WO2019066147A1 - O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 - Google Patents

O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 Download PDF

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박건욱
유종신
김진영
이주연
이현경
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한국기초과학지원연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing biological information for identification and relative quantification of O-linked glycopeptides using the results of high resolution mass spectrometry.
  • the glycosylation of proteins is divided into N-linked and O-linked glycosylation.
  • the glycation of the N-linked type occurs in the endoplasmic reticulum (ER) while the glycation of the O-linked type occurs in the ER, Golgi, or cytoplasm.
  • O-linked glycans are classified into non-mucin type and mucin type, and O-linked glycation occurring in mammals is mainly mucin type.
  • the mucin-type glycation begins by binding N-acetylgalactosamine (GalNAc) to serine or threonine, and is complex because it occurs directly by the enzyme without the aid of a precursor such as dolichol.
  • GalNAc N-acetylgalactosamine
  • mucin-type O-linked glycoproteins are mainly found in cytoplasm and nuclei.
  • O-linked glycosylation has not been well known since it has relatively fewer studies
  • glycoproteins Of the total glycoproteins, 12% glycoproteins contain O-linked types, of which 10% include both N-linked and O-linked. Therefore, the O-linked glycopeptide is relatively difficult to analyze because of its relatively low sensitivity due to the influence of the N-linked glycopeptide and the general peptide.
  • GlycReSoft A Software Package for Automated Recognition of Glycans from LC / MS Data, PLOS one, e45474.), and Protein Prospector (Robert J. Chalkley et al . , Use of a glycosylation site database to improve glycopeptide identification from complex mixtures, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2017, 409, 2, pp. 571-577) has been developed and used as an academy version.
  • the above-mentioned programs can not identify a new sugar chain that does not exist in the O-linked glycopeptide database in that only the sugar chain site or sugar chain structure existing in the database can be retrieved.
  • the programs can not simultaneously perform qualitative and quantitative analysis at one time, and do not support various fragmentation spectra of the high-resolution mass spectrometer.
  • the present inventors have solved the above problem and have found that the mass spectrometry can efficiently and accurately identify and quantify an O-linked glycopeptide having a relatively lower sensitivity (or concentration) than a general peptide or an N-linked glycopeptide
  • the analytical method was completed.
  • the isotope distribution of the glycopeptide obtained in the tandem mass spectrum (MS / MS) or the mass spectrum (MS) is compared with the above database or a new O-family search method is used, The present inventors confirmed that the O-linked glycopeptide can be accurately identified and the TIQ (top three isotope quantitation) calculated using ion chromatograms can be quantitatively analyzed without any labeling process, thereby completing the present invention Respectively.
  • the present invention provides a method for producing a protein, comprising: 1) obtaining a mass spectrum by analyzing a polypeptide obtained by hydrolyzing a glycoprotein in a sample with a high-resolution mass spectrometer; 2) converting the mass spectral results obtained in step 1) into MS and tandem spectra (MS / MS); 3)
  • the mass spectral to charge ratio (m / z) of the HCD-MS / MS individual spectral peak converted in step 2) is 126.05, 129.06, 138.06, 144.06, 145.05, 147.07, 163.06, 168.07, 186.08, 204.08, 274.09, Calculating M-scores in each tidal spectrum using oxonium ion peaks consisting of 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19, and 657.24; 4) determining a value for separating the glycopeptide and the peptide using the Gaus
  • the biological information processing assay method according to the present invention can efficiently and accurately analyze quantitative changes of O-linked glycated peptides having conventionally unknown sugar chains contained in various kinds of samples, and by using a high-resolution mass spectrometer,
  • the present invention can be useful for predicting or diagnosing a marker of a disease including cancer and the like or analyzing the structure of an O-linked glycopeptide of a glycoprotein drug.
  • Fig. 1 is a flow chart illustrating a biological information processing assay method for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention from analytical samples.
  • FIG. 2 is a diagram showing an M-score distribution diagram of a general peptide and a glycopeptide in a step 3) of the bioinformation processing analysis method for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the bioinformation treatment analysis method for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein, wherein the sugar peptide selected in step 4) is reacted with N-linked and O-linked glycopeptide O-connection type and N-connection type classification element.
  • FIG. 4 is a diagram showing a Y-score distribution diagram in step 7 of the bioinformation processing analysis method for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein.
  • FIG. 4 is a diagram showing a Y-score distribution diagram in step 7 of the bioinformation processing analysis method for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein.
  • FIG. 5 is a diagram showing an O-family search method in step 10 of the bioinformation processing analysis method for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein.
  • 6A and 6B are graphs showing that the spectral similarity in the O-family search method in the step 10) of the bioinformation processing analysis method for identifying and quantifying the O-linked glycopeptide according to the present invention using the standard glycoprotein is 0.97 to be.
  • FIG. 7 is a diagram showing a Y-score distribution diagram in step 11 of a bioinformation processing analysis method for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein.
  • FIGS. 8A and 8B are graphs showing the results of the bioinformation treatment analysis method for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein, T (HexNAc-Hex) PLPPT HexNAc-Hex) SAHGNVAEGETKPDPDVTER.
  • FIGS. 9A and 9B are graphs showing the results of the bioinformation treatment analysis method for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein.
  • Figure 2 is a representative EThcD spectrum.
  • 10A is a graph showing the result of repeating bioinformation processing analysis for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention three times using human serum samples in the examples.
  • FIG. 10B is a graph showing the result of repeating bioinformation processing analysis for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention three times using human serum samples in the examples.
  • FIG. 11A is a Venn diagram showing results of qualitative analysis of glycoprotein among bio-information processing analysis methods for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention using human serum samples in the examples.
  • FIG. 11B is a Venn diagram showing the result of qualitative analysis of an O-linked glycopeptide among bio-information processing analytical methods for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using human serum samples in the examples .
  • FIG. 12 is a graph showing the result of quantitative analysis of O-linked glycopeptide in a bio-information processing assay method for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using human serum samples in the examples .
  • FIG. 13A is a graph showing the results of a bioinformation processing analysis method for identification and quantification of an O-linked glycopeptide according to the present invention using a human serum sample in the Examples.
