WO2018194496A2 - Моноклональное антитело к pd-l1 - Google Patents

Моноклональное антитело к pd-l1 Download PDF

Info

Publication number
WO2018194496A2
WO2018194496A2 PCT/RU2018/050039 RU2018050039W WO2018194496A2 WO 2018194496 A2 WO2018194496 A2 WO 2018194496A2 RU 2018050039 W RU2018050039 W RU 2018050039W WO 2018194496 A2 WO2018194496 A2 WO 2018194496A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
cancer
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/050039
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2018194496A3 (ru
Inventor
Андрей Борисович УЛИТИН
Виктория Михайловна ЕКИМОВА
Екатерина Владимировна СОФРОНОВА
Юлия Сергеевна ЧЕРНЫХ
Сергей Андреевич АГЕЕВ
Анна Константиновна ВЛАДИМИРОВА
Алексей Александрович АЛЕКСАНДРОВ
Павел Алексеевич ГРЕБНЕВ
Валерий Владимирович СОЛОВЬЕВ
Яков Юрьевич УСТЮГОВ
Павел Андреевич ЯКОВЛЕВ
Тимофей Александрович НЕМАНКИН
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US16/605,865 priority Critical patent/US11236167B2/en
Priority to MA47221A priority patent/MA47221A1/fr
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority to BR112019021781A priority patent/BR112019021781A2/pt
Priority to JP2020506702A priority patent/JP2020516323A/ja
Priority to AU2018255132A priority patent/AU2018255132A1/en
Priority to PE2019002020A priority patent/PE20191786A1/es
Priority to CA3060395A priority patent/CA3060395A1/en
Priority to KR1020197033829A priority patent/KR20190140979A/ko
Priority to CN201880040390.1A priority patent/CN111247166B/zh
Priority to EP18786945.8A priority patent/EP3613770A4/en
Priority to EA201992206A priority patent/EA201992206A1/ru
Priority to NZ758093A priority patent/NZ758093A/en
Publication of WO2018194496A2 publication Critical patent/WO2018194496A2/ru
Publication of WO2018194496A3 publication Critical patent/WO2018194496A3/ru
Priority to PH12019502298A priority patent/PH12019502298A1/en
Priority to CONC2019/0011458A priority patent/CO2019011458A2/es
Priority to ZA2019/07065A priority patent/ZA201907065B/en
Priority to JP2023031932A priority patent/JP2023081942A/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, namely to antibodies or their antigennegative fragments, as well as their use. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically binds to PD-L1 (CD274, B7-H1, programmable cell death receptor ligand 1). The invention also relates to a nucleic acid encoding a given antibody or antigen binding fragment thereof, an expression vector, a method for producing an antibody, and the use of an antibody to enhance T-cell function for up-regulation of cell-mediated immune responses and for the treatment of disorders associated with T-cell dysfunction, for example , tumor immunity and cancer treatment.
  • T-type lymphocytes The two main types of lymphocytes in humans are the T-type (thymocytes) and the B-type (bone marrow). These cells are formed from hematopoietic stem cells in the bone marrow and embryonic liver, which are programmed onto the lymphoid pathway. The offspring of these stem cells matures in various ways to B- or T-lymphocytes.
  • B-lymphocytes The development of human B-lymphocytes occurs exclusively in the bone marrow.
  • T cells develop from immature precursors that leave the bone marrow and travel through the bloodstream to the thymus, where they multiply and differentiate into mature T lymphocytes.
  • Mature lymphocytes the source of which is the thymus or bone marrow, are in an inactive or “resting” state, that is, they are mitotically inactive. When they are dispersed in the bloodstream, these "untrained” or “naive” lymphocytes move to various secondary or peripheral lymphoid organs, such as the spleen, lymph nodes, or tonsils. Most naive lymphocytes have a short lifespan, and they die in a few days after leaving the bone marrow or thymus. However, if such a cell receives signals indicating the presence of antigen, it can be activated and undergo successive cycles of cell division.
  • Some cells from the resulting offspring then return to their resting state and become memory lymphocytes - B and T cells, which are essentially trained for the next meeting with a stimulating allergen.
  • Other offspring of activated naive lymphocytes are effector cells that live only a few days, but perform certain types of protective activity.
  • Lymphocyte activation is an ordered sequence of events that a resting lymphocyte goes through after stimulation to divide and produce offspring, from which some cells become effector cells. The complete answer includes both the induction of cell proliferation (mitogenesis) and the manifestation of immunological functions. Lymphocytes are activated when specific ligands bind to receptors on their surfaces. Ligands are different from T cells and B cells, but the final intracellular physiological mechanisms are similar.
  • lymphocytes in particular, large polymer antigens that cross-link surface immunoglobulins on B cells or other glycoproteins on T cells.
  • antigens are not polymeric, and even direct binding to B cells in large quantities does not provide activation.
  • These more common antigens activate B cells when they are stimulated in conjunction with nearby activated helper T lymphocytes.
  • Such stimulation can occur from lymphokines secreted by a T cell, but it is most efficiently transmitted by direct contact of B cells with surface proteins of T cells that interact with specific surface receptors of B cells to create a secondary signal.
  • T-lymphocytes do not express immunoglobulins, however, they detect the presence of foreign substances using surface proteins called T-cell receptors (TCR). These receptors recognize antigens either through direct contact or by affecting the activity of other immune cells. Together with macrophages, T cells are the main type of cells involved in cell-mediated immunity.
  • T cells can detect foreign substances only under specific conditions.
  • T-lymphocytes recognize a foreign protein only if it is cleaved into small peptides, which are then detected on the surface of a second host cell called an antigen-presenting cell (APC).
  • APC antigen-presenting cell
  • Many types of host cells can present antigens in some conditions, however, certain types are more specifically adapted for this and are especially important for regulating the activity of T cells, including macrophages and other B cells.
  • Antigen presentation is partly dependent on certain proteins, called proteins of the major histocompatibility complex (MHC), on the surface of the representing cells.
  • MHC major histocompatibility complex
  • T cells cytotoxic T lymphocytes
  • Tx helper T cells
  • TC cells are important for protection against viruses and are capable of killing viruses directly by recognizing certain viral peptides expressed on the cell surface.
  • Tx cells promote the proliferation, maturation and immunological function of other types of cells, for example, the secretion of lymphokines to regulate the activity of B cells, macrophages and cytotoxic T cells. Both naive T-lymphocytes and memory T-lymphocytes usually remain at rest, and in this state they do not show significant helper or cytotoxic activity.
  • CD4 + cells can only form CD4 + offspring
  • CD8 + cells give only CD8 + offspring.
  • Effector T cells express cell surface markers that are not expressed on resting T cells, such as CD25, CD28, CD29, CD40L, transferrin receptors, and MHC class II proteins. With the elimination of activating stimuli, cytotoxic or helper activity gradually decreases over several days, since the effector cells either die or return to a resting state.
  • T lymphocytes Like B cell activation, the response of T lymphocytes to most antigens also requires two types of simultaneous stimuli. The first is an antigen that, when properly exposed to MHC proteins on an antigen-presenting cell, can be recognized and bound by T-cell receptors. Since this antigen-MHC complex does not send a signal into the cell, it is usually insufficient to lead to T cell activation. Complete activation, such as that which occurs with helper T cells, requires co-stimulation with other specific ligands, called co-stimulators, which are expressed on the surface of the antigen-presenting cell. On the other hand, activation of a cytotoxic T cell usually requires IL-2, a cytokine secreted by activated helper T cells.
  • PD-1 programmed death receptor-1
  • B7-H1, CD274 ligand PD-L1
  • B7-DC PD-L2
  • the negative regulatory role of PD-1 was found in the help of PD-1 knockouts (Pdcdl _ / ⁇ ), which are prone to au immune disease and. (Nishimura et al, Immunity JJ: 141-51 (1999); Nishimura et al, Science 291: 319-22 (2001)).
  • PD-1 is associated with CD28 and CTLA-4, but it lacks cysteine closest to the membrane, allowing homodimerization.
  • the cytoplasmic domain of PD-1 contains an immunoreceptor tyrosine-binding inhibitory motif (ITIM, V / IxYxxL / V).
  • ITIM immunoreceptor tyrosine-binding inhibitory motif
  • PD-1 binds only to PD-L1 and PD-L2 (Freeman et al, J. Exp. Med. 192: 1 - 9 (2000); Dong et al, Nature Med. 5: 1365 - 1369 (1999); Latchman et al, Nature Immunol 2: 261-268 (2001); Tseng et al, J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)).
  • PD-1 can be expressed on T cells, B cells, natural killer T cells, activated monocytes and dendritic cells (DC).
  • DC dendritic cells
  • PD-1 is expressed by activated, non-stimulated human CD4 + and CD8 + T cells, B cells and myeloid cells. This is in contrast to the more limited expression of CD28 and CTLA-4 (Nishimura et al, Int. Immunol. 8: 773–80 (1996); Boettler et al, J. Virol. 80: 3532–40 (2006)).
  • PD-1 there are at least 4 variants of PD-1 that have been cloned from activated human T cells, including transcripts that lack (i) exon 2, (ii) exon 3, (iii) exons 2 and 3, or (iv) exons with 2 to 4 (Nielsen et al, Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)).
  • PD-1Deh3 all variants are expressed to the same extent as full-length PD-1 in resting peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the expression of all variants is significantly induced after the activation of human T cells with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies.
  • PD-lAex3 variants there is no transmembrane domain, and they are similar to the soluble CTLA-4, which plays an important role in autoimmunity (Ueda et al, Nature 423: 506-11 (2003)). This option is rich in synovial fluid and serum in patients with rheumatoid arthritis (Wan et al, J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)).
  • Two PD-1 ligands differ in expression patterns.
  • PD-L1 is constitutively expressed on murine T and B cells, CDs, macrophages, mesenchymal stem cells and bone marrow mast cells (Yamazaki et al, J. Immunol. 169: 5538 - 45 (2002)).
  • PD-L1 is expressed on many different non-hematopoietic cells (for example, corneal cells, lungs, vascular epithelium, non-parenchymal liver cells, mesenchymal stem cells, pancreatic islets, placental syncytrophoblasts, keratinocytes, etc.) [Keir et al, Annu. Rev. Immunol. 26: 677 - 704 (2008)] and undergoes increased regulation on many types of cells after activation. IFN interferons of both type I and type II cause an increase in PD-Ll (Eppihimer et al, Microcirculation 9: 133–45 (2002)); Schreiner et al, J.
  • non-hematopoietic cells for example, corneal cells, lungs, vascular epithelium, non-parenchymal liver cells, mesenchymal stem cells, pancreatic islets, placental syncytrophoblasts, keratinocytes, etc.
  • PD-L2 The expression of PD-L2 is more limited than PD-L1.
  • PD-L2 is inducibly expressed on DC, macrophages and bone marrow mast cells.
  • PD-L2 is also expressed on approximately half, or even two-thirds, of resting peritoneal B1 cells, but not on traditional B2 B cells (Zhong et al, Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)).
  • PD-L2 + Bl cells bind phosphatidylcholine and may be important for the natural immune response to bacterial antigens. IFN- ⁇ induction of PD-L2 is partially dependent on NF -KB (Liang et al, Eur. J. Immunol. 33_: 2706-16
  • PD-L2 can also be induced on monocytes and macrophages GM-CF, IL-4 and IFN- ⁇ (Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538 - 45 (2002); Loke et al, PNAS 100: 5336-41 (2003)).
  • the PD-1 signal typically affects cytokine production more than cell proliferation, with a significant effect on the production of IFN- ⁇ , TNF-a, and IL-2.
  • the PD-1 mediated inhibitory signal also depends on the strength of the TCR signal, with greater inhibition being achieved at lower levels of TCR stimulation. This decline can be overcome by costimulation through CD28 [Freeman et al, J. Exp. Med. 192: 1027
  • the signal through the PD-L1 and PD-L2 can be bidirectional. That is, in addition to modifying the TCR or BCR signal, the signal can also be delivered back to cells expressing PD-L1 and PD-L2.
  • treatment of dendritic cells with a natural human anti-PD-L2 antibody isolated from a patient with Waldenstrom macroglobulinemia did not detect upregulation of MHC II or costimulatory B7 molecules, such cells produced more proinflammatory cytokines, in particular TNF-a and IL-6. and stimulated the proliferation of T cells (Nguyen et al, J. Exp. Med. 196: 1393 - 98 (2002)).
  • mice with this antibody also (1) increased resistance to transplanted melanoma Lb and rapidly induced tumor-specific CTLs (Radhakrishnan et al, J. Immunol. 170: 1830 - 38 (2003); Radhakrishnan et al, Cancer Res. 64: 4965 - 72 (2004 ); Heckman et al, Eur. J. Immunol. 37: 1827
  • DC dendritic cell reverse signal
  • Interaction B7.1 PD-L1 may cause an inhibitory signal in T cells.
  • Crosslinking PD-L1 on CD4 + T cells using B7.1 or crosslinking B7.1 on CD4 + T cells using PD-L1 provides an inhibitory signal.
  • T cells lacking CD28 and CTLA-4 show reduced proliferation and cytokine production when stimulated with beads coated with anti-CD3 antibody plus B7.1.
  • B7.1 receptors i.e., CD28, CTLA-4, and PD-L1
  • B7.1 specifically acts via PD-L1 on the T cell in the absence of CD28 and CTLA-4.
  • T cells lacking PD-1 showed reduced proliferation and cytokine production when stimulated in the presence of beads coated with anti-CD3 antibody plus PD-L1, demonstrating the inhibitory effect of PD-L1 crosslinking on B7.1 on T cells.
  • the weakening of T-cell proliferation by balls coated with anti-CD3 antibody plus PD-L1 ceases.
  • PD-L1 can have an inhibitory effect on T cells via B7.1 or PD-1.
  • B7.1 and PD-L1 The direct interaction between B7.1 and PD-L1 indicates that the current understanding of costimulation is incomplete and emphasizes the importance for the expression of these molecules on T cells.
  • Studies of PD-L1 T cells show that PD-L1 on T cells can reduce the production of cytokines by the T cell. (Latchman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691 - 96 (2004)). Since both PD-L1 and B7.1 are expressed on T cells, B cells, DC and macrophages, there is the potential for targeted interaction between B7.1 and PD-L1 on these cell types.
  • PD-L1 on non-hematopoietic cells can interact with B7.1, as well as PD-1 on T cells, which raises the question of whether PD-L1 is involved in their regulation.
  • B7.1 PD-L1 interaction
  • signal antagonism via PD-L1, including blocking the interaction of PD-L1 with PD-1, B7.1, or both, thus preventing PD-L1 from sending a negative costimulatory signal to T cells and other antigen-presenting cells may enhance immunity in response to infection (eg, acute or chronic) and tumor immunity.
  • antibodies against PD-L1 according to the present invention can be combined with antagonists of other components of the signal PD-1: PD-L1, for example, an antagonist of antibodies against PD-1 and against PD-L2.
  • PD-L1 signal inhibition has been proposed as a means of increasing T cell immunity for treating cancer (e.g., tumor immunity) and infections, including both acute and chronic (e.g., resistant) infections.
  • PD-1 are known, among other sources, from documents W02001014557, W02002086083, W0200 005874, W02010036959, W02010077634 and WO20110666389.
  • Atesolizumab is approved by the FDA for use in patients with metastatic urothelial cancer, phase III CI continues in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), renal cell cancer, colorectal cancer (CRC), breast cancer (BC).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • CRC colorectal cancer
  • BC breast cancer
  • the preparation is an Igl antibody with a modified Fc region (in order to eliminate the ADCC effect).
  • Atesolizumab is described in document WO2010077634.
  • avelumab Pfizer
  • durvalumab Z
  • Durvalumab Durvalumab, MEDI-4736
  • Avelumab is described in document WO2013079174.
  • the main difference between the drug avelumab is the presence of an ADCC effect in the antibody, moreover, it can be enhanced using IFNg or IL12 (NCT01772004).
  • the safety profile of the drug Avelumab corresponds to that of other anti-PD-l / PD-Ll drugs (Cancer Immunol Res; 3 (10) October 2015; Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Activity of a Novel Anti-PD-Ll Antibody Avelumab on Human Tumor Cells; Benjamin Boyerinas).
  • the BCD-135 antibody selectively binds to PD-L1 and is an effective inhibitor of programmable cell death receptor ligand 1.
  • the present invention relates to binding molecules, in particular antibodies directed to bind to PD-L1. Such antibodies can be used to treat a disease or disorder mediated by PD-L1.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds to PD-L1 comprising a heavy chain variable domain comprising at least 90% amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain containing the amino acid sequence of at least 90% homologous to the sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains amino acid sequences that are at least 90% homologous to the sequences of SEQ ID NO: 1-3.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1-3.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains amino acid sequences that are at least 90% homologous to the sequences of SEQ ID NO: 5-7.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 5-7.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains at least 90% amino acid sequences homologous to SEQ ID NOS: 1-3 and a light chain variable domain that contains at least 90 amino acid sequences % homologous to the sequences of SEQ ID NO: 5-7.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1-3, and a light chain variable domain that contains the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5-7.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains at least 90% amino acid sequence homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains at least 90% amino acid sequence homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a light chain variable domain that contains at least 90% amino acid sequence homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a light chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain containing at least 90% amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 9 and a light chain containing at least 90% amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 10.
  • the monoclonal antibody comprises a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the monoclonal antibody specific for PD-L1 is a full-length IgG antibody.
  • the full-length IgG antibody is of the human IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 isotype.
  • the monoclonal antibody is a human IgGl isotype.
  • the present invention relates to a nucleic acid that encodes any of the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof.
  • the nucleic acid is DNA.
  • the present invention relates to an expression vector comprising any of the aforementioned nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for producing a host cell for producing any of the aforementioned antibodies or an antigen binding fragment thereof, which comprises transforming a cell with the aforementioned vector.
  • the present invention relates to a host cell for preparing any of the aforementioned antibodies or an antigen binding fragment thereof that contains any of the aforementioned nucleic acids.
  • the present invention relates to a method for producing any of the aforementioned antibodies or antigen-binding fragment thereof, which comprises culturing the aforementioned host cell in a culture medium under conditions sufficient to obtain the indicated antibody, if necessary, followed by isolation and purification of the obtained antibody.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1, which comprises any of the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical composition is intended for the prophylaxis or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1 selected from the group: CBC, cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma, cancer of the esophagus, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.
  • the present invention relates to a pharmaceutical combination for the prophylaxis or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1, which comprises any of the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof and at least one therapeutically active antitumor compound.
  • the pharmaceutical combination is intended for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1 selected from the group: CSF, cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma, cancer of the esophagus, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.
  • a disease or disorder mediated by PD-L1 selected from the group: CSF, cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma, cancer of the esophagus, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.
  • the pharmaceutical combination comprises a therapeutically active antitumor compound that is selected from a chemotherapeutic agent, antibody, or anti-hormone agent.
  • the present invention relates to a method for inhibiting the biological activity of PD-L1 in a subject in need of such inhibition, which comprises administering to the subject an effective amount of any of the aforementioned antibodies or antigen binding fragment thereof.
  • the present invention relates to the use of any of the aforementioned antibodies or antigen binding fragment thereof or the aforementioned pharmaceutical composition for the treatment in a subject in need of such treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1.
  • the invention relates to the use of any of the aforementioned antibodies or an antigen-binding fragment thereof or a pharmaceutical composition for treating a disease or disorder selected from the group: CRPS, cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, lymphoma Kina progress, MSI CRC.
  • FIG. 1 The synthesis scheme of a combinatorial naive human library.
  • FIG. 2 A phagemid map for cloning Fab phage display libraries.
  • FIG. 3 Map of expression plasmids for the production of Fab.
  • FIG. 4A Electrophoregram BCD-135 in reducing conditions, 12% SDS-PAGE.
  • FIG. 4B Electrophoregram BCD-135 in non-reducing conditions, 8% SDS-PAGE.
  • FIG. 5 Immunoassay analysis of the interaction of BCD-135 with PD-L1 and other antigens.
  • FIG. b Reactivation of NFAT signaling with anti-PD-Ll antibodies in the Jurkat-NFAT-PD-1 reporter cell line.
  • FIG. 7 Interaction analysis of BCD-135 with FcRn and Fcy receptors on an Octet RED 96 instrument.
  • FIG. 8 Enzyme-linked immunosorbent assay of interactions of BCD-135 with PD-L1 of different species of organisms.
  • FIG. 9 Analysis of the interactions of BCD-135 with human PD-L1 and a cynomolgus monkey on an Octet RED 96 instrument.
  • FIG. 10 Conformational stability analysis of BCD-135.
  • FIG. 11 Analysis of colloidal stability of BCD-135.
  • FIG. 12A Thermal stability analysis of BCD-135 in phosphate buffer.
  • the X axis is time, the Y axis is absorption.
  • FIG. 12B Thermal stability analysis of BCD-135 in acetate buffer.
  • the X axis is time, the Y axis is absorption.
  • FIG. 12V Thermal stability analysis of BCD-135 in histidine buffer.
  • the X axis is time, the Y axis is absorption.
  • FIG. 13A Analysis of the stability of BCD-135 in human serum. Calibration curve reflecting the dependence of optical density on the concentration of BCD-135 added to the well.
  • FIG. 13B Analysis of the stability of BCD-135 in human serum.
  • the resulting table shows the dependence of the concentration of BCD-135 during incubation in human serum from the time of incubation.
  • FIG. 14A 3D spatial model of the complex of BCD-135 and N-terminus Ig domain of PD-L1 antigen. General view of the 3D model.
  • FIG. 14B 3D spatial model of the complex of BCD-135 and N-terminus Ig domain of PD-L1 antigen. A detailed model in the area of direct contacts of an antigen-antibody (see the abl. In example 18).
  • PD-L1 programmable cell death receptor ligand 1
  • differentiation cluster 274 CD274
  • B7-H1 homolog 1 B7
  • PD-1 / PD-L1 or B7-1 / PD-L1 complexes are formed , this leads to the transmission of an inhibitory signal that decreases the proliferation of these CD8 + T cells in the lymph nodes.
  • PD-1 / PD-L-interaction is one of the key in the development of immune tolerance.
  • Disfunction in the context of immune dysfunction means a state of decreased immune response to antigenic stimulation.
  • the term includes common elements of exhaustion and / or anergy when of which antigen recognition can occur, however, the induced immune response is ineffective for controlling infection or tumor growth.
  • Enhancing T-cell function means the induction, induction, or stimulation of sustained or enhanced biological function of T cells, or the restoration or reactivation of depleted or inactive T cells.
  • Examples of enhanced T-cell function are: increased secretion of ⁇ -interferon from CD8 + T-cells, increased proliferation, increased response to an antigen (e.g., elimination of a virus or pathogen) relative to indicators prior to intervention.
  • the gain level is at least 50%, in the alternative, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. A method of measuring this gain is known to those skilled in the art.
  • T cell dysfunction related disorder is a disorder or condition of T cells characterized by a reduced response to antigenic stimulation.
  • the T-cell-related dysfunctional disorder is a disorder specifically associated with an unacceptably elevated signal through PD-1.
  • a disorder associated with T-cell dysfunction is a disorder in which T-cells are energetic or have reduced ability to secrete cytokines, proliferation, or cytolytic activity.
  • a decrease in response results in ineffective control of a pathogen or tumor expressing an immunogen. Examples of T-cell dysfunction-related disorders characterized by T-cell dysfunction include unresolved acute infection, chronic infection, and tumor immunity.
  • Tumor immunity means a process in which tumors evade immune recognition and elimination. Thus, as a therapeutic concept, tumor immunity is susceptible to “treatment” when such evasion is attenuated and tumors are recognized and attacked by the immune system. Examples of tumor recognition are tumor binding, tumor reduction, and tumor elimination.
  • the term “vaccine” as used herein includes any non-pathogenic immunogen that, when inoculated into the host organism, elicits protective immunity against a particular pathogen. Vaccines can take various forms. Vaccines can be whole organisms that share common antigens with the pathogen, but they themselves are not pathogenic (for example, smallpox). Vaccines can also be prepared from slaughtered
  • Vaccines can also be prepared from purified macromolecules isolated from a pathogenic organism. For example, toxoid vaccines (such as tetanus and diphtheria) containing an inactive form of a soluble bacterial toxin and resulting in the production of antibodies against the toxin, but not immunity to the intact bacterium. Subunit vaccines
  • hepatitis B contain only one immunogenic protein isolated from the desired pathogen.
  • Hapten conjugate vaccines attach some carbohydrate or polypeptide epitopes isolated from the desired pathogen to immunogenic carriers such as tetanus toxoid. These techniques primarily involve the use of epitopes, such as haptens, to induce antibody production, which then recognize one epitope in a natural pathogen.
  • epitopes such as haptens
  • such vaccines should include B- and T-cell epitopes, and T-cell epitopes should be selected to guarantee the possibility of their recognition, presentation and reaction to them from the immune systems of the host organisms.
  • DNA vaccines utilize the ability of host cells to capture and express DNA encoding pathogenic proteins, which is administered intramuscularly.
  • Immune adjuvants function in one or more of the following ways: (1) prolong the retention of the immunogen, (2) increase the effective size of the immunogen (and therefore activate phagocytosis and present to macrophages),
  • adjuvants are: Freund's complete adjuvant (CFA), aluminum salts and mycobacteria-based proteins, such as muramyldi or tripeptides.
  • Amplification of this gene and / or overexpression of its protein has been detected in many cancers, including cervical cancer, cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma, cancer of the esophagus, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, , kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.
  • binding molecule includes antibodies and immunoglobulins.
  • antibody or “immunoglobulin” (Ig), as used herein, includes whole antibodies and any antigen binding fragment (ie, “antigen binding part”) or its individual chains.
  • antibody refers to a glycoprotein containing at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds, or its antigen-binding part.
  • Each heavy chain contains a variable region of the heavy chain (abbreviated herein as VH) and a constant region of the heavy chain.
  • the constant region of the heavy chain consists of three domains, CH1, CH2 and CH 3.
  • Each light chain consists of a variable region of the light chain (abbreviated herein as VL) and a constant region of the light chain.
  • the constant region of the light chain consists of one domain, CL.
  • the VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDRs), scattered between regions that are more conservative, called framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs located from the amino end to the carboxy end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with the antigen.
  • Antibody constant regions can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells), and the first component (Clq) of the classical complement system.
  • antibody portion of an antibody or “antigen binding fragment” (or simply “antibody portion” or “antibody fragment”), as used herein, refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-sized antibody.
  • binding fragments included in the term “antigen binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH 1 domains; (ii) F (ab ') 2 fragment, a divalent fragment containing two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CH 1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of VL and VH domains in a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), which consists of a VH / VHH domain; and (vi) a designated complementarity determining region (CDR).
  • a Fab fragment a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH 1 domains
  • F (ab ') 2 fragment a divalent fragment containing two Fab fragments connected by a disulf
  • the two regions of the Fv fragment, VL and VH are encoded by different genes, they can be connected using recombinant methods using a synthetic linker, which makes it possible to obtain them as a single protein chain in which the VL and VH regions mate monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 -5883). It is contemplated that such single chain molecules are also included in the term “antigen binding portion” of an antibody. Such antibody fragments are prepared using conventional methods known to those skilled in the art, and these fragments are screened in the same manner as intact antibodies.
  • the CDR of the antigen binding site or the entire antigen binding site of the antibodies of the invention is from a mouse, llama or human donor library, or is essentially human in origin certain amino acid residues, altered, for example, substituted by different amino acid residues in order to optimize specific properties of the antibody, for example KD, koff, IC50, EC50, ED50.
  • the antibody fragments of the invention are of human origin or essentially human origin (at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% human origin).
  • the antigen binding site of an antibody of the invention may be derived from, but not limited to, other non-human species, including, but not limited to, a mouse, llama, rabbit, rat, or hamster.
  • the antigen binding site may be derived from human species.
  • variable refers to the fact that certain segments of the variable domains vary widely in sequence among antibodies. Domain V mediates antigen binding and determines the specificity of a particular antibody to its specific antigen. However, the variability is not evenly distributed across the 110-amino acid variable domain region. In contrast, V regions are composed of invariant fragments called framework regions (FR) of 15-30 amino acids, separated by shorter regions of extreme variability, called “hypervariable regions” or CDR or "HVR” or "HV”.
  • FR framework regions
  • Each variable domain of the native heavy and light chains contains four FRs, mainly taking the configuration of beta sheets connected by three hypervariable regions that form loops that bind, and in some cases are part of the beta-folded structure.
  • the hypervariable regions in each chain are held together in close proximity by FR and, with the hypervariable regions of the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
  • the constant domains are not directly involved in the binding of the antibody to the antigen, but exhibit various effector functions, such as participation antibodies in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC, ADCC).
  • hypervariable region refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding.
  • the hypervariable region contains amino acid residues from the "complementarity determining region” or “CDR”, and / or such residues from the "hypervariable loop”.
  • affinity maturation it may also be preferable to change one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity of the target epitope.
  • affinity maturation in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where humanization of an antibody leads to a decrease in binding specificity or affinity, and it is not possible to sufficiently improve binding specificity or affinity by using only inverse mutations.
  • affinity maturation methods are known in the art, for example, the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417
  • FR Framework regions
  • FR1 variable domain residues other than CDR residues.
  • each variable domain has four FRs, defined as FR1, FR2, FR3, and FR4.
  • CDRs are determined according to Kabat, the FRs of the light chain are localized approximately in the region of residues 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) and 98-107 (LCFR4), and the FRs of the heavy chain localized approximately in the region of residues 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) and 103-113
  • HCFR4 in the heavy chain. If sections of the CDRs contain amino acid residues from hypervariable loops, FR light chain residues are localized at approximately 1-25 residues (LCFR1), 33-49
  • LCFR2 LCFR2
  • LCFR3 LCFR3
  • LCFR4 FR residues of the heavy chain are localized, approximately, in residues 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) and 102-113 (HCFR4) in the residues of the heavy chain.
  • the FRs are adjusted accordingly. For example, when CDRH1 includes amino acids H26-H35, the heavy chain residues FR1 are at positions 1-25 and the FR2 residues are at positions 36-49.
  • An antibody of the invention that “binds” the target antigen is an antibody that binds the antigen with sufficient affinity so that the antibody can be used as a diagnostic and / or therapeutic agent when targeting a protein or cell or tissue expressing the antigen, and slightly cross-reacts with other proteins.
  • analytical methods sorting of fluorescently activated cells (FACS), radioimmunoprecipitation (RIA) or ELISA (ELISA), in such embodiments of the invention the degree of binding of the antibody to a protein that is not a "target” (with a "non-target protein") is less than 10 % of the binding of the antibody to a specific target protein.
  • the term “specific binding” or the expressions “specifically binds to” or “specific” to a particular polypeptide or epitope on a particular target polypeptide means a binding that is markedly (measurably) different from non-specific interaction
  • Specific binding can be quantified, for example, by determining the binding of a molecule compared to the binding of a control molecule. For example, specific binding can be determined by competitive reaction with another molecule similar to the target, for example, with an excess of unlabeled target. In this case, specific binding is indicated if the binding of the labeled target to the probe is competitively inhibited by an excess of unlabeled target.
  • the term “specific binding” or the expression “specifically binds to or specific to a particular polypeptide or epitope on a specific target polypeptide can be characterized by the example of a molecule having a Co! target of at least about 200 nM, or at least about 150 nM, or at least about 100 nM, or at least about 60 nM, or at least about 50 nM, or at least about 40 nM, or at least about 30 nM, or at least about 20 nM, or at least about 10 nM, or at least about 8 nM, or at least about 6 nM, or at least at least about 4 nM, or at least about 2 nM, or at least about 1 nM or higher.
  • the term “specific binding” refers to a binding in which a molecule binds to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide, practically without binding to any other polypeptide or epitope on the polypeptide.
  • Ka refers to the rate of association of a particular antibody-antigen interaction
  • Kd refers to the dissociation rate of a specific antibody-antigen interaction
  • Binding affinity generally refers to the strength of the cumulative non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, antigen). Unless otherwise specified, “binding affinity” refers to the intrinsic (characteristic, true) binding affinity that reflects a 1: 1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). The affinity of molecule X to its partner Y can usually be represented by constant dissociation (Kd).
  • the Kd value is about 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, b nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM or less.
  • Affinity can be measured by conventional methods known in the art, including those described herein. Low affinity antibodies usually bind slowly to the antigen and tend to easily dissociate, while high affinity antibodies usually bind more quickly and tend to stay tied longer. Various methods for measuring binding affinity are known in the art, any of these methods can be used for the purposes of the present invention.
  • the "Kd" or “Kd value” of this invention is measured by surface plasma resonance methods on a B1Acoge TM -2000 or BIAcore TM -3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25 ° C. using immobilized chips CM5 antigen at -10 relative units
  • carboxymethyldextran biosensor chips (response units, RU).
  • C5, BIAcore Inc.) are activated with hydrochloride (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide
  • EDC EEC
  • NHS ⁇ -hydroxysuccinimide
  • the antigen is diluted with a 10 mM sodium acetate solution, pH 4.8, to a concentration of 5 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.2 ⁇ M), and then injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min until approximately 10 relative units (RU) of the bound protein are reached.
  • a 1 M ethanolamine solution is administered to block unreacted groups.
  • Koff refers to the dissociation rate constant of a particular interaction of a binding molecule and antigen.
  • the koff + dissociation rate constant can be measured by bi-layer interferometry, for example using the Octet TM system.
  • the "on-rate” or “cop” of this invention can also be determined by the same surface plasma resonance method as described above on a B1Acoge TM -2000 or BIAcore TM -3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ ) at 25 ° C using chips with immobilized CM5 antigen at -10 relative units (response units, RU).
  • CM5 antigen at -10 relative units (response units, RU).
  • carboxymethyldextran biosensor chips CM5, BIAcore Inc.
  • EDC hydrochloride '- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the koff / kon ratio. See, for example, Chen, Y. , et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881.
  • a spectrometer such as a stopped flow spectrophotometer (Aviv Instruments) or a SLM-Aminco spectrophotometer (ThermoSpectronic) 8000 series with a stirring cuvette.
  • biologically active and biological activity and “biological characteristics” with respect to the polypeptide of this invention mean having the ability to bind to a biological molecule.
  • biological molecule refers to nucleic acid, protein, carbohydrate, lipid, and combinations thereof. In one embodiment of the invention, the biological molecule exists in nature.
  • Antibody sites such as Fab and F (ab ') 2 fragments, can be obtained from whole antibodies using traditional methods, such as papain or pepsin hydrolysis of whole antibodies. Moreover, antibodies, parts of antibodies and immunoadhesion molecules can be obtained using standard recombinant DNA methods, for example, as described herein.
  • recombinant antibody means an antibody that is expressed from a cell or cell line containing a nucleotide sequence (nucleotide sequences) that encodes an antibody, wherein said nucleotide sequence (nucleotide sequences) is not associated with the cell in nature.
  • variant antibody refers to an antibody having an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of its "parent” antibody by adding, removing and / or replacing one or more amino acid residues relative to the sequence of the parent antibody.
