WO2019039899A9 - 유도만능줄기세포를 이용한 치계모세포로의 분화방법 및 이의 용도 - Google Patents

유도만능줄기세포를 이용한 치계모세포로의 분화방법 및 이의 용도 Download PDF

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장미
이진
김지혜
양지혜
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서울대학교산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane

Definitions

  • the present invention relates to a method for differentiating into dental placenta cells using inducible pluripotent stem cells, and more particularly, to a method of differentiating pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells from human derived pluripotent stem cells A method for inducing differentiation into step cell, a stepped cell differentiated by said method, and a use thereof.
  • Teeth are an organ that has not yet been correctly identified for its mechanism of formation and regeneration due to its non-regenerating properties and complicated development processes.
  • interactions between mesenchymal stem cells and epithelial stem cells play a major role in tooth development.
  • many studies have been carried out so far to secure the cells from the missing or permanent teeth, but there are technical difficulties in securing and culturing the cells.
  • tooth epithelial stem cells are difficult to isolate and secure, and thus there are fewer studies than mesenchymal stem cells.
  • Induced pluripotent stem cells are known to have an advantage in establishing various cell origins as an important material of autoimmune-cell therapy.
  • tooth-derived cells have been reported to be more efficient in establishing inducible pluripotent stem cells than other tissues. Since teeth can be banked, it is possible to obtain induced pluripotent stem cells, It is expected to be used as an important material.
  • the differentiation of dendritic cells into pluripotent stem cells using inducible pluripotent stem cells has been mainly based on animal model derived cell lines (Tissue Engineering Part A 18.15-16 (2012): 1677-1685) In this study, the culture media derived from animal stem cells were widely used, and the need for research using human - derived cells is emerging.
  • the present inventors differentiated mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells into human dental-derived pluripotent stem cells and co-cultured the two differentiated cells, Induced differentiation into dental placenta cells for tooth regeneration, and the present invention has been completed by developing a technique capable of stably supplying human derived dental placenta cells.
  • the present invention provides a method of differentiating into dental placenta cells, comprising co-culturing induced pluripotent stem cells derived from induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells.
  • the present invention provides a phagocytic cell produced by the above differentiation method.
  • the induced pluripotent stem cells may be those prepared from human-derived mesenchymal stem cells.
  • the dentinal hematopoietic stem cells may be prepared by culturing the induced pluripotent stem cells on HERS / ERM (Hertwig's Epithelial Rests of Malassez) supporting cells.
  • the mesenchymal stem cells may be differentiated from neural cells after the inducible pluripotent stem cells are cultured on PA6 supporting cells and differentiated into neural cells.
  • the co-culture may be performed for 7 to 28 days.
  • the co-cultivation is carried out by adding Dexamethasone, B-glycerophosphate, and L-ascorbic acid phosphate to MEM alpha modification medium Can be achieved in osteogenic differentiation medium.
  • the present invention provides a cell therapy agent for regenerating a tooth comprising the above-mentioned dental placenta cells.
  • the present invention provides a tooth regeneration method comprising the step of administering the teeth maturation cells to a subject.
  • the present inventors have separately differentiated from human dental-derived pluripotent stem cells in order to stably obtain dental blood stem cells and mesenchymal stem cells, which are known as major cells in tooth regeneration, and co-cultivate the two cells, To induce differentiation into germ cells.
  • the method of differentiating into dental cancellous cells according to the present invention is a method for differentiating into dental germ cells by using dendritic stem cells and mesenchymal stem cells necessary for differentiation into dental cells using patient-customized inducible pluripotent stem cells capable of establishing from somatic cells of a patient, And it is differentiated from the same induced pluripotent stem cells obtained from one tooth. Therefore, it is believed that the epigenetic memory of the induced pluripotent stem cells may be advantageous for dental tissue regeneration, As the supply can be made, it is expected to be usefully used in the field of tooth regeneration medicine.
  • FIG. 1 shows a protocol for differentiation of human dental-derived pluripotent stem cells into dental herpetoid stem cells and differentiated iPSCs differentiated according to the protocol and epithelial-like cells obtained by subculturing them ). ≪ / RTI >
  • FIG. 2A is a micrograph of a comparison of the morphology of the epithelial cells before and after subculture, which is the last step of the differentiation protocol of FIG.
  • FIG. 2B shows the results of PCR for HSP-SV40, an epithelial stem cell used as a supporting cell in the above-described differentiated iPSC-derived Epi-like cells and the above-described differentiated pluripotent stem cells, -cadherin, ABCG2, EpCAM, Bmi1, p63, and p75) and stem cell-related genes (Oct4, Nanog, and Sox2).
  • FIG. 2c is a graph showing the results of FACS analysis of the differentiated pluripotent stem cells derived from the pluripotent stem cells and HERS-SV40, showing that the mesenchymal stem cell marker (CD10 and CD29), vascular endothelial cell marker (CD31) (CD45 and HLA-DR), and the human MHC marker (HLA-1) protein.
  • CD10 and CD29 mesenchymal stem cell marker
  • CD31 vascular endothelial cell marker
  • HLA-DR human MHC marker
  • FIG. 3 shows a protocol for differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from human tooth-derived pluripotent stem cells (MSCs) and suspension-cultured cells of induced pluripotent stem cells (iPSC) and mesenchymal stem cells (P2) It is a micrograph showing the shape.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • P2 mesenchymal stem cells
  • FIG. 4A is a micrograph showing the morphology of cells during long-term culture (P1 to P17) of mesenchymal stem cells differentiated according to the protocol of FIG.
  • FIG. 4B shows the results of comparing the expression levels of N-cadherin mRNA during primary cultured host-derived mesenchymal stem cells (SHEDs) and long-term cultures (P5, P10, and P15) of the differentiated mesenchymal stem cells.
  • SHEDs primary cultured host-derived mesenchymal stem cells
  • P5, P10, and P15 long-term cultures
  • FIG. 4c shows FACS analysis of the differentiated mesenchymal stem cells, showing that mesenchymal stem cell markers (CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105), hematopoietic stem cell markers (CD14, CD34, CD45, HLA-DR), vascular endothelial cell marker (CD31), and human MHC marker (HLA-1) protein.
  • mesenchymal stem cell markers CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105
  • hematopoietic stem cell markers CD14, CD34, CD45, HLA-DR
  • CD31 vascular endothelial cell marker
  • HLA-1 human MHC marker
  • FIG. 5 shows an overall protocol for co-culturing dental herniated stem cells and mesenchymal stem cells differentiated from human tooth-derived pluripotent stem cells into dental hereditary cells.
  • FIG. 6A is a graph showing that the cells obtained by co-culturing the dendritic stem cells and the mesenchymal stem cells in the control medium ( ⁇ 5) and the osteogenic differentiation medium ( ⁇ 5-OB) (Enamelin, KLK-4) and dentate germ-related genes (BSP, OCN, DMP1, DSPP).
  • FIG. 6b shows alizarin red S staining of the cells obtained by co-culturing the dental herniated stem cells and mesenchymal stem cells with the control medium ( ⁇ 5) and the osteogenic differentiation medium ( ⁇ 5-OB), respectively.
  • control medium ⁇ 5
  • osteogenic differentiation medium ⁇ 5-OB
  • the inventors of the present invention have found that, in order to stably assemble gingival cells for tooth regeneration, human-induced pluripotent stem cells are differentiated into dendritic stem cells and mesenchymal stem cells, respectively, and then the two cells are co-
  • the present invention has been accomplished by establishing techniques for differentiation.
  • the present invention provides a method of differentiating into dental mellitus cells comprising co-culturing induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells derived from pluripotent stem cells.
