JP7356626B2 - 体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用に関する。より具体的には、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬、肺胞上皮細胞の製造方法、肺胞上皮細胞及び細胞医薬に関する。本願は、2017年4月20日に、日本に出願された特願2017-083814号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
例えば、特発性肺線維症は、有効な治療方法が知られていない難病の1つである。特発性肺線維症の患者の肺では、肺胞が線維化し、酸素や二酸化炭素が通過する間質が、厚く、硬くなり、ガス交換がうまくできなくなる。特発性肺線維症の治療方法として、肺胞上皮細胞の再生又は移植が期待されている。
従来、肺細胞の再生医療には、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)等の幹細胞を利用する検討が行われてきた。例えば、非特許文献1には、ES細胞を肺胞上皮細胞に分化させる方法が記載されている。また、非特許文献2には、iPS細胞を肺胞上皮細胞に分化させる方法が記載されている。
Roszell B. et al., Efficient derivation of alveolar type II cells from embryonic stem cells for in vivo application., Tissue Eng. Part A. 15 (11), 3351-3365, 2009. Gotoh S. et al., Generation of Alveolar Epithelial Spheroids via Isolated Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells., Stem Cell Reports, 3 (3), 394-403, 2014.
しかしながら、幹細胞から肺胞上皮細胞を得る方法では、発生過程を辿るように数段階の過程を経て幹細胞を分化させる必要がある。このため、肺胞上皮細胞の調製に時間や手間がかかり、臨床応用することが困難な場合がある。また、無限増殖能を持つ幹細胞を使用するため、肺胞上皮細胞を患者に移植した後に奇形腫等の腫瘍が形成される可能性がある。そこで、本発明は、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
[1]NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びFoxファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
[2]NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター、Foxファミリー遺伝子の発現ベクター及びGataファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、[1]に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
[3]前記Gataファミリー遺伝子がGata Binding Protein 6(Gata6)遺伝子である、[2]に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
[4]前記NK2ホメオボックスファミリー遺伝子がNK2 Homeobox 1(Nkx2-1)遺伝子である、[1]~[3]のいずれかに記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
[5]前記Foxファミリー遺伝子がForkhead Box A1(Foxa1)遺伝子又はForkhead Box A2(Foxa2)遺伝子である、[1]~[4]のいずれかに記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
[6]体細胞にNK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させる工程と、強制発現後の前記体細胞を培養する工程と、を備える、肺胞上皮細胞の製造方法。
[7]NK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させる前記工程において、Gataファミリー遺伝子を更に強制発現させる、[6]に記載の製造方法。
[8]前記培養する工程を3次元培養により行う、[6]又は[7]に記載の製造方法。
[9]前記培養する工程を、デキサメタゾン及びFibroblast Growth Factor(FGF)ファミリータンパク質の存在下で行う、[6]~[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10][6]~[9]のいずれかに記載の製造方法により製造された肺胞上皮細胞。
[11][10]の肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬。
本発明によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することができる。
(a)は、実験例1において、遺伝子を導入した線維芽細胞のSurfactant Protein C(Sftpc)遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。(b)は、実験例1において、遺伝子を導入した線維芽細胞のSecretoglobin Family 1A Member 1(Scgb1a1)遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。 実験例2において、各遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞のSftpc遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。 (a)は、実験例3において、遺伝子を導入した線維芽細胞のSftpc遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。(b)は、実験例3において、遺伝子を導入した線維芽細胞のScgb1a1遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。 (a)は、実験例4において、遺伝子を導入した線維芽細胞のSftpc遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。(b)は、実験例4において、遺伝子を導入した線維芽細胞のScgb1a1遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。 (a)~(c)は、実験例6における、遺伝子導入から26日後の細胞の顕微鏡写真である。