  • the variant antibody comprises at least one or more (e.g., one to twelve, e.g., two, three, four, five, six, seven, eight or nine, ten, eleven or twelve; and in some embodiments one to about ten) additions, deletions and / or substitutions of amino acids relative to the parent antibody.
  • additions, deletions, and / or substitutions are made at the CDR regions of a variant antibody.
  • Identity or homology with respect to the sequence of the variant antibody is defined herein as the percentage of amino acid residues in the sequence of the variant antibody that are identical to the residues of the parent antibody, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percentage of sequence identity.
  • a variant antibody retains the ability to bind to the same antigen, and preferably the epitope, to which the parent antibody binds, and in some embodiments, the at least one property or biological activity exceeds that of the parent antibody.
  • a variant antibody may have, for example, a more pronounced binding affinity, a longer half-life, a lower IC50 value or an increased ability to suppress the biological activity of the antigen compared to the parent antibody.
  • a variant antibody showing a biological activity greater than at least 2 times (preferably at least 5 times, 10 times or 20 times) the biological activity of the parent antibody.
  • bispecific antibody means an antibody containing an antigen binding domain or antigen binding domains that are capable of specifically binding to two different epitopes on one biological molecule or capable of specific binding to epitopes on two different biological molecules.
  • a bispecific antibody is also referred to herein as having "double specificity” or as being an antibody with "double specificity”.
  • chimeric antibody refers in a broad sense to an antibody that contains one or more regions of one antibody, and one or more regions of one or more other antibodies, typically an antibody, partially human or partially non-human, that is, obtained partially from a non-human animal, such as a mouse, rat, or other rodent or camelid, such as a llama or alpaca. Chimeric antibodies are preferred over non-human antibodies in order to reduce the risk of an immune response directed against antibodies in humans, for example, a response directed against murine bodies in humans in the case of a mouse antibody.
  • An example of a typical chimeric antibody is one in which the variable region sequences are murine, while the constant region sequences are human.
  • non-human parts can be further modified to humanize the antibody.
  • humanization refers to the fact that when an antibody is wholly or partially non-human, for example, a mouse or llama antibody obtained by immunizing mice or llamas with an antigen of interest, respectively, or is a chimeric antibody based on such a mouse or llama antibody , you can replace some amino acids, in particular, in the framework regions and constant domains of the heavy and light chains, in order to avoid or minimize the immune response in humans.
  • the specificity of the interaction of the antibody with the target antigen is inherent mainly in amino acid residues located in six CDR regions of the heavy and light chains. Therefore, the amino acid sequences within the CDR regions are much more variable between the individual antibodies, compared with sequences outside the CDR regions.
  • recombinant antibodies can be expressed that mimic the properties of a specific natural antibody, or more generally, any specific antibody with a given amino acid sequence, for example, by constructing expression vectors that express CDR sequences -particles from a specific antibody to the framework sequences of another antibody.
  • a non-human antibody can be “humanized” and the binding specificity and affinity of the original antibody can be largely maintained.
  • non-human antibodies are generally more immunogenic than human antibodies.
  • Chimeric antibodies in which foreign (e.g., rodent or camel) constant regions have been replaced by sequences of human origin have shown generally lower immunogenicity than antibodies of completely foreign origin, and there is a tendency to use humanized or fully human antibodies in therapeutic antibodies.
  • Chimeric antibodies or other non-human antibodies can thus be humanized to reduce the risk of an anti-antibody immune response in humans.
  • humanization usually involves modifying the frame regions of the variable region sequences.
  • Amino acid residues that are part of the complementarity determining regions (CDR regions) will most often not change due to humanization, although in some cases it may be desirable to alter individual amino acid residues of the CDR region, for example, to remove a glycosylation region, a deamidation site, an aspartate isomerization site, or an undesired cysteine or methionine residue.
  • ⁇ -linked glycosylation occurs by attaching an oligosaccharide chain to an asparagine residue in the tripeptide sequence of Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, where X may be any amino acid except Pro.
  • Removal of the N-glycosylation site can be achieved by mutating the Asn or Ser / Thr residue with another residue, preferably by conservative substitution.
  • the deamidation of asparagine and glutamine residues may occur depending on factors such as pH and exposure of the surface.
  • Asparagine residues are particularly susceptible to deamidation, especially if they are present in the Asn Gly sequence, and to a lesser extent in other dipeptide sequences, such as Asn-Ala. In the presence of such a deamidated region, in particular Asn-Gly, in the sequence of the CDR region, it may be preferable to remove this region, usually by conservative substitution, to remove one of the residues involved.
  • CDR site transplantation may be based on Rabat CDR site definitions, although a later publication (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev. Oncol Hematol.
  • transplantation of a CDR region can reduce the specificity and affinity of binding, and therefore biological activity, of a transplanted non-human antibody CDR compared to the parent antibody from which the CDR regions are derived.
  • Reverse mutations (sometimes referred to as “frame repair”) can be applied at selected CDR positions transplanted antibodies, usually in frame sections, in order to restore the specificity and affinity of binding of the parent antibody.
  • the determination of positions for possible reverse mutations can be performed using information available in the literature and in the antibody databases.
  • Amino acid residues that are candidates for reverse mutations are typically located on the surface of an antibody molecule, while residues that are deepened or have a low degree of exposure to the surface will usually not be affected.
  • the humanization method an alternative to transplantation of the CDR region and reverse mutation, is a surface change in which residues of non-human origin unexposed on the surface are retained, while residues exposed on the surface are transformed into human residues.
  • Phage display is the first and most widely used in vitro antibody search technology.
  • Smith discovered that foreign DNA sequences can be cloned into an M13 filamentous bacteriophage in such a way that cloned gene sequences are expressed on the surface of phage particles as fusion proteins (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317.).
  • Smith GP Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317.
  • the repertoire of phage libraries reflects the repertoire of antibodies of b-lymphocytes of each person or animal, whose blood was used to create the library.
  • mice that expressed fully human antibodies, the repertoire of which could be comparable to those obtained by hybridoma technology (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al .: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.
  • transgenic mice express B-cell receptors, which are essentially mouse and human hybrid (human immunoglobulin, mouse Iga, Ig, and other signaling molecules), their B cells normally develop and mature. In some cases, it may also be preferable to change one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity of the target epitope.
  • affinity maturation This is known as “affinity maturation” and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where humanization of an antibody leads to a decrease in binding specificity or affinity, and it is not possible to sufficiently improve binding specificity or affinity by using only inverse mutations.
  • affinity maturation methods are known in the art, for example, the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), and a step-by-step method in vitro affinity maturation proposed by Wu et al. , Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998).
  • the term "monoclonal antibody” or “mAb” refers to an antibody that is synthesized and isolated by a separate clonal population of cells.
  • a clonal population may be a clonal population of immortalized cells.
  • the immortalized cells in the clonal population are hybrid cells, hybridomas that are usually obtained by fusing individual B lymphocytes from immunized animals with individual lymphocyte tumor cells.
  • Hybridomas are a type of engineered cell and are not found in nature.
  • “Native antibodies” are usually heterotetrameric glycoproteins with a molecular weight of approximately 150,000 daltons, consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds between the heavy chains varies in different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has evenly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has a variable domain (VH) at one end, followed by several constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at the other end.
  • VH variable domain
  • VL variable domain at one end
  • the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the variable domain of the light chain is aligned with the variable domain of the heavy chain.
  • Specific amino acid residues are believed to form an interface between the variable domains of the light chain and the heavy chain.
  • isolated means an antibody identified and isolated and / or regenerated from the cell or cell culture in which it is expressed.
  • Impurities (contaminants) from the natural environment are materials that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes.
  • the antibody is purified (1) to a degree sufficient to produce at least 15 residues of the embodying-terminal or internal amino acid sequence using a rotating glass cup sequencer (Edman sequencer), or (2) until homogeneous by SDS-PAGE in non-reducing or reducing conditions using Coomassie staining with brilliant blue or, preferably, silver.
  • An isolated antibody includes antibodies in situ within recombinant cells, since at least one component of the natural environment of the polypeptide is absent. Typically, an isolated polypeptide is obtained from at least one purification step.
  • An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one impurity nucleic acid molecule with which it is usually associated in a natural source of an antibody nucleic acid.
  • An isolated nucleic acid molecule differs from the form or kit in which it is found in vivo. Thus, the isolated nucleic acid molecule is different from the nucleic acid molecule that exists in cells in vivo.
  • the isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule located in cells in which expression of the antibody normally occurs, for example, if the nucleic acid molecule has a localization in the chromosome that is different from its localization in cells in vivo.
  • epitope refers to a part (determinant) of an antigen that specifically binds to a binding molecule (for example, an antibody or a related molecule, such as a bispecific binding molecule).
  • a binding molecule for example, an antibody or a related molecule, such as a bispecific binding molecule.
  • Epitope determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules, such as amino acids or carbohydrates, or sugar side chains, and, as a rule, have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific characteristics of charges.
  • An epitope can be “linear” or “conformational.” In a linear epitope, all points of interaction between a protein (eg, an antigen) and an interacting molecule (such as an antibody) occur linearly along the primary amino acid sequence of the protein.
  • a conformational epitope interaction points occur through amino acid residues on a protein that are separated from each other in the primary amino acid sequence.
  • antibodies to this epitope can be generated using techniques well known in the art.
  • the generation and characterization of antibodies or other binding molecules can shed light on information about the desired epitopes. Based on this information, binding molecules can then be competitively screened for binding to the same or similar epitopes, for example, by conducting competition studies to find binding molecules that compete for binding to antigen.
  • peptide linker in this document means any peptide with the ability to join domains with a length depending on the domains that it binds to each other, containing any amino acid sequence.
  • the peptide linker has a length of more than 5 amino acids and consists of any set of amino acids selected from G, A, S, P, E, T, D, K.
  • effector function of an antibody refers to the types of biological activity associated with the Fc region (native sequence of the Fc region or variants of the amino acid sequence of the Fc region) of the antibody, and vary depending on the isotype of the antibody.
  • antibody effector functions are: Cl q - binding; complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody-based cell-dependent cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (e.g., B-cell receptor, BCR); and B-cell activation.
  • ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • FcR Fc receptors
  • NK natural killer cells
  • macrophages eg, neutrophils and macrophages
  • the expression of FcR on hematopoietic cells is summarized in table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).
  • ADCC activity of the molecule of interest can be evaluated in vivo, for example, in an animal model, such as the model described in Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
  • Human effector cells are white blood cells that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcyRIII and perform an ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), natural killer cells (NKs), monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils; while PBMCs and Consequentlyplex relatively small cells. Effector cells can be isolated from their natural source, for example, from blood or PBMC, as described in this publication.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • NKs natural killer cells
  • monocytes cytotoxic T cells
  • neutrophils neutrophils
  • Effector cells can be isolated from their natural source, for example, from blood or PBMC, as described in this publication.
  • Fc receptor and “FcR” are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody.
  • a preferred FcR is a human FcR with a native sequence.
  • a preferred FcR is FcR, which binds an IgG antibody (gamma receptor), and preferred receptors include receptors of subclasses FcyRI, FcyRII and FcyRIII, including allelic variants and alternatively splicable forms of said receptors.
  • FcyRII receptors include FcyRIIA (an "activating receptor") and FcyRIIB (an "inhibiting receptor”), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains.
  • the activating receptor FcyRIIA contains a tyrosine-based immunoreceptor activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain.
  • ITAM immunoreceptor activation motif
  • the inhibitory receptor FcyRIIB contains in its cytoplasmic domain a tyrosine-based immunoreceptor inhibition motive (ITIM) (see review in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)).
  • ITIM tyrosine-based immunoreceptor inhibition motive
  • FcR FcR
  • FcRn neonatal receptor
  • “Complement dependent cytotoxicity” and “CDC” refer to the ability of a molecule to lyse a target in the presence of complement.
  • the complement activation pathway is initiated by the binding of the first component of the complement system (Clq) to the molecule
  • a CDC assay can be performed, for example, as described in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
  • identity or “homology” should be interpreted as meaning the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the residues of the corresponding sequence with which it is compared, after sequence comparison and the introduction of "gaps” if it is necessary to achieve the maximum percentage of identity for the full sequence and not considering any conservative substitutions as part of sequence identity. Neither N- or C-terminal extension, nor insertion segments should not be construed as reducing identity or homology. Methods and computer programs for comparison are well known. Sequence identity can be determined using sequence analysis software (e.g., Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). This software is suitable for such sequences by determining the degree of homology for a variety of substitutions, deletions (eliminations) and other modifications.
  • sequence analysis software e.g., Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705
  • nucleic acid sequence should be interpreted as a nucleotide sequence exhibiting at least 85%, preferably 90%, more preferably 95% and most preferably 97% sequence identity with respect to the nucleic acid sequence.
  • Modification (s) of the amino acid sequences of the antibodies described in this publication are proposed. For example, it may be desirable to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • Variants of the amino acid sequence of an antibody are obtained by introducing appropriate changes in the nucleotides into the nucleic acid of the antibody or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions and / or insertions and / or substitutions of residues in the amino acid sequences of the antibody. Any combination of deletions, insertions, and substitutions is performed to obtain the final construct, provided that the final construct has the required characteristics.
  • Amino Acid Changes May also alter post-translational processes in the antibody, such as changes in the number or position of glycosylation sites.
  • a variant of the modification of the amino acid sequences of antibodies using amino acid substitutions is the replacement of at least one amino acid residue in the antibody molecule with another residue.
  • Places of greatest interest for mutagenesis by substitutions include hypervariable regions or CDRs, but changes in the FR or Fc regions are also contemplated.
  • Conservative substitutions are shown in table 1 under the heading of "preferred substitutions.” If such substitutions result in a change in biological activity, then additional substantial changes can be introduced, called “examples of substitutions" in Table A, or changes additionally described below in the description of the classes of amino acids, and products can be screened.
  • nucleic acid means “nucleic acid sequence” or “nucleic acid sequence”, “polynucleotide”, “oligonucleotide”,
  • Polynucleotide sequence and “nucleotide sequence”, which are used interchangeably in this description, mean a clear sequence of nucleotides, modified or not modified, defining a fragment or region of a nucleic acid containing or not containing unnatural nucleotides and which is either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or transcription products of these DNA.
  • sequences of this invention have been isolated and / or purified, i.e. were taken directly or indirectly, for example by copying, while their environment was at least partially modified.
  • isolated nucleic acids obtained by genetic recombination for example using host cells (host cells), or obtained by chemical synthesis, should also be meant here.
  • a reference to a nucleotide sequence covers its compliment, unless otherwise indicated. So the link to a nucleic acid having a specific sequence should be understood as encompassing its complementary chain with its complementary sequence.
  • control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of a functionally linked coding sequence in a particular host organism.
  • Suitable control sequences for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator and a ribosome binding site.
  • promoters, polyadenylation signals and enhancers are present in eukaryotic cells.
  • a nucleic acid is “operably linked” if it is in functional association with another nucleotide sequence.
  • DNA of a presequence or secretory leader sequence is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that is involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is functionally linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; the ribosome binding site is functionally linked to the coding sequence, if located so that it can facilitate translation.
  • “operably linked” means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, are contiguous and are in the reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous. Binding is accomplished by ligation embedding in existing restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to well-known practice.
  • vector means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is connected.
  • the vector is a plasmid, i.e. a circular double-stranded portion of DNA into which ligates can be ligated additional DNA segments.
  • the vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • the vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (for example, bacterial vectors having a bacterial replication origin and episomal mammalian vectors).
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • vectors can be integrated into the genome of the host cell when introduced into the host cell, and thus replicate together with the host gene.
  • some vectors are capable of directing the expression of the genes with which they are functionally linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “expression vectors”).
  • recombinant host cell means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced.
  • the present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above.
  • the present invention also relates to host cells, which include, for example, a nucleotide sequence encoding a heavy chain or its antigen binding parts, a nucleotide sequence encoding a light chain or its antigen binding parts, or both of them, a first binding domain and / or a second binding domain trispecific binding molecules according to this invention.
  • host cell and “host cell” mean not only the particular cell claimed, but also the progeny of such a cell. Since modifications can occur in subsequent generations due to mutations or environmental influences, such offspring may not, in fact, be identical to the parent cell, but such cells are still included within the scope of the term “host cell” as used herein.
  • excipient is used herein to describe any ingredient other than the compound (s) of this invention.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising an antibody according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, solvents, diluents, carriers, auxiliary, distributing and perceptive agents, agents deliveries such as preservatives, stabilizers, fillers, grinders, moisturizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, sweeteners, perfumes, flavors, antibacterials erialnye agents, fungicides, lubricants, and prolonged delivery controllers, the choice and suitable proportions of which depend on the nature and purpose of the method and dosage.
  • suspending agents examples include ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene, sorbitol and sorbitol ether, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, as well as mixtures of these substances. Protection against the action of microorganisms can be achieved using a variety of antibacterial and antifungal agents, for example, such as parabens, chlorobutanol, sorbic acid and the like.
  • the composition may also include isotonic agents, for example, sugars, sodium chloride and the like.
  • the prolonged action of the composition can be achieved using agents that slow down the absorption of the active principle, for example, aluminum monostearate and gelatin.
  • suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, and also mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil) and injectable organic esters (such as ethyl oleate).
  • excipients are lactose, milk sugar, sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate and the like.
  • grinders and distributors are starch, alginic acid and its salts, silicates.
  • lubricants are magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, talc, and high molecular weight polyethylene glycol.
  • the pharmaceutical composition for oral, sublingual, transdermal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, local or rectal administration of the active principle, alone or in combination with another active principle, can be administered to animals and humans in a standard administration form in the form of a mixture with traditional pharmaceutical carriers.
  • Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, gelatine capsules, pills, powders, granules, chewing gums and oral solutions or suspensions, sublingual and buccal administration forms, aerosols, implants, local, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular administration forms and rectal administration forms.
  • Medical product - a substance (or a mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition) in the form of tablets, capsules, injections, ointments and other formulations intended to restore, correct or alter physiological functions in humans and animals, as well as treatment and prevention of diseases, diagnosis, anesthesia, contraception, cosmetology and other things.
  • disease or disorder mediated by PD-L1 means all diseases or disorders that are either directly or indirectly associated with PD-L1, including the etiology, development, progress, persistence or pathology of the disease or disorder.
  • Treatment refers to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and / or at least one of its accompanying symptoms.
  • Alleviate a disease, disease, or condition, it means reducing the severity and / or frequency of symptoms of the disease, disorder, or condition.
  • references to “treatment” contained herein include references to therapeutic, palliative, and prophylactic therapy.
  • the subject of treatment or the patient is a mammal, preferably a human subject. The aforementioned subject may be male or female of any age.
  • the term "violation” means any condition that can be improved as a result of treatment of the present invention.
  • the definition of this term includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that cause a mammal's predisposition to the occurrence of this violation.
  • diseases to be treated include benign and malignant tumors; leukemia and lymphoid malignancies, in particular cancer of the breast, ovary, stomach, endometrium, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid gland, pancreas, prostate or bladder; neural, glial, astrocytal, hypothalamic and other glandular, macrophage, epithelial, stromal and blastocellular disorders; inflammatory, angiogenic and immunological disorders.
  • the preferred disorder to be treated according to the invention is cancer.
  • cancer refers to a physiological state or describe a physiological state in mammals, which is typically characterized by unregulated (/) cell growth / proliferation. This definition covers benign and malignant cancers. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia.
  • cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, hepatic cell carcinoma, gastric cancer, including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, ovary, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, carcinoma endometrium and uterus, salivary carcinoma, kidney cancer (renal cell carcinoma), prostate cancer (prostate cancer), cancer of the external female genital organs, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal canal carcinoma, penis carcinoma, melanoma and various types of head and neck.
  • gastric cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, ovary, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, carcinoma endometrium and uterus, salivary carcinoma, kidney cancer (
  • immune response refers, for example, to the action of lymphocytes, antigen-presenting cells, phagocytic cells, granulocytes and soluble macromolecules produced by these cells or liver cells (including antibodies, cytokines and complement, invasive pathogens, cells or tissues infected with pathogens, cancer cells or, in cases of autoimmunity or pa, resulting from selective damage, destruction or elimination from the human body ologicheskogo inflammation, normal human cells or tissues).
  • a “therapeutically effective amount” is the amount of a therapeutic agent administered during treatment that will relieve to some extent one or more of the symptoms of the disease being treated.
  • chronic use refers to the continuous (long-term) use of the agent (s) as opposed to the acute (short-term) route of administration, so as to maintain the initial therapeutic effect (activity) for a long period of time.
  • “Intermittent” use refers to a treatment that is not administered sequentially without interruption, but which is rather periodic in nature.
  • the present invention relates to antibodies or an antigen binding fragment that bind PD-L1 (programmable death protein ligand 1).
  • the present invention relates to an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds PD-L1 and comprises:
  • variable region of the heavy chain containing CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of a homologous or identical sequence APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), and
  • variable region of the light chain containing CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of a homologous or identical sequence ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).
  • the present invention relates to an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds PD-L1 and comprises:
  • variable region of the light chain containing CDR3 with the amino acid sequence ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).
  • the present invention relates to an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds PD-L1 and comprises:
  • variable region of the heavy chain containing:
  • CDR1 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of a homologous or identical DYAMS sequence (SEQ ID NO: one) ,
  • CDR2 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous or identical sequence
  • CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of the homologous or identical sequence of APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), and
  • variable region of the light chain containing:
  • CDR1 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of the homologous or identical sequence GLSSGTVTAINYPG (SEQ ID NO: 5) ,
  • CDR2 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of a homologous or identical NTNTRHS sequence (SEQ ID NO: 6)
  • CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of the homologous or identical sequence ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).
  • the present invention relates to an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds PD-L1 and comprises:
  • variable region of the heavy chain containing:
  • variable region of the light chain containing:
  • the present invention relates to an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds PD-L1 and comprises:
  • variable region of the heavy chain with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of a homologous or identical sequence
  • variable region of the light chain with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of a homologous or identical sequence
  • the present invention relates to an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds PD-L1 and comprises:
  • the present invention relates to an isolated antibody that binds PD-L1, and contain:
  • the present invention relates to an isolated antibody that binds PD-L1, and contain:
  • the isolated antibody that binds PD-L1 is a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody that binds PD-L1 is a full-length IgG antibody.
  • the full-length IgG antibody is of the human IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 isotype.
  • the full-length IgG antibody is of the IgGl isotype.
  • the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and contains a variable region of the heavy chain containing CDR3 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a variable region of the light chain containing CDR3 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and contains a heavy chain variable region comprising CDR 1-3 with the corresponding amino acid sequences of SEQ ID NO: 1-3 and a light chain variable region, containing CDR 1-3 with the corresponding amino acid sequences of SEQ ID NO: 5-7.
  • the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and comprises a heavy chain variable region with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and contains a heavy chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the present invention also relates to nucleic acid molecules, and sequences encoding an anti-PD-L1 antibody of the invention described herein.
  • various nucleic acid molecules encode a first domain and a second domain amino acid sequence of an anti-PD-L1 antibody.
  • first domain and / or second domain contains a heavy chain and a light chain
  • various nucleic acids encode the heavy chain and amino acid sequences of the light chain.
  • the same nucleic acid molecule encodes a sequence of the heavy chain and light chain amino acids.
  • the nucleic acid molecule may encode any combination of amino acid sequences (eg, heavy and light chain sequences) of the first and second domain.
  • the nucleic acid molecule may encode the amino acid sequence of the first binding domain and the amino acid sequence of the light chain of the second binding domain, optionally including any sequence of a peptide linker connecting them.
  • a reference to a nucleotide sequence covers its compliment, unless otherwise indicated. Thus, reference to a nucleic acid having a specific sequence should be understood as encompassing its complementary chain with its complementary sequence.
  • polynucleotide as used herein means a polymeric form of nucleotides at least 10 bases in length, or ribonucleotides, or deoxynucleotides, or a modified form of any type of nucleotide. The term includes single and double chain forms.
  • the present invention also relates to nucleotide sequences that are at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% homologous or identical to one or more nucleotide sequences encoding the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 _ 3, 5-7.
  • the nucleotide sequences of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% are homologous or identical to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 8.
  • Present the invention also relates to nucleotide sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to one or more of the aforementioned nucleotide sequences encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of from SEQ ID NO: 9-10.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-10.
  • the nucleic acid molecule may also contain any combination of these nucleotide sequences.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the nucleic acid molecule contains nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-3 and nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5-7.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the nucleic acid molecule contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the nucleic acid molecules may be isolated.
  • the nucleic acid molecule of this invention can be isolated from any source that produces an antibody to PD-L1 or part thereof. In certain embodiments, a nucleic acid molecule of the invention may be synthesized rather than isolated.
  • the nucleic acid molecule of the invention may comprise a nucleotide sequence encoding a VH domain of a first or second domain of an anti-PD-L1 antibody of the invention, coupled as read from a nucleotide sequence encoding a constant domain of a heavy chain from any source.
  • a nucleic acid molecule of the invention may comprise a nucleotide sequence encoding a VL domain from a first or second region of an anti-PD-L1 antibody of the invention combined as a reader with a nucleotide sequence encoding a constant domain of a light chain from any source.
  • nucleic acid molecules encoding the variable domain of the heavy (VH) and / or light (VL) chains of the first or second binding domain can be "transformed” along the entire length of the antibody genes.
  • the nucleic acid molecules encoding the VH or VL domains are transformed into antibody genes along the entire length by insertion into an expression vector already encoding the constant domains of the heavy chain (CH) or light chain (CL), respectively, so that the VH segment is functional connected to the CH segment (s) in the vector and / or the VL segment is operatively connected to the CL segment in the vector.
  • nucleic acid molecules encoding the VH and / or VL domains are converted into genes along the entire length of the antibody by connecting, for example, ligation, a nucleic acid molecule encoding the VH and / or VL domains to a nucleic acid molecule encoding the CH and / or CL domains using standard molecular biological methods. Nucleic acid molecules encoding the entire length of the heavy and / or light chains can then be expressed from the cell into which they were introduced.
  • Nucleic acid molecules can be used to express a large number of recombinant antibodies to PD-L1. Nucleic acid molecules can be used to produce human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, bispecific antibodies, single chain antibodies, immunoadhesins, diabodies, mutated antibodies, and antibody derivatives, as described herein.
  • the present invention relates to a vector suitable for expression of any of the nucleotide sequences described herein.
  • the present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode any of the amino acid sequences of antibodies to PD-L1 or parts thereof (for example, heavy chain sequences of the first and / or heavy and / or light chain of the second binding domains) as described herein .
  • the present invention further relates to vectors containing nucleic acid molecules encoding fusion proteins, modified antibodies, antibody fragments.
  • nucleic acid molecules and vectors can be used to make mutated antibodies to PD-L1.
  • Antibodies can mutate in the variable domains of the heavy and / or light chains of the first and / or heavy and / or light chains of the second binding domain, for example, to change the binding ability of antibodies to PD-L1.
  • a mutation can occur at one or more CDR sites to increase or decrease the K D of antibodies to PD-L1, to increase or decrease k 0 ff, or to change the binding specificity of the antibody for PD-L1.
  • one or more mutations are subjected to an amino acid residue that is known to be altered from the germ line in an antibody corresponding to the first or second binding domain of an anti-PD-L1 antibody of the invention. These mutations can be made in the CDR region or the framework region of the variable domain, or in the constant domain. In a preferred embodiment mutation inventions produced in the variable domain. In another embodiment, the amino acid residue is known to undergo one or more mutations, which is known to be altered from the germ line in the CDR region or frame region of the variable domain of the anti-PD-L1 antibody of this invention.
  • the anti-PD-L1 antibodies of this invention are expressed by inserting DNA encoding partially or fully the sequence of the first and second binding domain (eg, heavy and light chain sequences, where the binding domain contains heavy and light chain sequences) obtained as described above, in expression vectors so that the genes are functionally linked to the necessary expression control sequences, such as transcriptional and translational control sequences.
  • Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic viruses, cosmids, YAC, EBV derived episomas and the like.
  • DNA molecules can be ligated into a vector so that sequences that control transcription and translation in the vector fulfill the intended function of regulating the transcription and translation of DNA.
  • the expression vector and expression control sequences can be selected so as to be compatible with the expression host cell used.
  • DNA molecules encoding partially or along the entire length of the sequence of the first and second binding domains e.g., heavy and light chain sequences, where the binding domain contains a heavy and light chain sequence
  • DNA molecules can be introduced into separate vectors.
  • any combination of the above DNA molecules is introduced into the same expression vector.
  • DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (e.g., ligation of complementary restriction sites on the gene fragment of the antibody and vector or ligation of blunt ends, if there are no restriction sites).
  • a suitable vector is one that encodes functionally complete human immunoglobulin CH or CL sequences to construct an appropriate restriction site such that any VH or VL sequence can be easily incorporated and expressed as described above.
  • NS and LC coding of genes in such vectors may contain intron sequences, which leads to a general increase in the protein products of antibodies by stabilization of the corresponding mRNA.
  • Intron sequences are surrounded by a splice donor and a splice acceptor sites that determine where RNA splicing will occur.
  • the arrangement of intron sequences can be either in the variable or constant regions of the antibody chains, or in both variable and constant regions when several introns are used. Termination of polyadenylation and transcription may occur downstream of the native chromosome site of the encoded regions.