  • &quot dental stem cell &quot
  • dental stem cell &quot is used to refer to a cell capable of differentiating into a dental-forming cell such as a dermal cell, an enamel cell, or a cementoblast.
  • the term " differentiation " refers to a process in which stem cells in an undifferentiated state at an early stage have characteristics as respective tissues, and it is the object of the present invention to provide a stem cell it means.
  • the term " induced pluripotent stem cell (iPSC) " refers to an embryonic stem (ES) cell that has been introduced into somatic cells differentiated as degenerated stem cells It is a cell that induces pluripotency like a cell.
  • the inducible pluripotent stem cells are cells obtained by repopulating the mesenchymal stem cells derived from human-derived size, but the type of tissue is not particularly limited as far as it is derived from human.
  • the dermal blood stem cells may be prepared by culturing the inducible pluripotent stem cells on HERS / ERM (Hertwig's Epithelial Root Sheath / Epithelial Rests of Malassez) supporting cells, but the present invention is not limited thereto.
  • HERS / ERM Hertwig's Epithelial Root Sheath / Epithelial Rests of Malassez
  • the mesenchymal stem cells may be differentiated from the neural cells after the inducible pluripotent stem cells are cultured on PA6 supporting cells to differentiate into neural cells, but the present invention is not limited thereto.
  • " co-culture " as used in the present invention means that two different cells are co-cultured in one place and can induce interaction between two cells through co-culture.
  • the dermal blood stem cells and the mesenchymal stem cells are co-cultured in the same culture dish.
  • the culturing can be performed for 7 days to 28 days, more preferably for 21 days, but is not limited thereto.
  • the co-cultivation was carried out in MEM alpha modification medium supplemented with dexamethasone, B-glycerophosphate, and L-ascorbic acid phosphate ( ⁇ 5-OB
  • the present invention is not limited thereto.
  • the present inventors induced differentiation into gingival epithelial cells through co-culture of dendritic stem cells and mesenchymal stem cells according to the above-described differentiation method.
  • induced pluripotent stem cells were first prepared from mesenchymal stem cells derived from human invasive scaffolds (see Example 1), and the pluripotent stem cells (See Example 2) and mesenchymal stem cells (see Examples 3 and 4) were differentiated to secure each of the above cells.
  • dental herniated stem cells and mesenchymal stem cells differentiated from human tooth-derived pluripotent stem cells were co-cultured for 21 days in an osteogenic differentiation medium to differentiate into gingival cells , And the expression of ameloblast and dental blast-related genes and alizarin RED staining revealed that induction of differentiation into dentate gyrus cells was induced by co-culturing in the osteogenic differentiation medium (see Example 5).
  • the present invention provides a gingival cell produced by the above differentiation method.
  • the present invention provides a cell therapy agent for regenerating teeth comprising the above-mentioned gum cells.
  • Dental caries, dental caries, attrition, abrasion, and erosion are the diseases that can be used for the cell therapy agent, and there are perioperis, If the disease is regenerative, the type is not limited.
  • the inventors of the present invention first prepared inducible pluripotent stem cells from mesenchymal stem cells derived from human-derived scaffolds to prepare human-derived pluripotent stem cells.
  • three episomal vectors of Oct-4, Sox-2, Klf-4, L-myc and Lin28 genes were constructed and transfected into the mesenchymal stem cells via electroporation (Neon-invitrogen)
  • the cells were transfected, cultured for 3 days, and then placed on SNL-supporting cells and cultured in embryonic stem cell culture medium (ESC-medium).
  • ESC-medium embryonic stem cell culture medium
  • a colony formed was subcultured on mouse embryonic fibroblast-supporting cells to prepare an induced pluripotent stem cell line.
  • Example 2 Differentiation and characterization of human dental-derived pluripotent stem cells into pluripotent stem cells
  • the present inventors used induction pluripotent stem cells prepared by the method of Example 1 to differentiate human dental-derived pluripotent stem cells into dental pulp stem cells, and according to the procedure shown in Fig. 1, the pluripotent stem cells Lt; / RTI > More specifically, 10 ⁇ g / ml of mitomycin C (MMC) (Sigma Aldrich, MO, USA, M4287) was added to HERS-SV40, an immortalized HERS / ERM cell that is primary cultured primary epithelial stem cell The cells were treated with Trypsin-EDTA (Gibco, CA, USA, 25200) for 30 min to inhibit cell division.
  • MMC mitomycin C
  • Single cells were separated and cultured in a 35 mm culture dish at a density of 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • iPSC clumps isolated from the undifferentiated state by physical methods were placed on the cultured supporter cell layer and co-cultured for 14 days in KGM-2 (Lonza, MD, USA, CC-3107) Induced differentiation into stem cells.
  • KGM-2 Longza, MD, USA, CC-3107
  • differentiated epithelial cells were treated with Accutase (Merck Millipore, MA, USA, SCR005) to separate into single cells and transferred to a new culture dish and subcultured.
  • the epithelial-like cells before the subculture (After subculture) and the subculture after the subculture were observed with an optical microscope .
  • FIG. 2A it was confirmed that the inducible pluripotent pluripotent stem cell clumps were differentiated into cells similar to epithelial cells through co-cultivation with the supporting cells, and cell morphology was maintained even after passage.
  • Example 2-2 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to determine whether epithelial-like cells differentiated by the method of Example 2-1 had epithelial cell characteristics, .
  • the cells were treated with Trypsin-EDTA to the HERS-SV40 supporting cells and the differentiated epithelial-like cells cultured for 14 days after passage, and total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany, 74106) Respectively.
  • RNeasy Mini Kit Qiagen, Germany, 74106
  • cDNA was synthesized using the extracted RNA as a template using amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, TX, USA, R5600), and the respective genes shown in the following Table 1, specifically the epithelial stem cell- (E-cadherin, ABCG2, EpCAM, Bmi1, p63, and p75) and stem cell-related genes (Oct4, Nanog, and Sox2).
  • PCR amplification products were then electrophoresed and confirmed on an electrophoretic gel recording apparatus (Bio-profil X-press zoom2000, Germany, Vilber Lourmat).
  • HERS-SV40 cell line and iPSC-derived Epi-like cell were treated with Trypsin-EDTA to separate into single cells, Formaldehyde (Junsei, Japan, 69360-0380) was treated and cells were fixed at room temperature for 10 minutes. (BD Bioscience, CA, USA, 555443).
  • the antibody and the treatment ratio used in the above were as follows: < tb > (BD Biosciences, 559866) 1: 100, CD45-FITC (eBioscience, CA, USA, 11-0459-73) 1: 100, HLA-DR-APC : 100, CD31-FITC (BD Bioscience, 555445) 1: 100, HLA-I-FITC (eBioscience, 11-9983-42) 1:50.
  • Cell surface antigen analysis was performed on 10,000 cells per each antibody using FACS Callibur (Becton Dickson, CA, USA), and the results were analyzed using BD CellQuest Pro software.
  • the two cells showed the same protein expression pattern. More specifically, CD29 was mostly expressed in the mesenchymal stem cell marker but CD10 was not expressed.
  • HLA-I a human MHC marker
  • the cells were differentiated from human dental-derived pluripotent stem cells according to the methods of Examples 2-1 to 2-4, and then immortalized to establish the epithelial stem cell line as a cell line. Briefly, the inducible pluripotent stem cells were differentiated into epithelial-like cells in the same manner as in Example 2-1, and then X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Roche, IN, USA, 06365787001) pcDNA 3.1 (+) SV40 vector and transfected into the epithelial-like cells.
  • mesenchymal stem cells which are further cells required for differentiation into gonadal cells
  • the inventors of the present invention obtained induction pluripotent stem cells from induced pluripotent stem cells prepared from human mesenchymal stem cells by the method of Example 1 To produce mesenchymal stem cells according to the procedure shown in FIG.
