WO2018221716A1 - ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する防御効果を提供するＩｇＹ抗体含有餌料 - Google Patents

ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する防御効果を提供するＩｇＹ抗体含有餌料 Download PDF

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toxin
vibrio
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ahpnd
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育生 廣野
秀裕 近藤
梨夏 中村
山本　雅一
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国立大学法人東京海洋大学
株式会社くろいし
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for controlling shrimp infections caused by Vibrio spp. Expressing toxin A and toxin B, and shrimp toxin A comprising administering or ingesting the composition to shrimp
  • the present invention relates to a method for controlling shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxin B.
  • EMS or AHPND Early Death Syndrome or Acute Liver Pancreatic Necrosis; hereinafter referred to as EMS / AHPND in this specification
  • EMS or AHPND is a shrimp infectious disease whose damage has been spreading in recent years.
  • Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus
  • Vibrio parahemolyticus is permanently present in seawater, but only a special type of Vibrio parahemolyticus has been found to be pathogenic to shrimp. It has been reported that Toxin A and Toxin B produced by Vibrio parahaemolyticus act as a lethal factor for shrimp (Non-Patent Documents 1 and 2). Also, in tests using toxin A or toxin B recombinants, when both toxin A and toxin B are present, EMS / AHPND pathology occurs and mortality increases in a dose-dependent manner. It has been reported that no mortality is observed when either A or toxin B is present alone (Non-patent Document 3).
  • Vibrio campbellii Other species of the genus Vibrio, Vibrio owensii, Vibrio harveyi, or Vibrio campbellii also express toxins A and B and cause EMS / AHPND (Non-Patent Documents 4 to 6).
  • the method for controlling an infectious disease by passive immunization is a method for controlling an infectious disease caused by a pathogen by administering or ingesting an antibody against the pathogen to a subject.
  • shrimps it has been reported that an infection control effect was obtained by oral administration of chicken egg-derived IgY using a pathogen as an antigen (Patent Document 1, Non-Patent Document 7).
  • IgY is an immunoglobulin possessed by chickens and exists mainly in egg yolk.
  • IgY specific to the antigen is produced and then transferred to the yolk in the egg, so that specific antibodies can be produced in large quantities at low cost without sacrificing the life of the animal. It is attracting attention as a method that can be easily produced.
  • Non-Patent Document 7 describes the use of IgY that uses the bacterial body of Vibrio parahemolyticus itself as an antigen.
  • the survival rate is only about 60% (that is, the lethality is suppressed to about 40% by taking IgY).
  • the present invention relates to a composition for controlling shrimp infections caused by Vibrio spp. Expressing toxin A and toxin B, and shrimp toxin A comprising administering or ingesting the composition to shrimp
  • a method for controlling shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxin B is provided.
  • the treatment method includes a control method, a therapeutic method and a prevention method.
  • Control methods include treatment methods and prevention methods.
  • the present invention may be as follows.
  • a composition for controlling shrimp infections caused by Vibrio bacteria expressing toxins A and B the composition comprising an antibody against toxin A.
  • Vibrio bacteria expressing toxins A and B are Vibrio parahaemolyticus, Vibrio owensii, Vibrio harveyi expressing toxins A and B, or The composition according to [1] above, which is Vibrio campbellii.
  • the composition according to [1] or [2] above, wherein the antibody against toxin A is a chicken egg antibody obtained from a chicken egg immunized with toxin A.
  • the infectious disease is shrimp early death syndrome / acute liver pancreatic necrosis (EMS / AHPND).
  • composition according to [1] or [2] above, wherein the composition is a shrimp feed.
  • the whole egg powder containing an antibody against toxin A is contained in an amount of 0.1% to 20% based on the weight of the composition.
  • compositions comprising an antibody against Vibrio spp.
  • Toxin A is effective for controlling infections caused by Vibrio spp. That effectively express toxins A and B.
  • the composition of the present invention can reduce the mortality of shrimp by EMS / AHPND to 20% or less.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of an infection experiment.
  • the vertical axis shows the cumulative mortality rate, and the horizontal axis shows the time after immersion infection of AHPND cells.
  • Control is the group fed with chicken egg powder derived from non-immunized chicken
  • A is the group fed with the whole egg powder of test group A
  • B contains the whole egg powder of test group B
  • AB represents a group fed with a food containing whole egg powder of test group AB
  • ABmix represents a group fed with a food containing whole egg powder of test group ABmix
  • FIG. 2 is a graph showing the results of an infection experiment.
  • the vertical axis shows the cumulative mortality rate, and the horizontal axis shows the time (days) after immersion of AHPND cells.