  • the recombinant expression vector can also encode a signal peptide that facilitates the production of an antibody chain by a host cell.
  • the antibody chain gene can be cloned into a vector so that the signal peptide is connected to the reading frame of the amino terminus of the immunoglobulin chain.
  • the signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide of a non-immunoglobulin nature protein).
  • the recombinant expression of the vectors of this invention can carry regulatory sequences that control the expression of antibody chain genes in the host cell.
  • regulatory sequences that control the expression of antibody chain genes in the host cell.
  • the design of an expression vector including the choice of regulatory sequences, may depend on factors such as selection of the host cell for transformation, expression level of the desired protein, etc.
  • Preferred regulatory sequences for an expressing host cell mammals include viral elements providing a high level of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (e.g. CMV promoter / enhancer), monkey virus 40 (SV40) (e.g.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 monkey virus 40
  • SV40 promoter / enhancer adenovirus (e.g., Late A promoter adenovirus (AdMLP)), polyoma virus, as well as strong mammalian promoters such as native immunoglobulin and actin promoters.
  • AdMLP Late A promoter adenovirus
  • strong mammalian promoters such as native immunoglobulin and actin promoters.
  • the recombinant expression vectors of the invention can carry additional sequences, such as sequences that regulate vector replication in host cells (e.g., replication origin) and selectable marker genes.
  • the selectable marker gene facilitates the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, for example, US patents 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017).
  • a selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, to the host cell into which the vector is introduced.
  • breeding marker genes include the dihydrofolate reductase gene (DHFR) (for use in dhfr host cells for the selection / amplification of methotrexate), the neo gene (for G418 selection), and the glutamate synthetase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase gene
  • neo for G418 selection
  • glutamate synthetase gene for use in dhfr host cells for the selection / amplification of methotrexate
  • glutamate synthetase gene glutamate synthetase gene
  • expression control sequence means polynucleotide sequences that are necessary to affect the expression and processing of coding sequences, to by which they are ligated.
  • Expression control sequences include corresponding transcription, termination, promoter and enhancer initiation sequences; effective RNA processing signals, such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize the cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (i.e., Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion.
  • control sequences vary depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter of the ribosomal binding site, as well as transcription termination sequences; in eukaryotes, typically, such control sequences include promoters and transcription termination sequences.
  • control sequences includes, at a minimum, all components whose presence is important for expression and processing, and may also include additional components whose presence is useful, for example, lead sequences and sequences of fused cells.
  • An additional aspect of the present invention relates to methods for producing antibodies to PD-L1 according to this invention.
  • One embodiment of the invention relates to a method for producing anti-PD-L1 antibodies, as defined herein, comprising preparing a recombinant host cell capable of expressing an anti-PD-L1 antibody, culturing said host cell under conditions suitable for production of an anti-PD-antibody L1, and isolation of the resulting anti-PD-L1 antibody.
  • An anti-PD-L1 antibody obtained by such expression in such recombinant host cells is referred to herein as “recombinant anti-PD-L1 antibodies”.
  • the invention also relates to offspring. cells of such host cells and antibodies to PD-L1, obtained in the same way.
  • Nucleic acid molecules encoding the anti-PD-L1 antibodies of the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or its cell, plant or its cell, bacterial or yeast host cell.
  • the conversion can occur by any known method for introducing polynucleotides into a host cell.
  • Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, transfection with a complex of nucleic acid and a positively charged polymer, transfection with nucleic acid and calcium phosphate precipitate, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion and lipid transfection direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells by viral vectors.
  • Cell transfection methods are well known in the art. See, for example, U.S. Patents 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 and 4,959,455.
  • Methods for transforming plant cells are well known in the art, including, for example, Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, direct injection, electroporation and viral transformation.
  • Methods for transforming bacterial and yeast cells are also well known in the art.
  • Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immortalized cell lines available. These include, in particular, Chinese hamster ovary cells (CHO), NS0 cells, SP2 cells, HEK-293T cells, 293 Freestyle cells (Ir itrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, hamster kidney cells (BHK), cells African green monkey (COS) kidney, human hepatocellular carcinoma cells (e.g., Hep G2), A549 cells, and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the necessary characteristics of the produced protein. Other cell lines that can be used are insect cell lines, such as Sf9 or Sf21 cells.
  • the antibodies When recombinant expression vectors encoding anti-PD-L1 antibodies are introduced into mammalian host cells, the antibodies are produced by culturing the host cells for a time sufficient to express the antibodies in the host cells or, more preferably, isolating the antibodies into a culture medium in which host cells are grown.
  • Antibodies to PD-L1 can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods.
  • Plant host cells for example, include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potatoes, etc.
  • Host bacterial cells include E. coli and Streptomyces species.
  • Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe,
  • the level of production of antibodies to PD-L1 according to this invention from a producing cell line can be enhanced using a number of known methods.
  • the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is common enough to enhance expression under certain conditions.
  • the GS system is discussed in whole or in part in connection with the patents EP 0216846, 0256055, 0323997 and 0338841.
  • the invention also relates to methods and processes for producing antibodies to PD-L1 and antigen-binding fragments thereof.
  • Monoclonal antibodies Monoclonal antibodies
  • Monoclonal antibodies can be created, for example, using the hybridoma method, which was first described by Kohler et al., Nature, 256, 1975, p. 495, or using recombinant DNA methods (US 4,816,567).
  • mice or another suitable host animal such as a hamster
  • lymphocytes can be obtained by in vitro immunization. After immunization, lymphocytes are isolated and then fused to the myeloma cell line using an acceptable binding agent, such as polyethylene glycol, to produce hybridoma cells (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, pp. 59-103).
  • the hybridoma cells thus obtained are seeded and grown in a suitable culture medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused parent myeloma cells.
  • a suitable culture medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused parent myeloma cells.
  • the hybridoma culture medium should typically include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (NAT medium), i.e. substances that inhibit the growth of HGPRT-deficient cells.
  • Myeloma cells used as a component for cell fusion are preferably fusion cells, maintain a stable high level of antibody production by selected antibody producing cells, and are sensitive to the selective medium on which unbound parental cells are selected.
  • Preferred myeloma cell lines are mouse myeloma lines, such as those based on the mouse tumor cell lines of the MORS-21 and MPC-11 lines, which can be obtained from the Salk Institite Cell Disrtibution Center, San Diego, pc. California, USA, and SP- lines 2 or X63-Ag8-653, which can be obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, pc.
  • the binding specificity of the monoclonal antibodies obtained using hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • the binding affinity of a monoclonal antibody can, for example, be determined using the Scatchard analysis described in Munson et al., Anal. Biochem., 107, 1980, p. 220.
  • clones can be subcloned using the limiting dilution method and grown by standard methods (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, cc. 59 -103). Suitable media for this purpose include, for example, DMEM or RPMI-1640.
  • hydriboma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals, for example, by intraperitoneal (i.p.) injection of cells into mice.
  • Monoclonal antibodies secreted by subclones can be separated from the culture medium, ascites fluid or serum using conventional antibody purification methods, for example, affinity chromatography (for example, using protein A - or protein Q-Sepharose), or ion exchange chromatography, chromatography on hydroxylapatites, gel electrophoresis, dialysis, etc.
  • affinity chromatography for example, using protein A - or protein Q-Sepharose
  • ion exchange chromatography chromatography on hydroxylapatites, gel electrophoresis, dialysis, etc.
  • DNA encoding monoclonal antibodies can be easily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., using oligonucleotide probes that have the ability to specifically bind to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies).
  • Hybridoma cells serve as a preferred source of such DNA.
  • DNA can be incorporated into expression vectors, which are then transfected with host cells, such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not produce antibody proteins without transfection, resulting in the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells.
  • monoclonal antibodies or antibody fragments can be isolated from phage libraries of antibodies generated using methods described by McCafferty et al., Nature, 348, 1990, cc. 552-554. Clackson et al., Nature, 352, 1991, cc. 624-628 and Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 1991, cc. 581-597 describe the isolation of murine and human antibodies, respectively, using phage libraries. Subsequent publications have described the production of high-affinity (nM range) human antibodies using chain permutation (Marks et al., Bio / Technology, 10, 1992, cc.
  • the DNA encoding the antibody can also be modified, for example, so as to obtain chimeric or fused polypeptides of antibodies, for example, by replacing the sequences of the constant regions of the heavy and light chains (Cn and CL) with homologous mouse sequences (US 4816567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, p. 6851) or by covalent binding of a coding sequence immunoglobulin with all or part of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide (heterologous polypeptide).
  • Cn and CL homologous mouse sequences
  • Non-immunoglobulin polypeptide sequences can be replaced by constant regions of the antibody or replaced by variable regions of the antigen binding center of the antibody, creating a chimeric bivalent antibody that contains one antigen binding center that has specificity for the antigen and another antigen binding center that has specificity for the other.
  • the humanized antibody has one or more amino acid residues built into it, obtained from a source other than human. These amino acid residues derived from a non-human source are often referred to as “import” residues, since they are usually derived from an “import” variable region. Humanization in general can be carried out according to the method of Winter et al. (Jones et al., Nature, 321, 1986, pp. 522-525; Riechmann et al., Nature, 332, 1988, pp. 323-327; Verhoeyen et al., Science, 239, 1988, pp.
  • humanized antibodies are chimeric antibodies (US 4,816,567), in which a region substantially smaller than the intact human variable region is replaced by an appropriate sequence obtained from species other than humans.
  • humanized antibodies are typically human antibodies in which part of the residues of the hypervariable region and possibly part of the FR residues are replaced by residues from similar regions of rodent antibodies.
  • variable region sequence of the rodent antibody is screened for a relatively complete library of known sequences of human variable regions.
  • the human sequence of the V region that is closest to the sequence from the rodent organism is identified and a human framework region (FR) suitable for use in a humanized antibody is selected within it (Sims et al., J. Immunol., 151, 1993, p. 2296); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196, 1987, p. 901).
  • Another method uses a specific framework region obtained from the consensus sequence of a particular subgroup of light or heavy chains of all human antibodies.
  • the same framework can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 1992, p. 4285; Presta et al., J. Immunol., 151, 1993 , p. 2623).
  • humanized antibodies are obtained by analysis of parental sequences and various humanized products using speculative three-dimensional models of parental and humanized sequences.
  • Three-dimensional models of immunoglobulins are generally available and well known to specialists in this field.
  • Computer programs are known that illustrate and display possible three-dimensional conformational structures of selected promising immunoglobulin sequences. The study of these images allows the analysis of the possible role of residues in the function of the promising sequence of immunoglobulin, i.e. analysis of residues that affect the ability of a prospective immunoglobulin to bind to an antigen.
  • residues in FR can select the residues in FR and combine with recipient and import sequences to achieve the desired antibody characteristics, such as increased affinity for the antigen (s) of the target (s).
  • residues of the hypervariable region have a direct and most significant effect on antigen binding.
  • a humanized antibody may be an antibody fragment, such as a Fab fragment, optionally conjugated to one or more cytotoxic agent (s) to create an immunoconjugate.
  • the humanized antibody may be a full-sized antibody, for example, a full-sized antibody in the form of IgGl.
  • human antibodies can be obtained.
  • transgenic animals e.g., mice
  • transgenic animals e.g., mice
  • jH segment antibody heavy chain gene
  • transferring the germline set of the human immunoglobulin gene into such a mutant mouse germline results in the production of human antibodies after challenge with the antigen (see, for example, Jakobovis et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • phage display can be used to obtain human antibodies and in vitro antibody fragments from the gene spectrum of the immunoglobulin variable region (V) of an immunoglobulin from an organism of immunized donors.
  • V immunoglobulin variable region
  • technology McCafferty et al., Nature, 348, 1990, pp. 552- ⁇ 553
  • the genes of the V region of the antibody are cloned into the reading frame with either the main or minor gene of the coat protein of a filamentous bacteriophage, such as M13 or fd, and present as functional fragments of the antibody on the surface of the phage particle.
  • the filamentous particle contains a copy of the single-stranded DNA of the phage genome, selection based on the functional properties of the antibody also leads to the selection of a gene encoding an antibody that has the indicated properties.
  • the phage mimics some of the properties of b cells. Phage presentation can be done in various formats
  • human antibodies can also be produced in vitro by activated B cells (see US 5567610 and 5229275).
  • antibody fragments rather than complete antibodies.
  • the smaller size of the fragments contributes to their rapid clearance and may contribute to better penetration into dense tumors.
  • antibody fragments Traditionally, these fragments were obtained by proteolytic cleavage of intact antibodies (see, for example, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24, 1992, cc. 107-117 and Brennan et al., Science, 229, 1985, p. 81). However, at present, these fragments can be obtained directly using recombinant host cells. Fab, Fv and scFv fragments of antibodies can be expressed and secreted from E. coli, which facilitates the production of large quantities of these fragments. Antibody fragments can be isolated from the above phage antibody libraries. In another embodiment, Fab '-SH fragments can be directly isolated from E.
  • F (ab ') 2 fragments can be isolated directly from a culture of recombinant host cells.
  • Fab and F (ab ') 2 fragments with increased in vivo half-lives in which epitope-binding receptor residues are stored are described in US Pat. No. 5,869,046.
  • Other methods for preparing antibody fragments will be apparent to those skilled in the art.
  • the selected antibody is a single chain Fv fragment (scFv) (see WO 93/16185; US 5571894 and US Pat. No.
  • Fv and sFv are the only species with intact binding sites lacking constant regions; as a result, they can be used for reduced nonspecific binding when used in vivo.
  • Fusion proteins carrying sFv can be designed to fuse an effector protein at either the ⁇ or C-terminus of sFv (see Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra).
  • An antibody fragment may also be a “linear antibody,” for example, as described in US Pat. No. 5,641,870. Such fragments of a linear antibody may be monospecific or bispecific.
  • Bespecifically antibodies are antibodies that have specificity for binding to two different epitopes.
  • bispecific antibodies can bind to two different epitopes of the PD-L1 protein.
  • Other bispecific antibodies may carry a PD-L1 binding site in combination with the site binding of another protein.
  • Bespecifically antibodies can be obtained in the form of full-sized antibodies or fragments of antibodies (for example, F (ab ') 2 fragments of bespecifically antibodies).
  • bispecific antibodies Methods for creating bispecific antibodies are known in the art.
  • the generally accepted production of full-size bispecific antibodies is based on the joint expression of two pairs of heavy and light immunoglobulin chains, where both chains have different specificities (Millstein et al., Nature, 305, 1983, pp. 537-539). Due to the random set of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) can potentially produce a mixture of 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule, which is usually carried out in several stages using affinity chromatography, is quite laborious, and the product yield is low. Similar processes are described in W0 93/08829 and Traunecker et al., EMBO J. , 10, 1991, ss. 3655-3659.
  • variable regions of an antibody with the desired binding specificity are fused to the sequences of the constant region of an immunoglobulin.
  • the fusion is preferably carried out with the constant region of the Ig heavy chain, which includes at least a part of the hinged Sn2 and Sn3 regions.
  • at least one of the fusions contains the first constant region of the heavy chain (CI1) containing the site necessary for binding of the light chain.
  • DNAs encoding the fusion of the immunoglobulin heavy chain and, if necessary, the immunoglobulin light chain are inserted into various expression vectors and together they transfect an acceptable host organism.
  • the bispecific antibodies are an immunoglobulin heavy chain hybrid providing the first binding specificity in the first arm, and an immunoglobulin light chain-heavy chain hybrid (which provides the second binding specificity) in the second arm. It has been found that this asymmetric structure facilitates the separation of the desired bispecific molecule from undesired combinations of immunoglobulin chains, since the presence of the immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule facilitates separation. This approach is described in WO 94/04690. For a further detailed description of the preparation of bispecific antibodies, see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121, 1986, p. 210.
  • a contact area can be constructed between a pair of antibody molecules in order to increase to the maximum level the percentage of heterodimers obtained from a culture of recombinant cells.
  • a preferred contact area includes at least a portion of the CHS region.
  • one or more small amino acids with side chains from the contact region of the first antibody molecule are replaced with molecules with larger side chains (for example, tyrosine or tryptophan).
  • Balancing "cavities" that are identical or close in size to the large side chain (s) (s) in the contact area of the second antibody molecule are created by replacing amino acids with large side chains with amino acids with smaller side chains (for example, alanine or threonine ) This provides a mechanism to increase the yield of heterodimer relative to other undesirable end products, such
  • Bespecific antibodies include crosslinked antibodies or “heteroconjugates”.
  • one of the antibodies in the heteroconjugate may be crosslinked with avidin, and the other with biotin.
  • Such antibodies can be used, for example, for targeted transfer of immune system cells to unwanted cells (US 4,676,980) and for the treatment of HIV infection (W0 91/00360, WO 92/200373 and EP 03089).
  • Heteroconjugate antibodies can be created using any of the conventional cross-linking methods. Acceptable cross-linkers are well known in the art and are described in US 4,676,980 along with various methods for introducing cross-linking.
  • bispecific antibodies can be obtained using chemical binding.
  • Brennan et al., Science, 229, 1985, p. 81 described a technique whereby intact antibodies are proteolytically cleaved to obtain F (ab ′) 2 fragments. These fragments are reduced in the presence of a complexing agent with dithiol, such as sodium arsenite, to stabilize neighboring dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfide bonds.
  • the resulting Fab ′ fragments are then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative.
  • TAB thionitrobenzoate
  • bispecific antibodies can be used as agents for the selective immobilization of enzymes.
  • bispecific antibodies were prepared using leucine zippers (Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5), 1992, pp. 1547-1553). Leucine zipper peptides from Fos and Jun proteins were linked to Fab 'fragments of two different antibodies by gene fusion. Antibody homodimers were reduced in the hinge region to produce monomers, and then antibody heterodimers were obtained by reoxidation. This method can also be used to obtain antibody homodimers. Dual Antibody Technology Described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Fragments contain a VH region linked to the VL region by a linker that is too short to allow pairing of two domains of the same chain. Thus, the VH and VL regions of one fragment must pair with the complementary VL and VH regions of another fragment, thereby forming two antigen-binding centers.
  • Another strategy for producing bispecific antibody fragments is also described, based on the use of single chain (Fv) - (sFv) dimers (see Gruber et al., J. Immunol, 152, 1994, p. 5368).
  • Antibodies having more than two valencies also fall within the scope of the invention.
  • trispecific antibodies can be prepared (Tutt et al., J. Immunol., 147, 1991, p. 60).
  • a polyvalent antibody can be internalized (and / or dissimilated) by a cell expressing the antigen to which the antibody binds faster than a bivalent antibody.
  • Antibodies of the present invention may be polyvalent antibodies (other than the IgM class) with three or more antigen binding sites (e.g., tetravalent antibodies) that can be readily prepared by recombinant expression of a nucleic acid encoding the antibody polypeptide chains.
  • a polyvalent antibody may contain a dimerized domain and three or more antigen binding sites.
  • a preferred dimerized domain contains (or consists of) an Fc fragment or hinge region. In this case, the antibody should contain an Fc fragment and three or more antigen binding sites located at the ⁇ -end relative to the Fc fragment.
  • a preferred multivalent antibody contains (or consists of) from 3 to about 8, but preferably 4, antigen binding sites.
  • a polyvalent antibody contains at least one polypeptide chain (and preferably two polypeptide chains), while the polypeptide (s) chain (s) contains (at) two or more variable regions.
  • the polypeptide (s) chain (s) may contain VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc, where VD1 is the first variable region, VD2 is the second variable region, Fc is one Fc- polypeptide chain of the fragment, XI and X2 are an amino acid or a polypeptide and n is 0 or 1.
  • the polypeptide (s) chain (s) may contain the following chain: VH-CHl-flexible linker-VH-CHl-Fc fragment; or a VH-CHl-VH-CHl-Fc fragment.
  • the multivalent antibody of the present invention preferably further comprises at least 2 (and preferably 4) light chain variable region polypeptides.
  • the polyvalent antibody of the invention may, for example, contain from about 2 to about 8 polypeptides of the light chain variable region.
  • the polypeptides of the variable region of the light chain comprise the variable region of the light chain and optionally further comprise a CL region.
  • compositions comprising, as an active ingredient (or as the sole active ingredient), an antibody that is specific for PD-L1.
  • the pharmaceutical composition may include any anti-PD-L1 antibody as described herein.
  • the compositions are intended to improve, prevent, or treat disorders that may be associated with PD-L1 activity.
  • the anti-PD-L1 antibodies of this invention are suitable for use in dosage forms in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients, for example, as described below.
  • compositions of this invention may contain at least one anti-PD-L1 antibody and one or more additional binding molecules (eg, antibodies) that target one or more corresponding surface receptors.
  • additional binding molecules eg, antibodies
  • the pharmaceutical composition is "sterile" if it is aseptic, i.e. free from microorganisms and their spores.
  • the pharmaceutical composition is “stable” if the active agent retains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the entire shelf life at a storage temperature, for example, at a temperature of 2-8 ° C.
  • the active agent retains both physical and chemical stability as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of the study of stability during accelerated and natural storage.
  • excipient is used herein to describe any ingredient other than the compound (s) of this invention.
  • the choice of an inert excipient will largely depend on factors such as the particular route of administration, the effect of the excipient on solubility and stability, and the nature of the dosage form.
  • a “pharmaceutically acceptable excipient” includes, without exception, solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and similar physiologically compatible substances.
  • Some examples of pharmaceutically acceptable excipients are water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerin, ethanol and the like, as well as combinations thereof.
  • isotonic agents for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, or sodium chloride.
  • additional examples of pharmaceutically acceptable substances are wetting agents or a small amount of excipients, such as wetting or emulsifying agents, preservatives or buffers, which increase the shelf life or effectiveness of the antibody.
  • buffering agent is meant a solution capable of maintaining a pH value due to the interaction of acidic and alkaline components included in its composition.
  • pH values of the pharmaceutical composition of 4.5 to 7.0 are preferred.
  • buffers that are known to those skilled in the art and may be found in the literature include, but are not limited to, histidine, citrate, succinate, acetate, phosphate, phosphate buffered saline, citrate phosphate buffers, as well as trometamine-based buffers and the like, or the like suitable mixtures.
  • isotonic agents an auxiliary substance or a mixture of two or more auxiliary substances that provide the isotonic osmotic pressure of the solution.
  • a solution that creates an osmotic pressure of about 250 to 350 mOsm / kg is considered “isotonic”.
  • isotonic agents polyols, mono- and disaccharides, amino acids, metal salts, for example, sodium chloride, and the like, can be used, but not limited to.
  • hyperotonic characterize a composition with an osmotic pressure below the osmotic pressure of human blood. Accordingly, the term “hypertonic” characterizes a composition with an osmotic pressure higher than the osmotic pressure of human blood.
  • surfactant refers to an excipient that can alter the surface tension of a liquid antibody preparation.
  • the surfactant reduces the surface tension of a liquid antibody preparation.
  • a “surfactant” can help improve the colloidal stability or solubility of any antibody in a given preparation.
  • a surfactant can reduce the aggregation of the prepared antibody preparation, and / or minimize the formation of particles in the preparation, and / or reduce adsorption.
  • the surfactant can also improve the stability of the antibody during, including after freezing / thawing and shaking.
  • Surfactants may be ionic or non-ionic.
  • Illustrative non-ionic surfactants that may be included in the compositions of the present invention include, for example, alkyl polyols (ethylene oxide), alkyl polyglucosides (e.g. octyl glucoside and decyl maltoside), fatty alcohols such as cetyl alcohol and oleyl alcohol, cocamide-MEA, cocamide -DEA and Cocamide-TEM.
  • alkyl polyols ethylene oxide
  • alkyl polyglucosides e.g. octyl glucoside and decyl maltoside
  • fatty alcohols such as cetyl alcohol and oleyl alcohol
  • cocamide-MEA cocamide-DEA
  • Cocamide-TEM Cocamide-TEM
  • nonionic surfactants that can be included in the compositions of the present invention include, for example, polysorbates such as Polysorbate 20 (Tween 20), Polysorbate 28, Polysorbate 40, Polysorbate 60, Polysorbate 65, Polysorbate 80 (Tween 80), polysorbate 81 and polysorbate 85; poloxamers, such as poloxamer 188 (Kolliphor P188), poloxamer 407; polyethylene polypropylene glycol or polyethylene glycol (PEG), copolymers of ethylene and propylene glycol (for example, Pluronic PF68, etc.).
  • polysorbates such as Polysorbate 20 (Tween 20), Polysorbate 28, Polysorbate 40, Polysorbate 60, Polysorbate 65, Polysorbate 80 (Tween 80), polysorbate 81 and polysorbate 85
  • poloxamers such as poloxamer 188 (Kolliphor P188), poloxamer 407
  • PEG polyethylene glycol
  • stabilizer is meant an auxiliary substance or a mixture of two or more auxiliary substances that provide the physical and / or chemical stability of the active agent.
  • stabilizers can be used amino acids, for example, arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline, but not limited to; surfactants, for example, polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxamer, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS ), but not limited to them; antioxidants, for example, methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, salts of seric acids, and the like, but not limited to; chelating agents, for example, but not limited to EDTA, DTPA, sodium citrate, and the like.
  • a “pharmaceutically acceptable acid” includes inorganic and organic acids that are non-toxic in the concentration and form in which they are formulated.
  • suitable inorganic acids include hydrochloric, perchloric, hydrobromic, hydroiodic, nitric, sulfuric, sulfonic, sulfanilic, phosphoric, carboxylic and the like.
  • Suitable organic acids include linear or branched alkyl, aromatic, cyclic, cycloaliphatic, acyloaliphatic saturated, unsaturated, mono-, di- and tricarboxylic acids, including, for example, formic, acetic, 2-hydroxyacetic, trifluoroacetic, phenylacetic, trimethylux clear, t-butyl acetic, anthranyl, propane, 2-hydroxypropane, 2-oxopropane, malonic, cyclopentane propionic, 3-phenylpropionic, butane, butanedioic, benzoic, 3- (4-hydroxybenzoyl) benzoic, 2-acetoxybenoy , stearic, muconic, almond, amber, embonic, fumaric, apple, maleic, hydroxymealeic, malonic, milk, lemon, tartaric, glycolic, glyconic, gluconic, pyruvic, glyoxalic, oxalic
  • “Pharmaceutically acceptable bases” include inorganic and organic bases that are non-toxic in the concentration and form in which they are formulated.
  • suitable bases include bases formed by inorganic base metals such as lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium, ammonium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum, N-methylglucamine, morpholine, piperidine, and organic non-toxic bases, including primary, secondary and tertiary amines, substituted amines, cyclic amines and basic ion exchange resins [for example, N (R ') 4+ (where R' independently is H or Cm alkyl, for example ammonium, Tris)], for example, isopropylamine , trimethylamine, diethylamine, tr ethylamine, tripropylamine, ethanolamine, 2-diethylaminoethanol, trimethamine, dicyclohexylamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydr
  • organic non-toxic bases are isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethamine, dicyclohexylamine, choline and caffeine.
  • Additional pharmaceutically acceptable acids and bases useful with the present invention include acids and bases which are derived from amino acids, for example, histidine, glycine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid, lysine and asparagine.
  • a “diluent” of interest is a diluent that is pharmaceutically acceptable (safe and non-toxic for human administration) and suitable for preparing a liquid composition, such as a composition diluted after lyophilization.
  • Typical diluents include water, bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffer solution (e.g. phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution or dextrose solution.
  • BWFI bacteriostatic water for injection
  • pH buffer solution e.g. phosphate buffered saline
  • sterile saline sterile saline
  • Ringer's solution or dextrose solution.
  • diluents may include aqueous solutions of salts and / or buffers.
  • a "preservative” is a compound that can be added to the compositions provided herein to reduce bacterial activity. Adding a preservative may, for example, facilitate the preparation of a composition for repeated use (with a multiple dose).
  • Examples of potential preservatives include octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride (a mixture of alkylbenzyldimethylammonium chlorides in which the alkyl groups are long chain compounds) and benzethonium chloride.
  • preservatives include aromatic alcohols such as phenol, butyl and benzyl alcohol, alkyl parabens such as methyl or propyl paraben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol.
  • aromatic alcohols such as phenol, butyl and benzyl alcohol
  • alkyl parabens such as methyl or propyl paraben
  • catechol resorcinol
  • cyclohexanol 3-pentanol
  • m-cresol m-cresol
  • lyophilized refers to a preparation that has undergone a process known in the art as freeze-drying, which involves freezing the preparation and then removing ice from the frozen contents.
  • amino acid as used herein means an amino acid (free amino acid, ie, not an amino acid in a peptide or in a protein sequence).
  • Amino acids used in the present invention include, but are not limited to, for example, arginine, glycine, lysine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, isoleucine, leucine, alanine, phenylalanine, tryptophan, series, cysteine, methionine and proline.
  • compositions of the present invention and methods for their manufacture will be undeniably apparent to those skilled in the art. Such compositions and methods for their manufacture can be found, for example, in Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Troy, Beringer., Lippincott Williams and Wilkins., Philadelphia, PA 2006.
  • manufacture of pharmaceutical compositions should preferably comply with GMP (Good Manufacturing Practice) requirements.
  • the pharmaceutical composition of this invention can be manufactured, packaged or sold widely, in the form of a single unit dose or many single unit doses.
  • unit dosage unit means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of an active ingredient.
  • the amount of active ingredient is usually equal to the dosage of the active ingredient that will be administered to the subject, or a convenient portion of such a dosage, for example half or a third of such a dosage.
  • Any method of administering peptides, proteins, or antibodies adopted in the art can be suitably used for the PD-L1 antibody of the invention.
  • parenteral administration of a pharmaceutical composition includes any route of administration that is characterized by a physical violation of the integrity of the tissue of the subject and the administration of the pharmaceutical composition through a violation in the tissue, which usually leads to direct entry into the bloodstream, muscle or internal organ.
  • parenteral administration includes, but is not limited to, administering the pharmaceutical composition by injecting the composition by administering the composition through a surgical incision, by applying the composition with a non-surgical wound penetrating the tissue, and the like.
  • parenteral administration includes, but is not limited to, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrathecal, intraventricular, intraurethral, intracranial, intraarticular injection or infusion; and renal dialysis infusion techniques.
  • Intratumoral delivery such as intratumoral injection, may also be beneficial.
  • Regional perfusion is also provided.
  • Preferred embodiments of the invention include intravenous and subcutaneous routes.
  • Dosage forms of pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration usually contain the active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier / excipient, for example, sterile water or a sterile isotonic solution.
  • a pharmaceutically acceptable carrier / excipient for example, sterile water or a sterile isotonic solution.
  • Such dosage forms can be manufactured, packaged or sold in a form suitable for bolus administration or for continuous administration.
  • Injectable dosage forms can be manufactured, packaged, or sold in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers containing a preservative.
  • Dosage forms for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous bases, pastes, and the like.
  • Such dosage forms may also contain one or more additional ingredients, including, but not limited to, suspending, stabilizing, or dispersing agents.
  • the active ingredient is provided in dry form (i.e., powder or granules) for dissolution with a suitable base (e.g., sterile pyrogen-free water) prior to parenteral administration of the reconstituted composition.
  • Parenteral dosage forms also include aqueous solutions that may contain excipients, such as salts, carbohydrates and buffering agents (preferably pH 3 to 9, even more preferably pH 4.5 to 7), but for some uses a more suitable dosage form the form may be a sterile non-aqueous solution or a dry form for use in combination with a suitable base, such as sterile pyrogen-free water.
  • a suitable base such as sterile pyrogen-free water.
  • An example of a form for parenteral administration are solutions or suspensions in sterile aqueous solutions, for example, aqueous solutions of propylene glycol or dextrose. Such dosage forms, if necessary, may be buffered.
  • Other suitable parenteral dosage forms may include those that contain the active ingredient in microcrystalline form or in a liposome preparation. Dosage forms for parenteral administration can be performed for immediate and / or modified release. Modified release dosage forms include delayed, delayed, pulsating, controlled, targeted and programmed release.
  • sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the anti-PD-L1 antibody in the required amount into an appropriate solvent with one or a combination of the ingredients listed above, as necessary, followed by filtration sterilization.
  • dispersions are prepared by incorporating the active compound in a sterile solvent that contains a basic dispersion medium and other necessary ingredients from those listed above.
  • the preparation methods are freeze-drying (lyophilization), which gives the powder of the active ingredient plus any additional desired ingredient from its pre-sterilized filtration solution.
  • the proper fluidity of the solution can be maintained, for example, by the use of coating materials such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants.
  • Prolonged absorption of the injectable compositions can be accomplished by incorporating into the composition an agent that delays absorption, for example, monostearates and gelatin, and / or by modified release coatings (eg, slow release coatings).
  • the PD-L1 antibody of the present invention can also be administered intranasally or inhaled, usually in the form of a dry powder (alone, as a mixture or as particles with mixed components, for example, mixed with a suitable pharmaceutically acceptable excipient) from a dry powder inhaler, such as a pressurized aerosol container, pump, spray, sprayer (preferably a sprayer in which the principle of electrohydrodynamics is used to obtain fine mist) or a nebulizer in which a suitable propellant is used or not, or in the form of nasal drops.