  • the human-derived induced pluripotent stem cells were co-cultured with PA6 cells (Riken BRC Cell Bank, Japan) to differentiate into neural crest cells.
  • PA6 cells were treated with 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, SH30919.03) and 1% antibiotic antimycotic (Gibco, CA, USA) in MEM alpha modification (Hyclone, Utah, USA, SH30265.01) , 15240), and co-cultured with the inducible pluripotent stem cells at 100% confluency after 3 days.
  • FBS fetal bovine serum
  • Gabco antibiotic antimycotic
  • the induced pluripotent stem cells were replaced and the medium was changed every 2 days thereafter.
  • the cells were detached using Accutase (Gibco, A11105-01) and dispensed into Ultra low-6 well plates (Corning, NY, USA, 3471) and cultured in DMEM / F12 (Gibco, 11320-033) (100X), 1% penicillin / streptomycin, 0.0007% 2-mercaptoethanol, B-27 Serum-Free supplement (50X) Liquid (Gibco, 17504-044), and 20ng / mL After incubation for 14 days in a neuron-forming medium supplemented with a basic fibroblast growth factor (bFGF) recombinant human protein (Gibco, 13256-029), neurons form neurospheres The medium was changed every two days.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the neurons were then collected and cultured in MEM alpha modification (Hyclone, SH30265.01) medium supplemented with 10% FBS, 1% antibiotic antimycotic, 1% MEM NEAA (100X), 10 ng / mL bFGF recombinant human protein MSC) medium in a 6-well plate.
  • MEM alpha modification Hyclone, SH30265.01
  • FBS fetal bovine serum
  • MEM NEAA 100X
  • 10 ng / mL bFGF recombinant human protein MSC 10 ng / mL bFGF recombinant human protein MSC
  • the morphology of the mesenchymal stem cells prepared according to the method of Example 3 was observed under a microscope while the mesenchymal stem cells were cultured for 17 days. As a result, as shown in FIG. 4A, it was confirmed that the morphology of the fibroblasts was continuously maintained during the long-term culture of the mesenchymal stem cells.
  • the gene expression pattern was analyzed by RT-PCR.
  • the expression level of the mesenchymal stem cell marker N-cadherin mRNA was measured, and the primary cultured mesenchymal stem cells (SHED) cultured as the control group were used.
  • the two cells were treated with trypsin-EDTA to collect the total RNAs using RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany, 74106), and then the amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, TX, USA, R5600 ), And PCR was carried out using the primers and i-max II DNA polymerase (Intron, Korea, 25261) described in Table 2 below.
  • the induced pluripotent stem cell-derived neurotrophic-mesenchymal stem cells differentiated as shown in FIG. 4B had the same level of SHED as the control group in passage 5 (P5), 10 (P10), and 15 cadherin was expressed and the expression remained constant during subculture.
  • Example 4-2 FACS analysis was performed to analyze the protein expression patterns of neural-mesenchymal stem cells differentiated from human tooth-derived pluripotent stem cells.
  • the differentiated neural-mesenchymal stem cells were cultured 5 times, treated with trypsin-EDTA to remove the cells, and the cells were fixed with 1% formaldehyde.
  • the antibody specific for the protein shown below was treated, and cell surface antigen analysis was performed using FACS Calibur (Becton Dickinson, CA, USA) and the results were analyzed using BD CellQuest Pro software.
  • CD29-PE (BD Biosciences, CA, USA, 555443) 1:50; CD44-FITC (BD Biosciences, 555478) 1:50; CD73-PE (BD Biosciences, 550257) 1:50; CD90-PE-Cy5 (BD Biosciences, 555597) 1: 100; CD105-APC (eBioscience, CA, USA, 17-1057-73) 1: 200; CD14-FITC (BD Biosciences, 555397) 1: 100; CD31-FITC (BD Biosciences, 555445) 1: 100; CD34-APC (BD Biosciences, 555824) 1: 100; CD45-FITC (eBioscience, 11-0459-73) 1: 100; CD117-PE (eBioscience, 12-1179-73) 1: 100; HLA-DR-APC (BD Biosciences, 559866) 1: 100; And HLA-I-FITC (eBioscience, 11-9983-42) 1:50.
  • CD29-PE BD Biosciences,
  • the mesenchymal stem cell markers CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105 were expressed in most of the cells of the neuron-mesenchymal stem cells.
  • hematopoietic stem cell markers CD14, CD34, CD45, and HLA-DR and CD31, a vascular endothelial cell marker were not expressed, whereas human MHC marker HLA-1 was expressed in most cells, Expression pattern.
  • Example 5 Induction and identification of differentiation into dentate germ cells through interaction of epithelial-like cell lines and mesenchymal stem cells differentiated from human tooth-derived pluripotent stem cells
  • the present inventors have conducted intensive studies to induce the differentiation into the gingival cells by inducing the interaction between the epithelium-like cell line and the mesenchymal stem cell obtained by differentiation from the human dental-derived pluripotent stem cells according to the above-mentioned methods of the present invention, Respectively.
  • trypsin-EDTA was treated with each of the inducible pluripotent stem cell-derived epithelial-like cell lines and mesenchymal stem cells prepared by the methods of Examples 2 and 3, And suspended at the same density of 10,000 cells / cm 2 and 5,000 cells / cm 2 , respectively, at the same time.
  • the culture medium was prepared by adding 0.1 ⁇ M dexamethasone (Sigma, MO, USA, D4902), 10 mM B-glycerol (0.1 mM) to the ⁇ 5 medium as a control group using ⁇ 5 medium supplemented with 5% FBS and 1% antibiotic antimycotic ( ⁇ 5-OB) supplemented with B-glycerophosphate (Sigma, 50020) and 50 ⁇ g / ml L-ascorbic acid phosphate (Sigma, A8960) And differentiation was induced.
  • dexamethasone Sigma, MO, USA, D4902
  • 10 mM B-glycerol 0.1 mM
  • Example 5-1 In order to verify whether the cells differentiated by the method of Example 5-1 were phyllotaxis cells, gene expression analysis was performed first, and co-cultured cells were cultured for 4, 8, 12, Expression was analyzed. More specifically, the cells were collected by treating with trypsin-EDTA (Gibco, CA, USA, 25200), RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany, 74106), and amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GendDEPOT, TX , USA, R5600).
  • trypsin-EDTA Gibco, CA, USA, 25200
  • RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany, 74106), and amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GendDEPOT, TX , USA, R5600).
  • Real-time PCR was performed on the synthesized cDNA using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo, Japan, QPK-201) and each gene-specific primer, and the primers were enamel- Enamelin, KLK-4, and BSP, OCN, DMP1, DSPP and the reference gene GAPDH were used, and Tm was set to 60 ° C.
  • the amplification procedure was performed in the order of 40 cycles of 94 ° C for 5 minutes, (94 ° C for 10 seconds, Tm for 30 seconds, and 72 ° C for 33 seconds), 94 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 5 seconds, and 94 ° C for 5 minutes. 2 - ⁇ CT method was used to quantify the relative quantification value.
  • enamelin and KLK-4 which are related to enamel epithelium, increased expression on days 12 and 16, and when cultured in osteogenic differentiation medium ( ⁇ 5-OB) Indicating high expression levels.
  • BSP, OCN, DMP and DSPP genes related to dentate germ cells also showed increased expression on the 12th and 16th days of differentiation and higher or similar expression levels in the osteoblastic differentiation medium ( ⁇ 5-OB).
  • Example 5-2 in order to verify whether the differentiated cells were phyllotaxis cells, alizarin red S staining was performed to confirm calcium deposition.