  • control-1 was fed with 1% by weight of whole egg powder derived from non-immunized chicken
  • control-10 was fed with 10% by weight of whole egg powder derived from non-immunized chicken
  • toxin A-10 fed group containing 10% by weight of whole egg powder of test group A
  • Shrimp refers to shrimp belonging to the family Panaeidae.
  • the shrimp belonging to the family Shrimp may be, for example, vaname shrimp, black tiger, or shrimp.
  • Vibrio bacterium expressing toxins A and B means a bacterium belonging to the genus Vibrio and expressing toxin A and toxin B. Such bacteria include Vibrio parahemolyticus, Vibrio owenzi, Vibrio harvey, or Vibrio campbergi that express toxins A and B. In a preferred embodiment, the “Vibrio bacterium expressing toxins A and B” may be Vibrio parahemolyticus expressing toxins A and B.
  • the “infection of shrimp with Vibrio spp. Expressing toxins A and B” is not particularly limited as long as it is a shrimp disease caused by infection with Vibrio spp. Expressing toxins A and B. .
  • Such infections include the shrimp EMS / AHPND.
  • “Shrimp infection by Vibrio bacteria expressing toxins A and B” may be referred to simply as “shrimp infection” herein.
  • toxin A refers to toxin A derived from Vibrio parahemolyticus (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 and the base sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 1), or a mutation thereof Body or homolog.
  • Toxin A derived from Vibrio parahemolyticus is encoded by nucleotides 1119 to 1454 in the nucleotide sequence disclosed in GenBank Accession No. AB972427.1.
  • toxin B means toxin A derived from Vibrio parahemolyticus (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4, and the base sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 3), or a mutation thereof Body or homolog.
  • Toxin B derived from Vibrio parahemolyticus is encoded by nucleotides 1467 to 2783 in the nucleotide sequence disclosed in GenBank Accession No. AB972427.1.
  • mutant may mean a protein having a sequence in which one or several amino acids have been deleted, inserted or added to the amino acid sequence of the original protein.
  • One or several amino acids have been deleted, inserted or added means that one or several amino acids in the subject amino acid sequence (for example, 30% of the total length of the amino acid sequence, preferably 25 %, 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2% or 1% amino acids) are deleted, substituted with other amino acids, inserted with other amino acids, And / or other amino acids have been added.
  • substitution is preferably a conservative substitution.
  • a conservative substitution is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics, but any substitution that does not substantially change the structural characteristics of the original sequence. For example, any substitution may be made so long as the substituted amino acid does not destroy the helix present in the original sequence or other types of secondary structures characterizing the original sequence.
  • conservative substitution of amino acid residues is exemplified for each substitutable residue, but the substitutable amino acid residues are not limited to those described below.
  • Group A leucine, isoleucine, valine, alanine, methionine
  • B group aspartic acid
  • glutamic acid glutamic acid
  • C group asparagine
  • glutamine D group: lysine
  • arginine arginine
  • Group E Serine
  • Threonine Group F: Phenylalanine, Tyrosine
  • one member of the above types can be exchanged for another type of member.
  • the amino acids of the above groups B, D, and E may be substituted with amino acids of other groups.
  • cysteines may be deleted or substituted with other amino acids to prevent folding in the protein with tertiary structure.
  • the hydropathic index of amino acids J.P.
  • J.P. which is a measure of hydrophobicity / hydrophilicity for amino acids, so that the hydrophilic / hydrophobic balance is maintained or the hydrophilicity is increased to facilitate synthesis.
  • Kyte and R. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982), amino acids may be substituted.
  • mutant in the present specification may mean a protein containing an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to the amino acid sequence of the original protein.
  • a “variant” is a protein comprising an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% sequence identity to the amino acid sequence of the original protein.
  • the percent identity between two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity can also be determined using a computer program. Examples of such computer programs include BLAST and ClustalW. In particular, various conditions (parameters) for identity search by the BLAST program are described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p.
  • the “homologue” of Vibrio parahemolyticus-derived toxin A or toxin B may be toxin A or toxin B derived from other Vibrio bacteria.
  • the “homologue” of toxin A or toxin B from Vibrio parahemolyticus may be toxin A or toxin B from Vibrio owenzi, Vibrio harvey, or Vibrio campbergii.
  • controlling shrimp infection by Vibrio spp. Expressing toxins A and B prevents infection of Vibrio spp. Expressing toxins A and B and expresses toxins A and B It means the action that prevents the development of shrimp infections caused by Vibrio spp.
