WO2018209457A1 - Aerosol orofaríngeo compuesto por un hidrolizado derivado de un probiótico que tiene impacto en la inmunidad del tracto genitourinario, método de obtención del hidrolizado, composiciones farmacéuticas que lo contienen y uso de las mismas - Google Patents

Aerosol orofaríngeo compuesto por un hidrolizado derivado de un probiótico que tiene impacto en la inmunidad del tracto genitourinario, método de obtención del hidrolizado, composiciones farmacéuticas que lo contienen y uso de las mismas Download PDF

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hydrolysate
hps
immuno
dsm32447
strain
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PCT/CL2018/050024
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Erica Castro Inostroza
María PIDERIT MORENO
Juan Pablo MELLADO
María José AGUAYO
Rodrigo BÓRQUEZ YÁÑEZ
Margarita GONZÁLEZ
Valeska Aeschlimann Arjona
Original Assignee
Universidad San Sebastián
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • Urinary tract infections include invasion, colonization and multiplication of microorganisms in the urinary tract.
  • 1TUs are one of the most frequent reasons for medical consultation, with 70,000 notifications of urinary infections per year.
  • the replacement of usual therapies for vaginal infections has been investigated by alternative methods that are less invasive and natural.
  • probiotics microorganisms that modulate the vaginal microbiota, protecting the mucosa from invasion of pathogens, producing antimicrobial substances, competing for space and nutrients stimulating the immune response by inducing anti-inflammatory cytokines and blocking the pathway of Cyclo-oxygenase 2 like that of the Andean prostag!, which would increase the concentration of vaginal immunogiobulin A (IgA).
  • IgA vaginal immunogiobulin A
  • Application MX2016003325 describes a mucosal vaccine composition! as a preventive medicine or the treatment of infections and / or cancer, by induction of systemic and mucosal immune response.
  • the composition contains at least one type of antigen.
  • an immunostimulatory agent a lipopoiisaccharide derived from gram-negative bacteria.
  • Application US 20080102061 describes a method of treatment and prophylaxis for vaginal diseases based on hydrolysates of non-pathogenic organisms and their metabolic products, after a fermentation process.
  • HPS soluble protein hydrolysates
  • the present invention relates to the use of a product derived from probiotic microorganisms in the prevention and systemic and local treatment of urinary tract infections.
  • the present invention describes soluble protein hydrolysates (HPS) obtained from vaginal probiotics, which stimulate the immunity of the genitourinary mucosa systemically and locally.
  • HPS soluble protein hydrolysates
  • the method of obtaining a soluble protein homogenate obtained from the probiotic strain Lactobacilius spp DSM32447 is described, in addition to the tai hydrolyzate itself and its use as a pharmaceutical composition with immunostimulatory activity.
  • the strain used in the formulation was deposited with DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganis und Zellkulturen GmbH, in Germany, under registration number DSM32447, for patenting purposes.
  • the strain Lactobacillus spp DSM32447 that has outstanding probiotic properties, is mechanically lysed to obtain HPS, which is dried by lyophilization, pharmacologically treated to give rise to a formulation contained in an attractive and technological format.
  • HPS of the strain Lactobacillus spp DSM32447 confers protection to intestinal cells and decreases the inflammation of these when exposed to inflammatory stimuli, thus manifesting an immunological stimulation. It was proved in in vivo tests that the use of the HPS product does not generate harmful alterations in the immune system.
  • the prophylactic application of the formulation results in a lower inflammatory response at the urine level, and may indicate a lower degree of infection and conferring protection. According to in vivo analysis it is shown that the prophylactic application confers greater protection than the therapeutic application.
  • the present invention then provides a new composition and alternative method of prophylaxis of the lower urinary tract mucosa.
  • the bacterial suspension is centrifuged for 8 min at 6000xg, then washed three times with 10mM saline phosphate buffer (PBS), pH 7.4.