  • induced pluripotent stem cell-derived epithelial-like cell lines and mesenchymal stem cells were co-cultured for 21 days and then seeded with 4% paraformaldehyde (Tech & Innovation, Korea, BPP -9004) and incubated at room temperature for 10 min.
  • the cells were treated with 2% Alizarin red s (Sigma, A5533-25G) for 10 min and observed under a microscope.
  • FIG. 6B the cells co-cultured in the control medium (? 5) were not stained, whereas those co-cultured in the osteogenic differentiation medium (? 5-OB) It was confirmed that the differentiated cells were phylum cells.
  • the present invention it is possible to effectively differentiate human-derived stem cells by co-culturing the dendritic stem cells and the mesenchymal stem cells differentiated from the same induced pluripotent stem cells, And thus the obtained tooth scale cells can be usefully used in the field of tooth regeneration medicine.

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Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포를 이용한 치계모세포로의 분화방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 인간유래 유도만능줄기세포로부터 각각 분화시킨 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 이용해 치계모세포로 분화를 유도하는 방법, 상기 방법으로 분화된 치계모세포, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 치계모세포로의 분화방법은 치계세포로의 분화에 필요한 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 환자의 체세포로부터 확립이 가능한 환자맞춤형 유도만능줄기세포를 이용함으로써 자가 세포치료 시스템의 확립이 가능하며, 하나의 치아에서 얻은 동일한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 것이므로 상기 유도만능줄기세포의 후생학적 기억(epigenetic memory)으로 인해 치아조직 재생에 이점이 있을 것으로 판단되며 안정적으로 치계모세포 공급이 이루어질 수 있는바, 치아 재생의학 분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

유도만능줄기세포를 이용한 치계모세포로의 분화방법 및 이의 용도
본 발명은 유도만능줄기세포를 이용한 치계모세포로의 분화방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 인간유래 유도만능줄기세포로부터 각각 분화시킨 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 이용해 치계모세포로 분화를 유도하는 방법, 상기 방법으로 분화된 치계모세포, 및 이의 용도에 관한 것이다.
치아는 재생이 되지 않는 특성과 복잡한 발생 과정으로 인해 아직까지 형성 및 재생에 대한 메커니즘이 정확히 규명되지 않은 장기이다. 그러나 중간엽줄기세포 및 상피줄기세포의 상호작용이 치아 발생에 있어서 주요한 역할을 차지하고 있음은 보고되어 있는바, 치아재생에 관한 다양한 후속 연구를 위해 상기 두 세포를 안정적으로 다량 확보하는 것이 주요 현안으로 여겨지고 있다. 이에, 현재까지 많은 연구는 탈락된 유치나 영구치로부터 상기 세포를 확보하여 이루어지고 있으나, 세포의 안정적인 확보 및 배양에는 기술적 어려움이 있는 실정이다. 특히, 치아상피줄기세포는 분리 및 확보가 어려워 중간엽줄기세포에 비해 연구가 많이 이루어지지 못하고 있으며, 기존 연구들은 인간이 아닌 동물유래의 상피줄기세포를 주로 사용하고 있고 인간 유래 상피줄기세포를 이용한 경우에도 초기 배양한 세포를 이용하기 때문에 실험에 세포를 균일하게 공급하지 못하는 문제점을 가지고 있다. 따라서 상기와 같은 문제점들을 극복하여 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 안정적으로 확보하고 이를 이용하여 치아 재생을 위한 치계모세포로의 분화기술을 확립하는 것이 치아재생 연구 및 임상분야에서 매우 중요한 과제이다.
한편, 유도만능줄기세포는 자가면역-세포치료의 중요한 재료로써 다양한 세포기원에서 확립이 가능한 장점이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 치아유래 세포는 다른 조직을 사용했을 때보다 유도만능줄기세포의 확립 효율이 좋다는 보고가 있으며, 치아는 banking이 가능하므로 이를 활용한 유도만능줄기세포 확보가 용이하여 세포치료 및 재생치료 연구의 중요한 재료로 사용될 전망이다. 그러나 아직까지 유도만능줄기세포를 이용한 치계세포로의 분화는 동물모델유래 세포주를 이용한 연구가 주를 이루고 있으며(Tissue Engineering Part A 18.15-16 (2012): 1677-1685), 치계세포로의 분화를 위해 주로 동물 치계세포유래 조건배지가 많이 이용되고 있어 인간유래 세포를 이용한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 인간 치아유래 유도만능줄기세포를 각각 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포로 분화시켰으며, 상기 분화된 두 세포를 공동 배양하여 상호작용을 유도함으로써 치아재생을 위한 치계모세포로 분화시켰는바, 인간유래 치계모세포를 안정적으로 공급할 수 있는 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 유도만능줄기세포유래 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 공동배양하는 단계를 포함하는, 치계모세포로의 분화방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 제조된 치계모세포 및 상기 치계모세포를 포함하는 치아 재생용 세포치료제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유도만능줄기세포유래 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 공동 배양하는 단계를 포함하는, 치계모세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 제조된, 치계모세포를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 유도만능줄기세포는 인간 치수유래 중간엽줄기세포로부터 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 치계상피줄기세포는 상기 유도만능줄기세포를 HERS/ERM(Hertwig's Epithelial Root Sheath/Epithelial Rests of Malassez) 지지세포 위에 올리고 배양하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 중간엽줄기세포는 상기 유도만능줄기세포를 PA6 지지세포 위에서 배양하여 신경능 세포로 분화시킨 후, 상기 신경능 세포로부터 분화된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 공동 배양은 7일 내지 28일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 공동 배양은 MEM alpha modification 배지에 덱사메타손(Dexamethasone), B-글리세로포스페이트(B-glycerophosphate), 및 L-아스코르브산 인산(L- ascorbic acid phosphate)이 첨가된 조골 분화배지에서 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 치계모세포를 포함하는, 치아 재생용 세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 치계모세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 치아 재생방법을 제공한다.
본 발명자들은 치아 재생에 있어서 주요한 세포로 알려져 있는 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 안정적으로 확보하기 위하여 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 각각 분화시켰으며, 상기 두 세포를 공동 배양하여 상호작용을 유도함으로써 치계모세포로 분화시키는 기술을 확립하였다. 본 발명에 따른 치계모세포로의 분화방법은 치계세포로의 분화에 필요한 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 환자의 체세포로부터 확립이 가능한 환자맞춤형 유도만능줄기세포를 이용함으로써 자가 세포치료 시스템의 확립이 가능하며, 하나의 치아에서 얻은 동일한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 것이므로 상기 유도만능줄기세포의 후생학적 기억(epigenetic memory)으로 인해 치아조직 재생에 이점이 있을 것으로 판단되며 안정적으로 치계모세포 공급이 이루어질 수 있는바, 치아 재생의학 분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 치계상피줄기세포로의 분화 프로토콜, 및 상기 프로토콜에 따라 분화시킨 유도만능줄기세포(differentiated iPSC)와 이를 계대배양하여 얻은 상피유사세포(Epithelial-like cells)의 세포 형태를 보여주는 현미경 사진이다.
도 2a는 도 1의 분화 프로토콜의 마지막 과정인 계대배양 전(Before subculture)과 후(After subculture) 상피유사세포의 형태를 비교한 현미경 사진이다.
도 2b는 상기 분화된 유도만능줄기세포 유래 상피유사세포(iPSC-derived Epi-like cell) 및 상기 프로토콜에서 지지세포로 이용한 상피줄기세포인 HERS-SV40에 대하여 PCR을 통해 상피줄기세포 관련 유전자(E-cadherin, ABCG2, EpCAM, Bmi1, p63, 및 p75) 및 줄기세포 관련 유전자(Oct4, Nanog, 및 Sox2)의 발현 양상을 비교한 결과이다.