  • the selected O-linked glycopeptide TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER (HexNAc-Hex- (High energy collision dissociation) spectrum of Neu5Ac (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 13B is a graph showing the results of the bioinformation treatment analysis method for identifying and quantifying the O-linked glycopeptide according to the present invention using human serum samples in the Examples.
  • the selected O-linked glycopeptide TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER (HexNAc-Hex- Neu5Ac) (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 2 shows a representative collision-induced dissociation (CID) spectrum.
  • FIG. 13C is a graph showing the results of the bioinformation treatment analysis method for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention using human serum samples in the Examples.
  • the O-linked glycopeptide TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER HexNAc-Hex- (Electron Transfer Dissociation) spectrum of Neu5Ac (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 13d shows the results of the bioinformation treatment analysis method for identifying and quantifying the O-linked glycopeptide according to the present invention using the standard glycoprotein in the Examples.
  • the selected O-linked glycopeptide T (HexNAc-Hex- ≪ / RTI > Neu5Ac) PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER.
  • FIG. 13E is a graph showing the results of the bioinformation processing analysis method for identifying and quantifying the O-linked glycopeptide according to the present invention using the standard glycoprotein in the Examples.
  • the O-linked glycopeptide T (HexNAc-Hex- Neu5Ac) < / RTI > PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER.
  • 13f shows the results of the bioinformation treatment analysis method for identification and quantification of O-linked glycopeptide according to the present invention using a standard glycoprotein in the Examples.
  • Neu5Ac PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER spectra of EThcD (electron-transfer / higher-energy collision dissociation).
  • the present invention relates to: 1) obtaining a mass spectrum by analyzing a polypeptide obtained by hydrolyzing a glycoprotein in a sample with a high-resolution mass spectrometer; 2) converting the mass spectral results obtained in step 1) into MS and tandem spectra (MS / MS); 3)
  • the mass spectral to charge ratio (m / z) of the HCD-MS / MS individual spectral peak converted in step 2) is 126.05, 129.06, 138.06, 144.06, 145.05, 147.07, 163.06, 168.07, 186.08, 204.08, 274.09, Calculating M-scores in each tidal spectrum using oxonium ion peaks consisting of 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19, and 657.24; 4) determining a value for separating the glycopeptide and the peptide using the Gaussian fitting method in the M-score distribution calculated in the step
  • hydrolysis refers to the process of separating only sugars from a glycoprotein.
  • the hydrolysis may be carried out using any method well known in the art.
  • the hydrolysis can be carried out using a hydrolytic enzyme, which specifically includes trypsin, arginine C (Arg-C), aspartate N (Asp-N), glutamic acid C (Glu- , Lysine C (Lys-C), chymotrypsin, and proteinase K.
  • tandem spectrum refers to a spectrum that is selected and analyzed for ions of interest or relatively sensitive ions in the total mass spectrum (MS).
  • the tandem mass analysis can be performed by analyzing the mass of the tandem spectrum.
  • O-linked glycoproteins not present in the database can be screened using a root / seed O-family search method based on O-linked glycopeptides present in the database determined using the tandem spectrum.
  • the tidal spectrum may be a CID or HCD-MS / MS spectrum.
  • the assay method according to the present invention can be used for mass spectrometry in order to efficiently qualitatively and quantitatively analyze O-linked glycopeptides which are more complex than general peptides, have a high diversity and exist in a low concentration in a sample.
  • the O-linked glycopeptide can be identified using the M-score, S-score, Y-score and P-score of the result obtained from the mass spectrometer, and quantitative analysis of the identified glycopeptide can be performed.
  • the mass spectrometer may have a mass resolution of greater than 10,000 and a mass accuracy of less than or equal to 50 ppm.
  • the mass analyzer may be Orbitrap Fusion Lumos, Orbitrap Elite, or Q Exactive.
  • the M-score can efficiently classify the general peptide spectrum and the glycopeptide spectrum.
  • the M-score may be calculated by the following equation:
  • n is the number of peaks per confirmed
  • I mi is the matched i-th peak intensity
  • I max is the intensity of the base peak in the spectrum
  • the M-score distribution from the HCD-MS / MS spectra of the glyoprotein standard sample (hemopexin) can be shown (FIG. 2).
  • the above distribution map can classify general peptides and glycopeptides by automatically applying Gaussian fitting.
  • step 5 comprises determining the O-linked type and the N-linked sorting factor (GlcNac / GalNAc) in the selected glycopeptide spectrum using the M- The O-linked glycopeptide spectrum of 4.0 or less can be determined ( Figure 3).
  • the O-connection type and N-connection type classification element can be calculated by the following equation:
  • the S-score can be used to obtain the isotope distribution in the MS of the sugar peptide spectrum in step 6) and compare it to the theoretical database to identify the glycopeptide, Can be calculated by:
  • Y1 is the mass of the nth peak of the experimental isotope peaks
  • X2 is the relative intensity of the nth peak of the theoretical isotope peaks
  • Y2 is the relative intensity of the nth peak of the experimental isotope peaks
  • the similarity can be measured using the Pearson correlation analysis for the mass distribution of the isotope, the Euclidean distance and the intensity distribution.
  • a database is constructed using the theoretical isotope distribution of the glycopeptide from the glycoprotein, and then it can be used for identification and quantitative analysis of the O-linked glycopeptide.
  • isotopic means a chemical element having the same atomic number but different atomic weight.
  • the O-linked glycated peptide candidate or O-linked glycated peptide (FIG. 4) evaluated using the Y-score in the above steps 7) and 10) Can be calculated and evaluated in the tandem spectrum (CID or HCD) with a Y-score (Figs. 8 and 9).
  • the Y-score can be calculated by the following equation (3), which can be expressed by the sum of the HCD match and the CID match :
  • I mi is the matched i-th peak intensity
  • I si is the ith peak intensity in the spectrum
  • the P-score of step 8) or 11) above can be confirmed and evaluated in the tandem spectrum (ETD / EThcD) of the peptide fragmentation degree of the glycopeptide which can theoretically appear.
