WO2019045356A1 - 반응성 산소종을 포함하는 박테리오파아지의 생산량 증가 조성물 및 방법 - Google Patents

반응성 산소종을 포함하는 박테리오파아지의 생산량 증가 조성물 및 방법 Download PDF

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명희준
조윤열
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한국외국어대학교 연구산학협력단
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    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to bacterial opaque production techniques.
  • a bacteriophage is a bacterial virus that specifically infects a specific bacterium and kills the bacteria through a complex lysis process involving many proteins.
  • the bacteriophage was highly specific for host bacteria, so it was highly evaluated as an antibiotic before the antibiotic was developed in earnest. However, the utility of the bacteriophage was reduced with the understanding of bacteriophage and the development of full-fledged antibiotics.
  • bacteriophage has been developed as an antibiotic for the treatment and prevention of infection.
  • U.S. Patent No. 7622293 discloses a bacteriophage against Pseudomonas and uses thereof.
  • Korean Patent No. 941892 discloses a bacteriophage against Salmonella gallinum and its use.
  • PAS Phage-antibiotic synergy
  • Comeau AM Tetart F, Trojet SN, Prere MF, Krisch HM 2007.
  • PLoS One 2 e799).
  • This article presents a method that can significantly improve the production of bacteriophage using sublethal ROS.
  • the present invention is a composition for increasing the production of bacteriophage comprising Reactive Oxygen Species (ROS), wherein the ROS is contained at an arsine concentration for the host bacteria that specifically infects the bacteriophage , A composition for increasing bacteriophage production.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • the composition according to the present invention is a combination of various bacteriophages infecting the various host cells used, for example, the host bacterium is Escherichia coli , and the bacteriophage is phage T4; Wherein the host bacterium is Bacilus cereus , the bacteriophage is PBBC O3; Wherein said host bacterium is Staphylococcus aures , said bacteriophage is phage SA11; Said host bacterium is Enterococcus faecalis , said bacteriophage is phage PBEF 07 and PBEF 09; The host bacteria are Escherichia coli Crooks and the bacteriophages are PBEC 22, PBEC 24, and PBEC 82; Or the host bacterium is Pseudomonas aerusinosa and can be used in the bacteriophage PA22, PA25, or PA26.
  • the host bacterium is Escherichia coli
  • H 2 O 2 Various materials capable of exhibiting the effects according to the present invention, H 2 O 2 , Superoxide, hydroxy radical, or singlet oxygen may be used.
  • ROS reactive oxygen species
  • the ROS is H 2 O 2 to be.
  • the culture is performed in a solid or liquid medium, wherein the ROS of the arch dose when performed in the solid medium is about 0.2 mM, the ROS of the arch dose when performed in the liquid medium is about 4.5 mM But is not limited thereto.
  • the disclosure provides a use for increasing bacteriophage production in host bacteria of Reactive Oxygen Species (ROS).
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • host bacteria and phages employed in the above applications may be referred to above.
  • the ROS that may be employed herein may be referred to above.
  • the method and composition for increasing the production of bacteriophage using ROS according to the present invention cause filamentation of the host bacteria in the presence of ROS at a low dose level and the generation of more phages as the melting timing is delayed after the phage infection, Can be greatly increased.
  • the plaque size on the solid medium can be increased to greatly improve the detection efficiency of the phage.
  • compositions of the present invention can be usefully employed in the production of bacteriophages in which the problem of resistance is used as an alternative to severe antibiotics.
  • FIG. 1 shows the results of determining the sodium concentration of H 2 O 2 as ROS when cultured in E. coli in a liquid medium.
  • FIG. 2 shows the result of observing the change of E. coli morphology (microfibrillation) in E. coli culturing under the sodium concentration of H 2 O 2 determined in FIG.
  • FIG. 3 shows the results of one step proliferation of bacteriophage T4 in E. coli culturing at a low dose concentration of H 2 O 2 as ROS in a liquid medium.
  • FIG. 4 shows the burst (burst) size of bacteriophage T4 when cultured in E. coli at a low dose of H 2 O 2 as ROS in liquid medium.
  • FIG. 5 shows the result of measuring the plaque size of phage T4 when cultured in E. coli at a low dose of H 2 O 2 as ROS in a solid medium.
  • the present invention is based on the discovery that Reactive Oxygen Species (ROS) can increase the production of bacteriophage at sublethal concentrations.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • this disclosure is directed to a composition for increasing bacterial production comprising reactive oxygen species.