도 2c는 상기 분화된 유도만능줄기세포 유래 상피유사세포 및 HERS-SV40에 대하여 FACS 분석을 실시하여 중간엽줄기세포 표지인자(CD10 및 CD29), 혈관내피세포 표지인자(CD31), 조혈모세포 표지인자(CD45 및 HLA-DR), 및 인간 MHC 표지인자(HLA-1) 단백질의 발현수준을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 3은 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 중간엽줄기세포(MSC)로의 분화 프로토콜, 및 상기 분화 과정에서 유도만능줄기세포(iPSC)의 부유배양된 세포 및 분화 후 중간엽줄기세포(P2)의 형태를 보여주는 현미경 사진이다.
도 4a는 도 3의 프로토콜에 따라 분화된 중간엽줄기세포를 장기배양(P1~P17) 하는 동안 세포의 형태를 보여주는 현미경 사진이다.
도 4b는 일차배양된 유치 치수유래 중간엽줄기세포(SHEDs) 및 상기 분화된 중간엽줄기세포의 장기배양(P5, P10, 및 P15) 동안 N-cadherin mRNA의 발현수준을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 4c는 상기 분화된 중간엽줄기세포에 대하여 FACS 분석을 실시하여 중간엽줄기세포 표지인자(CD29, CD44, CD73, CD90, 및 CD105), 조혈모세포 표지인자(CD14, CD34, CD45, CD117, 및 HLA-DR), 혈관내피세포 표지인자(CD31), 및 인간 MHC 표지인자(HLA-1) 단백질의 발현수준을 나타낸 결과이다.
도 5는 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 공동 배양하여 치계모세포로 분화시키는 전체적인 프로토콜을 도시한 것이다.
도 6a는 상기 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 대조군 배지(α5) 및 조골분화배지(α5-OB)에서 각각 공동 배양하여 분화시킨 세포가 치계모세포임을 검증하기 위해, 법랑모세포관련 유전자(Enamelin, KLK-4) 및 치아모세포관련 유전자(BSP, OCN, DMP1, DSPP)의 발현수준을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 6b는 상기 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 대조군 배지(α5) 및 조골분화배지(α5-OB)에서 각각 공동 배양하여 분화시킨 세포에 대하여 알리자린 레드 에스(alizarin red S) 염색을 실시하여 칼슘 침착여부를 비교 분석한 결과이다.
본 발명자들은 치아재생을 위한 치계모세포를 안정적으로 확보하기 위해, 인간유래 유도만능줄기세포를 각각 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포로 분화시킨 후 상기 두 세포를 공동 배양하여 치계모세포로 분화시키는 기술을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 유도만능줄기세포유래 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 공동 배양하는 단계를 포함하는 치계모세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치계모세포(dental stem cell)”란 상아모세포, 법랑질모세포, 시멘트질모세포와 같은 치아를 형성하는 세포로 분화 가능한 모세포를 아울러 이르는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “분화(differentiation)”란 초기 단계의 미분화 상태의 줄기세포가 각 조직으로써의 특성을 갖게 되는 과정을 일컫는 것으로서, 본 발명의 목적상 치계모세포로서의 특성을 지니게 되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)”란 역분화 줄기세포로써 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌린, 배아 줄기세포처럼 만능성을 유도해낸 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서, 유도만능줄기세포는 인간 유치 치수유래 중간엽줄기세포를 역분화시켜 얻은 세포이나, 인간유래의 것이라면 조직의 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 치계상피줄기세포는 상기 유도만능줄기세포를 HERS/ERM(Hertwig's Epithelial Root Sheath/Epithelial Rests of Malassez) 지지세포 위에 올리고 배양하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 상기 유도만능줄기세포를 PA6 지지세포 위에서 배양하여 신경능 세포로 분화시킨 후, 상기 신경능 세포로부터 분화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “공동 배양(co-culture)”이란, 서로 다른 2가지 세포를 한 곳에서 함께 배양하는 것을 의미하며, 공동 배양을 통해 두 세포 간의 상호작용을 유도할 수 있다. 본 발명에서는 상기 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 동일한 배양접시에 분주하고 공동 배양 하였으며, 배양은 7일 내지 28일, 보다 바람직하게는 21일 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱이, 상기 공동 배양은 MEM alpha modification 배지에 덱사메타손(Dexamethasone), B-글리세로포스페이트(B-glycerophosphate), 및 L-아스코르브산 인산(L- ascorbic acid phosphate)이 첨가된 조골분화배지(α5-OB)에서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 실시예를 통해 상기 분화방법에 따라 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포의 공동 배양을 통해 치계모세포로의 분화를 유도하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 먼저 인간 유치 치수유래의 중간엽줄기세포로부터 유도만능줄기세포를 제조하였고(실시예 1 참조), 상기 유도만능줄기세포로부터 각각 다른 방법을 통해 치계상피줄기세포(실시예 2 참조) 및 중간엽줄기세포(실시예 3 및 4 참조)를 분화시켜 상기 각 세포들을 확보하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 실시예에서 인간 치아유래 유도만능줄기세포에서 분화시킨 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 조골분화배지에서 21일 동안 공동 배양하여 치계모세포로의 분화를 유도하였으며, 법랑모세포 및 치아모세포 관련 유전자의 발현 분석과 알리자린 레드 에스 염색을 통해 상기 조골분화배지에서 공동 배양한 경우 치계모세포로의 분화가 유도되었음을 확인하였다(실시예 5 참조).
상기 실시예 결과로부터, 본 발명에 따른 분화방법을 통해 치계모세포로의 분화가 잘 이루어졌음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 제조된 치계모세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조된 치계모세포를 포함하는 치아 재생용 세포치료제를 제공한다.
상기 세포치료제가 이용될 수 있는 질환은 치과경조직 질환인 치아우식증(dental caries), 교모증(attrition), 마모증(abrasion), 및 침식증(erosion)이 있으며 그 외에 치주염(perioperis)이 있으나, 치아 재생이 필요한 질환이라면 그 종류가 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인간 치아유래 유도만능줄기세포의 제조
본 발명자들은 먼저 인간유래 유도만능줄기세포를 제조하기 위하여, 인간 유치 치수유래의 중간엽줄기세포로부터 유도만능줄기세포를 제조하고자 하였다. 이를 위해, Oct-4, Sox-2, Klf-4, L-myc, Lin28 유전자를 3개의 에피소말 벡터로 제작하여 전기천공법(electroporation)(Neon-invitrogen)을 통해 상기 중간엽줄기세포에 트랜스펙션(transfection)시키고 3일간 배양 후 SNL-지지세포 위에 올려 배아줄기세포 배양배지(ESC-medium)로 배양하였다. 이후 형성된 콜로니(colony)를 마우스 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)-지지세포 위에 계대배양하여 유도만능줄기세포주를 제조하였다. 상기 방법으로 배양하여 얻은 유도만능줄기세포는 20계대 이상 유지되었으며, 전능성 마커(pluripotent marker)인 Oct-4, Nanog, Sox-2, Tra-1-60, Tra-1-81, 및 SSEA-4 단백질이 모두 발현되며, 3배엽으로 모두 분화가 가능함을 확인함으로써 유도만능줄기세포의 특성을 지니는 것을 확인하였다.
