WO2019050350A2 - 줄기세포 유래 세르톨리유사세포, 그 제조방법, 및 그의 용도 - Google Patents

줄기세포 유래 세르톨리유사세포, 그 제조방법, 및 그의 용도 Download PDF

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    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Definitions

  • the present invention relates to stem cell-derived Sertoli-like cells (SLCs), a method for producing the same, and uses thereof.
  • SLCs stem cell-derived Sertoli-like cells
  • Cellular therapies can be used to treat, treat, or prevent diseases such as autologous, allogenic, xenogenic cells in vitro or in vitro, to alter cell biological properties, Diagnosis, and prevention.
  • Cell therapy can be classified into somatic cell therapy and stem cell therapy depending on the type and degree of differentiation of the cells used.
  • Stem cell therapy can be classified into embryonic stem cell therapy and adult stem cell therapy.
  • Stem cell therapy has attracted attention as an ideal reason for using stem cells with autogenous and pluripotent stem cells to help regenerate damaged cells to treat and ameliorate disease.
  • research on stem cells has difficulties in terms of ethical problems and securing the desired number of cells.
  • embryonic stem cells have superior performance compared to adult stem cells, there is a negative part in terms of bioethics. In the case of adult stem cells, harvesting and separation of stem cells involves pain in donors, Is low.
  • Sertoli Cell is a cell that exists in male testes and forms a tight junction to form an immunoprivileged site.
  • Sertoli Cell (SC) Secretes a substance that regulates the function of the cell, and has immunocompetent character and anti-inflammatory function itself, and thus can be used as a cell therapy agent.
  • it is very difficult to obtain the number of cells through in vitro culture because the characteristics of the Sertoli cells are not proliferative after puberty. Therefore, it has been recently proposed to obtain Sertoli cells using pre-differentiating stem cells, A small number of researchers have been working on securing Tolly cells, but they have not achieved any results.
  • One aspect provides a method for producing Sertoli-like cells in stem cells.
  • Another aspect provides a composition for the differentiation of stem cells into Sertoli-like cells.
  • Another aspect provides a celluloid-like cell produced by the method.
  • Another aspect provides a cell therapy agent for treating an autoimmune disease comprising the cellulolytic cell produced by the above method.
  • One aspect of the present invention is to provide a method for producing stem cells in a medium containing a Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK-3) inhibitor, a base fibroblast growth factor (bFGF), and retinoic acid (RA) To induce differentiation into intermediate mesoderm (IM); And bFGF, Fibroblast Growth Factor 9 (FGF9), Prostaglandin D2: PDG2, Follicle-Stimulating Hormone (FSH), and Glial cell Derived Neurotrophic Factor: GDNF) to induce differentiation into Sertoli-Like Cells (SLCs) by culturing the induced IMs in a medium comprising the same.
  • GSK-3 Glycogen Synthase Kinase 3
  • bFGF base fibroblast growth factor
  • RA retinoic acid
  • IM intermediate mesoderm
  • FGF9 Fibroblast Growth Factor 9
  • FSH Follicle-Stimulating Hormon
  • the term " stem cell” means a totipotent cell capable of differentiating into all kinds of cells or a pluripotent cell capable of differentiating into various types of cells.
  • Stem cells can be differentiated into cells of a specific tissue as undifferentiated cells.
  • the stem cell may be an embryonic stem cell (ESC), an adult stem cell, or an induced pluripotent stem cell (iPSC).
  • the embryonic stem cells are obtained by extracting the inner cell mass from the blastocyst embryo immediately before embryo implantation into the uterus of the mother and culturing it in vitro.
  • the adult stem cells are undifferentiated cells in which only a small amount exists in each tissue of the body, and refer to dead cells or cells replacing damaged tissues.
  • the induced pluripotent stem cell refers to a cell that induces pluripotency, such as embryonic stem cells, by injecting a cell differentiation-related gene into a differentiated somatic cell and returning it to a pre-differentiation cell stage.
  • the embryonic stem cell may be, for example, a mouse embryonic stem cell.
  • Sertoli-like Cell refers to a cell that expresses a Sertoli cell marker and has the characteristics of a Sertoli cell.
  • Sertoli cells are cells that are present in male testes, and play a role in regulating the maintenance and function of germ cells.
  • the Sertoli cell marker may be Wt1, Sox9, Sf1, Gata4, Fshr, Scf, or a combination thereof.
  • differentiation collectively refers to the process of changing structure and morphology from stem cells to specific cells. Specifically, a single cell called fertilized egg modified by sperm and egg divides into several identical-shaped cells through cleavage at the beginning. Each cell is then transformed into a specialized structure composed of various tissues and organs through cleavage and growth. Cells with these specialized structures carry out their respective functions. This is the process of changing the structure and shape to perform each function.
  • the differentiation may include spontaneous differentiation and induction differentiation.
  • the method comprises culturing stem cells in a medium comprising a GSK-3 inhibitor, bFGF, and RA to induce differentiation into IM.
  • the step of inducing differentiation into IM comprises the steps of: (a) culturing stem cells in a medium comprising a GSK-3 inhibitor; And (b) adding and further culturing the bFGF and RA to the medium.
  • the incubation period of step (a) may be about 1 day to about 3 days, specifically about 2 days, and the incubation period of step (b) may be about 2 days to about 5 days, have. If the incubation period exceeds the above number of days, it can be replaced with fresh medium.
  • the medium of step (a) may further comprise L-glutamine, an antibiotic, or a combination thereof.
  • the antibiotic may be, for example, penicillin / streptomycin, but is not limited thereto.
  • the method comprises culturing the induced IM in a medium comprising bFGF, FGF9, PDG2, FSH, and GDNF to induce differentiation into SLC.
  • the incubation period for inducing differentiation into the SLC may be from about 5 days to about 7 days, specifically about 6 days.
  • the concentration of the GSK-3 inhibitor may be from about 1 ⁇ M to about 10 ⁇ M, specifically about 1 ⁇ M, about 3 ⁇ M, about 5 ⁇ M, about 7 ⁇ M, or about 10 ⁇ M.
  • the concentration of bFGF is about 50 ng / ml to about 200 ng / ml, specifically about 50 ng / ml, about 75 ng / ml, about 100 ng / ml, about 150 ng / ml, Lt; / RTI >
  • the concentration of the RA may be from about 0.5 ⁇ M to about 1.5 ⁇ M, specifically about 0.5 ⁇ M, about 1.0 ⁇ M, or about 1.5 ⁇ M.
  • the concentration of FGF9 is about 50 ng / ml to about 200 ng / ml, specifically about 50 ng / ml, about 75 ng / ml, about 100 ng / ml, about 150 ng / ml, Lt; / RTI >
  • the concentration of PDG2 is about 250 ng / ml to about 750 ng / ml, specifically about 250 ng / ml, about 300 ng / ml, about 400 ng / ml, about 500 ng / About 700 ng / ml, or about 750 ng / ml.
  • the concentration of FSH may be from about 5 ng / ml to about 15 ng / ml, specifically about 5 ng / ml, about 10 ng / ml, or about 15 ng / ml.
  • the concentration of GDNF may be from about 5 ng / ml to about 15 ng / ml, specifically about 5 ng / ml, about 10 ng / ml, or about 15 ng / ml.
  • the IM may express PAX2, LHX1, or a combination thereof.
  • Glycogen Synthase Kinase 3 means a small molecule capable of causing a change in the Wnt signaling pathway.
  • the method can induce stem cells, in particular embryonic stem cells, into mesodermal stem cells by culturing the stem cells in a medium containing a GSK-3 inhibitor.
  • the GSK-3 inhibitor may be commercially available, synthesized, or isolated from an organism.
  • the GSK-3 inhibitors include, but are not limited to, CHIR99021 (CT99021, CAS 252917-06-9).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Retinoic acid refers to the metabolite of vitamin A (retinol). Lennitic acid can act as a molecule for intercellular signaling.
  • prostaglandin D2 is a prostaglandin that binds to the receptors PTGDR (DP1), and CRTH2 (DP2). Mammalian organs can be found in large numbers in brain and mast cells.
  • FSH Follicle-Stimulating Hormone
  • Glial cell Derived Neurotrophic Factor is a protein encoded by the GDNF gene and may be involved in the survival of many types of neurons.
  • the medium used in the step of inducing differentiation includes, without limitation, conventional media that can be used for culturing stem cells. Specifically, it may include DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium), RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 medium) and the like.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Keratinocyte-SFM Keratinocyte serum free medium
  • RPMI 1640 medium Roswell Park Memorial Institute 1640 medium
  • the medium may be supplemented with an additive.
  • an additive E. G., Serum, e. G., FBS, serum replacement, albumin, or essential amino acids and non-essential amino acids such as glutamine
  • lipid fatty acid, cholesterol, serum HDL or LDL extract
  • other components found in most types of storage medium of this kind (such as insulin or transferrin, nucleoside or nucleotide, pyruvate, G., Glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and / or reducing agents such as? -Mercaptoethanol).
  • the medium may include insulin-transferrin-selenium (ITS).
  • the method may further comprise separating or purifying the derived SLC.
  • the separation or purification refers to separation, sorting, or purification.
  • Methods for separation or purification may include, without limitation, any method capable of dividing a cell according to a specific standard in the art. Specifically, it may include Magnetic-activated cell sorting (MACS), Fluorescence-activated cell sorting (FACS), or chromatography.
  • the separation or purification may be to separate or purify cells that are positive for the Sertoli cell marker.
  • positive may refer to a cell marker (marker) that is present in greater amounts or at a higher concentration when compared to other cells on which the marker is based. It may also mean that the cell has a label at a value greater than the background value, for example, as much as a signal from a cell-measuring device.
  • Sertoli cells which are present in male testes and are not proliferated after puberty and thus can not be mass-produced through in vitro culture, are derived from embryonic stem cells having infinite growth ability, It is possible.
  • Another aspect is a composition for inducing the differentiation of stem cells into IM comprising GSK-3 inhibitor, bFGF, and RA; And a composition for inducing the differentiation of IM into SLC comprising bFGF, FGF9, PDG2, FSH, and GDNF, for the differentiation of stem cells into SLC.
  • the composition may be a medium for cell culture.
  • the composition may further comprise L-glutamine, an antibiotic, Insulin-Transferrin-Selenium (ITS), or a combination thereof.
  • Insulin is a peptide hormone secreted from beta cells of the islet of Langerhans.
  • Transferrin is a type of ⁇ globulin that binds to two molecules of trivalent iron ions absorbed in the serum to transport iron required for cell proliferation and hemoglobin production into iron-transporting proteins via the transferrin receptor.
  • Selenium is a trace mineral that is essential for many functions in the body and is an antioxidant.
  • Another aspect provides a Sertoli-like cell (SLC) produced by the method.
  • SLC Sertoli-like cell
  • Sertoli-like cells can be obtained in vitro or in vivo by differentiating them from stem cells. That is, the Sertoli-like cell may be derived from a stem cell.
  • the Sertoli-like cell may express a Sertoli cell marker.
  • the Sertoli cell marker may comprise Wt1, Sox9, Sf1, Gata4, Fshr, Scf, or a combination thereof.
  • the Sertoli-like cells may not express Oct4 as a pre-multipoint marker.
  • the Sertoli-like cells exhibit characteristics similar to mature or immature Sertoli cells expressing Sertoli cell markers.
  • the Sertoli-like cells may form a tube-like structure during incubation.
  • the Sertoli-like cells can form cell aggregates and form tube-like structures when cultured in a medium on a protein complex (e.g., Matrigel).
  • the Sertoli cells can produce a uniform hexagonal alignment.