  • PBS saline phosphate buffer
  • the pellet obtained is resuspended in sterile 1 mM PBS, pH 7.4, according to the ratio 4 grams of pellet in 15 ml of resuspension (optimal ratio according to experiment design).
  • This solution is deposited in a round bottom bottle 6 cm high and 1.5 cm in diameter. It is immediately sonicated in the Hielscher 200ST, with a 7 mm sonotrode capable of sonicating a volume between 20 and 500 ml. About 25 ml of solution is deposited for each sonication.
  • Each sonication has a duration of 10 continuous minutes, without pulses, with an amplitude of 50% of the equipment that offers 200 W of power.
  • the bottle where the solution is in the sonication process is inserted in a thermostatic bath with ice, where the temperature does not exceed 8 ° C.
  • the bacterial lysate that contains proteins and other soluble bacterial products is centrifuged at 1,200 xg (centrifuge 5810R, Eppendorf) for 15min at 4 ° C, keeping the supernatant at -20 e C • Quantification of total proteins.
  • the protein concentration of each sample was determined using the Bradford method (Bradford, 1976) using the Bradford reagent (Biorad), with a wavelength reading of 595 nm in a spectrophotometer (Bio Tek 31 1) .
  • a calibration curve was performed with bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 1 mg / mL.
  • Protein separation was carried out by electrophoresis using a 10% polyacrylamide gel, according to the method of Laemmli (Laemmli, 1970), allowing proteins to be separated between 20 to 300 KDa (SDS-PAGE) at 90mV by 1.5hrs, then the gel It was stained with Coomasie Blue dye to visualize the protein pattern of each strain under study.
  • the AccuRuler RGB Prestained Protein Ladder (MaestroGen) molecular weight marker was used to perform the standard curve.
  • lyophilization The most commonly used technique that allows obtaining powder products with high viability is sublimation drying, better known as lyophilization.
  • lyophilization the incorporation of protective agents for the bacteria to be dried is key.
  • the objective of these additives is to reduce the stress suffered by bacteria, first by freezing them and then by the same dehumidification stage.
  • the lyophilizer is taken in which the samples will be dehydrated. In this equipment they are left for 48 hours, since after this time the samples have evaporated all the water.
  • the busy lyophilizer of the VirTis BenchTop TM K brand operated at a constant condenser temperature of -58.0 ° C, reaching a maximum vacuum pressure of 30 mT granted by the vacuum pump ILMVAC P8Z.
  • the falcon tubes are inserted in a freeze-drying bottle, and this in turn is inserted into the tree of the freeze-drying chamber of the equipment (figure 1).
  • Table 1 Composition of the HPS-based aerosol formulation of the Lactobacillus spp DSM32447 strain.
  • Diluent Distilled water 1 ml The components of this formulation allow to maintain the chemical stability of the active substance for 30 days.
  • IL-10 Interleukin 10
  • TEER Transepitelial Electrical Resistance
  • HPS LactobacHIus spp DSÜVI32447
  • lipopolysaccharide LPS
  • Protective effects on the colon epithelium by preserving tight junctions cell junctions in a colorectal epithelial adenocarcinoma cell line (Caco-2) were studied with HPS of the Lactobaci ⁇ ius spp strain DSM32447. There is scientific evidence that shows that disruption of tight junctions leads to a loss of the integrity of the intestinal barrier.
  • HPS soluble protein hydrolysates
  • Example 3 Preventive model at the urinary level of the application of soluble protein hydrolyzate (HPS) of the strain LactobaciHus spp. DSIV132447, in C57BL / 6 mice infected with a strain of uropathogenic E. coli.
  • HPS soluble protein hydrolyzate
  • coli pathogenic strain was conserved in 50% glycerol and activated from cepary in Luria-Bertanni broth (MERCK) at 37 e C for 18 hrs. And this was suspended in PBS buffer until reaching a concentration of 10 8 CFU / ml.