  • the ROS is included as an arsine dose concentration for the bacteria specifically infected by the bacteriophage.
  • the reactive oxygen species of the present invention refers to a molecule containing an oxygen atom, which is a chemically reactive molecule, which contains oxygen ions and hydrogen peroxide. Molecule reactivity is very high due to unpaired electrons in the reactive oxygen species.
  • the reactive oxygen species may include peroxides, superoxide anion radicals (O 2 - ), singlet oxygen hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), hydroxy radicals (OH), lipid peroxide, nitric oxide Oxynitrite (NO 3 2- ), celoperoxy radical (R-SO 2 - ), and the like.
  • the reactive oxygen species is hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), peroxide, hydroxy radical, or singlet oxygen.
  • ROS commonly includes various materials that damage DNA / RNA and oxidize amino acids and fatty acids.
  • the term " atomic concentration of reactive oxygen species " refers to a concentration which is sufficient to cause bacterial killing, but which is not completely fatal, and which is insufficient to cause killing.
  • the concentration depends on the type of reactive oxygen species and host bacteria, It is set differently.
  • the sink concentration used herein is defined as the minimum amount at which the rate of bacterial growth is maintained constant until 1 hour after treatment but the rate of proliferation begins to decrease after 2 hours.
  • the amount of acidosis depends on the type of host bacteria.
  • the atomic concentration of hydrogen peroxide used in one embodiment herein is about 0.2 mM in the solid medium and about 4.5 mM in the liquid medium.
  • the reactive oxygen species of the present invention when present at a low dose concentration, microfibrillation occurs in the host bacteria and the timing of fusion after the bacteriophage infection is delayed, so that more bacteriophages can be produced .
  • the 'bacteria' to which the compositions herein may be used are used as host strains for the bacteriophage.
  • one type of bacteriophage infects only one specific type of bacterium, so the bacterium used can be determined according to the bacteriophage to which it is intended to increase production.
  • Both of Gram-positive and Gram-negative bacteria can be used in the bacteria of the present invention.
  • a positive bacteria Gram in one embodiment of the present example is Staphylococcus aureus (Staphylococcus aures) (American Type Culture Collection (ATCC) 13301), Enterococcus par faecalis (Enterococcus faecalis) (Korean Collection for Type Culture (KCTC) 2011) Sirius, and Bacillus (Bacillus cereus) (KCTC 1012) is used, but is not limited thereto. It can be obtained from the place indicated in parentheses of each of the above strains.
  • gram negative bacteria include Escherichia coli Crooks strain (ATCC 8739), Escherichia coli K12 strain MG1655 (ATCC 700926), and Pseudomonas aerusinosa. (ATCC 13388) is used, but is not limited thereto.
  • Escherichia coli K12 strain was used in one embodiment of the present invention. It can be obtained from the place indicated in parentheses of each of the above strains.
  • the 'bacteriophage' that is intended to increase production here can be defined by host bacteria.
  • phage SA11 may be used as a bacteriophage to increase production
  • S. aureus may be used as a host bacterium
  • phage PBEF 07 and PBEF 09 may be used as E. faecalis as a host bacterium
  • Phage T4 can be E. coli MG1655 as a host bacterium.
  • phage PBEC 22, PBEC 24, 82 and PBEC is a bacterial host may be used for E. coli Crooks, phage PA22, PA25, PA26 and the host bacteria to increase the production to the Rouge to P. Labor can be used, and PBBC 03 can use B. sirius as a host bacterium.
  • E. coli K12 was used as a host bacterium to increase the production of phage T4.
  • the reactive oxygen species of the present invention when present at a low dose concentration, fine filamentation occurs in the host bacteria and the fusion timing after the bacteriophage infection is delayed. As a result, more bacteriophages can be produced, Cells can be used to infect a variety of bacterial host cells and bacteriophage strains from which phage can be produced.
  • compositions herein may be added to the bacterial culture medium.
  • a medium that may comprise a composition comprising a reactive oxygen species used to increase the production of the bacteriophage of the present invention may be used in any of the batches used to increase the bacteriophage production.
  • the bacterial culture medium can be used either as a liquid medium or as a solid medium.
  • the increase in bacteriophage production by the composition of the present invention can be determined in comparison with a control group to which no reactive oxygen species are added.
  • bacterial phage are increased due to delayed bacterial dissolution due to microfibrillation in the presence of reactive oxygen species at a low dose level.
  • this disclosure relates to a method of increasing bacteriophage production.