실시예 2. 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 치계상피줄기세포로의 분화 및 특성 확인
2-1. 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 치계상피줄기세포로의 분화 유도
본 발명자들은 인간 치아유래 유도만능줄기세포를 치계상피줄기세포로 분화시키기 위하여, 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 유도만능줄기세포를 이용하여 도 1에 도시한 과정에 따라 치계상피줄기세포로의 분화를 유도하였다. 보다 구체적으로, 영구치유래 일차배양 상피줄기세포인 HERS/ERM 세포를 불멸화시킨 세포주 HERS-SV40에 10 μg/ml의 미토마이신 C(Mitomycin C; MMC)(Sigma Aldrich, MO, USA, M4287)를 1시간 30분 동안 처리하여 세포분열을 억제한 다음, Trypsin-EDTA(Gibco, CA, USA, 25200) 처리하여 단일세포로 분리한 후 35 mm 배양 접시에 1 X 106개씩 분주하여 배양하였다. 24시간 후 물리적 방법으로 떼어낸 미분화 상태의 유도만능줄기세포(iPSC) 클럼프를 상기 배양된 지지세포층 위에 얹고 KGM-2(Lonza, MD, USA, CC-3107) 배지에서 14일 동안 공동 배양하여 상피줄기세포로의 분화를 유도하였다. 이후 분화된 상피유사세포에 Accutase(Merck millipore, MA, USA, SCR005)를 처리하여 단일세포로 분리한 후 새로운 배양접시에 옮겨 계대배양(subculture)하였다.
2-2. 분화된 상피유사세포의 형태 관찰
상기 실시예 2-1의 방법에 따라 분화된 상피유사세포의 형태를 관찰하기 위해, 계대배양 전의 상피유사세포(Before subculture)와 계대배양 후의 상피유사세포(After subculture)를 각각 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 미분화 상태의 유도만능줄기세포 클럼프가 상기 지지세포와의 공동 배양을 통해 상피세포와 유사한 형태의 세포로 분화되었고, 계대배양 후에도 세포 형태가 유지되는 것을 확인하였다.
2-3. 분화된 상피유사세포의 유전자 발현 양상 분석
상기 실시예 2-2의 결과에 더하여, 실시예 2-1의 방법으로 분화된 상피유사세포가 상피세포의 특성을 갖는지 알아보기 위해 RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하여 유전자 발현 양상을 분석하고자 하였다. 이를 위해, HERS-SV40 지지세포와 계대 후 14일 동안 배양한 분화된 상기 상피유사세포에 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내고 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Germany, 74106)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 다음으로, 상기 추출한 RNA를 주형으로 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT, TX, USA, R5600)를 이용해 cDNA를 합성하였으며, 상기 cDNA에 대하여 하기 표 1에 나타낸 각 유전자, 구체적으로 상피줄기세포 관련 유전자(E-cadherin, ABCG2, EpCAM, Bmi1, p63, 및 p75) 및 줄기세포 관련 유전자(Oct4, Nanog, 및 Sox2)에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 증폭 과정은 PCR 장비(T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 94℃ 2분, (94℃ 20초, Tm 15초, 72℃ 30초)x cycles, 72℃ 5분의 조건으로 각각 E-cadherin, p63, Nanog, 및 Sox2는 Tm=55℃에서 35 cycles, Oct4는 Tm=57℃에서 35 cycles, ABCG2, EpCAM, Bmi1, 및 p75는 Tm=60℃에서 40 cycles, GAPDH는 Tm=60℃에서 28 cycles로 실행하였다. 이후 PCR 증폭산물은 전기영동을 실시하여 전기영동 겔 기록장치(Bio-profil X-press zoom2000, Germany, Vilber Lourmat)에서 확인하였다.
유전자 방향 서열(5'-3') 서열번호
E-cadherin Forward TGC CCA GAA AAT GAA AAA GG 1
Reverse GTG TAT GTG GCA ATG CGT TC 2
ABCG2 Forward CCA CAG GTG GAG GCA AAT CT 3
Reverse TCG CGG TGC TCC ATT TAT CA 4
EpCAM Forward GCT GGC CGT AAA CTG CTT TG 5
Reverse ACA TTT GGC AGC CAG CTT TG 6
Bmi1 Forward CAG CCC AGC AGG AGG TAT TC 7
Reverse GGA TGA GGA GAC TGC ACT GG 8
p63 Forward ATG TTG TAC CTG GAA AAC AAT GC 9
Reverse GTG ATG GAG AGA GAG CAT CGA A 10
p75 Forward ACC GAG CTG GAA GTC GAG 11
Reverse CTC ACC GCT GTG TGT GTA C 12
Oct4 Forward ACC CCT GGT GCC GTG AA 13
Reverse GGC TGA ATA CCT TCC CAA ATA 14
Nanog Forward CCT ATG CCT GTG ATT TGT GG 15
Reverse TTC TCT GCA GAA GTG GGT TG 16
Sox2 Forward GAC TTC ACA TGT CCC AGC AC 17
Reverse GGG TTT TCT CCA TGC TGT TT 18
GAPDH Forward GAT GCT GGC GCT GAG TAC G 19
Reverse GCT AAG CAG TTG GTG GTG C 20
실험결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, HERS-SV40 세포주와 분화된 유도만능줄기세포유래 상피유사세포(iPSC-derived Epi-like cell)는 상피줄기세포 관련 유전자인 E-cadherin, ABCG2, EpCAM, Bmi1, p63, 및 p75와 줄기세포관련 유전자인 Oct4, Nanog, 및 Sox2에서 모두 비슷한 발현 패턴을 나타내는 것을 관찰하였다. 상기 결과를 통해 분화된 상피유사세포가 상피세포의 특성을 나타내는 것을 확인하였다.
2-4. 분화된 상피유사세포의 단백질 발현 양상 분석
상기 실시예 2-3의 유전자 발현 분석결과에 더하여 단백질 발현 양상을 분석하기 위해, FACS 분석을 실시하여 세포 표지인자의 발현수준을 관찰하고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 2-3과 동일하게 HERS-SV40 세포주와 유도만능줄기세포유래 상피유사세포(iPSC-derived Epi-like cell)를 Trypsin-EDTA를 처리하여 단일세포로 분리한 후 1% 포름알데히드(Formaldehyde)(Junsei, Japan, 69360-0380)를 처리하고 10분간 상온에서 세포를 고정시켰다. 다음으로 각각 세포에 확인하고자 하는 단백질에 특이적인 항체를 넣고 4℃에서 30분 동안 처리하였으며, 상기에서 이용한 항체 및 처리비율은 다음과 같다: CD29-PE (BD Bioscience, CA, USA, 555443) 1:50, CD10-PE-Cy5 (BD Biosciences, 555376) 1:100, CD45-FITC (eBioscience, CA, USA, 11-0459-73) 1:100, HLA-DR-APC (BD Bioscience, 559866) 1:100, CD31-FITC (BD Bioscience, 555445) 1:100, HLA-I-FITC (eBioscience, 11-9983-42) 1:50. 이후 각 항체 당 10,000개의 세포를 FACS Callibur(Becton Dicknson. CA, USA)를 이용하여 세포표면 항원 분석을 시행하였으며 BD CellQuest Pro 소프트웨어를 이용해 결과를 분석하였다.
분석 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 상기 두 세포는 동일한 단백질 발현 패턴을 보였는데, 보다 상세하게 중간엽줄기세포 표지인자 중 CD29는 대부분 발현되었으나 CD10은 발현되지 않았고, 조혈모세포 표지인자인 CD45 및 HLA-DR과 혈관내피세포 표지인자인 CD31은 발현되지 않은 반면 인간 MHC 표지인자인 HLA-I는 대부분의 세포에서 발현되는 것을 관찰하였다. 상기 결과를 통해 분화된 상피유사세포가 상피세포의 특성을 갖는 것을 확인하였다.
