WO2018194124A1 - 体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用 - Google Patents

体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2018194124A1
WO2018194124A1 PCT/JP2018/016126 JP2018016126W WO2018194124A1 WO 2018194124 A1 WO2018194124 A1 WO 2018194124A1 JP 2018016126 W JP2018016126 W JP 2018016126W WO 2018194124 A1 WO2018194124 A1 WO 2018194124A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
alveolar epithelial
cells
epithelial cells
differentiation
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/016126
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
石井　誠
智子 別役
実 洪
真樹 家田
正也 四倉
尚生 淺村
アハメド ヒガブ
悠樹 中武
真由美 小田
Original Assignee
学校法人慶應義塾
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人慶應義塾 filed Critical 学校法人慶應義塾
Priority to EP18787999.4A priority Critical patent/EP3613857A4/en
Priority to JP2019513683A priority patent/JP7356626B2/ja
Priority to US16/606,294 priority patent/US11718831B2/en
Publication of WO2018194124A1 publication Critical patent/WO2018194124A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/42—Respiratory system, e.g. lungs, bronchi or lung cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a reagent for differentiation from somatic cells into alveolar epithelial cells and use thereof. More specifically, the present invention relates to a reagent for differentiation from somatic cells into alveolar epithelial cells, a method for producing alveolar epithelial cells, alveolar epithelial cells, and cell medicine.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2017-083814 filed in Japan on April 20, 2017, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • idiopathic pulmonary fibrosis is one of intractable diseases for which no effective treatment method is known.
  • the alveoli become fibrotic and the stroma through which oxygen and carbon dioxide pass becomes thick and stiff, making it difficult to exchange gas.
  • regeneration or transplantation of alveolar epithelial cells is expected.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for differentiating ES cells into alveolar epithelial cells.
  • Non-Patent Document 2 describes a method for differentiating iPS cells into alveolar epithelial cells.
  • Roszell B. et al. Efficient derivation of alveolar type II cells from embryonic stem cells for in vivo application., Tissue Eng. Part A. 15 (11), 3351-3365, 2009. Gotoh S. et al., Generation of Alveolar Epithelial Spheroids via Isolated Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells., Stem Cell Reports, 3 (3), 394-403, 2014.
  • an object of this invention is to provide the technique which manufactures an alveolar epithelial cell more simply, without using a stem cell.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a reagent for differentiation from somatic cells into alveolar epithelial cells comprising an expression vector of NK2 homeobox family gene and an expression vector of Fox family gene.
  • Gata family gene is a Gata Binding Protein 6 (Gata6) gene.
  • NK2 homeobox family gene is an NK2 Homebox 1 (Nkx2-1) gene.
  • Fox family gene is a Forkhead Box A1 (Foxa1) gene or a Forkhead Box A2 (Foxa2) gene reagent.
  • [6] A method for producing alveolar epithelial cells, comprising a step of forcibly expressing NK2 homeobox family gene and Fox family gene in somatic cells, and a step of culturing the somatic cells after forced expression.
  • the production method according to [6] wherein the Gata family gene is further forcibly expressed in the step of forcibly expressing the NK2 homeobox family gene and the Fox family gene.
  • a technique for producing alveolar epithelial cells more easily without using stem cells can be provided.
  • FIG. (A) is the graph which shows the result of having measured the expression level of the mRNA of Surfactant Protein C (Sftpc) gene of the fibroblast which introduce
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the mRNA expression level of Secretoglobulin Family 1A Member 1 (Scgb1a1) gene in the fibroblasts into which the gene was introduced in Experimental Example 1.
  • Experimental example 2 it is a graph which shows the result of having measured the expression level of mRNA of the Sftpc gene of the fibroblast which introduce
  • FIG. (A) is a graph which shows the result of having measured the expression level of mRNA of the Sftpc gene of the fibroblast which introduce
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the mRNA expression level of the Scgb1a1 gene in the fibroblasts into which the gene was introduced in Experimental Example 3.
  • (A) is a graph which shows the result of having measured the expression level of Sftpc gene mRNA of the fibroblast which introduce
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the mRNA expression level of the Scgb1a1 gene in the fibroblasts into which the gene was introduced in Experimental Example 4.
  • FIG. (B) is an enlarged photograph of the area enclosed by the square in (a).
  • A) shows a combination of three kinds of genes, Nkx2-1 gene, Foxa1 gene and Gata6 gene, introduced into fibroblasts in Experimental Example 7, and observed under a microscope 12 days after gene introduction.
  • FIG. 1 is a graph which shows transition of the body weight of the mouse
  • FIG. (B) is a graph showing the transition of the survival rate of mice in Experimental Example 8.
  • A) And (b) is the optical microscope photograph of the hematoxylin eosin dyeing
  • FIG. 9 the expression level of SFTPC gene mRNA in a human adult skin-derived fibroblast cell line (HDFa cell) into which human NKX2-1 gene, human FOXA1 gene, human FOXA2 gene, and human GATA6 gene were introduced in various combinations. It is a graph which shows the measurement result.
  • HDFa cell human adult skin-derived fibroblast cell line
  • the present invention provides a reagent for differentiation from somatic cells to alveolar epithelial cells, comprising an expression vector of an NK2 homeobox family gene and an expression vector of a Fox family gene.
  • the differentiation reagent of the present embodiment is a composition comprising an expression vector for the NK2 homeobox family gene and an expression vector for the Fox family gene.
  • it may be a kit containing an expression vector for the NK2 homeobox family gene and an expression vector for the Fox family gene.
  • the inventors forced fibroblasts to directly express alveolar epithelial cells without using stem cells by forcibly expressing NK2 homeobox family genes and Fox family genes. It was clarified that differentiation can be induced. Therefore, according to the differentiation reagent of the present embodiment, alveolar epithelial cells can be more easily produced without using stem cells.
  • examples of somatic cells include fibroblasts, cells derived from blood cells, and the like.
  • the differentiation reagent of this embodiment may be in any form as long as the NK2 homeobox family gene and the Fox family gene can be expressed in somatic cells.
  • one expression vector may contain an NK2 homeobox family gene and a Fox family gene in an expressible manner.
  • the vector is an expression vector for the NK2 homeobox family gene and also an expression vector for the Fox family gene.
  • the expression vector for the NK2 homeobox family gene and the expression vector for the Fox family gene may be included as separate vectors.
  • somatic cell seed genes may be used as the NK2 homeobox family gene and the Fox family gene.
  • a human gene may be used when the somatic cell is a human cell
  • a mouse gene may be used when the somatic cell is a mouse cell.
  • Examples of the NK2 homeobox family gene include Nkx2-1 gene, Nkx2-2 gene, Nkx2-5 gene, Nkx6-1 gene and the like. Of these, the Nkx2-1 gene is preferred. NCBI Gene ID (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) of the mouse Nkx2-1 gene is 21869, and MGI ID (http://www.informatics.jax.org/) is 108067. It is. The NCBI Gene ID (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) of the human NKX2-1 gene is 7080.
  • One type of NK2 homeobox family gene may be used alone, or two or more types may be mixed and used.
  • Fox family gene examples include Foxa1, Gene, Foxa2, Foxa3, Foxb1, Foxb2, Foxc1, Foxc2, Foxd1, Gene, Foxd2 gene, Foxd6 gene, Foxd5 gene, Foxd5 gene, Foxd6 gene, , Foxd8 gene, Fox1 gene, Fox2 gene, Foxe3 gene, Foxf1 gene, Foxf2 gene, Foxg1 gene, Foxh1 gene, Foxi1 gene, Foxj1 gene, Foxj2 gene, Fox1 gene, Foxk1 gene, Foxk1 gene, Foxk1 gene Gene, Foxn4 gene, Foxn5 gene, Foxn6 gene, Foxo Gene, Foxo3a gene, Foxo4 gene, FOXP1 gene, FOXP2 gene, Foxp3 gene, include Foxq1 gene.
  • the Foxa1 gene and the Foxa2 gene are preferable.
  • the NCBI Gene ID of the mouse Foxa1 gene is 15375, and the MGI ID is 1347472.
  • the NCBI Gene ID of the human FOXA1 gene is 3169.
  • the NCBI Gene ID of the mouse Foxa2 gene is 15376, and the MGI ID is 1347476.
  • the NCBI Gene ID of the human FOXA2 gene is 3170.
  • One type of Fox family gene may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the differentiation reagent of this embodiment may further contain an expression vector for a Gata family gene. That is, the differentiation reagent of the present embodiment may include an expression vector for the NK2 homeobox family gene, an expression vector for the Fox family gene, and an expression vector for the Gata family gene.
  • a differentiation reagent contains an expression vector for a Gata family gene, the efficiency of inducing differentiation of fibroblasts into alveolar epithelial cells tends to further increase.
  • one expression vector may include an NK2 homeobox family gene, a Fox family gene, and a Gata family gene in an expressible manner.
  • the vector is an expression vector for the NK2 homeobox family gene, an expression vector for the Fox family gene, and an expression vector for the Gata family gene.