  • the method comprises mixing a bacterium with a bacteriophage specific for the bacterium and an aseptic dose of ROS for the bacterium.
  • the production of the bacteriophage is improved by the ROS of the arch dose.
  • the reactive oxygen species are as described above.
  • Bacteria and bacteriophages the method can be used are as described above.
  • the phage used and the E. coli strain bacteriophage T4 were used and the host was E. coli MG1655.
  • the bacteria were cultured in LB (Luria-Bertani) medium at 37 ° C. All phages were obtained from Bacteriophage Bank of Korea (http://www.phagebank.or.kr/).
  • phage cultivation and purification The phages were cultured in the presence of phage -encoded colanic acid-degrading enzyme permits lytic (Kim MS, Kim YD, Hong SS, Park K, Ko KS, Myung H. 2015) phage infection of a capsule-forming resistant mutant Escherichia coli strain. Appl Environ Microbiol 2015 81: 900-909) and a glycerol gradient method.
  • a standard phage technique was used as described in Sambrook J et al. (Sambrook J, Russell DW, 2006. Purification of bacteriophage particles by centrifugation through a glycerol step gradient, CSH Protoc pdb.prot 3969).
  • Bacterial Imaging The bacterial morphology was observed with a laser scanning microscope using ZEN software (Zeiss LSM 700). For sampling, 5-10 l of bacteria were added to the glass slide and covered with cover slip. After drying for 20 minutes in a fume hood, the bacteria were observed using a 100X objective. Bacteria were cultured using a glass-bottom 96-well black plate (Ibidi # 89626), the bacteria were fixed with cold acetone and blocked with 1% BSA in PBST for 30 minutes.
  • phage plaque size The phage plaque was allowed to form on a bacterial lawn and then size was measured using a digital caliper.
  • H 2 O 2 were sequentially diluted to 1/2, and the concentration was determined to be 0.2 mM in the solid medium (Table 3) and 4.5 mM in the liquid medium (FIG. 1).
  • E. coli K12 (MG1655) was overnight cultured. 10 ml of LB broth (liquid medium) was placed in a 50 ml tube and fresh culture was performed for 1 hr with overnight cultured bacteria (1/100). When OD 600 reached 0.3, H 2 O 2 was treated with 4.5 mM and incubated for 1 hr (OD 600 0.5 to 0.7).
  • Phage T4 was treated with an MOI of 0.001. And adsorption was carried out for 5 minutes in a 37 ⁇ C shaking incubator. After centrifugation at 12,000 rpm for 5 min, the supernatant was removed. Fresh LB broth (10 ml) was added and resuspended. At the end of the resuspension, the cells were placed in a 37 ° C incubator at 0 min and dispensed at 500 ⁇ l intervals every 5 minutes. Plates were plated using a double agar overlay and the number of phages was measured.
  • the phage solution was plated in a solid medium containing H 2 O 2 at a low dose concentration using a double layer overlay method and the number of phages was measured.
  • the E. coli cultured in the presence of H 2 O 2 at a low concentration in a liquid state was observed under an optical microscope at 1000 magnification.

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Abstract

본원은 ROS를 이용한 박테리오파아지 생산 증가용 방법 및 조성물을 개시한다. 본원에 따르면 아치사량 농도의 ROS의 존재하에서 박테리오파아지의 생산량은 수 배 이상 증가한다. 따라서 본원의 방법 및 조성물은 내성의 문제가 심각한 항생제의 대안으로 사용되는 박테리오파아지의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

반응성 산소종을 포함하는 박테리오파아지의 생산량 증가 조성물 및 방법
본원은 박테리아오파아지 생산기술에 관한 것이다.
박테리아 병원균을 제거하기 위해 사용되는 항생제에 대한 내성을 갖는 균의 출현은 전세계적으로 큰 문제를 야기하고 있어, 항생제를 대신할 수 있는 물질의 개발이 시급한 실정이다.
박테리오파아지는 특정 박테리아를 특이적으로 감염하여, 많은 단백질이 관여하는 복잡한 융해(lysis) 과정을 통해 박테리아를 사멸시키는 박테리아 바이러스이다. 박테리오파아지는 숙주 박테리아에 대한 특이성이 매우 높아 항생제가 본격적으로 개발되기 전 항생제로서의 가능성이 높이 평가되었으나, 박테리오파아지에 대한 부족한 이해 및 본격적인 항생제의 개발과 함께, 그 효용이 줄어드는 추세였다.