2-5. 불멸화 유도를 통한 치계상피줄기세포주 제조
상기 실시예 2-1 내지 2-4의 방법에 따라 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 후 상피세포의 특성이 확인된 치계상피줄기세포를 세포주로 확립하기 위하여 불멸화시키고자 하였다. 간단하게, 상기 실시예 2-1에서와 동일한 방법으로 상기 유도만능줄기세포를 상피유사세포로 분화시킨 후 SV40 유전자를 도입하기 위해 X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent(Roche, IN, USA, 06365787001)를 pcDNA 3.1 (+) SV40 vector와 혼합하여 상기 상피유사세포에 트랜스펙션(transfection)하였다. 48시간 후 100 μg/ml의 G418(Cellgro Mediatech, DC, USA, 61-234-RF)을 처리하여 pcDNA 3.1 (+) SV40가 도입된 세포를 14일 동안 선별함으로써 불멸화된 치계상피줄기세포주를 수득하였다.
실시예 3. 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 중간엽줄기세포로의 분화
본 발명자들은 치계모세포로의 분화에 필요한 또 다른 세포인 중간엽줄기세포를 확보하기 위하여, 상기 실시예 1의 방법에 따라 인간 유치 치수유래 중간엽줄기세포로부터 제조한 유도만능줄기세포로부터 도 3에 도시한 과정에 따라 중간엽줄기세포를 제조하고자 하였다.
보다 구체적으로, 상기 인간유래 유도만능줄기세포를 신경능 세포(neural crest cell)로 분화시키기 위해 PA6 세포(Riken BRC Cell Bank, Japan)와 함께 공동 배양 하였다. 상기 PA6 세포는 MEM alpha modification(Hyclone, Utah, USA, SH30265.01) 배지에 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS)(Hyclone, SH30919.03) 및 1% antibiotic antimycotic(Gibco, CA, USA, 15240)이 함유된 a10 배지를 이용해 6웰 플레이트에서 배양하였고, 3일 후 100% confluency를 보일 때 상기 유도만능줄기세포와 공동 배양하였으며, 이때 GMEM(Gibco, 11710-035)에 10% 넉아웃 혈청 대체제(knockout serum replacement; KSR)(Gibco, 10828-028), 1% MEM 비필수아미노산(Non-Essential Amino Acid; NEAA)(100X)(Gibco, 11140-050), 1% 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate)(Gibco, 11360-070), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin Streptomycin)(Gibco, 15140), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)(Sigma, MO, USA, M7522)이 첨가된 신경능 배지(Neural crest medium)에서 공동 배양하였다. 상기 유도만능줄기세포는 미분화 상태의 콜로니를 물리적으로 분리한 다음 Trypsin-EDTA(Gibco, 25300)를 처리하여 단일세포 상태로 만들어 한 웰당 1x105 개씩 세포를 분주하였다. 4일 후 상기 유도만능줄기세포가 자리를 잡으면 배지를 갈아주었고, 그 이후부터는 2일 마다 배지를 갈아주었다. 공동 배양 14일 후, Accutase(Gibco, A11105-01)를 이용하여 세포를 떼어내어 Ultra low-6웰 플레이트(Corning, NY, USA, 3471)에 분주하고 DMEM/F12(Gibco, 11320-033) 배지에 1% MEM NEAA(100X), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.0007% 2-머캅토에탄올, B-27 무혈청 첨가제(Serum-Free supplement)(50X) Liquid (Gibco, 17504-044), 및 20ng/mL 염기성 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF) 재조합 인간 단백질(Gibco, 13256-029)이 첨가된 신경능 형성 배지에서 14일 동안 부유배양하여 신경능세포가 신경구(neurosphere)를 형성하도록 하였으며 2일마다 배지를 갈아주었다. 이후 형성된 신경구를 모아서 MEM alpha modification(Hyclone, SH30265.01) 배지에 10% FBS, 1% antibiotic antimycotic, 1% MEM NEAA(100X), 10 ng/mL bFGF 재조합 인간 단백질이 첨가된 NMSC(Neural crest derived MSC) 배지를 이용해 6웰 플레이트에서 배양하였다. 상기 과정에 따라 유도만능줄기세포를 배양한 결과 섬유아세포 형태의 세포로 변하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 인간 치아유래 유도만능줄기세포에서 분화된 신경능-중간엽줄기세포의 특성 분석
4-1. 분화된 신경능-중간엽줄기세포의 형태 관찰
상기 실시예 3의 방법에 따라 제조한 중간엽줄기세포의 형태를 관찰하기 위해, 상기 중간엽줄기세포를 17계대까지 장기배양하면서 현미경으로 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 상기 중간엽줄기세포를 장기 배양하는 동안 섬유아세포의 형태가 지속적으로 유지되는 것을 확인하였다.
4-2. 분화된 신경능-중간엽줄기세포의 유전자 발현 양상 분석
상기 실시예 3의 방법에 따라 분화된 유도만능줄기세포유래 신경능-중간엽줄기세포의 특성을 좀 더 알아보기 위하여 RT-PCR을 통해 유전자 발현 양상을 분석하고자 하였다. 이를 위해, 중간엽줄기세포 표지자인 N-cadherin mRNA의 발현수준을 측정하였으며, 이때 대조군으로는 일차배양된 유치 치수유래 중간엽줄기세포(SHED)를 이용하였다. 보다 구체적으로, 상기 2가지 세포에 Trypsin-EDTA 처리하여 세포를 모으고 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Germany, 74106)를 이용하여 총 RNA를 추출한 다음, amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT, TX, USA, R5600)로 cDNA 합성을 진행하였으며, 하기 표 2에 기재한 프라이머 및 i-max II DNA polymerase(Intron, Korea, 25261)를 이용해 PCR을 진행하였다. PCR을 통한 증폭과정은 PCR 장비(T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 94℃ 2분, (94℃ 20초, Tm 15초, 72℃ 30초)x cycles, 72℃ 5분의 조건으로 각각 N-cadherin은 Tm=55℃에서 35cycles로, reference 유전자인 GAPDH는 Tm=60℃에서 28 cycles로 실행하였다.
유전자 방향 서열(5'-3') 서열번호
N-cadherin Forward ACA GTG GCC ACC TAC AAA GG 21
Reverse CCG AGA TGG GGT TGA TAA TG 22
실험결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 분화된 유도만능줄기세포유래 신경능-중간엽줄기세포는 계대 5(P5), 10(P10), 및 15(P15)에서 대조군인 SHED와 동일한 수준으로 N-cadherin을 발현하였으며 계대배양 동안 발현이 지속적으로 유지되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과를 통해 지속적인 배양에도 중간엽줄기세포의 특성이 유지되는 것을 확인하였다.
4-3. 분화된 신경능-중간엽줄기세포의 단백질 발현 양상 분석
상기 실시예 4-2의 유전자 발현 분석결과에 더하여 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 신경능-중간엽줄기세포의 단백질 발현 양상을 분석하기 위해, FACS 분석을 실시하였다. 이를 위해, 분화된 신경능-중간엽줄기세포를 5회 계대배양한 후 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내고 1% 포름알데히드를 이용해 세포를 고정시켰다. 다음으로 하기에 나타낸 단백질에 특이적인 항체를 처리한 후 FACS Calibur(Becton Dickinson, CA, USA)로 세포표면 항원분석을 실시하였으며, BD CellQuest Pro 소프트웨어를 이용해 결과를 분석하였다. 상기에서 이용한 항체 및 처리 비율은 다음과 같다: CD29-PE (BD Biosciences, CA, USA, 555443) 1:50; CD44-FITC (BD Biosciences, 555478) 1:50; CD73-PE (BD Biosciences, 550257) 1:50; CD90-PE-Cy5 (BD Biosciences, 555597) 1:100; CD105-APC (eBioscience, CA, USA, 17-1057-73) 1:200; CD14-FITC (BD Biosciences, 555397) 1:100; CD31-FITC (BD Biosciences, 555445) 1:100; CD34-APC (BD Biosciences, 555824) 1:100; CD45-FITC (eBioscience, 11-0459-73) 1:100; CD117-PE (eBioscience, 12-1179-73) 1:100; HLA-DR-APC (BD Biosciences, 559866) 1:100; 및 HLA-I-FITC (eBioscience, 11-9983-42) 1:50.