  • the effect of controlling shrimp infection may be evaluated by the effect of reducing mortality due to shrimp infection.
  • Shrimp are almost 100% killed by EMS / AHPND. If the mortality due to EMS / AHPND is reduced as compared to the non-treated group, it can be determined that the shrimp infection has been controlled. In a preferred embodiment, even when the mortality due to EMS / AHPND is reduced to 50% or less, 40% or less, 30% or less, 25% or less, or 20% or less, it is judged that the shrimp infection is controlled. Good.
  • composition for Controlling Shrimp Infection is a composition for controlling shrimp infection by Vibrio bacteria expressing toxins A and B, comprising an antibody against toxin A. It relates to the composition.
  • the composition may be referred to as “the composition of the present invention” in the present specification.
  • the range for each component is as described in the item “Definitions” above.
  • the antibody against toxin A is not particularly limited as long as it is a specific antibody against toxin A.
  • the antibody against toxin A is a chicken egg antibody obtained from a chicken egg immunized with toxin A.
  • a “chicken egg antibody” is an antibody contained in a chicken egg. It is known that by immunizing a chicken with an antigen, an antibody specific to the antigen is produced and transferred to the yolk in the egg. Further, it is known that chicken egg antibodies mainly contain IgY (immunoglobulin class Y).
  • the antibody against toxin A contained in the composition of the present invention is an IgY antibody against toxin A.
  • the antibody against toxin A can be obtained, for example, from whole eggs or egg yolks obtained from eggs immunized with toxin A and immunized chickens.
  • the antigen contained in the inoculation source is only toxin A.
  • other antigens are inoculated at a site different from the site where toxin A is inoculated.
  • the number of inoculations and the inoculation amount when immunizing chickens with toxin A are not particularly limited as long as antibodies against toxin A are produced in chicken eggs.
  • the dose per inoculation should be 0.1 to 5.0 mg / mL, 0.3 to 3.0 mg / mL, 0.5 to 1.0 mg / mL, or 0.7 mg / mL. it can.
  • the whole egg or egg yolk obtained from a chicken immunized with toxin A may be used as a material containing an antibody against toxin A. It is preferred to use whole egg powder containing antibodies against toxin A. By using whole egg powder, it is possible to reduce the steps of separating the egg into egg white and egg yolk, separating the IgY antibody, etc., and to reduce the production cost of the composition.
  • the composition of the present invention is a shrimp feed (hereinafter sometimes referred to as “the shrimp feed of the present invention”).
  • the shrimp feed may be obtained by mixing an antibody against toxin A and a known shrimp feed (for example, a commercially available shrimp feed).
  • shrimp food may be obtained by mixing whole egg powder containing an antibody against toxin A and a known food for shrimps.
  • whole egg powder containing an antibody against toxin A is used, the total egg powder content is 0.1% by weight or more, 0.5% by weight or more, 1.0% by weight or more, 5.0% by weight or more based on the weight of the composition. You may adjust so that it may contain 10 weight% or more.
  • the total egg powder content relative to the composition weight is preferably 20% by weight or less.
  • the present invention relates to shrimp infections caused by Vibrio spp. Expressing toxins A and B, comprising administering or ingesting the composition of the present invention to shrimp. It relates to a method for controlling.
  • method for controlling a shrimp infection of the present invention The range for each component is as described in the item “Definitions” above.
  • composition of the present invention is as described above in the section “Composition for controlling shrimp infections”.
  • the time when the composition of the present invention is administered to the shrimp or starts to be ingested is within the shrimp farming period, and the infection to Vibrio bacteria expressing toxins A and B is not confirmed. Any time may be used.
  • administration / intake of the composition of the present invention to shrimps is started immediately after hatching or immediately after the start of cultivation.
  • the period during which the composition of the present invention is administered to or taken from shrimp may extend over the entire range of the shrimp farming period.
  • the method for controlling a shrimp infection of the present invention may be a method comprising feeding a shrimp feed of the present invention to a shrimp.
  • the shrimp feed of the present invention is as described above.
  • the amount of shrimp body weight 3-10%, 3-7%, 4-6%, or 5% by weight of the shrimp per day may be divided into several times a day. Good.
  • Example 1 Preparation of IgY Toxin A and toxin B recombinant proteins derived from Vibrio parahemolyticus were prepared using E. coli.
  • Chickens were injected with 1 mL (0.7 mg / mL) of recombinant protein (toxin A and / or toxin B) every 6 weeks. The injection was performed 5 times in total. For each injection, 1 mL was injected in two portions, the chicken breast and paws. IgY is produced in the immunized chicken and then migrates to the yolk in the chicken egg. IgY was prepared in the following four test sections.