하지만 최근들어 박테리오파아지에 대한 연구결과의 축적과 함께 최근 항생제 남용으로 불거진 문제를 해결하기 위한 대안으로 박테리오파아지를 감염치료 및 방지 등에 사용하는 항생제로서의 개발이 증가하는 추세이다.
미국특허 제7622293호는 슈도모나스에 대한 박테리오파아지 및 그 용도에 관하여 개시하고 있다.
한국특허 제941892호는 살모넬라 갈리나움에 대한 박테리오파아지 및 그 용도에 관하여 개시하고 있다.
또한 PAS(Phage-antibiotic synergy)라고 불리는, 아치사량 농도의 항생제와 함께 사용시 박테리오파아지의 생산량이 증가하는 현상이 알려져 있다(Comeau AM, Tetart F, Trojet SN, Prere MF, Krisch HM. 2007. Phage-Antibiotic Synergy (PAS): beta-lactam and quinolone antibiotics stimulate virulent phage growth. PLoS One 2:e799).
하지만, 이러한 다양한 용도로 사용하기 위해, 박테리오파아지의 생산량을 증가시키고, 또한 항생제의 사용없이 생산량을 증가시킬 수 있는 기술개발이 필요하다.
본원은 아치사량(sublethal)의 ROS를 이용한 박테리오파아지의 생산량을 대폭 향상시킬 수 있는 방법을 제시한다.
한 양태에서 본원은 반응성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 포함하는 박테리오파아지 생산 증가용 조성물로, 상기 ROS는 상기 박테리오파아지가 특이적으로 감염하는 숙주 박테리아에 대한 아치사량 농도로 포함되는 것인, 박테리오파아지 생산 증가용 조성물을 제공한다.
본원에 따른 조성물은 사용하는 다양한 숙주세포에 맞추어 이를 감염하는 다양한 박테리오파아지의 조합 예를 들면 상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 T4; 상기 숙주 박테리아는 바실러스 시리우스(Bacilus cereus) 이고, 상기 박테리오파아지는 PBBC O3; 상기 숙주 박테리아는 스테필로코커스 아우레스(Staphylococcus aures) 이고, 상기 박테리오파아지가 파아지 SA11; 상기 숙주 박테리아는 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 PBEF 07 및 PBEF 09; 상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) Crooks 이고, 상기 박테리오파아지는 PBEC 22, PBEC 24, 및 PBEC 82; 또는 상기 숙주 박테리아는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aerusinosa) 이고, 상기 박테리오파아지 PA22, PA25, 또는 PA26에 사용될 수 있다.
본원에 따른 효과를 나타낼 수 있는 다양한 물질, H2O2, 과산화물(superoxide), 하이드록시 라디칼, 또는 일중항 산소(singlet oxygen)가 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 숙주 박테리아, 이에 특이적인 박테리오파아지 및 상기 박테리아에 대한 아치사량의 반응성 산소종(ROS)의 존재 중에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 아치사량의 ROS에 의해 상기 박테리오파아지의 생산량이 향상되는 것인, 박테리오파아지 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 박테리아 및 이에 감염하는 파아지, 및 ROS의 종류는 본원에 개시사항을 참조할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 ROS는 H2O2 이다.
다른 구현예에서 상기 배양은 고체 또는 액체 배지에서 수행되며, 상기 고체배지에서 수행되는 경우에는 상기 아치사량의 ROS는 약 0.2mM, 상기 액체배지에서 수행되는 경우에는 상기 아치량의 ROS는 약 4.5mM 이나, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 반응성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)의 숙주 박테리아에서 박테리오파아지 생산 증가용 용도를 제공한다.
일 구현예서 상기 용도에 채용되는 숙주 박테리아 및 파아지는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 채용될 수 있는 ROS는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 ROS를 이용한 박테리오파아지 생산 증가 방법 및 조성물은 아치사량 농도의 ROS의 존재하에서 숙주 박테리아는 미세섬유화(filamentation)를 일으키고, 파아지 감염 후 융해의 타이밍이 늦어지면서 더 많은 파아지를 만들어 내어 박테리오파아지의 생산 효율을 크게 높일 수 있다. 아울러 고체배지 상에서의 플라크 크기를 증가시켜 파아지의 탐지 효율을 크게 향상시킬 수 있다.
따라서 본원의 방법 및 조성물은 내성의 문제가 심각한 항생제의 대안으로 사용되는 박테리오파아지의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 액체배지에서 E. coli 배양시 ROS로서 H2O2의 아치사량 농도를 결정한 결과이다.