  • Sertoli-like cells exhibit a high phagocytic activity activity like Sertoli cells.
  • Sertoli-like cells can be maintained in the basal part of the tubules or testes, such as Sertoli cells.
  • the Sertoli-like cell expresses an immunomodulation-related gene.
  • the Sertoli-like cell may have superior immunoregulatory ability and immunity privilege as compared to other cells.
  • Sertoli-like cells do not form carcinogenic effects or teratomas since they do not proliferate after the differentiation as Sertoli cells.
  • the above-mentioned Sertoli-like cells are capable of avoiding autoimmune and immune rejection due to their immunosuppressive function and anti-inflammatory function, and can be mass-cultured because they are derived from stem cells. Therefore, For example, in the treatment of autoimmune diseases.
  • Another aspect provides a cell therapy agent or pharmaceutical composition for treating an autoimmune disease comprising the cellulolytic cell produced by the above method.
  • Yet another aspect provides the use of said Sertoli-like cells for use in the manufacture of a cell therapy, pharmaceutical composition or formulation.
  • Another aspect relates to the use of said Sertoli-like cells, cell populations or cultures thereof, lysates, or extracts for use in the manufacture of a medicament for use in the treatment or prevention of diseases, e. to provide.
  • another aspect provides a method for treating diseases, such as autoimmune diseases, comprising administering to a subject in need thereof an effective ingredient of said Sertoli-like cell, a population thereof, or a culture, lysate, ≪ / RTI >
  • cellular therapeutic agent is a pharmaceutical (US FDA regulation) used for therapeutic, diagnostic and prophylactic purposes with cells and tissues prepared by isolation, cultivation and special manipulation from an individual, Diagnosis, and prevention through a series of actions, such as proliferating, differentiating, or otherwise altering the biological characteristics of a cell, in vitro, in vitro or in vivo.
  • treatment means any action that alleviates or alleviates symptoms of the disease upon administration of the cell therapy agent or pharmaceutical composition.
  • active ingredient or " effective amount” means any amount of composition used in the practice of the invention provided herein sufficient to alleviate, inhibit or prevent the disease, disorder or condition, .
  • Sertoli-like cells may alternatively be used in their culture, lysate or extract thereof.
  • the culture, lysate or extract may be a useful alternative when it is difficult to use the cell as it is, and it may exhibit biological activity similar to or equivalent to that of the original cell since it contains components of cells including proteins and the like.
  • the lysate or extract may be obtained using a commercially available cell lysis kit or an extraction kit.
  • the cell therapy or pharmaceutical composition may be formulated into a unit dosage form of a pharmaceutical preparation suitable for administration to a patient in accordance with a conventional method in the pharmaceutical field.
  • the preparation may be administered once or several times Effective dosages.
  • Suitable formulations for this purpose include injections such as ampoules injected as parenteral dosage forms, injecting agents such as injection bags, and spray agents such as aerosol formulations.
  • the injectable ampoule may be mixed with an injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, and Ringer's solution may be used as the injection solution.
  • the infusion bag may be made of polyvinyl chloride or polyethylene and may be manufactured by Baxter, Becton Dickinson, Medcep, National Hospital Products or Terumo, An injection bag of a yarn can be exemplified.
  • the pharmaceutical preparation may contain one or more pharmaceutically acceptable inert carriers such as a preservative, an anhydrous agent, a solubilizing agent or a stabilizer in the case of injection, A lubricant, a preservative, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable inert carriers such as a preservative, an anhydrous agent, a solubilizing agent or a stabilizer in the case of injection, A lubricant, a preservative, and the like.
  • the cell therapeutic agent or pharmaceutical composition of the present invention thus prepared can be administered in the form of a mixture with other stem cells used for transplantation and other uses or a mixture with such a stem cell using administration methods conventionally used in the art , Preferably, it is possible to directly engraft or transplant to a diseased part of a patient in need of treatment, or to directly implant or inject into the abdominal cavity, but is not limited thereto.
  • the above-mentioned administration is both non-surgical administration using a catheter and surgical administration such as implantation or transplant after incision of a disease site, but non-surgical administration method using a catheter is more preferable.
  • parenterally for example, by direct injection into a lesion in addition to a general method, transplantation by intravascular injection is also possible.
  • the daily dose of the Sertoli-like cells may be administered once or several times in a dose of 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 10 cells / kg body weight, preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 cells / kg body weight. It should be understood, however, that the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of various relevant factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the body weight, age and sex of the patient, The scope of the present invention is not limited thereto.
  • the cell therapeutic agent or pharmaceutical composition can induce immunosuppression and anti-inflammatory function, can form immunity privilege, and can be transformed using a method known in the art, And may be useful as a cell therapy agent.
  • the autoimmune disease may be at least one selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, osteoarthritis, Behcet's disease, autoimmune hemodilution, autoimmune myocarditis, atopic dermatitis, asthma, primary cirrhosis, dermatomyositis, gut fissure syndrome, autoimmune meningitis, Sjogren's syndrome, Anemia, autoimmune hepatitis, autoimmune mumps, Crohn's disease, diabetic disease, eosinophilic epidermolysis, epididymitis, glomerulonephritis, Graves' disease, Gilman's disease, Hashimoto's disease, hemolytic anemia , At least one selected from the group consisting of systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, psoriasis, sarcoidosis, scleroderma, spondylarthrosis
  • the Sertoli-like cells can be used in a wide variety of therapeutic protocols in which the tissues or organs of the body are enriched, treated or replaced by the engraftment, transplantation or infusion of the desired cell populations.
  • the cell therapeutic agent, pharmaceutical composition may be used without being frozen or frozen for later use. If it is to be frozen, standard cryopreservatives (eg DMSO, glycerol, Epilife® cell freezing medium (Cascade Biologics)) may be added to the pre-freezing cell population.
  • standard cryopreservatives eg DMSO, glycerol, Epilife® cell freezing medium (Cascade Biologics)
  • administering means introducing a cell therapy agent of the present invention to a patient in any suitable manner, including implantation of differentiated cells.
  • the administration route of the cell therapeutic agent or the pharmaceutical composition of the present invention can be administered through various routes as long as it can reach the target tissue. May be administered by any suitable route that delivers at least a portion of the cells or cellular components of the composition according to one embodiment to the desired location within the living individual.
  • the survival period of the cells after administration of the individual may be several hours, for example, from several hours to several days, for example, and may be several years or longer.
  • the administration of the cell therapeutic agent or pharmaceutical composition is applicable to any animal.
  • the animal includes human and primate as well as cattle such as cows, pigs, sheep, horses, dogs, rats, rats and cats.
  • compositions for a health functional food for preventing or ameliorating an autoimmune disease comprising a Sertoli-like cell, or a culture, a lysate, or an extract thereof.
  • the health food composition may be used in combination with other food or food ingredients other than the above-mentioned Sertoli-like cells, and may be suitably used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw material when the health functional food is prepared. There is no particular limitation on the kind of the health food.
  • compositions containing them are useful for the treatment, prevention, or amelioration of autoimmune diseases .
  • Sertoli-like cells can differentiate from embryonic stem cells having excellent proliferative power, they can be secured in large quantities, can secrete immunosuppressants, form immune privileges and induce anti-inflammatory functions, It can be used to develop cell therapy for diseases.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a method of predicting mesenchymal stem cells (ES) through mesododerm (ME) and IM (CHIR: CHIR99021).
  • FIG. 2 is a phase-shift image of mESC on days 4, 5 and 6 (D4, D5, D6 respectively) treated with CHIR and treated with day 2 (D2), bFGF and RA (CHIR: CHIR99021).
  • FIG. 3 shows RT-PCR results of mRNA expression levels of Oct4, Pax2, Osr1, Lhx2 and Wt1 on days 2, 4, 5 and 6 (d2, D4, D5 and D6) while mESC was induced in IM.
  • 4 is mESC is shown the 2, 4, 5, 6, make the primary (D2, D4, D4, D6) mRNA expression levels of Oc4, Pax2, Lhx1, Wt1 and Osr1 in a real time PCR results for induced by IM Graph.
  • Figure 5 shows the results of immunofluorescence staining for IM markers PAX2 and LHX1 in IM induced mESC; Scale bar 50 ⁇ m.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a method of differentiating IM into SLC derived from mESC.
  • FIG. 7 is a phase transfer image of 5 day old mouse Sertoli cells (5d mouse SCs), which is differentiated into SLC on day 3 (D3 SLCs), 7th day (D7 SLCs), and immature mouse Sertoli cells of IM.
  • FIG. 8 is an image showing the morphology of immature Sertoli cells (5 d mouse SCs) obtained from 5-day old mice and SLC derived from ESCs after culturing in 10% FBS and differentiation medium.
  • 10 is a graph determined in mESC, derived SLC and Sertoli cells (SC) the mRNA level of expression of Oct4, Wt1, Sox9, Sf1, Gata4, Fshr and Scf by real time PCR.
  • Figure 11 shows immunofluorescence staining for GATA4 and FSHR, the Sertoli cell markers in SLC induced by IM; Scale bar 50 ⁇ m.
  • FSHR + FSHR positive
  • FSHR- FSHR voice.
  • 13 is a graph showing the results of flow cytometry before and after separation.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of real time PCR of mRNA expression levels of Oct4 , Wt1 , Sox9 , Gata4 , and Fshr genes in FSHR-positive SLC and FSHR-negative SLC; mESCs: mouse embryonic stem cells; FSHR (+): FSHR-positive SLC; FSHR (-): FSHR-negative SLC.
  • FIG. 15 is a photograph showing the results of RT-PCR of mRNA expression levels of Oct4 , Wt1 , Sox9 , Gata4 , and Fshr genes in FSHR-positive SLC and FSHR-negative SLC; mESCs: mouse embryonic stem cells; FSHR (+): FSHR-positive SLC; FSHR (-): FSHR-negative SLC; DW: distilled water (control group).
  • FIG. 16 is a photograph showing the expression of EGFP in testis and trichotomy of mice after SLC transplantation; Scale bar 5 cm.
  • Figure 17 is the immunofluorescence analysis of testis stained with anti-GATA4 (red) and anti-GFP (green) antibodies on days 1 and 7 after SLC transplantation; Scale bar 20 ⁇ m.
  • Figure 18 is an image showing phagocytic activity of FSHR-positive SLC (FSHR (+)) and FSHR-negative SLC (FSHR (-)).
  • Blue Hoechst-stained nucleus
  • Green Fluorescent microbeads
  • Red derived SLC derived from RFP-transfected mESC
  • FSHR (+) FSHR-positive SLC
  • FSHR (-) FSHR-negative SLC
  • FIG. 19 is a graph comparing the phagocytic activity of adult SC, 5-day-old SC, FSHR-positive SLC, FSHR-negative SLC and MEF.
  • Figure 20 is a histogram of CD4 + T cell proliferation measured by CFSE; hBM-MSC: human bone marrow derived mesenchymal stem cells; FSHR (+) SLCs: FSHR-positive SLC.
  • FIG. 21 is a graph showing mean values of CD4 + T cell proliferation measured by CFSE.
  • hBM-MSC human bone marrow derived mesenchymal stem cells;
  • FSHR (+) SLCs FSHR-positive SLC.
  • Figure 22 shows the results of RT-PCR analysis of mRNA expression levels of TGF - beta1 , Transferrin , IL-6 , Fas- L, and Clusterin in non-isolated SLC, FSHR-positive SLC, and adult testis; FSHR (+) SLCs: FSHR-positive SLC; DW; Distilled water (control group).