  • Test area A A toxin A recombinant protein was injected.
  • Test area B Toxin B recombinant protein was injected.
  • Test section AB Toxin A recombinant protein was injected into one site, and toxin B recombinant protein was injected into another site.
  • Test zone ABmix A mixture of toxin A and toxin B recombinant protein was injected.
  • Example 2 Preparation of IgY-containing feed
  • Whole eggs of eggs obtained from chickens immunized in Example 1 were powdered to obtain whole egg powders.
  • a whole egg powder obtained from a non-immunized chicken was also prepared as a control.
  • the bait was prepared by mixing with a commercially available shrimp bait and expressed in the form of the total egg powder content X weight% (X is a numerical value) with respect to the final bait weight.
  • X is a numerical value
  • For molding commercially available shrimp food and whole egg powder are mixed with sterilized distilled water, shaped into food form on a tray using a syringe, dried in an oven at 60 ° C for about 2 hours, and stored at 4 ° C. .
  • Five types of IgY-containing feed were obtained in the control and test groups.
  • Example 3 Infection experiment (1)
  • AHPND TUMSAT strain (a strain of Vibrio parahemolyticus isolated by the inventor, which was confirmed to express toxin A and toxin B) was used to infect vanamae shrimp, The control effect was examined by giving the IgY-containing feed prepared in Example 2 (total egg powder content 20%) and confirming the mortality rate.
  • vanamae shrimp was placed in a water tank and fed for 2 days, followed by immersion infection. Feeding was continued for 6 days after immersion, and mortality was confirmed.
  • the results are shown in FIG.
  • the mortality rate in the group fed with chicken egg powder derived from non-immunized chicken was 100% (control).
  • the mortality rate of the group fed with the feed containing the whole egg powder of the test group A was 13%
  • the mortality rate of the group fed with the feed containing the whole egg powder of the test group B was 86%
  • the whole egg powder of the test group ABmix was used.
  • the mortality rate of the group fed with the feed containing the food was 82%
  • the mortality rate of the group fed with the feed containing the whole egg powder of the test group AB was 17%.
  • AHPND can be controlled by oral passive immunization using chicken egg yolk antibody. Moreover, since the mortality rate of the group fed with the feed containing whole egg powder of the test group A and the test group AB is reduced to 20% or less, the feed containing IgY specific for toxin A is It has been shown to be particularly effective in controlling AHPND.
  • Example 4 Infection experiment (2) In the method infection test, AHPND TUMSAT strain prepared separately (same strain as used in Example 3) was used to infect shrimp, and whole egg as a feed containing IgY-containing whole egg powder prepared in Example 2 The control effect was examined by giving a feed with a powder content of 1% by weight (toxin A-1) and 10% by weight (toxin A-10) and confirming the mortality rate. As controls, a group fed with 1% by weight of whole egg powder derived from non-immunized chicken (control-1) and a feed containing 10% by weight of whole egg powder derived from non-immunized chicken (control-10) ) was set.
  • vanamae shrimp was placed in a water tank and fed for 2 days, followed by immersion infection. Feeding was continued for 7 days after immersion, and mortality was confirmed.
  • Mortality was 52% and 32%, respectively, in the groups fed with hen egg powder derived from non-immunized chicken (control-1 and control-10).
  • the mortality rate in the group fed with toxin A-1 was 4%, and the mortality rate in the group fed with toxin A-10 was 0%.
  • AHPND can be controlled by oral passive immunization using chicken egg yolk antibody.
  • the use of a feed containing 1% by weight of whole egg powder containing IgY specific for toxin A has been shown to be particularly effective in controlling AHPND.
  • a composition comprising an antibody against Vibrio spp. Toxin A is effective to effectively control infections caused by Vibrio spp. Expressing toxins A and B, and EMS / AHPND kills shrimps It has been shown that the rate can be reduced to 20% or less. Infection of shrimp with EMS / AHPND has a high lethality and causes severe damage in shrimp aquaculture, but the present invention reduces the death rate of shrimp by EMS / AHPND, This is useful for stable aquaculture.