  • a dry powder inhaler such as a pressurized aerosol container, pump, spray, sprayer (preferably a sprayer in which the principle of electrohydrodynamics is used to obtain fine mist) or a nebulizer in which a suitable propellant is used or not, or in the form of nasal drops.
  • a pressurized container, pump, spray, nebulizer or nebulizer typically contains a solution or suspension of a binding molecule of the present invention, including, for example, a suitable substance for dispersing, dissolving or prolonging the release of the active substance, a propellant as a solvent.
  • the drug Prior to use as a dry powder or suspension, the drug is usually micronized to a size suitable for delivery by inhalation (usually less than 5 microns).
  • a size suitable for delivery by inhalation usually less than 5 microns.
  • This can be achieved by any suitable grinding method, such as grinding in a spiral jet mill, grinding in a fluidized bed jet mill, supercritical cleaning of a liquid to form nanoparticles, high pressure homogenization, or spray drying.
  • Capsules, blisters, and cartridges for use in an inhaler or insufflator may be configured to contain a powder mixture of a compound of this invention, a suitable powder base, and an activity modifier.
  • a suitable solution formula for use in a nebulizer that utilizes the electrohydrodynamic principle to produce fine mist may contain a suitable dose of the anti-PD-L1 antibody of the present invention with one press and the volume per press may vary, for example, from 1 ⁇ l to 200 ⁇ l, more preferably from 1 ⁇ l to 100 ⁇ l.
  • Suitable flavoring agents such as menthol and levomenthol, or sweeteners, such as saccharin or sodium saccharin, may be added to the dosage forms of this invention for inhalation / intranasal administration.
  • sweeteners such as saccharin or sodium saccharin
  • Dosage forms for parenteral administration can be performed for immediate and / or modified release.
  • Modified Dosage Forms Releases include delayed, delayed, pulsating, controlled, targeted and programmed release.
  • the dosage unit is set by means of a valve that delivers a metered amount.
  • Units in accordance with this invention are usually set for the introduction of a measured dose or "injection" of a binding molecule according to this invention.
  • the total daily dose will usually be administered as a single dose or more often as divided doses throughout the day.
  • the PD-L1 antibody of the invention can also be formulated for oral administration.
  • Oral administration may include swallowing, so that the compound enters the gastrointestinal tract and / or buccally, lingually or sublingually enters the bloodstream directly from the oral cavity.
  • Dosage forms suitable for oral administration include solid, semi-solid and liquid systems, such as tablets; soft or hard capsules containing multi- or nanoparticles, liquids or powders; lozenges (including those filled with liquid); chewing forms; gels; rapidly soluble dosage forms; films; suppositories; Sprays and buccal / mucoadhesive adhesives.
  • Liquid dosage forms include suspensions, solutions, syrups and elixirs. Such dosage forms can be used as fillers in soft or hard capsules (for example, gelatin or hydroxypropyl methylcellulose) and usually contain a carrier, for example, water, ethanol, polyethylene glycol, propylene glycol, methyl cellulose or a suitable oil and one or more emulsifiers and / or suspending agents . Liquid dosage forms can also be made by reconstituting a solid, for example, from a sachet. Therapeutic Use of the PD-L1 Antibody of the Invention
  • the anti-PD-L1 antibody of this invention is used in the treatment of diseases and disorders that are associated with the activity of PD-L1, for example, a disease or disorder selected from the group: PRGS (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (thrice-negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI Colorectal p AK with high microsatellite instability).
  • PRGS squamous cell carcinoma of the head and neck
  • cervical cancer cancer without primary source
  • glioblastoma esophageal cancer
  • bladder cancer thrice-negative breast cancer
  • CRC colonrectal cancer
  • hepatocellular carcinoma melanoma
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • the subject of treatment or the patient is a mammalian, preferably a human subject.
  • the above subject may be male or female and of any age.
  • a therapeutically effective amount of an antibody or antibody fragment can reduce the number of cancer cells; reduce the initial size of the tumor; inhibit (i.e., to some extent slow down and, preferably, stop) cancer cell infiltration of peripheral organs; inhibit (i.e., to some extent slow down and, preferably, stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and / or alleviate, to some extent, one or more symptoms associated with the disorder.
  • An antibody or antibody fragment can, to some extent, prevent the growth and / or kill existing cancer cells, it can cause a cytostatic and / or cytotoxic effect.
  • in vivo efficacy can be determined, for example, by assessing life expectancy, time to disease progression (TTR), tumor response rate (RR), response duration and / or quality of life.
  • TTR time to disease progression
  • RR tumor response rate
  • response duration duration and / or quality of life.
  • co-administration refer to or include:
  • PD-L1 antibody of this invention may be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as an independent therapy.
  • treatment with an anti-PD-L1 antibody of the invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy).
  • an anti-PD-L1 antibody may be co-administered or formulated with another cancer medication / drug.
  • cytotoxic agent refers to a substance that inhibits or prevents the functioning of cells and / or causes destruction of cells.
  • the term is intended to include radioactive isotopes (e.g., At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 and radioactive isotopes Lu), chemotherapeutic agents and toxins, such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins originating from bacteria, fungi, plants or animals, including fragments and / or variants thereof.
  • radioactive isotopes e.g., At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 and radioactive isotopes Lu
  • chemotherapeutic agents and toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins originating from
  • a “chemotherapeutic agent” is a chemical compound useful in the treatment of a malignant tumor.
  • chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN ®); alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquinone, meturedopa and uredopa; ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylene melamine, triethylene phosphoramide, triethylene thiophosphoramide and trimethyl melamine; acetogenins (in particular, bullatacin and bullatacinon); delta-9- tetrahydrocannabinol (dronabinol, MARIN0L ® ); beta lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; camptothecin (including the synthetic analogue of topote
  • calicheamicin in particular calicheamicin gamma II and calicheamicin omega II (see, for example, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dynamin, including dynemycin A; esperamycin; as well as the neocarcinostatin chromophore and related chromophores of the chromoprotein enediin antibiotics, aclacinomisins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycin, cactinomycin, carabicin, carcinomycin, carzinofinin bichrominocinin, bichromycin-dicinodinomin bichrominocinobinin B-norleucine, doxorubicin (including ADRIAMICIN ® , morfolinodoksorubitsin, tsianomorfolinodoksorubitsin, 2-pyrrolino, doksorubit
  • 5-fluorouracil 5-fluorouracil
  • folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimethrex
  • purine analogs such as fludarabine, b-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine
  • pyrimidine analogs such as ancitabine, azacytidine
  • TAX0L ® a paclitaxel preparation based on engineered albumin-linked nanoparticles (ABRAXANETM) and docetaxel
  • TXOTERE ® chlorambucil; b-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum-based products such as cisplatin, oxaliplatin and carboplatin; vinca alkaloids that prevent the polymerization of tubulin from the resulting microtubules, including vinblastine (VELBAN ® ), vincristine
  • NAVELBINE ® etoposide
  • VP-16 etoposide
  • ifosfamide mitoxantrone; leucovorin; novantron; edatrexate; daunomycin; aminopterin; ibandronate; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine
  • DMF0 retinoids such as retinoic acid, including bexarotene (TARGRETIN ® ); bisphosphonates such as clodronate
  • oligonucleotides in particular oligonucleotides that inhibit gene expression in signaling pathways involved in the proliferation of aberrant cells, such as, for example, PKC alpha, Raf, H-Ras and epidermal growth factor receptor (EGF-R); vaccines such as the THERATOPE ® vaccine and vaccines for gene therapy, for example ALLOVECTIN ® vaccine, LEUVECTIN ® vaccine and VAXID ® vaccine; topoisomerase 1 inhibitor (e.g. LURTOTECAN ® ); rmRH
  • perifosin a COX-2 inhibitor (e.g., celecoxib or etoricoxib), a proteosome inhibitor (e.g., PS341); bortezomib
  • COX-2 inhibitor e.g., celecoxib or etoricoxib
  • proteosome inhibitor e.g., PS341
  • VELCADE ® CCI-779; tipifarnib (811577); orafenib, ABT510; a Bc1-2 inhibitor such as sodium oblimersen (GENASENSE ® ); pixantron; EGFR inhibitors (see definition below); tyrosine kinase inhibitors (see definition below); and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above; and combinations of two or more of the above, such as CHOP, short name for combination therapy with cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone, and FOLFOX, short name for oxaliplatin treatment regimen (ELOXATINTM) in combination with 5-FU and leucovorin.
  • CHOP short name for combination therapy with cyclophosphamide
  • doxorubicin vincristine and prednisone
  • FOLFOX short name for oxaliplatin treatment regimen
  • anti-hormonal drugs that act to regulate or inhibit the action of hormones on tumors, such as antiestrogens with a mixed agonist / antagonist profile, including tamoxifen (NOLVADEX ® ), 4-hydroxytamoxifen, trioxifen, toremifene (FARESTON ® ); idoxifene, droloxifene, raloxifene (EVISTA ® ), trioxifene, keoxifen and selective estrogen receptor modulators
  • SERM such as SERM3
  • pure antiestrogens without agonistic properties such as fulvestrant (FASLODEX ® ) and EM800 (such agents can block the dimerization of estrogen receptors
  • ER inhibit DNA binding, enhance ER metabolism and / or lower ER levels
  • aromatase inhibitors including steroidal aromatase inhibitors such as formestane and exemestane
  • non-steroidal aromatase inhibitors such as anastrazole (ARIMIDEX ® ), letrozole (FEMARA ® ) and aminoglutetimide and other aromatase inhibitors, including Vorozol (RIVIS0R ® ), megestrol acetate (MEGASE ® ), fadrozole, imidazole; agonists rilizing- hormone luteinizing hormone, including leuprolide (LUPRON ® and ELIGARD ®), goserelin, buserelin, and tripterelin; sex steroids including progestins, such as megestrol acetate and medroxyprogesterone acetate, estrogens, such as diethylstilbestrol and premarin and androgens / retinoids, such as fluoxymesterone, fully transretinoic acid and phenretinide; shepriston; antiprogesterones; estrogen receptor lowering regulator
  • therapeutic agents that can be used in combination with the anti-PD-L1 antibodies of the invention can be growth factor function inhibitors, for example, such inhibitors include growth factor antibodies and growth factor receptor antibodies (eg, anti-eBB2 antibody trastuzumab [Herceptin], anti -EGFR panitumumab antibody, anti-erbBl cetuximab antibody [Erbitux, C225] and any antibodies of growth factors or growth factor receptors disclosed by Stern et al. Critical reviews in oncology / haematology, 2005, Vol.
  • growth factor antibodies and growth factor receptor antibodies eg, anti-eBB2 antibody trastuzumab [Herceptin], anti -EGFR panitumumab antibody, anti-erbBl cetuximab antibody [Erbitux, C225] and any antibodies of growth factors or growth factor receptors disclosed by Stern et al. Critical reviews in oncology / haematology, 2005, Vol.
  • anti-angiogenic agents such as the inhibitory effects of vascular endothelial growth factor, [for example, an antibody against vascular endothelial growth factor bevacizumab (Avastin)], antibodies against vascular endothelial growth factor receptors, such as anti-KDR antibodies and anti-fltl antibodies; antisense therapies, for example, aimed at the above targets, such as ISIS 2503, anti-ras antisense agents or G3139 (Genasense), anti-bc12 antisense agents; gene therapy approaches, including, for example, approaches with the replacement of aberrant genes such as aberrant p53 or aberrant BRCA1 or BRCA2, GDEPT (gene-directed enzymatic prodrug therapy) approaches using cytosine deaminase, thymidine kinase or bacterial nitroreductase enzyme, and approaches patient tolerance to chemotherapy or radiation therapy, such as gene therapy for multidrug resistance; immunotherapeutic approaches, including, for example, an antibody against vascular end
  • the PD-L1 antibody of this invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result.
  • the therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the particular condition being treated, the patient’s age, gender and weight, as well as whether the administration of the anti-PD-L1 antibody is an independent treatment or is carried out in combination with one or more additional anti-autoimmune or anti-inflammatory treatments.
  • Drug regimens can be adjusted to provide the optimum desired response. For example, maybe one bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally reduced or increased depending on the severity of the therapeutic situation. Particularly useful is the manufacture of parenteral compositions in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosage.
  • the unit dosage form refers to physically discrete units suitable as unit doses for patients / subjects to be treated; each unit contains a predetermined amount of the active compound, calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the desired pharmaceutical carrier.
  • unit dosage forms of the present invention is generally dictated and depends on (a) the unique characteristics of the chemotherapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved, and (b) the limitations inherent in the compounding technique of such an active compound for treatment of sensitivity in subjects.
  • the dose and dosage regimen are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field.
  • the maximum tolerated dose can be easily set and an effective amount can also be determined that provides a detectable therapeutic effect for the patient, as well as the time requirements for the administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • some dosages and regimen regimens are given as examples herein, these examples do not in any way limit the dosages and regimens that may be necessary for the patient to practice the present invention.
  • dosage values may vary, depending on the type and severity of the condition that follows relieve, and may include one or more doses.
  • specific administration schedules should be adjusted after some time according to individual needs and at the discretion of the medical professional who administers or controls the administration of the compositions, and that the concentration ranges given in this description are only given as an example and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions.
  • the dosage regimen with the compositions of this invention can be based on various factors, including the type of disease, age, weight, gender, health status of the patient, severity of the condition, route of administration, and the specific anti-PD-L1 antibody used.
  • the dosage regimen can vary widely, but can be determined regularly using standard methods.
  • doses may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects, such as toxic effects or laboratory values.
  • pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters which may include clinical effects, such as toxic effects or laboratory values.
  • the present invention covers an individual dose increase, which is determined by a qualified specialist. Determination of the required dose and modes are well known in the relevant field of technology and will be clear to a person skilled in the art after familiarization with the ideas disclosed herein.
  • a suitable dose of the anti-PD-L1 antibody of the invention will be in the range of 0.1-200 mg / kg, preferably 0.1-100 mg / kg, including about 0.5-50 mg / kg, for example , about 1-20 mg / kg.
  • the PD-L1 antibody can be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg / kg, for example at least 0.5 mg / kg, including at least 1 mg / kg, for example at least 1.5 mg / kg, for example, as well as at least 2 mg / kg, for example at least 3 mg / kg, including at least 4 mg / kg, for example at least 5 mg / kg; and for example up to maximum 50 mg / kg, including up to a maximum of 30 mg / kg, for example, up to a maximum of 20 mg / kg, including up to a maximum of 15 mg / kg.
  • the administration will usually be repeated at suitable intervals, for example, once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks, and for as long as it is deemed appropriate by the responsible physician, who may in some cases increase or reduce the dose if necessary.
  • the next variant embodiment of the invention is a product that contains products used to treat cancer, in particular CSW, cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma, cancer of the esophagus, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, cancer kidney, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.
  • the product is a container and a label or leaflet in the package, which are placed on the container or enclosed in it. Suitable containers are, for example, cans, vials, syringes, etc. Containers can be made from various materials, such as glass or plastic.
  • the container contains a composition effective for treating a particular condition and may have a sterile inlet (for example, the container may be an intravenous solution bag or vial equipped with a plug that can be pierced with a hypodermic needle). At least one active ingredient in the composition is an anti-PD-L1 antibody of the invention.
  • the label or package insert indicates that the composition is used to treat a particular condition.
  • the label or package insert must additionally contain instructions for administering the antibody composition to the patient.
  • the package leaflet contains the usual instructions that include in the sale of the package of therapeutic products, including approximate information about the indications, use, dose, route of administration, contraindications and / or precautions regarding the use of such therapeutic products.
  • the package insert indicates that the composition is used to treat cancer, in particular PRGS, cervical cancer, cancer without a primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanomas, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin lymphoma, MSI CRC.
  • the product may further comprise a second container with a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BSVI), phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution.
  • a pharmaceutically acceptable buffer such as bacteriostatic water for injection (BSVI), phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution.
  • BSVI bacteriostatic water for injection
  • phosphate buffered saline such as phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution.
  • it may include other products necessary from a commercial point of view and from a consumer point of view, in particular other buffers, diluents, filters, needles and syringes.
  • kits that can be used for various purposes, for example, for detecting PD-L1 in mammalian tissues, cells or body fluids. Such a kit would be suitable for screening PD-L1-associated diseases.
  • the kit includes a specific binding agent or antibody of the invention and agents indicative of the reaction of the specific binding agent or antibody with PD-L1, if present.
  • the antibody is a monoclonal antibody.
  • the PD-L1 binding antibody is labeled.
  • the antibody is an unlabeled primary antibody, and the kit further comprises means for detecting the primary antibody.
  • the detection means comprises a labeled second antibody, which is an anti-immunoglobulin.
  • kits may be a kit that contains antibodies for the detection and quantification of PD-L1 in vitro, for example when performing ELISA or Western blotting.
  • the kit contains a container and a label or package leaflet located on the surface or inside the container.
  • the container contains a composition that includes at least one PD-L1 antibody of the invention. Additional containers may contain, for example, diluents and buffers, control antibodies.
  • the label or package insert may contain a description of the composition, as well as instructions for their use in vitro or for diagnostic purposes.
  • the PD-L1 antibody of the present invention is also used in diagnostic processes (e.g., in vitro, ex vivo).
  • an anti-PD-L1 antibody can be used to detect or measure PD-L1 levels in samples obtained from a patient (for example, a tissue sample or a sample of body fluid, such as inflammatory exudate, blood, blood serum, intestinal fluid, saliva, or urine) .
  • Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescent analysis, radioimmunoassay and immunohistology.
  • the invention further includes kits (eg, diagnostic kits) containing antibodies to PD-L1 described herein.
  • Antibodies and antigens were produced in cells of a constant cell line derived from Chinese hamster ovary cells (CHO-K1 line) according to published protocols [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91 (6): 670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun; 28 (11): 843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5; 84 (3): 332-342].
  • a recombinant PD-L1 protein containing an EPEA-tag (glutamic acid-proline-glutamic acid-alanine) at the C-terminus of the protein was isolated and purified from the culture fluid using a CaptureSelect C-tag Affinity Matrix sorbent.
  • the culture fluid was passed through a chromatographic column pre-filled with 5 ml of C-tag sorbent, then the column was washed with 25 ml of PBS to wash non-specific binding components.
  • the bound antigen was eluted under mild conditions using 20tM Tris, 2M MDC12 pH7.0-7.4.
  • the protein was transferred to the FSB (pH 7.4) using dialysis using a semipermeable dialysis membrane, filtered (0.22 ⁇ m), transferred to test tubes and stored at - 70 ° C.
  • Recombinant PD-1 and PD-Ll-Fc proteins from the culture fluid were isolated and purified using a Protein A affinity chromatography column.
  • the clarified culture fluid was passed through a 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF column (GE Healthcare) equilibrated with phosphate buffered saline (FSB, pH 7.4). Then the column was washed with 5 column volumes of FSB to wash the non-specific binding components.
  • the bound antigen was eluted using 0.1 M glycine buffer pH 3.
  • the main protein peak of elution was collected and adjusted to neutrality with 1 M Tris buffer (pH 8). All stages were carried out at a flow rate of 110 cm / h.
  • the protein was transferred to PBS (pH 7.4) using dialysis using SnakeSkin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 ⁇ m), transferred to test tubes and stored at -70 ° C.
  • IgGl antibodies were purified on a 1 ml Hi Trap rProteinA FF column (GE Healthcare) according to the procedure described above for antigens. The purity of the resulting protein solution was evaluated using SDS gel electrophoresis (Fig. 4A and 4B).
  • RNA of B lymphocytes from individual blood samples of more than a thousand human donors was isolated using the RNeasy Mini Kit according to the proposed protocol (from QIAGEN). RNA concentration was determined using a Nanovue kit (from GE Healthcare) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis on a 1.5% agarose gel.
  • the reverse transcription reaction was performed using the MMLV RT kit (from Evrogen) according to the recommended protocol using MMuLV reverse transcriptase and random hexamer oligonucleotides as a seed.
  • Reverse transcription products were used as templates in a two-step polymerase chain reaction for for generating variable domain genes flanked by restriction sites using a set of oligonucleotides according to the protocols of the authors [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274 (26): 18218-30].
  • the obtained DNA preparation VL-CK-VH (Fig. 1) was treated with restriction endonucleases NheI / Eco91I and ligated into the original pH5 phagemid (Fig. 2). Ligation products were transformed into electrocompetent cells of strain SS320 prepared according to protocols [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63.].
  • the repertoire of the MeganLibTM combinatorial phage Fab display library was 10 11 transformants. Preparations of phage Fab libraries were prepared according to the procedure described previously [J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581-97].
  • biotinylated PD-Ll-Fc at a concentration of 10 ⁇ g / ml was immobilized on the surface of streptavidin magnetic particles by incubating the protein with particles for 1 hour at room temperature on a rotator. Then the particles were washed with FSB (pH 7.4), then the particles were blocked with a solution of 2% skim milk on FSB (pH 7.4) for 1 hour. Then, a solution of phages in FSB (pH 7.4) with 2% skim milk was added to magnetic particles with bound antigen, the concentration of phage particles was 2.5 ⁇ 10 12 per ml. This mixture was incubated for 40 minutes with stirring.
  • ELISA Fab specifically binding to human PD-L1 ELISA
  • a Fab with the published sequence Atezolizumab (Genentech) was used as a positive control.
  • wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) were coated with 50 ⁇ l of PD-L1-FE (0.2 ⁇ g / ml in 1 x carbonate buffer), sealed, and incubated overnight at 4 ° C. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on Genetix Qpix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan).
  • BB blocking buffer 200 ⁇ l of 0.5% non-skim milk in PBS
  • 50 ⁇ l was added per well of the test cell supernatant containing the test Fab mixed with an equal volume of explosives.
  • the plates were again incubated by shaking for one hour at room temperature, after which each well of the plates was washed three times with FSB-Tween buffer.
  • 50 ⁇ l / well of anti-human Fab HRP-conjugated secondary antibody (from Pierce-ThermoScientific) was added in a ratio of 1: 5000 in PBS-Tween.
  • ELISA also used the analysis of nonspecific binding of the studied Fab fragments with other antigens. The study was carried out as described above, but IL6R-Fc, INFa2b, PCSK9-VG-FE, PD-1-Fc (2.5 ⁇ g / ml in 1 ⁇ carbonate buffer) were used as antigens for immobilization. PD-Ll-Fc (0.2 ⁇ g / ml in 1 x carbonate buffer) was used as a control for specific binding. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on Genetix Qpix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tesap Freedom EVO 200 (from Tesap). Clones in which the color signal of nonspecific binding did not exceed the signal from specific binding was tested in a competitive ELISA to detect antagonistic Fabs that block the interaction of the ligand and receptor.
  • ELISA Competitive ELISA
  • PD-1-Fc was immobilized in wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) at 50 ⁇ l with a concentration of 1 ⁇ g / ml in 1 carbonate buffer and incubated overnight at 4 ° C. All subsequent steps were carried out according to standard IFA protocols using a high-performance automated platform based on Genetix Qpix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan). To block nonspecific binding, BB blocking buffer (200 ⁇ l of 0.5% non-skim milk in PBS) was added. The plates were incubated on a shaker for one hour at room temperature.
  • the cell supernatant containing the tested Fab and PD-Ll-Fc (at a final concentration of 2 ⁇ g / ml in FSB-Tween) was mixed in a 1: 1 ratio, incubated for 45 minutes at room temperature and shaken at 500 rpm min
  • ThermoScienti fic in a ratio of 1: 5000 in FSB-Twin. Incubated for 45 min at room temperature and shaking 500 rpm. / min., after which each well of the tablets was washed three times with FSB-twin buffer, as described above.
  • the colorimetric signal was developed by adding TMB (50 ⁇ l / well) to saturation (average 3-5 min), then further development was stopped by adding a stop solution (30 ⁇ l / well, 10% sulfuric acid).
  • the color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise plate reader (from Tecan). The degree of Fab binding was inversely proportional to the color signal production.
  • Koff screening was performed using a Pall Forte Bio Octet Red 96 instrument.
  • Anti FABCHl biosensors were rehydrated for 30 minutes in working buffer containing 10 mM FSB, pH 7.2– 7.4, 0.1% Tween-20, 0.1% BSA.
  • working buffer was added to a final concentration of 1 *.
  • anti-FABCHl biosensors were immersed in E. coli supernatants containing Fab fragments of antibody candidates for 12 hours at 4 ° C. Sensors with fragments immobilized on the Fab surface were transferred to wells with a working buffer, where a baseline (60 s) was prescribed.
  • the sensors were then transferred to wells with analyte solution (PD-L1, 30 ⁇ g / ml) for association of the antigen-antibody complex (300 sec.). Then the sensors were returned to the wells containing the working buffer for the subsequent stage of dissociation (600 s.). After each experiment, the sensors used were regenerated by placing them in the regeneration buffer three times (Gly-HCl, pH 1.7) and then used in the next experiment. The analysis of the obtained curves was carried out using Octet Data Analysis software (version 7.0) according to the standard procedure for the 1: 1 interaction model.
  • ELISA was used to measure the comparative affinity of antibodies to PD-L1 and other antigens.
  • wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) were coated with 50 ⁇ l of PD-Ll-Fc, fPCSK9-EPEA, Ang2-H6F, GM-CSF- FE, CD3-ED-Fc, IL17a, CD38-Fc, IL6R-Fc (1 ⁇ g / ml in 1 x carbonate buffer) were sealed and incubated overnight at 4 ° C. All subsequent steps were performed according to the standard ELISA protocol. To block nonspecific binding, an explosive buffer (200 ⁇ l of 0.5% nonfat milk in PBS) was added.
  • test antibody BCD-135 was added at a concentration of 5 ⁇ g / ml in FSB-Tween.
  • the plates were again incubated by shaking for one hour at room temperature, after which each well of the plates was washed three times with FSB-Tween buffer.
  • 50 ⁇ l / well of anti-human Fab HRP-conjugated secondary antibody was added in a ratio of 1: 5000 in PBS-Tween.
  • the plates were shaken on a rotary shaker (50 min, room temperature) and washed three times with FSB-Twin buffer as described above.
  • the colorimetric signal was developed by adding TMB (50 ⁇ l / well) to saturation (average 3-5 min), then further development was stopped by adding a stop solution (30 ⁇ l / well, 10% sulfuric acid).
  • the color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise plate reader (from Tesap).
  • the degree of antibody binding was proportional to the production of a color signal (FIG. 5).
  • the anti-PD-L1 antibody specifically binds to PD-L1 and does not bind to other antigens tested.
  • the human T-cell lineage Jurkat was engineered by introducing two genetic constructs into its genome. One construct encoded the human PD-1 receptor gene. The second construct encoded a luciferase gene controlled by an NFAT-sensitive genetic element. The result was a Jurkat-NFAT-PD-1 reporter cell line that expressed the PD-1 receptor on the surface membrane and contained NFAT-dependent a promoter that directs transcription of the luciferase gene. The synthesis of the luciferase enzyme in the cells of this line is proportional to the level of NFAT activity, which, in turn, reflected the overall level of T-lymphocyte activation.
  • MDA-MB-231 cells were activated for production of PD-L1 with interferon gamma solution, for this 72 hours before analysis, interferon gamma was added to the cell suspension to a concentration of 20 ng / ml, then the cells were seeded in 9b-well culture plates at the rate of 10,000 cells / well.
  • growth medium was removed from the MDA-MB-231 cell plates and dilutions of the analyzed antibodies, control antibody and isotypic control in cell growth medium from 10 ⁇ g / ml to 0.001 ⁇ g / ml were added to them, incubated for 30 minutes at room temperature.
  • a suspension of Jurkat-NFAT-PD-1 cells and a solution of activating antibodies aCD3 / aCD28 / a-mouseIgG were added to each well. Put the tablet in a COg incubator for 6 hours.
  • Biotinylated receptors were immobilized on the surface of the sensors. Then, the association stage was carried out: sensors with bound antigen were immersed in antibody solutions with different concentrations (a series of dilutions of the antibody was prepared in advance in a working buffer and placed in the corresponding wells of a 96-well plate). After this, a dissociation step was carried out: the sensors from the antibody solution were transferred to wells with a working buffer.
  • pH7.4 phosphate buffer was used, and pH6.0 phosphate buffer was used for FcRn.
  • ELISA ELISA
  • the affinity constants of binding of the antibody to human PD-L1 and cynomolgus were measured using an OctetRed 96 instrument (from ForteBio).
  • Antibody BCD-135 at a concentration of 30 ⁇ g / ml was non-specifically immobilized on the surface of second-generation amino-reactive sensors (ForteBio, AR2G) according to the standard protocol according to the manufacturer's instructions for the preparation and immobilization of AR2G sensors.
  • the analysis was carried out at 30 ° C. using PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as the working buffer.
  • the binding of human and monkey PD-L1 solutions to a sensor-bound antibody was analyzed in a working buffer with antigen concentration from 10 ⁇ g / ml to 1 ⁇ g / ml.
  • the binding curves with the deduction of the base signal were analyzed using the Octet Data Analysis software (version 8.2) according to the standard procedure using a 1: 1 interaction model.
  • the anti-PD-Ll antibody specifically and affinity binds to the human PD-L1 antigen and the cynomolgus monkey (Fig. 9) with constants ⁇ 1.0E-12 and 5.55E-10 1 ⁇ M, respectively.
  • the conformational stability of BCD-135 was evaluated by the point of protein aggregation by dynamic light scattering (DLS).
  • the aggregation point of the studied proteins (1 mg / ml) was determined on a Zetasizer Nano ZSP instrument. For this, 0.5 ml of the solution was placed in a quartz dedusted cuvette, which was gradually heated from 50 ° C to 90 ° C in a setup with constant measurement of the intensity of the scattered light.
  • the BCD-135 antibody showed high conformational stability in 20 mM acetate buffer, melting point greater than 80 ° C (Fig. 10).
  • colloidal stability of the candidates was evaluated by PEG protein aggregation.
  • samples with a protein concentration of 5 mg / ml were used.
  • the BCD-135 antibody showed high colloidal stability (FIG. 11).
  • the thermal stability of the antibody was evaluated by thermostress method at 50 ° C for 48 h in three different buffers: 20 mM phosphate buffer at pH 6.0 (Fig. 12A), 20 mM acetate buffer at pH 5.0 (Fig. 12B) and 20 mM histidine buffer pH 5.5 (FIG. 12B). Homogeneity was monitored by HPLC HPLC (SEC HPLC).
  • the studied samples at a protein concentration of ⁇ 5 mg / ml were divided into 2 parts and placed in separate tubes: 1 tube for each composition was stored in a refrigerator at 4 ° C, the rest were placed in a thermostat and incubated at 50 ° C for 72 hours . After warming up, the tubes were removed from the thermostat and transferred for analysis (in Figures 12A, 12B and 12B, the control stored at +4 is marked in red, and the sample after the stress is marked in blue).
  • Anti-PD-Ll antibody showed high thermal stability in all three buffers (the difference between the content of aggregates in solution before and after stress stress was not more than 5%):
  • BCD-135 The stability of BCD-135 in normal human serum for 7 days at 37 ° C was also evaluated.
  • recombinant PDL1 100 ⁇ l, 2.5 ⁇ g / ml in 1 x carbonate buffer
  • PDL1 100 ⁇ l, 2.5 ⁇ g / ml in 1 x carbonate buffer
  • the plates were incubated at 37 ° C for 30 minutes, after which they were washed 2 times with a solution of TBST.
  • the plates were incubated for 30 min at a temperature of 37 ° C, then the plates were washed 3 times with a solution of TBST. After that, 100 ⁇ l of a solution of a conjugate of goat polyclonal antibodies to the Fc fragment of human IgG with horseradish peroxidase was added to each well. The plates were incubated for 30 minutes at 37 ° C. Next, the tablets were washed 4-5 times with a solution of TBST. 100 ⁇ l of TMB solution was added to the washed and dried wells for color development. The tablets were placed in a dark place and incubated at a temperature of 22 ° C for 20 to 25 minutes to develop color. The reaction was stopped by adding to the wells 50 ⁇ l of a stop solution of 0.9 M sulfuric acid. The optical density of the solution in the wells was measured on a microplate spectrophotometer at a wavelength of 450 nm.
  • a calibration curve was constructed (Fig. 13A), reflecting the dependence of the optical density on the concentration of BCD-135 added to the well.
  • Fig. 13A a calibration curve was constructed (Fig. 13A), reflecting the dependence of the optical density on the concentration of BCD-135 added to the well.
  • BCD-135 library of mutant antibodies specific for PD-L Construction of a BCD-135 library of mutant antibodies specific for PD-L1.
  • a structural analysis was performed based on 3D modeling using the BIOCAD YLab software package and PD-L1 model (PDB 4ZQK, PDB 4Z18) (see also Example 18).
  • BCD-135 gene libraries were synthesized with partially degenerate codons (FUH G ET AL.), Improving antibody binding affinity and specificity for therapeutic development, Methods Mol Biol., 2009, 525, 353-376) at positions in the first and third CDR regions of the variable domain of the heavy chain of SEQ ID NO: 4 and the third CDR of the variable domain of the light chain of SEQ ID NO: 8.
  • ELISA was used to measure the binding of the studied mutant Fab antibodies to human PD-L1, as described in Example 4. The number of tested clones producing BCD-135 mutant Fab antibodies amounted to 400 pieces. As positive control used a wild version of the BCD-135 Fab antibody with the sequence of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8.
  • Koff screening was performed using a Pall Forte Bio Octet Red 96 instrument, similar to that described in Example 7.
  • Anti-FABCHl biosensors were rehydrated for 30 minutes in a working buffer containing 10 mM FSB, pH 7.2-7.4, 0.1% Tween-20, 0 , 1% BSA.
  • a working buffer was added to a final concentration of 1 ⁇ .
  • anti-FABCHl biosensors were immersed in E. coli supernatants containing Fab fragments of antibody candidates for 12 hours at 4 ° C. Sensors with Fab fragments immobilized on the surface were transferred to wells with a working buffer, where a baseline (60 s) was prescribed.
  • the sensors were then transferred to wells with analyte solution (PD-L1, 30 ⁇ g / ml) for association of the antigen-antibody complex (300 sec.). Then the sensors were returned to the wells containing the working buffer for the subsequent stage of dissociation (600 s.). After each experiment, the sensors used were regenerated by placing them in the regeneration buffer three times (Gly-HCl, pH 1.7) and then used in the next experiment. Analysis the obtained curves were performed using Octet Data Analysis software (version 7.0) according to the standard procedure for the 1: 1 interaction model.
  • mutant Fab antibodies were obtained, which showed comparable characteristics with the wild variant BCD-135 Fab, and thus tolerance of up to 8% of substitutions across three CDR variable domains.
  • a stable BCD-135 monoclonal antibody producer cell line was obtained by electroporation using the Neon Transfection System (Life Technologies) instrument of the parent suspension CH0-S cell line with vector constructs containing the light and heavy chains of the antibody in an optimized ratio.
  • Clonal lines with a high level of productivity were obtained using the ClonePix robotic platform (Molecular Devices) and preliminary stages of mini-pool selection using antibiotics in different cultivation formats.
  • Productivity analysis was performed using the Octet RED96 analytical system (Pall Life Sciences). DOE for the selection of the basal medium and cultivation schemes was carried out on the basis of the automated system Biomek FX robotics (Beckman Coulter).
  • the clarification of the culture fluid was carried out on a depth filter Millistak C0HC (Merck-Millipore).
  • the primary purification of antibodies from clarified QOL was carried out on an affinity sorbent with protein A. Specific elution of the target protein was carried out under acidic conditions, pH3-3-3.8 in glycine buffer. The resulting eluate was kept at an acidic pH for 30-60 minutes for viral inactivation, and then neutralized with a 1M Tris-OH solution to a pH of 6.5-7.0.
  • Final breakthrough chromatographic purification was performed on a CaptoAdhere sorbent (GE Healthcare LifeSciences) to remove residual DNA, producer cell proteins, cleaved affinity sorbent ligand, aggregates and antibody fragments.
  • a protein solution was passed through a prepared sorbent, in pH 6.5-7.0, with a low conductivity value ( ⁇ 3MC / cm 2 ).
  • the purified protein was subjected antiviral filtration using the Viresolve PRO filter kit (Millipore), concentration and diafiltration against the final buffer containing acetate buffer (pH 5, 0-5.5) and trehalose.
  • the concentration of the obtained protein was 50 mg / ml or more.
  • the middle column shows the amino acid residues of the BCD-135 antibody forming an interaction with human PD-L1.
  • the right column shows the corresponding amino acid residues of the PD-L1 antigen interacting with the BCD-135 antibody.