  • FIG. 23 is a graph showing real-time PCR of mRNA expression levels of TGF - beta1 , Transferrin , IL-6 , Fas- L and Clusterin in isolated SLC, FSHR-positive SLC and adult testis; FSHR (+) SLCs: FSHR-positive SLC; DW; Distilled water (control group).
  • mouse embryonic stem cells mouse embryonic stem cells (mouse ESC: mESC)
  • the mESC strain (karyotype: XY) was derived from a C57BL / 6 strain mouse and a GFP-expressing transgenic mouse [C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP), Japan SLC, Inc., Shuzuoka, Japan] (MEFs; CF1 strain, Jackson Laboratory, Los GoTos, Calif.) Were used as feeder cells.
  • mESC was diluted with 20% (v / v), SR (Gibco-BRL, Franklin Lakes, NJ), 1% (v / v) NEAA (Gibco-BRL), 0.1% (v / v) -BRL) and a culture medium consisting of 80% (v / v) DMEM high glucose (HyClone, Logan, UT) containing 100 U / ml LIF (ESGRO, Chemicon, Temecula, CA) 2 incubator.
  • ESGRO Chemicon, Temecula, CA
  • the mESC was treated with 0.05% trypsin-EDTA (TE; HyClone) for 3 minutes, removed from the dish, and split into fresh MEF-seeded dishes every 3-4 days.
  • the mESC culture medium was changed daily.
  • the undifferentiated mESC stored as in 1.1 above was inoculated on an eltrex (Gibco-BRL) -coated plate in an EC cell culture medium at a density of 6 10 4 cells / cm 2 . After overnight incubation, cells were resuspended in 100 x L-GlutaMAX (L-glu; Gibco-BRL) and 1% penicillin / streptomycin (P / S; Gibco-BRL) and 5 ⁇ M CHIR99021 (glycogen synthase kinase- Treated with Advanced RPMI (A-RPMI 1640; Gibco-BRL) supplemented with 10 mM Tris-HCl (Sigma), Lexington, MA for 36-48 hours (approximately 2 days).
  • L-GlutaMAX L-glu
  • P / S penicillin / streptomycin
  • CHIR99021 glycogen synthase kinase- Treated with Advanced RPMI
  • IM was induced by treatment with 100 ng / ml bFGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) and 1 ⁇ M retinoic acid (RA; Sigma, St. Louis, MO) for about 4 days. After approximately two days, the medium was replaced.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a method of predicting IM through mesododerm (ME) in embryonic stem cells (ES).
  • FIG. 2 is a phase-shift image of mESC on days 4, 5 and 6 (D4, D5, D6 respectively) treated with CHIR and treated with day 2 (D2), bFGF and RA (CHIR: CHIR99021).
  • Fig. 2 it was confirmed that the morphology of the cell clump did not change on day 2 (D2) after treatment of mESC with CHIR99021.
  • adherent cells were changed and proliferated in an increased form after treatment with bFGF and RA for 4 days, 5 days, and 6 days (D4, D5, D6).
  • RT-PCR was performed using the First Strand cDNA synthesis kit (Takara Bio, Shiga, Japan) and AccuPower PCR premix (Bioneer, Deajeon, Korea) according to the manufacturer's instructions. All PCR products were separated by 2% agarose gel electrophoresis. The primer set used is shown in Table 1 below.
  • 3 and 4 are mESC this while guiding the IM 2, 4, 5, 6 primary to (D2, D4, D5, D6 ) Oct4, Pax2, Osr1, the mRNA expression level of Lhx2 and Wt1 RT-PCR and real time PCR.
  • no expression of the IM marker was detected in the cultured cells treated with CHIR99021 for 2 days while mESC was pre-assigned to IM.
  • the bFGF and RA it was the expression of Pax2, Lhx1 and Wt1 detected, the bFGF and RA treatment Day 2 (D4) Osr1 was not observed.
  • D6 After 4 days of treatment with bFGF and RA (D6), all IM markers were expressed in the cells.
  • IM markers PAX2 and LHX1 expression in mESC-induced IM were confirmed by immunofluorescence staining.
  • the cells to be analyzed were fixed at 4 ° C with 4% paraformaldehyde (PFA, Biosesang, Gyeonggi-do, Korea) in PBS and permeabilized with 0.1% Triton X-100 Respectively. Cells were then blocked with blocking solution (DAKO North America Inc., Carpinteria, Calif.) For 1 hour at room temperature and incubated with primary antibody overnight at 4 ° C.
  • PFA paraformaldehyde
  • the secondary antibodies were incubated for 1 hour at room temperature and the antibodies and dilutions used were as follows: LHX1 (1: 100; Santa Cruz), PAX2 (1: 100; Thermo Scientific), GATA4 Cruz), and FSHR (1: 100, Santa Cruz).
  • the secondary antibodies used were: Alexa-488, Alexa-594, Alexa-488 (1: 200, Life Technologies).
  • Primary antibodies used for immunohistochemical analysis were: GFP (1: 100; Abcam, Boston, MA) and GATA4 (1: 100; Santa Cruz).
  • the secondary antibodies used were: Alexa-488 and Alexa-594 (1: 100, Life Technologies). Immunofluorescence images were obtained using a confocal microscope (Carl Zeiss LSM 880, Oberkochen, Germany) after all treatments.
  • Figure 5 shows the results of immunofluorescence staining for the IM markers PAX2 and LHX1 in IM induced by mESC.
  • IM-stage cells were treated with 100 ng / ml bFGF, 100 ng / ml FGF-9 (Peprotech), 500 ng / ml prostaglandin D2 10 ng / ml of follicle stimulating hormone (FSH) was injected into the glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF; R & D, Minneapolis, Minn. Sigma) and 100 XITS (Insulin-Transferrin-Selenium; Invitrogen, Grand Island, NY) for about 6 days. The medium was replaced every 2 days. The morphology of the cells after induction for 6-7 days was confirmed.
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • XITS Insulin-Transferrin-Selenium; Invitrogen, Grand Island, NY
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a method of differentiating IM into SLC derived from mESC.
  • FIG. 7 is a phase transfer image of 5 day old mouse Sertoli cells (5d mouse SCs), which is differentiated into SLC on day 3 (D3 SLCs), 7th day (D7 SLCs), and immature mouse Sertoli cells of IM.
  • Immature Sertoli cells (5 d mouse SCs) obtained from 5-day old mice and SLC derived from ESC were cultured in a differentiation medium on Matrigel (same as the above SLC differentiation medium) for about 48 hours. Cells cultured in 10% FBS were used as a control group, and the results of comparing the ability of these cells to form a cord-like structure are shown in FIG.
  • the network-like structure implies the possibility of tube formation, and thus it has been confirmed that IM-induced SLC can easily form a tube-like structure.
  • 9 and 10 are the result determined in mES cells, derived SLC, and Sertoli cells (SC) the mRNA level of expression of Oct4, Wt1, Sox9, Sf1, Gata4, Fshr and Scf by RT-PCR and real time PCR. as shown in Figs. 9 and 10, while Sertoli cell marker in mES is not expressed, in the case of the Sertoli cell marker in induced SLC Wt1, Sox9, Sf1, Gata4, the Sertoli cell expression of Fshr and Scf, and And it was confirmed that they were similar to each other.
  • the SLC derived from IM by the above method expresses a Sertoli cell marker, and thus it is confirmed that the cell is a Sertoli-like cell having the characteristics of Sertoli cells.
  • Sertoli cell markers GATA4 and FSHR in the induced SLC was confirmed by immunofluorescence staining.
  • 5-day-old mouse Sertoli cells 5 d mouse SCs were used.
  • Figure 11 shows immunofluorescence staining for GATA4 and FSHR, the Sertoli cell markers in SLC induced by IM.
  • Example 3 Isolation, purification and characterization of Steroly cells induced SLC
  • differentiated SLC 1 X 10 7 was trypsinized, harvested and incubated with 100 ⁇ l MACS solution (Miltenyi Biotec, Gladbach) for 30 min at room temperature (1:20, Bioss, Woburn, MA) Lt; / RTI > 1-2 ml of buffer was added and the unbound anti-FSHR-biotin antibody was washed and removed by centrifugation twice at 300 xg for 10 minutes. The cell pellet was resuspended in 80 [mu] l buffer and 20 [mu] l anti-Biotin Microbeads UltraPure (Miltenyi Biotec) was added, mixed well and incubated at 4 [deg.] C for 15 min.
  • MACS solution Miltenyi Biotec, Gladbach
  • the cells were then washed with 2 ml 0.5% BSA (Sigma) in PBS buffer and centrifuged at 300 xg for 10 min to remove excess beads from the solution.
  • the wash solution was then processed and the pellet resuspended in 500 ⁇ l buffer at maximum column volume according to the manufacturer's guidelines and the suspension was added to a pre-treated LD column (Miltenyi Biotec) mounted on a MACSMidi magnetic cell separator (Miltenyl Biotec) Respectively.
  • the column was washed twice with 2 ml buffer to remove non-labeled cells. After removing the column from the magnetic separator, the separated cells were eluted with a 1 ml buffer, and purified and separated SLC was collected.
  • FSHR and GATA4 are Sertoli cell markers.
  • 10 is an image showing the result of immunostaining FSHR and GATA4 with SLC before and after separation, and after separation.
  • flow cytometric analysis was further performed as follows. Before and after separation, SLC was collected and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature. After washing, the cells were permeabilized with chilled 90% methanol for 10 minutes. Next, cells were blocked with 0.5% BSA (Sigma) / PBS for 30 min at room temperature and incubated with the primary antibody. To assess the efficiency of the FSHR MACS classification, cells were incubated with anti-rabbit FSHR antibody (Santa Cruz) and anti-mouse GATA4 antibody for 1 hour at 4 ° C. Secondary antibodies were detected by incubation with APC-conjugated (Life technology) and PE-conjugated antibodies at 4 ° C for 1 hour. Control cells were not treated with primary antibody. Cells were stored in ice-dark conditions prior to analysis using a Becton DicKinson FACS IV Calibur (Becton Dickinson, San Jose, Calif.). At least 5,000 or 10,000 events were collected for each sample.
  • 13 is a graph showing the results of flow cytometry before and after separation.
  • mRNA expression levels of Oct4 , Wt1 , Sox9 , Gata4 , and Fshr genes in FSHR-positive SLC and FSHR-negative SLC were confirmed by real-time PCR and RT-PCR.
  • real time PCR is extracted from the total RNA from each cell in the same manner as, and Bio-Rad CFX96 TM Real-Time PCR for the quantification of gene expression levels according to the above-described embodiment iQ TM ⁇ SYBR Green supermix (Bio- Rad Laboratories, Alfred Nobel Drive Hercules, Calif.) Using real time PCR at a final concentration of 25 ng cDNA.
  • the expression level of each gene was standardized to the level of Gapdh using the ⁇ Ct method and expressed as relative to mESC.
  • the primers used in the real time RT PCR are the same as the primers shown in Table 1 and Table 2 above.
  • Real time RT PCR results are shown in Fig. 14, and RT-PCR results are shown in Fig.
  • mRNA expression levels of Sertoli cell markers Wt1 , Sox9 , Gata4 , and Fshr were higher than those of FSHR-negative SLC (FSHR (+)) In the study area.
  • Busulfan-treated ICR mice were used. Receptor mice were anesthetized with avertin, and a cell suspension (MACS-isolated cells) expressing EGFP described in the above example was injected at a density of 1 x 10 5 cells / testis in an amount of less than 10 ⁇ l, And transplanted into the tubules.
  • a cell suspension (MACS-isolated cells) expressing EGFP described in the above example was injected at a density of 1 x 10 5 cells / testis in an amount of less than 10 ⁇ l, And transplanted into the tubules.