도 2는 도 1에서 결정된 H2O2의 아치사량 농도 하에 E. coli 배양시 나타나는 E. coli 형태의 변화(미세섬유화)를 관찰한 결과이다.
도 3은 액체배지에서 ROS로서 H2O2의 아치사량 농도에서 E. coli 배양시 박테리오파아지 T4의 one step 증식을 확인한 결과이다.
도 4는 액체배지에서 ROS로서 H2O2의 아치사량 농도에서 E. coli 배양시 박테리오파아지 T4의 burst(파열) 크기를 측정한 결과이다.
도 5는 고체배지에서 ROS로서 H2O2의 아치사량 농도에서 E. coli 배양시 파아지 T4의 plaque(플라크) 크기를 측정한 결과이다.
본원은 반응성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)이 아치사량(sublethal) 농도에서 박테리오파아지의 생산량을 증가시킬 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
이에 한 양태에서 본원은 반응성 산소종을 포함하는 박테라오파아지 생산 증가용 조성물에 관한 것이다. 상기 ROS는 상기 박테리오파아지가 특이적으로 감염하는 박테리아에 대한 아치사량 농도로 포함된다.
본원의 상기 반응성 산소종은 산소원자를 포함하는, 화학적으로 반응성 있는 분자로서, 산소이온 그리고 과산화수소를 포함하고 있는 분자를 말한다. 반응성산소종에 있는 짝지어지지 않은 전자 때문에 분자의 반응성이 매우 높다. 상기 반응성산소종에는 과산화물, 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(O2 -), 일중항산소 과산화수소(H2O2), 하이드록시 라디칼(OH), 과산화지질(lipid peroxide), 니트릭 옥사이드(NO), 퍼옥시나이트라이트(NO3 2-), 씨올퍼옥시라디칼(R-SO2 -)등이 있다. 본원의 일 구현에서 상기 반응성산소종은 과산화수소(H2O2), 과산화물, 하이드록시라디칼, 또는 일중항산소가 사용된다. 본원에 사용되는 ROS는 공통적으로 DNA/RNA에 손상을 입히고 아미노산과 지방산을 산화시키는 다양한 물질이 사용될 수 있다.
본원에서 반응성 산소종의 “아치사량 농도”란 박테리아 사멸에 영향을 미치기는 하나 완전히 치명적이 아닌, 사멸을 일으키기엔 부족한 정도의 농도를 말하며, 반응성 산소종 및 숙주 박테리아 종류, 배양배지 등에 따라 농도가 달리 정해진다. 본원에서 사용된 아치사량 농도는 처리 1시간 이후까지 세균의 증식속도가 일정하게 유지되나, 2시간 이후에는 증식속도가 감소하기 시작하는 최소량으로 정의한다. 아치사량은 숙주세균의 종류에 따라 달라질 수 있다. 본원의 일 구현예에서 사용된 과산화수소의 아치사량 농도는 고체배지에서는 약 0.2 mM, 액체배지에서는 약 4.5 mM 이다.
본 이론으로 한정하는 것은 아니나, 본원의 상기 반응성 산소종이 아치사량 농도로 존재할 때, 숙주 박테리아에서 미세섬유화(filamentation)가 일어나서 박테리오파아지 감염 후의 융해 타이밍이 지연되므로, 박테리오파아지가 더 많이 만들어질 수 있음을 발견하였다.
본원의 조성물이 사용될 수 있는‘박테리아’는 박테리오파아지에 대한 숙주 균주로 사용된다. 통상 한 종류의 박테리오파아지는 하나의 특정 종류의 박테리아에만 감염하므로, 생산을 증가시키고자 하는 박테리오파아지에 따라 사용되는 박테리아가 정해질 수 있다. 본 발명의 상기 박테리아에는 그램 양성균 및 그램 음성균 둘다 사용될 수 있다.
본원의 일 실시예에서 그램 양성균으로는 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aures) (American Type Culture Collection(ATCC) 13301), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)(Korean Collection for Type Culture (KCTC) 2011), 및 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) (KCTC 1012)가 사용되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 각 균주의 괄호에 기재된 곳에서 입수할 수 있다.
본원의 일 실시예에서 그램 음성균으로는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 크룩스(Crooks) 균주(ATCC 8739), 에세리키아 콜라이 K12 균주 MG1655 (ATCC 700926), 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aerusinosa) (ATCC 13388)가 사용되나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 일 구현예에서 에세리키아 콜라이 K12 균주가 사용되었다. 상기 각 균주의 괄호에 기재된 곳에서 입수할 수 있다.