실험결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 상기 신경능-중간엽줄기세포의 경우 중간엽줄기세포 표지자인 CD29, CD44, CD73, CD90, 및 CD105가 대부분의 세포에서 발현되었다. 또한, 조혈모세포 표지자인 CD14, CD34, CD45, 및 HLA-DR과 혈관내피세포 표지인자인 CD31은 발현되지 않은 반면 인간 MHC 표지자인 HLA-1은 대부분의 세포에서 발현되어 중간엽줄기세포와 유사한 단백질 발현 양상을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 5. 인간 치아유래 유도만능줄기세포에서 분화된 상피유사세포주 및 중간엽줄기세포의 상호작용을 통한 치계모세포로의 분화 유도 및 확인
5-1. 치계모세포로의 분화 유도
본 발명자들은 상기 실시예 방법들에 따라 인간 치아유래 유도만능줄기세포로부터 분화시켜 얻은 상피유사세포주와 중간엽줄기세포를 공동 배양하여 두 세포 간 상호작용을 유도함으로써 치계모세포로의 분화를 유도하고자 하였다. 이를 위해, 도 5에 그림으로 도시한 바와 같이 상기 실시예 2 및 3의 방법을 통해 제조한 각각의 상기 유도만능줄기세포유래 상피유사세포주 및 중간엽줄기세포에 Trypsin-EDTA를 처리하여 단일세포로 부유시킨 후 각각 10,000 cells/cm2 및 5,000 cells/cm2 밀도로 동일한 배양접시에 동시에 분주하였다. 배양배지는 MEM alpha modification에 5% FBS 및 1% antibiotic antimycotic이 첨가된 α5배지 조건을 대조군으로 하여 상기 α5배지에 0.1 μM 덱사메타손(Dexamethasone)(Sigma, MO, USA, D4902), 10 mM B-글리세로포스페이트(B-glycerophosphate)(Sigma, 50020), 및 50 ug/ml L-아스코르브산 인산(L-ascorbic acid phosphate)(Sigma, A8960)이 첨가된 조골분화배지(α5-OB)를 이용해 21일간 배양하여 분화를 유도하였다.
5-2. 분화된 치계모세포의 유전자 발현 분석
상기 실시예 5-1의 방법으로 분화시켜 얻은 세포가 치계모세포인지를 검증하기 위하여, 먼저 유전자 발현 분석을 실시하였으며, 공배양한 세포는 4, 8, 12, 및 16일 동안 분화 유도 후 유전자 발현을 분석하였다. 보다 상세하게, Trypsin-EDTA(Gibco, CA, USA, 25200)를 처리하여 세포를 모으고 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Germany, 74106)을 이용하여 RNA를 추출하였으며, amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GendDEPOT, TX, USA, R5600)로 cDNA 합성을 진행하였다. 이후 합성된 cDNA에 대하여 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo, Japan, QPK-201)와 각각의 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 Realtime PCR을 실시하였으며, 프라이머는 하기 표 3에 기재한 바와 같이 법랑모세포 관련 유전자인 Enamelin, KLK-4와 치아모세포관련 유전자인 BSP, OCN, DMP1, DSPP 그리고 reference 유전자인 GAPDH에 특이적인 것을 사용하였고 Tm=60˚C로 설정하였다. 증폭 과정은 94℃ 5분, (94℃ 10초, Tm℃ 30초, 72℃ 33초) x 40 cycles, 94℃ 10초, 65℃ 5초, 94℃ 5분의 순서로 진행하였으며, 데이터는 2-△CT방법을 이용하여 상대정량 값을 수치화하였다.
유전자 방향 서열(5'-3') 서열번호
Enamelin Forward TCC ACG GAA ATC CTC AGC AC 23
Reverse GGG GGT TGA GCT TCC TCT TC 24
KLK-4 Forward GAT CGC TCG TCT CTG GTA GC 25
Reverse GAG TTC TGG AAA CAG TGT GCG 26
BSP Forward AAG GCT ACG ATG GCT ATG ATG GT 27
Reverse AAT GGT AGC CGG ATG CAA AG 28
OCN Forward ATC CTT TGG GGT TTG GCC TAC 29
Reverse GCC AAT AGG GCG AGG AGT G 30
DMP1 Forward ACA GGC AAA TGA AGA CCC 31
Reverse TTC ACT GGC TTG TAT GG 32
DSPP Forward GCC AGA GCA AGT CTG GTA ACG GT 33
Reverse TGT CTC TGC AGG AGT TAG GTC TTG GT 34
실험 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 법랑모세포 관련 유전자인 Enamelin과 KLK-4가 12일, 16일에서 발현이 증가하였으며 대조군 배지(α5)에서보다 조골분화 배지(α5-OB)에서 배양하였을 때 더 높은 발현수준을 나타내었다. 또한 치아모세포관련 유전자인 BSP, OCN, DMP, DSPP 역시 분화 12일과 16일째에 발현이 증가하였으며 조골분화 배지(α5-OB)에서 더 높거나 비슷한 발현수준을 나타내었다.
5-3. 칼슘 침착 여부 분석
상기 실시예 5-2의 결과에 더하여, 분화시켜 얻은 세포가 치계모세포인지를 검증하기 위해 알리자린 레드 에스(alizarin red S) 염색을 통해 칼슘 침착 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 상기 과정에 따라 유도만능줄기세포유래 상피유사세포주 및 중간엽줄기세포를 21일 동안 공동 배양 한 후 분화시킨 세포에 4% 파라포름알데히드(4% paraformaldehyde)(Tech & Innovation, Korea, BPP-9004)를 처리하고 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 2% Alizarin red s(Sigma, A5533-25G)를 10분 동안 처리한 후 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 대조군 배지(α5)에서 공동 배양한 세포의 경우에는 염색되지 않은 반면, 조골분화배지(α5-OB)에서 공동 배양한 세포는 붉게 염색된 것을 관찰하였으며, 이를 통해 상기 분화된 세포가 치계모세포임을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따르면 동일한 유도만능줄기세포에서 분화시킨 치계상피줄기세포와 중간엽줄기세포를 공동배양함으로써 인간유래 치계모세포를 효과적으로 분화시킬 수 있는바, 상기 분화방법은 치계모세포를 안정적으로 공급하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이며, 이를 통해 수득되는 치계모세포는 치아 재생의학 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims (9)

  1. 유도만능줄기세포유래 치계상피줄기세포 및 중간엽줄기세포를 공동 배양하는 단계를 포함하는, 치계모세포로의 분화방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유도만능줄기세포는 인간 치수유래 중간엽줄기세포로부터 제조된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 치계상피줄기세포는 상기 유도만능줄기세포를 HERS/ERM(Hertwig's Epithelial Root Sheath/Epithelial Rests of Malassez) 지지세포 위에 올리고 배양하여 제조된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중간엽줄기세포는 상기 유도만능줄기세포를 PA6 지지세포 위에서 배양하여 신경능 세포로 분화시킨 후, 상기 신경능 세포로부터 분화된 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 공동 배양은 7일 내지 28일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 공동 배양은 MEM alpha modification 배지에 덱사메타손(Dexamethasone), B-글리세로포스페이트(B-glycerophosphate), 및 L-아스코르브산 인산(L- ascorbic acid phosphate)이 첨가된 조골 분화배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 분화방법.
  7. 제1항의 분화방법에 의해 제조된, 치계모세포.
  8. 제7항의 치계모세포를 포함하는, 치아 재생용 세포치료제.
  9. 제7항의 치계모세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 치아 재생방법.
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