WO2018195637A1 - Cistatina recombinante da cana-de-açúcar para redução do desgaste dentário erosivo e proteção contra cárie dentária - Google Patents

Cistatina recombinante da cana-de-açúcar para redução do desgaste dentário erosivo e proteção contra cárie dentária Download PDF

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WO2018195637A1
WO2018195637A1 PCT/BR2018/050134 BR2018050134W WO2018195637A1 WO 2018195637 A1 WO2018195637 A1 WO 2018195637A1 BR 2018050134 W BR2018050134 W BR 2018050134W WO 2018195637 A1 WO2018195637 A1 WO 2018195637A1
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dental
cystatin
canecpi
wear
protection against
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PCT/BR2018/050134
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Flavio Henrique Da SILVA
Marília Afonso Rabelo BUZALAF
Andrea Soares Da Costa FUENTES
Adelita Carolina SANTIAGO
John Michael EDWARDSON
Mariana Cardoso MIGUEL
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Fundação Universidade Federal De São Carlos
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Definitions

  • the present invention belongs to the biotechnology section, specifically to the dental area, as it is a product whose active component is an acid-resistant protein, with the potential to protect the dental structure from acid attack, both of microbial origin. non-microbial, and erosive tooth wear.
  • the main difference in the etiology of caries and erosive tooth wear is due to the fact that the acids involved in caries are produced by microorganisms established in a cariogenic biofilm (Takahashi and Nyvad 201 1), while the acids involved in erosive lesions are from the diet (extrinsic) (Barbour and Lussi 2014) or from the gastric content of the host (intrinsic) (Moazzez and Bartlett 2014). Also the pH of the acids involved in the etiology of these lesions is different.
  • critical pH corresponds to a pH value in which the solution is exactly saturated with respect to a specific solid, such as enamel. This depends as much on the solubility of the solid of interest as on the activities of the relevant mineral constituents of the solution, calcium, phosphate, and fluoride to a lesser extent (Lussi and Carvalho 2014).
  • erosion there is subsaturation in relation to both hydroxyapatite and fluorapatite, initially causing a softening of the tooth surface, followed by continuous layer-by-layer dissolution of the enamel crystals, leading to a permanent loss of volume with a softened layer. on the surface of the remaining tissue.
  • dentin is exposed (Lussi, Schlueter et al. 201 1). With dentin exposure, the progression of both caries lesion and erosion lesion undergoes a significant change due to the composition of dentin tissue.
  • Saliva is one of the most important biological factors involved in caries and erosion, having a protective role due to its different functions (Hannig and Baiz 1999, Hannig and Baiz 2001, Lussi, Jaeggi et al. 2004, Van Nieuw Amerongen, Bolscher et al. 2004, Hara, Ando et al.
  • This first adhering protein layer appears to provide the greatest protection against tooth demineralization as it is a very dense electron layer. Subsequent layers have a much looser arrangement compared to that of the basal films (Hannig 1999). It has been reported that there is no difference in protective potential against demineralization of films formed after 3 minutes of saliva exposure compared with those formed 2 hours after (Hannig, Fiebiger et al. 2004).
  • the thickness of the film reaches a plateau between 30 and 90 minutes, with a thickness between 100 and 1000 ⁇ , depending on its location in the buccal cavity, being thicker in the buccal region when compared to the lingual one (Hannig 1999).
  • the film may still undergo intrinsic and extrinsic maturation, which may affect its solubility. Intrinsic maturation may be caused by the presence of transglutaminase, derived from buccal epithelial cells, which can cross-link. between basic PRPs and staterin (Yao, Lamkin et al. 2000, Hannig, Spitzmuller et al. 2008), as well as the presence of alkaline phosphatase.
  • Salivary proteolysis which may occur before (Helmerhorst, Alagl et al. 2006) or after adsorption to hydroxyapatite (McDonald, Goldberg et al. 201 1), plays an important role in extrinsic film maturation, as many of its components are peptide fragments (Vitorino, Calheiros-Lobo et al. 2007, Siqueira and Oppenheim 2009). Film formation and maturation can also be influenced by extrinsic factors such as tooth whitening products, abrasive toothpastes, and ingestion of acidic foods and beverages (Hara and Zero 2010).
  • proline rich staterins and proteins are able to maintain a supersaturation state in relation to calcium and phosphate in the oral cavity by inhibiting their precipitation at neutral pH and releasing these ions after an acid attack and during demineralization. It has recently been reported that the calcium concentration in the film acquired in patients with erosion is reduced by 50% and the concentration of staterin (a calcium binding protein) is reduced by 35% (Carpenter, Cotroneo et al. 2014). In relation to dietary proteins, casein appears to have acid-protective properties (Barbour, Shellis et al. 2008), especially when combined with mucin (Cheaib and Lussi 201 1).
  • ovalbumin can also reduce the dissolution of hydroxyapatite by acid solutions in vitro (Hemingway, Shellis et al. 2008).
  • Acid resistant proteins such as mucins and cystatin B have been identified (Delecrode, Siqueira et al. 2015, Delecrode, Siqueira et al. 2015b).
  • Cystatins are reversible protease inhibitor proteins, more specifically cysteine peptidases. Cystatins found in plants are called phytocystatins, and constitute a subfamily independent of the cystatine superfamily.
  • Sugarcane cystatines were first described by Reis and Margis (2001), who identified in the SUCEST ⁇ Sugarcane Expressed Tags Project) database of sugarcane ESTs, twenty-five probable cystatines, which were classified into four groups by phylogenetic analysis.
  • the present invention aims to provide a product that provides significant protection of tooth enamel mineral loss through its incorporation into the acquired tooth enamel film to prevent enamel dissolution by both microbial acids acting against dental caries, as well as by acids of non microbial origin, acting against dental erosion.
  • the present patent application describes the heterologous expression, purification of a recombinant sugarcane cystatin, called CaneCPI-5, and its insertion in dental products to reduce erosive tooth wear and protect against tooth decay.
  • CaneCPI-5 a recombinant sugarcane cystatin
  • which is of great importance in the dental segment because of its inhibitory action against cathepsin B and because it is an acid-resistant protein that, when incorporated into the acquired film, has the potential to protect the dental structure from acid attacks of microbial or not; and, increases erosive tooth wear resistance.
  • the present invention has as its main advantages:
  • FIG. 2 Amplification of sugarcane cystatin ORF.
  • the CaneCPI-5 cystatin gene region was PCR amplified from clone SCVPAM1059C07.g using specific primers.
  • FIG. 3 Heterologous expression and periodic collection every 1 hour after CaneCPI-5 cystatin induction. SDS-PAGE analysis 15% of samples collected from soluble (1), insoluble (2), uninduced (3) fractions, 1 hour induction (4), 2 hours induction (5), 3 hours induction (6), and with 4 hours of induction (7).
  • M BenchMark TM Protein Ladder (Invitrogen). The arrow indicates the CaneCPI-5 cystatin band (-15.2 kDa).
  • FIG. 5 Inhibition of human cathepsin B by recombinant cystatin.
  • the inhibitory activity of CaneCPI-5 cystatin against human cathepsin B enzyme was measured in fluorometric assay using substrate Z-Phe-Arg-MCA.
  • the graph represents the inhibitor inhibition curve obtained by calculating the residual activity of cathepsin B as the inhibitor was added. Values are expressed as the mean ⁇ standard deviation of three independent experiments.
  • FIG. 6 Typical AFM images of enamel samples that have undergone various treatments.
  • A Control (untreated). Arrows indicate resulting polishing lines.
  • B Citric acid.
  • C Mucine.
  • D Casein.
  • E Mucine plus casein.
  • F CaneCPI-5. The color scale indicates 0-23 nm for (A), (B) and (E), and 0-25 nm for (C), (D) and (F).
  • FIG. 8 Average change in hardness percentage after 1 or 3 days of treatment of enamel samples with human saliva for 2 hours, then protein solutions for 2 hours, followed by 0.65% citric acid challenge for 1 minute. The treatment was performed once / day for 3 days.
  • Seq ID No 3 CaneCPI-5 coding sequence (open reading frame - ORF);
  • Seq ID No 4 Complete amino acid sequence of CaneCPI-5 translated from the ORF described in Seq ID No 3;
  • ⁇ Seq ID No 7 Amino acid sequence of pET28a cloned CaneCPI-5 expressed and used in the experiments described in this application.
  • Amplification (E1) was performed in a final volume of 25 ⁇ _, containing 30 ng of template, 200 ⁇ of each dNTP (Promega), 1 x reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.8, 16 mM MgCl2, 500 mM KCI), 10 pmoles of each primer and 1.25 U of Taq DNA polymerase enzyme (SINAPSE Biotecnologia Ltda.).
  • the T100 Bio-Rad thermal cycler with the following amplification cycle was used: denaturation 94 ° C for 3 minutes, 35 amplification cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 60 seconds and a final extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the amplified product (2) was analyzed (E2) in 1% agarose gel containing 1 ⁇ g / mL ethidium bromide and visualized (E3) in UV on ChemiDoc MP System Bio-Rad.
  • E7 50 ng of the pET28a vector (4) and 16 ng of the insert were used using 1 U of T4 DNA ligase enzyme (Thermo Fisher Scientic) (6) in a final reaction volume of 10 ⁇ _, incubated ( E8) at 4 ° C for 16 hours.
  • the ligation was transformed (E9) into chemocompetent E. coli DH5a.
  • bacteria (7) were plated (E10) in selective LB medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin antibiotic and incubated at 37 ° C for 16 hours. Recombinant colonies (8) were confirmed by PCR (E11) using the primers and reaction cited above.
  • the pET28a vector with CaneCPI-5 (8) was transformed (E12) into E. coli Rosetta (DE3) chemocompetent bacteria (9).
  • Transformed bacteria (9) were plated (E13) in LB medium containing 25 g / ml kanamycin and chloramphenicol antibiotics and incubated (E14) at 37 ° C for 16 hours.