  • MERCK Luria-Bertanni broth
  • Group 1 control animals. Not infected.
  • mice 4 Animals treated only with HPS for 7 days after probing. C57BL / 6 strain female mice were used. The mice were kept in cages and fed ad libitum under controlled conditions of temperature (25 ⁇ 0.5 e C), humidity and light.
  • the use of the HPS product does not generate harmful alterations in the immune system and when performing the white blood cell count, the groups that used the product prior to the infection exhibited a lower inflammatory response at the level of the urinalysis, being able to indicate a lower degree of infection, since the curative group G5 , presented major changes such as increased leukocytes, erythrocytes, presence of bacilli, among others. It is projected that generated a model of symptomatic urinary infection, a clearer response is evident in animals with the pathogenic strain and treated with HPS. When comparing the groups that used the HPS product, a better response was seen in the preventive group (G4) than the curative (G5). The G6 group that used both the preventive and curative product responded in a similar way to the preventive scheme. From this perspective, similar results can be projected in cases of cervicovaginitis and complementary to antibiotic schemes.
  • FIG. 1 Effect of soluble protein homogenate of Lactobacillus spp DS 32447 on the production of IL-10 by mononuclear cells (CMN), in vitro. At 70 hours of culture, in the supernatants IL-10 was quantified by ELISA. The results are reported as average ⁇ standard error.
  • Figure 2. Transepitelial Electrical Resistance (TEER) against stimulation with HPS
  • Lactobacillus spp DSM32447 and with lipopolysaccharide LPS
  • Caco-2 cells were stimulated with 150 g / mL of the HPS of the LPV31 strain for 48 hours, then washed to extract the bacterial proteins and 100 ng / mL of LPS were stimulated for 48 hours after stimulation with the HPS.
  • the black bars correspond to the cells without stimulation, the white bars to the cells after being stimulated with the HPS, and the gray bars to the Caco-2 cells stimulated with the HPS of LPV31 but with LPS.
  • the TEER values are indicated as a percentage, the dotted line corresponds to the baseline TEER (100%). Performed in quadruplicate. p ⁇ 0.05.

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Abstract

La invención desarrollada en el campo de los productos biotecnológicos naturales, describe un compuesto basado en hidrolizado proteico soluble (HPS) de la cepa probiótica Lactobacillus spp DSM32447. En particular, la invención refiere a un compuesto de origen natural, inocuo que confiere inmunidad de mucosas, se describe el método de obtención, composiciones farmacéuticas que lo contienen y uso de las mismas.

Description

AEROSOL OROFARÍNGEO COMPUESTO POR UN HIDROLIZADQ DERIVADO DE UN
PROBIÓTICO QUE TIENE IMPACTO EN LA INMUNIDAD DEL TRACTO GENITOURINARIO, MÉTODO DE OBTENCIÓN DEL HIDROLIZADO, COMPOSICIONES
FARMACÉUTICAS QUE LO CONTIENEN Y USO DE LAS MISMAS
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones del tracto urinario (¡TU) comprenden la invasión, colonización y multiplicación de microorganismos en el aparato urinario. En Chile, las 1TU, son uno de los motivos más frecuentes de consulta médica, con 70.000 notificaciones de infecciones urinarias al año. Se ha investigado el reemplazo de las terapias habituales para las infecciones vaginales, por métodos alternativos menos invasivos y naturales. Entre estos, el empleo de probióticos, microorganismos que modulan la microbiota vaginal, protegiendo la mucosa de la invasión de patógenos, produciendo sustancias antimicrobianas, compitiendo por espacio y nutrientes estimulando la respuesta ínmunológica mediante la inducción de citoquinas anti-infiamatorias y bloqueando la vía de la ciclo-oxigenasa 2 como la de las prostag!andinas, lo que incrementaría la concentración de inmunogiobulina A (IgA) vaginal.