  • the differentiation reagent of the present embodiment includes one expression vector that can express any two of the three genes of the NK2 homeobox family gene, the Fox family gene, and the Gata family gene, and the remaining The expression vector of one kind of gene may be included.
  • the differentiation reagent of the present embodiment may include an expression vector for the NK2 homeobox family gene, an expression vector for the Fox family gene, and an expression vector for the Gata family gene as separate vectors.
  • a somatic cell seed gene may be used as the Gata family gene.
  • a human gene may be used when the somatic cell is a human cell
  • a mouse gene may be used when the somatic cell is a mouse cell.
  • Gata family gene examples include Gata6 gene, Gata1 gene, Gata4 gene and the like. Of these, the Gata6 gene is preferred.
  • the NCBI Gene ID of the mouse Gata6 gene is 14465 and the MGI ID is 107516.
  • the NCBI Gene ID of the human GATA6 gene is 2627.
  • One type of Gata family gene may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the expression vector may be a viral vector.
  • Viral vectors have high gene transfer efficiency and are easy to use. Examples of virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adeno-associated virus vectors, adenovirus vectors, and the like.
  • the present invention provides the production of alveolar epithelial cells, comprising the step of forcibly expressing NK2 homeobox family gene and Fox family gene in somatic cells, and the step of culturing the somatic cells after forced expression. Provide a method.
  • the inventors forced fibroblasts to directly express alveolar epithelial cells without using stem cells by forcibly expressing NK2 homeobox family genes and Fox family genes. It was clarified that differentiation can be induced. Therefore, according to the production method of the present embodiment, alveolar epithelial cells can be more easily produced without using stem cells.
  • somatic cells are the same as those described above.
  • the method for forcibly expressing the NK2 homeobox family gene and the Fox family gene is not particularly limited.
  • a method of introducing an expression vector of the NK2 homeobox family gene and an expression vector of the Fox family gene into a somatic cell may be used.
  • a method of adding a compound that induces the expression of the NK2 homeobox family gene, a compound that induces the expression of the Fox family gene, or the like to the medium of somatic cells may be used.
  • NK2 homeobox family gene the Fox family gene, and the expression vector are the same as those described above.
  • the Gata family gene may be further forcibly expressed.
  • the Gata family gene when the Gata family gene is forcibly expressed in addition to the NK2 homeobox family gene and Fox family gene in somatic cells, the efficiency of inducing differentiation of somatic cells into alveolar epithelial cells further increases. There is a tendency.
  • the method for forcibly expressing the Gata family gene is not particularly limited.
  • a method for introducing an expression vector of the Gata family gene into a somatic cell or a compound that induces the expression of the Gata family gene may be used.
  • the method of adding to a culture medium may be sufficient.
  • the Gata family gene and the expression vector are the same as those described above.
  • the step of culturing somatic cells after forced expression of the NK2 homeobox family gene, the Fox family gene, and optionally the Gata family gene is preferably performed by three-dimensional culture.
  • the three-dimensional culture method is not particularly limited, and examples thereof include a method using matrigel, a method using collagen, and a method using laminin.
  • the efficiency of inducing differentiation of somatic cells into alveolar epithelial cells tends to further increase by performing the step of culturing somatic cells after gene introduction by three-dimensional culture.
  • the step of culturing somatic cells after gene introduction is performed in the presence of dexamethasone and FGF family proteins.
  • the efficiency of inducing differentiation of somatic cells into alveolar epithelial cells tends to further increase by performing the step of culturing somatic cells after gene introduction in the presence of dexamethasone and FGF family proteins. is there.
  • FGF family proteins include FGF7, FGF2, and FGF10.
  • FGF7 is preferable.
  • the NCBI Reference Sequence of the mouse FGF7 protein is NP_032034, and the NCBI Reference Sequence of the human FGF7 protein is NP_002000.
  • NCBI Reference Sequence of mouse FGF2 protein is NP_032032.1, and NCBI Reference Sequence of human FGF2 protein is NP_001997.
  • NCBI Reference Sequence of mouse FGF10 protein is NP_032028.1
  • NCBI Reference Sequence of human FGF10 protein is NP_004456.1.
  • the medium is not only dexamethasone and FGF family protein, but also protein kinase A activator such as 8-Br-cAMP; cAMP phosphodiesterase or cGMP phosphodiesterase inhibitor such as IBMX
  • GSK3 Glycogen synthase kinase 3
  • the present invention provides alveolar epithelial cells produced by the production method described above.
  • the alveolar epithelial cells of the present embodiment may be transplanted with alveolar epithelial cells such as idiopathic interstitial pneumonia, pneumonia caused by influenza or bacteria, acute respiratory distress syndrome (ARDS), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), etc. It can be used for treatment of effective diseases.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the alveolar epithelial cells of this embodiment are not differentiated by normal development, but are produced by forcibly expressing a specific gene in somatic cells. For this reason, it is predicted that the gene expression profile is different from that of normal alveolar epithelial cells. However, it is difficult to specify the difference in the expression profile of genes that can distinguish the alveolar epithelial cells of the present embodiment from normal alveolar epithelial cells.
  • the present invention provides a cell medicine containing alveolar epithelial cells produced by the production method described above as an active ingredient.
  • the cell medicine of this embodiment is effective for transplantation of alveolar epithelial cells such as idiopathic interstitial pneumonia, pneumonia caused by influenza or bacteria, acute respiratory distress syndrome (ARDS), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), etc. It can be used for treatment of diseases.
  • the alveolar epithelial cell may be produced from the patient's own somatic cell, or produced from a third party's somatic cell to which the major histocompatibility complex is compatible. It may be a thing.
  • the present invention provides a method for treating pulmonary disease, comprising transplanting an effective amount of alveolar epithelial cells produced by the production method described above to a patient in need of treatment.
  • pulmonary diseases include idiopathic interstitial pneumonia, pneumonia caused by influenza and bacteria, acute respiratory distress syndrome (ARDS), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and the like.
  • the present invention provides the use of alveolar epithelial cells produced by the production method described above for the treatment of lung diseases.
  • pulmonary diseases include idiopathic interstitial pneumonia, pneumonia caused by influenza and bacteria, acute respiratory distress syndrome (ARDS), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and the like.
  • the present invention provides the use of alveolar epithelial cells produced by the production method described above for producing a therapeutic agent for lung diseases.
  • pulmonary diseases include idiopathic interstitial pneumonia, pneumonia caused by influenza and bacteria, acute respiratory distress syndrome (ARDS), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and the like.
  • Example 1 (Examination of factors necessary for differentiation from somatic cells to alveolar epithelial cells 1) Factors necessary for differentiation from somatic cells to alveolar epithelial cells were examined. Mouse somatic fibroblasts were used as somatic cells. First, 14 types of mouse genes shown in Table 1 below were simultaneously introduced into mouse fibroblasts using a retrovirus expression vector and overexpressed. Table 1 also shows the NCBI Gene ID and MGI ID of each gene.
  • the expression levels of the Surfactant Protein C (Sftpc) gene and the Secretoglobulin Family 1A Member 1 (Scb1a1) gene were measured by quantitative RT-PCR.
  • fibroblasts into which a retrovirus expression vector of green fluorescent protein (GFP) was introduced instead of the genes shown in Table 1 were used.
  • the NCBI Gene ID of the mouse Sftpc gene is 20389, and the MGI ID is 109517. Further, the NCBI Gene ID of the mouse Scgb1a1 gene is 22287, and the MGI ID is 98919.
  • FIG. 1 (a) is a graph showing the results of measuring the expression level of Sftpc gene mRNA.
  • FIG. 1B is a graph showing the results of measuring the expression level of the Scgb1a1 gene mRNA.
  • “GFP” indicates the result of the control cell
  • “14 Factors” indicates the result of introducing the 14 types of genes shown in Table 1.
  • the expression level of the Sftpc gene mRNA increased 2000 times or more and the expression level of the Scgb1a1 gene mRNA was 300 times that of the control. It became clear that it increased more.