  • a recombinant colony (10) was isolated (E15) for the pre-inoculum in 5 ml LB culture medium with 25 g / ml kanamycin and chloramphenicol and the culture (11) was kept under stirring (E16) at 200 rpm.
  • cells (14) were centrifuged (E21) in Sorvall RC-5C centrifuge at 5500xg, 4 ° C for 10 minutes.
  • the precipitate (15) was resuspended (E22) in 30 mL lysis buffer (100 mM NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4, 10 mM Tris), pH 8.0 and sonicated (E23) with five one minute pulses at 20 ° C. % at 30-second intervals using the Sonic Dismembrator 500 sonicator (Fisher Scientific).
  • Lysate (16) was centrifuged (E24) at 1100 xg, 4 ° C for 15 minutes and supernatant (17), after filtering (E25) on 0.45 ⁇ Millipore membrane, was purified (E26) by affinity chromatography. , a column containing 3 mL Ni-NTA Superilow (Qiagen) nickel resin (18) was used to purify CaneCPI-5 (17), Seq ID No 7. The column was equilibrated with 5 volumes of lysis buffer (19). and the supernatant containing CaneCPI-5 (17) was applied. Resin (20) was washed (E27) with 3 volumes (9 mL) of lysis buffer (19).
  • Protein (21) was eluted (E28) with 2 volumes (6 mL) of lysis buffer (19) containing different concentrations of imidazole (10, 25, 50, 75, 100 mM), and 3 volumes (9 mL) containing 250 mM imidazole.
  • the eluted fractions (22) collected were analyzed (E29) in denaturing polyacrylamide gel (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis - SDS-PAGE) 15%.
  • Purified protein (23) was dialyzed (E30) using 3500 MWCO membrane (Pierce) against 1 liter PBS buffer (24) pH 8.0 at 4 ° C, performing three (1 liter) changes: one after 1 hour , one after 2 hours and one after 16 hours.
  • CaneCPI-5 (25) was then sterilized (E31) on a 0.22 ⁇ Millex-GV filter (Millipore) and its concentration was determined (E32) by the Bradford 1976 method using Hitachi U5100 Spectrophotometer and CaneCPI-5 ready for use. to be used (26) has been made available.
  • Product (26) can be immediately added (E33) to dental products or stored (E34) in a -20 ° C (or -80 ° C) freezer indefinitely.
  • Ready CaneCPI-5 (26) can still be lyophilized (E35) for stabilization, preferably with cryostabilizers such as glycerol, sorbitol, polyethylene glycol, xylitol, glucose and others.
  • cryostabilizers such as glycerol, sorbitol, polyethylene glycol, xylitol, glucose and others.
  • other expression systems such as filamentous fungi and yeast, including Pichia pastoris, may be used.
  • the protein could be produced in transgenic plants such as sugarcane itself, tobacco, Arabidopsis, tomato etc. Synthesis could still be performed independently of biological systems, ie in vitro.
  • other sugarcane cystatins may also have similar dental properties to CaneCPI-5 (26), which is the subject of this patent application.
  • CaneCPI-5 (26) due to its properties can be added to dental products such as dentifrices, gels, mouthwash solutions and chewable tablets, chewing gum and mouth sprays in an amount ranging from 0.05 at 3% w / w, according to the product.
  • dental products such as dentifrices, gels, mouthwash solutions and chewable tablets, chewing gum and mouth sprays in an amount ranging from 0.05 at 3% w / w, according to the product.
  • some formulations are proposed for such products, which are non-limiting examples of the invention:
  • the dentifrice has in its composition abrasive components, between 4 and 50% w / w, according to the desired degree of abrasiveness, among them calcium carbonate, calcium pyrophosphate (conditioned to the use of monofluorophosphate as fluorinated agent) or, preferably silica gel; humectant components, ranging from 20 to 65% w / w, and may be sorbitol, glycerin, polyethylene glycol, propylene glycol and / or mixtures thereof; binder components, from 0.5 to 7% w / w, which may be carboxymethicellulose, xanthan gum, thickening silica or a mixture thereof; surfactant components, ranging from 1 to 6% w / w, which may be betaines, cocoamidopropyl betaine or, preferably, sodium lauryl sulfate or a mixture thereof; preservatives, from 0.01 to 0.5% w / w, which may be
  • the gel dental composition comprises as an adjuvant component hydroxycellulose; as a binding agent glycerine, more specifically;
  • the propylene glycol as a wetting component, as well as methylparaben and imidazolidinyl urea as preservatives and deionized water in a maximum amount of 7.5%.
  • CaneCPI-5 concentration may range from 0.05 to 3%.
  • an antioxidant agent, retinoic acid, a vitamin A acid is added.
  • Mouthwash solution will be prepared with deionized, flavoring, preservative (methylparaben and imidazolidinyl urea) and CaneCPI-5 (26) with concentrations ranging from 0.05 to 3%.
  • CaneCPI-5 (26) to bind to tooth enamel and protect against acid dissolution was analyzed by Atomic Force Microscopy, as described below.
  • CaneCPI-5 (0.025 mg / ml), and CaneCPI-5 (0.025 mg / ml) applied prior to formation of the acquired film.
  • Stimulated saliva was collected from three volunteers and used to form an acquired enamel film on the samples for 2 hours. Samples from the first four groups were exposed to protein solutions with shaking at 30 ° C for 2 hours. For the final group, the enamel samples were treated with CaneCPI-5 in solution before the film formed.
  • the microscope was operated in touch mode using silicon beams (OTESPA-R3, Bruker, UK) with a spring constant of 26 N / m and a resonant frequency of 300 kHz.
  • OESPA-R3 silicon beams
  • Bruker Bruker, UK
  • Enamel samples were washed with Milli-Q water and dried under nitrogen gas stream. The samples were mounted on steel discs using Azul Tack®, and the discs were fixed using BluTak® in the center of 6 cm Petri dishes. Phosphate buffered saline (pH 7.4; 4.5 mL) was added to the plate to submerge the enamel sample. Mucin, casein and CaneCPI-5 were covalently coupled to the AFM silicon nitride tips (the "C” cantilever of MLCT probes (Bruker), which had an excitation frequency of 7 kHz and a specified spring constant of 0, 01 N / m) via a flexible polyethylene glycol linker (PEG18).
  • the tips were amino-functionalized using 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES, and then reacted with acetal-PEG18-NHS.
  • Aceto groups were converted to aldehyde groups by incubating the tip in 1% citric acid followed by washing Then the aldehyde groups reacted with protein amino groups by incubating the tip with a protein solution.
  • CaneCPI-5 (26) to bind to tooth enamel and protect against acid dissolution was also analyzed by working experiments, as described below.
  • Newly extracted bovine incisors were used.
  • the teeth were stored in 0.1% buffered thymol solution (pH 7.0) at 4 ° C (Kato et al. 2010).
  • the crowns were separated from the roots with a diamond saw (Isomet 1000; Buehler, Lake Bluff, IL, USA) using two parallel diamond discs separated by a 4 mm spacer. 1 -2 blocks were cut from the crown of each bovine incisor.
  • the samples were individually fixed on wax acrylic discs.
  • the enamel surfaces of the blocks were leveled with water-cooled carborundum discs (320, 600, and 1200 paper types AI2O3; Buehler, Lake Bluff, IL, USA), and polished with diamond spray felt (1 micron; Buehler, Lake Bluff, IL, USA) on a machine rotary polishing. After polishing, the specimens were cleaned in an ultrasonic bath (T7 Thornton, single Ind and with Ltda, Sao Paulo, SP, Brazil) for 7 minutes using deionized water.
  • an ultrasonic bath T7 Thornton, single Ind and with Ltda, Sao Paulo, SP, Brazil
  • blocks were pre-selected based on their initial hardness. Six notches in the central region of the blocks (100 meters apart) were made using a 50 g load (penetrating Knoop) for 15 seconds (HMV-2000; Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan). Baseline hardness (SHb) values were determined by the average of six wells. Only samples with 10% above or below average baseline indentation were used. Saliva Collection
  • 0.27% mucin + 0.5% casein was prepared using bovine milk casein (Sigma) and pig gastric mucin (Sigma) dissolved in deionized water.
  • cystatin B was prepared using recombinant human cystatin B (Sigma) dissolved in deionized water.
  • the ORF corresponding to cystatin was cloned into the pET-28a expression vector.
  • This vector allows directional cloning of the gene of interest in phase with a sequence, which encodes a "tail" of six C-terminal or N-terminal histidines.
  • This "His-Tag” facilitates purification of the fusion protein by affinity chromatography and can subsequently be removed if necessary since between the protein sequence of interest and the histidines there is a site for the thrombin protease.
  • the protein, CaneCPI-5 was expressed by fusion with the histidine tail (His-Tag) in the N-terminal region, derived from the pET-28a vector, Seq ID no: 6.
  • Ki the inhibition constant
  • CHENG and PRUSOFF the enzyme-inhibitor complex dissociation constant
  • cathepsin B When compared to other cysteine peptidases, cathepsin B contains a structural element, called the occluding loop, which blocks the gap of the active site (MUSIL et al, 1991). Since cystatins inhibit cathepsins through competitive binding to the active site, conformation of this loop to cathepsin B is incompatible with cystatine binding. This influence of the loop on accessibility to the active site is reflected in higher Ki values for most cystatins when compared to those obtained against cysteine peptidases that lack such a loop. (BARRETT et al., 1986; KONDO et al., 1990; ABRAHAMSON, 1994; OHTSUBO et al., 2005; MARTINEZ et al, 2005b).
  • Enamel samples were incubated with water-enriched saliva (control), mucin (2.7 mg / ml) plus casein (5 mg / ml), cystatin B (0.025 mg / ml), and CaneCPI-5 (0.025 mg / ml) at 30 ° C for 2 h.
  • a group of enamel samples were incubated with CaneCPI-5 prior to saliva treatment. All samples were then incubated once daily for three days in 0.65% citric acid (pH 3.4) for 1 minute at 30 ° C. After one day, the% SHC for the control group was 46.9 ⁇ 6.7 (SEM)%.