La solicitud MX2016003325 describe una composición de vacuna mucosa! como medicina preventiva o el tratamiento de infecciones y/o cáncer, por inducción de respuesta inmune sistémica y mucosal. La composición contiene ai menos un tipo de antígeno. un agente inmunoestimulante, un lipopoiisacárido derivado de bacteria gram negativas.
La solicitud US 20080102061 describe un método de tratamiento y profilaxis para enfermedades vaginales basados en hidrolizados de organismos no patógenos y productos del metabolismo de estos, luego de un proceso de fermentación.
A diferencia del Arte Previo la presente invención describe hidrolizados proteicos solubles (HPS) obtenidos de bacterias lácticas para el uso en la prevención o tratamiento de Infecciones del tracto urinario.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso de un producto derivado de microorganismos probióticos en la prevención y tratamiento sistémico y local de Infecciones del tracto urinario.
La presente invención describe hidrolizados proteicos solubles (HPS) obtenidos desde probióticos vaginales, los cuales estimulan la inmunidad de la mucosa genitourinaria de manera sistémica y local.
Se describe el método de obtención de un homogenizado proteico soluble obtenido desde la cepa probiótica Lactobacilius spp DSM32447, además del hidrolizado propiamente tai y su uso como composición farmacéutica con actividad inmunoestimulante. La cepa utilizada en la formulación fue depositada en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, en Alemania, bajo número de registro DSM32447, con fines de patentamiento.
La cepa Lactobacillus spp DSM32447 que presenta propiedades probióticas destacadas, es lisada mecánicamente para obtener el HPS, el cual es secado por liofilización, tratado farmacológicamente para dar lugar a una formulación contenida en un formato atractivo y tecnológico. El HPS de la cepa Lactobacillus spp DSM32447, confiere protección a células intestinales y disminuye la inflamación de estas al ser expuestas ante estímulos inflamatorios, manifestando así una estimulación inmunológica. Se comprobó en ensayos in vivo, que el uso del producto HPS no genera alteraciones nocivas en el sistema inmune. La aplicación profiláctica de la formulación, resulta en una menor respuesta inflamatoria a nivel de orina, pudiendo indicar un menor grado de infección y confiriendo protección. Según análisis in vivo se demuestra que la aplicación profiláctica confiere mayor protección que la aplicación terapéutica. La presente invención provee entonces una nueva composición y método alternativo de profilaxis de la mucosa del tracto urinario inferior.
DESCRPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Método de Preparación
Obtención de hidrolizados proteicos solubles HPS desde la bacteria Lactobacillus spp. DSM32447.
• Extracción de proteínas totales de Lactobacillus spp. DSM32447
La suspensión bacteriana es centrifugada por 8 min a 6000xg, posteriormente lavadas tres veces con Buffer fosfato salino (PBS) 10mM, pH 7.4. El pellet obtenido es resuspendido en PBS 1 mM estéril, pH 7.4, de acuerdo a la razón 4 gramos de pellet en 15 mi de resuspensión (razón óptima de acuerdo a diseño de experimento).
Esta solución es depositada en un frasco de fondo redondo de 6 cm de alto por 1 .5 cm de diámetro. Inmediatamente es sometida a sonicación en el equipo Hielscher 200ST, con un sonotrodo de 7 mm capaz de sonicar un volumen entre 20 y 500 mi. Se depositan cerca de 25 mi de solución por cada sonicación.
Cada sonicación tiene una duración de 10 minutos continuos, sin pulsos, con una amplitud del 50% del equipo que ofrece 200 W de potencia. El frasco en donde se encuentra la solución en el proceso de sonicación está inserto en un baño termostático con hielo, en donde la temperatura no supera los 8°C.
Luego de realizar el rompimiento de las bacterias, el lisado bacteriano que contiene proteínas y otros productos bacterianos solubles, es centrifugado a 1 2800 xg (centrifuga 5810R, Eppendorf) por 15min a 4°C, guardando el sobrenandante a -20eC • Cuantificación de proteínas totales.