  • Example 2 (Examination of factors necessary for differentiation from somatic cells to alveolar epithelial cells 2) The factors required for differentiation from somatic cells to alveolar epithelial cells were examined in more detail. Specifically, alveolar epithelial cells were first prepared in the same manner as in Experimental Example 1, except that 13 genes obtained by removing one gene from each of the 14 genes shown in Table 1 were introduced into mouse fibroblasts. The expression level of the Sftpc gene, which is a marker, was measured by quantitative RT-PCR. As a control, fibroblasts into which a GFP retrovirus expression vector was introduced instead of the genes shown in Table 1 were used.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the expression level of mRNA of the Sftpc gene in fibroblasts into which a combination of genes has been introduced.
  • GFP indicates the result of the control cell
  • 14 Factors indicates the result of introducing all 14 types of genes shown in Table 1.
  • 14F- # 1 indicates the result of introducing 13 genes excluding the gene of No. 1 in Table 1 from the 14 genes shown in Table 1, and so on.
  • “NO transfect” indicates the result of fibroblasts into which no gene was introduced.
  • FIG. 3 (a) is a graph showing the results of measuring the expression level of Sftpc gene mRNA.
  • FIG. 3 (b) is a graph showing the results of measuring the expression level of the Scgb1a1 gene mRNA.
  • “GFP” shows the result of the control cell
  • “# 1 + # 2” shows the result of introducing a combination of the gene of No. 1 and the gene of No. 2 in Table 1, The same applies hereinafter.
  • “NO transfect” indicates the result of fibroblasts into which no gene was introduced.
  • the expression levels of the Sftpc gene and the Scgb1a1 gene may increase. It became clear. This result indicates that expression of these gene combinations is important for inducing differentiation from fibroblasts into alveolar epithelial cells.
  • FIG. 4 (a) is a graph showing the results of measuring the expression level of mRNA of the Sftpc gene.
  • FIG. 4B is a graph showing the results of measuring the expression level of SCGB1A1 gene mRNA.
  • “GFP” indicates the result of the control cell
  • “# 1” indicates the result of introducing the gene of number 1 in Table 1
  • “# 1 + # 2 + # 3” indicates The results of introducing the genes of Nos. 1, 2 and 3 in Table 1 in combination are shown below, and so on.
  • “NO transfect” indicates the result of fibroblasts into which no gene was introduced.
  • the SPC-GFP mouse is a transgenic mouse in which a construct having a GFP gene linked thereto is introduced downstream of the promoter of the SPC (Sftpc) gene.
  • Sftpc SPC-GFP mice
  • GFP fluorescence is observed in cells that express the Sftpc gene.
  • the factor 1 (Nkx2-1 gene), the factor 2 (Foxa1 gene), the factor 3 (Foxa2 gene) and the factor 8 (see Table 1) were applied to fibroblasts of SPC-GFP mice. Gata6 gene) was introduced in various combinations, followed by two-dimensional culture for 2 days, and GFP fluorescence was observed.
  • GFP fluorescence-positive cells were observed 14 days after gene transfer.
  • 5 to 7% of the cells became GFP fluorescence positive 28 days after the gene transfer.
  • FIGS. 5 (a) to 5 (c) are photomicrographs of cells 26 days after gene introduction.
  • 5A is a bright-field observation image
  • FIG. 5B is a fluorescence micrograph of GFP fluorescence
  • FIG. 5C is an image of FIGS. 5A and 5B. It is the image which merged.
  • FIGS. 6A and 6B are representative electron micrographs.
  • FIG. 6B is an enlarged photograph of the area surrounded by the square in FIG.
  • the arrow indicates a lamella body.
  • the lamellar body is known to be a characteristic structure of type II alveolar epithelial cells. From these results, it was revealed that cells derived from somatic cells were alveolar epithelial cells morphologically.
  • FGF2 dexamethasone and FGF family proteins (FGF2, FGF7, FGF10) among humoral factors is important in order to obtain GFP fluorescence positive cells from somatic cells. It was. Furthermore, among the FGF family proteins, the presence of FGF7 was thought to be particularly important.
  • differentiation induction efficiency from somatic cells to alveolar epithelial cells is significantly increased by culturing somatic cells after gene introduction in three dimensions or in the presence of dexamethasone and FGF family proteins. It became clear that it can be made.
  • Example 7 (Examination of differentiation conditions from somatic cells to alveolar epithelial cells 3) A total of three genes, fibroblasts of SPC-GFP mice, number 1 factor (Nkx2-1 gene), number 2 factor (Foxal gene) and number 8 factor (Gata6 gene) shown in Table 1, or A total of three types of genes, factor 1 (Nkx2-1 gene), factor 3 (Foxa2 gene), and factor 8 (Gata6 gene) were introduced and cultured three-dimensionally in the same manner as in Experimental Example 6.
  • FIG. 7 (a) shows a combination of a total of three types of genes, fibroblast, number 1 factor (Nkx2-1 gene), number 2 factor (Foxa1 gene) and number 8 factor (Gata6 gene) shown in Table 1. It is an image obtained by merging a bright-field observation image and a fluorescence micrograph obtained by observing fluorescence of GFP after being introduced into a cell and observed with a microscope 12 days after gene introduction.
  • GFP fluorescence positive cells formed clusters 12 days after gene introduction.
  • the formation of clusters indicates that alveolar epithelial cells having proliferative ability were obtained.
  • alveolar epithelial cells can also be obtained by introducing a combination of three kinds of genes.
  • the combination of a total of three genes, the factor 1 (Nkx2-1 gene), the factor 2 (Foxa1 gene) and the factor 8 (Gata6 gene) shown in Table 1, were introduced into fibroblasts.
  • the GFP fluorescence-positive cells obtained above were fluorescently immunostained to examine the expression of SP-C (Sftpc) protein and Aquaporin 5 (AQP5, NCBI Reference Sequence is NP — 03831.1). Cell nuclei were stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  • FIG. 7 (b) is a fluorescence micrograph showing the result of staining the SP-C protein by fluorescent immunostaining. As a result, it was confirmed that cells that were positive for GFP fluorescence expressed SP-C protein. Since SP-C is mainly expressed in type II alveolar epithelial cells, it is generally regarded as a type II alveolar epithelial cell marker.
  • FIG. 7 (c) is a fluorescence micrograph showing the result of staining AQP5 protein by fluorescent immunostaining. As a result, it was confirmed that the cells positive for GFP fluorescence expressed the AQP5 protein. Since AQP5 is mainly expressed in type I alveolar epithelial cells, it is generally regarded as a marker for type I alveolar epithelial cells.
  • cells derived from somatic cells include both type I alveolar epithelial cells and type II alveolar epithelial cells.
  • Example 8 Transplantation of differentiation-induced alveolar epithelial cells into influenza mice
  • Mouse-adapted influenza virus A / H1N1, PR8
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 8A is a graph showing changes in the body weight of the mice in each group
  • FIG. 8B is a graph showing changes in the survival rate of the mice in each group.
  • “Flu + iPUL” is the result of the group in which mice were infected with influenza virus and administered with alveolar epithelial cells (iPUL) induced to differentiate from embryonic fibroblasts.
  • “Flu + MEF” indicates that the result of the group in which the mouse was infected with influenza virus and embryonic fibroblasts that had not undergone differentiation induction were administered, and “Flu + PBS” indicated that the mouse was infected with influenza virus.
  • PBS is the result of the group administered
  • PBS + iPUL is the result of the group administered PBS to mice followed by administration of alveolar epithelial cells induced to differentiate from embryonic fibroblasts.
  • “PBS + MEF” is the result of the group in which PBS was administered to mice followed by administration of embryonic fibroblasts that had not undergone differentiation induction It is shown the door.
  • FIG. 9 (a) is a micrograph of a tissue section of the lung of the Flu + iPUL group.
  • FIG. 9B is a photomicrograph of lung tissue sections of the Flu + MEF group.
  • FIGS. 10A and 10B are representative fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • (A) and (b) have different fields of view and magnification.
  • FIGS. 10 (a) and 10 (b) double positive cells of GFP protein and SP-C protein are indicated by arrows.
  • gene combinations include human NKX2-1 gene, human FOXA1 gene and human GATA6 gene, 3 gene combinations, human NKX2-1 gene, human FOXA2 gene and human GATA6 gene, 3 gene combinations, human NKX2-1 gene, A combination of 4 genes of human FOXA1 gene, human FOXA2 gene and human GATA6 gene was examined.
  • a retrovirus system (model “pMX”, Cell Biolabs) was used.
  • Plat-GP cells (Cell Biolabs) were used as packaging cells.
  • the HDFa cells into which each gene was introduced started three-dimensional culture using Matrigel on the second day after the gene introduction. Subsequently, on the 11th and 17th days after gene introduction, the expression level of the SFTPC gene in each cell was measured by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR.
  • the expression level of the SFTPC gene is shown as a relative value where the expression level of the SFTPC gene in HDFa cells into which the gene has not been introduced is 1.
  • a technique for producing alveolar epithelial cells more easily without using stem cells can be provided.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Botany (AREA)