Abstract

Реферат Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и предлагает антитела, которые специфично связываются с PD-L1. Изобретение также относится к ДНК, кодирующей указанные антитела, соответствующим экспрессионным векторам и способам продукции, а также к способам лечения с использованием указанных антител.

Description

МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К PD-L1
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается с PD-L1 (CD274, В7-Н1, лиганд 1 рецептора программируемой гибели клеток) . Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для усиления функции Т-клеток для повышающей регуляции клеточно-опосредованных иммунных реакций и для лечения связанных с дисфункцией Т-клеток нарушений, например, иммунитета опухоли и для лечения рака.
Уровень техники
Развитие и активация лимфоцитов
Двумя основными типами лимфоцитов у человека являются Т-тип (тимоциты) и В-тип (костномозговые) . Эти клетки образуются из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге и эмбриональной печени, которые запрограммированы на лимфоидный путь развития. Потомство этих стволовых клеток различными путями созревает до В- или Т-лимфоцитов . Развитие В-лимфоцитов человека происходит исключительно в костном мозге. Т-клетки, с другой стороны, развиваются из незрелых предшественников, которые покидают костный мозг и перемещаются через кровоток в тимус, где они размножаются и дифференцируются в зрелые Т-лимфоциты.
Зрелые лимфоциты, источником которых является тимус или костный мозг, пребывают в неактивном или "покоящемся" состоянии, т. е., они являются митотически неактивными. Когда они рассредоточиваются в кровотоке, эти "необученные" или "наивные" лимфоциты перемещаются в различные вторичные или периферические лимфоидные органы, такие, как селезенка, лимфатические узлы или миндалины. Для большинства наивных лимфоцитов характерна короткая продолжительность жизни, и они погибают за несколько дней после того, как покидают костный мозг или тимус. Однако если такая клетка получает сигналы, указывающие на присутствие антигена, она может активироваться и претерпевать последовательные циклы деления клеток. Некоторые клетки из полученного в результате потомства затем возвращаются в покоящееся состояние и становятся лимфоцитами памяти - В- и Т- клетками, которые по сути обучены для следующей встречи со стимулирующим аллергеном. Другим потомством активированных наивных лимфоцитов являются эффекторные клетки, живущие лишь несколько дней, но выполняющие определенные виды защитной активности .
Активация лимфоцитов представляет собой упорядоченную последовательность событий, которую проходит покоящийся лимфоцит после стимуляции к делению и производству потомства, из которого некоторые клетки становятся эффекторными клетками. Полный ответ включает как индукцию пролиферации клеток (митогенез) , так и проявление иммунологических функций. Лимфоциты активируются, когда специфические лиганды связываются с рецепторами на их поверхностях. Лиганды отличаются от Т-клеток и В-клеток, однако конечные внутриклеточные физиологические механизмы сходны.
Сами же некоторые инородные антигены могут вызывать активацию лимфоцитов, в частности, большие полимерные антигены, сшивающие поверхностные иммуноглобулины на В-клетках или другие гликопротеины на Т-клетках. Однако большинство антигенов не являются полимерными, и даже прямое связывание с В- клетками в больших количествах не обеспечивает активации. Эти более распространенные антигены активируют В-клетки, когда они стимулируются совместно с активированными поблизости хелперными Т-лимфоцитами . Такая стимуляция может происходить от лимфокинов, секретируемых Т-клеткой, однако наиболее эффективно она передается путем прямого контакта В-клетки с поверхностными белками Т-клеток, взаимодействующими с определенными поверхностными рецепторами В-клеток для создания вторичного сигнала . Т-клетки
Т-лимфоциты не экспрессируют иммуноглобулины, однако обнаруживают присутствие инородных веществ при помощи поверхностных белков, называемых рецепторами Т-клеток (TCR) . Эти рецепторы распознают антигены либо через прямой контакт, либо воздействуя на активность других иммунных клеток. Вместе с макрофагами Т-клетки являются основным типом клеток, вовлеченных в клеточно-опосредованный иммунитет.
В отличие от В-клеток, Т-клетки могут обнаруживать инородные вещества только в конкретных условиях. В частности, Т- лимфоциты распознают инородный белок, только если он расщепляется на малые пептиды, которые затем выявляются на поверхности второй клетки-хозяина, называемой антигенпрезентирующей клеткой (АРС) . Многие типы клеток-хозяев могут представлять антигены в некоторых условиях, однако определенные типы более специфично адаптированы для этой и являются особенно важными для регулирования активности Т-клеток, включая макрофаги и другие В-клетки. Представление антигена частично зависит от определенных белков, называемых белками главного комплекса гистосовместимости (МНС) , на поверхности представляющих клеток. Таким образом, для стимуляции клеточно- опосредованного иммунитета инородные пептиды должны быть представлены Т-клеткам в комбинации с пептидами МНС, и эта комбинация должна распознаваться рецептором Т-клеток.
Существует две значительных субпопуляции Т-клеток: цитотоксичные Т- лимфоциты (Тц-клетки или CTL) и хелперные Т- клетки (Тх) , которые ориентировочно идентифицируются по экспрессии на клеточной поверхности маркера CD8 и CD4. Тц-клетки важны для защиты от вирусов и способны уничтожать вирусы непосредственно путем распознавания некоторых экспрессируемых на поверхности клеток вирусных пептидов. Тх-клетки способствуют пролиферации, созреванию и иммунологической функции других типов клеток, например, секреции лимфокинов для регулирования активности В-клеток, макрофагов и цитотоксичных Т-клеток. И наивные Т-лимфоциты, и Т-лимфоциты памяти обычно остаются в покоящемся состоянии, и в этом состоянии они не демонстрируют значительной хелперной или цитотоксичной активности. В активированном состоянии эти клетки претерпевают несколько циклов митотического деления для образования дочерних клеток. Некоторые из этих дочерних клеток возвращаются в покоящееся состояние как клетки памяти, а другие становятся эффекторными клетками, активно проявляющими хелперную или цитотоксичную активность. Эти дочерние клетки подобны их родительским клеткам: CD4+ клетки могут образовывать только CD4+ потомство, a CD8+ клетки дают только CD8+ потомство. Эффекторные Т-клетки экспрессируют маркеры поверхности клеток, которые не экспрессируются на покоящихся Т-клетках, таких, как CD25, CD28, CD29, CD40L, рецепторы трансферрина и белки МНС II класса. При устранении активирующих стимулов цитотоксичная или хелперная активность постепенно снижается в течение нескольких дней, поскольку эффекторные клетки либо отмирают, либо возвращаются в покоящееся состояние.
Подобно активации В-клеток, реакция Т-лимфоцитов на большинство антигенов также требует двух типов одновременных стимулов. Первым является антиген, который, будучи соответствующим образом экспонированным белками МНС на антигенпрезентирующей клетке, может распознаваться и связываться рецепторами Т- клеток. Поскольку этот комплекс антиген-МНС не посылает сигнал внутрь клетки, он обычно бывает недостаточным для того, чтобы привести к активации Т-клетки. Полная активация, такая, как та, что происходит с хелперными Т-клетками, требует костимуляции другими специфическими лигандами, называемыми костимуляторами, которые экспрессируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки. С другой стороны, активация цитотоксичной Т-клетки обычно требует IL-2 - цитокина, секретируемого активированными хелперными Т-клетками.
Путь PD-1
Важные отрицательный костимулирующий сигнал, регулирующий активацию Т-клеток, обеспечивается рецептором запрограммированной гибели- 1 (PD-1, CD279) и его партнерами по связыванию с лигандом PD-L1 (В7-Н1, CD274) и PD-L2 (B7-DC, CD273) . Отрицательная регулирующая роль PD-1 была обнаружена при помощи нокаутов PD-1 (Pdcdl _/~) , которые склонны к ау оиммуннос и . (Nishimura et al, Immunity JJ: 141 - 51 (1999); Nishimura et al, Science 291: 319 - 22 (2001)). PD-1 связан с CD28 и CTLA-4, но в нем отсутствует ближний к мембране цистеин, обеспечивающий возможность гомодимеризации . Цитоплазматический домен PD-1 содержит иммунорецепторный тирозинсвязывающий ингибирующий мотив (ITIM, V/IxYxxL/V) . PD-1 связывается только с PD-L1 и PD-L2 (Freeman et al, J. Exp. Med. 192: 1 - 9 (2000); Dong et al, Nature Med. 5: 1365 - 1369 (1999); Latchman et al, Nature Immunol 2: 261 - 268 (2001); Tseng et al, J. Exp. Med. 193 : 839 - 846 (2001) ) .
PD-1 может экспрессироваться на Т-клетках, В-клетках, природных киллерных Т-клетках, активированных моноцитах и дендритных клетках (DC) . PD-1 экспрессируется активированными, не нестимулированными человеческими Т- клетками CD4+ и CD8+, В- клетками и миелоидными клетками. В этом состоит отличие от более ограниченной экспрессии CD28 и CTLA-4 (Nishimura et al, Int. Immunol. 8: 773 - 80 (1996); Boettler et al, J. Virol. 80: 3532 - 40 (2006) ) . Существует как минимум 4 варианта PD-1, которые были клонированы из активированных человеческих Т-клеток, включая транскрипты, в которых отсутствуют (i) экзон 2, (ii) экзон 3, (iii) экзоны 2 и 3 или (iv) экзоны с 2 по 4 (Nielsen et al, Cell. Immunol. 235: 109 - 16 (2005)) . За исключением PD- 1ДехЗ, все варианты экспрессируются в такой же мере, как и PD-1 полной длины в покоящихся мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) . Экспрессия всех вариантов в значительной мере индуцируется после активации человеческих Т-клеток антителами против CD3 и против CD28. В вариантах PD-lAex3 отсутствует трансмембранный домен, и они подобны растворимому CTLA-4, играющему важную роль в аутоиммунности (Ueda et al, Nature 423: 506 - 11 (2003)) . Этим вариантом богата синовиальная жидкость и сыворотка пациентов с ревматоидным артритом (Wan et al, J. Immunol. 177: 8844 - 50 (2006)) . Два лиганда PD-1 отличаются по характеру экспрессии. PD-L1 конститутивно экспрессируется на мышиных Т- и В-клетках, CD, макрофагах, мезенхимальных стволовых клетках и мастоцитах костного мозга (Yamazaki et al, J. Immunol. 169: 5538 - 45 (2002) ) . PD-L1 экспрессируется на многих различных негемопоэтических клетках (например, клетках роговицы, легких, сосудистого эпителия, непаренхиматозных клетках печени, мезенхимальных стволовых клетках, панкреатических островках, плацентарных синцитиотрофобластах, кератиноцитах и т. п.) [Keir et al, Annu . Rev. Immunol. 26: 677 - 704 (2008)] и подвергается повышенной регуляции на многих типах клеток после активации. Интерфероны IFN как типа I, так и типа II вызывают повышение PD- Ll (Eppihimer et al, Microcirculation 9: 133 - 45 (2002)); Schreiner et al, J. Neuroimmunol 155: 172 - 82 (2004) . Экспрессия PD-L1 в линиях клеток снижается при ингибировании MyD88, TRAF6 и МЕК (Liu et al, Blood НО: 296 - 304 (2007)). JAK2 также участвует в 30 индукции PD-L1 (Lee et al, FEBS Lett, 580: 755 - 62 (2006); Liu et al, Blood HO: 296 - 304 (2007)). Потеря или ингибирование гомолога фосфатазы и тензина (PTEN) , клеточной фосфатазы, которая модифицирует фосфатидилинозитол-3-киназу
(PI3K) и сигнал Akt, повышала посттранскрипционную экспрессию PD-L1 при раке (Parsa et al, Nat. Med. 13: 84 - 88 (2007)).
Экспрессия PD-L2 более ограничена по сравнению с PD-L1. PD- L2 индуцибельно экспрессируется на DC, макрофагах и мастоцитах костного мозга. PD-L2 также экспрессируется приблизительно на половине, а то и двух третях покоящихся брюшинных В1-клетках, но не на традиционных В2 В-клетках (Zhong et al, Eur. J. Immunol. 37: 2405 - 10 (2007) ) . PD-L2+ Bl клетки связывают фосфатидилхолин и могут быть важны для природного иммунного ответа на бактериальные антигены. Индукция PD-L2 со стороны IFN-γ частично зависит от NF -KB (Liang et al, Eur. J. Immunol. 33_: 2706 - 16
(2003)) . PD-L2 также может индуцироваться на моноцитах и макрофагах GM-CF, IL-4 и IFN-γ (Yamazaki et al . , J. Immunol. 169: 5538 - 45 (2002); Loke et al, PNAS 100: 5336-41 (2003)).
Сигнал PD-1, как правило, больше влияет на выработку цитокина, чем на пролиферацию клеток, со значительным влиянием на выработку IFN-γ, TNF-a и IL-2. Опосредованный PD-1 ингибиторный сигнал также зависит от силы сигнала TCR, причем большее ингибирование обеспечивается при более низких уровнях стимуляции TCR. Это снижение может быть преодолено путем костимуляции через CD28 [Freeman et al, J. Exp. Med. 192: 1027
- 34 (2000)] или присутствие IL-2 [Carter et al, Eur. J. Immunol. 32 : 634 - 43 (2002) ] .
Появляется все больше свидетельств того, что сигнал через PD-L1 и PD-L2 может быть двунаправленным. То есть, помимо модификации сигнала TCR или BCR, сигнал также может доставляться обратно к клеткам, экспрессирующим PD-L1 и PD-L2. Хотя обработка дендритных клеток природным человеческим антителом против PD- L2, выделенным из организма пациента с макроглобулинемией Вальденстрема, не обнаружила повышающей регуляции МНС II или костимулирующих молекул В7, такие клетки вырабатывали большее количество провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a и IL- 6, и стимулировали пролиферацию Т-клеток (Nguyen et al, J. Exp. Med. 196: 1393 - 98 (2002) ) . Лечение мышей этим антителом также (1) повышало сопротивление пересаженной меланоме Ыб и быстро индуцировало опухолеспецифические CTL (Radhakrishnan et al, J. Immunol. 170: 1830 - 38 (2003); Radhakrishnan et al, Cancer Res. 64: 4965 - 72 (2004); Heckman et al, Eur. J. Immunol. 37: 1827
- 35 (2007)); (2) блокировало развитие воспалительной болезни дыхательных путей в мышиной модели аллергической астмы
(Radhakrishnan et al, J. Immunol. 173: 1360 - 65 (2004); Radhakrishnan et al, J. Allergy Clin. Immunol. UJy. 668 - 74
(2005) ) .
Еще одно свидетельство обратного сигнала в дендритные клетки ("DC") было получено по результатам исследований костномозговых DC, культивированных с растворимым PD-1 (домен PD-1 ЕС, слитый с константной областью Ig - "s-PD-1") (Kuipers et al, Eur. J. Immunol. 36: 2472 - 82 (2006)) . Этот sPD-1 ингибировал активацию DC и повышал выработку IL-10 обратимым способом благодаря введению антитела против PD-1. Кроме того, некоторые исследования выявили рецептор для PD-L1 или PD-L2, независимый от PD-1. В7.1 уже был определен как партнер по связыванию для PD-L1 (Butte et al, Immunity 27: 111 - 22 (2007) ) . Исследования химического сшивания показывают, что PD-L1 и В7.1 могут взаимодействовать через их IgV-подобные домены. Взаимодействие В7.1 :PD-L1 может вызывать ингибиторный сигнал в T- клетки. Сшивание PD-L1 на CD4+ Т-клетках при помощи В7.1 или сшивание В7.1 на CD4+ Т-клетках при помощи PD-L1 обеспечивает ингибиторный сигнал. Т-клетки с отсутствующими CD28 и CTLA-4 демонстрируют сниженную пролиферацию и выработку цитокинов при тимулировании шариками, покрытыми антителом против CD3 плюс В7.1. В Т-клетках с отсутствием всех рецепторов для В7.1 (т. е., CD28, CTLA-4 и PD-L1) ингибирование пролиферации Т-клеток и выработки цитокинов шариками, покрытыми антителом против CD3 плюс В7.1, прекращалось. Это указывает на то, что В7.1 специфично действует через PD-L1 на Т-клетку в отсутствие CD28 и CTLA-4. Подобным образом Т-клетки с отсутствующим PD-1 демонстрировали сниженную пролиферацию и выработку цитокинов при стимулировании в присутствии шариков, покрытых антителом против CD3 плюс PD- L1, демонстрируя ингибирующее воздействие сшивания PD-L1 на В7.1 на Т-клетки. При отсутствии в Т-клетках всех известных рецепторов для PD-L1 (т. е., при отсутствии PD-1 и В7.1) ослабление пролиферации Т-клеток шариками, покрытыми антителом против CD3 плюс PD-L1, прекращается. Таким образом, PD-L1 может оказывать ингибиторное воздействие на Т- клетки через В7.1 или PD-1.
Прямое взаимодействие между В7.1 и PD-L1 указывает на то, что нынешнее понимание костимуляции является неполным и подчеркивает значение для экспрессии этих молекул на Т-клетках. Исследования PD-L1 Т-клеток показывают, что PD-L1 на Т- клетках может снижать выработку цитокинов Т-клеткой. (Latchman et al, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691 - 96 (2004)). Поскольку и PD-L1, и B7.1 экспрессируются на Т-клетках, В- клетках, DC и макрофагах, существует потенциал для направленного взаимодействия между В7.1 и PD-L1 на этих типах клеток. Кроме того, PD-L1 на негемопоэтических клетках может взаимодействовать с В7.1, а также PD-1 на Т- клетках, что вызывает вопрос: участвует ли PD-L1 в их регуляции. Одним из возможных объяснений ингибиторного влияния взаимодействия В7.1 : PD-L1 является то, что PD-L1 Т-клеток может улавливать или изолировать АРС В7.1 от взаимодействия с CD28. В результате антагонизм сигнала через PD-L1, включающий блокирование взаимодействия PD-L1 с PD-1, В7.1, или и с тем, и с другим, таким образом, не давая PD-L1 отправить отрицательный костимулирующий сигнал на Т-клетки и другие антиген- представляющие клетки, возможно, повышает иммунитет в ответ на инфекцию (например, острую или хроническую) и иммунитет опухоли. Кроме того, антитела против PD-L1 согласно настоящему изобретению могут комбинироваться с антагонистами других компонентов сигнала PD-1: PD-L1, например, антагониста антител против PD-1 и против PD-L2.
В частности, ингибирование сигнала PD-L1 было предложено в качестве средства повышения иммунитета Т-клетки для лечения рака (например, иммунитета опухоли) и к инфекциям, включая как острые, так и хронические (например, устойчивые) инфекции.
Ингибиторы, блокирующие взаимодействие PD-L1 : PD-1, известны, помимо прочих источников, из документов W02001014557, W02002086083, W0200 005874 , W02010036959, W02010077634 и WO2011066389.
В настоящее время на ранних стадиях клинических исследований находятся более 10 моно- и биспецифических препаратов с анти-PD-Ll компонентом.
Одно моноспецифическое анти-PD-Ll антитело, MPDL3280A (atezolizumab, Roche), успешно прошло клинические испытания (КИ) и применяется в клинической практике. Атезолизумаб одобрен FDA к применению у пациентов с метастатическим уротелиальным раком, продолжаются КИ III фазы у пациентов с немелкоклеточный рак легких (НМРЛ) , почечно-клеточным раком, колоректальный рак (КРР) , раком молочной железы (РМЖ) . Препарат представляет собой Igl антитело с модифицированным Fc-регионом (с целью элиминации ADCC - эффекта) . Атезолизумаб описан в документе WO2010077634.
Другими анти-PD-Ll препаратами, находящимися на заключительной фазе КИ, являются препараты avelumab (Pfizer) и durvalumab ( Z) . Дурвалумабом (Durvalumab, MEDI-4736) описан в документе WO2011066389. Авелумаб (Avelumab) описан в документе WO2013079174. Основным отличием препарата авелумаб является наличие у антитела ADCC-эффекта, более того, его можно усиливать с помощью IFNg или IL12 (NCT01772004 ) . При этом профиль безопасности препарата авелумаб соответствует таковому других анти-PD-l/PD-Ll препаратов (Cancer Immunol Res; 3(10) October 2015; Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Activity of a Novel Anti-PD-Ll Antibody Avelumab on Human Tumor Cells; Benjamin Boyerinas) .
Таким образом, существует необходимость в создание эффективного ингибитора PD-L1 (лиганда 1 рецептора программируемой гибели клеток)
В связи с вышесказанным, актуальным является создание новых антител, которые эффективно связываются с PD-L1.
Антитело BCD-135 селективно связывается с PD-L1 и является эффективным ингибитором лиганда 1 рецептора программируемой гибели клеток.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, в частности антителам, направленным для связывания с PD-L1. Такие антитела могут быть использованы для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфично связывается с PD-L1, включающее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности, представленные последовательностями SEQ ID NO: 1-3.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 5-7.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности, представленные последовательностями SEQ ID NO: 5-7.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 5-7.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5-7.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах моноклональное антитело, специфичное к PD-L1, представляет собой полноразмерное антитело IgG.
В некоторых вариантах полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 человека.
В некоторых вариантах моноклональное антитело относится к изотипу IgGl человека.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоты, которая кодирует любое вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых вариантах нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору содержащему любую вышеуказанную нуклеиновую кислоту.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает трансформирование клетки вышеуказанным вектором.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которая содержит любую вышеуказанную нуклеиновую кислоту.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который заключается в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, которая содержит любое вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами . В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, выбранного из группы: ПРГШ, рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ , КРР , гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ , рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, которая содержит любое вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение .
В некоторых вариантах фармацевтическая комбинация предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, выбранного из группы: ПРГШ, рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ, рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР.
В некоторых вариантах фармацевтическая комбинация содержит терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое выбирают из химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности PD-L1 у субъекта, нуждающемуся в таком ингибировании, который включает введение субъекту эффективного количества любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого PD- L1. В некоторых вариантах изобретение относится к применению любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, выбранного из группы: ПРГШ, рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ, рак почки, рак яичника, лимфома Ход кина, MSI КРР.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Схема синтеза комбинаторной наивной библиотеки человека .
Фиг. 2. Карта фагмиды для клонирования Fab фаговых дисплейных библиотек.
Фиг. 3. Карта экспрессионной плазмиды для наработки Fab.
Фиг. 4А. Электрофореграмма BCD-135 в восстанавливающих условиях, 12% SDS-PAGE.
Фиг. 4Б. Электрофореграмма BCD-135 в невосстанавливающих условиях, 8% SDS-PAGE.
Фиг. 5. Иммуно ерментный анализ взаимодействия BCD-135 с PD-L1 и другими антигенами.
Фиг. б. Реактивация NFAT-сигналинга анти-PD-Ll антителами в репортерной клеточной линии Jurkat-NFAT-PD-1.
Фиг. 7. Анализ взаимодействий BCD-135 с FcRn и Fcy- рецепторами на приборе Octet RED 96.
Фиг. 8. Иммуноферментный анализ взаимодействий BCD-135 с PD-L1 разных видов организмов.
Фиг. 9. Анализ взаимодействий BCD-135 с PD-L1 человека и обезьяны циномолгуса на приборе Octet RED 96.
Фиг. 10. Анализ конформационной стабильности BCD-135.
Фиг. 11. Анализ коллоидной стабильности BCD-135.
Фиг. 12А. Анализ термической стабильности BCD-135 в фосфатном буфере. По оси X -время, по оси Y - поглощение.
Фиг. 12Б. Анализ термической стабильности BCD-135 в ацетатном буфере. По оси X -время, по оси Y - поглощение. Фиг. 12В. Анализ термической стабильности BCD-135 в гистидиновом буфере. По оси X -время, по оси Y - поглощение.
Фиг. 13А. Анализ стабильности BCD-135 в сыворотке крови человека. Калибровочная кривая отражающую зависимость оптической плотности от концентрации добавленного в лунку BCD-135.
Фиг. 13Б. Анализ стабильности BCD-135 в сыворотке крови человека. Результирующая таблица показывающая зависимость концентрации BCD-135 при инкубации в сыворотке человека от времени инкубации.
Фиг. 14А. 3D пространственная модель комплекса BCD-135 и N- terminus Ig домена PD-L1 антигена. Общий вид 3D модели.
Фиг. 14Б. 3D пространственная модель комплекса BCD-135 и N- terminus Ig домена PD-L1 антигена. Детализированная модель в районе прямых контактов антиген антитело (см. абл. в примере 18) .
Описание изобретения
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области. Примерные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут также использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе. Все публикации и другие ссылочные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены во всей их полноте путем отсылки. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет превалировать. Хотя в настоящем документе цитируется ряд документов, такое цитирование не является признанием того, что любой из этих документов образует часть общеизвестных знаний в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
В этом описании и вариантах осуществления изобретения слова «иметь» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Определения, связанные с антителом
PD-L1 (лиганд 1 рецептора программируемой гибели клеток) , также известный как кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 В7 (В7-Н1), является трансмембранным белком 1 типа, массой 40кДа. Состоит из 3 доменов: внеклеточного, представленного Ig V и С-подобными доменами (220), трансмембранного (21) и внутриклеточного (31) . Он играет важную роль в супрессии иммунной системы в период беременности, при пересадке чужеродной ткани, некоторых заболеваниях, например, при гепатите. В нормальных условиях, в ответ на собственные антигены, в лимфатических узлах и селезенке аккумулируется некоторое количество антиген-специфичных CD8+ Т-эффекторных клеток, с целью предотвращения аутоиммунного процесса, формируются PD-1/PD-L1 или B7-1/PD-L1 комплексы, это приводит к передаче ингибиторного сигнала, снижающего пролиферацию данных CD8+ Т - клеток в лимфоузлах. Таким образом PD-1/PD-L- взаимодействие является одним из ключевых в развитии иммунной толерантности .
"Дисфункция" в контексте иммунной дисфункции означает состояние снижения иммунной реакции на антигенную стимуляцию. Термин включает общие элементы истощения и/или анергии, при которых может происходить распознавание антигена, однако вызываемая иммунная реакция неэффективна для контроля над инфекцией или ростом опухоли.
"Усиление функции Т-клеток" означает индукцию, вызывание или стимулирование устойчивой или усиленной биологической функции Т-клетки или восстановление или реактивацию истощенных или неактивных Т-клеток. Примерами усиления функции Т-клеток являются: повышенная секреция γ-интерферона из CD8+ Т- клеток, повышенная пролиферация, повышенная реакция на антиген (например, элиминация вируса или патогена) относительно показателей до вмешательства. В одном варианте воплощения уровень усиления составляет как минимум 50%, в альтернативном варианте - 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Способ измерения этого усиления известен специалистам в данной области.
"Связанное с дисфункцией Т-клеток нарушение" представляет собой нарушение или состояние Т-клеток, характеризующееся сниженной реакцией на антигенную стимуляцию. В конкретном варианте воплощения связанным с Т-клетками дисфункциональным нарушением является нарушение, конкретно связанное с неприемлемо повышенным сигналом через PD-1. В другом варианте воплощения связанным с дисфункцией Т-клеток нарушением является нарушение, при котором Т- клетки являются энергическими или обладают сниженной способностью к секретированию цитокинов, пролиферации или цитолитической активности. В конкретном аспекте снижение реакции приводит к неэффективности контроля над патогеном или опухолью, экспрессирующей иммуноген. Примерами связанных с дисфункцией Т-клеток нарушений, характеризующихся дисфункцией Т- клеток, могут быть неразрешенная острая инфекция, хроническая инфекция и иммунитет опухоли.
"Иммунитет опухоли" означает процесс, при котором опухоли уклоняются от иммунного распознавания и элиминации. Таким образом, как терапевтическое понятие, иммунитет опухоли поддается "лечению", когда такое уклонение ослабляется, и опухоли распознаются и атакуются иммунной системой. Примерами распознавания опухолей являются связывание опухоли, уменьшение размеров опухоли и элиминация опухоли. Термин "вакцина" в контексте данного описания включает любой непатогенный иммуноген, который, будучи инокулированным в организм-хозяин, вызывает защитный иммунитет против конкретного патогена. Вакцины могут приобретать различные формы. Вакцины могут быть целыми организмами, имеющими общие антигены с патогеном, но сами не являются патогенными (например, коровья оспа) . Вакцины также могут быть приготовлены из убитых
(например, вакцина против полиомиелита Salk) или ослабленных (с потерей способности к вызыванию болезни - например, вакцина против полиомиелита Sabin) . Вакцины также могут приготавливаться из очищенных макромолекул, выделенных из патогенного организма. Например, токсоидные вакцины (например, столбняка и дифтерии) , содержащие неактивную форму растворимого бактериального токсина и обеспечивающие в результате выработку антител против токсина, но не иммунитет к интактной бактерии. Субъединичные вакцины
(например, гепатит В) содержат только один иммуногенный белок, выделенный из нужного патогена. Гаптеновые конъюгатные вакцины присоединяют некоторые углеводные или полипептидные эпитопы, выделенные из нужного патогена, к иммуногенным носителям, таким, как столбнячный токсоид. Эти методики предусматривают главным образом применение эпитопов, таких, как гаптены, для индукции выработки антитела, которые затем распознают один эпитоп в природном патогене. Однако для максимальной эффективности такие вакцины должны включать В- и Т-клеточные эпитопы, и должны выбираться Т-клеточные для гарантии возможности их распознавания, презентации и реакции на них со стороны иммунных систем организмов-хозяев. В ДНК-вакцинах используется способность клеток-хозяев к захвату и экспрессии ДНК, кодирующей патогенные белки, которую вводят внутримышечно . Реакция хозяина на иммуногены может усиливаться при введении в форме смеси с адъювантами. Иммунные адъюванты функционируют одним или несколькими из следующих способов: (1) продления удерживания иммуногена, (2) увеличения эффективного размера иммуногена (и, следовательно, активации фагоцитоза и презентации макрофагам) ,
(3) стимуляции притока макрофагов других иммунных клеток к месту инъекции или (4) активации местной выработки цитокинов и других видов иммунологической активности. Примерами адъювантов могут быть: полный адъювант Фрейнда (CFA) , соли алюминия и белки на основе микобактерий, такие, как мурамилди- или трипептиды.
Амплификация этого гена и/или сверхэкспрессия его белка были обнаружены при многих раковых заболеваниях, в том числе при ПРГШ, раке шейки матки, раке без выявленного первоисточника, глиобластома, раке пищевода, раке мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ, раке почки, раке яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР.
Термин «связывающая молекула» включает в себя антитела и иммуноглобулины .
Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН 3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) , разбросанные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR) . Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино- конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками) , и первый компонент (Clq) классической системы комплемента .
Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») , как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть" антитела включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН 1; (ii) F(ab')2- фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и СН 1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb- фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR) . Кроме того, две области Fv- фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al . (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) . Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.
Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет происхождение из мыши, ламы или донорской человеческой библиотеки или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными, например, замещенными разными аминокислотными остатками с тем, чтобы оптимизировать конкретные свойства антитела, например KD, koff, IC50, ЕС50, ED50. Предпочтительно каркасные участки антитела по изобретению имеют человеческое происхождение или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческое происхождение) .
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок антитела по изобретению может происходить из других нечеловеческих видов, включая мыши, ламы, кролика, крысу или хомяка, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, антигенсвязывающий участок может происходить из человеческих видов .
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых "гипервариабельными областями" или CDR или "HVR" или "HV" . Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC) .
Термин "гипервариабельная область" ("HVR" или "HV") по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" или "CDR", и/или такие остатки из "гипервариабельной петли".
В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно как «созревание аффиности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417
(1997) , и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный u et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042
(1998) .
"Каркасные области" (FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от CDR остатков. Обычно каждый вариабельный домен имеет четыре FR, определяемые как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяются согласно Kabat, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1- 23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103- 113
(HCFR4) в тяжелой цепи. Если участки CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в остатках 1-25 (LCFR1), 33-49
(LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, a FR остатки тяжелой цепи локализуются, примерно, в остатках 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. В некоторых примерах, когда CDR содержит аминокислоты как из CDR по Rabat, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, FR соответствующим образом корректируются. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты Н26- Н35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в положениях 1-25, а остатки FR2 находятся в положениях 36-49.
Антитело по данному изобретению, "которое связывает" целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку или ткань, экспрессирующую антиген, и в незначительной степени перекрестно реагирует с другими белками. По данным аналитических методов: сортинга флуоресцентно-активированных клеток (FACS), радиоиммунопреципитации (RIA) или ИФА (ELISA) , в таких вариантах изобретения степень связывания антитела с белком, не являющимся "мишенью" (с "нецелевым белком"), составляет менее 10% от связывания антитела с конкретным белком-мишенью. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин "специфическое связывание" или выражения "специфически связывается с" или "специфический к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия
(например, в случае ЬН1-44 или ЬН1-81 неспецифическое взаимодействие представляет собой связывание с бычьим сывороточным альбумином, казеином, фетальной бычьей сывороткой или нейтравидином) . Специфическое связывание можно определять количественно, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание можно определять конкурентной реакцией с другой молекулой, аналогичной мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание указывается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. В данном описании термин "специфическое связывание" или выражения "специфически связывается с" или "специфический к" конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени можно характеризовать на примере молекулы, имеющей Ко! к мишени по меньшей мере около 200 нМ, или же по меньшей мере около 150 нМ, или же по меньшей мере около 100 нМ, или же по меньшей мере около 60 нМ, или же по меньшей мере около 50 нМ, или же по меньшей мере около 40 нМ, или же по меньшей мере около 30 нМ, или же по меньшей мере около 20 нМ, или же по меньшей мере около 10 нМ, или же по меньшей мере около 8 нМ, или же по меньшей мере около 6 нМ, или же по меньшей мере около 4 нМ, или же по меньшей мере около 2 нМ, или же по меньшей мере около 1 нМ или выше. В одном варианте изобретения термин "специфическое связывание" относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, практически не связываясь с каким-либо другим полипептидом или эпитопом на полипептиде .
Термин «Ка», как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело- антиген, тогда как термин или «Kd» относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
"Аффинность связывания" обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном) . Если не указано иначе, "аффинность связывания" относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1 : 1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном) . Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно можно представить константной диссоциации (Kd) . Желательно, чтобы величина Kd составляла, примерно, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, б нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее . Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения .
В одном варианте изобретения "Kd" или "величину Kd" по данному изобретению измеряют методами поверхностного плазменного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при -10 относительных единицах
(единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом
Figure imgf000028_0001
( 3-диметиламинопропил) -карбодиимида
(EDC) и Ν-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) , а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% T een 20 (PBST) при 25°С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (коп) и скорости ассоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один
(BIAcore Evaluation Software версия 3.2), с помощью одновременного получения сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol . Biol. 293: 865-881. Если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазмонного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М-1 сек-1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии
(возбуждение=295 нм; эмиссия (излучение) =340 нм, полоса 16 нм) при 25°С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, рН 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco ( ThermoSpectronie ) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.
Термин «Koff» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff +можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.
"Скорость ассоциации" ("on-rate") или "коп" по данному изобретению можно также определять тем же самым описанным выше методом поверхностного плазменного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при -10 относительных единицах (единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом
Figure imgf000029_0001
' - ( 3- диметиламино пропил) -карбодиимида (EDC) и N- гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) , а затем вводят
(инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% Tween 20 (PBST) при 25°С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (коп) и скорости ассоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один
(BIAcore Evaluation Software версия 3.2), одновременно получая сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y . , et al., (1999) J. Mol . Biol. 293: 865-881. Однако, если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазменного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М-1 сек- 1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбу дение=295 нм; эмиссия (излучение) =340 нм, полоса 16 нм) при 25°С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, рН 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco ( ThermoSpectronic ) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.
Если специально не указано иначе, выражения "биологически активный", и "биологическая активность", и "биологические характеристики", по отношению к полипептиду по данному изобретению, означают обладание способностью связываться с биологической молекулой.
Выражение "биологическая молекула" относится к нуклеиновой кислоте, белку, углеводу, липиду и их комбинации. В одном варианте изобретения биологическая молекула существует в природе .
Участки антител, такие как Fab- и F (ab ' ) 2-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе .
Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется из клетки или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности) , которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.
Термин «вариантное» антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его «родительского» антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокисло ных остатков относительно последовательности родительского антитела . В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеций и/или замены осуществляются на CDR-участках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела .
Термин «биспецифичное антитело» означает антитело, содержащее антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью» .
Термин «химерное антитело» относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предпочтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных тел у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела .
Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, в частности, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR- участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR- участков. Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела в каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека, на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека.
Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR участков), чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR-участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. Ν-связанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N- гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как рН и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, в частности, Asn-Gly в последовательности CDR-участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.
В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела; см., например, обзор Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008) . Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR- участков, например, когда химерные антитела мышиного происхождения задействуют идентификацию человеческих зародышевых генных эквивалентов к мышиным генам вариабельного участка и трансплантацию последовательностей мышиных CDR- участков в этот каркас. Трансплантация CDR участка может быть основана на определениях CDR-участков по Rabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine-Beuzelin et al . , Crit Rev. Oncol Hematol . 64:210 225 (2007)) предполагается, что определение по IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)) . В некоторых случаях, трансплантация CDR-участкка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR- участки. Обратные мутации (иногда именуемые «ремонт каркасного участка») , могут применяться в выбранных положениях CDR трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, для того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки.
Существует две технологии получения полностью человеческих антител: с использованиемл_п vit-гособранных фаговых библиотек или in vivo иммунизацией гуманизированных животных (мышей, крыс и т.д. ) .
Фаговый дисплей является первой и самой широко распространенной in vitro технологией для поиска антител. В 1985 году Смит обнаружил, что последовательности чужеродной ДНК могут быть клонированы в нитевидный бактериофаг М13 таким образом, что клонированные последовательности генов экспрессируются на поверхности фаговых частиц как слитые белки (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317.) . Таким образом, можно проводить селекцю интересующих нас слитых белков на основе их способности связывать другие белки. Это открытие было скомбинировано с методами ПЦР-амплификации, что позволило клонировать кДНК репертуар генов иммуноглобулинов для создания разнообразных фаговых библиотек, содержащих вариабельные домены, которые могут быть использованы для быстрого поиска мишень-специфичных моноклональных антител. Репертуар фаговых библиотек отражает репертуар антител В-лимфоцитов каждого человека или животного, кровь которого была использована при создании библиотеки. В 1995 году две статьи сообщили о создании генетически сконструированных мышей, которые экспрессировали полностью человеческие антитела, репертуар которых может быть соспоставим с полученных гибридомной технологией (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859; Green LL, Hardy MC, Maynard-Currie CE, Tsuda H, Louie DM, Mendez MJ, Abderrahim H, Noguchi M, Smith DH, Zeng Y et al .:Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet 1994, 7:13-21.) У этих животных были целенаправленно разрушены гены своих собственных эндогенных тяжелых и к легких цепей иммунноглобулинов и введены трансгены, представляющие собой сегменты генов тяжелых и к легких цепей человека . Оказалось , что репертуар генов человека может быть использован мышиной иммунной системой для создания высокоспецифичных и высокоаффинных антител ко большему разнообразию антигенов. Несмотря на то, что трансгенные мыши экспрессируют В-клеточные рецепторы, которые по существу являются гибридными мышиных и человеческих (человеческий иммуноглобулин, мышиные Iga, Ig и другие сигнальные молекулы) , их В-клетки нормально развиваются и созревают. В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно как «созревание аффиности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al . , Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al . , Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).
Термин «моноклональное антитело» или «mAb» относится к антителу, которые синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.
"Нативные антитела" обычно являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH) , за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.
Определение "выделенный" ("изолированный"), применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется . Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, при использовании секвенатора с вращающейся стеклянной чашечкой (секвенатора Эдмана) , или (2) до гомогенности методом SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитела in situ внутри рекомбинантных клеток, так как по меньшей мере один компонент природной среды полипептида отсутствует. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки .
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты- примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия антитела, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.
Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула) . Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи Сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным.» В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном.
Термин «пептидный линкер» в настоящем документе означает любой пептид с возможностью соединения доменов с длиной в зависимости от доменов, которые он связывает между собой, содержащий любую аминокислотную последовательность .
Предпочтительно пептидный линкер имеет длину более 5 аминокислот и состоит из любого набора аминокислот, выбранного из G, A, S, Р, Е, Т, D, К.
Понятие «эффекторная функция» антитела относится к видам биологической активности, связанным с Fc-областью (нативной последовательностью Fc-области или с вариантами аминокислотной последовательности Fc-области) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: Clq- связывание; комплементзависимая цитотоксичность ; связывание Fc-рецептора; антитело- обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) ; фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и В-клеточная активация.
"Зависимая от антител опосредованная клетками цитотоксичность" и "ADCC" относятся к опосредованному клетками ответу, при котором неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK) , нейтрофилы и макрофаги) , узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, ΝΚ-клетки, экспрессируют только FCYRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 в публикации Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Чтобы оценить активность в ADCC представляющей интерес молекулы можно осуществить анализы ADCC in vitro, такие как анализы, описанные в патентах США W- 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (NK) . Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как модель, описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998) .
"Эффекторными клетками человека" являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcyRIII и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) , природные клетки-киллеры (NK) , моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительны РВМС и ΝΚ-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из крови или РВМС, как описано в настоящей публикации .
Термины "Fc-рецептор" и "FcR" используют для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор) , и к предпочтительным рецепторам относятся рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсируемые формы указанных рецепторов. Рецепторы FcyRII включают FcyRIIA ("активирующий рецептор") и FcyRIIB ( "ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcyRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив активации иммунорецептора (ITAM) . Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив ингибирования иммунорецептора (ITIM) (см. обзор в Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)) . Обзор, посвященный FcR, представлен в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92
(1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в настоящем описании в термин "FcR". Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al . , J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al . , J. Immunol. 24: 249 (1994)).
"Комплемент-зависимая цитотоксичность " и "CDC" относятся к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с молекулой
(например, антителом) в комплексе со своим антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента можно осуществить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 : 163 (1996) .
Термин "идентичность" или "гомологичность" следует толковать как означающее процентное содержание остатков аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после сравнения последовательностей и введения "брешей", если необходимо достичь максимального процента идентичности для полной последовательности и не учитывая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Ни N- или С-концевой удлиняющей, ни инсерционные сегменты не следует толковать как уменьшающие идентичность или гомологичность . Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны. Идентичность последовательности можно определить, используя программное обеспечение для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705) . Данное программное обеспечение подходит для подобных последовательностей путем определения степени гомологичности для разнообразных замещений, делеций (элиминирований) и других модификаций .
Фразу "гомологичный", что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере, 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%- ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих, по крайней мере, 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты .
Предлагается модификация (и) аминокислотных последовательностей антител, описанных в настоящей публикации. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают введением соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеций, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Осуществляют любое сочетание делеций, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы в антителе, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования .
Вариант модификации аминокислотных последовательностей антител с помощью аминокислотных замен. Такой вариант представляет собой замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в молекуле антитела на другой остаток. Места, представляющие наибольший интерес для мутагенеза путем замен, включают гипервариабельные области или CDR, но также предполагаются изменения и в области FR или Fc. Консервативные замены показаны в таблице 1 под заголовком "предпочтительные замены" . Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены дополнительные существенные изменения, названные "примерами заменам" в таблице А, или изменения, дополнительно описанные ниже при описании классов аминокислот, и может быть проведен скрининг продуктов.