  • N number of peptide fragmentation (c, z ion) in the sugar peptide to be identified
  • n number of peptide fragments of the confirmed glycopeptide
  • I max is the intensity of the base peak in the spectrum
  • I mi is the matched ith peak intensity
  • step 8) or 11 can use the S-score in the spectra of MS, which is theoretically the strongest among the isotope peaks indicating the strength of the selected glycopeptide in the MS spectra, The intensity of the dog peak can be shown together.
  • an O-linked glycopeptide present in a database determined using the tandem spectrum of step 9) is used as a root / seed O-
  • the ligated glycopeptide can be selected (Fig. 5).
  • the selection can be calculated by the following equation (6), where spectral similarity (SS) can be used to find a similar spectrum, and the value can be 0.9 or more (FIG. 6):
  • S'i is the (x ', y') matrix, x 'is the nth relative peak intensity, and y' is the mass of the nth peak)
  • the inventors of the present invention found that the sugar peptide of a standard glycoprotein sample (hemopexin) was analyzed by using the HCD, CID and EThcD (electron-transfer / higher-energy collision dissociation) spectra obtained with Orbitrap, a high- Table 1 shows the results of performing the step up to step 8) before applying the search method (Table 1).
  • the present invention quantitatively analyzed O-linked glycated peptides present in a database that was qualitatively analyzed using a Y-score distribution chart of a standard glycoprotein sample (hemopexin), wherein quantitative analysis was performed using ion chromatography And the three-point TIQ values of the ion chromatograms.
  • the data points for calculating the TIQ are the sum of the peak intensities of three isotopes based on the strongest peaks.
  • O-linked glycopeptides not present in the database were selected using the O-family search method of step 9) (FIGS. 5 and 6).
  • the O-linked glycoproteins not present in the selected database were identified and quantitated as described above using the Y-score distribution (FIG. 7), and the results are shown in Table 2 (Table 2).
  • TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER (2HexNAc-2Hex) (SEQ ID NO: 1), which is an O-linked glycopeptide having the same molecular weight, A) T (HexNAc-Hex) PLPPT (HexNAc-Hex) SAHGNVAEGETKPDPDVTER or B) T (2HexNAc-2Hex) PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER (FIGS.
  • the method according to the present invention can be used to identify a correct O-linked glycopeptide in a standard glycoprotein sample and perform its quantitative analysis.
  • Such a method can be applied and applied to various studies related to glycoprotein analysis including biosimilars.
  • Human serum samples were purchased from Sigma Aldrich. The purchased serum sample was added with trypsin and hydrolyzed overnight at a temperature of 37 ° C. The hydrolyzed sample was prepared by concentration using a ZIC ® -HILIC column.
  • LC / ESI-MS / MS analysis was performed by linking the polypeptide contained in the sample prepared in Example 1 to Orbitrap Fusion lumos (Orbitrap Fusion TM), a high-resolution mass spectrometer. The assay was repeated three times to verify reproducible results.
  • Mass analysis result file (RAW) was converted into ms1 (MS) and ms2 (MS / MS) files using freeware program RAWConverter v1.1 (The Scripps Research Institute, USA).
  • RAWConverter v1.1 The Scripps Research Institute, USA.
  • the identification and quantitative analysis of O-linked glycopeptides in each mass spectrometric analysis was carried out using the bioinformation processing assay method for identification and quantification of O-linked glycopeptide, and the results are shown in FIGS. 10 to 13.
  • FIG. 10 the qualitative analysis results of the O-linked glycopeptide repeated three times using human serum samples using the method according to the present invention were confirmed (FIG. 10A), and the results were shown in a graph 10b). Also, as shown in FIG. 11, the results for the analyzed glycoprotein (FIG. 11A) or the O-linked glycopeptide (FIG. 11B) were confirmed by the Venn diagram. Further, as shown in FIG. 12, The result of quantitative analysis of the O-linked glycopeptide repeated three times using human serum samples was confirmed by heatmap (FIG. 12). Furthermore, as shown in FIG.

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Abstract

본 발명은 고분해능 질량 스펙트럼의 결과를 이용한 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 생물정보처리 분석 방법은 다양한 종류의 시료에 포함된 종래에 공지되지 않은 당쇄를 갖는 O-연결형 당펩티드의 양적 변화를 효율적이고 정확하게 분석할 수 있고, 고분해능 질량 분석기를 이용함으로써, 시료로부터 암 등을 포함하는 질병의 마커를 발견하여 예측 또는 진단하거나 당단백질 의약품의 O-연결형 당펩티드의 구조를 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법
본 발명은 고분해능 질량 스펙트럼의 결과를 이용한 O-연결형 당펩티드의 동정 및 상대적 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법에 관한 것이다.
인간의 혈액은 수많은 단백질들의 혼합체이며, 이중 50% 이상이 당단백질이다. 그러나, 당단백질은 당의 다양성과 복잡성때문에 단백체 분석에 비해 정성분석 또는 정량분석이 어렵다. 최근 고분해능 질량분석기의 도입으로 당이나 당단백질의 분석이 빠른 속도로 발전하고 있으나, 이와 같은 방법으로 분석된 결과를 이용하여 당단백질을 동정 및 정량할 수 있는 생물정보처리 기술이 미약하다.
단백질의 당화는 N-연결형과 O-연결형 당화로 구분된다. N-연결형의 당화는 소포체(ER)에서 일어나는 반면, O-연결형의 당화는 ER, 골지체 또는 세포질에서 일어난다. O-연결형 당화는 비-뮤신 타입(non-mucin type)과 뮤신 타입(mucin type)으로 분류되며, 포유류에서 발생하는 O-연결형 당화는 주로 뮤신 타입이다. 뮤신 타입의 당화는 주로 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이 세린 또는 트레오닌에 결합함으로써 시작되며, 돌리콜(dolichol)과 같은 전구체(precursor)의 도움 없이 바로 효소에 의해 일어나기 때문에 복잡하다. 또한, 뮤신 타입의 O-연결형 당단백질은 세포질이나 핵에서 주로 발견된다. 다만, O-연결형 당화는 N-연결형 당화에 비해 상대적으로 연구가 적어 아직까지 많이 알려져 있지 않다.