La determinación de la concentración de las proteínas de cada muestra, se realizó mediante el método de Bradford (Bradford, 1976) utilizando el reactivo de Bradford (Biorad), con lectura a una longitud de onda de 595nm en espectrofotometro (Bio Tek 31 1 ). Se realizó una curva de calibración con albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma) 1 mg/mL.
• Electroforesis SDS PAGE
Se realizó la separación de proteínas por electroforesis mediante un gel de poliacrilamida al 10%, según método de Laemmli (Laemmli, 1970), permitiendo separar proteínas entre 20 a 300 KDa (SDS-PAGE) a 90mV por 1 ,5hrs, luego el gel fue teñido con colorante Azul de Coomasie para la visualización del patrón de proteínas de cada cepa en estudio. Se utilizó el marcador de peso molecular AccuRuler RGB Prestained Protein Ladder (MaestroGen), para realizar la curva estándar.
• Secado del hidrolizado proteico soluble (HPS) por liofilización
La técnica más utilizada y que permite obtener productos en polvo con alta viabilidad es el secado por sublimación, más conocido como liofilización. Para el caso de la liofilización, resulta clave la incorporación de agentes protectores para las bacterias a secar. El objetivo de estos aditivos es reducir el stress que sufren las bacterias, primeramente por la congelación de estas y posteriormente por la misma etapa de dehumidificación.
Para realizar la liofilización al concentrado proteico, por cada tubo Falcon de 50 mi, se dispone de 25 mi de suspensión estéril, con una concentración aproximada de 0,03 g de proteína/ml. El procedimiento empleado es el siguiente: Los 25 mi son disueltos en un envase que se somete a congelación, en un baño de alcohol a -25eC. Estos envases se congelan en forma horizontal y girando para que así el medio congelado quede adherido a las paredes del envase.
Una vez congelado el medio, se procede a llevar al liofilizador en el cual serán deshidratadas las muestras. En este equipo se dejan durante 48 horas, ya que transcurrido este tiempo a las muestras se les ha evaporado toda el agua. El liofilizador ocupado de marca VirTis BenchTop™ K, operó con una temperatura constante del condensador de -58,0°C, llegando a una presión de vacío máxima de 30 mT otorgada por la bomba de vacio ILMVAC P8Z. Los tubos falcon son insertos en un frasco de liofilización, y éste a su vez es inserto en el árbol de la cámara de liofilización del equipo (figura 1 ).
Preparaciones Farmacéuticas
Procedimiento para preparar 10 mL de solución nasal:
1 . Tomar un matraz aforado de 10ml y agregar 5 mi de agua destilada estéril. Posteriormente agregar 100mg de hidrolizado proteico, y agitar hasta que el hidrolizado se encuentre completamente disuelto.
Luego agregar 0,8mg de preservante, en este caso Sorbato de Potasio y agitar nuevamente.
Posteriormente completar a volumen hasta alcanzar los 10ml_, y agitar nuevamente. Envasar la solución en un Frasco tipo ámbar y etiquetar.
Tabla 1 : Composición de la formulación aerosol en base a HPS de la cepa Lactobacillus spp DSM32447.
Contenido %
Función Constituyente Contenido
Principio Activo Hidrolizado proteico 5 mg a 15 mg 1
cepa Lactobacillus spp
DS 32447
Preservante Sorbato de potasio 0.02 mg a 5 mg 0.008
Diluyente Agua destilada 1 mi Los componentes de esta formulación permiten conservar la estabilidad química del principio activo por 30 días.
FORMAS PREFERENTES
A continuación se presentan algunos ejemplos a modo de ilustración, sin por esto restringir el espacio de la invención.
Ejemplo 1.