  • FIG. 16 is a photograph showing the expression of EGFP in testis and tubules of mice after SLC transplantation with UV.
  • Figure 17 shows immunofluorescence analysis of testis stained with anti-GATA4 (red) and anti-GFP (green) antibodies on days 1 and 7 after SLC transplantation.
  • ESC-derived SLC can be transplanted into the tubules of the recipient and located at the basal region of the tubule, such as the Sertoli cells after transplantation, to replace the Sertoli cells functionally.
  • a commercially available kit (Vybrant Phagocytosis Assay kit, Molecular Probes, USA) was used for adult SC, 5 day old SC, induced SLC, FSHR-positive SLC, FSHR- Eugene, OR) was used to measure the absorption of fluorescein-labeled E. coli according to the manufacturer's instructions.
  • Each cell was inoculated to a 4-well plate at a concentration of 2 x 10 5 cells / well in SLC differentiation medium at 5% CO 2 , 37 ° C. After 12 hours of inoculation, each cell was washed with PBS and incubated overnight in SLC differentiation medium containing fluorescein-labeled E. coli .
  • Figure 18 is an image showing the phagocytic activity of FSHR-positive SLC (FSHR (+)) and FSHR-negative SLC (FSHR (-)).
  • Blue Hoechst-stained nucleus; Green: Fluorescent microbeads; Red: derived SLC derived from RFP-transplanted mESC.
  • FIG. 19 is a graph comparing the phagocytic activity of adult SC, 5-day-old SC, FSHR-positive SLC, FSHR-negative SLC and MEF. Phagocytotic activity was calculated by cell / total cells (mean ⁇ SEM) containing fluorescent microbeads, and different alphabets showed P ⁇ 0.05.
  • the phagocytic activity of FSHR-positive SLC was significantly higher than that of MEF cells (somatic control group) and FSHR-negative SLC, and was similar to that of adult Sertoli cells.
  • the SLC and other cells derived from the SLC of the present invention to examine CD4 + T cell proliferation activity through CFSE were compared and analyzed as follows.
  • Spleen cells (splenocyte) were isolated from 6-8 week old male mice, and erythrocyte was removed by adding red cell solution (Sigma).
  • CD4 T cell isolation kit (Miltenyi Biotecn) was used to isolate the cells according to the manufacturer's instructions. Isolated CD4 + T cells were labeled with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSC, BD bioscineces). 1.2 ⁇ M of CFSE was labeled at 37 ° C. for 10 minutes and then washed three times at room temperature.
  • CFSE-labeled CD4 + T cells were co-incubated for 5 days at a ratio of 5: 1 with spleen cells, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSC, Lonza), adult SC and induced SLC (FSHR Respectively.
  • hBM-MSC human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • FSHR induced SLC
  • 50 ng / ml of phorbol myristate acetate (PMA, Sigma) and 1 ⁇ M of ionomycin (Sigma) were co-cultured in the culture medium. After co-culture, the proliferative activity of CD4 + T cells was measured with a flow cytometer (BD bioscience).
  • FIG. 20 is a histogram showing CD4 + T cell proliferative activity through CSFE in spleen cells, hBM-MSC, adult SC, and induced SLC.
  • FIG. 21 is a graph showing the average value of CD4 + T cell proliferative activity measured 3 times or more over CSFE in spleen cells, hBM-MSC, adult SC, and induced SLC. Different alphabets indicate P ⁇ 0.05.
  • the CD4 + T cell proliferation activity was significantly lower than that of adult SC, and was significantly lower than that of PMA and ionomycin-treated group, spleen cells and hBM-MSC for proliferation induction Respectively.
  • Transferrin which is a non-isolated SLC, FSHR-positive SLC (FSHR (+) SLCs), a marker of functional Sertoli cells in adult testis MRNA levels of TGF- ⁇ 1, IL- 6 , Fas- L, and Clusterin were confirmed by real-time PCR and RT-PCR.
  • the primer sets used for real-time PCR and RT-PCR are shown in Table 3 below.
  • Figure 22 shows the results of RT-PCR analysis of mRNA expression levels of TGF - beta1 , Transferrin, Il- 6 , Fas- L and Clusterin in non-isolated SLC, FSHR-positive SLC and adult testis. Similarly, expression levels of Clusterin , IL- 6 and TGF - ⁇ 1 were highly expressed in FSHR-positive SLC and adult testis tissues. Furthermore, it was confirmed that the expression level of Transferrin was detected in FSHR-positive SLC and adult testis tissues.
  • the mESC-induced SLC has immunosuppressive function and has the functional characteristics of mature Sertoli cells by the method of the present invention.

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Abstract

줄기세포 유래 세로톨리유사세포, 그 제조방법, 및 그 용도에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 세르톨리유사세포는 증식력이 우수한 배아줄기세포로부터 분화시킬 수 있으므로 대량으로 확보가 가능하며, 면역억제물질을 분비하여 면역특권을 형성하고 항염증 기능을 유도할 수 있기 때문에 세포치료제 개발에 활용할 수 있다.

Description

줄기세포 유래 세르톨리유사세포, 그 제조방법, 및 그의 용도
본 출원은 2017년 9월 7일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2017-0114680호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체를 본 출원의 참고문헌이다.
줄기세포 유래 세르톨리유사세포(Sertoli-like cells: SLCs), 그 제조방법, 및 그의 용도에 관한 것이다.
세포치료제는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용하는 의약품을 의미한다. 세포치료제는 이용하는 세포의 종류와 분화 정도에 따라 체세포치료제와 줄기세포치료제로 나눌 수 있으며, 줄기세포치료제는 배아줄기세포치료제와 성체줄기세포치료제로 분류될 수 있다. 줄기세포 치료제는 자가 증식력과 다분화능을 가진 줄기세포를 이용하여 손상된 세포의 재생을 도움으로써 환자의 질병을 치료하고 증상을 개선할 수 있을 것이라는 이상적인 이유로 주목을 받게 되었다. 그러나 줄기세포에 대한 연구는 윤리적인 문제와 원하는 세포 수의 확보 등에서 어려움을 가지고 있다. 배아줄기세포의 경우 성체줄기세포에 비하여 우월한 성능을 가지지만 생명윤리의 측면에서 부정적인 부분이 있으며, 성체 줄기세포의 경우 줄기세포의 채취 및 분리 과정 시 공여자에게 고통이 수반되고, 줄기세포의 분리 효율이 낮다는 단점이 있다.
한편, 세르톨리세포(Sertoli Cell: SC)는 남성의 정소 내에서 존재하는 세포로, 밀착결합(tight junction)을 형성하여 정소 내 면역특권부위(immunoprivileged site)를 형성할 뿐 만 아니라 실제로 면역세포의 기능을 조절하는 물질을 분비하여 그 자체로 면역특권 성격과 항염증 기능도 가지므로 세포치료제로 사용될 수 있다. 또한 세르톨리세포는 사춘기 이후 성숙된 이후에는 증식이 되지 않는 특성 때문에 체외배양을 통해 그 수를 확보하는 것이 매우 어려우므로, 최근 전분화능 줄기세포를 이용하여 세르톨리세포를 확보하거나 직분화를 통해 세르톨리세포를 확보하려는 연구가 소수의 연구진에 의해 진행되고 있으나 별다른 성과가 없다.
따라서, 무한증식 능력이 있는 배아줄기세포로부터 세르톨리세포의 기능을 갖는 세포로 분화할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 줄기세포에서 세르톨리유사세포를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 줄기세포의 세르톨리유사세포로의 분화용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 세르톨리유사세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 세르톨리유사세포를 포함하는 자가면역질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
일 양상은 글리코겐 신타제 키나제 3β(Glycogen Synthase Kinase 3: GSK-3) 저해제, 염기성 섬유아세포 성장인자(base Fibroblast Growth Factor: bFGF), 및 레티노산(Retinoic Acid: RA)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 중간중배엽(Intermediate Mesoderm: IM)으로의 분화를 유도하는 단계; 및 bFGF, 섬유아세포 성장인자 9(Fibroblast Growth Factor 9: FGF9), 프로스타글란딘 D2(Prostaglandin D2: PDG2), 여포자극호르몬(Follicle-Stimulating Hormone: FSH), 및　교세포유래신경영양인자(Glial cell Derived Neurotrophic Factor: GDNF)를 포함하는 배지에서 상기 유도된 IM을 배양하여 세르톨리유사세포(Sertoli-Like Cell: SLC)로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 SLC를 제조하는 방법을 제공한다.
용어 "줄기세포(stem cell)"는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성 세포(totipotent cell) 또는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(pluripotent cell)를 의미한다. 줄기세포는 미분화 세포로서 특정 조직의 세포로 분화될 수 있다. 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)일 수 있다. 상기 배아 줄기세포는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 말한다. 상기 성체 줄기세포는 신체 각 조직에 극히 소량만이 존재하는 미분화된 세포로서 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)는 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌려, 배아 줄기세포처럼 만능성을 유도한 세포를 말한다. 상기 배아 줄기세포는 예를 들면 마우스에서 유래한 마우스 배아 줄기세포일 수 있다.
상기 방법에서, 무한한 증식능을 가진 줄기세포를 세르톨리유사세포로 분화시키므로, 상기 방법에 의해서 세르톨리유사세포를 대량으로 확보할 수 있다.
용어 "세르톨리유사세포(SLC)"는 세르톨리세포 마커를 발현하며, 세르톨리세포의 특징을 갖는 세포를 지칭한다. 일반적으로, 세르톨리세포는 남성의 정소 내에 존재하는 세포로, 생식세포의 유지와 기능을 조절하는 역할을 한다. 상기 세르톨리세포 마커는 Wt1, Sox9, Sf1, Gata4, Fshr, Scf, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "분화"는 줄기세포로부터 특정 세포로 구조와 형태를 변화시키는 과정을 총칭한다. 구체적으로 정자와 난자가 수정하여 만들어진 수정란이라는 하나의 세포는 초반에 난할이라는 분열을 통하여 여러 개의 같은 모습의 세포로 분열한다. 그 후 각 세포는 분열, 생장 등을 통하여 다양한 조직이나 기관을 이루는 특수화된 구조로 변화하게 된다. 이렇게 특수화된 구조를 지니게 된 세포들은 각각에게 주어진 기능을 수행하게 된다. 이렇게 각각의 기능을 수행하기에 알맞은 구조와 형태를 변화시키는 과정을 말한다. 상기 분화는 자연발생적 분화 및 유도 분화 등을 포함할 수 있다.
상기 방법은 GSK-3 저해제, bFGF, 및 RA를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 IM으로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다.
상기 IM으로의 분화를 유도하는 단계는 (a) GSK-3 저해제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배지에 bFGF 및 RA를 첨가하고 추가적으로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 (a) 단계의 배양기간은 약 1일 내지 약 3일, 구체적으로는 약 2일일 수 있고, 상기 (b) 단계의 배양기간은 약 2일 내지 약 5일, 구체적으로는 약 4일일 수 있다. 배양기간이 상기 일수를 초과할 경우, 신선한 배지로 교체하여줄 수 있다.
상기 (a) 단계의 배지는 L-글루타민, 항생제, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 상기 항생제는 예를 들면 페니실린/스트렙토마이신일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 bFGF, FGF9, PDG2, FSH, 및　GDNF를 포함하는 배지에서 상기 유도된 IM을 배양하여 SLC로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다.
상기 SLC로의 분화를 유도하는 단계의 배양기간은 약 5일 내지 약 7일, 구체적으로는 약 6일일 수 있다.