Abstract

ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。

Description

体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用
　本発明は、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用に関する。より具体的には、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬、肺胞上皮細胞の製造方法、肺胞上皮細胞及び細胞医薬に関する。本願は、２０１７年４月２０日に、日本に出願された特願２０１７－０８３８１４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　例えば、特発性肺線維症は、有効な治療方法が知られていない難病の１つである。特発性肺線維症の患者の肺では、肺胞が線維化し、酸素や二酸化炭素が通過する間質が、厚く、硬くなり、ガス交換がうまくできなくなる。特発性肺線維症の治療方法として、肺胞上皮細胞の再生又は移植が期待されている。
　従来、肺細胞の再生医療には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞を利用する検討が行われてきた。例えば、非特許文献１には、ＥＳ細胞を肺胞上皮細胞に分化させる方法が記載されている。また、非特許文献２には、ｉＰＳ細胞を肺胞上皮細胞に分化させる方法が記載されている。
Roszell B. et al., Efficient derivation of alveolar type II cells from embryonic stem cells for in vivo application., Tissue Eng. Part A. 15 (11), 3351-3365, 2009. Gotoh S. et al., Generation of Alveolar Epithelial Spheroids via Isolated Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells., Stem Cell Reports, 3 (3), 394-403, 2014.
　しかしながら、幹細胞から肺胞上皮細胞を得る方法では、発生過程を辿るように数段階の過程を経て幹細胞を分化させる必要がある。このため、肺胞上皮細胞の調製に時間や手間がかかり、臨床応用することが困難な場合がある。また、無限増殖能を持つ幹細胞を使用するため、肺胞上皮細胞を患者に移植した後に奇形腫等の腫瘍が形成される可能性がある。そこで、本発明は、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［２］ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクター及びＧａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、［１］に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［３］前記Ｇａｔａファミリー遺伝子がＧａｔａ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　６（Ｇａｔａ６）遺伝子である、［２］に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［４］前記ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子がＮＫ２　Ｈｏｍｅｏｂｏｘ　１（Ｎｋｘ２－１）遺伝子である、［１］～［３］のいずれかに記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［５］前記Ｆｏｘファミリー遺伝子がＦｏｒｋｈｅａｄ　Ｂｏｘ　Ａ１（Ｆｏｘａ１）遺伝子又はＦｏｒｋｈｅａｄ　Ｂｏｘ　Ａ２（Ｆｏｘａ２）遺伝子である、［１］～［４］のいずれかに記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［６］体細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる工程と、強制発現後の前記体細胞を培養する工程と、を備える、肺胞上皮細胞の製造方法。
［７］ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる前記工程において、Ｇａｔａファミリー遺伝子を更に強制発現させる、［６］に記載の製造方法。
［８］前記培養する工程を３次元培養により行う、［６］又は［７］に記載の製造方法。
［９］前記培養する工程を、デキサメタゾン及びＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の存在下で行う、［６］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］［６］～［９］のいずれかに記載の製造方法により製造された肺胞上皮細胞。
［１１］［１０］の肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬。
　本発明によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することができる。
（ａ）は、実験例１において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ（Ｓｆｔｐｃ）遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ　Ｆａｍｉｌｙ　１Ａ　Ｍｅｍｂｅｒ　１（Ｓｃｇｂ１ａ１）遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。 実験例２において、各遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞のＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例４において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例６における、遺伝子導入から２６日後の細胞の顕微鏡写真である。（ａ）は明視野観察画像であり、（ｂ）はＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であり、（ｃ）は（ａ）及び（ｂ）の画像をマージした画像である。 （ａ）は、実験例６において、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞を観察した代表的な電子顕微鏡写真である。（ｂ）は、（ａ）の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。 （ａ）は、実験例７において、Ｎｋｘ２－１遺伝子、Ｆｏｘａ１遺伝子及びＧａｔａ６遺伝子の合計３種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入し、遺伝子導入から１２日後に顕微鏡観察し、明視野観察画像及びＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真をマージした画像である。（ｂ）は、実験例７において、蛍光免疫染色によりＳＦＴＰＣタンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）は、実験例７において、蛍光免疫染色によりＡｑｕａｐｏｒｉｎ　５（Ａｑｐ５）タンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例８における、マウスの体重の推移を示すグラフである。（ｂ）は、実験例８における、マウスの生存率の推移を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例８における、マウスの肺の組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色の光学顕微鏡写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例８における、マウスの肺の組織切片の蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 実験例９において、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子、ヒトＧＡＴＡ６遺伝子を様々な組み合わせで導入したヒト成人皮膚由来線維芽細胞株（ＨＤＦａ細胞）におけるＳＦＴＰＣ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
［体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬］
　１実施形態において、本発明は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬を提供する。本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む組成物であるということもできる。あるいは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含むキットであるということもできる。
　実施例において後述するように、発明者らは、線維芽細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることにより、幹細胞を使用することなく、線維芽細胞を直接肺胞上皮細胞に分化誘導することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の分化用試薬によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造することができる。
　本実施形態の分化用試薬において、体細胞としては、例えば、線維芽細胞、血球由来の細胞等が挙げられる。
　本実施形態の分化用試薬は、体細胞中でＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を発現させることができる限りどのような形態であってもよい。例えば、１つの発現ベクターが、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を発現可能に含んでいてもよい。この場合、当該ベクターは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターでもあるということができる。あるいは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターと、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターをそれぞれ別個のベクターとして含んでいてもよい。
　本実施形態の分化用試薬において、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子としては、体細胞の種の遺伝子を使用するとよい。例えば、体細胞がヒトの細胞である場合にはヒトの遺伝子を使用すればよく、体細胞がマウスの細胞である場合にはマウスの遺伝子を使用すればよい。
　ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子としては、例えば、Ｎｋｘ２－１遺伝子、Ｎｋｘ２－２遺伝子、Ｎｋｘ２－５遺伝子、Ｎｋｘ６－１遺伝子等が挙げられる。中でも、Ｎｋｘ２－１遺伝子が好ましい。マウスＮｋｘ２－１遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）は２１８６９であり、ＭＧＩ　ＩＤ（http://www.informatics.jax.org/）は１０８０６７である。また、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）は７０８０である。ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