본원에서 생산을 증가시키고자 하는‘박테리오파아지’는 숙주 박테리아에 따라 정해질 수 있다.
본원의 일 실시예에서 생산을 증가시키고자 하는 박테리오파아지가 파아지 SA11는 숙주 박테리아로는 S. 아우레우스를 사용할 수 있고, 파아지 PBEF 07 및 PBEF 09는 숙주 박테리아로는 E. 파에칼리스를 사용할 수 있고, 파아지 T4는 숙주 박테리아로는 E. coli MG1655를 사용할 수 있다. 또한 생산을 증가시키고자 하는 박테리오파아지가 파아지 PBEC 22, PBEC 24, 및 PBEC 82는 숙주 박테리아로는 E. coli Crooks를 사용할 수 있고, 파아지 PA22, PA25, 및 PA26는 숙주 박테리아로는 P. 에루지노사를 사용할 수 있고, PBBC 03는 숙주 박테리아로 B. 시리우스를 사용할 수 있다. 본원의 일 구현예에서 숙주 박테리아로 에세리키아 콜라이 K12를 사용하여 파아지 T4의 생산을 증가시켰다.
상술한 바와 같이 본원의 상기 반응성 산소종이 아치사량 농도로 존재할 때, 숙주 박테리아에서 미세섬유화(filamentation)가 일어나서 박테리오파아지 감염 후의 융해 타이밍이 지연되므로, 그 결과 박테리오파아지가 더 많이 만들어질 수 있어, 숙주세포를 감염하여, 파아지가 생산될 수 있는 다양한 박테리아 숙주세포 및 박테리오파아지 조합에 사용될 수 있다.
상기 파아지에 대한 정보 및 입수는 Bacteriophage Bank of Korea (http://www.phagebank.or.kr/)에서 가능하다.
본원의 조성물은 박테리아 배양 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 박테리오파아지 생산을 증가시키기 위해 사용되는 반응성산소종을 포함하는 조성물을 포함할 수 있는 배지는 상기 박테리오파아지 생산을 증가시키는데 이용되는 어떠한 배지라도 이용될 수 있다. 박테리아 배양 배지는 액체 배지 또는 고체 배지 어느 것이라도 이용될 수 있다.
본원의 조성물에 의한 박테리오파아지 생산 증가는 반응성산소종이 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 판별할 수 있다.
상술한 바와 같이, 아치사량 농도의 반응성 산소종 존재시에 미세섬유화에 기인한 박테리아 용해 지연으로 인해 박테리아파아지가 더 많아진다.
이에 다른 양태에서 본원은 박테리오파아지 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본원의 일 실시예에서 상기 방법은 박테리아를 상기 박테리아에 특이적인 박테리오파아지 및 상기 박테리아에 대한 아치사량의 ROS와 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 아치사량의 ROS에 의해 상기 박테리오파아지의 생산량이 향상된다.
상기 반응성 산소종은 상술한 바와 같다.
상기 방법이 사용될 수 있는 박테리아 및 박테리오파아지는 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 재료 및 방법
사용한 파아지 및 E. coli strain 박테리오파아지 T4를 사용하였고 그 숙주로는 E. coli MG1655를 사용하였다. 상기 박테리아는 37℃, LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양하였다. 파아지는 모두 Bacteriophage Bank of Korea (http://www.phagebank.or.kr/)에서 얻었다.
박테리오파아지 배양 및 정제 파아지는 Kim MS 등의 문헌(Kim MS, Kim YD, Hong SS, Park K, Ko KS, Myung H. 2015. Phage-encoded colanic acid-degrading enzyme permits lytic phage infection of a capsule-forming resistant mutant Escherichia coli strain. Appl Environ Microbiol 2015 81:900-909)에 기재된 원심분리 및 글리세롤 gradient 방법을 사용하여 정제하였다. Sambrook J 등의 문헌(Sambrook J, Russell DW. 2006. Purification of bacteriophage particles by centrifugation through a glycerol step gradient. CSH Protoc pdb.prot3969)에 기재된 바와 같은, 표준 파아지 기술을 사용하였다.
통계분석 모든 데이터는 3개의 독립된 실험을 3번 반복한 것의 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. 유의성을 나타내는 P 수치가 < 0.05인 Student’s t test를 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다.