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Abstract

本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法に関する。

Description

ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する防御効果を提供するＩｇＹ抗体含有餌料
　本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法に関する。
　ＥＭＳまたはＡＨＰＮＤ（早期死亡症候群または急性肝すい臓壊死病；以下、本明細書においてＥＭＳ／ＡＨＰＮＤと表記することがある。）は、近年被害が拡大しているエビ類の感染症で、その原因菌は特殊タイプの腸炎ビブリオ（ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus））である。
　一般的に、海水中にはビブリオ・パラヘモリティカスが常在しているが、特殊タイプのビブリオ・パラヘモリティカスのみがエビ類に病原性を示すことが分かっており、この特殊タイプの腸炎ビブリオが産生する毒素Ａおよび毒素Ｂがエビへの致死因子として働く可能性が報告されている（非特許文献１、２）。また、毒素Ａまたは毒素Ｂの組換え体を用いた試験では、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方が存在する場合に、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの病態が生じ、用量依存的に死亡率が上昇するが、毒素Ａまたは毒素Ｂいずれかが単独で存在する場合には死亡率は認められないことが報告されている（非特許文献３）。
　また、ビブリオ属の他の種である、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）も、毒素ＡおよびＢを発現し、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを引き起こすことが報告されている（非特許文献４～６）。
　エビ類においては、抗体を介した特異的免疫機能が存在しないといわれており、エビ類の感染症にして能動免疫による感染防除効果は期待できない。エビ類における感染症に対する防除対策として抗生物質を用いる方法があるが、抗生物質の多用に伴い耐性菌の出現といった問題点もある。
　エビ類における感染症に対するその他の防除対策として、受動免疫が注目されている。受動免疫による感染症の防除方法は、病原体に対する抗体を対象に投与するまたは摂取させることにより、当該病原体による感染症を防除する手法である。エビ類について、病原体を抗原とした鶏卵由来ＩｇＹを経口投与することで感染症防除効果が得られたことが報告されている（特許文献１、非特許文献７）。ＩｇＹとは、鶏が持つ免疫グロブリンであり、主に卵黄に存在する。抗原を用いて鶏に免疫した際に、当該抗原に特異的なＩｇＹが作られた後、卵内の卵黄に移行することから、動物の命を犠牲にすることなく特異的抗体を大量かつ安価に生産できる手法として注目されている。
　ここで、非特許文献７は、ビブリオ・パラヘモリティカスの菌体そのものを抗原としたＩｇＹを用いることを記載している。しかし、その生存率は６０％程度（すなわち、ＩｇＹ摂取により致死率が４０％程度に抑制された）にとどまっている。
　エビ類におけるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤについて、より高い生存率を達成するために有効な防除方法が求められている。
特開平５－２５５１１３
Tinwongger, S., et al., J. Appl. Microbiol., 2016 Dec;121(6):1755-1765 Lee, C. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2015 Aug 25; 112(34):10798-803 Sirikharin, R., et al., PLOS ONE, 2015 May 27; 10(5): e0126987 Liu, L., et al., Genome Announc., 2015 Dec 3; 3(6):e01395-15 Kondo, H., et al., Genome Announc., 2015 Sep 17; 3(5):e00978-15 Xiao J., et al., Sci. Rep., 2017 Feb 7; 7:42177 Gao, X., et al., Int. J. Mol. Sci., 2016 May; 17(5): 723
　本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法を提供する。本明細書において、処置方法は、防除方法、治療方法および予防方法を包含する。防除方法は、治療方法および予防方法を包含する。
　以上に鑑み、本件の発明者は、特殊タイプの腸炎ビブリオが産生する毒素Ａおよび毒素Ｂに注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、毒素Ａに対するＩｇＹが、エビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率を劇的に低減することを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
　すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
　［１］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物。
　［２］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌が、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）である、上記［１］に記載の組成物。
　［３］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
　［４］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
　［５］感染症が、エビ類の早期死亡症候群／急性肝すい臓壊死病（EMS／AHPND）である、上記［１］または［２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［６］組成物がエビ類餌料である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
　［７］毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を、組成物重量に対して０．１％～２０％含む、上記［６］に記載の組成物。
　［８］上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法。
　［９］上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を処置する方法。