　また、Ｆｏｘファミリー遺伝子としては、例えばＦｏｘａ１遺伝子、Ｆｏｘａ２遺伝子、Ｆｏｘａ３遺伝子、Ｆｏｘｂ１遺伝子、Ｆｏｘｂ２遺伝子、Ｆｏｘｃ１遺伝子、Ｆｏｘｃ２遺伝子、Ｆｏｘｄ１遺伝子、Ｆｏｘｄ２遺伝子、Ｆｏｘｄ３遺伝子、Ｆｏｘｄ４遺伝子、Ｆｏｘｄ５遺伝子、Ｆｏｘｄ６遺伝子、Ｆｏｘｄ７遺伝子、Ｆｏｘｄ８遺伝子、Ｆｏｘｅ１遺伝子、Ｆｏｘｅ２遺伝子、Ｆｏｘｅ３遺伝子、Ｆｏｘｆ１遺伝子、Ｆｏｘｆ２遺伝子、Ｆｏｘｇ１遺伝子、Ｆｏｘｈ１遺伝子、Ｆｏｘｉ１遺伝子、Ｆｏｘｊ１遺伝子、Ｆｏｘｊ２遺伝子、Ｆｏｘｊ３遺伝子、Ｆｏｘｋ１遺伝子、Ｆｏｘｍ１遺伝子、Ｆｏｘｎ１遺伝子、Ｆｏｘｎ２遺伝子、Ｆｏｘｎ３遺伝子、Ｆｏｘｎ４遺伝子、Ｆｏｘｎ５遺伝子、Ｆｏｘｎ６遺伝子、Ｆｏｘｏ１遺伝子、Ｆｏｘｏ３ａ遺伝子、Ｆｏｘｏ４遺伝子、Ｆｏｘｐ１遺伝子、Ｆｏｘｐ２遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、Ｆｏｘｑ１遺伝子等が挙げられる。中でも、Ｆｏｘａ１遺伝子、Ｆｏｘａ２遺伝子が好ましい。マウスＦｏｘａ１遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは１５３７５であり、ＭＧＩ　ＩＤは１３４７４７２である。また、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは３１６９である。また、マウスＦｏｘａ２遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは１５３７６であり、ＭＧＩ　ＩＤは１３４７４７６である。また、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは３１７０である。Ｆｏｘファミリー遺伝子は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
　本実施形態の分化用試薬は、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを更に含んでいてもよい。すなわち、本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクター及びＧａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを含んでいてもよい。
　実施例において後述するように、分化用試薬がＧａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを含むと、線維芽細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
　本実施形態の分化用試薬において、１つの発現ベクターが、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子及びＧａｔａファミリー遺伝子を発現可能に含んでいてもよい。この場合、当該ベクターは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターでもあるということができる。
　あるいは、本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子及びＧａｔａファミリー遺伝子の３種類の遺伝子のうちの任意の２種類の遺伝子を発現可能に含む１つの発現ベクターと、残りの１種類の遺伝子の発現ベクターとを含んでいてもよい。
　あるいは、本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターと、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターと、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを、それぞれ別個のベクターとして含んでいてもよい。
　本実施形態の分化用試薬において、Ｇａｔａファミリー遺伝子としては、体細胞の種の遺伝子を使用するとよい。例えば、体細胞がヒトの細胞である場合にはヒトの遺伝子を使用すればよく、体細胞がマウスの細胞である場合にはマウスの遺伝子を使用すればよい。
　Ｇａｔａファミリー遺伝子としては、例えば、Ｇａｔａ６遺伝子、Ｇａｔａ１遺伝子、Ｇａｔａ４遺伝子等が挙げられる。中でも、Ｇａｔａ６遺伝子が好ましい。マウスＧａｔａ６遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは１４４６５であり、ＭＧＩ　ＩＤは１０７５１６である。また、ヒトＧＡＴＡ６遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２６２７である。Ｇａｔａファミリー遺伝子は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
　本実施形態の分化用試薬において、発現ベクターはウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは遺伝子の導入効率が高く使いやすい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。
［肺胞上皮細胞の製造方法］
　１実施形態において、本発明は、体細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる工程と、強制発現後の前記体細胞を培養する工程と、を備える、肺胞上皮細胞の製造方法を提供する。
　実施例において後述するように、発明者らは、線維芽細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることにより、幹細胞を使用することなく、線維芽細胞を直接肺胞上皮細胞に分化誘導することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の製造方法によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造することができる。
　本実施形態の方法において、体細胞としては上述したものと同様である。また、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる方法は、特に制限されない。例えば、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを体細胞に導入する方法であってもよい。あるいは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等、及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等を体細胞の培地に添加する方法であってもよい。
　ここで、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子、発現ベクターについては上述したものと同様である。
　また、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる前記工程において、Ｇａｔａファミリー遺伝子を更に強制発現させてもよい。実施例において後述するように、体細胞中で、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子に加えてＧａｔａファミリー遺伝子を強制発現させると、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
　Ｇａｔａファミリー遺伝子を強制発現させる方法は特に制限されず、例えば、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを体細胞に導入する方法であってもよいし、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等を体細胞の培地に添加する方法であってもよい。ここで、Ｇａｔａファミリー遺伝子、発現ベクターについては上述したものと同様である。
　本実施形態の製造方法において、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子、並びに任意選択でＧａｔａファミリー遺伝子を強制発現後の体細胞を培養する工程を、３次元培養により行うことが好ましい。３次元培養の方法としては特に限定されず、例えば、マトリゲルを用いる方法、コラーゲンを用いる方法、ラミニンを用いる方法等が挙げられる。
　実施例において後述するように、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程を３次元培養により行うことにより、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
　また、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程を、デキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の存在下で行うことが好ましい。実施例において後述するように、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程をデキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の存在下で行うことにより、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
　ＦＧＦファミリータンパク質としては、例えば、ＦＧＦ７、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０等が挙げられる。中でも、ＦＧＦ７が好ましい。マウスＦＧＦ７タンパク質のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３２０３４であり、ヒトＦＧＦ７タンパク質のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿００２０００である。また、マウスＦＧＦ２タンパク質のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３２０３２．１であり、ヒトＦＧＦ２タンパク質のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿００１９９７である。また、マウスＦＧＦ１０タンパク質のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３２０２８．１であり、ヒトＦＧＦ１０タンパク質のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿００４４５６．１である。
　遺伝子導入後の体細胞を培養する工程において、培地は、デキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の他にも、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ等のプロテインキナーゼＡ活性化剤；ＩＢＭＸ等のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ又はｃＧＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤；ＣＨＩＲ－９９０２１等のＧｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（ＧＳＫ３）の阻害剤等を含有していてもよい。
［肺胞上皮細胞］
　１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造した肺胞上皮細胞を提供する。本実施形態の肺胞上皮細胞は、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の肺胞上皮細胞の移植が有効な疾患の治療等に用いることができる。
　なお、本実施形態の肺胞上皮細胞は、通常の発生によって分化したものではなく、体細胞に特定遺伝子を強制発現させることにより製造されたものである。このため、通常の肺胞上皮細胞と比較すると遺伝子の発現プロファイル等が異なっていることが予測される。しかしながら、本実施形態の肺胞上皮細胞と通常の肺胞上皮細胞とを識別可能な遺伝子の発現プロファイルの相違点を特定することは困難である。
［細胞医薬］
　１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬を提供する。本実施形態の細胞医薬は、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の肺胞上皮細胞の移植が有効な疾患の治療等に用いることができる。本実施形態の細胞医薬において、肺胞上皮細胞は、患者自身の体細胞から製造されたものであってもよいし、主要組織適合遺伝子複合体が適合する第３者の体細胞から製造されたものであってもよい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む肺疾患の治療方法を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等が挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、肺疾患の治療のための、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の使用を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等が挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、肺疾患の治療薬を製造するための、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の使用を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等が挙げられる。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討１）