(a)は明視野観察画像であり、(b)はGFPの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であり、(c)は(a)及び(b)の画像をマージした画像である。 (a)は、実験例6において、GFP蛍光陽性の細胞を観察した代表的な電子顕微鏡写真である。(b)は、(a)の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。 (a)は、実験例7において、Nkx2-1遺伝子、Foxa1遺伝子及びGata6遺伝子の合計3種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入し、遺伝子導入から12日後に顕微鏡観察し、明視野観察画像及びGFPの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真をマージした画像である。(b)は、実験例7において、蛍光免疫染色によりSFTPCタンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。(c)は、実験例7において、蛍光免疫染色によりAquaporin 5(Aqp5)タンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 (a)は、実験例8における、マウスの体重の推移を示すグラフである。(b)は、実験例8における、マウスの生存率の推移を示すグラフである。 (a)及び(b)は、実験例8における、マウスの肺の組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色の光学顕微鏡写真である。 (a)及び(b)は、実験例8における、マウスの肺の組織切片の蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 実験例9において、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA1遺伝子、ヒトFOXA2遺伝子、ヒトGATA6遺伝子を様々な組み合わせで導入したヒト成人皮膚由来線維芽細胞株(HDFa細胞)におけるSFTPC遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。
[体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬]
1実施形態において、本発明は、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びFoxファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬を提供する。本実施形態の分化用試薬は、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びFoxファミリー遺伝子の発現ベクターを含む組成物であるということもできる。あるいは、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びFoxファミリー遺伝子の発現ベクターを含むキットであるということもできる。
実施例において後述するように、発明者らは、線維芽細胞にNK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させることにより、幹細胞を使用することなく、線維芽細胞を直接肺胞上皮細胞に分化誘導することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の分化用試薬によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造することができる。
本実施形態の分化用試薬において、体細胞としては、例えば、線維芽細胞、血球由来の細胞等が挙げられる。
本実施形態の分化用試薬は、体細胞中でNK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を発現させることができる限りどのような形態であってもよい。例えば、1つの発現ベクターが、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を発現可能に含んでいてもよい。この場合、当該ベクターは、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Foxファミリー遺伝子の発現ベクターでもあるということができる。あるいは、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターと、Foxファミリー遺伝子の発現ベクターをそれぞれ別個のベクターとして含んでいてもよい。
本実施形態の分化用試薬において、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子としては、体細胞の種の遺伝子を使用するとよい。例えば、体細胞がヒトの細胞である場合にはヒトの遺伝子を使用すればよく、体細胞がマウスの細胞である場合にはマウスの遺伝子を使用すればよい。
NK2ホメオボックスファミリー遺伝子としては、例えば、Nkx2-1遺伝子、Nkx2-2遺伝子、Nkx2-5遺伝子、Nkx6-1遺伝子等が挙げられる。中でも、Nkx2-1遺伝子が好ましい。マウスNkx2-1遺伝子のNCBI Gene ID(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)は21869であり、MGI ID(http://www.informatics.jax.org/)は108067である。また、ヒトNKX2-1遺伝子のNCBI Gene ID(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)は7080である。NK2ホメオボックスファミリー遺伝子は1種類を単独で用いてもよく、2種類以上を混合して用いてもよい。
また、Foxファミリー遺伝子としては、例えばFoxa1遺伝子、Foxa2遺伝子、Foxa3遺伝子、Foxb1遺伝子、Foxb2遺伝子、Foxc1遺伝子、Foxc2遺伝子、Foxd1遺伝子、Foxd2遺伝子、Foxd3遺伝子、Foxd4遺伝子、Foxd5遺伝子、Foxd6遺伝子、Foxd7遺伝子、Foxd8遺伝子、Foxe1遺伝子、Foxe2遺伝子、Foxe3遺伝子、Foxf1遺伝子、Foxf2遺伝子、Foxg1遺伝子、Foxh1遺伝子、Foxi1遺伝子、Foxj1遺伝子、Foxj2遺伝子、Foxj3遺伝子、Foxk1遺伝子、Foxm1遺伝子、Foxn1遺伝子、Foxn2遺伝子、Foxn3遺伝子、Foxn4遺伝子、Foxn5遺伝子、Foxn6遺伝子、Foxo1遺伝子、Foxo3a遺伝子、Foxo4遺伝子、Foxp1遺伝子、Foxp2遺伝子、Foxp3遺伝子、Foxq1遺伝子等が挙げられる。中でも、Foxa1遺伝子、Foxa2遺伝子が好ましい。マウスFoxa1遺伝子のNCBI Gene IDは15375であり、MGI IDは1347472である。また、ヒトFOXA1遺伝子のNCBI Gene IDは3169である。また、マウスFoxa2遺伝子のNCBI Gene IDは15376であり、MGI IDは1347476である。また、ヒトFOXA2遺伝子のNCBI Gene IDは3170である。Foxファミリー遺伝子は1種類を単独で用いてもよく、2種類以上を混合して用いてもよい。