  • FIG.6 AFM topographic images (Fig.6) of untreated and protein-coated enamel samples: mucin (2.7 mg / ml_), casein (10 mg / ml), mucin (2.7 mg / ml) plus casein (10 mg / ml), and Canecystatin-5 (0.86 mg / ml) before and after incubation with citric acid (0.65%, pH 3.4 for 1 min) were performed in air.
  • casein and CaneCPI-5 were quantified at the level of a single force molecule by spectroscopy using an atomic force microscope.
  • the proteins were covalently coupled to the silicon nitride AFM probe through a flexible polyethylene glycol binder (PEG18) to allow the protein to interact with the enamel surface in various orientations.
  • Typical force curves for control discs (no protein) and protein-coupled tips are shown in Figure 7. Note that the control force, mucin, and casein axes ( Figures 7A-C), respectively, are identical to each other. others, but different from the power axis for CaneCPI-5 ( Figure 7D).
  • CaneCPI-5 demonstrated a high strength of enamel interaction (and statistically significant; P 0.0001 ⁇ ). In contrast, the forces shown by mucin and casein were not significantly different from control.

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Abstract

A presente invenção refere-se à expressão heteróloga, purificação e inserção em produtos odontológicos de uma cistatina recombinante da cana-de-açúcar para redução do desgaste dentário erosivo e proteção contra cárie dentária, denominada CaneCPI-5. Essa cistatina apresenta grande importância no segmento odontológico devido a sua ação inibitória contra a catepsina B e, por ser uma proteína ácido-resistente, quando incorporada à película adquirida do esmalte dentário, apresenta potencial para proteger a estrutura dentária de ataques de ácidos, de origem microbiana ou não, por impedir a dissolução da mesma, aumentando a resistência ao desgaste dentário erosivo.

Description

CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA BREVE DESCRIÇÃO
[001 ] Trata a presente solicitação de patente de invenção de uma inédita "CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA" que se refere a expressão heteróloga, purificação de uma nova cistatina de cana-de-açúcar, denominada CaneCPI-5, e sua inserção em produtos odontológicos, devido a sua ação inibitória contra a catepsina B e por ser uma proteína ácido-resistente com potencial para proteger a estrutura dentária de ataques de ácidos, de origem microbiana ou não; e, de aumentar a resistência ao desgaste dentário erosivo.
CAMPO DE APLICAÇÃO
[002] A presente invenção pertence à seção de biotecnologia, mais especificamente à área odontológica, por ser tratar de um produto cujo componente ativo é uma proteína ácido-resistente, com potencial para proteger a estrutura dentária do ataque de ácidos, tanto de origem microbiana como não-microbiana, e do desgaste dentário erosivo.
CONVENCIMENTO
[003] A alimentação é essencial para a sustentação da vida, para que ela seja considerada adequada diversos tipos de alimentos, com diferentes nutrientes e propriedades são ingeridos diariamente. Convencionalmente, o processo alimentar se inicia pela boca, a qual possui personagens importantes para o processo digestivo, os dentes e a saliva. O consumo de alguns tipos de alimento favorece o desgaste dental, assim como a má higienização dos dentes favorece a proliferação de bactérias causadoras de cárie. Dessa maneira, pode-se dizer que os hábitos alimentares estão diretamente relacionados aos dois principais tipos de lesões dentárias causadas por ácidos: a cárie e o desgaste dentário erosivo.
[004] Apesar de poder ser facilmente prevenida, a cárie dentária é a doença crónica mais prevalente em todo o mundo, considerada um importante problema de saúde pública, consome recursos consideráveis para o seu tratamento e o de suas sequelas.
[005] Na União Europeia, em 201 1 , os gastos anuais com tratamento dentário foram estimados em 79 bilhões de euros (Rugg-Gunn 2013), enquanto que nos Estados Unidos da América, este custo foi de 1 1 1 bilhões de dólares em 2012 (Wall, Nasseh et al. 2014).
[006] Dados estatísticos relativos aos gastos com tratamentos dentários no Brasil não estão facilmente disponíveis, mas em função do desenvolvimento económico e do IDH (índice de desenvolvimento humano) de alguns países europeus e dos Estados Unidos da América, pode-se especular que cifras proporcionalmente aproximadas incidam também sobre o Brasil. Mundialmente, cerca de 60-90% das crianças e quase 100% dos adultos têm ou tiveram cárie, que frequentemente leva a dor ou desconforto (Organization 2012). Em adição, doenças dentárias, incluindo a cárie, são a principal causa da ausência de crianças na escola (Rugg-Gunn 2013). Dados de prevalência de desgaste dentário erosivo são mais difíceis de serem encontrados, especialmente a nível nacional ou global, sem contar o fato de que os distintos sistemas de registro dificultam a comparação entre os diferentes estudos. Os poucos dados disponíveis revelam um aumento de prevalência, variando de 1 a 79% em dentes decíduos de crianças de 2 a 5 anos, 14% nos dentes permanentes de crianças de 5 a 9 anos, de 7 a 100% em adolescentes de 9 a 20 anos e de 4 a 100% em adultos (18 a 88 anos) (Jaeggi and Lussi 2014). Uma revisão sistemática recente estimou a prevalência de desgaste dentário erosivo em dentes permanente de crianças e adolescentes em 30,4% (Salas, Nascimento et al. 2015). Deve ser considerado que o desgaste dentário erosivo é progressivo e, se não forem instauradas medidas preventivas apropriadas em tempo, a prevalência tende a aumentar com a idade (Jaeggi and Lussi 2014). Sendo as prevalências de cárie e desgaste dentário erosivo elevadas e suas sequelas indesejáveis, a prevenção é altamente necessária.
[007] A principal diferença na etiologia da cárie e do desgaste dentário erosivo se deve ao fato de os ácidos envolvidos na cárie serem produzidos por microrganismos estabelecidos num biofilme cariogênico (Takahashi and Nyvad 201 1 ), enquanto que os ácidos envolvidos nas lesões erosivas são provenientes da dieta (extrínsecos) (Barbour and Lussi 2014) ou do conteúdo gástrico do hospedeiro (intrínsecos) (Moazzez and Bartlett 2014). Também o pH dos ácidos envolvidos na etiologia destas lesões é diferente. No caso da cárie, quando o hospedeiro tem uma dieta rica em açúcares, os microrganismos produzem ácidos, reduzindo o pH do biofilme abaixo do crítico para hidroxiapatita (pH 5,5), mas ficando acima do crítico para a fluorapatita (pH 4,5), o que acaba gerando uma desmineralização de subsuperfície, caracterizada clinicamente como mancha branca, o que caracteriza uma lesão não cavitada (Buzalaf and Whitford 201 1 ). Durante este estágio, ainda é possível reverter o processo, evitando a cavitação e consequentemente a necessidade de restauração (Stahl and Zandona 2007). Já no caso da erosão, embora não exista um pH crítico característico fixo, como no caso da cárie, o "pH crítico" corresponde a um valor de pH no qual a solução é exatamente saturada em relação a um sólido específico, como por exemplo o esmalte. Isto depende tanto da solubilidade do sólido de interesse quanto das atividades dos constituintes minerais relevantes da solução, cálcio, fosfato, e fluoreto, numa menor extensão (Lussi and Carvalho 2014). Na erosão existe subsaturação tanto em relação à hidroxiapatita quanto em relação à fluorapatita, ocasionando inicialmente um amolecimento da superfície dentária, seguido por dissolução contínua de camada por camada dos cristais do esmalte, culminando por levar a uma perda permanente de volume, com uma camada amolecida na superfície do tecido remanescente. Nos estágios mais avançados, a dentina acaba sendo exposta (Lussi, Schlueter et al. 201 1 ). Com a exposição dentinária, a progressão, tanto da lesão de cárie, quanto da lesão de erosão, sofre uma mudança expressiva, em decorrência da composição do tecido dentinário.
[008] Devido à etiologia multifatorial tanto da cárie quanto da erosão dentária, várias possibilidades preventivas e terapêuticas têm sido propostas para o controle destas lesões. Estas estratégias são, em primeira instância, focadas nos fatores etiológicos (Magalhães, Wiegand et al. 2009, Davies and Blinkhorn 2013, Rugg-Gunn 2013, Lussi and Hellwig 2014, Carvalho, Colon et al. 2015). A saliva é um dos mais importantes fatores biológicos envolvidos na cárie e na erosão, tendo um papel protetor devido às suas diferentes funções (Hannig and Baiz 1999, Hannig and Baiz 2001 , Lussi, Jaeggi et al. 2004, Van Nieuw Amerongen, Bolscher et al. 2004, Hara, Ando et al. 2006). Ela dilui os ácidos e promove a sua eliminação da cavidade bucal, através do clearance; tem capacidade tampão, neutralizando os ácidos; é supersaturada em relação ao mineral dentário, fornecendo íons cálcio, fosfato e fluoreto para a remineralização; tem um rico conteúdo proteico, com diferentes propriedades protetoras, além de contribuir para a formação da película adquirida (Nicolau 2009, Buzalaf, Hannas et al. 2012), que é uma camada orgânica, livre de bactérias, que se forma in vivo como resultado da adsorção seletiva de proteínas salivares à superfície do esmalte dentário (Dawes, Jenkins et al. 1963). Sua formação é um processo dinâmico, influenciado por vários fatores, como ciclo circadiano, composição da microbiota bucal, capacidade proteolítica do ambiente bucal e propriedades físico-químicas das superfícies dentárias, bem como localização na cavidade bucal (Lendenmann, Grogan et al. 2000).
[009] A formação da película adquirida inicia-se apenas alguns segundos depois da exposição do esmalte à saliva, ocorrendo um rápido aumento na sua espessura, atingindo cerca de 10-20 nm nos primeiros minutos, a qual fica estável por cerca de 30 minutos (Hannig 1999). Inicialmente ocorre a aderência seletiva de proteínas precursoras, com alta afinidade pela hidroxiapatita, as quais interagem eletrostaticamente com a superfície do esmalte (Hay 1973). Dentre elas encontram-se as proteínas ricas em prolina (PRPs), estaterina e histatinas, conforme identificado por estudos in vitro, embora estudos in situ tenham confirmado a presença também de mucinas, amilase, cistatinas, lisozima e lactoferrina (Siqueira, Custodio et al. 2012).