박테리아 이미징 ZEN 소프트웨어(Zeiss LSM 700)를 사용하여 레이저 스캐닝 현미경으로 박테리아 형태를 관찰하였다. 샘플링을 하기 위하여, 5~10㎕의 박테리아를 글래스슬라이드에 적가하고 커버슬립으로 덮었다. 흄후드에서 20분간 건조한 후, 상기 박테리아를 100X 대물렌즈를 사용하여 관찰하였다. 유리바닥(glass-bottom) 96-웰 블랙 플레이트(Ibidi #89626)를 사용하여 박테리아를 배양하며, 상기 박테리아는 차가운 아세톤으로 고정시키고 PBST에서 1% BSA로 30분간 블락시켰다.
파아지 플라크 크기 측정 파아지 플라크가 박테리아 론(lawn)에 형성되도록 한 후 디지털 캘리퍼를 사용하여 크기를 측정하였다.
실시예 1. 아치사량의 ROS(reactive oxygen species) 존재시 파아지 생산량 증가 확인
1-1. 아치사량(Sublethal) 농도 확정
H2O2를 순차적으로 1/2 희석하여, 고체배지에서는 0.2 mM를(표 3), 액체배지에서는 4.5 mM를(도 1) 아치사량 농도로 결정하였다.
1-2. 액체배지에서 ROS 존재 시 파아지 생산량 증가 분석
E. coli K12(MG1655)를 밤샘 배양(overnight culture)하였다. 50ml 튜브에 LB 브로스(액체배지)를 10ml 넣고 밤샘배양한 박테리아(1/100)로 1hr 신선 배양(fresh culture)을 실시하였다. OD600이 0.3에 이르면 H2O2를 4.5 mM로 처리 후 1hr 배양하였다(OD600 0.5 ~ 0.7까지).
파아지 T4를 MOI 0.001로 처리하였다. 37℃ 회전 배양기(Shaking incubator)에서 흡착을 5분간 실시하였다. 12,000rpm, 5min 원심분리 실시 후, 상등액을 제거하였다. 신선 LB 브로스(broth)를 10ml 넣어주고 재현탁을 실시하였다. 재현탁이 끝난 시점을 0min으로 37℃ 회전 배양기에 넣고 5분 간격으로 500μl씩 분주를 실시하였다. 두 겹 아가 오버레이(Double agar overlay)를 이용하여 플레이팅하고 파아지의 개수를 측정하였다.
상기와 동일한 방법으로, DNA/RNA에 손상을 입히고 아미노산과 지방산을 산화시키는 다양한 반응성산소종, 예를 들면 과산화물, 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(O2 -), 일중항산소 과산화수소(H2O2), 하이드록시 라디칼(OH), 과산화지질(lipid peroxide), 니트릭 옥사이드(NO), 퍼옥시나이트라이트(NO3 2-), 씨올퍼옥시라디칼(R-SO2 -)이 사용될 수 있으며, H2O2 처리시와 동일 또는 유사한 효과를 얻을 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 것이다.
1-3. 고체배지에서 ROS 존재 시 파아지 생산량 증가 분석
연속 희석(Serial dilution)한 파아지 용액을 아치사량 농도의 H2O2가 들어 있는 고체배지에 두 겹 아가 오버레이 방법을 이용하여 플레이팅하고 파아지의 개수를 측정하였다. 액체상태에서 아치사량 농도의 H2O2 존재하에 배양한 E. coli를 광학현미경 하에서 1000배율로 관찰하였다.
상기와 동일한 방법으로, DNA/RNA에 손상을 입히고 아미노산과 지방산을 산화시키는 다양한 반응성산소종, 예를 들면 과산화물, 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(O2 -), 일중항산소 과산화수소(H2O2), 하이드록시 라디칼(OH), 과산화지질(lipid peroxide), 니트릭 옥사이드(NO), 퍼옥시나이트라이트(NO3 2-), 씨올퍼옥시라디칼(R-SO2 -)이 사용될 수 있으며, H2O2 처리시와 동일 또는 유사한 효과를 얻을 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 것이다.
그 결과 아치사량 농도의 H2O2 존재 하에 배양한 E. coli의 형태를 관찰하면, 대조군에 비하여 길이가 길어진 미세섬유화를 관찰할 수 있다(도 2).
또한, 아치사량 농도의 H2O2 존재 하에 배양한 E. coli에 파아지 T4를 감염시켰을 때의 한 단계(one step) 증식을 관찰하면(도 3), 대조군에 비하여 burst(파열)의 시작이 5분 늦게 일어나고, burst(파열)의 size가 6배로 높아졌다.