Efecto del hidrolizado obtenido de la cepa Lactobacillus spp. DSM32447 en la respuesta inmune inflamatoria a través de la modulación de Sos niveles de IL-10,
El hidrolizado de laboratorio obtenido de la cepa Lactobacillus spp. DSM32447, disminuye significativamente la respuesta inflamatoria a través de la modulación de los niveles de Interleuquina 10 (IL-10) en un modelo de estudio en células mononucleares de sangre periférica humana (figura 1 ).
Ejemplo 2.
Resistencia Eléctrica Transepitelial (TEER) frente a estímulo con HPS de LactobacHIus spp DSÜVI32447 y con lipopolisacárido (LPS). Efectos protectores en el epitelio de colon por medio de la preservación de las uniones celulares tight junctions en una línea celular de adenocarcinoma epitelial colorectal (Caco-2) fueron estudiados con HPS de la cepa Lactobaciíius spp DSM32447. Existe evidencia científica que demuestra que la disrupción de las uniones estrechas de enterocitos (tight junctions), lleva a una pérdida de la integridad de la barrera intestinal. Experiencias en nuestro laboratorio han demostrado que hidrolizados proteicos solubles (HPS) derivados de esta cepa, promueve la mantención de integridad de las uniones estrechas de enterocitos, mediante la cuantificación de resistencia eléctrica trans-epitelial (TEER) en monocapas de células cancerosas de colon (Caco-2) (figura 2).
Ejemplo 3. Modelo preventivo a nivel urinario de la aplicación de hidrolizado proteico soluble (HPS) de la cepa LactobaciHus spp. DSIV132447, en ratones C57BL/6 infectados con una cepa de E. coli uropatógena. Se empleó una suspensión bacteriana de la cepa LactobaciHus spp. DSM32447, la cual fue inoculada por vía oral en ratones durante 7 días antes de la inoculación del patógeno y 7 días post inoculación patógeno (inoculo patógeno: 108 UFC/ratón, en dosis única). La cepa patógena E. coli, fue conservada en glicerol 50% y activada desde cepario en caldo Luria- Bertanni (MERCK) a 37eC durante 18 hrs. Y esta fue suspendida en buffer PBS hasta alcanzar una concentración de 108 UFC/ml. Los grupos experimentales fueron los sgtes:
Grupo 1 . 4 Animales control. No infectados.
Grupo 2. 4 Animales infectados trans uretral, sólo con E. coli.
Grupo 3. 4 Animales tratados sólo con HPS por 14 días.
Grupo 4. 4 Animales tratados con HPS preventivo 7 días e ITU con E. coli.
Grupo 5. 4 Animales tratados con HPS curativo 7 días e ITU con E. coli.
Grupo 6. 4 Animales tratados con HPS 7 días pre-inoculación y 7 días post inducción de ITU con E. coli.
Grupo 7. 4 Animales tratados sólo con HPS por 7 días post sondaje. Se utilizaron ratones hembras cepa C57BL/6. Los ratones fueron mantenidos en jaulas y alimentados ad libitum bajo condiciones controladas de temperatura (25 ± 0.5e C), humedad y luz.