[010] Esta primeira camada de proteínas que se adere parece ser a que confere a maior proteção contra a desmineralização dentária, uma vez que se trata de uma camada bastante elétron densa. As camadas subsequentes têm um arranjo muito mais frouxo quando comparado àquele das películas basais (Hannig 1999). Foi relatado que não há diferença no potencial protetor contra a desmineralização de películas formadas depois de 3 minutos de exposição à saliva, quando comparadas com aquelas formadas 2 horas após (Hannig, Fiebiger et al. 2004).
[01 1 ] No segundo estágio de formação da película, chamado estágio maturacional, ocorre um rápido aumento na sua espessura (100-1000 nm), o que, juntamente com a presença de estruturas globulares, sugere o envolvimento de agregados proteicos, mais do que proteínas individuais, no seu desenvolvimento (Hannig and Baiz 2001 ).
[012] A espessura da película atinge um plateau, entre 30 e 90 minutos, ficando com uma espessura entre 100 e 1000 μιη, dependendo da sua localização na cavidade bucal, sendo mais espessa na região vestibular quando comparada à lingual (Hannig 1999). A película ainda pode sofrer maturação intrínseca e extrínseca, o que pode afetar a sua solubilidade. A maturação intrínseca pode ser causada pela presença de transglutaminase, derivada de células epiteliais bucais, que pode fazer ligações cruzadas entre as PRPs básicas e a estaterina (Yao, Lamkin et al. 2000, Hannig, Spitzmuller et al. 2008), bem como pela presença de fosfatase alcalina. De fato, as ligações cruzadas enzimáticas e a desfosforilação parecem ser os eventos mais importantes para a maturação intrínseca da película, enquanto que a proteólise parece ser de menor importância (Hannig, Spitzmuller et al. 2008). Já a proteólise salivar, que pode ocorrer antes (Helmerhorst, Alagl et al. 2006) ou após a adsorção à hidroxiapatita (McDonald, Goldberg et al. 201 1 ), desempenha um importante papel na maturação extrínseca da película, já que muitos dos seus componentes são fragmentos peptídicos (Vitorino, Calheiros-Lobo et al. 2007, Siqueira and Oppenheim 2009). A formação e maturação da película também podem ser influenciadas por fatores extrínsecos, como produtos de clareamento dentário, dentifrícios abrasivos e ingestão de alimentos e bebidas ácidos (Hara and Zero 2010).
[013] A incorporação de proteínas salivares na película adquirida pode afetar sua habilidade em proteger contra a erosão. Pacientes com erosão têm a metade da quantidade de proteínas na película adquirida formada in situ quando comparados ao grupo controle, o que reforça a importância do papel protetor das proteínas presentes na película adquirida (Carpenter, Cotroneo et al. 2014). Dentre essas proteínas encontra- se a mucina, que, quando aderida à superfície do esmalte, sozinha ou combinada com outras proteínas, inibe a desmineralização causada por ataque erosivo (Cheaib and Lussi 201 1 ). Além da mucina, as estaterinas e proteínas ricas em prolina (PRPs) são capazes de manter um estado de supersaturação em relação ao cálcio e ao fosfato na cavidade bucal, por inibir a precipitação deles em pH neutro e liberar estes íons após um ataque ácido e durante a desmineralização. Foi relatado recentemente que a concentração de cálcio na película adquirida em pacientes com erosão está reduzida em 50% e a concentração de estaterina (uma proteína ligadora do cálcio) está reduzida em 35% (Carpenter, Cotroneo et al. 2014). Em relação às proteínas presentes na dieta, a caseína parece ter propriedades ácido-protetoras (Barbour, Shellis et al. 2008), especialmente, quando combinada com a mucina (Cheaib and Lussi 201 1 ). Similarmente à caseína, a ovalbumina também pode reduzir a dissolução da hidroxiapatita por soluções ácidas in vitro (Hemingway, Shellis et al. 2008). Num estudo recente de um grupo de pesquisa formado por pesquisadores da UFSCar e da USP, foram identificadas proteínas que restaram na película adquirida formada in situ sobre a dentina e in vivo sobre o esmalte após exposição a ácido cítrico ou ácido lático, simulando processos erosivo ou carioso, respectivamente. Foram identificadas proteínas ácido resistentes, como as mucinas e a cistatina B (Delecrode, Siqueira et al. 2015, Delecrode, Siqueira et al. 2015b).
[014] Alguns estudos têm relatado importantes aplicações para cistatinas recombinantes, incluindo na área de odontologia. As cistatinas são proteínas inibidoras reversíveis de proteases, mais especificamente, as cisteíno-peptidases. As cistatinas encontradas em plantas são denominadas fitocistatinas, e constituem uma subfamília independente da superfamília das cistatinas. As cistatinas de cana-de-açúcar foram primeiramente descritas por Reis e Margis (2001 ), que identificaram no SUCEST {Sugarcane Expressed Tags Project) banco de dados de ESTs da cana-de-açúcar, vinte e cinco prováveis cistatinas, as quais foram classificadas em quatro grupos por meio de análises filogenéticas. Recentemente, o Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Genética e Evolução da UFSCar identificou e estudou a atividade de duas novas cistatinas da cana-de-açúcar, denominadas Cane-CPI5 e CaneCPI-6. Essas proteínas foram capazes de inibir a atividade de Catepsinas humanas e também de insetos praga (Miguel, 2014).
[015] A partir do exposto, tem-se que o reforço da película adquirida pela alteração da sua composição, através da "engenharia de película", tem sido sugerido como uma medida promissora para prevenção da desmineralização dentária (Vukosavljevic, Custodio et al. 2014). Dentro desse conceito, a busca por proteínas ácido-resistentes na película, bem como por compostos que, uma vez incorporados à película possam aumentar o seu potencial ácido-resistente, reveste-se de extrema importância. Uma vez identificados, estas proteínas ou compostos protetores poderão ser incorporados a produtos odontológicos, como dentifrícios, soluções de bochecho ou géis, visando a enriquecer a película com os mesmos e, consequentemente aumentar a sua capacidade ácido-resistente. A cistatina B humana demonstrou ser de interesse para incorporação em produtos odontológicos (Delecrode et al 2015b). Entretanto, a enzima proveniente de humanos tem um alto custo de produção. Assim, a utilização da Cane CPI-5 para essa finalidade é altamente promissora. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[016] No atual estado da técnica, estão presentes alguns documentos que descrevem a utilização de proteínas do grupo das cistatinas como componentes ativos de composições odontológicas. Dentre as anterioridades encontradas, nenhuma mencionou a utilização de uma proteína heteróloga proveniente da cana de açúcar na composição dos produtos e/ou processos descritos. Assim, nenhuma das anterioridades encontradas antecipa completamente a proposta descrita por este pedido de patente.
[017] No atual estado da técnica encontra-se a anterioridade PI9307800-5, intitulada "Composições anticárie" que descreve composições orais e edíveis que oferecem benefícios anticárie, cujo ingrediente ativo primário é uma proteína, em sua totalidade ou fragmentos dela, selecionada do grupo constituído por proteínas salivares, dentre elas cistatina S, cistatina SA, cistatina SN e suas misturas.
[018] Também está presente no atual estado da técnica a anterioridade US2002052476, intitulada "Disclosed is a human CysE polypeptide and DNA (RNA) encoding such polypeptide" a qual descreve um processo de obtenção por técnicas recombinantes de um polipeptídeo, denominado CysE, seu DNA e RNA codificante e seu emprego no tratamento de osteoporose, metástase de tumor, infecções microbianas, infecções virias, choque séptico, inflamação, irritação da retina, cárie, cachicia e perda muscular; a anterioridade também menciona a utilização da CysE em metodologias de detecção de mutações em sua região codificadora e de alteração na concentração dos polipeptídeos em uma amostra derivada de um hospedeiro. Apesar da mencionada proteína ser empregada contra cárie, sua origem é distinta da proposta neste pedido de patente, a CaneCPI-5, cuja origem é a cana-de-açúcar, além de ela ser bastante diferente em sequência de aminoácidos, apenas 23 de identidade em 125 alinhados. A proposição do uso da cistatina humana para cárie está relacionada ao seu potencial antimicrobiano, pelo fato de ela inibir cisteíno peptidases essenciais para os microorganismos no biofilme bacteriano, a CaneCPI-5, além dessa propriedade, ainda apresenta uma forte interação com o esmalte dentário, estando seu mecanismo de ação relacionado à sua incorporação na película adquirida do esmalte, de forma a impedir a dissolução do esmalte, tanto por ácidos de origem microbiana (atuando contra a cárie dentária) quanto por ácidos de origem não microbiana (atuando contra a erosão dentária); o que evidencia que a ação da CaneCPI-5 contra a cárie é mais eficiente do que a de cistatina recombinante humana, uma vez que ela possui dois mecanismos de ação, inibição de microrganismos e ligação ao esmalte, o que a cistatina humana não possui.
[019] A partir do exposto, observa-se que nenhuma das anterioridades encontradas antecipa totalmente a proposta do presente pedido de patente. Assim, nenhuma das anterioridades antecipa a proposta que descreva a expressão heteróloga, purificação de uma cistatina recombinante da cana-de-açúcar e sua inserção em produtos odontológicos para redução do desgaste dentário erosivo e proteção contra cárie dentária.
OBJETIVO DA INVENÇÃO
[020] A presente invenção tem como objetivo dispor um produto que proporcione proteção significativa da perda mineral do esmalte dentário, através de sua incorporação à película adquirida do esmalte dentário, de forma a impedir a dissolução do esmalte tanto por ácidos de origem microbiana, atuando contra a cárie dentária, quanto por ácidos de origem não microbiana, atuando contra a erosão dentária.