상기 방법에서, 상기 GSK-3 저해제의 농도는 약 1 μM 내지 약 10 μM, 구체적으로는 약 1 μM, 약 3 μM, 약 5 μM, 약 7 μM, 또는 약 10 μM일 수 있다. 상기 bFGF의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 200 ng/ml, 구체적으로는 약 50 ng/ml, 약 75 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 또는 약 200 ng/ml일 수 있다. 상기 RA의 농도는 약 0.5 μM 내지 약 1.5 μM, 구체적으로는 약 0.5 μM, 약 1.0 μM, 또는 약 1.5 μM일 수 있다. 상기 FGF9의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 200 ng/ml, 구체적으로는 약 50 ng/ml, 약 75 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml, 또는 약 200 ng/ml일 수 있다. 상기 PDG2의 농도는 약 250 ng/ml 내지 약 750 ng/ml, 구체적으로는 약 250 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 400 ng/ml, 약 500 ng/ml, 약 600 ng/ml, 약 700 ng/ml, 또는 약 750 ng/ml일 수 있다. 상기 FSH의 농도는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml, 구체적으로는 약 5 ng/ml, 약 10 ng/ml, 또는 약 15 ng/ml일 수 있다. 상기 GDNF의 농도는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml, 구체적으로는 약 5 ng/ml, 약 10 ng/ml, 또는 약 15 ng/ml일 수 있다.
상기 IM은 PAX2, LHX1, 또는 이들의 조합을 발현할 수 있다.
용어 "글리코겐 신타제 키나제 3β(Glycogen Synthase Kinase 3: GSK-3)"는 Wnt 신호전달경로에 변화를 일으킬 수 있는 소분자를 의미한다. 상기 방법은 GSK-3 저해제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 줄기세포, 구체적으로는 배아줄기세포를 중간중배엽으로 유도할 수 있다.
상기 GSK-3 저해제는 상업적으로 이용가능한 것이거나, 합성한 것이거나, 생물로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 GSK-3 저해제는 CHIR99021(CT99021, CAS 252917-06-9)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "염기성 섬유아세포 성장인자(base Fibroblast Growth Factor: bFGF)"는 혈관 신생, 상처 치유, 배아 발달 및 다양한 내분비 신호전달경로에 관여하는 인자를 지칭한다. bFGF는 다양한 세포 및 조직의 중식과 분화 과정에서 중요한 역할을 할 수 있다.
용어 "레티노산(Retinoic Acid: RA)"은 비타민 A(레티놀)의 대사 산물을 지칭한다. 레니토산은 세포 간 신호전달을 하는 분자의 역할을 할 수 있다.
용어 "프로스타글란딘 D2(Prostaglandin D2: PDG2)"은 수용체 PTGDR (DP1), 및 CRTH2 (DP2)에 결합하는 프로스타글란딘이다. 포유동물의 기관에서는 뇌와 비만 세포에서 다량 발견될 수 있다.
용어 "여포자극호르몬(Follicle-Stimulating Hormone: FSH)"은 뇌하수체전엽의 생식선자극호르몬에 의해 합성되며, 신체의 발육, 성장, 생식 과정 등을 조절하는 물질일 수 있다.
용어 "교세포유래신경영양인자(Glial cell Derived Neurotrophic Factor: GDNF)"는 GDNF 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로, 많은 종류의 뉴런의 생존에 관여할 수 있다.
상기 방법에서, 분화를 유도하는 단계에서 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 제한 없이 포함한다. 구체적으로, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium), RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute 1640 medium) 등을 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 포함할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 인슐린-트랜스페린-셀레늄(Insulin-Transferrin-Selenium: ITS)을 포함할 수 있다.
상기 방법은 유도된 SLC를 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 분리 또는 정제는 분리, 분류, 또는 정제를 의미하며, 분리 또는 정제의 방법으로는 당업계에서 세포를 특정 기준에 따라 나눌 수 있는 방법이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로는, MACS(Magnetic-activated cell sorting), FACS(Fluorescence-activated　cell sorting), 또는 크로마토그래피 등을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 분리 또는 정제는 세르톨리세포 마커에 대해 양성인 세포를 분리 또는 정제하는 것일 수 있다. 용어, "양성"은 세포 표지(마커)와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다.
상기 방법에 의하면, 남성의 정소 내에 존재하며 사춘기 이후에는 증식되지 않는 특징을 가져 체외배양을 통해 대량 수득이 불가능한 세르톨리세포를 무한한 증식능을 가진 배아줄기세포로부터 유도하여 세톨리유사세포의 대량 확보가 가능하다.
다른 양상은 GSK-3 저해제, bFGF, 및 RA를 포함하는 줄기세포의 IM으로의 분화 유도용 조성물; 및 bFGF, FGF9, PDG2, FSH, 및 GDNF를 포함하는 IM의 SLC로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 줄기세포의 SLC로의 분화용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 세포 배양용 배지일 수 있다. 상기 조성물은 L-글루타민, 항생제, 인슐린-트랜스페린-셀레늄(Insulin-Transferrin-Selenium: ITS), 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 인슐린은 이자의 랑게르한스 섬의 β 세포에서 분비되는 펩티드 호르몬이다. 트랜스페린은 β 글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2 분자의 3가 철 이온과 결합하여 세포 증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린 수용체를 매개로 하여 철을 세포 내로 공급하는 철 운반 단백질이다. 셀레늄은 체내의 여러 가지 작용에 필수적인 미량의 무기질이며, 항산화 물질이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 세르톨리유사세포(SLC)를 제공한다.
상기 세르톨리유사세포는 줄기세포로부터 분화시킴으로써 시험관 내 또는 생체 내에서 얻을 수 있다. 즉, 상기 세르톨리유사세포는 줄기세포에서 유래된 것일 수 있다.
상기 세르톨리유사세포는 세르톨리세포 마커를 발현할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세르톨리세포 마커는 Wt1, Sox9, Sf1, Gata4, Fshr, Scf, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 세르톨리유사세포는 전분화능 마커인 Oct4를 발현하지 않을 수 있다. 따라서, 상기 세르톨리유사세포는 세르톨리세포 마커를 발현하는 성숙, 또는 미성숙 세르톨리세포와 유사한 특징을 나타낸다.
상기 세르톨리유사세포는 배양하는 동안 관-유사(tube-like) 구조를 형성할 수 있다. 구체적으로 상기 세르톨리유사세포는 단백질 복합체(예를 들면, 매트리겔) 상의 배지에서 배양하는 경우 세포 응집체를 형성하며 관-유사 구조를 형성할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세르톨리세포는 균일한 육각형의 정렬을 생성할 수 있다.
상기 세르톨리유사세포는 세르톨리세포와 같이 높은 식세포작용 활성을 나타낸다.
상기 세르톨리유사세포는 세르톨리세포와 같이 세정관 또는 정소의 기저 부위에서 유지될 수 있다.
상기 세르톨리유사세포는 면역 조절 관련 유전자를 발현한다. 따라서, 상기 세르톨리유사세포는 타 세포에 비해 우수한 면역조절능력을 가질 수 있고, 면역특권을 형성할 수 있다.
상기 세르톨리유사세포는 세르톨리세포와 같이 분화 이후에는 더 이상 증식되지 않으므로, 발암 작용 또는 기형종을 형성하지 않는다.
따라서, 상기 세르톨리유사세포는 면역억제기능, 항염증 기능이 현저하여 자가면역과 면역거부반응을 피할 수 있고, 줄기세포에서 유래하므로 대량배양이 가능하므로, 세포치료제로서 면역억제효과가 필요한 질환, 예를 들어 자가면역질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 세르톨리유사세포를 포함하는 자가면역질환 치료용 세포치료제 또는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 세포치료제, 약학적 조성물 또는 제제의 제조에 사용하기 위한 상기 세르톨리유사세포의 용도를 제공한다.
또한, 다른 양상은 질병, 예를 들면 자가면역질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 세르톨리유사세포, 그의 세포 집단 또는 그의 배양물, 용해물, 또는 추출물의 용도를 제공한다.
또한, 다른 양상은 유효성분의 상기 세르톨리유사세포, 그의 세포집단, 또는 그의 배양물, 용해물, 또는 추출물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병, 예를 들면 자가면역질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
세르톨리유사세포, 세르톨리유사세포의 제조 방법은 상기한 바와 같다.
용어 "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
용어 "치료"는 상기 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
용어 "유효성분" 또는 "유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
상기 세르톨리유사세포는 대안적으로 그의 배양물, 용해물 또는 그의 추출물이 이용될 수 있다. 상기 배양물, 용해물 또는 추출물은 세포 그대로를 이용하기 어려운 경우 유용한 대안이 될 수 있으며, 단백질 등을 포함한 세포의 구성 성분을 포함하고 있으므로 본래 세포와 유사하거나 동등한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 상기 용해물 또는 추출물은 상업적으로 이용가능한 세포 용해 키트, 또는 추출 키트 등을 이용하여 얻을 수 있다.
상기 세포치료제 또는 약학적 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화 폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터(Baxter), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제 또는 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 세르톨리유사세포의 1일 투여량은 1.0Х104 내지 1.0Х1010 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0Х105 내지 1.0Х109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 세포치료제 또는 약학적 조성물은 면역억제와 항염증 기능을 유도할 수 있고, 면역특권을 형성할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 형질전환이 가능하므로, 자가면역질환을 치료하기 위한 세포치료제로서 유용할 수 있다.
상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 골 관절염, 베체트병, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 당뇨성 질환, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 전신성 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 악성빈혈, 공피증, 미토콘드리아 관련 증후군 및 염증성 장질환으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 세르톨리유사세포는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다.
상기 세포치료제, 약학적 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프(Epilife®) 세포 동결 배지(Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 세포치료제를 도입하는 것을 의미하며, 분화된 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일, 길면 수년 이상일 수 있다.
상기 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여는 임의의 동물에 적용 가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또 다른 양상은 세르톨리유사세포, 또는 그의 배양물, 용해물, 또는 추출물을 포함하는 자가면역질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품용 조성물을 제공한다.
상기 건강식품 조성물은 상기 세르톨리유사세포 이외에 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.
본 발명자들은 세르톨리유사세포가 면역억제물질을 분비하여 면역특권을 형성하고 항염증 기능을 유도함을 확인하였으므로, 이를 포함하는 조성물은 자가면역질환의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
일 구체예에 따른 세르톨리유사세포는 증식력이 우수한 배아줄기세포로부터 분화시킬 수 있으므로 대량으로 확보가 가능하며, 면역억제물질을 분비하여 면역특권을 형성하고 항염증 기능을 유도할 수 있기 때문에 자가면역질환을 위한 세포치료제 개발에 활용할 수 있다.
도 1은 배아줄기세포(ES)에서 내중배엽(mesendoderm: ME)을 거쳐 IM으로 예정화하는 방법을 간략히 나타낸 그림이다(CHIR: CHIR99021).
도 2는 CHIR을 처리한 2일차(D2), bFGF 및 RA를 처리한 4, 5, 6일차(각각 D4, D5, D6) mESC의 상전이 이미지이다(CHIR: CHIR99021).
도 3은 mESC이 IM으로 유도되는 동안 2, 4, 5, 6일차에(D2, D4, D5, D6) Oct4, Pax2, Osr1, Lhx2 및 Wt1의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 mESC이 IM으로 유도되는 동안 2, 4, 5, 6일차에(D2, D4, D4, D6) Oc4, Pax2 , Lhx1 , Wt1 및 Osr1의 mRNA 발현 수준을 real time PCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 mESC에서 유도된 IM에서 IM 마커인 PAX2 및 LHX1에 대한 면역형광염색 결과이다; 스케일바 50 μm.