또한, 아치사량 농도의 H2O2 존재 하에 고체상에서 배양한 파아지의 플라크 사이즈를 관찰하면(도 5), 플라크의 지름이 대조군에 비하여 5배 이상 커졌다.
박테리아가 ROS 스트레스에 반응하여 파아지 생산을 증가시키는지를 시험하였다. H2O2 아치사량 농도에서 박테리아 미세섬유화가 확연히 관찰되었다(도 2). 따라서 증가된 파아지 생산은 H2O2 존재시에 확연히 관찰되었다(도 2).
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (11)

  1. 반응성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 포함하는 박테리오파아지 생산 증가용 조성물로, 상기 ROS는 상기 박테리오파아지가 특이적으로 감염하는 숙주 박테리아에 대한 아치사량 농도로 포함되는 것인, 박테리오파아지 생산 증가용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 T4;
    상기 숙주 박테리아는 바실러스 시리우스(Bacilus cereus) 이고, 상기 박테리오파아지는 PBBC O3;
    상기 숙주 박테리아는 스테필로코커스 아우레스(Staphylococcus aures) 이고, 상기 박테리오파아지가 파아지 SA11;
    상기 숙주 박테리아는 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 PBEF 07 및 PBEF 09;
    상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) Crooks 이고, 상기 박테리오파아지는 PBEC 22, PBEC 24, 및 PBEC 82; 또는
    상기 숙주 박테리아는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aerusinosa) 이고, 상기 박테리오파아지 PA22, PA25, 또는 PA26인, 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 ROS는 H2O2 , 과산화물(superoxide), 하이드록시 라디칼, 또는 일중항 산소(singlet oxygen)인, 조성물.
  4. 박테리오파아지 생산량을 증가시키는 방법으로,
    숙주 박테리아 및 이에 특이적인 박테리오파아지를 상기 박테리아에 대한 아치사량의 반응성 산소종(ROS)의 존재 중에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 아치사량의 ROS에 의해 상기 박테리오파아지의 생산량이 향상되는 것인, 박테리오파아지 생산량을 증가시키는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 T4;
    상기 숙주 박테리아는 바실러스 시리우스(Bacilus cereus) 이고, 상기 박테리오파아지는 PBBC O3;
    상기 숙주 박테리아는 스테필로코커스 아우레스(Staphylococcus aures) 이고, 상기 박테리오파아지가 파아지 SA11;
    상기 숙주 박테리아는 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 PBEF 07 및 PBEF 09;
    상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) Crooks 이고, 상기 박테리오파아지는 PBEC 22, PBEC 24, 및 PBEC 82; 또는
    상기 숙주 박테리아는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aerusinosa) 이고, 상기 박테리오파아지 PA22, PA25, 또는 PA26인, 방법.
  6. 제 4 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ROS는 H2O2 , 과산화물(superoxide), 하이드록시 라디칼, 또는 일중항 산소(singlet oxygen)인, 방법.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양은 고체 또는 액체 배지에서 수행되며, 상기 고체 배지에서 수행되는 경우에는 상기 아치사량의 ROS 농도는 0.2 mM, 상기 액체 배지에서 수행되는 경우에는 상기 아치사량의 H2O2 농도는 4.5 mM인, 방법.
  8. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ROS는 H2O2 인, 방법.
  9. 반응성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)의 숙주 박테리아에서 박테리오파아지 생산 증가용 용도.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 T4;
    상기 숙주 박테리아는 바실러스 시리우스(Bacilus cereus) 이고, 상기 박테리오파아지는 PBBC O3;
    상기 숙주 박테리아는 스테필로코커스 아우레스(Staphylococcus aures) 이고, 상기 박테리오파아지가 파아지 SA11;
    상기 숙주 박테리아는 엔테로코커스 파에칼리스 ( Enterococcus faecalis ) 이고, 상기 박테리오파아지는 파아지 PBEF 07 및 PBEF 09;
    상기 숙주 박테리아는 대장균(Escherichia coli) Crooks 이고, 상기 박테리오파아지는 PBEC 22, PBEC 24, 및 PBEC 82; 또는
    상기 숙주 박테리아는 슈도모나스 에루지노사 ( Pseudomonas aerusinosa ) 이고, 상기 박테리오파아지 PA22, PA25, 또는 PA26인, 용도.
  11. 제 10 항 또는 제 11 항에서,
    상기 ROS는 H2O2 , 과산화물(superoxide), 하이드록시 라디칼, 또는 일중항 산소(singlet oxygen)인, 용도.
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