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Норлейцин
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид»,
«полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двуцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии.
Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например с помощью принимающих клеток (клеток- хозяев) , или полученные путем химического синтеза.
Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью .
Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связавают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем встраивания лигированием в существующие сайты рестрикции. Если такие сайты не существуют, то согласно известной практике применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих) . В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы») .
Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка- хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше . Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка- хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка- хозяин» при использовании в настоящем документе. Термин «эксципиент» используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличающегося от соединения ( -ий) по данному изобретению.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя антитело согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат) . Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального , сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные , подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции) в виде таблеток, капсул, инъекций, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего .
Термин «заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1» подразумевает все заболевания или нарушения, которые либо прямо, либо косвенно связаны с PD-L1, включая этиологию, развитие, прогресс, персистентность или патологию заболевания или нарушения .
«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, чтобы «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию . В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского возраста любого возраста.
Термин "нарушение" означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения. Неограничивающие примеры подлежащих лечению заболеваний включают в себя доброкачественные и злокачественные опухоли; лейкозы и лимфоидные злокачественные новообразования, в частности рак молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы, предстательной железы или мочевого пузыря; нейронные, глиальные, астроцитальные, гипоталамусные и другие гландулярные, макрофаговые, эпителиальные, стромальные и бластоцельные нарушения; воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения. Предпочтительным подлежащим лечению нарушением согласно изобретению являются рак.
Термины "рак" или "раковый" относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ( /-ой) ростом/пролиферацией клеток. Это определение охватывает доброкачественные и злокачественные раковые заболевания. Примеры раковых заболеваний включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая рак ЖКТ, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, цервикальный рак, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки (почечноклеточную карциному) , рак предстательной железы (рак простаты) , рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, карциному анального канала, карциному пениса, меланому и различные типы рака головы и шеи.
Термины «иммунный ответ», «аутоиммунная реакция», «аутоиммунное воспаление» относятся, например, к действию лимфоцитов, антиген-представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, вырабатываемых указанными клетками или клетками печени (включая антитела, цитокины и комплемент, образующиеся в результате селективного повреждения, разрушения или элиминации из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей) .
«Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.
Понятие «хроническое» применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента (ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживать первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.
«Прерывистое» применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Подробное описание изобретения
Антитело
Настоящее изобретение относится к антителам или антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1 (лиганд 1 протеина программируемой смерти) .
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности ALYMGNGGHM (SEQ ID NO : 7 ) .
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7) .
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности DYAMS (SEQ ID NO: 1) ,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности
DISWSGSNTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2),
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3) , и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности GLSSGTVTAINYPG (SEQ ID NO: 5) ,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности NTNTRHS (SEQ ID NO : 6 ) ,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7) .
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью DYAMS (SEQ ID NO : 1 ) ,
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью DISWSGSNTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2),
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую:
(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью GLSSGTVTAINYPG (SEQ ID NO: 5),
(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью NTNTRHS (SEQ ID NO: 6) ,
(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7) . В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат:
(a) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности
EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSS
( SEQ ID NO: 4) , и
(b) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности
QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPD RFSGS ISGNKAAL I GAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTK (SEQ ID NO: 8) .
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат:
(a) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 4) , и
(b) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью
QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPD RFSGS ISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTK (SEQ ID NO: 8) .
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое связывает PD-L1, и содержат :
(а) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности
EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9), и
(b) легкую цепь с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности
QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPD RFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP SSЕЕLQANKATLVCLISDFYРGAVTVAWKADSSРVKAGVEТТТРSKQS NKYAASSYLSLТР EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO : 10) .
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое связывает PD-L1, и содержат :
(a) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9), и
(b) легкую цепь с аминокислотной последовательностью QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPD RFSGS ISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP
SSЕЕLQANKATLVCLISDFYРGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 10) .
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело, которое связывает PD-L1, представляет собой моноклональное антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения моноклональное антитело, которое связывает PD-L1, представляет собой полноразмерное антитело IgG. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 человека.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgGl.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR 1-3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1-3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR 1-3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 5-7.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4 и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.
Молекулы нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, и последовательностям, кодирующим антитело к PD-L1 по данному изобретению, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения различные молекулы нуклеиновых кислот кодируют первый домен и второй домен аминокислотной последовательности антитела к PD-L1. Там, где первый домен и/или второй домен содержит тяжелую цепь и легкую цепь, в некоторых вариантах осуществления изобретения различные нуклеиновые кислоты кодируют тяжелую цепь и аминокислотные последовательности легкой цепи. В других вариантах осуществления изобретения та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность тяжелой цепи и аминокислот легкой цепи. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать любую комбинацию из аминокислотных последовательностей (например, последовательности тяжелой и легкой цепи) первого и второго домена. В конкретной варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать аминокислотную последовательность первого связывающего домена и аминокислотную последовательность легкой цепи второго связывающего домена, необязательно включающей любую последовательность соединяющего их пептидного линкера. Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин «полинуклеотид», упоминаемое в данном документе, означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы.
Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% гомологичны или идентичны одной или нескольким нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NO: 1_3, 5-7. В определенных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичны или идентичны нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или 8. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичны одной или нескольким из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-10.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-10. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать любую комбинацию указанных нуклеотидных последовательностей. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1-3 и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5-7. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.
Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует антитело к PD-L1 или ее часть. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена.
В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VH домен из первого или второго домена антитела к PD-L1 по данному изобретению, соединенного в рамках считывания с нуклеотидной последовательности, кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VL домен из первой или второй области антитела к PD-L1 по данному изобретению, объединеной в рамках считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника.
В еще одном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей первого или второго связывающего домена, могут «преобразовываться» по всей длине генов антитела. В одном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены VH или VL преобразуются в гены антитела по всей длине путем вставки в экспрессионный вектор, уже кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН) или легкой цепи (CL) , соответственно, так что VH сегмент функционально соединен с СН сегментом ( -ами) в векторе и/или VL сегмент оперативно соединен с CL сегментом в векторе. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL домены преобразуются в гены по всей длине антитела путем соединения, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH и/или VL домены, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или CL домены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие по всей длине тяжелую и/или легкую цепи, могут затем экспрессироваться из клетки, в которую они были введены.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии большого количества рекомбинантных антител к PD-L1. Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для получения человеческих антител, гуманизированных антител, химерных антител, биспецифических антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов , диател, мутированных антител и производных антител, как описано в настоящем документе.
Вектор
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей антител к PD-L1 или их частей (например, последовательностей тяжелой цепи первого и/или тяжелой и/или легкой цепи второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител .
В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот и векторы могут быть использованы для изготовления мутировавших антител к PD-L1. Антитела могут мутировать в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей первого и/или тяжелой и/или легкой цепей второго связывающего домена, например, для изменения связывающей способности антител к PD-L1. Например, мутация может произойти в одном или нескольких CDR-участках, чтобы увеличить или уменьшить KD антител к PD-L1, чтобы увеличить или уменьшить k0ff или изменить специфичность связывания антитела в отношении к PD-L1. В другом варианте осуществления изобретения одной или более мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в антителе, соответствующем первому или второму связывающему домену антитела к PD-L1 по данному изобретению. Эти мутации могут быть сделаны в CDR- участке или каркасном участке вариабельного домена, или в константном домене. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутации произведены в вариабельном домене. В другой варианте осуществления изобретения одной или нескольким мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена антитела к PD-L1 по данному изобретению.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела к PD-L1 по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК, кодирующей частично или полностью последовательность первого и второго связывающего домена (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательности тяжелой и легкой цепи) , полученный, как описано выше, в экспрессионных векторах таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (AAV) , вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют) .
Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС - и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации соответствующей мРНК. Интронные последовательности находятся в окружении сплайс-донора и сплайс- акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов. Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичныи сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы) .
Помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промотеры и/или энхансеры полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотера/энхансера ) , обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотера/энхансера) , аденовируса, (например, аденовирус большого позднего промотора (AdMLP) ) , вирус полиомы, а также сильных промотеров млекопитающих, таких как нативный иммуноглобулин и актин промотеров. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, патенты США 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. Способы экспрессии связывающих молекул, таких как антитела растений, в том числе описание промотеров и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области техники. См., например, патент США 6,517,529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.
В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах при селекции/амплификации метотрексата) , ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.
Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака) ; последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма- хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотер рибосомального сайта связывания, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промотеры и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.
Клетки-хозяева
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способам получения антител к PD-L1 по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения антител к PD-L1, как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать антитело к PD-L1, культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продукции антитела к PD-L1, и выделение полученного антитела к PD-L1. Антитело к PD- L1, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках- хозяевах упоминается в данном документе как «рекомбинантные антитела к PD-L1». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и антителам к PD-L1, получаемым аналогично .
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к PD-L1 по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран-опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области.
Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, в частности, клетки яичников китайского хомячка (СНО) , NS0 клетки, клетки SP2, НЕК-293Т клетки, 293 Фристайл клетки ( Ir itrogen) , NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК) , клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие антитела к PD-L1, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антител в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения антител в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела к PD-L1 могут быть выделены из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Е. coli и Streptomyces . Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe,
Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.
Кроме того, уровень продукции антител к PD-L1 по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.
Вполне вероятно, что антитела к PD-L1 различных клеточных линий или трансгенные животные будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования . Однако все антитела к PD-L1, кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащими аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, являются частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций.
Изобретение относится также к способам и процессам получения антител к PD-L1 и их антигенсвязывающих фрагментов . Моноклональные антитела
Моноклональные антитела можно создавать, например, с помощью метода на основе гибридом, который впервые описан Kohler и др., Nature, 256, 1975, с. 495, или с помощью методов рекомбинантной ДНК (US 4816567) .
При использовании метода на основе гибридом мьшь или другое пригодное животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют согласно описанной выше методике, для того, чтобы вызывать образование лимфоцитов, которые продуцируют или могут продуцировать антитела, обладающие способностью специфически связываться с белком, применяемым для иммунизации. Согласно другому варианту лимфоциты можно получать в результате иммунизации in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и затем сливают с клеточной линией миеломы с помощью приемлемого связывающего агента, такого как полиэтиленгликоль , с получением клетки гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, изд-во Academic Press, 1986, cc . 59-103) .
Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не содержат фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT) , то культуральная среда для гибридом, как правило, должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда) , т.е. вещества, которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT.
Предпочтительными применяемые в качестве компонента для слияния клетками миеломы являются клетки, которые легко поддаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень производства антител выбранными продуцирующими антитела клетками и чувствительны к избирательной среде, на которой происходит отбор несвязанных родительских клеток. Предпочтительными линиями клеток миелом являются линии мышиной миеломы, такие как созданные на основе мышиных линий опухолевых клеток линии МОРС- 21 и МРС-11, которые можно получать из Salk Institite Cell Disrtibution Center, Сан-Диего, шт. Калифорния, США, и линии SP- 2 или X63- Ag8-653, которые можно получать из Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт. Мэриленд, США. Описано также применение линий клеток человеческой миеломы и гетеромиеломы типа «мышь-человек» для производства моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001; и Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker Inc., Нью-Йорк, 1987, cc. 51- 63) .
Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, полученных с использованием клеток гибридомы, определяют методом иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (РИА) или твердофазный имммуноферментный анализ (ELISA) .
Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определять с помощью Скэтчард-анализа, описанного у Munson и др., Anal. Biochem., 107, 1980, с. 220.
После выявления клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с помощью метода лимитирующих разведений и выращивать стандартными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, изд-во Academic Press, 1986, cc. 59-103) . Пригодные для этой цели среды включают, например, среду DMEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гидрибомы можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в организме животных, например, путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции клеток мышам.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделять от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных методов очистки антител, например, аффинной хроматографией (например, с использованием протеин А- или протеин Q-сефарозы) , или ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатитах, гель-электрофореза, диализа и т.д.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител) . В качестве предпочтительного источника такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения ДНК можно включать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, обезьяньи COS- клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без трансфекции не продуцируют белок антитела, что приводит к синтезу моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзор статей о рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, см. у Skerra и др., Curr. Opinion in Imunol., 5, 1993, cc. 256-262 и Pliickthun, Immunol. Revs. 130, 1992, cc. 151-188.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методов, описанных у McCafferty и др., Nature, 348, 1990, cc. 552-554 . У Clackson и др., Nature, 352, 1991, cc . 624- 628 и Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, cc. 581-597 описано выделение мышиных и человеческих антител соответственно с помощью фаговых библиотек. В последующих публикациях было описано производство высокоаффинных (нМ-диапазон) человеческих антител с помощью перестановки цепи (Marks и др., Bio/Technology, 10, 1992, cc. 779-783), а также комбинаторная инфекция и рекомбинация in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и др., Nucl . Acids. Res., 21, 1991, cc. 2265-2266) . Таким образом, эти методы представляют собой реальную альтернативу традиционным методам выделения моноклональных антител на основе гибридом моноклональных антител .
ДНК, кодирующую антитело, можно также модифицировать, например таким образом, чтобы получать химерные или слитые полипептиды антител, например, путем замены последовательностей константных областей тяжелой и легкой цепи (Сн и CL) на гомологичные мышиные последовательности (US 4816567 и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, с. 6851) или с помощью ковалентного связывания кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей или с частью кодирующей последовательности полипептида, не относящегося к иммуноглобулинам (гетерологичного полипептида) . Не относящиеся к иммуноглобулинам полипептидные последовательности можно заменять на константные области антитела или заменять на вариабельные области антигенсвязывающего центра антитела, создавая химерное бивалентное антитело, которое содержит один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.
Гуманизированные антитела
Методы создания «гуманизированных» антител животных, кроме человека, известны в данной области. Предпочтительно гуманизированное антитело имеет один или несколько встроенных в него аминокислотных остатков, полученных из источника, отличного от человека. Эти полученные из источника, отличного от человека, аминокислотные остатки часто называют «импортными» остатками, поскольку их обычно получают из «импортной» вариабельной области. Гуманизацию в целом можно осуществлять согласно методу Winter с соавторами (Jones и др., Nature, 321, 1986, сс. 522- 525; Riechmann и др., Nature, 332, 1988, сс . 323-327; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, сс. 1534-1536) путем замены последовательностей гипервариабельного участка на соответствующие последовательности человеческого антитела. Таким образом, «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела (US 4816567), в которых участок, существенно меньший, чем интактная человеческая вариабельная область, заменен соответствующей последовательностью, полученной из видов кроме человека. На практике гуманизированные антитела представляют собой, как правило, человеческие антитела, в которых часть остатков гипервариабельного участка и возможно часть остатков FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.
Выбор человеческих вариабельных областей как легкой, так и тяжелой цепи, предназначенных для получения гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности и НАМА-ответа (человеческое антимышиное антитело) , когда антитело предназначено для лечения человека. Согласно так называемому методу «наилучшего подбора» последовательность вариабельной области антитела грызунов подвергают скринингу относительно полной библиотеки известных последовательностей человеческих вариабельных областей. Человеческую последовательность V- области, которая наиболее близка к последовательности из организма грызунов, идентифицируют и внутри нее выбирают человеческий каркасный участок (FR) , пригодный для применения в гуманизированном антителе (Sims и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2296); Chothia и др., J . Mol. Biol., 196, 1987, с. 901). В другом методе используют определенный каркасный участок, полученный из консенсусной последовательности определенной подгруппы легких или тяжелых цепей всех человеческих антител. Один и тот же каркасный участок можно применять для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 1992, с. 4285; Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623) .
Также важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой связывающей способности к антигену и других важных биологических свойств. Для решения этой задачи согласно предпочтительному способу гуманизированные антитела получают с помощью анализа родительских последовательностей и различных гуманизированных продуктов с использованием умозрительных трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и хорошо известны специалистам в данной области. Известны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных перспективных последовательностей иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет осуществлять анализ возможной роли остатков в функции перспективной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность перспективного иммуноглобулина связываться с антигеном. Таким путем можно выбирать остатки в FR и объединять с реципиентными и импортными последовательностями для достижения требуемых характеристик антитела, таких как повышенная аффинность к антигену (ам) -мишени (ням) . Как правило, остатки гипервариабельного участка оказывают непосредственное и наиболее существенное влияние на связывание антигена.
Гуманизированное антитело может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab-фрагмент, необязательно конъюгированный с одним или несколькими цитотоксическим (ими) агентом (ами) для создания иммуноконъюгата . В альтернативном варианте гуманизированное антитело может представлять собой полноразмерное антитело, например, полноразмерное антитело в виде IgGl .
Человеческие антитела и методика, основанная на применении фаговой дисплейной библиотеки
В качестве альтернативы гуманизации можно получать человеческие антитела. Например, в настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей) , которые после иммунизации могут продуцировать полный спектр человеческих антител без производства эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция областей стыка гена тяжелой цепи антитела ( jH-сегмента) в организме химерных мышей и мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию производства эндогенного антитела. Перенос набора зародышевой линии гена человеческого иммуноглобулина в такую мутантную зародышевую линию мышей приводит к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (см., например, Jakobovis и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA: 90, 1993, с. 2551; Jakobovis и др., Nature, 362, 1993, сс. 25-258; Bruggermann и др., Year in Immune, 7, 1993, с. 33; и US 5545806, 5569825, 5591669 (все на имя фирмы GenPharm) ; 5545807; и W0 97/17852)
В альтернативном варианте для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из спектра генов вариабельной области (V) иммуноглобулина из организма иммунизированных доноров можно использовать фаговую дисплейную технологию (McCafferty и др., Nature, 348, 1990, сс. 552-ι553) . Согласно этой методике гены V-области антитела клонируют в рамке считывания либо с основным, либо с минорным геном оболочечного белка нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и презентируют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекции по признаку функциональных свойств антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, которое обладает указанными свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговую презентацию можно осуществлять в различных форматах
(обзор которых см., например Johnson Kevin S. и Chiswell David J., Current Opinion in Structural Biology, 3, 1993, cc. 564- 571) . Для фаговой презентации можно использовать различные источники сегментов V-генов. Clackson и др., Nature, 352, 1991, сс. 624-628 выделили различные наборы антител к оксазолону из небольшой произвольной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированных мышей. Можно конструировать спектр V-генов, полученных из организма иммунизированных людей-доноров, и антитела к различному набору антигенов (включая аутоантигены) можно выделять в целом согласно методам, описанным у Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581-597 или у Griffith и др., ЕМВО J . , 12, 1993, сс. 725-734)
(см. также US 5565323 и 5537905) .
Как описано выше, человеческие антитела могут продуцироваться также in vitro активированными В-клетками (см. US 5567610 и 5229275) .
Фрагменты антител
В определенных обстоятельствах целесообразно применять фрагменты антител, а не полные антитела. Меньший размер фрагментов способствует их быстрому клиренсу и может способствовать лучшему проникновению в плотные опухоли.
Для получения фрагментов антител разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24, 1992, cc . 107-117 и Brennan и др., Science, 229, 1985, с. 81) . Однако в настоящее время эти фрагменты можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител можно экспрессировать и секретировать из Е. coli, что позволяет облегчать производство больших количеств указанных фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из описанных выше фаговых библиотек антител. Согласно другому варианту Fab ' -SH-фрагменты можно непосредственно выделять из Е. coli и химически сшивать с получением F(ab' ) 2- фрагментов (Carter и др., Bio/Technology, 10, 1992, сс. 163- 167) . Согласно другому подходу F(ab' )2 - фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Fab- и F ( ab ' ) 2-фрагмент с повышенным временем полужизни in vivo, в которых сохранены остатки эпитопсвязывающего рецептора, описаны в US 5869046. Специалистам в данной области должны быть очевидны другие методики получения фрагментов антител. В других вариантах осуществления изобретения выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv- фрагмент (scFv) (см. WO 93/16185; US 5571894 и US США 5587458) . Fv и sFv представляют собой единственные виды с интактными связывающими сайтами, лишенные константных областей; в результате их можно применять для пониженного неспецифического связывания при применении in vivo. Слитые белки, несущие sFv, можно конструировать для получения слияния эффекторного белка либо на Ν-, либо на С-конце sFv (см. Antibody Engineering, под ред. Borrebaeck, выше) . Фрагмент антитела может представлять собой также «линейное антитело», например, описанное в US 5641870. Такие фрагменты линейного антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими .
Биспецифические антитела
Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью к связыванию с двумя различными эпитопами. Например, биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами белка PD-L1. Другие биспецифические антитела могут нести сайт связывания с PD-L1 в сочетании с сайтом связывания другого белка. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F (ab ' ) 2-фрагментов биспецифических антител) .
Методы создания биспецифических антител известны в данной области. Общепринятое получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, где обе цепи имеют различную специфичность (Millstein и др., Nature, 305, 1983, сс. 537-539) . Из-за случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) потенциально могут продуцировать смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно осуществляют в несколько стадий с помощью аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта - низким. Аналогичные процессы описаны в W0 93/08829 и у Traunecker и др., ЕМВО J . , 10, 1991, сс. 3655-3659.
Согласно другому подходу вариабельные области антитела с требуемой специфичностью связывания (антигенсвязывающие центры антитела) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константной областью тяжелой цепи Ig, которая включает по меньшей мере часть шарнирных Сн2- и СнЗ-областей . Предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из слияний присутствовала первая константная область тяжелой цепи (Сн1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и при необходимости легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в различные экспрессионные векторы и ими совместно трансфектируют приемлемый организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в подборе общих пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда в конструкции используют неравные соотношения трех полипептидных цепей с целью оптимизации выходов . Однако можно также встраивать кодирующие последовательности в две или во все три полипептидные цепи в одном экспрессионном векторе, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных пропорциях обеспечивает высокие выходы или когда соотношения не имеют решающего значения.
В предпочтительном варианте осуществления указанного подхода биспецифические антитела представляют собой гибрид тяжелой цепи иммуноглобулина, обеспечивающий первую специфичность связывания в первом плече, и гибрид пары тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (что обеспечивает вторую специфичность связывания) во втором плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение требуемой биспецифической молекулы от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Этот подход описан в WO 94/04690. Дополнительное подробное описание получения биспецифических антител см., например у Suresh и др., Methods in Enzymology, 121, 1986, с. 210.
Согласно следующему подходу, описанному в патенте US 5731168, можно сконструировать область контакта между парой молекул антител с целью повышения до максимального уровня процентного содержания гетеродимеров, которые получают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область контакта включает по меньшей мере часть СнЗ-области. Согласно этому методу одну или несколько небольших аминокислот с боковыми цепями из области контакта первой молекулы антитела заменяют на молекулы с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан) . Уравновешивающие «полости», идентичные или близкие по размеру большой (им) боковой (ым) цепи (ям) создают в области контакта второй молекулы антитела путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с более мелкими боковыми цепями (например, на аланин или треонин) . Это обеспечивает механизм, способствующий повышению выхода гетеродимера относительно других нежелательных конечных продуктов, таких
Биспецифические антитела включают перекрестносшитые антитела или «гетероконъюгаты» . Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть сшито с авидином, а другое с биотином. Такие антитела можно использовать, например, для направленного переноса клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (US 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (W0 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089) . Антитела-гетероконъюгаты можно создавать с помощью любого из обычных методов введения перекрестных сшивок. Приемлемые кросс-линкеры хорошо известны в данной области и описаны в US 4676980 наряду с различными методами введения перекрестных сшивок.
Методы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать с помощью химического связывания. Brennan и др., Science, 229, 1985, с. 81 описали методику, согласно которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению, получая F (ab ' ) 2-фрагменты. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиолом, такого как арсенит натрия, для стабилизации соседних дитиолов и предупреждения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab ' -фрагменты затем превращают в тионитробензоатное (TNB) производное. Одно из Fab ' -ΤΝΒ-производных затем повторно превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab ' -ΤΝΒ-производного , получая биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела можно применять в качестве агентов для избирательной иммобилизации ферментов.
Достигнутый в настоящее прогресс позволяет облегчать непосредственное выделение из Е. coli Fab ' -SH-фрагментов, которые можно химически сшивать с образованием биспецифических антител. Shalaby и др., J. Exp. Med., 175, 1992, сс . 217-225 описали получение F ( ab ' ) 2-фрагмента молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела. Каждый Fab ' - фрагмент по отдельности секретировался из Е. coli и его подвергали непосредственному химическому связыванию in vitro с получением биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладало способностью связываться с клетками, для которых характерна сверхэкспрессия рецептора ErbB2, и с обычными человеческими Т-клетками, а также стимулировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, мишенью которых является опухоль молочной железы человека.
Описаны также различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с помощью лейциновых «застежек-молний» (Kostelny и др . , J. Immunol., 148(5), 1992, сс. 1547-1553) . Пептиды лейциновых «застежек-молний» из белков Fos и Jun связывали с Fab ' - фрагментами двух различных антител путем генного слияния. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем путем повторного окисления получали гетеродимеры антител. Этот метод можно применять также для получения гомодимеров антител. Технология на основе «двойных антител», описанная Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, сс. 6444-6448, представляет собой другой механизм получения фрагментов биспецифических антител. Фрагменты содержат VH-область, связанную с VL- областью линкером, который является слишком коротким, для того чтобы позволить произойти спариванию двух доменов одной и той же цепи. Таким образом, VH- и VL-области одного фрагмента должны спариваться с комплементарными VL- и VH- областями другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих центра. Описана также другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител, основанная на применении одноцепочечных (Fv)- (sFv) димеров (см. Gruber и др., J . Immunol, 152, 1994, с. 5368) .
Под объем изобретения подпадают также антитела, имеющие более двух валентностей. Например, можно получать триспецифические антитела (Tutt и др., J. Immunol., 147, 1991, с. 60) .
Поливалентные антитела
Поливалентное антитело может интернализоваться (и/или диссимилироваться ) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело, быстрее, чем бивалентное антитело. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой поливалентные антитела (отличные от класса IgM) с тремя или большим количеством антигенсвяызвающих центров (например, тетравалентные антитела) , которые можно легко получать путем рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать димеризованный домен и три или большее количество антигенсвязывающих центров. Предпочтительный димеризованный домен содержит (или состоит из) Fc-фрагмент или шарнирную область . В таком случае антитело должно содержать Fc- фрагмент и три или большее количество антигенсвязывающих центров, расположенных на Ν-конце относительно Fc- фрагмента. Согласно настоящему описанию предпочтительное поливалентное антитело содержит (или состоит из) от 3 до примерно 8, но предпочтительно 4, антигенсвязывающих центров. Поливалентное антитело содержит, про меньшей мере, одну полипептидную цепь (и предпочтительно две полипептидные цепи) , при этом полипептидная (ые ) цепь (и) содержит (ат) две или большее количество вариабельных областей. Например полипептидная (ые) цепь (и) может (ут) содержать VD1- (XI ) n-VD2- (Х2 ) n-Fc, где VD1 обозначает первую вариабельную область, VD2 обозначает вторую вариабельную область, Fc обозначает одну полипептидную цепь Fc- фрагмента, XI и Х2 обозначают аминокислоту или полипептид и п обозначает 0 или 1. Например, полипептидная (ые ) цепь (и) может (ут) содержать следующую цепь: VH-CHl-гибкий линкер-VH-CHl- Fc-фрагмент; или VH-CHl-VH-CHl-Fc-фрагмент . Поливалентное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере 2 (и предпочтительно 4) полипептида вариабельной области легкой цепи. Поливалентное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может, например, содержать от примерно 2 до примерно 8 полипептидов вариабельной области легкой цепи. В контексте настоящего описания подразумевается, что полипептиды вариабельной области легкой цепи содержат вариабельную область легкой цепи и необязательно дополнительно содержит CL-область . Фармацевтические композиции
Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента (или в качестве единственного активного ингредиента) антитело, которое специфично к PD-L1. Фармацевтическая композиция может включать любое антитело к PD-L1, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые могут быть связаны с активностью PD-L1.
Как правило, антитела к PD-L1 по данному изобретению пригодны для применения в виде лекарственных форм в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемым эксципиентом, например, как описано далее.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут содержать по меньшей мере одно антитело к PD-L1 и одну или более дополнительных связывающих молекул (например, антител) , которые нацелены на один или более соответствующих поверхностных рецепторов .
Фармацевтическая композиция является «стерильной», если она асептична, т.е. свободная от микроорганизмов и их спор.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течении всего срока годности при температуре хранения, например, при температуре 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активные агент сохранял и физическую и химическую стабильность, а также биологическую активность . Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильность при ускоренном и естественном хранении.
Термин «эксципиент» используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличающегося от соединения ( -ий) по данному изобретению. Выбор инертного эксципиента будет в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения, действие эксципиента на растворимость и стабильность и характер лекарственной формы. При использовании в данном документе «фармацевтически приемлемый эксципиент» включает все без исключения растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и подобные физиологически совместимые вещества. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых эксципиентов являются вода, физиологический раствор, фосфатный буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительным включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбит, или хлорид натрия. Дополнительными примерами фармацевтически приемлемых веществ являются увлажняющие агенты или небольшое количество вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, которые увеличивают продолжительность хранения или эффективность антитела .
Под «буферным агентом» понимается раствор способный сохранять значение рН благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,5 до 7,0. Примеры буферов, которые известны специалистам и могут быть найдены в литературе, включают, но не ограничиваются ими, гистидиновые, цитратные, сукцинатные, ацетатные, фосфатные, фосфатно-солевой, цитратно-фосфатный буферы, а также буферы на основе трометамина и тому подобное или их подходящие смеси.
Под «изотоническими агентами» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают изотоническое осмотическое давление раствора. «Изотоническим» счетается раствор создающий осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими. Термином "гипотоническая" характеризуют композицию с осмотическим давлением ниже осмотического давления крови человека. Соответственно, термин "гипертоническая" характеризует композицию с осмотическим давлением выше осмотического давления крови человека.
Термин «поверхностно-активное вещество» (другое название сурфактант или детергент, или ПАВ) в том виде, как он здесь использован, относится к эксципиенту, который может изменять поверхностное натяжение жидкого препарата антитела. В определенных воплощениях данное поверхностно-активное вещество снижает поверхностное натяжение жидкого препарата антитела. В других воплощениях «поверхностно-активное вещество» может способствовать улучшению коллоидной стабильности или растворимости любого антитела в данном препарате. Поверхностно- активное вещество может снижать агрегацию приготовленного препарата антитела, и/или минимизировать образование частиц в данном препарате, и/или уменьшать адсорбцию. Поверхностно- активное вещество также может улучшать стабильность антитела во время, в том числе после замораживания/оттаивания и при встряхивании. Поверхностно-активные вещества могут быть ионными или неионными. Иллюстративные неионные поверхностно-активные вещества, которые можно включать в составы по настоящему изобретению, включают, например, алкилполи (этиленоксид ) , алкилполиглюкозиды (например, октилглюкозид и децилмальтозид ) , жирные спирты, такие как цетиловый спирт и олеиловый спирт, кокамид-МЕА, кокамид-DEA и кокамид-ТЕА. Конкретные неионные поверхностно-активные вещества, которые можно включать в составы по настоящему изобретению, включают, например, полисорбаты, такие как полисорбат 20 (Tween 20), полисорбат 28, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80 (Tween 80), полисорбат 81 и полисорбат 85; полоксамеры, такие как полоксамер 188 (Kolliphor Р188), полоксамер 407; полиэтиленполипропиленгликоль или полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этилен- и пропиленгликоля (например, плюроники PF68 и .д.).
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно- активные вещества, например , полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner) , Плуроник (Pluronic) ) , натрия додецилсульфат (SDS) , но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, ЭДТА, ДТПА, цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.
"Фармацевтически приемлемая кислота" включает неорганические и органические кислоты, которые являются нетоксичными в концентрации и форме, в которых они включены в состав. Например, к подходящим неорганическим кислотам относятся хлористоводородная, перхлорная, бромистоводородная, йодистоводородная, азотная, серная, сульфоновая, сульфаниловая, фосфорная, карбоновая и т. п. К подходящим органическим кислотам относятся линейные или разветвленные алкильные, ароматические, циклические, циклоалифатические, арилалифатические, гетероциклические, насыщенные, ненасыщенные, моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, включая, например, муравьиную, уксусную, 2-гидроксиуксусную, трифтороуксусную, фенилуксусную, триметилуксусную, t-бутилуксусную, антраниловую, пропановую, 2- гидроксипропановую, 2 -оксопропановую, малоновую, циклопентанпропионовую, 3- фенилпропионовую, бутановую, бутандиоевую, бензойную, 3-(4- гидроксибензоил) бензойную, 2- ацетоксибензойную, аскорбиновую, коричную, лаурилсерную, стеариновую, муконовую, миндальную, янтарную, эмбоновую, фумаровую, яблочную, малеиновую, гидроксималеиновую, малоновую, молочную, лимонную, виннокаменную, гликолевую, гликоновую, глюконовую, пировиноградную, глиоксаловую, щавелевую, мезиловую, янтарную, салициловую, фталевую, пальмовую, пальмеиновую, тиоциановую, метансульфоновую, этансульфоновую, 1,2- этандисульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, бензолсульфоновую, 4- хлоробензолсульфоновую, нафталин-2- сульфоновую, р-толуолсульфоновую, камфорсульфонов, 4- метилбицикло I 2.2.2 ] -окт-2-ен-1 -карбоновую, глюкогептоновую, 4,4'- 4, 4' -метиленбис-3- (гидрокси-2-ен-1 -карбоновую), гидроксинафтоевую .
"Фармацевтически приемлемые основания" включают неорганические и органические основания, которые являются нетоксичными в концентрации и форме, в которых они включены в состав. Например, пригодные основания включают основания, образованные образующими неорганическое основание металлами, такими как литий, натрий, калий, магний, кальций, аммоний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий, N- метилглюкамин, морфолин, пиперидин, и органические нетоксические основания, включая первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы [например, N(R')4+ (где R' независимо представляет собой Н или См алкил, например, аммоний, Tris)], например, изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, 2-диэтиламиноэтанол, триметамин, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, Ν-этилпиперидин, полиаминовые смолы и т.п. Особенно предпочтительными органическими нетоксическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметамин, дициклогексиламин, холин и кофеин. Дополнительные фармацевтически приемлемые кислоты и основания, применимые с настоящим изобретением, включают кислоты и основания, которые образованы из аминокислот, например, гистидина, глицина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина и аспарагина.
"Разбавитель", представляющий интерес согласно настоящему изобретению, представляет собой разбавитель, который является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и пригодным для получения жидкой композиции, такой, как композиция, разбавленная после лиофилизации. Типичные разбавители включают воду, бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), рН-буферный раствор (например, фосфатно-солевой буфер), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. В альтернативном варианте воплощения разбавители могут включать водные растворы солей и/или буферов.
"Консервант" представляет собой соединение, которое может добавляться к представленным в данном документе композициям для снижения бактериальной активности. Добавление консерванта может, например, облегчать получение композиции для многократного применения (с многократной дозой) . Примеры потенциальных консервантов включают хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, в которых алкильные группы представляют собой соединения с длинной цепью) и хлорид бензэтония. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол. Наиболее предпочтительным консервантом, представленным в настоящем документе, является бензиловый спирт.
Термин «лиофилизованный», используемый в настоящем документе, относится к препарату, который был подвергнут процессу, известному в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающему в себя замораживание препарата и последующее удаление льда из замороженного содержимого .
Термин «аминокислота», используемый в настоящем документе, означает аминокислоту (свободную аминокислоту, т.е. не аминокислоту в пептиде или в белковой последовательности) . Аминокислоты, используемые в настоящем изобретении, включают в себя, но не ограничиваются ими, например, аргинин, глицин, лизин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, триптофан, серии, цистеин, метионин и пролин.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Такие композиции и способы их изготовления можно найти, например, в Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Troy, Beringer., Lippincott Williams and Wilkins., Philadelphia, PA 2006. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики) .