　本発明により、ビブリオ属細菌の毒素Ａに対する抗体を含む組成物が、有効に毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌による感染症を防除するために有効であることが示された。本発明の組成物は、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによるエビ類の死亡率を２０％以下にまで低減することが可能である。
図１は、感染実験の結果を示すグラフである。縦軸は累積死亡率を示し、横軸はＡＨＰＮＤ菌体を浸漬感染させた後の時間を示す。グラフ中、Controlは、免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末を給餌した区；Ａは、試験区Ａの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；Ｂは、試験区Ｂの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；ＡＢは、試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；ＡＢｍｉｘは、試験区ＡＢｍｉｘの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；を示す。 図２は、感染実験の結果を示すグラフである。縦軸は累積死亡率を示し、横軸はＡＨＰＮＤ菌体を浸漬感染させた後の時間（日数）を示す。グラフ中、コントロール－１は、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１重量％含む餌料を与えた区；コントロール－１０は、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１０重量％含む餌料を与えた区；ｔｏｘｉｎＡ－１は、試験区Ａの全卵粉末を１重量％含む餌料を与えた区；ｔｏｘｉｎＡ－１０は、試験区Ａの全卵粉末を１０重量％含む餌料を与えた区；を示す。
　以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
　定義
　本明細書において「エビ類」とは、クルマエビ科（family Panaeidae）に属するエビをいう。クルマエビ科に属するエビは、例えばバナメイエビ、ブラックタイガー、クルマエビであってもよい。
　本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌」とは、ビブリオ属細菌であって、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現する細菌を意味する。そのような細菌には、ビブリオ・パラヘモリティカス、ビブリオ・オウェンジー、ビブリオ・ハーベイ、またはビブリオ・カンプベリイであって、毒素ＡおよびＢを発現する細菌が含まれる。好ましい態様において、「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌」は、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカスであってもよい。
　本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症」とは、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌の感染により引き起こされるエビ類の疾病であれば特に限定されない。当該感染症にはエビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤが含まれる。「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症」を、本明細書において単に「エビ類の感染症」と表記することがある。
　本明細書において「毒素Ａ」とは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａ（アミノ酸配列は配列番号２に示され、それをコードする塩基配列は配列番号１に示される）、またはその変異体もしくはホモログである。ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａは、GenBankアクセッション番号AB972427.1に開示される塩基配列の１１１９～１４５４番目のヌクレオチドによりコードされる。
　本明細書において「毒素Ｂ」とは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａ（アミノ酸配列は配列番号４に示され、それをコードする塩基配列は配列番号３に示される）、またはその変異体もしくはホモログである。ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ｂは、GenBankアクセッション番号AB972427.1に開示される塩基配列の１４６７～２７８３番目のヌクレオチドによりコードされる。
　本明細書において「変異体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは付加された配列を有するタンパク質を意味してもよい。「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは付加された」とは、対象となるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸（例えば、アミノ酸配列の全長に対して３０％、好ましくは２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％または１％のアミノ酸）が欠失しているか、他のアミノ酸に置換されているか、他のアミノ酸が挿入されているか、および／または他のアミノ酸が付加されていることを意味する。
　上記のうち置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。以下に、アミノ酸残基の保存的置換について置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、
Ｅ群：セリン、スレオニン
Ｆ群：フェニルアラニン、チロシン
　非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができる。例えば、不用意な糖鎖修飾を排除するために上記のＢ、Ｄ、Ｅ群のアミノ酸をそれ以外の群のアミノ酸に置換してもよい。または、３次構造でタンパク質中に折りたたまれることを防ぐためにシステインを欠失させるか、他のアミノ酸に置換してもよい。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（J. Kyte およびR. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982）を考慮して、アミノ酸を置換してもよい。