전체 당단백질 중에서 12%의 당단백질이 O-연결형을 포함하고 있고, 그중에서 10%는 N-연결형과 O-연결형을 모두 포함한다. 따라서, O-연결형 당펩티드는 N-연결형 당펩티드와 일반 펩티드의 영향에 의해 상대적으로 낮은 감도를 나타냄으로써 분석이 어렵다.
O-연결형 당펩티드를 정성 및 정량분석하는데 사용된 종래의 방법은 다음과 같은 한계가 있다. 첫째, O-연결형 당펩티드의 일반적인 기본 구조는 알려져 있으나, O-연결형 당펩티드가 매우 다양한 형태로 존재하기 때문에 새로운 O-연결형 당펩티드의 조성을 미리 알 수 없다. 따라서, 완전한 O-연결형 당펩티드에 대한 데이터베이스를 만드는데 어려움이 있다. 둘째, 동물에서는 O-연결형 당펩티드의 뮤신 타입이 가장 많이 발견되는데, 이는 상기 서술한 바와 같이 N-아세틸갈락토사민이 세린 또는 트레오닌의 산소원자에 결합하면서 시작된다. 그러나, 단백질을 구성하는 아미노산 서열에서 세린 및 트레오닌은 발견 빈도가 높아 분석하고자 하는 O-연결형 당펩티드에도 두개 이상의 O-연결형 당질화 사이트가 존재할 수 있다.
한편, 현재 질량 스펙트럼 또는 탄뎀 질량 스펙트럼을 이용하여 O-연결형 당펩티드를 검색하는 소프트웨어로는 SimGlycan(Arun Apte, Ningombam Sanjib Meitei, et al ., Bioinformatics in Glycomics: Glycan Characterization with Mass Spectrometric Data Using SimGlycan™, Springer Protocols, 2009, 269-281), Byonic(Bern, M. et al ., Current Protocols in Bioinformatics; Wiley: New York, 2012, Chapter 13, Unit 13.20)과 같은 상업용 소프트웨어가 있다. 뿐만 아니라, 프리웨어 소프트웨어로는 GlycoMID(Yanlin Zhang et al ., Identification of Glycopeptides with Multiple Hydroxylysine O-Glycosylation Sites by Tandem Mass Spectrometry, Journal of proteome research, 2015, 14, 5099-5108), SweetNET(Waqas Nasir et al ., SweetNET: A Bioinformatics Workflow for Glycopeptide MS/MS Spectral Analysis, Journal of proteome research, 2016, 15, 2826-2840), GPQuest(Shadi Toghi Eshghi et al ., Classification of Tandem Mass Spectra for Identification of N- and O-linked Glycopeptides, Scientific Reports, 2016, DOI: 10.1038/srep37189), GlycResoft(Evan Maxwell et al ., GlycReSoft: A Software Package for Automated Recognition of Glycans from LC/MS Data, PLOS one, 2012.7.9. e45474.), 및 Protein Prospector(Robert J. Chalkley et al ., Use of a glycosylation site database to improve glycopeptide identification from complex mixtures, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2017, 409, 2, pp.571-577) 등의 프로그램이 아카데미 버전으로 개발되어 사용되고 있다.
그러나, 상기와 같은 프로그램들은 데이터베이스 내에 존재하는 당쇄 사이트 또는 당쇄 구조만 검색할 수 있다는 점에서 O-연결형 당펩티드 데이터베이스에 존재하지 않는 새로운 당쇄는 확인할 수 없다. 또한, 상기 프로그램들은 한번에 정성 및 정량분석을 동시에 수행할 수 없고, 고분해능 질량 분석기의 다양한 조각화 스펙트럼을 지원하지 않는 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제를 해결하고, 질량 스펙트럼의 결과로부터 일반 펩티드나 N-연결형 당펩티드에 비해 상대적으로 감도(또는 농도)가 낮은 O-연결형 당펩티드를 효율적이고 정확하게 동정 및 정량할 수 있는 분석 방법을 완성하였다. 구체적으로, 일반적으로 잘 알려진 11종류의 O-연결형 당쇄구조(Essentials of Glycobiology, Second Edition: 1) HexNAc, 2) HexNAc-Neu5Ac, 3) 2HexNAc, 4) 2HexNAc-Neu5Ac, 5) 3HexNAc, 6) HexNAc-Hex, 7) HexNAc-Hex-Neu5Ac, 8) HexNAc-Hex-2Neu5Ac, 9) 2HexNAc-Hex, 10) 2HexNAc-2Hex, 11) 3HexNAc-1Hex)와 Uniprot 데이터베이스에 공지된 O-연결형 당쇄 위치를 데이터베이스에 저장하고, 저장된 O-연결형 당펩티드들의 이론적인 동위원소 분포를 모델링한 결과를 추가 데이터베이스화하였다. 한편, 탄뎀 질량 스펙트럼(MS/MS) 또는 질량 스펙트럼(MS)에서 수득된 당펩티드의 동위원소 분포를 상기 데이터베이스와 비교하거나 새로운 O-패밀리 검색(O-family search) 방법을 이용하여 당쇄 사이트나 구조에 제한없이 O-연결형 당펩티드를 정확히 동정하고, 이온 크로마토그램(ion chromatograms)을 이용하여 TIQ(top three isotope quantitation)을 계산함으로써 별다른 표지과정 없이 정량분석할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 질량 스펙트럼의 결과로부터 일반 펩티드에 비해 상대적으로 감도(또는 농도)가 낮은 O-연결형 당펩티드를 효율적으로 정확하게 동정 및 정량분석하기 위한 생물정보처리 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 1) 시료 내 당단백질을 가수분해하여 수득된 폴리펩티드를 고분해능 질량분석기로 분석하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 얻은 질량 스펙트럼 결과를 MS 및 탄뎀 스펙트럼(MS/MS)으로 변환하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 변환된 HCD-MS/MS 개별 스펙트럼 피크의 질량 대 전하비(m/z)가 126.05, 129.06, 138.06, 144.06, 145.05, 147.07, 163.06, 168.07, 186.08, 204.08, 274.09, 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19 및 657.24로 구성된 피크(Oxonium ion peaks)를 이용하여 각 탄뎀 스펙트럼에서 M-스코어를 계산하는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 계산된 M-스코어 분포도에서 가우시안 피팅 방법을 사용하여 당펩티드와 펩티드를 분리하는 값을 결정하고 당펩티드 스펙트럼을 선택하는 단계; 5) 상기 단계 4)에서 선택된 당펩티드 스펙트럼에서 O-연결형 및 N-연결형 분류 요소(O/N sorting factor)를 이용하여 O-연결형 당펩티드 스펙트럼을 선택하는 단계; 6) 상기 단계 5)에서 선택된 O-연결형 당펩티드 스펙트럼의 MS에서 동위원소 분포를 얻고, 이를 데이터베이스와 비교하여 계산된 S-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 결정하는 단계; 7) 상기 단계 6)에서 결정된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드로부터 탄뎀 스펙트럼에서의 Y-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 평가하는 단계; 8) 상기 단계 7)에서 평가된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드에 대하여 P-스코어를 계산하여 O-연결형 당 사이트를 결정하고, 평가된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드의 정량분석을 수행하는 단계; 9) 상기 단계 8)에서 정량분석된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 근거로(root/seed) O-패밀리 서치 방법을 