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться, в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащего заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.
Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела к PD-L1 по данному изобретению.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения. Используемый в данном документе термин «парентеральное введение» фармацевтической композиции включает любой способ введения, для которого характерно физическое нарушение целостности ткани субъекта и введение фармацевтической композиции через нарушение в ткани, что обычно приводит к прямому попаданию в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Таким образом, парентеральное введение включает, помимо прочего, введение фармацевтической композиции путем инъекции композиции посредством введения композиции через хирургический разрез, путем нанесения композиции с помощью проникающей в ткани нехирургической раны и т.п. В частности, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную инъекцию или инфузии; и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может оказаться полезной. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути.
Лекарственные формы фармацевтических композиций, подходящие для парентерального введения, обычно содержат активный ингредиент в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем/эксципиентом, например, стерильной водой или стерильным изотоническим раствором. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или проданы в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Инъекционные лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, или в многодозовых контейнерах, содержащих консервант. Лекарственные формы для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное. Такие лекарственные формы могут также содержать один или более дополнительных ингредиентов, включая, помимо прочего, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном варианте осуществления изобретения композиции для парентерального введения активный ингредиент предоставляется в сухой форме (то есть, порошок или гранулы) для растворения с подходящей основой (например, стерильная апирогенная вода) до парентерального введения восстановленного состава.
Парентеральные лекарственные формы и также включают водные растворы, которые могут содержать наполнители, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно рН от 3 до 9, еще более предпочтительно рН от 4,5 до 7), но для некоторых видов применения более подходящей лекарственной формой может являться стерильный неводный раствор или сухая форма для использования в сочетании с подходящей основой, такой как стерильная апирогенная вода. Примером формы для парентерального введения являются растворы или взвеси в стерильных водных растворах, например, водные растворы пропиленгликоля или декстрозы. Такие лекарственные формы при необходимости могут быть буферными. Другие подходящие лекарственные формы для парентерального введения могут включать те, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме или в липосомальном препарате. Лекарственные формы для парентерального введения могут быть выполнены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Лекарственные формы с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.
Например, в одном из аспектов стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения антитела к PD-L1 в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей фильтрационной стерилизацией. Обычно дисперсии получают введением активного соединения в стерильный растворитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов, способы получения представляют собой сушку вымораживанием (лиофилизацию) , которая дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, применением материалов покрытия, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть осуществлено путем включения в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, моностеараты и желатин, и/или путем покрытий с модифицированным высвобождением (например, покрытий с медленным высвобождением) .
Антитело к PD-L1 по данному изобретению могут также вводиться интраназально или ингаляционно, обычно в форме сухого порошка (самостоятельно, в виде смеси или в виде частиц со смешанными компонентами, например, смешанными с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем) из ингалятора с сухим порошком, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель (предпочтительно распылитель, в котором использован принцип электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана) или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель .
Контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель или небулайзер обычно содержит раствор или суспензию связывающей молекулы по данному изобретению, включая, например, подходящее вещество для диспергирования, растворения или продления высвобождения активного вещества, пропеллент в качестве растворителя .
До использования в виде сухого порошка или суспензии, лекарственный препарат обычно микронизируют до размера подходящего для доставки путем ингаляции (обычно менее 5 микрон) . Этого можно достичь любым подходящим способом измельчения, таким как размол на спиральной струйной мельнице, размол на струйной мельнице с кипящим слоем, сверхкритическая очистка жидкости для формирования наночастиц, гомогенизация высоким давлением или распылительная сушка.
Капсулы, блистеры и картриджи для использования в ингаляторе или инсуфляторе могут выполнены так, чтобы содержать порошковую смесь соединения по данному изобретению, подходящей порошковой основы и модификатор активности.
Подходящая формула раствора для использования в распылителе, в котором использован принцип электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана, может содержать подходящую дозу антитела к PD-L1 по данному изобретению на одно нажатие, и объем на нажатие может варьироваться, например, от 1 мкл до 200 мкл, более предпочтительно от 1 мкл до 100 мкл .
В лекарственные формы по данному изобретения, предназначенные для ингаляции/интраназального введения, могут быть добавлены подходящие ароматизаторы, такие как ментол и левоментол, или подсластители, такие как сахарин или натрия сахарин .
Лекарственные формы для парентерального введения могут быть выполнены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Лекарственные формы с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.
В случае порошковых ингаляторов и аэрозолей, единица дозирования устанавливается посредством клапана, который доставляет отмеренное количество. Единицы в соответствии с данным изобретением обычно устанавливают для введения отмеренной дозы или «впрыска» связывающей молекулы по данному изобретению. Общая суточная доза будет обычно вводиться в виде однократной дозы или еще чаще - в виде разделенных доз в течение суток.
Антитело к PD-L1 по данному изобретению также могут быть выполнены в лекарственной форме для перорального введения. Пероральное введение может включать глотание, так что соединение поступает в желудочно-кишечный тракт и/или буккально, лингвально или сублингвально поступает в кровоток непосредственно из полости рта.
Лекарственные формы, пригодные для перорального введения, включают твердые, полутвердые и жидкие системы, такие как таблетки; мягкие или твердые капсулы, содержащие мульти- или наночастицы, жидкости или порошки; пастилки (включая заполненные жидкостью) ; жевательные формы; гели; быстро растворимые лекарственные формы; пленки; суппозитории; спреи; и щечные/мукоадгезивные пластыри .
Жидкие лекарственные формы включают суспензии, растворы, сиропы и эликсиры. Такие лекарственные формы могут быть использованы как наполнители в мягких или жестких капсулах (например, из желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы) и обычно содержат носитель, например, воду, этанол, полиэтиленгликоль , пропиленгликоль , метилцеллюлозу или подходящее масло и один или более эмульгаторов и/или суспендирующих агентов. Жидкие лекарственные формы могут быть также изготовлены путем восстановления твердого вещества, например, из саше. Терапевтическое применение антитела к PD-L1 по данному изобретению
В одном аспекте антитело к PD-L1 по данному изобретению применяется в лечении заболеваний и нарушений, которые связаны с активностью PD-L1, например заболевание или нарушение выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи) , рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы) , КРР (колоректальный рак) , гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого) , рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР (Колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью) .
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопи ающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола и любого возраста.
В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела (например, антитела или фрагмента антитела, которое специфически связывает к PD-L1) может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками периферических органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных расстройством. Антитело или фрагмент антитела может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая продолжительность жизни, время до прогрессирования заболевания (ТТР) , частоту ответа опухоли на лечение (RR) , продолжительность ответа и/или качество жизни. Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относящиеся антителу к PD-L1 с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, ссылаются или включают:
1) одновременное введение такой комбинации антитела к PD- L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
2) одновременное введение такой комбинации антитела к PD- L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
3) последовательное введение такой комбинации антитела к PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также
4) последовательное введение такой комбинации антитела к PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями. Антитело к PD-L1 по данному изобретению могут назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение антителом к PD-L1 по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия) . В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело к PD-L1 может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для лечения рака .
Термин "цитотоксическое средство" в используемом в настоящем описании смысле относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu) , химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты.
"Химиотерапевтическим средством" является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®) ; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон) ; дельта-9- тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARIN0L®) ; бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®) , СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®) , ацетилкамптотецин, скополектин и 9- аминокамптотецин) ; бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин) ; подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, риптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, б-диазо-5-оксо-Ъ-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, доксорубициноНС1 в инъецируемых липосомах (DOXOL®) , липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®) , пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин) , эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®) , тегафур (UFTORAL®) , капецитабин (XELODA®) , эпотилон и
5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрекса ; аналоги пурина, такие как флударабин, б-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин,
6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2- этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"- трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин) ; уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("ага-С"); тиотепа; таксоид, например паклитаксел
(TAX0L®) , препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел
(TAXOTERE®) ; хлорамбуцил; б-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN®) , винкристин
(ONCOVIN®) , виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин
(NAVELBINE®) ; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин
(DMF0) ; ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен ( TARGRETIN®) ; бифосфонаты, такие как клодронат
(например, BONEFOS® или 0STAC®) , этидронат (DIDROCAL®) , NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат
(F0SAMAX®) , памидронат (AREDIA®) , тилудронат (SKELID®) или ризендронат (ACTONEL®) ; троксацитабин ( 1 , 3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина) ; антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R) ; вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®) ; rmRH
(например, ABARELIX®) ; BAY439006 (сорафениб; Bayer) ; SU-11248
(Pfizer) ; перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб) , ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб
(VELCADE®) ; CCI-779; типифарниб (811577); орафениб, АВТ510; ингибитор Вс1-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®) ; пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже); ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.
Также в указанное определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX®) , 4- гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON®) ; идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®) , триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена
(SERM) , такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена
(ER) , ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER) ; ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан
(AROMAS IN®) , и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®) , летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVIS0R®) , ацетат мегестрола (MEGASE®) , фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг- гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®) , гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD) ; антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.
Другими терапевтическими средствами, которые могут применяться в комбинации с антителами против PD-L1 согласно изобретению могут быть ингибиторы функции фактора роста, например, такие ингибиторы включают антитела фактора роста и антитела рецептора фактора роста (например, анти-егЬВ2 антитело трастузумаб [Herceptin] , анти-EGFR антитело панитумумаб, анти- erbBl антитело цетуксимаб [Erbitux, С225] и любые антитела факторов роста или рецепторов фактора роста, раскрытые Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, ppll-29); антиангиогенные агенты, такие как ингибирующие эффекты сосудистого эндотелиального фактора роста, [например, антитело против фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток бевацизумаб (Avastin) ] , антитела против рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста, такие как анти-KDR антитела и анти-fltl антитела; антисмысловые терапии, например, направленные на вышеперечисленные мишени, такие как ISIS 2503, анти-ras антисмысловые средства или G3139 (Genasense) , анти-Ьс12 антисмысловые средства; подходами генной терапии, включая, например, подходы с заменой аберрантных генов, таких как аберрантный р53 или аберрантный BRCA1 или BRCA2 , GDEPT (ген- направленная ферментная пролекарственная терапия) подходы с использованием цитозиндеаминазы, тимидинкиназы или фермента бактериальной нитроредуктазы, и подходы, направленные на повышение толерантности пациента к химиотерапии или лучевой терапии, такие как генная терапия мультилекарственной резистентности; иммунотерапевтические подходы, включая, например, лечение Алемтузумабом (campath-lH) , моноклональным антителом, направленным на CD52, или лечение антителами, направленными на CD22, ex vivo и in vivo подходы по повышению иммуногенности опухолевых клеток пациента, трансфекцию цитокинами, такими как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор, подходы, направленные на снижение анергии Т-клеток, такие как лечение моноклональными антителами, ингибирующими функцию CTLA-4, подходы с использованием трансфицированных иммунных клеток, таких как цитокин-трансфицированные дендритные клетки, подходы с использованием цитокин-трансфицированных опухолевых клеточных линий и подходы, использующие анти-идиотипические антитела, адаптивный перенос Т-клеток с использованием Т-клеток, подвергнутых неспецифической активации или нацеленных на конкретный антиген, представляющий интерес, ex vivo; ингибиторы деградации белка, такие как ингибитор протеасом, такой как Велкаде (бортезомид) ; биотерапевтические терапевтические подходы, например, использующие пептиды или белки (такие как антитела или растворимые конструкты внешних рецепторных доменов), которые секвестируют рецепторы лигандов, блокируют связывание лиганда с рецептором или ослабляют сигнализацию рецептора (например, вследствие повышенной деградации рецептора или сниженных уровней экспрессии) .
Дозы и пути введения
Антитело к PD-L1 по данному изобретению будут вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение антитела к PD-L1 самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных анти-аутоиммунных или противовоспалительных методов лечения.
Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (Ь) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.
Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.
Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело к PD-L1. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.
Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.
Предполагается, что подходящая доза антитела к PD-L1 по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Антитело к PD-L1 может быть введена, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.
Изделие (продукты) и наборы
Следующим вариант осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения рака, в частности ПРГШ, рака шейки матки, рака без выявленного первоисточника, глиобластомы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, НМРЛ, рака почки, рака яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковке, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций) . По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело к PD-L1, предлагаемое в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту.
Листовка-вкладыш в упаковке содержит обычные инструкции, которые включают в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, в том числе примерную информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения рака, в частности ПРГШ, рака шейки матки, рака без выявленного первоисточника, глиобластомы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, НМРЛ, рака почки, рака яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР.
Кроме того, изделие может дополнительно содержать второй контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ) , забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей, например, для детектирования PD- L1 в тканях, клетках или жидкостях организма млекопитающего. Такой набор будет пригодным для скрининга ассоциированных с PD- L1 болезней. Набор включает специфический связывающий агент или антитело по изобретению и средства, указывающие на протекание реакции специфического связывающего агента или антитела с PD- L1, в случае его присутствия. В одном варианте воплощения антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном варианте воплощения антитело, связывающее PD-L1, является меченым. В другом варианте воплощения антитело представляет собой немеченое первичное антитело, и набор дополнительно включает средства детектирования первичного антитела. В одном варианте воплощения средства детектирования включают меченое второе антитело, представляющее собой анти-иммуноглобулин. Антитело может быть меченым с помощью маркера, выбранного из группы, состоящей из флуорохрома, фермента, радионуклида и радионепрозрачного материала. Набор может представлять собой набор, который содержит антитела для выявления и количественной оценки PD-L1 in vitro, например при осуществлении ELISA или Вестерн-блоттинга . Также, как и в случае изделия, набор содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковке, расположенные на поверхности или внутри контейнера. Контейнер содержит композицию, которая включает по меньшей мере одно антитело к PD-L1, предлагаемое в изобретении. Дополнительные контейнеры могут содержать, например разбавители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке могут содержать описание композиции, а также инструкции по их применению in vitro или для целей диагностики.
Диагностическое использование и композиции
Антитело к PD-L1 по настоящему изобретению также используются в диагностических процессах (например, in vitro, ex vivo) . Например, антитело к PD-L1 может использоваться для обнаружения или измерения уровня PD-L1 в образцах, полученных от пациента (например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкость кишечника, слюна или моча) . Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) , хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология . Изобретение далее включает наборы (например, диагностические наборы), содержащие антитела к PD-L1, описанные в данном документе.
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения .
Примеры
Пример 1.
Продукция рекомбинантных антигенов и антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих
Антитела и антигены продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СНО-К1), согласно опубликованным протоколам [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91 ( 6) : 670-677 , Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun; 28 ( 11 ) : 843-848 ; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84(3) :332-342]. Использовали клетки, конститутивно экспрессирующие ген белка EBNA1 (Epstein-Barrvirus nuclear antigen 1) . Суспензионное культивирование осуществляли в колбах на орбитальном шейкере, с использованием бессывороточных сред производства компании Life Technologies Corporation и согласно инструкциям производителя. Для транзиентной экспрессии клетки в концентрации 2*106/мл трансфецировали с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ «МАХ», компания «Polysciences») . Соотношение ДНК/ПЭИ составляло 1:3/1:10. Через 5-7 дней после трансфекции культуральную среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии.
Рекомбинантный белок PD-L1, содержащий EPEA-tag (glutamic acid-proline-glutamic acid-alanine ) на С-конце белка, выделяли и очищали из культуральной жидкости, используя сорбент CaptureSelect C-tag Affinity Matrix. Культуральную жидкость пропускали через хроматографическую колонку, предварительно заполненную 5 мл C-tag сорбента, затем промывали колонку 25 мл ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающиеся компоненты. Связанный антиген элюировали в мягких условиях, используя 20тМ Tris, 2М МдС12 рН7,0-7,4. Далее белок переводили в ФСБ (рН 7,4) с помощью диализа, используя полупроницаемую диализную мембрану, фильтровали (0,22 мкм) , переносили в пробирки и хранили при - 70°С.
Рекомбинантные белки PD-1 и PD-Ll-Fc из культуральной жидкости выделяли и очищали, используя колонку для аффинной хроматографии протеин А. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку HiTrap rProtein A Sepharose FF объемом 5 мл (GE Healthcare) , уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН 7,4) . Затем колонку промывали 5 колоночными объемами ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антиген элюировали, используя 0, 1 М глициновый буфер рН 3. Главный протеиновый пик элюции собирали и доводили его рН до нейтральности с помощью 1 М буфера Tris (рН 8) . Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (рН 7,4) с помощью диализа, используя технологию SnakeSkin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм), переносили в пробирки и хранили при -70 °С.
Антитела IgGl очищали на колонке Hi Trap rProteinA FF объемом 1 мл (GE Healthcare) согласно методике, описанной выше для антигенов. Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза (фиг. 4А и 4Б) .
Пример 2.
Создание наивной Fab-библиотеки человеческих антител MeganLibTM
Суммарную РНК В-лимфоцитов из индивидуальных образцов крови более тысячи человеческих доноров выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно предлагаемому протоколу (от QIAGEN) . Концентрацию РНК определяли с помощью набора Nanovue (от GE Healthcare) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit (от Evrogen) согласно рекомендуемому протоколу с использованием обратной транскриптазы MMuLV и рандом-гексамерных олигонуклеотидов в качестве затравки.
Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции для получения генов вариабельных доменов, фланкированных сайтами рестрикции, с использованием набора олигонуклеотидов по протоколам авторов [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26) : 18218- 30] .
Полученный ДНК препарат VL-CK-VH (фиг. 1) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI/Eco91I и лигировали в оригинальную фагмиду рН5 (фиг. 2) . Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки штамма SS320, приготовленные согласно протоколам [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63.]. Репертуар комбинаторной фаговой Fab-дисплейной библиотеки MeganLibTM составлял 1011 трансформантов. Препараты фага Fab-библиотек готовили согласно процедуре, описанной ранее [ J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97].
Пример 3.
Селекция Fab-библиотек фаговых антител
Специфичные фаговые Fab-антитела человека против PD-L1 получали из комбинаторной фаговой Fab-дисплейной библиотеки MeganLibTM. Селекцию проводили на PD-L1 человека методом фагового дисплея [Nat Biotechnol . 1996 Mar; 14 ( 3 ) : 309- 14 ; J Mol Biol.1991 Dec 5; 222(3) : 581-97], но с использованием магнитных частиц и прибора KingFisher Flex, так как использование данной методики позволяет проводить параллельно до 96 различных схем и вариантов биопэннинга.
В селекции методом биопэннинга биотинилированный PD-Ll-Fc в концентрации 10 мкг/мл иммобилизовали на поверхности стрептавидиновых магнитных частиц, инкубировав белок с частицами в течение 1 часа при комнатной температуре на ротаторе. Далее частицы отмывали ФСБ (рН 7,4), затем блокировали частицы раствором 2% обезжиренного молока на ФСБ (рН 7,4) в течение 1 часа. Затем добавляли к магнитным частицам со связанным антигеном раствор фагов в ФСБ (рН 7,4) с 2% обезжиренным молоком, концентрация фаговых частиц составляла 2, 5*1012 на мл. Инкубировали данную смесь в течение 40 мин при перемешивании. Несвязавшиеся фаги удаляли в ходе нескольких отмывок магнитных частиц раствором ФСБ (рН 7,4) с 0,1% Твин 20. Количество отмывок увеличивали от раунда к раунду (на 1-ом раунде 10 отмывок, на 2- ом - 20 и на 3-ем - 30) . Фаги, связавшиеся с антигеном на поверхности магнитных частиц, элюировали с частиц 100 мМ раствором Gly-HCl (рН 2,2) в течение 15 мин при перемешивании, после элюции нейтрализовали раствор 1М TRIS-HC1 (рН 7.6) . Бактерии штамма Е. coli TGI инфицировали полученными фагами, нарабатывали в них фаги, выделяли их и использовали в следующем раунде селекции. После двух-трех раундов из фагов выделяли их ДНК (фагмиды) , и гены вариабельных доменов антител клонировали в экспрессионные вектора (Фиг. 3) для наработки Fab в клетках Е . coli .
Пример 4.
Скрининг Fab, специфически связывающих PD-L1 человека ИФА (ELISA) использовали для поиска Fab, связывающих PD-L1 человека. В качестве позитивного контроля использовали Fab с опубликованной последовательностью Atezolizumab (Genentech) . Для анализа специфического связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл PD-L1-FE (0,2 мкг/мл в 1χ карбонатном буфере), герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan) . Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ) . Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре. После отмывок ФСБ-Твином добавляли по 50 мкл на лунку тестируемого клеточного супернатанта, содержащего исследуемый Fab, смешанного с равным объемом ВВ. Планшеты снова инкубировали, встряхивая, один час при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) анти-человеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-ThermoScientific) в соотношении 1:5000 в ФСБ-Твин. Планшеты встряхивали на ротационном шейкере (50 мин, комнатная температура) и промывали три раза буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин) , затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота) . Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет- ридер Tecan-Sunrise (от Тесап) . Степень связывания антитела была пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, у которых цветовой сигнал превышал сигнал от контрольного антитела, проверяли в ИФА на неспецифическое связывание.
Пример 5.
Анализ неспецифического связывания отобранных Fab с другими антигенами
ИФА (ELISA) использовали также анализа неспецифического связывания исследуемых Fab-фрагментов с другими антигенами. Исследование проводили, как описано выше, но в качестве антигенов для иммобилизации использовали IL6R-Fc, INFa2b, PCSK9- VG-FE, PD-1-Fc (2,5 мкг/мл в 1χ карбонатном буфере) . В качестве контроля специфического связывания использовали PD-Ll-Fc (0,2 мкг/мл в 1χ карбонатном буфере) . Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Тесап Freedom EVO 200 (от Тесап) . Клоны, у которых цветовой сигнал неспецифического связывания не превышал сигнал от специфического связывания, проверяли в конкурентном ИФА анализе для выявления антагонистических Fab, блокирующих взаимодействие лиганда и рецептора.
Пример б .
Конкурентный ИФА анализ блокирования взаимодействия PD-L1 с его рецептором PD-1
Конкурентный ИФА (ELISA) использовали для проверки отобранных ранее специфичных Fab против PD-L1 человека на способность блокировать взаимодействие с рецептором PD-1. В качестве позитивного контроля антагониста использовали Fab с опубликованной последовательностью Atezolizumab (Genentech) .
PD-1-Fc иммобилизовали в лунках планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) по 50 мкл с концентрацией 1 мкг/мл в 1 карбонатном буфере и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартным ИФА протоколам с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan) . Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ) . Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре .
Параллельно в несорбирующих планшетах смешивали в соотношении 1:1 клеточный супернатант, содержащий тестируемый Fab и PD-Ll-Fc (в конечной концентрации 2 мкг/мл в ФСБ-Твин) , инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре и шейкинге при 500 об/мин.
После отмывок от ВВ планшета, содержащего PD-1 рецептор, туда переносили смесь Fab и PD-L1, инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре и шейкинге при 500 об/мин. После чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин, добавляли по 50 мкл/лунку анти-человеческого Fab HRP- конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-
ThermoScienti fic) в соотношении 1:5000 в ФСБ-Твин. Инкубировали 45 мин при комнатной температуре и встряхивании 500 об. /мин., после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин) , затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота) . Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет- ридер Tecan-Sunrise (от Tecan) . Степень связывания Fab была обратно пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, показавшие блокирование на уровне контрольного Fab антитела Atezolizumab, отмечали как позитивные и использовали в дальнейших анализах. Гены вариабельных доменов позитивных клонов секвенировали, согласно стандартным протоколам на аппарате Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) и анализировали .
Пример 7.
Сравнительный скрининг анти-PD-Ll Fab кандидатов человека по koff
Koff-скрининг производили с использованием прибора Pall Forte Bio Octet Red 96. Анти FABCHl-биосенсоры в течение 30 минут регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ ФСБ, рН 7.2- 7.4, 0.1% Твин-20, 0,1% БСА. В исследуемые образцы супернатантов Е. coli добавляли рабочий буфер до конечной концентрации 1*. Затем анти FABCHl -биосенсоры погружали в супернатанты Е. coli, содержащие Fab-фрагменты кандидатов антител, на 12 часов при 4°С. Сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab фрагментами переносили в лунки с рабочим буфером, где прописывали базовую линию (60 с.) . Далее сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (PD-L1, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген-антитело (300 с.) . Затем сенсоры возвращали в лунки, содержащие рабочий буфер, для последующей стадии диссоциации (600 с.) . После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (Gly-HCl, рН 1,7) после чего использовали в следующем эксперименте . Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре по модели взаимодействия 1:1.
Пример 8.
Иммуноферментный анализ взаимодействия анти-PD-Ll антитела с PD-L1 и другими антигенами
ИФА (ELISA) использовали для измерения сравнительной аффинности антител к PD-L1 и другим антигенам. Для анализа связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл PD-Ll-Fc, fPCSK9-EPEA, Ang2-H6F, GM-CSF- FE, CD3-ED-Fc, IL17a, CD38-Fc, IL6R-Fc (1 мкг/мл в 1χ карбонатном буфере) , герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному ИФА протоколу. Для блокирования неспецифического связывания добавляли буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ) . Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре. После отмывок ФСБ-Твином добавляли по 50 мкл на лунку тестируемого антитела BCD- 135 в концентрации от 5 мкг/мл в ФСБ-Твин. Планшеты снова инкубировали, встряхивая, один час при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) анти-человеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-ThermoScientific) в соотношении 1:5000 в ФСБ-Твин. Планшеты встряхивали на ротационном шейкере (50 мин, комнатная температура) и промывали три раза буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота) . Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет- ридер Tecan-Sunrise (от Тесап) . Степень связывания антитела была пропорциональна продуцированию цветового сигнала (фиг. 5) . Анти- PD-L1 антитело специфически связывалось с PD-L1 и не связывалось с другими исследуемыми антигенами.
Пример 9.
Реактивация NFAT-сигналинга анти-PD-Ll антителами в репортерной клеточной линии Jurkat-NFAT-PD- 1
Проводили инжиниринг человеческой линии Т-клеточного происхождения Jurkat путем внедрения в ее геном двух генетических конструкций. Одна конструкция кодировала ген рецептора PD-1 человека. Вторая конструкция кодировала ген люциферазы, находящийся под контролем NFAT-чувствительного генетического элемента. В результате получали репортерную клеточную линию Jurkat-NFAT-PD-1 , которая экспрессировала на поверхностной мембране рецептор PD-1 и содержала NFAT-зависимый промотор, который направлял транскрипцию гена люциферазы. Синтез фермента люциферазы в клетках этой линии пропорционален уровню активности NFAT, которая, в свою очередь, отражала общий уровень активации Т-лимфоцита.
Анализ активности анти-PD-Ll антител с помощью этой клеточной линии осуществляли следующим образом: активация TCR- рецепторов с помощью анти-СОЗ и анти-СБ28 антител запускала внутриклеточный каскад, в результате которого активировался NFAT-промотор. PD-L1 представлен на поверхности клеток MDA-MB- 231, активированных интерфероном. Взаимодействие PD-L1 с PD-1 ингибировало передачу сигнала с TCR-рецепторов на NFAT-промотор. Антитела анти-PD-Ll разобщали взаимодействие PD-L1-PD-1 и происходила реактивация внутриклеточной сигнализации.
Клетки MDA-MB-231 активировали на продукцию PD-L1 раствором интерферона гамма, для этого за 72 ч до анализа к клеточной суспензии добавляли интерферон гамма до концентрации 20 нг/мл, затем сеяли клетки в 9б-луночные культуральные планшеты из расчета 10000 кл/лунку.
Через 72 часа активации удаляли среду роста из планшетов с клетками MDA-MB-231 и добавляли к ним разведения анализируемых антител, контрольного антитела и изотипического контроля в среде роста клеток от 10 мкг/мл до 0,001 мкг/мл, инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.
Далее добавляли в каждую лунку суспензию клеток Jurkat- NFAT-PD-1 и раствор активирующих антител aCD3/aCD28/a-mouseIgG. Ставили планшет в СОг инкубатор на 6 часов.
Заранее подготовленный субстрат к люциферазе Bio-Glo Luciferase assay system (Promega) добавляли из расчета V клеток/V субстрата. Измеряли уровень люминесценции на Fluoroscan Ascent (фиг. б) . Анти-PD-Ll антитела реактивировали уровень люминесценции в репортерной линии Jurkat-PD-1-NFAT .
Пример 10.
Анализ взаимодействий анти-PD-Ll антитела с FcRn and Fcy- рецепторами при помощи Octet RED 96 Для анализа взаимодействия антител с рецепторами FcgRIIIaV, FcgRIa, FcRn использовали прибор Fortebio Octet RED96. Использовали рецепторы, биотинилированные по С-концу, и покрытые стрептавидином биосенсоры (SA-Streptavidin) .
Биотинилированные рецепторы иммобилизовали на поверхности сенсоров. Далее проводили стадию ассоциации: сенсоры со связанным антигеном погружали в растворы антитела с различной концентрацией (подготовили заранее серию разведений антитела в рабочем буфере и поместили в соответствующие лунки 96-луночного планшета) . После этого проводили стадию диссоциации: сенсоры из раствора антитела перемещали в лунки с рабочим буфером.
Для оценки константы аффинности антитела к FcgRIIIaV, и FcgRIa использовали фосфатный буфер РН7.4, для FcRn - фосфатный буфер РН6.0.
Анализ полученных кривых проводили используя программное обеспечение прибора Forte Bio Data Analysis 8.2 и модели связывания 1:1. Результаты представлены на фиг. 7. Не детектировали связывания с Fcg-рецепторами модифицированного антитела IgGl в сравнении с вариантом дикого типа, что предполагало отсутствие эффекторных функций анализируемого антитела. Константа аффинности к FcRn анализируемого анти-PD-Ll антитела составляла 1.69Е-08 1/М.
Пример 11.
Иммуноферментный анализ взаимодействий анти-PD-Ll антитела с PD-L1 разных организмов
ИФА (ELISA) использовали для измерения сравнительной аффинности антител к PD-L1 разных организмов. Для анализа связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл PD-Ll-Fc человека, циномолгуса, мыши, крысы, собаки, кролика, (0,5 мкг/мл в 1χ карбонатном буфере) , герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному ИФА протоколу, описанному выше. Анти-PD-Ll антитело специфически связывалось с PD-L1 человека и обезьяны циномолгус и не связывалось с другими исследуемыми рецепторами (фиг. 8) . Пример 12.
Анализ взаимодействий анти-PD-Ll антител с PD-L1 человека и циномолгуса на приборе Octet RED 96
Константы аффинности связывания антитела с PD-L1 человека и циномолгуса измеряли с помощью прибора OctetRed 96 (от ForteBio) . Антитело BCD-135 в концентрации 30 мкг/мл неспецифически иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30°С с использованием PBS, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% BSA в качестве рабочего буфера. Анализировали связывание растворов PD-L1 человека и обезьяны со связанным на сенсоре антителом в рабочем буфере с концентрацией антигенов от 10 мкг/мл до 1 мкг/мл.
Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Анти-PD-Ll антитело специфически и аффинно связывается с антигеном PD-L1 человека и обезьяны циномолгус (фиг. 9) с константами <1.0Е-12 и 5.55Е-10 1\М, соответственно.
Пример 13.
Определение стабильности анти-PD-Ll антитела
Конформационную стабильность BCD-135 оценивали по точке агрегации белка методом динамического светорассеяния (DLS) . Определение точки агрегации исследуемых белков (1 мг/мл) осуществляли на приборе Zetasizer Nano ZSP. Для этого 0.5 мл раствора помещали в кварцевую обеспыленную кювету, которую постепенно нагревали от 50 °С до 90 °С в установке при постоянном измерении интенсивности рассеянного света. Антитело BCD-135 демонстрировало высокую конформационную стабильность в 20 мМ ацетатном буфере, точка плавления более 80°С (фиг. 10) .
Коллоидную стабильность кандидатов оценивали методом ПЭГ агрегации белка. Для эксперимента использовали образцы с концентрацией белка 5 мг/мл. В планшеты для УФ-спектрофотометрии переносили расчетное количество образца, раствора плацебо и раствора ПЭГ 6000. Все полученные в лунках растворы хорошо перемешивали, пипетируя. После этого оценивали степень мутности растворов визуально, а также измеряли оптическую плотность растворов при λ = 320 нм. Антитело BCD-135 демонстрировало высокую коллоидную стабильность (фиг. 11) .
Термическую стабильность антитела оценивали методом термостресса при 50 °С в течение 48 ч в трех разных буферах: 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,0 (фиг. 12А) , 20 мМ ацетатном буфере при рН 5,0 (фиг. 12Б) и 20 мМ гистидиновом буфере рН 5,5 (фиг. 12В) . Контроль гомогенности проводили методом ГФ ВЭЖХ (SEC HPLC) .
Figure imgf000114_0001
Исследуемые образцы в концентрации белка ~ 5 мг/мл разделяли на 2 части и помещали в отдельные пробирки: по 1 пробирке на каждый состав откладывали в холодильник на хранение при 4°С, остальные устанавливали в термостат и инкубировали при 50°С в течение 72 часов. После окончания прогрева пробирки убирали из термостата и передавали на анализ (на рисунках 12А, 12Б и 12В красным обозначен контроль, хранившийся на +4, синим - образец после термостресса) . Анти-PD-Ll антитело демонстрировало высокую термическую стабильность во всех трех буферах (разница между содержанием агрегатов в растворе до термостресса и после составила не более 5%) :
Также оценивали стабильность BCD-135 в нормальной сыворотке крови человека в течение 7 дней при 37С. Для этого рекомбинантный PDL1 (по 100 мкл, 2,5 мкг/мл в 1χ карбонатном буфере) вносили в лунки 96-ти луночного ИФА планшета высокой сорбции. Инкубировали при 4°С в течение 18 ч. Далее содержимое лунок удаляли и вносили туда блокирующий буфер (200 мкл 0,5% нежирного молока в ТБСТ) . Планшеты инкубировали при температуре 37° С в течение 30 мин, после чего промывали 2 раза раствором ТБСТ.
В лунки первого вертикального ряда вносили по 100 мкл растворов для построения калибровочного графика, содержащих BCD- 135 в концентрации 0; 7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125,0; 250,0 нг/мл, разведенных в блокирующем буфере.
Планшеты инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С, далее планшеты 3 раза промывали раствором ТБСТ. После этого вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора конъюгата поликлональных антител козы к Fc фрагменту IgG человека с пероксидазой хрена. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С. Далее планшеты 4-5 раз промывали раствором ТБСТ. В отмытые и осушенные лунки вносили по 100 мкл раствора ТМБ для развития окраски. Планшеты помещали в защищенное от света место и инкубировали при температуре 22 °С в течение 20 - 25 мин для развития окраски. Реакцию останавливали, добавляя в лунки по 50 мкл стопового раствора 0,9М серной кислоты. Оптическую плотность раствора в лунках измеряли на микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм.
На основании полученных данных строили калибровочную кривую (фиг. 13А) , отражающую зависимость оптической плотности от концентрации добавленного в лунку BCD-135. Для построения кривой используют среднее арифметическое значение оптической плотности растворов. На основании калибровочной кривой, находили значение концентрации BCD-135 в образце, соответствующее полученным в эксперименте значениям оптической плотности.
По итогам исследования через 7 дней хранения при 37 °С в сыворотке человека определяемая концентрация BCD-135 достоверно не отличалась от концентрации, определяемой в образцах сыворотки, приготовленных непосредственно перед анализом (фиг. 13Б) , что свидетельствовало о стабильности антитела.
Пример 14.
Конструирование библиотеки BCD-135 мутантных антител, специфичных к PD-L1. Для создания BCD-135 мутантных антител, специфичных к PD- L1, был проведен структурный анализ на основе 3D моделирования с использованием программного пакета YLab компании БИОКАД и модели PD-L1 (PDB 4ZQK, PDB 4Z18) (см. также Пример 18) . На основе расчетный моделей были синтезированы библиотеки генов BCD-135, имеющие частично вырожденные кодоны ( FUH G ЕТ AL . ) , Improving antibody binding affinity and specificity for therapeutic development, Methods Mol Biol., 2009, 525, 353-376) в позициях в первом и третьем CDR регионах вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO : 4 и третьем CDR вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO : 8. Полученная ДНК рандомизированного гена была клонирована в фаговую дисплейную плазмиду рН5 (Фиг.2), согласно протоколу описанному в Примере 2. Трансформация, указанных конструкций в штамм SS320 дала на выходе от 5*10е7 независимых трансформантов для библиотеки, согласно процедуре [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63] . Препараты фага мутантных VH BCD-135 библиотек были приготовлены согласно процедуре, описанной ранее [Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97].
Селекции полученных фаговых мутантных BCD-135 Fab библиотек проводили в условиях аналогичных, описанных выше (Пример 3) .
После третьего раунда селекции описанных выше библиотек на препарате рекомбинантного PD-Ll-Fc человека, проведенный ИФА анализ препаратов поликлонального фага показал значительное обогащение и превышение более 10 раз над фоном неспецифического связывания. Пулы генов из обогащенных фаговых библиотек BCD-135 мутантных Fab антител, специфичных к PD-Ll-Fc человека, были реклонированы в экспрессионную плазмиду pLL (Фиг.З), содержащую myc-tag пептид на С-конце для ELISA детекции.
Пример 15.
Сравнительный ИФА анализ BCD-135 мутантных Fab антител, специфичных к PD-L1
ИФА (ELISA) используют для измерения связывания исследуемых мутантных Fab антител с PD-L1 человека, аналогично описываемому в Примере 4. Количество тестируемых клонов, продуцентов BCD-135 мутантных Fab антител, составило 400 штук. В качестве позитивного контроля использовали дикий вариант BCD-135 Fab антитела с последовательностью SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8.
В результате было отобрано 85 позитивных клонов, давших сигнал выше или аналогичный контрольному дикому BCD- 135 Fab антителу (значения в интервале 0,7-1,2 отн.ед.) .
Пример 1 б .
Характеризация BCD-135 мутантных Fab антител, специфичных против PD-L1
Восемьдесят пять отобранных в результате ИФА скрининга (пример 15) кандидатов позитивных клонов, давших сигнал выше или аналогичный контрольному дикому BCD-135 Fab антителу были секвенированы на секвенаторе Applied Biosystems 3130, согласно протоколам рекомендуемым компанией производителем. В результате было получено 25 уникальных по последовательности клона. Восемь мутантных Fab антитела уникальных клонов были далее проанализированы по количественной характеристике кинетической константы диссоциации на приборе Octet Red 96, согласно Примеру 7.
Koff-скрининг производили с использованием прибора Pall Forte Bio Octet Red 96, аналогично указанному в Примере 7. Анти FABCHl-биосенсоры в течение 30 минут регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ ФСБ, рН 7.2-7.4, 0.1% Твин-20, 0,1% БСА. В исследуемые образцы супернатантов Е. coli добавляли рабочий буфер до конечной концентрации 1χ. Затем анти FABCHl- биосенсоры погружали в супернатанты Е. coli, содержащие Fab- фрагменты кандидатов антител, на 12 часов при 4°С. Сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab - фрагментами переносили в лунки с рабочим буфером, где прописывали базовую линию (60 с.) . Далее сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (PD-L1, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген-антитело (300 с.) . Затем сенсоры возвращали в лунки, содержащие рабочий буфер, для последующей стадии диссоциации (600 с.) . После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (Gly-HCl, рН 1,7) после чего использовали в следующем эксперименте. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре по модели взаимодействия 1:1.
В результате были получены кинетические константы диссоциации мутантных Fab антител, которые продемонстрировали сравнимые характеристики с диким вариантом BCD-135 Fab, и таким образом толерантность до 8% замен по трем CDR вариабельных доменов .
Anti-PDLl VK of BCD-135
BCD-135 VH
10 20 30 40 50 70 80
90 100 110 120
12345678301234567890123456 890123456789012 567890123456783012345678901234567890123 56 789012345678901234567890123 56789012
EVQb ^SGGGVT EGGSbIULSCjyk3GFTFDDYi^SWVRQJLPGRGLEWVa DISWSGSMTNYJUDSVKGEFTISRDKi-K SLYbQMKSb
RftE DTAbYHCARaPbLb AMT FGVGSWGQGTLVWS 3
EVQbVES{-H-H_arVRPGGS:LRbS ^^
RAEDTJU^YHCA^EbiSxXTF^V SWGQGTL SS
BCD-135 VL
10 20 30 40 50 B O 70 80
90 100
12345673901234567830123456 83012345678901234567890123456789012345678901234567890123 56 789012345678 90123456
QT TQEPSbSVSPGGTVTbTCGbSSGTVTAIHYPGWYQQTPGQAPRTLI^
DYYCALYMGNGGHMFGGGTK
QTWTQEFSbSVSEGGTV LTCGbSSGTVTAIHYFGmYQQTF^
DYYCiibY G GKHMFGGGT
Figure imgf000118_0001
Пример 17.
Создание стабильной клеточной линии, продукция и очистка анти-PD-Ll антитела
Стабильную клеточную линию продуцента моноклонального антитела BCD-135 получали путем трансфекции методом электропорации с использованием прибора Neon Transfection System (Life Technologies) родительской суспензионной клеточной линии CH0-S векторными конструкциями, содержащими легкие и тяжелые цепи антитела в оптимизированном соотношении. Клональные линии с высоким уровнем продуктивности (более 1000 мг/л) получали с использованием роботизированной платформы ClonePix (Molecular Devices) и предварительных этапов селекции минипулов с использованием антибиотиков в разных форматах культивирования. Анализ продуктивности проводили с использованием аналитической системы Octet RED96 (Pall Life Sciences) . DOE по подбору базовой среды и схемы культивирования осуществляли на базе автоматизированной системы Biomek FX robotics (Beckman Coulter) . Для культивирования продуцента использовали бессывороточные среды и фидинги, не содержащие белков животного происхождения. Наработку препарата BCD-135 для предклинических исследований проводили в ферментере HyClone single-use bioreactor (Thermo Fisher Scientific) рабочим объемом 50 л.
Осветление культуральной жидкости проводили на глубинном фильтре Millistak C0HC (Merck-Millipore) . Первичную очистку антитела из осветленной КЖ проводили на аффинном сорбенте с белком А. Специфическую элюцию целевого белка проводили в кислых условиях рНЗ.3-3.8 в глициновом буфере. Полученный элюат выдерживали в кислом рН в течение 30-60 минут для вирусной инактивации, а затем нейтрализовали 1М раствором Tris-OH до значения рН 6.5-7.0. Финальую хроматографическую очистку в режиме проскока проводили на сорбенте CaptoAdhere (GE Healthcare LifeSciences ) для удаления остаточных ДНК, белков клеток продуцента, отщепленного лиганда аффинного сорбента, агрегатов и фрагментов антител. Для этого раствор белка пропускали через подготовленный сорбент, в рН 6,5-7,0 при низком значении кондуктивности (<ЗмС/см2) . Очищенный белок подвергали противовирусной фильтрации с использованием набора фильтров Viresolve PRO (Millipore) , концентрированию и диафильтрации против конечного буфера, содержащего ацетатный буфер (рН 5, 0- 5,5) и трегалозу. Концентрация полученного белка составляла 50 мг/мл и более.
Пример 18.
In silico моделирование комплекса BCD-135 антитела и PD-L1 человека .
Для создания BCD-135 мутантных антител, специфичных против PD-L1 был проведен структурный анализ на основе 3D моделирования с использованием программных пакетов Schrodinger Suite компании Schrodinger и пакета YLab компании БИОКАД . В качестве кристаллической структуры мишени была выбрана PDB 5СЗТ, так как она имеет больше кристаллизованных аминокислот, чем классическая структура 4ZQK, в которой упор сделан на PD-1. Докинг осуществлялся с помощью инструмента HEDGE (часть пакета YLab компании БИОКАД) . Выбор оптимальных позиций был проведен с помощью оценки свободной энергии на 10 наносекундном интервале молекулярной динамики (инструмент Desmond, часть пакета Schrodinger Suite) . Визуализация полученной структуры создана с помощью инструмента PyMOL компании Schrodinger. Модель включающая вариабельные домены BCD-135 представлена на Фиг. 14 А, тогда как на рисунке Фиг. 14 Б приведена область взаимодействия антигена и антитела с выделенными аминокислотными остатками, образующими плотный межбелковый контакт.
В таб. В представлены ключевые аминокислотные остатки как антитела, так и антигена, обуславливающие плотны межбелковые взаимодействия .
Табл. В. В среднем столбце представлены аминокислотные остатки BCD-135 антитела, образующие взаимодействие с PD-L1 человека. В правом столбце приведены соответсвующие аминокислотные остатки антигена PD-L1, взаимодействющие с антителом BCD-135.
Figure imgf000121_0001