本実施形態の分化用試薬は、Gataファミリー遺伝子の発現ベクターを更に含んでいてもよい。すなわち、本実施形態の分化用試薬は、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター、Foxファミリー遺伝子の発現ベクター及びGataファミリー遺伝子の発現ベクターを含んでいてもよい。
実施例において後述するように、分化用試薬がGataファミリー遺伝子の発現ベクターを含むと、線維芽細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
本実施形態の分化用試薬において、1つの発現ベクターが、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子、Foxファミリー遺伝子及びGataファミリー遺伝子を発現可能に含んでいてもよい。この場合、当該ベクターは、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Foxファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Gataファミリー遺伝子の発現ベクターでもあるということができる。
あるいは、本実施形態の分化用試薬は、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子、Foxファミリー遺伝子及びGataファミリー遺伝子の3種類の遺伝子のうちの任意の2種類の遺伝子を発現可能に含む1つの発現ベクターと、残りの1種類の遺伝子の発現ベクターとを含んでいてもよい。
あるいは、本実施形態の分化用試薬は、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターと、Foxファミリー遺伝子の発現ベクターと、Gataファミリー遺伝子の発現ベクターを、それぞれ別個のベクターとして含んでいてもよい。
本実施形態の分化用試薬において、Gataファミリー遺伝子としては、体細胞の種の遺伝子を使用するとよい。例えば、体細胞がヒトの細胞である場合にはヒトの遺伝子を使用すればよく、体細胞がマウスの細胞である場合にはマウスの遺伝子を使用すればよい。
Gataファミリー遺伝子としては、例えば、Gata6遺伝子、Gata1遺伝子、Gata4遺伝子等が挙げられる。中でも、Gata6遺伝子が好ましい。マウスGata6遺伝子のNCBI Gene IDは14465であり、MGI IDは107516である。また、ヒトGATA6遺伝子のNCBI Gene IDは2627である。Gataファミリー遺伝子は1種類を単独で用いてもよく、2種類以上を混合して用いてもよい。
本実施形態の分化用試薬において、発現ベクターはウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは遺伝子の導入効率が高く使いやすい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。
[肺胞上皮細胞の製造方法]
1実施形態において、本発明は、体細胞にNK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させる工程と、強制発現後の前記体細胞を培養する工程と、を備える、肺胞上皮細胞の製造方法を提供する。
実施例において後述するように、発明者らは、線維芽細胞にNK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させることにより、幹細胞を使用することなく、線維芽細胞を直接肺胞上皮細胞に分化誘導することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の製造方法によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造することができる。
本実施形態の方法において、体細胞としては上述したものと同様である。また、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させる方法は、特に制限されない。例えば、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びFoxファミリー遺伝子の発現ベクターを体細胞に導入する方法であってもよい。あるいは、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等、及びFoxファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等を体細胞の培地に添加する方法であってもよい。
ここで、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子、Foxファミリー遺伝子、発現ベクターについては上述したものと同様である。
また、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させる前記工程において、Gataファミリー遺伝子を更に強制発現させてもよい。実施例において後述するように、体細胞中で、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子、Foxファミリー遺伝子に加えてGataファミリー遺伝子を強制発現させると、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
Gataファミリー遺伝子を強制発現させる方法は特に制限されず、例えば、Gataファミリー遺伝子の発現ベクターを体細胞に導入する方法であってもよいし、Gataファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等を体細胞の培地に添加する方法であってもよい。ここで、Gataファミリー遺伝子、発現ベクターについては上述したものと同様である。
本実施形態の製造方法において、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子、並びに任意選択でGataファミリー遺伝子を強制発現後の体細胞を培養する工程を、3次元培養により行うことが好ましい。3次元培養の方法としては特に限定されず、例えば、マトリゲルを用いる方法、コラーゲンを用いる方法、ラミニンを用いる方法等が挙げられる。
実施例において後述するように、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程を3次元培養により行うことにより、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