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 선별하는 단계; 10) 상기 단계 9)에서 선별된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드로부터 탄뎀 스펙트럼의 Y-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 평가하는 단계; 11) 상기 단계 10)에서 평가된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드에 대하여 P-스코어를 계산하여 O-연결형 당 사이트를 결정하고, 평가된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드에 대하여 정량분석을 수행하는 단계를 포함하는 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 생물정보처리 분석 방법은 다양한 종류의 시료에 포함된 종래에 공지되지 않은 당쇄를 갖는 O-연결형 당펩티드의 양적 변화를 효율적이고 정확하게 분석할 수 있고, 고분해능 질량 분석기를 이용함으로써, 시료로부터 암 등을 포함하는 질병의 마커를 발견하여 예측 또는 진단하거나 당단백질 의약품의 O-연결형 당펩티드의 구조를 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 분석 시료로부터 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법을 도식화한 순서도이다.
도 2는 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 3)에서 일반 펩티드와 당펩티드의 M-스코어 분포도를 나타내는 도면이다.
도 3은 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 4)에서 선택된 당펩티드를 단계 5)에서 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드로 O-연결형 및 N-연결형 분류 요소로 분류한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 7)에서의 Y-스코어 분포도를 나타내는 도면이다.
도 5는 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 10)에서의 O-패밀리 서치 방법을 도식화한 도면이다.
도 6a 및 6b는 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 10)에서의 O-패밀리 서치 방법 중 스펙트럼 유사도가 0.97임을 확인한 결과 도면이다.
도 7은 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중 단계 11)에서의 Y-스코어 분포도를 나타내는 도면이다.
도 8a 및 8b는 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 T(HexNAc-Hex)PLPPT(HexNAc-Hex)SAHGNVAEGETKPDPDVTER의 대표적인 EThcD 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 9a 및 9b는 표준 당단백질을 이용한 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 T(2HexNAc-2Hex)PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER의 대표적인 EThcD 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 10a는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석을 3회 반복한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10b는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석을 3회 반복한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중, 당단백질의 정성분석 결과를 벤다이어그램으로 나타낸 도면이다.
도 11b는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중, O-연결형 당펩티드의 정성분석 결과를 벤다이어그램으로 나타낸 도면이다.
도 12는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법 중, O-연결형 당펩티드의 정량분석 결과를 히트 맵으로 나타낸 도면이다.
도 13a는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER(HexNAc-Hex-Neu5Ac)(서열번호 2)의 대표적인 HCD(high energy collision dissociation) 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 13b는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER(HexNAc-Hex-Neu5Ac)(서열번호 2)의 대표적인 CID(collision-induced dissociation) 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 13c는 실시예에서 인간 혈청 시료를 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER(HexNAc-Hex-Neu5Ac)(서열번호 2)의 대표적인 ETD(electron transfer dissociation) 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 13d는 실시예에서 표준 당단백질을 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 T(HexNAc-Hex-Neu5Ac)PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER의 대표적인 HCD 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 13e는 실시예에서 표준 당단백질을 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 T(HexNAc-Hex-Neu5Ac)PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER의 대표적인 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 13f는 실시예에서 표준 당단백질을 이용하여 본 발명에 따른 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법의 결과에 따라 선별된 O-연결형 당펩티드인 T(HexNAc-Hex-Neu5Ac)PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER의 대표적인 EThcD(electron-transfer/higher-energy collision dissociation) 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 시료 내 당단백질을 가수분해하여 수득된 폴리펩티드를 고분해능 질량분석기로 분석하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 얻은 질량 스펙트럼 결과를 MS 및 탄뎀 스펙트럼(MS/MS)으로 변환하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 변환된 HCD-MS/MS 개별 스펙트럼 피크의 질량 대 전하비(m/z)가 126.05, 129.06, 138.06, 144.06, 145.05, 147.07, 163.06, 168.07, 186.08, 204.08, 274.09, 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19 및 657.24로 구성된 피크(Oxonium ion peaks)를 이용하여 각 탄뎀 스펙트럼에서 M-스코어를 계산하는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 계산된 M-스코어 분포도에서 가우시안 피팅 방법을 사용하여 당펩티드와 펩티드를 분리하는 값을 결정하고 당펩티드 스펙트럼을 선택하는 단계; 5) 상기 단계 4)에서 선택된 당펩티드 스펙트럼에서 O-연결형 및 N-연결형 분류 요소(O/N sorting factor)를 이용하여 O-연결형 당펩티드 스펙트럼을 선택하는 단계; 6) 상기 단계 5)에서 선택된 O-연결형 당펩티드 스펙트럼의 MS에서 동위원소 