도 6는 mESC에서 유도한 IM에서 SLC로 분화시키는 방법을 간략히 나타낸 그림이다.
도 7은 IM의 SLC로 분화 3일차(D3 SLCs), 7일차(D7 SLCs), 및 미성숙 마우스 세르톨리세포인 5일령 마우스 세르톨리세포(5d mouse SCs)의 상전이 이미지이다.
도 8은 5일령 마우스에서 얻은 미성숙 세르톨리세포(5d mouse SCs) 및 ESC에서 유도한 SLC를 10% FBS와 분화 배지에서 배양한 후 형태를 확인한 이미지이다.
도 9는 mESC, 유도된 SLC, 및 세르톨리세포(SC)에서 Oct4 , Wt1 , Sox9 , Sf1 , Gata4, Fshr 및 Scf의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 mESC, 유도된 SLC 및 세르톨리세포(SC)에서 Oct4 , Wt1 , Sox9 , Sf1 , Gata4, Fshr 및 Scf의 mRNA 발현 수준을 real time PCR로 확인한 그래프이다.
도 11은 IM에서 유도된 SLC에서 세르톨리세포 마커인 GATA4 및 FSHR에 대한 면역형광염색 결과이다; 스케일바 50 μm.
도 12는 정제, 분리 전과 분리 후의 SLC를 FSHR 및 GATA4에 대해 면역염색한 결과를 나타낸 이미지이다; FSHR+: FSHR 양성; FSHR-:FSHR 음성.
도 13은 분리 전 및 분리 후의 유세포분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 FSHR-양성 SLC와 FSHR-음성 SLC에서 Oct4, Wt1, Sox9, Gata4, 및 Fshr 유전자의 mRNA 발현 수준을 real time PCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다; mESCs: 마우스 배아줄기세포; FSHR(+): FSHR-양성 SLC; FSHR(-):FSHR-음성 SLC.
도 15는 FSHR-양성 SLC와 FSHR-음성 SLC에서 Oct4, Wt1, Sox9, Gata4, 및 Fshr 유전자의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 사진이다; mESCs: 마우스 배아줄기세포; FSHR(+): FSHR-양성 SLC; FSHR(-): FSHR-음성 SLC; D.W: 증류수(대조군).
도 16은 SLC 이식 후 UV로 마우스의 정소 및 세정관에서 EGFP 발현 여부를 확인한 사진이다; 스케일바 5 cm.
도 17은 SLC 이식 1일, 7일 후에 항-GATA4(red) 및 항-GFP(green) 항체로 염색된 정소의 면역형광분석 결과이다; 스케일바 20 μm.
도 18은 FSHR-양성 SLC(FSHR(+)) 및 FSHR-음성 SLC(FSHR(-))의 식세포작용 활성을 나타낸 이미지이다. 푸른색: Hoechst-염색된 핵; 녹색: 형광마이크로비드; 붉은색: RFP-이식된 mESC에서 유래한 유도된 SLC; FSHR(+): FSHR-양성 SLC; FSHR(-): FSHR-음성 SLC; 스케일바 40 μm.
도 19는 성체 SC, 5일된 SC, FSHR-양성 SLC, FSHR-음성 SLC 및 MEF의 식세포작용 활성을 비교한 그래프이다.
도 20은 CFSE를 통해 CD4+ T 세포 증식을 측정한 히스토그램이다; hBM-MSC: 인간 골수 유래 중간엽줄기세포; FSHR(+) SLCs: FSHR-양성 SLC.
도 21은 CFSE를 통해 CD4+ T 세포 증식을 측정하여 평균값을 나타낸 그래프이다. hBM-MSC: 인간 골수 유래 중간엽줄기세포; FSHR(+) SLCs: FSHR-양성 SLC.
도 22는 분리되지않은 SLC, FSHR-양성 SLC, 및 성체 정소에서 TGF - β1 , Transferrin, IL-6, Fas -L 및 Clusterin의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다; FSHR(+) SLCs: FSHR-양성 SLC; D.W; 증류수(대조군).
도 23은 분리되지 않은 SLC, FSHR-양성 SLC 및 성체 정소에서 TGF - β1 , Transferrin, IL-6, Fas -L 및 Clusterin의 mRNA 발현 수준을 real time PCR 로 확인한 그래프이다; FSHR(+) SLCs: FSHR-양성 SLC; D.W; 증류수(대조군).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 마우스 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell: ESC )에서 중간중배엽(Intermediate Mesoderm: IM)으로의 예정화(specification)
1.1 마우스 배아줄기세포(mouse ESC: mESC)의 보관
mESC 주(핵형: XY)는 C57BL/6 계통 마우스와 GFP-발현 형질전환 마우스 [C57BL/6-Tg (CAG-EGFP), Japan SLC, Inc., Shuzuoka, Japan]에서 유래한 것이고, 조사된 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs; CF1 strain, Jackson Laboratory, Los GoTos, CA)를 피더(feeder) 세포로 하여 배양하였다. mESC를 20% (v/v), SR (Gibco-BRL, Frankin Lakes, NJ), 1% (v/v) NEAA (Gibco-BRL), 0.1% (v/v) β-머캅토에탄올 (Gibco-BRL), 100 U/ml LIF (ESGRO, Chemicon, Temecula, CA)를 함유하는 80% (v/v) DMEM high glucose (HyClone, Logan, UT)로 구성된 배양 배지 상에서 37℃, 5% 습윤 CO2 인큐베이터에서 보관하였다. 계대를 위해서, mESC에 0.05% 트립신-EDTA(TE; HyClone)를 3분 동안 처리하여 디쉬에서 떼어내고 3-4일마다 새로운 MEF-시딩된 디쉬에 나누었다. mESC 배양 배지를 매일 교환하였다.
1.2. mESC의 IM으로의 분화 및 확인
상기 1.1과 같이 보관한 미분화 mESC를 EC 세포 배양배지에서 eltrex (Gibco-BRL)-코팅된 플레이트 위에 6 ± 104 세포/cm2의 밀도로 파종하였다. 밤새 배양 한 후, 세포를 100Х L-GlutaMAX (L-glu; Gibco-BRL) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S; Gibco-BRL) 및 5 μM CHIR99021 (글리코겐 신타제 키나제-3β 저해제; Stemgent, Lexington, MA)로 보충된 Advanced RPMI (A-RPMI 1640; Gibco-BRL)로 36-48시간 동안(약 2일 동안) 처리하였다. 이후, 100 ng/ml bFGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) 및 1 μM 레티노산 (Retinoic Acid: RA; Sigma, St. Louis, MO)을 약 4일 동안 처리하여 IM으로 유도하였다. 약 2일 후 배지를 교체하였다.
도 1은 배아줄기세포(ES)에서 내중배엽(mesendoderm: ME)을 거쳐 IM으로 예정화하는 방법을 간략히 나타낸 그림이다.
도 2는 CHIR을 처리한 2일차(D2), bFGF 및 RA를 처리한 4, 5, 6일차(각각 D4, D5, D6) mESC의 상전이 이미지이다(CHIR: CHIR99021).
도 2에 나타낸 바와 같이, mESC를 CHIR99021로 처리한 후 2일차에(D2), 세포 군집(clump)의 형태는 변화하지 않았음을 확인하였다. 또한, bFGF 및 RA로 4일, 5일, 6일 동안 처리한 이후(D4, D5, D6), 부착된 세포가 늘어난 형태로 변화 및 증식하는 것을 확인하였다.
또한, mESC에서 IM으로 예정화되는 동안, IM 마커 유전자인 Pax2 , Osr1 , Lhx2 및 Wt1의 발현과 전분화능 마커 유전자인 Oct4의 발현을 RT-PCR 분석으로 확인하였다. RT-PCR을 위해, TRIzol Reagent (Invitrogen)를 사용하여 각 단계의 세포에서 총 RNA를 분리하고 NANODROP 2000 UV/Vis Spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 정량화하였다. First Strand cDNA Synthesis kit (Takara Bio, Shiga, Japan)와 AccuPower PCR premix (Bioneer, Deajeon, Korea)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 RT-PCR을 수행하였다. 모든 PCR 생성물을 2 % 아가로즈 겔 전기영동으로 분리하였다. 사용한 프라이머 세트는 다음 표 1과 같다.
유전자 wjd방향 프라이머 역방향 프라이머
Oct4 5'-TGTGGACCTCAGGTTGGACT-3' 5'- TTTCATGTCCTGGGACTCCTC-3'
Pax2 5'-CTGTTTCCAGCGCCTCTAAC-3' 5'-GACGCTCAAAGACTCGATCC-3'
Osr1 5'-TTCGTTTGCAAGTTCTGTGG-3' 5'-TGTAGCGTCTTGTGGACAGC-3'
Lhx1 5'- CAGTGTCGCCAAAGAGAACA-3' 5'-TCAACGTCTCCAGTTGCTTG-3'
Wt1 5'-CCAGTGTAAAACTTGTCAGCGA-3' 5'-TGGGATGCTGGACTGTCT-3'
도 3과 4는 mESC이 IM으로 유도되는 동안 2, 4, 5, 6일차에(D2, D4, D5, D6) Oct4, Pax2 , Osr1 , Lhx2 및 Wt1의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR 및 real time PCR로 확인한 결과이다.도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, mESC가 IM으로 예정화되는 동안, CHIR99021로 2일 동안 처리하여 배양된 세포에서 IM 마커의 발현은 검출되지 않았다. 그러나, bFGF 및 RA로 2일 동안 처리한 후 Pax2 , Lhx1 및 Wt1의 발현이 검출되었고, bFGF 및 RA 처리 2일차(D4)에 Osr1은 관찰되지 않았다. bFGF 및 RA로 4일 동안 처리한 후(D6), 모든 IM 마커들이 세포에서 발현됨을 확인하였다.
또한, mESC에서 유도된 IM에서 IM 마커인 PAX2 및 LHX1 발현을 면역형광염색으로 확인하였다. 구체적으로, 분석대상세포를 PBS 내 4% 파라포름알데히드(paraformaldehude: PFA, Biosesang, Gyeonggi-do, Korea)로 4℃에서 고정하였고 PBS 내 0.1% Triton X-100(Sigma)로 5분 동안 투과처리 하였다. 이후, 세포를 차단 용액(DAKO North America Inc., Carpinteria, CA)으로 1시간 동안 상온에서 차단하였고 일차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이차 항체를 1시간 동안 상온에서 인큐베이션하였고, 이 때 사용된 항체와 희석은 다음과 같다: LHX1 (1:100; Santa Cruz), PAX2 (1:100; Thermo Scientific), GATA4 (1:100; Santa Cruz), 및 FSHR (1:100, Santa Cruz). 사용된 이차 항체는 다음과 같다: Alexa-488, Alexa-594, Alexa-488 (1:200, Life Technologies). 면역조직화학분석을 위해 사용한 일차 항체는 다음과 같다: GFP (1:100; Abcam, Boston, MA) 및 GATA4 (1:100; Santa Cruz). 사용한 이차 항체는 다음과 같다: Alexa-488 및 Alexa-594 (1:100, Life Technologies). 모든 처리 후 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 880, Oberkochen, Germany)을 사용하여 면역형광이미지를 얻었다.