DA INVENÇÃO
[021 ] O presente pedido de patente de invenção descreve a expressão heteróloga, purificação de uma cistatina recombinante da cana-de-açúcar, denominada CaneCPI-5, e sua inserção em produtos odontológicos para redução do desgaste dentário erosivo e proteção contra cárie dentária. A qual, apresenta grande importância no segmento odontológico devido a sua ação inibitória contra a catepsina B e por ser uma proteína ácido-resistente que, quando incorporada à película adquirida, apresenta potencial para proteger a estrutura dentária de ataques de ácidos, de origem microbiana ou não; e, aumenta a resistência ao desgaste dentário erosivo.
VANTAGENS DA INVENÇÃO
[022] Em suma, a presente invenção apresenta como principais vantagens:
■ Dispor um produto com potencial para proteger a estrutura dentária de ataques de ácidos, de origem microbiana ou não, e de aumentar a resistência ao desgaste dentário erosivo;
■ Dispor um produto com papel protetor contra a desmineralização do esmalte dentário; Dispor um produto a ser incorporado a produtos odontológicos, como dentifrícios, soluções de bochecho, géis para aplicação tópica, comprimidos mastigáveis, goma de mascar e sprays bucais;
■ Dispor um produto com custo de produção reduzido e com processo de produção relativamente simples.
DESCRIÇÃO DA FIGURA
[023] A invenção será descrita em uma realização preferencial, assim, para melhor entendimento serão feitas referências ao fluxograma e as imagens anexas.
■ Figura 1 : Fluxograma do processo de obtenção da CaneCPI-5;
■ Figura 2: Amplificação da ORF da cistatina da cana-de-açúcar. A região gênica da cistatina CaneCPI-5 foi amplificada por PCR a partir do clone SCVPAM1059C07.g, utilizando primers específicos. Nas colunas do gel: (L) 1 Kb DNA ladder (Invitrogen),
(1 ) controle negativo da PCR, e (2) produto de PCR correspondente a ORF da cistatina. pb: pares de bases. A seta indica a banda amplificada de aproximadamente 345 pb para CaneCPI-5. Gel de agarose 1 %.
■ Figura 3: Expressão heteróloga e coleta periódica a cada 1 hora após a indução da cistatina CaneCPI-5. Análise em SDS-PAGE 15% das amostras coletadas das frações solúveis (1 ), e insolúveis (2), não induzidas (3), com 1 hora de indução (4), com 2 horas de indução (5), com 3 horas de indução (6), e com 4 horas de indução (7). M: BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen). A seta indica a banda referente à cistatina CaneCPI-5 (-15,2 kDa).
■ Figura 4: Expressão heteróloga e purificação da cistatina CaneCPI-5. Análise em SDS-PAGE 15% das amostras coletadas das culturas não induzidas (1 ), e induzidas
(2) , das frações insolúveis (3), e solúvel (4), resultante da lise celular, e da purificação em coluna de níquel (5). M: BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen). A seta indica a banda referente à cistatina CaneCPI-5 (-15,2 kDa).
■ Figura 5: Inibição da catepsina B humana pela cistatina recombinante. A atividade inibitória da cistatina CaneCPI-5 contra a enzima catepsina B humana foi medida em ensaio fluorométrico utilizando o substrato Z-Phe-Arg-MCA. O gráfico representa a curva de inibição do inibidor, obtida pelo cálculo da atividade residual da catepsina B humana à medida que o inibidor foi adicionado. Os valores estão expressos como a média ± o desvio padrão de três experimentos independentes.
■ Figura 6: Imagens de AFM típicas de amostras de esmalte, as quais foram submetidas a vários tratamentos. (A) Controle (não tratado). As setas indicam linhas resultantes de polimento. (B) Ácido cítrico. (C) Mucina. (D) Caseína. (E) Mucina mais caseína. (F) CaneCPI-5. A escala de cor indica 0-23 nm para (A), (B) e (E), e 0-25 nm para (C), (D) e (F).
■ Figura 7: Curvas típicas de força. (A) Controle (sem proteína). (B) Mucina. (C)
Caseína. (D) Canacistatina-5. Atenção para a diferença na escala de força entre (A-
C) e (D).
■ Figura 8: Variação média de percentual de dureza após 1 ou 3 dias do tratamento das amostras de esmalte com saliva humana durante 2 horas, em seguida, com soluções de proteínas durante 2 horas, seguido de desafio com ácido cítrico a 0,65% durante 1 minuto. O tratamento foi realizado uma vez / dia durante 3 dias.
[024] DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE DNA E PROTEÍNA
S Seq ID no 1 : primer CaneCPI-5 Forward
S Seq ID no 2: primer CaneCPI-5 Reverse
■ Seq ID no 3: Sequência codificante da CaneCPI-5 (open reading frame - ORF); ■ Seq ID no 4: Sequência completa de aminoácidos da CaneCPI-5 traduzida a partir da ORF descrita na Seq ID no 3;
■ Seq ID no 5: Sequência codificante da CaneCPI-5, sem o peptídeo sinal, clonada no plasmídeo pET28a;
■ Seq ID no 6: Sequência de DNA final da CaneCPI-5, incluindo bases adicionais
(cada de histidinas e outras) do plasmídeo pET28a;
■ Seq ID no 7: Sequência de aminoácidos da CaneCPI-5 clonada em pET28a, expressa e utilizada nos experimentos descritos no presente pedido.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[025] O processo de obtenção da CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE- AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA (Figura 1 ) se inicia com a amplificação (E1 ) da região codificante (1 ) da CaneCPI-5, Seq ID no 3, por reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) a partir do clone de cDNA SCVPAM1059C07.g (Projeto SUCEST-FAPESP), utilizando os primers descritos na Seq ID no 1 e Seq ID no 2, usando as enzimas de restrição Nhe-\ e BamHA (Thermo Fisher Scientific), para posterior clonagem no vetor de expressão pET28a (Novagen). A amplificação (E1 ) foi realizada em um volume final de 25 μΙ_, contendo 30 ng de molde, 200 μΜ de cada dNTP (Promega), tampão de reação 1 x (Tris-HC1 100 mM pH 8,8, MgCI2 16 mM, KCI 500 mM), 10 pmoles de cada primer e 1 ,25 U da enzima Taq DNA polimerase (SINAPSE Biotecnologia Ltda.). Para a amplificação (E1 ), foi utilizado o termociclador T100 Bio-Rad com o seguinte ciclo de amplificação: desnaturação 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de amplificação a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 60 segundos e uma extensão final a 72°C, durante 10 minutos. O produto amplificado (2) foi analisado (E2) em gel de agarose 1 %, contendo 1 μg/mL de brometo de etídeo e visualizado (E3) em UV no equipamento ChemiDoc MP System Bio-Rad.
[026] Para a clivagem (E4) com as enzimas (3) Nhe\ e Bam \ (1 ,5 U) foram usados 2 μg do produto amplificado (2) e do vetor pET28a (4) em uma reação de 50 μΙ_ a 37°C por 2 horas. Os produtos clivados (5) foram recuperados (E5) em gel de agarose 1 % e purificados (E6) com o kit Wizard SV Gel and PCR Clean Up System (Promega). Para posterior ligação (E7), foram usados 50 ng do vetor pET28a (4) e 16 ng do inserto usando 1 U da enzima T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientic) (6) em um volume final de reação de 10 μΙ_, incubada (E8) a 4°C por 16 horas. A ligação foi transformada (E9) em E. coli DH5a quimiocompetentes. Após transformação (E9), as bactérias (7) foram plaqueadas (E10) em meio seletivo LB contendo 25 μg/mL do antibiótico canamicina e incubadas a 37°C por 16 horas. As colónias recombinantes (8) foram confirmadas por PCR (E1 1 ) usando os primers e reação anteriormente citados.
[027] Para a expressão recombinante, o vetor pET28a com a CaneCPI-5 (8) foi transformado (E12) em bactérias quimiocompetentes E. coli Rosetta (DE3) (9). As bactérias transformadas (9) foram plaqueadas (E13) em meio LB contendo 25 g/mL dos antibióticos canamicina e cloranfenicol e incubadas (E14) a 37°C por 16 horas. Uma colónia recombinante (10) foi isolada (E15) para o pré-inóculo em 5 mL de meio de cultura LB com 25 g/mL de canamicina e cloranfenicol e a cultura (1 1 ) foi mantida sob agitação (E16) de 200 rpm a 37°C por 16 horas em shaker New Brunswick Scientific IL Ecxella E24. Após este período, o pré-inóculo (12) foi adicionado (E17) a 500 mL de meio LB contendo 25 g/mL de canamicina e cloranfenicol sob agitação (E18) de 200 rpm a 37°C até atingir a DOeoo de 0,5. A expressão (E19) de CaneCPI-5, Seq ID no 6, foi induzida pela adição de IPTG {Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside) (13) a uma concentração final de 0,4 mM por 4 horas sob as mesmas condições de agitação (E20) e temperatura, de 200 rpm a 37°C. Após o período de indução as células (14) foram centrifugadas (E21 ) em centrífuga Sorvall RC-5C a 5500xg, 4°C por 10 minutos. O precipitado (15) foi ressuspendido (E22) em 30 mL de tampão de lise (NaCI 100 mM, NaH2PO4 50 mM, Tris 10 mM), pH 8,0 e sonicado (E23) com cinco pulsos de um minuto à potência de 20%, com intervalos de 30 segundos, utilizando o sonicador Sonic Dismembrator 500 (Fisher Scientific). O lisado (16) foi centrifugado (E24) a 1 1900 xg, 4°C por 15 minutos e o sobrenadante (17), após filtragem (E25) em membrana Millipore 0,45 μιη, foi purificado (E26) por cromatografia de afinidade, uma coluna contendo 3 mL da resina de níquel Ni-NTA Superílow (Qiagen) (18) foi usada para purificar a CaneCPI- 5 (17), Seq ID no 7. A coluna foi equilibrada com 5 volumes de tampão lise (19) e o sobrenadante contendo a CaneCPI-5 (17) foi aplicado. A resina (20) foi lavada (E27) com 3 volumes (9 mL) de tampão de lise (19). A proteína (21 ) foi eluída (E28) com 2 volumes (6 mL) de tampão de lise (19) contendo diferentes concentrações de imidazol (10, 25, 50, 75, 100 mM), e 3 volumes (9 mL) contendo 250 mM de imidazol. As frações eluídas (22) coletadas foram analisadas (E29) em gel de poliacrilamida desnaturante (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis - SDS-PAGE) 15%. A proteína purificada (23) foi dialisada (E30) usando membrana 3500 MWCO (Pierce) contra 1 litro de tampão PBS (24) pH 8,0, a 4°C, realizando três trocas (de 1 litro): uma após 1 hora, uma após 2 horas e uma depois de 16 horas. A CaneCPI-5 (25) foi então esterilizada (E31 ) em filtro Millex-GV 0,22 μιη (Millipore) e sua concentração foi determinada (E32) pelo método Bradford, 1976, utilizando Espectrofotômetro Hitachi U5100 e a CaneCPI-5 pronta para ser utilizada (26) foi disponibilizada. O produto (26) pode ser imediatamente adicionado (E33) a produtos odontológicos ou armazenado (E34) em freezer -20°C (ou - 80°C), indefinidamente. A CaneCPI-5 pronta (26) ainda pode ser liofilizada (E35) para estabilização, de preferência com crioestabilizadores como glicerol, sorbitol, polietilenoglicol, xilitol, glicose dentre outros. [028] Além do vetor pET28a e de sua transformação em E. coli DH5a quimiocompetentes, podem ser utilizados outros sistemas de expressão como fungos filamentosos e leveduras, incluindo Pichia pastoris. A proteína poderia ser produzida em plantas transgênicas, como a própria cana-de-açúcar, tabaco, Arabidopsis, tomateiro etc.A síntese ainda poderia ser realizada independentemente de sistemas biológicos, ou seja, in vitro. Apesar de ainda não terem sido testadas, outras cistatinas provenientes da cana-de-açúcar também podem apresentar propriedades odontológicas parecidas com a CaneCPI-5 (26), objeto do presente pedido de patente.