분포를 얻고, 이를 데이터베이스와 비교하여 계산된 S-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 결정하는 단계; 7) 상기 단계 6)에서 결정된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드로부터 탄뎀 스펙트럼에서의 Y-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 평가하는 단계; 8) 상기 단계 7)에서 평가된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드에 대하여 P-스코어를 계산하여 O-연결형 당 사이트를 결정하고, 평가된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드의 정량분석을 수행하는 단계; 9) 상기 단계 8)에서 정량분석된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 근거로(root/seed) O-패밀리 서치 방법을 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 선별하는 단계; 10) 상기 단계 9)에서 선별된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드로부터 탄뎀 스펙트럼의 Y-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 평가하는 단계; 11) 상기 단계 10)에서 평가된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드에 대하여 P-스코어를 계산하여 O-연결형 당 사이트를 결정하고, 평가된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드에 대하여 정량분석을 수행하는 단계를 포함하는 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "가수분해"는 당단백질로부터 당만을 분리하는 과정을 의미한다. 상기 가수분해 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법이라면 어떠한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 상기 가수분해는 가수분해 효소를 사용하여 수행될 수 있고, 이는 구체적으로, 트립신(trypsin), 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(chymotrypsin) 및 프로테나아제 K(proteinase K)로 구성된 군으로부터 선택된 효소로 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "탄뎀 스펙트럼(MS/MS)"은 전체 질량 스펙트럼(MS) 중에서 관심있는 이온 또는 상대적으로 감도가 높은 이온들을 선택하여 분석한 스펙트럼을 의미한다. 상기 탄뎀 스펙트럼의 질량을 분석하여 탄뎀 질량분석을 수행할 수 있다. 탄뎀 스펙트럼을 이용하여 결정된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 근거로(root/seed) O-패밀리 서치 방법을 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 선별할 수 있다. 상기 탄뎀 스펙트럼은 CID 또는 HCD-MS/MS 스펙트럼일 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법은 일반 펩티드에 비해 복잡하고, 다양성이 높으며 시료 내에 낮은 농도로 존재하는 O-연결형 당펩티드를 효율적으로 정성 및 정량분석하기 위해 질량분석기를 이용할 수 있다. 상기 질량분석기로부터 수득된 결과를 M-스코어, S-스코어, Y-스코어 및 P-스코어를 이용하여 O-연결형 당펩티드를 동정하고, 동정된 당펩티드의 정량분석을 수행할 수 있다. 상기 질량분석기는 10,000 이상의 질량 분해능을 갖고, 50 ppm 이하의 질량 정확도를 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 질량분석기는 Orbitrap Fusion Lumos, Orbitrap Elite 또는 Q Exactive일 수 있다.
상기 M-스코어는 일반 펩티드 스펙트럼 및 당펩티드 스펙트럼을 효율적으로 분류할 수 있다. 상기 M-스코어는 하기 수학식 1에 의해 계산될 수 있다:
[수학식 1]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000001
(N은 확인할 수 있는 당피크 수,
n은 확인한 당피크 수,
Imi는 매치된 i번째 피크 강도,
Imax는 스펙트럼에서 염기 피크의 강도, 및
C는 상수 값).
상기 방법에 따라 당단백질 표준시료(hemopexin)의 HCD-MS/MS 스펙트라로부터 M-스코어 분포도를 나타낼 수 있다(도 2). 상기 분포도는 가우시안 피팅을 자동으로 적용함으로써 일반 펩티드 및 당펩티드를 분류할 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법에서, 단계 5)는 단계 4)에서 M-스코어 분포도를 이용하여 선택된 당펩티드 스펙트럼에서 O-연결형 및 N-연결형 분류 요소(O/N sorting factor)(GlcNac/GalNAc)가 4.0 이하인 O-연결형 당펩티드 스펙트럼을 결정할 수 있다(도 3). 이때, O-연결형 및 N-연결형 분류 요소는 하기 수학식 5에 의해 계산될 수 있다:
[수학식 5]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000002
본 발명에 따른 분석 방법에서, S-스코어는 단계 6)에서 당펩티드 스펙트럼의 MS에서 동위원소 분포를 얻고, 이를 이론적인 데이터베이스와 비교하여 당펩티드를 동정하는데 사용될 수 있고, 이는 하기 수학식 2에 의해 계산될 수 있다:
[수학식 2]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000003
(X1은 이론적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 질량,
Y1은 실험적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 질량,
X2는 이론적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 상대적인 강도,
Y2는 실험적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 상대적인 강도,
C1 및 C2는 상수값).
상기 S-스코어를 계산할 때 동위원소의 질량 분포가 유클리드 거리 및 강도 분포를 피어슨 상관 분석을 이용하여 유사도를 측정할 수 있다. 또한, 상기 단계 6)에서 당단백질로부터 당펩티드의 이론적인 동위원소 분포를 이용하여 데이터베이스를 구축한 다음, 이를 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량 분석에 이용할 수 있다. 상기 용어, "동위원소(isotopic)"는 원자 번호는 같으나 원자량이 다른 화학원소를 의미한다.
본 발명에 따른 분석 방법에서, 상기 단계 7) 및 10)에서 Y-스코어를 이용하여 평가된 O-연결형 당펩티드 후보 또는 O-연결형 당펩티드(도 4)는 O-패밀리 서치 방법을 이용하여 이론적으로 나타낼 수 있는 당펩티드 단편화의 정도를 탄뎀 스펙트럼(CID 또는 HCD)에서 Y-스코어로 계산 및 평가할 수 있다(도 8 및 9). 이때, 상기 Y-스코어는 하기 수학식 3에 의해 계산될 수 있고, 이는 HCDmatch 및 CIDmatch의 합으로 나타낼 수 있다:
[수학식 3]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000004
(Imax는 스펙트럼에서 염기 피크의 강도,
Imi는 매치된 i번째 피크 강도,
Isi는 스펙트럼에서 i번째 피크 강도, 및
C1 및 C2는 상수값).
본 발명에 따른 분석 방법에서, 상기 단계 8) 또는 11)의 P-스코어는 이론적으로 나타날 수 있는 당펩티드의 펩티드 단편화 정도를 탄뎀 스펙트럼(ETD/EThcD)에서 확인 및 평가할 수 있다. 상기 P-스코어는 당화된 사이트 위치를 지정하는데 사용될 수 있고, 이는 하기 수학식 4에 의해 계산될 수 있다:
[수학식 4]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000005
(N: 확인할 수 있는 당펩티드에서 펩티드 단편화(c,z 이온) 수,
n: 확인 한 당펩티드의 펩티드 단편화 수
Imax는 스펙트럼에서 염기 피크의 강도, 및
Imi는 매치된 i번째 피크 강도).