도 5는 mESC에서 유도된 IM에서 IM 마커인 PAX2 및 LHX1에 대한 면역형광염색 결과이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, mESC에서 유도된 IM에서 IM 마커가 모두 검출되었다. 따라서, 상기 처리 조건에 의해 mESC로부터 IM 특징을 나타내는 IM을 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. mESC 유래 IM에서 세르톨리유사세포 ( Sertoli -like cell: SLC ) 로의 분화
상기 실시예 1과 같이 mESC로부터 유도한 IM을 SLC로 분화시키기 위해서, IM 단계의 세포를 100 ng/ml bFGF, 100 ng/ml FGF-9 (Peprotech), 500 ng/ml 프로스타글란딘 D2 (PGD2, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), 10 ng/ml 신경교세포주-유래 신경영양인자(glia cell line-derived neurotrophic factor: GDNF; R&D, Minneapolis, MN), 10 ng/ml 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone: FSH; Sigma) 및 100ХITS (Insulin-Transferrin-Selenium; Invitrogen, Grand Island, NY)로 약 6일 동안 처리하였다. 배지는 2일마다 교체하였다. 6-7일 동안의 유도 후 세포의 형태를 확인하였다.
도 6는 mESC에서 유도한 IM에서 SLC로 분화시키는 방법을 간략히 나타낸 그림이다.
도 7은 IM의 SLC로 분화 3일차(D3 SLCs), 7일차(D7 SLCs), 및 미성숙 마우스 세르톨리세포인 5일령 마우스 세르톨리세포(5d mouse SCs)의 상전이 이미지이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, IM을 SLC로 분화한 후 유도된 SLC가 미성숙 마우스 세르톨리세포와 유사하게 끈-유사(cord-like) 구조를 형성하는 것을 확인하였다.
또한, 상기와 같이 유도된 SLC가 관-유사(tube-like) 구조를 용이하게 형성할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다. 5일령 마우스에서 얻은 미성숙 세르톨리세포(5d mouse SCs) 및 ESC에서 유도한 SLC를 매트리겔(Matrigel) 상의 분화 배지(상기 SLC 분화용 배지와 동일)에서 약 48시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 10% FBS에서 배양한 세포를 사용하였고, 이들의 형태를 비교하여 끈-유사 구조를 형성하는 능력을 비교한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 매트리겔 상의 분화 배지에서 배양한 경우, 세포들은 약 48시간 후에 5일령 마우스 세르톨리세포와 같이 세포 응집체를 형성하고 3D의 속이 빈 끈-유사(cord-like) 구조를 형성할 수 있음을 확인하였다. 3D 끈-유사 구조는 관과 유사하게 속이 비어있으며 매트리겔 에서 매우 균일한 육각형의 정렬을 생성하였다. 반면, 10% FBS에서 배양한 경우, 속이 빈 끈-유사 구조를 형성하지 않는 것을 확인하였다.
따라서, 세포가 매트리겔 상에 SLC 분화 배지 내에서 배양되는 경우, 망-유사(web-like) 구조가 형성됨을 확인하였다. 망-유사 구조는 관생성 가능성을 의미하므로 IM에서 유도된 SLC가 관-유사 구조를 용이하게 형성할 수 있음을 확인하였다.
또한, IM에서 유도된 SLC가 세르톨리세포의 특징을 갖는지 확인하기 위해서, 세르톨리세포 마커인 Wt1 , Sox9 , Sf1 , Gata4 , Fshr 및 Scf유전자의 mRNA 수준과 전분화능 마커 유전자인 Oct4 유전자의 mRNA 수준을 RT-PCR 및 real time PCR로 확인하였다. RT-PCR 및 real time PCR에 사용한 프라이머 세트의 정보는 하기 표 2와 같다.
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
Sox9 5'-CACAAGAAAGACCACCCCGA-3' 5'- GGACCCTGAGATTGCCCAGA-3'
Sf1 5'-AGAAGTTTCTGAGAGCCCGC-3' 5'-TACGAATAGTCCATGCCCGC-3'
Gata4 5'-CTGGCCAGGACTGCCG-3' 5'-GGTTGCTCCAGAAATCGTGC-3'
Fshr 5'- AATCCGTGGAGGTTTTCGCT-3' 5'- AGCACAAATCTCAGTTCAATGGC-3'
Scf 5'-GAAGACACAAACTTGGATTATCACT-3' 5'-CATCCCGGCGACATAGTTGA-3'
도 9 및 10은 mES 세포, 유도된 SLC, 및 세르톨리세포(SC)에서 Oct4 , Wt1 , Sox9, Sf1 , Gata4 , Fshr 및 Scf의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR 및 real time PCR로 확인한 결과이다.도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, mES에서 세르톨리세포 마커가 발현되지 않은 반면, 유도된 SLC에서 세르톨리세포 마커인 Wt1 , Sox9 , Sf1 , Gata4 , Fshr 및 Scf의 발현이 세르톨리세포의 경우와 유사한 수준으로 높게 나타남을 확인하였다.
따라서, 상기 방법으로 IM에서 유도된 SLC는 세르톨리세포 마커를 발현하므로, 세르톨리세포의 특징을 갖는 세르톨리유사세포임을 확인하였다.
또한, 유도된 SLC에서 세르톨리세포 마커인 GATA4 및 FSHR의 발현을 면역형광염색으로 확인하였다. 대조군으로는 5일령 마우스 세르톨리세포(5d mouse SCs)를 사용하였다.
도 11은 IM에서 유도된 SLC에서 세르톨리세포 마커인 GATA4 및 FSHR에 대한 면역형광염색 결과이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, IM에서 유도된 SLC에서 세르톨리세포 마커가 높게 검출되었으므로, IM에서 유도된 SLC가 세르톨리세포의 특징을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, ESC-유래 SLC가 상기 조건에서 SLC로 분화되며, SLC는 5일령 마우스에서 얻은 미성숙 세르톨리세포와 매우 유사한 특징을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3. 유도된 SLC의 분리, 정제 및 세르톨리세포의 특징 확인
3.1 유도된 SLC의 분리 및 정제
도 11에서 확인되는 바와 같이, SLC에서 전분화능 마커인 Oct4 mRNA의 약한 발현은 미분화된 ESC또는 분화 중인 SLC가 분화된 SLC에 남아있음을 의미한다. 따라서, 배양물로부터 분화된 SLC를 분리, 정제하기 위해서, 정소 세르톨리세포 마커인 FSHR에 대한 항체를 이용한 MACS를 수행하였다.
구체적으로, 분화된 SLC 1Х107을 트립신화하고, 수집하고, 항-FSHR-비오틴 항체(1:20, Bioss, Woburn, MA)를 100 μl MACS 용액 (Miltenyi Biotec, Gladbach) 내에서 30분 동안 상온에서 인큐베이션 하였다. 1-2 ml의 버퍼를 첨가한 후 300 x g에서 10 분 동안 2 회 원심분리하여 결합되지 않은 항-FSHR-비오틴 항체를 세척 및 제거하였다. 세포 펠렛을 80 μl 버퍼에 재현탁한 후, 20 μl 항-비오틴 마이크로비드 울트라퓨어(Anti-Biotin Microbeads UltraPure, Miltenyi Biotec)를 첨가하고, 잘 혼합한 후, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션 하였다. 이후 세포를 PBS 완충액 내 2 ml 0.5% BSA (Sigma)로 세척하고 300xg로 10분 동안 원심분리하여 용액에서 과량의 비드를 제거하였다. 이후 세척 용액을 처리하고 제조업자의 가이드라인에 따라, 최대 컬럼 용량에서 펠렛을 500 μl 버퍼로 재현탁하고 MACSMidi 자성 세포 분리기 (Miltenyl Biotec)에 장착된 예비처리된 LD 컬럼(Miltenyi Biotec)에 현탁액을 첨가하였다. 상기 컬럼을 2 ml 버퍼로 2회 연속 세척하여 비표지 세포를 제거하였다. 자성 분리기에서 컬럼을 제거한 후, 분리된 세포를 1 ml 버퍼로 용출하여 정제, 분리된 SLC를 수집하였다.
3.2 유도된 SLC의 분리 및 정제 후 세포 특성 확인
상기 방법에 의해 유도된 SLC가 정제, 분리되었는지 확인하기 위해서, 세르톨리세포 마커인 FSHR 및 GATA4에 대해 면역염색 하였다. 도 10은 정제, 분리 전과 분리 후의 SLC를 FSHR 및 GATA4에 대해 면역염색한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 12에 나타낸 바와 같이, FSHR 및 GATA4-이중 양성 SLC의 비율이 분리 및 정제 전에 비하여 분리 후에 매우 증가함을 확인하였다
또한, 추가적으로 유세포분석(Flow cytometric analysis)을 다음과 같이 수행하였다. 분리 전 및 분리 후 SLC를 수집하고 4 % 파라포름알데히드로 10분 동안 실온에서 고정시켰다. 세척 후, 세포를 냉각된 90% 메탄올로 10 분 동안 투과 처리 하였다. 다음, 세포를 상온에서 30 분 동안 0.5% BSA (Sigma)/PBS로 차단하고 1 차 항체와 함께 배양했다. FSHR MACS 분류의 효율을 평가하기 위해, 세포를 항-토끼 FSHR 항체 (Santa Cruz) 및 항-마우스 GATA4 항체와 함께 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 2 차 항체는 APC-접합 (Life technology) 및 PE-접합 항체를 사용하여 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 검출하였다. 대조군 세포는 1 차 항체로 처리하지 않았다. Becton DicKinson FACS IV Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 분석 전까지 세포를 얼음 위 암상태에서 보관하였다. 각 시료에 대해 적어도 5,000 건 또는 10,000 건의 사건을 수집하였다.
도 13은 분리 전 및 분리 후의 유세포분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 분리 후에 FSHR-양성 SLC 비율(90.0 ± 5.9% )이 분리 전의 FSHR-양성 SLC 비율(15.4 ± 2.0%))에 비하여 유의적으로 높음을 확인하였다. 또한 검출된 대부분의 세포가 FSHR 및 GATA4-이중 양성 SLC임을 확인하였다.
또한, FSHR-양성 SLC와 FSHR-음성 SLC에서 Oct4, Wt1, Sox9, Gata4, 및 Fshr 유전자의 mRNA 발현 수준을 real time PCR과 RT-PCR로 확인하였다. 구체적으로, real time PCR은 상기 실시예에 기재한 바와 같은 방법으로 각 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 유전자 발현 수준의 정량화를 위해 Bio-Rad CFX96TM 실시간 PCR에서 iQTM \SYBR Green supermix (Bio-Rad Laboratories, Alfred Nobel Drive Hercules, CA)를 사용하여 25 ng cDNA의 최종 농도로 real time PCR을 수행하였다. ΔΔCt 방법을 적용하여 각 유전자의 발현 수준을 Gapdh의 수준으로 표준화하였고 mESC에 상대적인 것으로 표현하였다. Real time RT PCR에 사용한 프라이머는 상기 표 1 및 표 2에 기재한 프라이머와 같다. Real time RT PCR 결과를 도 14에 나타내었고, RT-PCR 결과를 도 15에 나타내었다.
도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 세르톨리세포 마커인 Wt1, Sox9, Gata4, 및 Fshr의 mRNA 발현 수준이 FSHR-양성 SLC(FSHR(+))에서보다 FSHR-음성 SLC(FSHR(-))에서 훨씬 더 높게 나타났음을 확인하였다.
따라서, FSHR-양성 SLC가 성숙 세르톨리세포의 특징을 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 유도된 SLC의 기능 분석
4.1 유도된 SLC의 면역학적 특징 확인
본 발명에서 유도한 SLC가 면역학적 기능을 확인하기 위해서, 수용체 동물로 부설판(Busulfan) 처리된 ICR 마우스를 사용하였다. 수용체 마우스를 아베르틴(avertin)을 이용해 마취하고, 상기 실시예에 기재된 EGFP를 발현하는 세포 현탁액(MACS-분리된 세포)를 1Х105 세포/정소로, 10 μl 미만을 주입하여 세포를 수출관을 통해 세정관에 이식하였다.