　体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子を検討した。体細胞として、マウス胎仔由来の線維芽細胞を使用した。まず、マウス線維芽細胞に、レトロウイルス発現ベクターを用いて、下記表１に示す１４種類のマウス遺伝子を同時に導入して過剰発現させた。表１には、各遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ及びＭＧＩ　ＩＤも記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　続いて、遺伝子導入から７日後に、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ（Ｓｆｔｐｃ）遺伝子及びＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ　Ｆａｍｉｌｙ　１Ａ　Ｍｅｍｂｅｒ　１（Ｓｃｇｂ１ａ１）遺伝子の発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。なお、マウスＳｆｔｐｃ遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２０３８９であり、ＭＧＩ　ＩＤは１０９５１７である。また、マウスＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２２２８７であり、ＭＧＩ　ＩＤは９８９１９である。
　図１（ａ）はＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図１（ｂ）はＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図１（ａ）及び（ｂ）中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「１４Ｆａｃｔｏｒｓ」は表１に示す１４種類の遺伝子を導入した結果を示す。
　その結果、表１に示す１４種類の遺伝子を導入した線維芽細胞では、対照と比較して、Ｓｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が２０００倍以上に増加し、Ｓｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量が３００倍以上に増加したことが明らかとなった。
［実験例２］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討２）
　体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子のより詳細な検討を行った。具体的には、まず、表１に示す１４種類の遺伝子から１種類ずつ遺伝子を除いた１３種類の遺伝子をマウス線維維芽細胞に導入した以外は実験例１と同様にして、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｆｔｐｃ遺伝子の発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりにＧＦＰのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。
　図２は、各遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞におけるＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図２中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「１４Ｆａｃｔｏｒｓ」は表１に示す１４種類の遺伝子を全て導入した結果を示す。また、「１４Ｆ－＃１」は表１に示す１４種類の遺伝子から、表１の番号１の遺伝子を除いた１３種類の遺伝子を導入した結果を示し、以下同様である。また、「ＮＯ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。
　その結果、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）の発現ベクターを除くと、Ｓｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が低下することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にＮｋｘ２－１遺伝子の発現が必須であることを示す。
［実験例３］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討３）
　実験例２の結果から、体細胞から肺胞上皮細胞への分化にＮｋｘ２－１遺伝子の発現が必須であることが明らかとなった。そこで、Ｎｋｘ２－１遺伝子と、表１に示すＮｋｘ２－１遺伝子以外の１３種類の遺伝子から選択した１種類の遺伝子との組み合わせをマウス線維芽細胞に導入し、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりにＧＦＰのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。
　図３（ａ）はＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図３（ｂ）はＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図３（ａ）及び（ｂ）中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「＃１＋＃２」は表１の番号１の遺伝子及び番号２の遺伝子を組み合わせて導入した結果を示し、以下同様である。また、「ＮＯ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。
　その結果、Ｎｋｘ２－１遺伝子と組み合わせて、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）等を導入した線維芽細胞では、Ｓｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にこれらの遺伝子の組み合わせの発現が重要であることを示す。
［実験例４］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討４）
　実験例２、３の結果に基づいて、体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討を更に行った。具体的には、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ３遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）を様々な組み合わせでマウス線維芽細胞に導入し、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりにＧＦＰのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。
　図４（ａ）はＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）はＳＣＧＢ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図４（ａ）及び（ｂ）中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「＃１」は表１の番号１の遺伝子を導入した結果を示し、「＃１＋＃２＋＃３」は表１の番号１、２及び３の遺伝子を組み合わせて導入した結果を示し、以下同様である。また、「ＮＯ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。
　その結果、これらの遺伝子を組み合わせて導入した線維芽細胞では、Ｓｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にこれらの遺伝子の組み合わせの発現が重要であることを示す。
［実験例５］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討１）
　ＳＰＣ－ＧＦＰマウスは、ＳＰＣ（Ｓｆｔｐｃ）遺伝子のプロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子が連結されたコンストラクトが導入されたトランスジェニックマウスである。ＳＰＣ－ＧＦＰマウスでは、Ｓｆｔｐｃ遺伝子を発現する細胞でＧＦＰの蛍光が観察される。そこで、体細胞として、ＳＰＣ－ＧＦＰマウスの胎仔由来の線維芽細胞を使用して肺胞上皮細胞への分化条件の検討を行った。
　まず、ＳＰＣ－ＧＦＰマウスの線維芽細胞に、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ２遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）を様々な組み合わせで導入して２日間２次元培養し、ＧＦＰの蛍光を観察した。
　因子の組み合わせとしては、番号１、番号２、番号３及び番号８の因子の組み合わせ、番号１、番号２及び番号８の因子の組み合わせ、番号１、番号３及び番号８の因子の組み合わせを検討した。
　その結果、ＧＦＰの蛍光は明確には検出されなかった。一方、Ｓｆｔｐｃ遺伝子の発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果、Ｓｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が増加したことが確認された。
［実験例６］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討２）
　ＳＰＣ－ＧＦＰマウスの線維芽細胞に、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ３遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計４種類の遺伝子を導入して１～２日間２次元培養した。
　その後、マトリゲルを用いた３次元培養を行った。３次元培養の培地には、各種液性因子を添加した。表２に、使用した液性因子及び終濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、遺伝子導入から１４日後にＧＦＰ蛍光陽性の細胞が認められるようになった。また、遺伝子導入から２８日後には、５～７％の細胞がＧＦＰ蛍光陽性となった。
　図５（ａ）～（ｃ）は、遺伝子導入から２６日後の細胞の顕微鏡写真である。図５（ａ）は明視野観察画像であり、図５（ｂ）はＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であり、図５（ｃ）は図５（ａ）及び図５（ｂ）の画像をマージした画像である。
　続いて、得られたＧＦＰ蛍光陽性の細胞をセルソーターで回収し、電子顕微鏡で観察した。図６（ａ）及び（ｂ）は代表的な電子顕微鏡写真である。図６（ｂ）は図６（ａ）の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。その結果、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞にはラメラ体と呼ばれる構造体が存在することが明らかとなった。図６（ｂ）中、矢印はラメラ体を示す。ラメラ体は、ＩＩ型肺胞上皮細胞に特徴的な構造体であることが知られている。この結果から、体細胞から誘導した細胞が、形態的にも肺胞上皮細胞であることが明らかとなった。
　同様の実験を繰り返し行った結果、体細胞からＧＦＰ蛍光陽性の細胞を得るためには、液性因子の中でも、特にデキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質（ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０）の存在が重要であると考えられた。更に、ＦＧＦファミリータンパク質の中でも、特にＦＧＦ７の存在が重要であると考えられた。