Después de realizado el modelo murino de ITU, se efectuaron recuentos microbiológicos de orina, no encontrando evidencias concretas de un proceso infeccioso agudo, sino que más bien de un cuadro subclínico, según los hallazgos observados en el análisis de las muestras de orina. Por cierto, esta evaluación macroscópica de orina mostró algunas asociaciones importantes atribuibles a protección de la mucosa del tracto urinario inferior en los grupos donde se aplicó el hidrolizado. Se puede inferir que el uso del producto HPS no genera alteraciones nocivas en el sistema inmune y al realizar el recuento de leucocitos, los grupos que utilizaron el producto previamente a la infección exhibieron una menor respuesta inflamatoria a nivel del análisis de orina, pudiendo indicar un menor grado de infección, ya que el grupo curativo G5, presentó mayores cambios como aumento de leucocitos, eritrocitos, presencias de bacilos, entre otros. Se proyecta que generado un modelo de infección urinaria sintomático, se evidencie una respuesta más clara en los animales con la cepa patógena y tratados con HPS. Al comparar los grupos que utilizaron el producto HPS, se vio una mejor respuesta en el grupo preventivo (G4) que el curativo (G5). El grupo G6 que utilizó el producto tanto preventivo como curativo, respondió de forma similar al esquema preventivo. Desde esta perspectiva, se puede proyectar resultados similares en cuadros de cérvicovaginitis y complementarios a los esquemas antibióticos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS
Figura 1. Efecto de homogenizado proteico soluble de Lactobacillus spp DS 32447 en la producción de IL-10 por células mononucleares (CMN), in vitro. A las 70 horas de cultivo, en los sobrenadantes se cuantificó IL-10 mediante ELISA. Los resultados son informados como promedio ± error estándar. Figura 2. Resistencia Eléctrica Transepitelial (TEER) frente a estímulo con HPS
Lactobacillus spp DSM32447 y con lipopolisacárido (LPS). Células Caco-2 fueron estimuladas con 150 g/mL del HPS de la cepa LPV31 durante 48 horas, luego fueron lavadas para extraer las proteínas bacterianas y fueron estimuladas 100 ng/mL de LPS durante 48 horas posterior al estímulo con el HPS. Las barras negras corresponden a las células sin estímulo, las barras blancas a las células luego de ser estimuladas con el HPS, y las barras grises a las células Caco-2 estimuladas con el HPS de LPV31 pero con LPS. Se indican los valores de TEER en porcentaje, la línea punteada corresponde a la TEER basal (100%). Realizado por cuadruplicado. p<0,05.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un método para producir una composición inmuno estimulante, CARACTERIZADO porque comprende los pasos: i) Centrifugar una suspensión bacteriana de la cepa Lactobacillus spp DSM32447 ii) Resuspender el pellet obtenido en ii) en PBS
iii) Sonicar el producto de ii)
iv) Centrifugar el lisado iii), recuperando el sobrenadante
v) Deshidratar el sobrenadante
vi) Disolver 100 mg de hidrolizado proteico en 5 mi de agua destilada estéril.
vii) Agregar preservante.
2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la suspensión bacteriana i) es centrifugada por 8 min a 6000xg, posteriormente lavadas tres veces con PBS 10mM, pH 7,4.
3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la razón de suspensión para ii) es 4 g de pellet en 15 mi de PBS.
4. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la sonicación de iii) tiene una duración de 10 minutos continuos, sin pulsos, con una amplitud del 50% del equipo que ofrece 200 W de potencia, estando el frasco en donde se encuentra la solución en el proceso de sonicación inserto en un baño termostático con hielo, en donde la temperatura no supera los 8°C.
5. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el lisado es centrifugado a 1 2800 xg por 15min a 4°C.
6. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque sobrenadante es deshidratado mediante secado por liofilización.
7. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el preservante corresponde a sórbalo de potasio.
8. Composición inmunoestimulante. CARACTERIZADA porque corresponde a hidrolizado proteico soluble (HPS) de la cepa probiótica Lactobacillus spp DS 32447.
9. Composición farmacéutica inmuno estimulante, CARACTERIZADA porque contiene como ingrediente activo hidrolizado de Lactobaci!us sp. DSM32447 según la reivindicación 8 en un rango de 80 a 90 % p/v.
10. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 9, CARACTERIZADA porque corresponde a un aerosol orofaríngeo.
1 1 . Uso de composición inmuno estimulante según ia reivindicación 8, CARACTERIZADA porque sirve para preparar un médicamente útil para el tratamiento de enfermedades Infecciosas del Tracto Urinario.
12. Uso de composición inmuno estimulante según la reivindicación 8, CARACTERIZADA porque sirve para preparar un médicamente útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias del tracto genital.
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