도 16은 SLC 이식 후 UV로 마우스의 정소 및 세정관에서 EGFP 발현 여부를 확인한 사진이다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 부설판-처리된 수용체 마우스의 정소 및 세정관에서 EGFP가 발현됨을 확인하였다.
따라서, SLC이 마우스 정소로 잘 이식되었음을 확인하였고, 생체 외에서 유도한 SLC을 생체 내로 이식할 수 있음을 확인하였다.
도 17은 SLC 이식 후 1일 및 7일에 항-GATA4(red) 및 항-GFP(green) 항체로 염색된 정소의 면역형광분석 결과이다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 면역조직화학분석에 의해서, 소수의 EGF-양성 SLC가 수용체 마우스의 세정관의 기저에서 관찰되었고 SC 마커인 GATA4와 동시 발현됨을 확인하였다. 이식 후 1일차에는 수용체 마우스 정소의 세정관에서 클러스터가 검출되었다(상부 패널). 이식 후 7일차에는 수용체 마우스 세정관의 기저 부위에 이식 세포가 위치함을 확인하였다(하부 패널).
따라서, ESC-유래 SLC가 수용체의 세정관으로 이식될 수 있으며 이식 후 세르톨리세포와 같이 세정관의 기저 부위에 위치하여 기능적으로 세르톨리세포를 대체할 수 있음을 확인하였다.
4.2 유도된 SLC의 식세포활성(Phagocytosis activity) 확인
본 발명에서 유도한 SLC의 식세포활성을 확인하기 위해서, 세르톨리세포와 유도한 SLC를 대상으로 한 인 비트로 실험을 다음과 같이 수행하였다.
성체 SC, 5일된 SC, 유도된 SLC, FSHR-양성 SLC, FSHR-음성 SLC 및 마우스배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts: MEF)를 대상으로, 상업적으로 이용 가능한 키트(Vybrant Phagocytosis Assay kit, Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 플루오레세인이 표지된 E. coli의 흡수를 측정하였다. 5% CO2, 37℃ 조건에서 SLC 분화 배지에 2Х105 세포/웰의 농도로 각각의 세포를 4-웰 플레이트에 접종하였다. 접종 12시간 후, 각각의 세포를 PBS로 세척하고 플루오레세인이 표지된 E. coli를 포함하는 SLC 분화 배지에 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간의 종기에, 세포외의 식세포활동을 하지 않은 E. coli를 제거하기 위해서 각각의 세포를 2번 세척하였고, 각각의 웰에 PBS 내 100 ng/ml Hoechst (세포핵 염색용; Thermo Scientific)를 포함하는 용액 0.5 ml을 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션 하였다. 이후, 각각의 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 각각의 세포를 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 880)을 사용해서 이미지를 얻었다. 식세포작용 활성은 ImageJ (NIH, Bethesda, MD) 소프트웨어를 사용하여 GFP 입자를 갖는 세포/전체 세포로 측정하였다.
도 18은 FSHR-양성 SLC(FSHR(+)) 및 FSHR-음성 SLC(FSHR(-))의 식세포활성을 나타낸 이미지이다. 푸른색: Hoechst-염색된 핵; 녹색: 형광마이크로비드; 붉은색: RFP-이식된 mESC에서 유래한 유도된 SLC.
도 19는 성체 SC, 5일된 SC, FSHR-양성 SLC, FSHR-음성 SLC 및 MEF의 식세포작용 활성을 비교한 그래프이다. 식세포작용 활성은 형광마이크로비드를 포함하는 세포/전체세포(평균±SEM)로 계산하였고, 상이한 알파벳은 P<0.05를 나타낸다.
도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, FSHR-양성 SLC의 식세포작용 활성은 MEF 세포(체세포 대조군) 및 FSHR-음성 SLC보다 유의적으로 높고, 성체 세르톨리세포와 유사한 수준임을 확인하였다.
4.3 유도된 SLC의 CD4+ T 세포 증식활성(CD4+ T cell proliferation assay) 확인
본 발명에서 유도한 SLC의 CFSE를 통한 CD4+ T 세포 증식활성을 확인하기 위해서 유도한 SLC 와 다른 세포들을 다음 실험 방법과 같이 비교 분석하였다.
6~8 주령의 수컷 생쥐에서 비장세포(splenocyte)를 분리하고, 적혈구 용해액(Sigma)을 첨가하여 적혈구를 제거하였다. CD4+ T 세포의 분리를 위하여 CD4 T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotecn)를 이용하여 제조사의 방법대로 분리하였다. 분리된 CD4+ T 세포는 카르복시플루오레스세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSC, BD bioscineces)로 라벨링하였다. 1.2μM 의 CFSE를 37℃에서 10분간 라벨링한 후 상온에서 3회 세척하였다. CFSE-라벨된 CD4+ T 세포는 비장세포, 인간 골수 유래 중간엽줄기세포(hBM-MSC, Lonza), 성체 SC 및 유도된 SLC(FSHR(+)) 와 5:1의 비율로 5일간 공배양을 실시하였다. CD4+ T 세포의 증식을 유도하기 위하여 50ng/ml의 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA, Sigma)와 1μM의 아이오노마이신(ionomycin, Sigma)를 배양액에 섞어 공배양하였다. 공배양 이후, CD4+ T 세포의 증식활성은 유세포분석기(BD bioscience)로 측정하였다.
도 20은 비장세포, hBM-MSC, 성체 SC 및 유도된 SLC에서 CSFE를 통해 CD4+ T 세포 증식활성을 확인한 히스토그램이다.
도 21은 비장세포, hBM-MSC, 성체 SC 및 유도된 SLC에서 CSFE를 통해 CD4+ T 세포 증식활성을 3반복 이상 측정하여 그 평균값을 나타낸 그래프이다. 상이한 알파벳은 P<0.05를 나타낸다.
도 20 및 도 21에서 나타난 바와 같이 CD4+ T 세포 증식활성은 증식 유도를 위한 PMA와 ionomycin 처리군, 비장세포 및 hBM-MSC 보다 유도된 SLC가 유의적으로 낮게 확인되었으며, 성체 SC와 유사한 수준임을 확인하였다.
또한, 본 발명의 SLC이 세르톨리세포 유사 기능을 나타내는지 확인하기 위해서, 분리되지 않은 SLC, FSHR-양성 SLC(FSHR(+) SLCs), 성체 정소에서 기능적 세르톨리세포의 마커인 Transferrin의 mRNA 발현 수준과 면역조절관련 유전자인 TGF-β1, Il -6, Fas -L 및 Clusterin의 mRNA 발현 수준을 real time PCR과 RT-PCR로 확인하였다. real time PCR과 RT-PCR에 사용한 프라이머 세트는 다음 표 3과 같다.
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
TGF - β1 5'-CCGCAACAACGCCATCTATG-3' 5'-TGCCGTACAACTCCAGTGAC-3'
Transferrin 5'-TCTTCTCGGGCAGTTGTGTC-3' 5'-CATGAGAAGGGATCCGAGCC-3'
Il-6 5'-AGCCAGABTCCTTCAGAGAGA-3' 5'-TGGTCTTGGTCCTTAGCCAC-3'
Fas-L 5'-GAACTGCGAGAACTCCGTGA-3' 5'-ACTCCAGAGATCAGAGCGGT-3'
Clusterin 5'-GGGTGTACTTGAGCAGAGC-3' 5'-TCCTTGGAATCTGGAGTCCGGT-3'
도 22는 분리되지않은 SLC, FSHR-양성 SLC, 및 성체 정소에서 TGF - β1 , Transferrin, Il -6, Fas -L 및 Clusterin의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다.도 22에 나타낸 바와 같이, Clusterin, Il -6 및 TGF - β1의 발현 수준이 FSHR-양성 SLC 및 성체 정소 조직에서 높게 발현함을 확인하였다. 또한, Transferrin의 발현 수준이 FSHR-양성 SLC 및 성인 정소 조직에서 검출되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 방법에 의해 mESC에서 유도된 SLC가 면역억제 기능을 가지며, 성숙한 세르톨리세포의 기능적 특징을 갖는 것을 확인하였다.
통계분석
별도의 표시가 없는 한, 모든 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험을 대표하는 것이다. 결과는 평균±SEM으로 표시하였다. 통계적 유의성은 one-way ANOVA와 Tukey test를 사용하여 평가하였다.

Claims (18)

  1. 글리코겐 신타제 키나제 3β(Glycogen Synthase Kinase 3: GSK-3) 저해제, 염기성 섬유아세포 성장인자(base Fibroblast Growth Factor: bFGF), 및 레티노산(Retinoic Acid: RA)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하여 중간중배엽(Intermediate Mesoderm: IM)으로의 분화를 유도하는 단계; 및
    bFGF, 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor 9: FGF9), 프로스타글란딘 D2(Prostaglandin D2: PDG2), 여포자극호르몬(Follicle-Stimulating Hormone: FSH), 및　교세포유래신경영양인자(Glial cell Derived Neurotrophic Factor: GDNF)를 포함하는 배지에서 상기 유도된 IM을 배양하여 세르톨리유사세포(Sertoli-Like Cell: SLC)로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 줄기세포에서 SLC를 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 IM으로의 분화를 유도하는 단계는 (a) GSK-3 저해제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배지에 bFGF 및 RA를 첨가하고 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양기간은 1일 내지 3일이고, 상기 (b) 단계의 배양기간은 2일 내지 5일인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 L-글루타민, 항생제, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 SLC로의 분화를 유도하는 단계의 배양기간은 5일 내지 7일인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 GSK-3 저해제의 농도는 1 μM 내지 10 μM, bFGF의 농도는 50 ng/ml 내지 200 ng/ml, RA의 농도는 0.5 μM 내지 1.5 μM, FGF9의 농도는 50 ng/ml 내지 200 ng/ml, PDG2의 농도는 250 ng/ml 내지 750 ng/ml, FSH의 농도는 5 ng/ml 내지 15 ng/ml 및 GDNF의 농도는 5 ng/ml 내지 15 ng/ml인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)인 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 배아 줄기세포는 마우스 배아 줄기세포인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium), 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute 1640 medium)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 SLC로의 분화를 유도하는 단계에서 배지가 인슐린-트랜스페린-셀레늄(Insulin-Transferrin-Selenium: ITS)을 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 유도된 SLC를 분리 또는 정제하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. GSK-3 저해제, bFGF, 및 RA를 포함하는 줄기세포의 IM으로의 분화 유도용 조성물; 및 bFGF, FGF9, PDG2, FSH, 및 GDNF를 포함하는 IM의 SLC로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 줄기세포의 SLC로의 분화용 조성물.
  13. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 SLC.
  14. 청구항 13에 있어서, Wt1 , Sox9 , Sf1 , Gata4 , Fshr , Scf , 또는 이들의 조합을 발현하는 것인 SLC.
  15. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 SLC를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 자가면역질환이 류마티스 관절염, 골 관절염, 베체트병, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 당뇨성 질환, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 전신성 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 악성빈혈, 공피증, 미토콘드리아 관련 증후군 및 염증성 장질환으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인 약학적 조성물.
  17. 자가면역질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 청구항 1의 방법에 의해 제조된 SLC, 그의 세포 집단, 그의 배양물, 용해물, 또는 추출물의 용도.
  18. 유효량의 청구항 1의 방법에 의해 제조된 SLC, 그의 세포 집단, 그의 배양물, 용해물, 또는 추출물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환을 치료 또는 예방하는 방법.
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