Claims

Формула изобретения
1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с PD-L1, включающее :
вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 3;
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 7.
2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3.
5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, где вариабельный домен тяжелой цепи, содержит аминокислотные последовательности, представленные последовательностями SEQ ID NO: 1-3.
6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 5-7.
7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. б, где вариабельный домен легкой цепи, содержит аминокислотные последовательности, представленные последовательностями SEQ ID NO: 5-7.
8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 5-7.
9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, где
вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5-7.
10. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
11. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
12. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
13. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
14. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где
вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
15. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающии фрагмент по п. 14, где
вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 ;
вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
16. Моноклональное антитело по п. 1, включающее:
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 9;
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 10.
17. Моноклональное антитело по п. 16, включающее:
тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
18. Моноклональное антитело по любому из п. 1, где антитело, специфичное к PD-L1, представляет собой полноразмерное антитело IgG.
19. Моноклональное антитело по п. 18, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 человека .
20. Моноклональное антитело по п. 19, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgGl человека.
21. Нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-20.
22. Нуклеиновая кислота по п. 21, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
23. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 21-22.
24. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из ππ. 1-20, включающий трансформирование клетки вектором по п.
23.
25. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 21-22.
26. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 25 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
27. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-20, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами .
28. Фармацевтическая композиция по п. 27, предназначенная для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, выбранного из группы: ПРГШ
(плоскоклеточный рак головы и шеи) , рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы) , КРР (колоректальный рак) , гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого) , рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР
(Колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью) .
29. Фармацевтическая комбинация для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-20 и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение.
30. Фармацевтическая комбинация по п. 29, предназначенная для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, выбранного из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи) , рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы) , КРР (колоректальный рак) , гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (Немелкоклеточный рак легкого) , рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР (Колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью) .
31. Фармацевтическая комбинация по пп. 29-30, где терапевтически активное противоопухолевое соединение выбирают из химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.
32. Способ ингибирования биологической активности PD-L1 у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20.
33. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-20 или фармацевтической композиции по п. 27 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого PD- L1.
34. Применение по п. 33, где заболевание или нарушение выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи) , рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ
(трижды негативный рак молочной железы) , КРР (колоректальный рак) , гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ
(Немелкоклеточный рак легкого) , рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР (Колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью) .
PCT/RU2018/050039 2017-04-17 2018-04-11 Моноклональное антитело к pd-l1 WO2018194496A2 (ru)

Priority Applications (16)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201880040390.1A CN111247166B (zh) 2017-04-17 2018-04-11 针对pd-l1的单克隆抗体
KR1020197033829A KR20190140979A (ko) 2017-04-17 2018-04-11 Pd-l1에 대한 단일클론 항체
BR112019021781A BR112019021781A2 (pt) 2017-04-17 2018-04-11 anticorpo monoclonal, célula hospedeira, método para produzir anticorpo, composição farmacêutica, combinação farmacêutica, método para inibir a atividade biológica e método de utilização do anticorpo
JP2020506702A JP2020516323A (ja) 2017-04-17 2018-04-11 抗ｐｄ−ｌ１モノクローナル抗体
AU2018255132A AU2018255132A1 (en) 2017-04-17 2018-04-11 Monoclonal antibody to PD-L1
PE2019002020A PE20191786A1 (es) 2017-04-17 2018-04-11 Anticuerpo monoclonal para pd-l1
MA47221A MA47221A1 (fr) 2017-04-17 2018-04-11 Anticorps monoclonal à pd-l1
US16/605,865 US11236167B2 (en) 2017-04-17 2018-04-11 Monoclonal antibody to PD-L1
CA3060395A CA3060395A1 (en) 2017-04-17 2018-04-11 Monoclonal antibody to pd-l1
EA201992206A EA201992206A1 (ru) 2017-04-17 2018-04-11 Моноклональное антитело к pd-l1
EP18786945.8A EP3613770A4 (en) 2017-04-17 2018-04-11 MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST PD-L1
NZ758093A NZ758093A (en) 2017-04-17 2018-04-11 Monoclonal antibody to pd-l1
PH12019502298A PH12019502298A1 (en) 2017-04-17 2019-10-07 Monoclonal antibody to pd-l1
CONC2019/0011458A CO2019011458A2 (es) 2017-04-17 2019-10-16 Anticuerpo monoclonal para pd-l1
ZA2019/07065A ZA201907065B (en) 2017-04-17 2019-10-25 Monoclonal antibody to pd-l1
JP2023031932A JP2023081942A (ja) 2017-04-17 2023-03-02 抗ｐｄ－ｌ１モノクローナル抗体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017113141 2017-04-17
RU2017113141A RU2665790C1 (ru) 2017-04-17 2017-04-17 Моноклональное антитело к pd-l1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2018194496A2 true WO2018194496A2 (ru) 2018-10-25
WO2018194496A3 WO2018194496A3 (ru) 2019-01-10

Family

ID=63459922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/050039 WO2018194496A2 (ru) 2017-04-17 2018-04-11 Моноклональное антитело к pd-l1

Country Status (21)

Country Link
US (1) US11236167B2 (ru)
EP (1) EP3613770A4 (ru)
JP (2) JP2020516323A (ru)
KR (1) KR20190140979A (ru)
CN (1) CN111247166B (ru)
AR (1) AR113223A1 (ru)
AU (1) AU2018255132A1 (ru)
BR (1) BR112019021781A2 (ru)
CA (1) CA3060395A1 (ru)
CL (1) CL2019002894A1 (ru)
CO (1) CO2019011458A2 (ru)
EA (1) EA201992206A1 (ru)
JO (1) JOP20190246A1 (ru)
MA (1) MA47221A1 (ru)
NZ (1) NZ758093A (ru)
PE (1) PE20191786A1 (ru)
PH (1) PH12019502298A1 (ru)
RU (1) RU2665790C1 (ru)
UY (1) UY37683A (ru)
WO (1) WO2018194496A2 (ru)
ZA (1) ZA201907065B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021054867A1 (ru) 2019-09-19 2021-03-25 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Иммуноцитокин, включающий гетеро димерный белковый комплекс на основе il-15 и il-15rα
JP2022516627A (ja) * 2019-04-01 2022-03-01 ▲華▼博生物医▲薬▼技▲術▼（上▲海▼）有限公司 プログラム細胞死リガンドに対する結合物およびその使用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170135860A (ko) 2015-03-13 2017-12-08 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항-pdl1 항체, 활성화 가능한 항-pdl1 항체, 및 이들의 사용 방법
US11168144B2 (en) 2017-06-01 2021-11-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-PDL1 antibodies, and methods of use thereof
EA039662B1 (ru) * 2017-10-03 2022-02-24 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1
WO2022121846A1 (zh) * 2020-12-08 2022-06-16 博际生物医药科技(杭州)有限公司 Pd-l1抗体及其应用
EP4359445A1 (en) * 2021-06-21 2024-05-01 Joint Stock Company "Biocad" Isolated bispecific antibody that specifically binds to cd47 and pd-l1
WO2023187460A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Mabtree Biologics Ag Human antibody or antigen binding fragment thereof specific against pd-l1 to enhance t-cell function

Citations (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0003089A1 (fr) 1978-01-06 1979-07-25 Bernard David Séchoir pour feuilles imprimées par sérigraphie
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0216846A1 (en) 1985-04-01 1987-04-08 Celltech Ltd TRANSFORMED MYELOMA CELL LINE AND METHOD FOR EXPRESSING A GENE ENCODING A EUKARYOTIC POLYPEPTIDE EMPLOYING THIS LINE.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
EP0256055A1 (en) 1986-01-23 1988-02-24 Celltech Ltd RECOMBINANT DNA SEQUENCES, THESE VECTORS, AND METHODS OF USE THEREOF.
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
EP0338841A1 (en) 1988-04-18 1989-10-25 Celltech Limited Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5500362A (en) 1987-01-08 1996-03-19 Xoma Corporation Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
US5537905A (en) 1994-09-08 1996-07-23 Zimmer Industries, Inc. Nicked cutting rule
US5545807A (en) 1988-10-12 1996-08-13 The Babraham Institute Production of antibodies from transgenic animals
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5565323A (en) 1994-03-30 1996-10-15 Mitokor Cytochrome oxidase mutations aiding diagnosis of sporadic alzheimer's disease
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5569825A (en) 1990-08-29 1996-10-29 Genpharm International Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5591669A (en) 1988-12-05 1997-01-07 Genpharm International, Inc. Transgenic mice depleted in a mature lymphocytic cell-type
WO1997017852A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide mischungen
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5821337A (en) 1991-06-14 1998-10-13 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
WO2001014557A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
WO2007005874A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
WO2010036959A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Dana-Farber Cancer Institute Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
WO2010077634A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Genentech, Inc. Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
WO2011066389A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Medimmmune, Limited Targeted binding agents against b7-h1
WO2013079174A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2086417C (en) 1990-06-29 1999-07-06 Biosource Technologies, Inc. Melanin production by transformed organisms
US20110280877A1 (en) * 2010-05-11 2011-11-17 Koji Tamada Inhibition of B7-H1/CD80 interaction and uses thereof
CA3175758A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-l1
CA3139031A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
NZ728749A (en) * 2014-08-05 2023-06-30 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-l1 antibodies
US9988452B2 (en) * 2014-10-14 2018-06-05 Novartis Ag Antibody molecules to PD-L1 and uses thereof
CN105777906B (zh) * 2014-12-19 2019-04-23 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗pd-l1全人抗体及其应用
GB201500319D0 (en) * 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
KR20170135860A (ko) * 2015-03-13 2017-12-08 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항-pdl1 항체, 활성화 가능한 항-pdl1 항체, 및 이들의 사용 방법
WO2017020291A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel anti-pd-l1 antibodies

Patent Citations (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0003089A1 (fr) 1978-01-06 1979-07-25 Bernard David Séchoir pour feuilles imprimées par sérigraphie
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846A1 (en) 1985-04-01 1987-04-08 Celltech Ltd TRANSFORMED MYELOMA CELL LINE AND METHOD FOR EXPRESSING A GENE ENCODING A EUKARYOTIC POLYPEPTIDE EMPLOYING THIS LINE.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
EP0256055A1 (en) 1986-01-23 1988-02-24 Celltech Ltd RECOMBINANT DNA SEQUENCES, THESE VECTORS, AND METHODS OF USE THEREOF.
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5500362A (en) 1987-01-08 1996-03-19 Xoma Corporation Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
EP0338841A1 (en) 1988-04-18 1989-10-25 Celltech Limited Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US5545807A (en) 1988-10-12 1996-08-13 The Babraham Institute Production of antibodies from transgenic animals
US5591669A (en) 1988-12-05 1997-01-07 Genpharm International, Inc. Transgenic mice depleted in a mature lymphocytic cell-type
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5569825A (en) 1990-08-29 1996-10-29 Genpharm International Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
US5821337A (en) 1991-06-14 1998-10-13 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5565323A (en) 1994-03-30 1996-10-15 Mitokor Cytochrome oxidase mutations aiding diagnosis of sporadic alzheimer's disease
US5537905A (en) 1994-09-08 1996-07-23 Zimmer Industries, Inc. Nicked cutting rule
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
WO1997017852A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide mischungen
WO2001014557A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
WO2007005874A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
WO2010036959A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Dana-Farber Cancer Institute Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
WO2010077634A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Genentech, Inc. Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
WO2011066389A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Medimmmune, Limited Targeted binding agents against b7-h1
WO2013079174A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALMAGROFRANSSON, FRONT BIOSCI., vol. 13, 2008, pages 1619 - 1633
ANGEW, CHEM. INTL. ED. ENGL, vol. 33, 1994, pages 183 - 186
BIOTECHNOL BIOENG., vol. 84, no. 3, 5 November 2003 (2003-11-05), pages 332 - 342
BIOTECHNOL BIOENG., vol. 91, no. 6, 20 September 2005 (2005-09-20), pages 670 - 677
BIOTECHNOL LETT., vol. 28, no. 11, June 2006 (2006-06-01), pages 843 - 848
BOETTLER ET AL., J. VIROL., vol. 80, 2006, pages 3532 - 40
BRENNAN ET AL., SCIENCE, vol. 229, 1985, pages 81
BRUGGEMANN ET AL., YEAR IN IMMUNO., vol. 7, 1993, pages 33
BURKS ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 94, 1997, pages 412 - 417
BUTTE ET AL., IMMUNITY, vol. 27, 2007, pages 111 - 22
CAPEL ET AL., IMMUNOMETHODS, vol. 4, 1994, pages 25 - 34
CARTER ET AL., BIO/TECHNOLOGY, vol. 10, 1992, pages 163 - 167
CARTER ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 32, 2002, pages 634 - 43
CARTER ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 89, 1992, pages 4285
CHEN, Y. ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 293, 1999, pages 865 - 881
CHOTHIA ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 196, 1987, pages 901 - 63
CLACKSON ET AL., NATURE, vol. 352, 1991, pages 624 - 628
CLYNES ET AL., PNAS (USA, vol. 95, 1998, pages 652 - 656
DAERON, ANNU. REV. IMMUNOL., vol. 15, 1997, pages 203 - 234
DE HAAS ET AL., J. LAB. CLIN. MED., vol. 126, 1995, pages 330 - 41
DON ET AL., NATURE, vol. 5, 1999, pages 1365 - 1369
EPPIHIMER ET AL., MICROCIRCULATION, vol. 9, 2002, pages 133 - 45
FREEMAN ET AL., J. EXP. MED., vol. 192, 2000, pages 1027 - 34
FUH G ET AL.: "Improving antibody binding affinity and specificity for therapeutic development", METHODS MOL BIOL., vol. 525, 2009, pages 353 - 376, XP009135953
GAZZANO-SANTORO ET AL., J. IMMUNOL. METHODS, vol. 202, 1996, pages 163
GREEN LLHARDY MCMAYNARD-CURRIE CETSUDA HLOUIE DMMENDEZ MJABDERRAHIM HNOGUCHI MSMITH DHZENG Y ET AL.: "Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs", NAT GENET, vol. 7, 1994, pages 13 - 21, XP000953045, DOI: 10.1038/ng0594-13
GRIFFITH ET AL., EMBO J., vol. 12, 1993, pages 725 - 734
GRUBER ET AL., J. IMMUNOL, vol. 152, 1994, pages 5368
GUYER ET AL., J. IMMUNOL., vol. 117, 1976, pages 587
HECKMAN ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 37, 2007, pages 1827 - 35
HUSTON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 5879 - 5883
J BIOL CHEM., vol. 274, no. 26, 25 June 1999 (1999-06-25), pages 18218 - 30
J MOL BIOL., vol. 222, no. 3, 5 December 1991 (1991-12-05), pages 581 - 97
JAKOBOVIS ET AL., NATURE, vol. 362, 1993, pages 25 - 258
JAKOBOVITS ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 6444 - 6448
JOHNSON KEVIN S.CHISWELL DAVID J., CURRENT OPINION IN STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 3, 1993, pages 564 - 571
JONES ET AL., NATURE, vol. 321, 1986, pages 522 - 525
KEIR ET AL., ANNU. REV. IMMUNOL., vol. 26, 2008, pages 677 - 704
KIM ET AL., J. IMMUNOL., vol. 24, 1994, pages 249
KOHLER ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
KOSTELNY ET AL., J. IMMUNOL., vol. 148, no. 5, 1992, pages 1547 - 1553
KOZBOR, J. IMMUNOL., vol. 133, 1984, pages 3001
KUIPERS ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 36, 2006, pages 2472 - 82
LATCHMAN ET AL., NATURE IMMUNOL, vol. 2, 2001, pages 261 - 268
LATCHMAN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 101, 2004, pages 10691 - 96
LEE ET AL., FEBS LETT, vol. 580, 2006, pages 755 - 62
LEFRANC ET AL., DEV. COMP IMMUNOL., vol. 27, 2003, pages 55 - 77
LIANG ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 33, 2003, pages 2706 - 16
LIAO METAL., 2004
LIU ET AL., BLOOD, 2007, pages 296 - 304
LOKE ET AL., PNAS, vol. 100, 2003, pages 5336 - 41
LONBERG NTAYLOR LDHARDING FATROUNSTINE MHIGGINS KMSCHRAMM SRKUO CCMASHAYEKH RWYMORE KMCCABE JG ET AL.: "Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications", NATURE, vol. 368, 1994, pages 856 - 859, XP002626115, DOI: 10.1038/368856a0
MAGDELAINE-BEUZELIN ET AL., CRIT REV.ONCOL HEMATOL., vol. 64, 2007, pages 210 - 225
MARKS ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 581 - 597
MCCAFFERTY ET AL., NATURE, vol. 348, 1990, pages 552 - i553
METHODS ENZYMOL., vol. 328, 2000, pages 333 - 63
MILLSTEIN ET AL., NATURE, vol. 305, 1983, pages 537 - 539
MOL BIOL., vol. 222, no. 3, 5 December 1991 (1991-12-05), pages 581 - 97
MORIMOTO ET AL., JOURNAL OF BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL METHODS, vol. 24, 1992, pages 107 - 117
MORRISON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 6851
MUNSON ET AL., ANAL. BIOCHEM., vol. 107, 1980, pages 220
NAT BIOTECHNOL., vol. 14, no. 3, March 1996 (1996-03-01), pages 309 - 14
NGUYEN ET AL., J. EXP. MED., vol. 196, 2002, pages 1393 - 98
NIELSEN ET AL., CELL. IMMUNOL., vol. 235, 2005, pages 109 - 16
NISHIMURA ET AL., IMMUNITY JJ, 1999, pages 141 - 51
NISHIMURA ET AL., INT. IMMUNOL., vol. 8, 1996, pages 773 - 80
NISHIMURA ET AL., SCIENCE, vol. 291, 2001, pages 319 - 22
PARSA ET AL., NAT. MED., vol. 13, 2007, pages 84 - 88
PLIICKTHUN, IMMUNOL. REVS., vol. 130, 1992, pages 151 - 188
PRESTA ET AL., J. IMMUNOL., vol. 151, 1993, pages 2623
RADHAKRISHNAN ET AL., CANCER RES., vol. 64, 2004, pages 4965 - 72
RADHAKRISHNAN ET AL., J. ALLERGY CLIN. IMMUNOL. UJY, 2005, pages 668 - 74
RADHAKRISHNAN ET AL., J. IMMUNOL., vol. 170, 2003, pages 1830 - 38
RADHAKRISHNAN ET AL., J. IMMUNOL., vol. 173, 2004, pages 1360 - 65
RAVETCHKINET, ANNU. REV. IMMUNOL, vol. 9, 1991, pages 457 - 92
RIECHMANN ET AL., NATURE, vol. 332, 1988, pages 323 - 327
SCHREINER ET AL., J. NEUROIMMUNOL, vol. 155, 2004, pages 172 - 82
SHALABY ET AL., J. EXP. MED., vol. 175, 1992, pages 217 - 225
SKERRA ET AL., CURR. OPINION IN IMUNOL., vol. 5, 1993, pages 256 - 262
SMITH GP: "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface", SCIENCE, vol. 228, 1985, pages 1315 - 1317, XP002464311, DOI: 10.1126/science.4001944
STERN ET AL., CRITICAL REVIEWS IN ONCOLOGY/HAEMATOLOGY, vol. 54, 2005, pages ll-29
SURESH ET AL., METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 121, 1986, pages 210
TRAUNECKER ET AL., EMBO J., vol. 10, 1991, pages 3655 - 3659
TSENG ET AL., J. EXP. MED., vol. 193, 2001, pages 839 - 846
TUTT ET AL., J. IMMUNOL., vol. 147, 1991, pages 60
UEDA ET AL., NATURE, vol. 423, 2003, pages 506 - 11
VERHOEYEN ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 1534 - 1536
WAN ET AL., J. IMMUNOL., vol. 177, 2006, pages 8844 - 50
WARD ET AL., NATURE, vol. 341, 1989, pages 544 - 546
WATERHOUSE ET AL., NUCL. ACIDS. RES., vol. 21, 1991, pages 2265 - 2266
WU ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 95, 1998, pages 6037 6042
YAMAZAKI ET AL., J. IMMUNOL., vol. 169, 2002, pages 5538 - 45

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022516627A (ja) * 2019-04-01 2022-03-01 ▲華▼博生物医▲薬▼技▲術▼（上▲海▼）有限公司 プログラム細胞死リガンドに対する結合物およびその使用
JP7182815B2 (ja) 2019-04-01 2022-12-05 ▲華▼博生物医▲薬▼技▲術▼（上▲海▼）有限公司 プログラム細胞死リガンドに対する結合物およびその使用
WO2021054867A1 (ru) 2019-09-19 2021-03-25 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Иммуноцитокин, включающий гетеро димерный белковый комплекс на основе il-15 и il-15rα

Also Published As

Publication number Publication date
CL2019002894A1 (es) 2020-03-13
CA3060395A1 (en) 2019-11-18
JOP20190246A1 (ar) 2019-10-16
EP3613770A4 (en) 2021-01-27
RU2665790C1 (ru) 2018-09-04
BR112019021781A2 (pt) 2020-05-05
US20200369771A1 (en) 2020-11-26
EP3613770A2 (en) 2020-02-26
US11236167B2 (en) 2022-02-01
CN111247166B (zh) 2024-03-26
CO2019011458A2 (es) 2020-01-17
EA201992206A1 (ru) 2020-02-21
CN111247166A (zh) 2020-06-05
UY37683A (es) 2018-11-30
JP2023081942A (ja) 2023-06-13
MA47221A1 (fr) 2020-04-30
WO2018194496A3 (ru) 2019-01-10
NZ758093A (en) 2022-09-30
AR113223A1 (es) 2020-02-19
PH12019502298A1 (en) 2020-07-06
AU2018255132A2 (en) 2019-11-07
JP2020516323A (ja) 2020-06-11
KR20190140979A (ko) 2019-12-20
AU2018255132A1 (en) 2019-10-31
ZA201907065B (en) 2020-09-30
PE20191786A1 (es) 2019-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11840567B2 (en) Bispecific antibodies with specific binding to CD47 and PD-L1
RU2665790C1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1
RU2734432C1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR
RU2724469C2 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20
RU2698048C2 (ru) МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К IL-5Rα
RU2779652C2 (ru) АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1
EA041915B1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1
EA044786B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr
WO2019190359A1 (ru) Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека
EA044757B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18786945

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020506702

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112019021781

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018255132

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20180411

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20197033829

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018786945

Country of ref document: EP

Effective date: 20191118

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18786945

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112019021781

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20191017