[029] A CaneCPI-5 (26) devido às suas propriedades pode ser adicionada a produtos odontológicos como dentifrícios, géis, soluções para bochecho e ainda em comprimidos mastigáveis, goma de mascar e sprays bucais, em uma quantidade que varia entre 0,05 a 3% p/p, de acordo com o produto. Assim, são propostas algumas formulações para esses produtos, as quais são exemplos não limitativos da invenção:
[030] O dentifrício apresenta em sua composição componentes abrasivos, entre 4 a 50% p/p, conforme o grau de abrasividade desejado, dentre eles carbonato de cálcio, pirofosfato de cálcio (condicionado à utilização de monofluorofosfato como agente fluoretado) ou, preferencialmente, sílica gel; componentes umectantes, variando entre 20 a 65% p/p, podendo ser sorbitol, glicerina, polietilenoglicol, propilenoglicol e/ou misturas deles; componentes aglutinantes, entre 0,5 a 7% p/p, podendo ser carboximeticelulose, goma xantana, sílica espessante ou mistura dos mesmos; componentes tensoativos, entre 1 a 6% p/p, podendo ser betaínas, cocoamidopropilbetaína ou, preferencialmente, lauril sulfato de sódio ou mistura deles; agentes conservantes, entre 0,01 e 0,5% p/p, podendo ser metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio, hidroxibenzoato de metila ou mistura deles; agentes fluoretados, entre 500 a 5000 ppm, podendo ser monofluorfosfato de sódio, tetrafluoreto de titânio, fluoreto estanoso, fluoreto de amina, preferencialmente fluoreto de sódio, ou mistura deles; agentes antiplaca, podendo ser clorexidina, cloreto de cetilpiridíneo, triclosan e CaneCPI-5 (26), entre 0,05 a 3% p/p. A formulação de dentifrício descrita apresente pH acidulado que varia de cerca de 6,0 a 7,0.
[031 ] A composição odontológica em gel compreende como componente adjuvante a hidroxicelulose; como agente aglutinante a glicerina, mais especificamente; o propilenoglicol como componente umectante, além de metilparabeno e imidazolidinil uréia como conservantes e água deionizada em quantidade máxima de 7,5%. A concentração de CaneCPI-5 poderá variar de 0,05 a 3%. De forma opcional, caso ultrapassada a quantidade de água, adiciona-se um agente antioxidativo, ácido retinóico, um ácido da vitamina A.
[032] A solução para bochecho será preparada com água deionizada, flavorizante, conservante (metilparabeno e imidazolidinil uréia) e CaneCPI-5 (26) com concentração variando entre 0,05 e 3%.
[033] A seguir são mostrados os resultados de ensaios feitos com CaneCPI-5 (26):
[034] O potencial da CaneCPI-5 (26) para se ligar ao esmalte dentário e proteger contra dissolução ácida foi analisado através de Microscopia de Força Atómica, a partir do descrito a seguir.
Preparação da amostra
[035] As amostras foram cortadas a partir do meio da face vestibular das coroas usando uma serra ISOMET a baixa velocidade (Buehler, Lake Bluff, IL, EUA) com dois discos de diamante (Extec, Enfield, CT, EUA) separados por um de 4 mm e espaçador grosso. A superfície do esmalte foi moída com discos refrigerados a água com carboneto de silício (320, 600 e 1 .200 documentos de qualidade, ANSI grão; Buehler) e polidos com papel de filtro molhado com spray de diamante. Finalmente, as amostras foram limpas em água destilada utilizando um banho de ultrassom para remover qualquer resíduo.
[036] Medição do efeito de enriquecimento de proteína da película adquirida na mudança de dureza de superfície, em resposta ao ácido
[037] Amostras de esmalte foram divididas em cinco grupos (n = 15 para cada grupo): água (controle), mucina (2,7 mg / ml) mais caseína (5 mg / ml), cistatina-B (0,025 mg / ml), CaneCPI-5 (0,025 mg / ml), e CaneCPI-5 (0,025 mg / ml) aplicados antes da formação da película adquirida. Saliva estimulada foi recolhida a partir de três voluntários e utilizada para formar uma película de esmalte adquirido sobre as amostras durante 2 horas. As amostras dos quatro primeiros grupos foram expostas às soluções de proteínas com agitação a 30°C durante 2 horas. Para o grupo final, as amostras de esmalte foram tratadas com CaneCPI-5 em solução antes da película se formar. Todas as amostras foram depois incubadas em 0,65% de ácido cítrico (pH 3,4) durante 1 minuto a 30°C. O tratamento foi conduzido uma vez por dia durante três dias. Para medir a dureza da superfície do esmalte, cinco entalhes foram feitos, utilizando 25 g durante 10 segundos (Knoop-KHN, kgf / mm2; Shimadzu HMV-2 Tóquio, Japan Micro hardness tester) e foi calculada a variação de dureza percentual de superfície (% SHC). Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey (p <0,05).
[038] Medição do efeito da camada de proteína na rugosidade da superfície, em resposta ao ácido
[039] Amostras de esmalte foram divididas em cinco grupos (n = 8 para cada grupo): controle (sem proteína), mucina (2,7 mg / mL), caseína (10 mg / ml), mucina (2,7 mg / ml) mais caseína (10 mg / mL), e CaneCPI-5 (0,85 mg / ml). Todas as amostras foram previamente lavadas com água Milli-Q e secas numa corrente de azoto gasoso. As amostras foram montadas em discos de aço com fita dupla face e digitalizadas no ar usando um microscópio de força atómica Bioscope controlado por um Nanoscope Illa (Bruker, Coventry, Reino Unido). O microscópio foi operado em modo tocando usando vigas de silício (OTESPA-R3, Bruker, UK) com uma constante de mola de 26 N/m e uma frequência de ressonância de 300 kHz. Para o tratamento com proteínas, as amostras de esmalte foram em seguida incubadas em soluções contendo as concentrações de proteína descritas acima durante 4 horas à temperatura ambiente, com agitação suave.
[040] As amostras foram enxaguadas com água e secas. Microscopia de força atómica (AFM) foi conduzida para detectar qualquer alteração na rugosidade da superfície, como consequência da deposição de proteínas. Todas as amostras (controle e tratadas com proteína) foram então incubadas numa solução de ácido cítrico a 0,65% (pH 3,5) durante 1 minuto à temperatura ambiente com agitação suave, e novamente lavadas com água e secas. Foram obtidas imagens das amostras mais uma vez para avaliar o efeito do ácido sobre a rugosidade superficial. As imagens de AFM foram niveladas usando o software Nanoscope e processadas usando o Gwyddion 2,44 free scanning probe microscopy data analysis Software (http://gwyddion.net/). Especificamente, oito linhas de perfis diagonais (128 pixels de largura) foram traçadas randomicamente em cada imagem, para obter o valor médio de rugosidade para a imagem. Os valores de rugosidade para os diferentes grupos foram comparados utilizando um teste t não pareado, com nível de significância de 0,05. Medição de força molecular por AFM
[041 ] Amostras de esmalte foram lavadas com água Milli-Q e secas em corrente de azoto gasoso. As amostras foram montadas em discos de aço, utilizando Azul Tack®, e os discos foram fixados, utilizando BluTak®, no centro de 6 cm placas de Petri. Solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4; 4,5 ml) foi adicionada à placa de modo para submergir a amostra de esmalte. A mucina, caseína e CaneCPI-5 foram covalentemente acopladas às pontas de nitreto de silício de AFM (o cantilever "C" de sondas MLCT (Bruker), que tinha uma frequência de excitação de 7 kHz e uma constante de mola especificada de 0,01 N/m), via um linker flexível de polietilenoglicol (PEG18).
[042] Especificamente, as pontas foram amino-funcionalizadas utilizando 3- aminopropiltrietoxissilano (APTES, e depois reagidas com acetal-PEG18-NHS. Os grupos aceto foram convertidos em grupos aldeído por incubação da ponteira em ácido cítrico a 1 %, seguido de lavagem em água. Em seguida, os grupos aldeído reagiram com grupos amino da proteína por incubação da ponteira com uma solução da proteína.