　以上の結果から、遺伝子導入後の体細胞を３次元培養することや、デキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の存在下で培養すること等により、体細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導効率を顕著に上昇させることができることが明らかとなった。
［実験例７］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討３）
　ＳＰＣ－ＧＦＰマウスの線維芽細胞に、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子、又は番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ２遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子をそれぞれ導入し、実験例６と同様に３次元培養した。
　図７（ａ）は、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入し、遺伝子導入から１２日後に顕微鏡観察し、明視野観察画像及びＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真をマージした画像である。
　その結果、遺伝子導入から１２日後にＧＦＰ蛍光陽性の細胞がクラスターを形成したことが確認された。クラスターの形成は、増殖能を有する肺胞上皮細胞が得られたことを示す。
　また、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ２遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞においても、遺伝子導入から１２日後にＧＦＰ蛍光陽性の細胞がクラスターを形成したことが確認された。
　以上の結果から、３種類の遺伝子の組み合わせの導入によっても、肺胞上皮細胞が得られることが明らかとなった。
　続いて、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２－１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入して得られたＧＦＰ蛍光陽性の細胞を蛍光免疫染色し、ＳＰ－Ｃ（Ｓｆｔｐｃ）タンパク質及びＡｑｕａｐｏｒｉｎ　５（ＡＱＰ５、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３３８３１．１である。）タンパク質の発現を検討した。また、細胞の核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。
　図７（ｂ）は、蛍光免疫染色によりＳＰ－Ｃタンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞が、ＳＰ－Ｃタンパク質を発現していることが確認された。ＳＰ－Ｃは主にＩＩ型肺胞上皮細胞に発現するため一般的にはＩＩ型肺胞上皮細胞マーカーとされる。
　また、図７（ｃ）は、蛍光免疫染色によりＡＱＰ５タンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞が、ＡＱＰ５タンパク質を発現していることが確認された。ＡＱＰ５は主としてＩ型肺胞上皮細胞に発現するため一般的にはＩ型肺胞上皮細胞のマーカーとされる。
　以上の結果から、体細胞から誘導した細胞が、Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞の双方を含むことが示された。
［実験例８］
（分化誘導した肺胞上皮細胞のインフルエンザマウスへの移植）
　マウス馴化インフルエンザウイルス（Ａ／Ｈ１Ｎ１、ＰＲ８）を、２００ｐ．ｆ．ｕ．／マウスの投与量で点鼻感染させた。また、対照として、インフルエンザウイルスの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与したマウスを用意した。
　続いて、１時間後に、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を１×１０６個ずつ経気管支投与した。また、比較のために、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を１×１０６個ずつ経気管支投与したマウス、及び、ＰＢＳを投与したマウスも用意した。
《体重及び生存率の検討》
　続いて、各群のマウスの体重及び生存率の推移を観察した。図８（ａ）は、各群のマウスの体重の推移を示すグラフであり、図８（ｂ）は、各群のマウスの生存率の推移を示すグラフである。図８（ａ）及び（ｂ）中、「Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞（ｉＰＵＬ）を投与した群の結果であることを示し、「Ｆｌｕ＋ＭＥＦ」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群の結果であることを示し、「Ｆｌｕ＋ＰＢＳ」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、ＰＢＳを投与した群の結果であることを示し、「ＰＢＳ＋ｉＰＵＬ」は、マウスにＰＢＳを投与し、続いて胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群の結果であることを示し、「ＰＢＳ＋ＭＥＦ」は、マウスにＰＢＳを投与し、続いて分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群の結果であることを示す。
　その結果、インフルエンザウイルスを感染させたマウスに、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群、ＰＢＳを投与した群の間で、インフルエンザウイルスの感染による体重減少には有意差は認められなかった。一方、インフルエンザウイルスを感染させたマウスに胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与すると、インフルエンザウイルスの感染による死亡を有意に抑制したことが明らかとなった。「Ｆｌｕ＋ＭＥＦ」群の生存率に対する「Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ」群の生存率には、Ｐ＝０．００８で有意差が認められた。
《肺組織切片の組織化学的解析》
　マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群（Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群）、及び、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群（Ｆｌｕ＋ＭＥＦ群）の各群のマウスについて、インフルエンザウイルスの感染から５日目にそれぞれ肺を摘出した。続いて、摘出した肺を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィン包埋組織切片を作製した。続いて、各群の組織切片を、エタノール及び純水にて脱パラフィン処理を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色し、光学顕微鏡で観察した。
　図９（ａ）は、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群の肺の組織切片の顕微鏡写真である。また、図９（ｂ）は、Ｆｌｕ＋ＭＥＦ群の肺の組織切片の顕微鏡写真である。その結果、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群では、インフルエンザウイルスの感染による肺損傷が抑制されたことが明らかとなった。一方、Ｆｌｕ＋ＭＥＦ群では、インフルエンザウイルスの感染による肺損傷を抑制することができなかったことが明らかとなった。
《肺組織切片の蛍光免疫染色》
　続いて、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群の肺の組織切片を免疫染色し、ＧＦＰタンパク質及びＳＰ－Ｃタンパク質の発現を検討した。
　図１０（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。
（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ視野及び倍率が異なっている。図１０（ａ）及び（ｂ）中、ＧＦＰタンパク質及びＳＰ－Ｃタンパク質の二重陽性細胞を矢印で示す。
　その結果、ＧＦＰタンパク質及びＳＰ－Ｃタンパク質の二重陽性細胞の存在が確認された。この結果から、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群の肺に、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞が生着していることが確認された。
［実験例９］
（ヒト線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導）
　ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（細胞名「ＨＤＦａ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子、ヒトＧＡＴＡ６遺伝子を組み合わせて導入し、マウスと同様に肺胞上皮細胞に分化誘導できるか否かを検討した。
　遺伝子の組み合わせとしては、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせ、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせ、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の４遺伝子の組み合わせを検討した。
　各遺伝子の導入には、レトロウイルスシステム（型式「ｐＭＸ」、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用した。また、パッケージング細胞にはＰｌａｔ－ＧＰ細胞（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用した。
　各遺伝子を導入したＨＤＦａ細胞は、遺伝子導入から２日目にマトリゲルを用いた３次元培養を開始した。続いて、遺伝子の導入から１１日目及び１７日目に、各細胞におけるＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。
　図１１は、定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１１中、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量は、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞におけるＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量を１とした相対値で示す。
　その結果、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせを導入したＨＤＦａ細胞では、遺伝子導入から１７日目に、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞の約６３０倍に達したことが明らかとなった。
　また、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせを導入したＨＤＦａ細胞では、遺伝子導入から１７日目に、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞の約２９０倍に達したことが明らかとなった。
　また、ヒトＮＫＸ２－１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の４遺伝子の組み合わせを導入したＨＤＦａ細胞では、遺伝子導入から１７日目に、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞の約５２０倍に達したことが明らかとなった。
　以上の結果から、ヒトにおいても、マウスと同様に、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子、Ｇａｔａファミリー遺伝子の組み合わせを体細胞に発現させることにより、体細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導を行うことができることが明らかとなった。
　本発明によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することができる。