상기 방법에서, 단계 8) 또는 11)의 정량분석은 MS의 스펙트라에서 S-스코어를 이용할 수 있고, 이는 MS의 스펙트라에서 선택된 당펩티드의 강도를 나타내는 동위원소 피크 중에 이론적으로 가장 강도가 강한 것부터 3개 피크의 강도를 합쳐서 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법에서, 단계 9)의 탄뎀 스펙트럼을 이용하여 결정된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 근거로(root/seed) O-패밀리 서치 방법을 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 선별할 수 있다(도 5). 이때, 상기 선별은 하기 수학식 6에 의해 계산될 수 있고, 이때, 스펙트럼 유사도(spectral similarity, SS)는 유사한 스펙트럼을 찾기 위해 사용될 수 있고, 그 값은 0.9 이상일 수 있다(도 6):
[수학식 6]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000006
(SS: 서로 다른 두 개의 탄뎀 질량분석 스펙트럼 피크와 질량의 유사도,
Si: (x,y) 매트릭스이며, x는 n번째의 상대적인 피크 강도, y는 n번째의 피크의 질량, 및
S'i: (x',y') 매트릭스이며, x'은 n번째의 상대적인 피크 강도, y'은 n번재의 피크의 질량)
본 발명자들은 표준 당단백질 시료(hemopexin)의 당펩티드를 고분해능 질량분석기인 Orbitrap으로 수득한 HCD, CID 및 EThcD(electron-transfer/higher-energy collision dissociation) 스펙트럼을 이용하여 본 발명의 방법에서 O-패밀리 서치 방법을 적용하기 전인 단계 8)까지 수행한 결과를 하기 표 1에 나타내었다(표 1).
Figure PCTKR2017014856-appb-T000001
이때, 본 발명들은 표준 당단백질 시료(hemopexin)의 Y-스코어 분포도를 이용하여 정성분석된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드의 정량분석을 수행하였고, 이때 정량분석은 각각의 당펩티드의 이온 크로마토그램(ion chromatograms)의 3 포인트 TIQ 값의 합으로 계산하였다. TIQ를 계산하기 위한 각 포인트(data point)는 가장 강도가 강한 피크를 기준으로 3개 동위원소의 피크 강도를 합한 값으로 나타내었다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서 단계 9)의 O-패밀리 서치 방법을 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 선별하였다(도 5 및 6). 상기 선별된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드는 Y-스코어 분포를 이용하여 상기와 같이 동정 및 정량 분석을 수행하였고(도 7), 그 결과를 표 2에 나타내었다(표 2).
Figure PCTKR2017014856-appb-T000002
상기 결과는 참조 문헌[Miloslav Sanda, et al ., Increased sialylation of site specific O-glycoforms of hemopexin in liver disease. Clin Proteom, 2016, 13:24]과 유사한 정성 및 정량 분포를 나타내었다. 표준 당단백질 시료(hemopexin)을 이용하여 분석한 결과, 분자량이 같은 O-연결형 당펩티드인 TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER(2HexNAc-2Hex)(서열번호 1)가 서로 다른 O-당질화 사이트에 다른 형태로 당쇄가 결합된 A) T(HexNAc-Hex)PLPPT(HexNAc-Hex)SAHGNVAEGETKPDPDVTER 또는 B) T(2HexNAc-2Hex)PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER 형태임을 확인하였다(도 8 및 9).
결론적으로, 상기로부터 본 발명에 따른 방법은 표준 당단백질 시료에서 정확한 O-연결형 당펩티드를 동정하고, 이의 정량분석을 수행하는데 사용될 수 있음을 알 수 있다. 이와 같은 방법은 바이오시밀러를 포함하는 당단백질 분석과 관련된 다양한 연구에 응용 및 적용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 혈청 시료의 제조
인간 혈청 시료는 시그마 알더리치로부터 구입하였다. 구입한 혈청 시료에 트립신을 첨가하여 37℃의 온도하에서 하룻밤 동안(overnight) 가수분해시켰다. 가수분해된 시료를 ZIC®-HILIC 컬럼을 사용하여 농축하여 준비하였다.
실시예 2. O-연결형 당펩티드의 정성 및 정량 분석
실시예 1에서 준비된 시료 내에 포함되는 폴리펩티드를 고분해능 질량분석기인 Orbitrap Fusion lumos(Orbitrap Fusion™)에 연결하여 LC/ESI-MS/MS 분석을 수행하였다. 상기 분석은 재현성 있는 결과를 검정하기 위해 3회 반복 수행하였다. 질량분석 결과 파일(RAW)을 프리웨어 프로그램인 RAWConverter v1.1(The Scripps Research Institute, 미국)을 이용하여 ms1(MS), ms2(MS/MS) 파일로 변환하였다. O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법을 이용하여 각 질량 분석 결과에서 O-연결형 당펩티드들의 동정 및 정량 분석을 수행하고, 그 결과를 도 10 내지 13에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 인간 혈청 시료를 이용하여 3회 반복한 O-연결형 당펩티드의 정성 분석 결과를 확인하고(도 10a), 그 결과를 그래프로 나타내었다(도 10b). 또한, 도 11에 나타난 바와 같이, 분석된 당단백질(도 11a) 또는 O-연결형 당펩티드(도 11b)에 대한 결과를 벤다이어그램으로 확인하였다, 또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 인간 혈청 시료를 이용하여 3회 반복한 O-연결형 당펩티드의 정량 분석 결과를 히트맵으로 확인하였다(도 12). 나아가, 도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 분석된 인간 혈청 시료의 대표적인 O-연결형 당펩티드가 표준 단백질 시료의 대표적인 O-연결형 당펩티드인 T(HexNAc-Hex-Neu5Ac)PLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER와 HCD, CID 및 ETD 스펙트럼이 유사함을 확인하였다(도 13).

