS-PEG-Lf의 엔도시토시스 확인
랫트(rat)로부터 췌장의 랑게르한스섬(Langerhans islets)을 분리 및 정제하여 배양하였다. GFP 5 ㎍과 gCS-PEG-Lf 25 ㎍을 혼합하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 반응물(GFP/gCS-PEG-Lf)을 랑게르한스섬에 4시간 동안 처리하였다. 4시간 후 배지를 교체하고, 랑게르한스섬을 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 끝난 후 GFP의 발현 여부를 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 랑게르한스섬 내부에서 GFP가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 엔도시토시스를 통해 gCS-PEG-Lf가 췌장의 랑게르한스섬에 이입된다는 것을 의미한다.
실시예 9: FGF21/gCS-PEG-Lf 투여에 의한 제2형 당뇨병 개선 효과
9-1. 제2형 당뇨병 동물모델 제작
C57BL6J 마우스를 정상 식이군(Normal; n=5)과 고지방 식이군(high fat diet, HFD; n=5)으로 분류하고, 14주 동안 해당 사료를 섭취시켰다. 이후 제2형 당뇨병의 유도 여부를 확인하기 위하여 ITT(Insulin tolerance test)를 수행하였다. 양 그룹의 마우스를 6시간 동안 금식시킨 후 인슐린 용액(0.75 U/㎏)을 복강내에 주사하였다. 주사 후 일정 시간 간격으로 혈당을 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 정상 식이군과 비교하여 고지방 식이군에서 모든 시간대에 혈당이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통하여 고지방 식이군에 제2형 당뇨병이 유도된 것으로 판단할 수 있었다.
9-2. FGF21/gCS-PEG-Lf 투여에 의한 혈당 및 체중 개선 효과
FGF21 유전자는 마우스 1 마리당 500 ㎍을 사용하였다. FGF21 유전자 500 ㎍과 gCS-PEG-Lf 2500 ㎍을 상온에서 30분 동안 반응시켜 FGF21/gCS-PEG-Lf을 수득하였다. HFD 마우스를 대조군(HFD control), FGF21 단기 투여군(HFD+FGF21 short term) 및 FGF21 장기 투여군(HFD+FGF21 long term)으로 나누고, FGF21/gCS-PEG-Lf를 4일에 한번씩 경구 투여하였다. FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여하기 전 SB 버퍼(sodium borate buffer)를 경구로 투여하였다. FGF21 단기 투여군에는 FGF21/gCS-PEG-Lf를 총 3회 투여하고, FGF21 장기 투여군에는 총 9회 투여하였다. 실험을 진행하는 동안 체중(body weight), 사료 섭취량(food intake) 및 비-공복 혈당(non-fasting blood glucose level)을 2일에 한 번씩 측정하고, 공복 혈당(fasting blood glucose level)은 4일에 한 번씩 FGF21/gCS-PEG-Lf 투여 직전에 측정하였다.
그 결과, 도 12a 및 12b에 나타난 바와 같이 시간이 경과함에 따라 FGF21 투여군(단기&장기)에서 체중이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 FGF21 단기 투여군의 경우 FGF21/gCS-PEG-Lf의 경구 투여를 중단한 이후 체중이 증가하는 것을 알 수 있었다. 한편, 대조군과 FGF21 투여군(단기&장기) 사이에 사료 섭취량은 유의미한 차이가 없었다(도 12c 및 12d).
또한, 도 13a 내지 13d에 나타난 바와 같이 혈당 또한 체중과 유사한 경향을 나타내었다. 이를 통하여 체중과 혈당 감소 효과가 FGF21/gCS-PEG-Lf의 경구 투여에 의한 것임을 알 수 있었으며, FGF21/gCS-PEG-Lf을 투여하는 것이 제2형 당뇨병 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
9-3. FGF21/gCS-PEG-Lf 투여에 의한 혈중 FGF21과 인슐린 수준 확인
FGF21/gCS-PEG-Lf 경구투여 실험 종료 후 마우스에서 혈액을 채취하고, 혈장을 분리하여 FGF21과 인슐린 수준을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay)로 측정하였다.
그 결과, 도 14a에 나타난 바와 같이 HFD를 공급하지 않은 정상군(normal)에서는 FGF21 농도가 약 0.5 ng/㎖로 나타나고, 대조군(HFD Con)과 FGF21 단기 투여군은 정상군과 비교하여 높은 FGF21 농도를 나타내는 것을 알 수 있었다. 그러나 FGF21 장기 투여군은 나머지 실험군과 비교하여 혈중 FGF21 농도가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 14b에 나타난 바와 같이 혈중 인슐린 농도 또한 FGF21과 유사한 경향을 보였다. 정상군에서 가장 낮은 농도를 보였고, 대조군과 FGF21 단기 투여군이 더 높은 농도를 나타내었다. FGF21 장기 투여군에서 인슐린 농도가 가장 높은 것을 알 수 있었다.
FGF21 단기 투여군과 대조군의 결과가 유사한 것은 FGF21/gCS-PEG-Lf의 경구 투여 후 오랜 시간이 경과하면 FGF21 유전자가 제거(clearance)되기 때문인 것으로 생각된다.
본 실험을 통하여 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여함으로써 혈중 FGF21 단백질과 인슐린의 농도를 높일 수 있음을 확인할 수 있었다.
9-4. FGF21/gCS-PEG-Lf 투여에 의한 FGF21과 인슐린 발현 변화 확인
FGF21/gCS-PEG-Lf의 경구 투여 실험이 종료한 후 각 실험군의 마우스를 희생시켜 뇌, 십이지장, 공장, 회장, 심장, 신장, 간, 폐, 지라 및 췌장을 분리하였다. 실시예 5의 방법에 따라 분리한 장기로 면역조직화학 염색을 수행한 후 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 대조군에서는 FGF21(녹색)과 인슐린(적색)의 발현 수준이 매우 낮은 것을 알 수 있었고, FGF21 단기 투여군은 대조군과 유사한 결과를 나타내었다. 그러나 FGF21 장기 투여군에서는 FGF21과 인슐린의 발현 수준이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통하여 FGF21/gCS-PEG-Lf를 경구 투여함으로써 각 장기에서 FGF21 단백질과 인슐린의 발현을 유도할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. (a) 생체적합성 고분자; 및
    (b) 상기 생체적합성 고분자에 공유결합으로 연결된 페길화된 락토페린(pegylated lactoferrin)을 포함하는 유전자 전달용 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 글리콜 키토산(glycol chitosan), 폴리락틱산(poly lactic acid), 폴리락틱-코-글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid)), 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리-L-리신, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 유전자 전달용 복합체.
  3. 체내로 전달하고자 하는 목적 유전자 단편을 포함하는 벡터; 및
    제1항의 유전자 전달용 복합체를 포함하는 유전자 전달체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 목적 유전자 단편은 서열번호 1의 서열을 포함하는 것인 유전자 전달체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 벡터 및 유전자 전달용 복합체의 결합비가 1:2 내지 1:15인 것인 유전자 전달체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 경구로 투여되는 것인 유전자 전달체.
  7. 제3항의 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 서열번호 1의 서열을 포함하는 것인 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용인 것인 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제3항의 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 치료용 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 제2형 당뇨병 치료용 조성물은 경구 투여용인 것인, 제2형 당뇨병 치료방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 서열번호 1의 서열을 포함하는 것인, 제2형 당뇨병 치료방법.
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