[043] Medições de força foram realizadas sob fluído a um pH de 7,4 com um microscópio de força atómica Bioscópio (Bruker). Forças de ruptura e valores de separação de descolamento foram obtidas de curvas força-extensão, utilizando o software Scanning Probe de processamento de imagem.
[044] O potencial da CaneCPI-5 (26) para se ligar ao esmalte dentário e proteger contra dissolução ácida também foi analisado através de Experimentos funcionas, a partir do descrito a seguir.
[045] Preparação de amostras de esmalte
[046] Incisivos bovinos recém-extraídos foram utilizados. Os dentes foram armazenados em 0,1 % de solução de timol tamponada (pH 7,0) a 4°C (Kato et al. 2010). As coroas foram separadas das raízes com uma serra de diamante (Isomet 1000;. Buehler, Lake Bluff, IL, EUA), utilizando dois discos de diamante paralelas separadas por um espaçador de 4 mm. 1 -2 blocos foram cortados a partir da coroa de cada incisivo bovino. As amostras foram fixadas individualmente em discos de acrílico com cera. As superfícies do esmalte dos blocos foram niveladas com discos carborundum refrigerados a água (320, 600 e 1200 tipos de papéis AI2O3; Buehler, Lake Bluff, IL, EUA)., e polido com feltro com spray de diamante (1 micron; Buehler, Lake Bluff, IL, EUA), em uma máquina de polimento rotativo. Após o polimento, os espécimes foram limpos em banho de ultrassom (T7 Thornton, única Ind e com Ltda, São Paulo, SP, Brasil) por 7 minutos usando água deionizada.
[047] Para fins de normalização, foi realizada uma pré-seleção dos blocos com base em sua dureza inicial. Seis entalhes na região central dos blocos (distantes 100 um do outro) foram realizados, utilizando uma carga de 50 g (Knoop penetrador) durante 15 segundos (HMV-2000; Shimadzu Corporation, Tóquio, Japão). Os valores de linha de base de dureza superficial (SHb) foram determinados pela média de seis cavidades. Somente amostras com recuo da linha de base de 10% acima ou abaixo da média foram utilizadas. Coleta de saliva
[048] O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comité de Ética da Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo. Os voluntários doaram a saliva, depois de assinar um termo de consentimento. Amostras de saliva estimulada em parafina a partir de 3 doadores saudáveis de ambos os sexos, com idade entre 20-35 anos, foram coletadas em frascos resfriados em gelo e agrupados. As coletas foram feitas entre 9 e 1 1 :00. Imediatamente após a coleta, toda a saliva foi centrifugada durante 20 minutos a 4°C e 14000 g. Os sobrenadantes foram divididos em alíquotas de 13 ml e armazenados a -80°C até a sua utilização. Os sobrenadantes foram recolhidos com uma pipeta para a formação de um pool.
As soluções de proteínas
[049] Foram preparadas as seguintes soluções de proteína, todas preparadas imediatamente antes dos experimentos e o seu pH foi ajustado para 7,0:
0,27% de mucina + 0,5% de caseína: foi preparado utilizando a caseína do leite bovino (Sigma) e mucina gástrica de porco (Sigma) dissolvido em água deionizada.
0,025 ug / ul de cistatina B: foi preparado utilizando cistatina B humana recombinante (Sigma) dissolvida em água deionizada.
0.025 μ9/μΙ CaneCPI-5: foi preparado utilizando CaneCPI-5 dissolvida em água deionizada.
Grupos e tratamentos [050] Os espécimes foram selecionados de acordo com sua dureza inicial e divididos em 5 grupos experimentais (n = 15) de acordo com o tratamento recebido: 1 ) água deionizada (controle), 2) 0,27% mucina + solução de caseína 0,5%, 3) 0,025 g/solução uL cistatina-B, 4) 0,025 ug/uL de solução de CaneCPI-5, e 5) 0,025 ug/uL solução de CaneCPI-5 aplicada antes da formação da película adquirida. Exceto para o grupo 5, os espécimes foram imersos na saliva preparada (300 ml), por 2 horas a 30QC, sob agitação constante. Eles foram, em seguida, enxaguados em água deionizada e expostos à solução de proteína (100 mL) durante 2 horas adicionais a 30°C sob agitação constante {Cheaib, 201 1 # 2; Yin, 2006 # 3}. As amostras do grupo 5 foram imersas primeiramente na solução de proteína durante 2 horas a 30°C sob agitação constante, em seguida, enxaguadas em água deionizada e expostas à saliva preparada (300 mL) durante 2 horas adicionais a 30°C sob agitação constante. As amostras foram lavadas mais uma vez em água deionizada e foram incubadas numa solução de 0,65% de ácido cítrico (pH 3,5) durante 1 minuto a 30°C sob agitação constante (1 ml por amostra). Elas foram, em seguida, enxaguadas com água deionizada e secas ao ar. Cada amostra foi tratada uma vez por dia durante 3 dias. Os espécimes foram armazenados em uma câmara de humidade a 4QC entre os tratamentos.
Medição de dureza de superfície
[051 ] Medidas de dureza foram realizadas utilizando um diamante Knoop sob uma carga de 50 g e um tempo de 15 segundos (HMV-2000; Shimadzu Corporation, Tóquio, Japão). Seis entalhes foram feitos no centro do bloco, distantes 100 um do outro. Entalhes controle de 2 e 5 g foram feitos para detectar a possível perda de superfície {Cheaib 201 1 # 2}. A dureza superficial foi analisada na linha de base e depois nos dias 1 e 3 (SHT) e a percentagem de mudança de dureza de superfície (% SHC) foi calculado como uma medida de amaciamento do esmalte, de acordo com a seguinte equação: % de SHC = [(SHB-SHT) / SHb] * 100.
Análise estatística
[052] O software GraphPad InStat versão 3.0 para Windows (GraphPad Software RIPC., La Jolla, CA, EUA) foi utilizado. Uma vez que o pressuposto de normalidade (teste de Kolmogorov-Smirnov) e homogeneidade (teste de Bartlett) foram satisfeitos, os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey (P <0,05). Resultados obtidos a partir dos testes
[053] Amplificação da ORF que codifica a cistatina CaneCPI-5 e construção do vetor de expressão
[054] A ORF foi obtida por PCR, Seq ID no:3, e a análise do produto da amplificação em eletroforese de gel de agarose (Fig. 2) mostrou a presença do fragmento correspondente a cistatina no tamanho esperado, de aproximadamente 345 pb. O produto da PCR (Fig.2) foi ligado ao plasmídeo de propagação pTZ57R/T. Como outras cistatinas de cana-de- açúcar, CaneCPI-1 (SOARES-COSTA et al., 2002), CaneCPI-2 e CaneCPI-3 (GIANOTTI et al., 2006), já haviam sido expressas e purificadas de forma eficiente usando o vetor pET-28a, neste estudo foi adotada a mesma estratégia para a obtenção da proteína CaneCPI-5.
Expressão heteróloga e purificação da cistatina recombinante
[055] A ORF correspondente à cistatina foi clonada no vetor de expressão pET-28a. Este vetor permite a clonagem direcional do gene de interesse em fase com uma sequência, que codifica uma "cauda" de seis histidinas na extremidade C ou N-terminal. Esta "His- Tag" facilita a purificação da proteína de fusão por cromatografia de afinidade e posteriormente pode ser removida, se necessário, uma vez que entre a sequência da proteína de interesse e as histidinas existe um sítio para a protease trombina. Dessa maneira, a proteína, CaneCPI-5 foi expressa em fusão com a cauda de histidinas (His- Tag), na região N-terminal, derivada do vetor pET-28a, Seq ID no:6. Considerando que os resíduos de histidina possuem afinidade pelo níquel, foi possível purificá-la em etapa única por esse procedimento. A análise em SDS-PAGE 15%, das amostras coletadas periodicamente a cada 1 hora, após o início da indução, revelou que a partir da primeira hora, a proteína recombinante já era expressa, e que não há muita diferença nos níveis de expressão das amostras coletadas em 2, 3 e 4 horas (Fig 3).
[056] As frações solúveis e insolúveis resultante da lise celular das bactérias, mostraram que, a cistatina CaneCPI-5 encontra-se em sua maior parte na fração solúvel. A fração solúvel foi utilizada para a purificação da cistatina recombinante por cromatografia de afinidade em coluna contendo resina de níquel. Essa fração foi, então, adicionada à coluna e a proteína foi eluída em tampão de lise contendo imidazol. O imidazol, que também apresenta forte afinidade pelo níquel, compete com as histidinas pela ligação a esse metal, liberando a proteína de fusão. A análise em SDS-PAGE revelou que a maior parte da proteína CaneCPI-5 foi eluída nas frações que continham 250 mM de imidazol (Fig 4). O rendimento da cistatina purificada, foi de aproximadamente 16 mg por litro de cultura celular.
[057] Inibição da atividade da cisteíno-peptidase catepsina B humana pela nova cistatina recombinante CaneCPI-5.
[058] A atividade inibitória da CaneCPI-5 recombinante contra a enzima catepsina B, foi medida em espectrofluorímetro Hitachi F2000, utilizando o substrato fluorogênico Z-Phe- Arg-MCA. O resultado, sumarizado na Figura 5, mostra que a cistatina recombinante CaneCPI-5 apresentou atividade inibitória contra catepsina B.
[059] O valor da constante de inibição (Kí), também denominado constante de dissociação do complexo enzima-inibidor, expressa a afinidade do inibidor pela enzima (CHENG e PRUSOFF, 1973). Para um inibidor ser considerado potente, sua afinidade pela enzima alvo deve ser tão alta, que o seu valor de K\ é menor ou igual a concentração total de enzima utilizada no ensaio de inibição (COPELAND, 2005). Considerando o valor de Kí encontrado para a inibição de catepsina B podemos verificar que a cistatina CaneCPI-5 apresentou uma considerável atividade inibitória contra essa enzima com K\ no valor de 6,87 nM.