Claims (14)

1) 시료 내 당단백질을 가수분해하여 수득된 폴리펩티드를 고분해능 질량분석기로 분석하여 질량 스펙트럼을 얻는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 얻은 질량 스펙트럼 결과를 MS 및 탄뎀 스펙트럼(MS/MS)으로 변환하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 변환된 HCD-MS/MS 개별 스펙트럼 피크의 질량 대 전하비(m/z)가 126.05, 129.06, 138.06, 144.06, 145.05, 147.07, 163.06, 168.07, 186.08, 204.08, 274.09, 292.10, 350.15, 366.14, 454.16, 528.19 및 657.24로 구성된 피크(Oxonium ion peaks)를 이용하여 각 탄뎀 스펙트럼에서 M-스코어를 계산하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 계산된 M-스코어 분포도에서 가우시안 피팅 방법을 사용하여 당펩티드와 펩티드를 분리하는 값을 결정하고 당펩티드 스펙트럼을 선택하는 단계;
5) 상기 단계 4)에서 선택된 당펩티드 스펙트럼에서 O-연결형 및 N-연결형 분류 요소(O/N sorting factor)를 이용하여 O-연결형 당펩티드 스펙트럼을 선택하는 단계;
6) 상기 단계 5)에서 선택된 O-연결형 당펩티드 스펙트럼의 MS에서 동위원소 분포를 얻고, 이를 데이터베이스와 비교하여 계산된 S-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 결정하는 단계;
7) 상기 단계 6)에서 결정된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드로부터 탄뎀 스펙트럼에서의 Y-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 평가하는 단계;
8) 상기 단계 7)에서 평가된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드에 대하여 P-스코어를 계산하여 O-연결형 당 사이트를 결정하고, 평가된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드의 정량분석을 수행하는 단계;
9) 상기 단계 8)에서 정량분석된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 근거로(root/seed) O-패밀리 서치 방법을 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 선별하는 단계;
10) 상기 단계 9)에서 선별된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드로부터 탄뎀 스펙트럼의 Y-스코어를 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 평가하는 단계;
11) 상기 단계 10)에서 평가된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드에 대하여 P-스코어를 계산하여 O-연결형 당 사이트를 결정하고, 평가된 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드에 대하여 정량분석을 수행하는 단계를 포함하는 O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 탄뎀 스펙트럼이 CID 또는 HCD-MS/MS 스펙트럼이고, M-스코어가 하기 수학식 1에 의해 계산되는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법:
[수학식 1]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000007
(N은 확인할 수 있는 당피크 수,
n은 확인한 당피크 수,
Imi는 매치된 i번째 피크 강도,
Imax는 스펙트럼에서 염기 피크의 강도, 및
C는 상수 값).
제1항에 있어서, S-스코어가 하기 수학식 2에 의해 계산되는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법:
[수학식 2]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000008
(X1은 이론적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 질량,
Y1은 실험적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 질량,
X2는 이론적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 상대적인 강도,
Y2는 실험적인 동위원소 피크들 중 n번째 피크의 상대적인 강도,
C1 및 C2는 상수값).
제3항에 있어서, S-스코어를 계산할 때 동위원소의 질량 분포가 유클리드 거리 및 강도 분포를 피어슨 상관 분석을 이용하여 유사도를 측정하는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 6)에서 당단백질로부터 당펩티드의 이론적인 동위원소 분포를 이용하여 데이터베이스를 구축한 다음, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량 분석에 이용하는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 7) 또는 10)의 탄뎀 스펙트럼이 CID 또는 HCD-MS/MS 스펙트럼이고, Y-스코어가 하기 수학식 3에 의해 계산되는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법:
[수학식 3]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000009
(Imax는 스펙트럼에서 염기 피크의 강도,
Imi는 매치된 i번째 피크 강도,
Isi는 스펙트럼에서 i번째 피크 강도, 및
C1 및 C2는 상수값).
제1항에 있어서, 상기 단계 8) 또는 11)의 탄뎀 스펙트럼이 CID 또는 HCD-MS/MS 스펙트럼이고, P-스코어가 하기 수학식 4에 의해 계산되는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법:
[수학식 4]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000010
(N: 확인할 수 있는 당펩티드에서 펩티드 단편화(c,z 이온) 수,
n: 확인 한 당펩티드의 펩티드 단편화 수
Imax는 스펙트럼에서 염기 피크의 강도, 및
Imi는 매치된 i번째 피크 강도).
제1항에 있어서, 탄뎀 스펙트럼을 이용하여 결정된 데이터베이스에 존재하는 O-연결형 당펩티드를 근거로(root/seed) O-패밀리 서치 방법을 이용하여 데이터베이스에 존재하지 않는 O-연결형 당펩티드를 선별하는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제8항에 있어서, 상기 선별이 하기 수학식 6에 의해 계산되는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법:
[수학식 6]
Figure PCTKR2017014856-appb-I000011
(SS: 서로 다른 두 개의 탄뎀 질량분석 스펙트럼 피크와 질량의 유사도,
Si: (x,y) 매트릭스이며, x는 n번째의 상대적인 피크 강도, y는 n번째의 피크의 질량, 및
S'i: (x',y') 매트릭스이며, x'은 n번째의 상대적인 피크 강도, y'은 n번재의 피크의 질량)
제1항에 있어서, 상기 가수분해가 트립신(trypsin), 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(chymotrypsin) 및 프로테나아제 K(proteinase K)로 구성된 군으로부터 선택된 효소로 수행되는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 질량분석기가 10,000 이상의 질량 분해능을 갖고, 50 ppm 이하의 질량 정확도를 갖는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제9항에 있어서, 상기 질량분석기가 Orbitrap Fusion Lumos, Orbitrap Elite 또는 Q Exactive인, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 8) 또는 11)에서 정량 분석이 MS의 스펙트라에서 S-스코어를 이용하는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 8) 또는 11)에서 정량 분석이 MS의 스펙트라에서 선택된 당펩티드의 강도를 나타내는 동위원소 피크 중에 이론적으로 가장 강도가 강한 것부터 3개 피크의 강도를 합쳐서 나타내는, O-연결형 당펩티드의 동정 및 정량을 위한 생물정보처리 분석 방법.
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