Claims (11)

  1. 　ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
  2. 　Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを更に含む、請求項１に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
  3. 　前記Ｇａｔａファミリー遺伝子がＧａｔａ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　６（Ｇａｔａ６）遺伝子である、請求項２に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
  4. 　前記ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子がＮＫ２　Ｈｏｍｅｏｂｏｘ　１（Ｎｋｘ２－１）遺伝子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
  5. 　前記Ｆｏｘファミリー遺伝子がＦｏｒｋｈｅａｄ　Ｂｏｘ　Ａ１（Ｆｏｘａ１）遺伝子又はＦｏｒｋｈｅａｄ　Ｂｏｘ　Ａ２（Ｆｏｘａ２）遺伝子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
  6. 　体細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることと、
    　強制発現後の前記体細胞を培養することと、
    　を備える、肺胞上皮細胞の製造方法。
  7. 　前記ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることにおいて、Ｇａｔａファミリー遺伝子を更に強制発現させる、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記培養する工程を３次元培養により行う、請求項６又は７に記載の製造方法。
  9. 　前記培養する工程を、デキサメタゾン及びＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の存在下で行う、請求項６～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 　請求項６～９のいずれか一項に記載の製造方法により製造された肺胞上皮細胞。
  11. 　請求項１０の肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬。
PCT/JP2018/016126 2017-04-20 2018-04-19 体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用 WO2018194124A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18787999.4A EP3613857A4 (en) 2017-04-20 2018-04-19 REACTIVE TO DIFFERENTIATE SOMATIC CELLS INTO ALVEOLAR EPITHELIAL CELLS, AND USE OF THE REAGENT
JP2019513683A JP7356626B2 (ja) 2017-04-20 2018-04-19 体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用
US16/606,294 US11718831B2 (en) 2017-04-20 2018-04-19 Reagent for differentiating somatic cells into alveolar epithelial cells, and use of said reagent

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-083814 2017-04-20
JP2017083814 2017-04-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018194124A1 true WO2018194124A1 (ja) 2018-10-25

Family

ID=63856801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/016126 WO2018194124A1 (ja) 2017-04-20 2018-04-19 体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11718831B2 (ja)
EP (1) EP3613857A4 (ja)
JP (1) JP7356626B2 (ja)
WO (1) WO2018194124A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021263281A3 (en) * 2020-06-26 2022-03-10 Ann And Robert H. Lurie Children's Hospital Of Chicago Methods and compositions for the treatment of covid-19 and associated respiratory distress and multi-organ failure, sepsis, acute respiratory distress syndrome, and cordiovascular diseases

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015178496A1 (ja) * 2014-05-20 2015-11-26 国立研究開発法人産業技術総合研究所 肺前駆細胞の作製方法
WO2016143803A1 (ja) * 2015-03-06 2016-09-15 国立大学法人京都大学 肺胞上皮細胞の分化誘導法
JP2017083814A (ja) 2015-10-27 2017-05-18 日本電気硝子株式会社 波長変換部材及びその製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2420566A4 (en) 2009-04-17 2014-01-15 Univ Tohoku METHOD FOR PREPARING HUMAN PULMONARY TISSUE STEM CELLS AND METHOD FOR INDUCING HUMAN ALVEOLAR EPITHELIAL CELL DIFFERENTIATION
WO2015173578A1 (en) * 2014-05-14 2015-11-19 The University Court Of The University Of Aberdeen Methods of obtaining islet cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015178496A1 (ja) * 2014-05-20 2015-11-26 国立研究開発法人産業技術総合研究所 肺前駆細胞の作製方法
WO2016143803A1 (ja) * 2015-03-06 2016-09-15 国立大学法人京都大学 肺胞上皮細胞の分化誘導法
JP2017083814A (ja) 2015-10-27 2017-05-18 日本電気硝子株式会社 波長変換部材及びその製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOTOH S. ET AL.: "Generation of Alveolar Epithelial Spheroids via Isolated Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.", STEM CELL REPORTS, vol. 3, no. 3, 2014, pages 394 - 403, XP055293770, DOI: 10.1016/j.stemcr.2014.07.005
ROSZELL B. ET AL.: "Efficient derivation of alveolar type Π cells from embryonic stem cells for in vivo application.", TISSUE ENG., vol. 15, no. 11, 2009, pages 3351 - 3365, XP055460157, DOI: 10.1089/ten.tea.2008.0664

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021263281A3 (en) * 2020-06-26 2022-03-10 Ann And Robert H. Lurie Children's Hospital Of Chicago Methods and compositions for the treatment of covid-19 and associated respiratory distress and multi-organ failure, sepsis, acute respiratory distress syndrome, and cordiovascular diseases

Also Published As

Publication number Publication date
US20200318074A1 (en) 2020-10-08
JP7356626B2 (ja) 2023-10-05
EP3613857A4 (en) 2021-03-03
US11718831B2 (en) 2023-08-08
JPWO2018194124A1 (ja) 2020-02-27
EP3613857A1 (en) 2020-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Evans et al. Alveolar wars: the rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease
Ma et al. Regeneration of functional alveoli by adult human SOX9+ airway basal cell transplantation
Garreta et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells
Xiang et al. Loss of β-catenin in resident cardiac fibroblasts attenuates fibrosis induced by pressure overload in mice
JP6450311B2 (ja) 腎前駆細胞の製造方法及び腎前駆細胞を含む医薬
Leibel et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy
JP4383896B2 (ja) 脈管形成性の始原細胞をインビトロで同定し、単離し、または分化させるための新規な方法
Carpino et al. Evidence for multipotent endodermal stem/progenitor cell populations in human gallbladder
US8975072B2 (en) Human erythroid progenitor cell line comprising HPV E6/E7 operably linked to an inducible promoter and method for producing human enucleated red blood cells
JP2019213538A (ja) 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法
Clarke et al. The adult mouse dentate gyrus contains populations of committed progenitor cells that are distinct from subependymal zone neural stem cells
US20210030811A1 (en) Use of alveolar or airway organoids for the treatment of lung diseases and disorders
JP2008523823A (ja) ヒト胚性幹細胞の分化ならびにそれに由来する心筋細胞および心筋前駆細胞
US20200199541A1 (en) Blood vessel organoid, methods of producing and using said organoids
US20210395695A1 (en) Method for fabrication of three-dimensional lung organoid comprising human stem cell-derived alveolar macrophage
Tanaka et al. Human induced pluripotent stem cell-derived salivary gland organoids model SARS-CoV-2 infection and replication
AU2017308738A1 (en) Method for generating mesoderm and/or endothelial colony forming cell-like cells having in vivo blood vessel forming capacity
McIntyre et al. Expansive generation of functional airway epithelium from human embryonic stem cells
TW202039828A (zh) 肝細胞擴增方法
Ikeo et al. Core-shell hydrogel microfiber-expanded pluripotent stem cell-derived lung progenitors applicable to lung reconstruction in vivo
WO2015081902A1 (zh) 肝样细胞的新型体外培养方法及采用该方法获得的优化肝样细胞
US7354763B2 (en) Generating vascular smooth muscle cells in vitro from ES cells
Buisson et al. Regenerative medicine of the bile duct: beyond the myth
JP7274683B2 (ja) 多能性幹細胞から樹状分岐した集合管を伴う腎臓構造を作製する方法
WO2018194124A1 (ja) 体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18787999

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019513683

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018787999

Country of ref document: EP

Effective date: 20191120