　あるいは、本明細書において「変異体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を意味してもよい。好ましくは、「変異体」は、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、ＮＣＢＩやDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894；Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DNASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI（Infomax）等のプログラムを用いて決定することもできる。
　本明細書においてビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａまたは毒素Ｂの「ホモログ」とは、他のビブリオ属細菌由来の毒素Ａまたは毒素Ｂであってもよい。好ましくは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａまたは毒素Ｂの「ホモログ」は、ビブリオ・オウェンジー、ビブリオ・ハーベイ、またはビブリオ・カンプベリイ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂであってもよい。
　本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する」とは、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌の感染を防ぎ、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症の発症を防ぐ作用を意味する。エビ類の感染症の防除効果は、エビ類の感染症による死亡率の低減効果により評価してもよい。エビ類はＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによりほぼ１００％死滅する。ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率が、処置しない区と比較して低減した場合は、エビ類の感染症を防除したと判断することができる。好ましい態様において、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率が５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、または２０％以下に低減した場合に、エビ類の感染症を防除したと判断してもよい。
　エビ類の感染症を防除するための組成物
　本発明は、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物に関する。当該組成物を、以下、本明細書において「本発明の組成物」と表記することがある。各構成についての範囲は、上記「定義」の項目において記載した通りである。
　毒素Ａに対する抗体は、毒素Ａに対して特異的な抗体であれば特に限定されない。
　一態様において、毒素Ａに対する抗体は、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である。「鶏卵抗体」とは、鶏の卵に含まれる抗体である。鶏を抗原で免疫することにより、当該抗原に特異的な抗体が作られ、卵内の卵黄に移行することが知られている。また、鶏卵抗体には、主にＩｇＹ（免疫グロブリン・クラスＹ）が含まれることが知られている。好ましい態様において、本発明の組成物に含まれる毒素Ａに対する抗体は毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である。
　毒素Ａに対する抗体は、例えば、鶏を毒素Ａで免疫し、免疫した鶏から得られた卵の全卵または卵黄より得ることができる。ここで、毒素Ａで鶏を免疫する際には、接種源に含まれる抗原は毒素Ａのみとする。複数の抗原で鶏を免疫する場合は、他の抗原は、毒素Ａを接種した部位とは異なる部位に接種する。鶏を毒素Ａで免疫する際の接種回数および接種量は、鶏の卵において毒素Ａに対する抗体が生じる条件であれば特に限定されない。例えば、鶏は毒素Ａで複数回、例えば、３回、５回、７回、または１０回接種することが、鶏卵における抗体価を上げるために好ましい。また、１回あたりの接種量は、０．１～５．０ｍｇ／ｍＬ、０．３～３．０ｍｇ／ｍＬ、０．５～１．０ｍｇ／ｍＬ、または０．７ｍｇ／ｍＬであることができる。
　毒素Ａで免疫した鶏から得られた卵の全卵または卵黄を粉末化したものを、毒素Ａに対する抗体を含む材料として使用してもよい。毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を用いることが好ましい。全卵粉末を用いることにより、卵を卵白と卵黄とに分離する、ＩｇＹ抗体を分離する等の工程を減らすことができ、組成物の製造コストの低減を図ることができる。
　一態様において、本発明の組成物は、エビ類餌料である（以下、「本発明のエビ類餌料」と記載することがある）。エビ類餌料は、毒素Ａに対する抗体と公知のエビ類用の餌料（例えば、市販のエビ類用の餌料）と混合することにより得てもよい。例えば、毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末と公知のエビ類用の餌料を混合することにより、エビ類餌料を得てもよい。毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を用いる場合、組成物重量に対して全卵粉末を０．１重量％以上、０．５重量％以上、１．０重量％以上、５．０重量％以上、１０重量％以上含むように調整してもよい。組成物重量に対する全卵粉末の含有量の上限に特に制限はなく、当業者が適宜設定することができる。組成物の製造コストを考慮する場合、組成物重量に対する全卵粉末の含有量は２０重量％以下とすることが好ましい。
　エビ類の感染症を防除するための方法
　本発明は、本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類感染症を防除する方法に関する。以下、本明細書において「本発明のエビ類の感染症を防除するための方法」と表記することがある。各構成についての範囲は、上記「定義」の項目において記載した通りである。また、「本発明の組成物」については上記「エビ類の感染症を防除するための組成物」の項目において説明した通りである。
　本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを開始する時期は、エビ類の養殖期間内であって、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌への感染が確認されない段階であればいかなる時期であってもよい。好ましくは孵化直後または養殖開始直後より本発明の組成物のエビ類への投与・摂取を開始する。また、本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させる期間は、エビ類の養殖期間の全範囲に渡っていてもよい。
　一態様において、本発明のエビ類の感染症を防除するための方法は、本発明のエビ類餌料をエビ類に摂取させることを含む方法であってもよい。本発明のエビ類餌料については上述の通りである。その際、餌量は、一日あたりエビ類体重の３～１０重量％、３～７重量％、４～６重量％、または５重量％を、一日に数回に分けて摂取させてもよい。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　実施例１：ＩｇＹの調製
　ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａおよび毒素Ｂの組換えタンパク質を、大腸菌を用いて調製した。
　ニワトリに６週間ごとに組換えタンパク質（毒素Ａおよび／または毒素Ｂ）を１ｍＬ（０．７ｍｇ／ｍＬ）注射した。注射は計５回行った。１回の注射につき、１ｍＬをニワトリの胸と足の２箇所に分けて注射した。ＩｇＹは、免疫したニワトリにおいて作られた後、当該ニワトリの卵内の卵黄に移行する。以下の４つの試験区に分けて、ＩｇＹを調製した。
　試験区Ａ：毒素Ａの組換えタンパク質を注射した。
　試験区Ｂ：毒素Ｂの組換えタンパク質を注射した。
　試験区ＡＢ：毒素Ａの組換えタンパク質を１箇所に注射し、毒素Ｂの組換えタンパク質を別の箇所に注射した。
　試験区ＡＢｍｉｘ：毒素Ａと毒素Ｂの組換えタンパク質を混合したものを注射した。
　実施例２：ＩｇＹ含有餌料の調製
　実施例１において免疫したニワトリから得られた卵の全卵を粉末化し、全卵粉末を得た。また、対照区として何も免疫されていない鶏から得られた全卵粉末も用意した。餌料は市販のエビ用餌料と混ぜて作成し、最終的な餌の重量に対し全卵粉末の含有率Ｘ重量％（Ｘは数値）という形で表した。成型には、市販のエビ用餌料と全卵粉末を滅菌蒸留水と混ぜ合わせ、シリンジを用いてトレーに餌の形に整形し、６０℃のオーブンで約２時間乾燥させ、４℃で保存した。対照区、試験区合わせて５種類のＩｇＹ含有餌料を得た。
　実施例３：感染実験（１）
　方法
　感染試験には、ＡＨＰＮＤ　ＴＵＭＳＡＴ株（発明者が分離したビブリオ・パラヘモリティカスの株であって、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現することが確認された株）を用いてバナメイエビを感染させ、実施例２で調製したＩｇＹ含有餌料（全卵粉末の含有率２０％）を与えて死亡率を確認することにより防除効果を調べた。
　感染試験を行った際の水槽における条件は、塩分濃度３０ｐｐｔ、水温約２４℃、水量１０Ｌ、餌量は一日にエビ体重の５％を一日に３～４回で行った（ｎ＝２５）。また、感染実験を行う上で水槽内にバナメイエビを入れ、２日間給餌したのち、浸漬感染させた。給餌は浸漬感染後も６日間継続して行い、死亡率を確認した。
　結果
　結果を図１に示す。免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末を給餌した区の死亡率は１００％であった（対照区（control））。試験区Ａの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は１３％、試験区Ｂの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は８６％、試験区ＡＢｍｉｘの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は８２％、そして試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は１７％であった。
　これらの結果から、鶏卵卵黄抗体を用いた経口受動免疫によりＡＨＰＮＤの防除が可能となることが示された。また、特に試験区Ａおよび試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は２０％以下に低減されていることから、毒素Ａに対して特異的なＩｇＹを含む餌料が、ＡＨＰＮＤに対する防除に特に有効であることが示された。
　実施例４：感染実験（２）
　方法
　感染試験には、別途調製したＡＨＰＮＤ　ＴＵＭＳＡＴ株（実施例３で使用した物と同じ株）を用いてバナメイエビを感染させ、実施例２で調製したＩｇＹ含有全卵粉末を含む餌料として、全卵粉末の含有率１重量％（ｔｏｘｉｎＡ－１）および１０重量％（ｔｏｘｉｎＡ－１０）の餌料を与えて死亡率を確認することにより防除効果を調べた。対照として、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１重量％含む餌料（コントロール－１）を与えた区、および免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１０重量％含む餌料（コントロール－１０）を与えた区を設定した。
　感染試験を行った際の水槽における条件は、塩分濃度３０ｐｐｔ、水温約２６℃、水量１０Ｌ、餌量は一日にエビ体重の５％を一日に３～４回で行った（ｎ＝２５）。また、感染実験を行う上で水槽内にバナメイエビを入れ、２日間給餌したのち、浸漬感染させた。給餌は浸漬感染後も７日間継続して行い、死亡率を確認した。
　結果
　結果を図２に示す。免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末含む餌料（コントロール－１、およびコントロール－１０）を与えた区の死亡率はそれぞれ５２％および３２％であった。ｔｏｘｉｎＡ－１を給餌した区の死亡率は４％、ｔｏｘｉｎＡ－１０を給餌した区の死亡率は０％であった。
　これらの結果からも、鶏卵卵黄抗体を用いた経口受動免疫によりＡＨＰＮＤの防除が可能となることが示された。特に、毒素Ａに対して特異的なＩｇＹを含む全卵粉末を１重量％含有する餌料を使用しても、ＡＨＰＮＤに対する防除に特に有効であることが示された。
　本発明により、ビブリオ属細菌の毒素Ａに対する抗体を含む組成物が、有効に毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌による感染症を防除するために有効であり、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによるエビ類の死亡率を２０％以下にまで低減できることが示された。エビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤへの感染は致死率が高く、エビ類の養殖業において甚大な被害を与えるものであるが、本発明はエビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率を低減し、エビ類の養殖を安定的に行うために有用である。

Claims (8)

  1. 　毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物。
  2. 　毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌が、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
  5. 　感染症が、エビ類の早期死亡症候群／急性肝すい臓壊死病（EMS／AHPND）である、請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 　組成物がエビ類餌料である、請求項１または２に記載の組成物。
  7. 　毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を、組成物重量に対して０．１％～２０％含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を処置する方法。
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