[060] A capacidade de inibir a atividade enzimática das catepsinas, além de outras cisteíno-peptidases, sugere que a cistatina recombinante CaneCPI-5 está em sua conformação correta. Os resultados obtidos nesse estudo revelam que a proteína CaneCPI-5 foi capaz de inibir eficientemente a atividade da catepsina B humana, com um K\ similar ao de CaneCPI-4 (GIANOTTI et ai, 2008).
[061 ] Quando comparada a outras cisteíno-peptidases, a catepsina B contém um elemento estrutural, denominado loop de oclusão {"occluding loop"), o qual bloqueia a fenda do sítio ativo (MUSIL et ai, 1991 ). Como as cistatinas inibem as catepsinas através de ligação competitiva ao sítio ativo, a conformação deste loop na catepsina B, é incompatível com a ligação das cistatinas. Essa influência do loop na acessibilidade ao sítio ativo é refletida em valores altos de Ki para a maioria das cistatinas, quando comparados àqueles obtidos contra cisteíno-peptidases que carecem de tal loop (BARRETT et ai, 1986; KONDO et al., 1990; ABRAHAMSON, 1994; OHTSUBO et al., 2005; MARTINEZ et ai, 2005b).
[062] Efeito de enriquecimento de proteína da película adquirida na mudança dureza de superfície, em resposta ao ácido
[063] Amostras de esmalte foram incubadas com saliva enriquecida com água (controle), mucina (2,7 mg/ ml) mais caseína (5 mg / ml), cistatina B (0,025 mg / ml), e CaneCPI-5 (0,025 mg / ml) a 30 °C durante 2 h. Além disso, um grupo de amostras de esmalte foi incubada com CaneCPI-5 antes do tratamento com a saliva. Todas as amostras foram, então, incubadas uma vez por dia durante três dias em ácido cítrico a 0,65% (pH 3,4) durante 1 minuto a 30°C. Depois de um dia, o SHC% para o grupo de controle foi de 46,9 ± 6,7 (SEM)%. O tratamento com cistatina B (35,1 ± 9,9%) e CaneCPI-5 (35,2 ± 6,6%) antes da formação da película significativamente (P <0,05) reduzidos % SHC em comparação com o controle, enquanto mucina mais caseína e CaneCPI-5 durante a formação da película não apresentou efeito. Após três dias, todos os tratamentos com cistatinas (54,5 ± 8,6, 55,5 ± 10,7 e 53,1 ± 9,3% para a cistatina-B, e CaneCPI-5 durante e antes da formação da película, respectivamente) reduziu significativamente a % SHC em comparação com o controle (67,6 ± 9,4%). Além disso, o tratamento com CaneCPI- 5 antes de formação da película significativamente reduzida% SHC. Em contraste, a combinação de mucina mais caseína não confere proteção significativa (64,4 ± 9,4%). Efeito do revestimento de proteínas sobre a rugosidade de superfície em resposta ao ácido:
[064] As imagens topográficas de AFM (Fig.6) de amostras de esmalte não tratadas e com as amostras revestidas com proteínas: mucina (2,7 mg/ml_), caseína (10 mg/ml), mucina (2,7 mg/ml) mais caseína (10 mg/ml), e Canecistatina- 5 (0,86 mg / ml), antes e após incubação com ácido cítrico (0,65%, pH 3,4, durante 1 min), foram realizadas em ar. Como mostrado na Figura 6A, uma amostra típica não tratada tinha uma superfície relativamente suave com um número de linhas Scour lineares (setas). A rugosidade média do esmalte não tratado foi de 0,28 ± 0,03 nm (n = 8). Imagens de esmaltes que haviam sido expostos ao ácido cítrico apresentaram um aumento dramático na rugosidade da superfície, mesmo depois de um tratamento de 1 minuto (Figura 6B), e a rugosidade média aumentou para 1 ,06 ± 0,05 nm (P <0,0001 ). A incubação das amostras com proteínas causou uma deposição de material visível nas superfícies de esmalte.
[065] Esta deposição refletiu em um aumento dos valores de rugosidade média de esmalte tratados com proteína: 0,42 ± 0,04 nm para mucina, 0,40 ± 0,04 nm para a caseína, 0,33 ± 0,04 nm para mucina mais caseína, e 0,46 ± 0,06 nm para CaneCPI-5). Os valores de esmalte tratados com proteína após tratamento com ácido cítrico foram: 0,93 ± 0,07 nm para mucina, 1 ,10 ± 0,10 nm para a caseína, 0,78 ± 0,09 nm para mucina mais caseína, e 0,79 ± 0,06 nm para CaneCPI-5 (todos os valores de n = 8). Das três proteínas a única que protegeu significativamente contra o dano do esmalte induzida por ácido cítrico foi a CaneCPI-5 (P = 0,005).
Medidas de força única de molécula de AFM:
[066] A seguir a adesão das três proteínas mucina, caseína e CaneCPI-5 foi quantificada, no nível de uma única molécula de força por espectroscopia usando um microscópio de força atómica. As proteínas foram acopladas covalentemente a sonda de AFM de nitreto de silício através de um ligante flexível de polietilenoglicol (PEG18), a fim de permitir que a proteína possa interagir com a superfície do esmalte em várias orientações. Curvas de força típicas para discos de controle (sem nenhuma proteína) e pontas acopladas à proteína estão apresentados na Figura 7. Nota-se que os eixos força de controle, mucina e caseína (Figuras 7A-C), respectivamente, são idênticos uns aos outros, mas diferente de o eixo de força para CaneCPI-5 (Figura 7D). As forças detectadas foram 0,177 ± 0,031 nN para o controle, 0,221 ± 0,058 nN para mucina, 0,261 ± 0,050 nN para a caseína, e 0,933 ± 0,108 nN para CaneCPI-5 (n = 40 para cada condição). Valores correspondentes de separação de descolamento foram 132,9 ± 14,9 nm para o controle, 82,1 ± 10,8 nm para mucina, 92,5 ± 9,5 nm para a caseína, e 134,6 ± 10,1 nm para CaneCPI-5 (n = 40).
[067] Assim, a CaneCPI-5 demonstrou uma alta força da interação com o esmalte (e estatisticamente significativa; P 0,0001 <). Em contraste, as forças mostradas por mucina e caseína não foi significativamente diferente do controle.
Experimentos funcionais
[068] No dia 1 , tratamento com cistatina B (35.1 ±9.9%) e CaneCPI-5 (35.2±6.6%) antes da formação da película reduziu significativamente a % SHC comparada com o controle (46.9±6.7%) (Figura 1 1 A, P<0.05). No dia 3, todos tratamentos com cistatinas (54.5±8.6, 55.5±10.7 e 53.1 ±9.3% para cistatina -B, CaneCPI-5 e CaneCPI-5 antes da formação da película, respectivamente reduziram significativamente a % de SHC em comparação com o controle (67.6±9.4%) (P<0.01 ). Além disso, tratamento com CaneCPI-5 antes da formação da película reduziu significativamente a % de SHC comparado com a combinação de muci na/caseína (64.4±9.4%) (Figura 8B, P<0.05).

Claims

REIVINDICAÇÕES
1) CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA, onde a cistatina recombinante (26) após a fusão no plasmídeo e inserção da sequência de histidinas seja caracterizada por codificar como sequência final de proteína a Seq ID no 6.
2) CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com a reivindicação 1 , onde a CaneCPI-5 (26) clonada em pET28a seja caracterizada por apresentar como sequência de aminoácidos a Seq ID no 7.
3) CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com as reivindicações 1 e 2, a Cane CPI-5 (26) seja caracterizada por ser adicionada a produtos odontológicos em uma proporção entre 0,05 e 3% pp do produto.
4) CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com a reivindicação 3, onde os produtos odontológicos aos quais a Cane CPI-5 é adicionada sejam caracterizados por serem dentifrícios, géis, soluções para bochecho, comprimidos mastigáveis, goma de mascar e spray bucal.
5) CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com as reivindicações 3 e 4, onde o dentifrício proposto apresente composição caracterizada por compreender componentes abrasivos, entre 4 e 50% p/p, dentre eles carbonato de cálcio, pirofosfato de cálcio, sílica gel; componentes umectantes, variando entre 20 a 65% p/p, podendo ser sorbitol, glicerina, polietilenoglicol, propilenoglicol ou misturas deles; componentes aglutinantes, entre 0,5 e 7% p/p, podendo ser carboximeticelulose, goma xantana, sílica espessante ou mistura dos mesmos; componentes tensoativos, entre 1 e 6% p/p, podendo ser betaínas, cocoamidopropilbetaína, lauril sulfato de sódio ou mistura deles; agentes conservantes, entre 0,01 e 0,5% p/p, podendo ser metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio, hidroxibenzoato de metila ou mistura deles; agentes fluoretados, entre 500 a 5000 ppm, podendo ser monofluorfosfato de sódio, tetrafluoreto de titânio, fluoreto estanoso, fluoreto de amina, fluoreto de sódio ou mistura deles; agentes anti-placa, podendo ser clorexidina, cloreto de cetilpiridíneo, triclosan e; CaneCPI-5 (26), entre 0,05 e 3,00% p/p.
6) CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com as reivindicações 3 e 4, onde o gel odontológico proposto apresente composição caracterizada por compreender como componente adjuvante a hidroxicelulose; como agente aglutinante a glicerina; o propilenoglicol como componente umectante; além de metilparabeno e imidazolidinil uréia como conservantes; água deionizada, em quantidade máxima de 7,5% e CaneCPI-5 (26) entre 0,05 e 3,00%pp.
7) CISTATINA RECOMBINANTE DA CANA-DE-AÇÚCAR PARA REDUÇÃO DO DESGASTE DENTÁRIO EROSIVO E PROTEÇÃO CONTRA CÁRIE DENTÁRIA, de acordo com as reivindicações 3 e 4, onde a solução para bochecho proposta apresente composição caracterizada por compreender água deionizada, flavorizante, metilparabeno e imidazolidinil uréia como conservantes e CaneCPI-5 (26) numa concentração entre 0,05 e 3,00% pp.
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