また、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程を、デキサメタゾン及びFGFファミリータンパク質の存在下で行うことが好ましい。実施例において後述するように、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程をデキサメタゾン及びFGFファミリータンパク質の存在下で行うことにより、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
FGFファミリータンパク質としては、例えば、FGF7、FGF2、FGF10等が挙げられる。中でも、FGF7が好ましい。マウスFGF7タンパク質のNCBI Reference SequenceはNP_032034であり、ヒトFGF7タンパク質のNCBI Reference SequenceはNP_002000である。また、マウスFGF2タンパク質のNCBI Reference SequenceはNP_032032.1であり、ヒトFGF2タンパク質のNCBI Reference SequenceはNP_001997である。また、マウスFGF10タンパク質のNCBI Reference SequenceはNP_032028.1であり、ヒトFGF10タンパク質のNCBI Reference SequenceはNP_004456.1である。
遺伝子導入後の体細胞を培養する工程において、培地は、デキサメタゾン及びFGFファミリータンパク質の他にも、8-Br-cAMP等のプロテインキナーゼA活性化剤;IBMX等のcAMPホスホジエステラーゼ又はcGMPホスホジエステラーゼの阻害剤;CHIR-99021等のGlycogen synthase kinase 3(GSK3)の阻害剤等を含有していてもよい。
[肺胞上皮細胞]
1実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造した肺胞上皮細胞を提供する。本実施形態の肺胞上皮細胞は、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等の肺胞上皮細胞の移植が有効な疾患の治療等に用いることができる。
なお、本実施形態の肺胞上皮細胞は、通常の発生によって分化したものではなく、体細胞に特定遺伝子を強制発現させることにより製造されたものである。このため、通常の肺胞上皮細胞と比較すると遺伝子の発現プロファイル等が異なっていることが予測される。しかしながら、本実施形態の肺胞上皮細胞と通常の肺胞上皮細胞とを識別可能な遺伝子の発現プロファイルの相違点を特定することは困難である。
[細胞医薬]
1実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬を提供する。本実施形態の細胞医薬は、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等の肺胞上皮細胞の移植が有効な疾患の治療等に用いることができる。本実施形態の細胞医薬において、肺胞上皮細胞は、患者自身の体細胞から製造されたものであってもよいし、主要組織適合遺伝子複合体が適合する第3者の体細胞から製造されたものであってもよい。
[その他の実施形態]
1実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む肺疾患の治療方法を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等が挙げられる。
1実施形態において、本発明は、肺疾患の治療のための、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の使用を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等が挙げられる。
1実施形態において、本発明は、肺疾患の治療薬を製造するための、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の使用を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等が挙げられる。
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
[実験例1]
(体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討1)
体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子を検討した。体細胞として、マウス胎仔由来の線維芽細胞を使用した。まず、マウス線維芽細胞に、レトロウイルス発現ベクターを用いて、下記表1に示す14種類のマウス遺伝子を同時に導入して過剰発現させた。表1には、各遺伝子のNCBI Gene ID及びMGI IDも記載した。
Figure 0007356626000001
続いて、遺伝子導入から7日後に、肺胞上皮細胞のマーカーであるSurfactant Protein C(Sftpc)遺伝子及びSecretoglobin Family 1A Member 1(Scgb1a1)遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにより測定した。また、対照として、表1に示す遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質(GFP)のレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。なお、マウスSftpc遺伝子のNCBI Gene IDは20389であり、MGI IDは109517である。また、マウスScgb1a1遺伝子のNCBI Gene IDは22287であり、MGI IDは98919である。
図1(a)はSftpc遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図1(b)はScgb1a1遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。図1(a)及び(b)中、「GFP」は対照細胞の結果を示し、「14Factors」は表1に示す14種類の遺伝子を導入した結果を示す。
その結果、表1に示す14種類の遺伝子を導入した線維芽細胞では、対照と比較して、Sftpc遺伝子のmRNAの発現量が2000倍以上に増加し、Scgb1a1遺伝子のmRNAの発現量が300倍以上に増加したことが明らかとなった。
[実験例2]
(体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討2)
体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子のより詳細な検討を行った。具体的には、まず、表1に示す14種類の遺伝子から1種類ずつ遺伝子を除いた13種類の遺伝子をマウス線維維芽細胞に導入した以外は実験例1と同様にして、肺胞上皮細胞のマーカーであるSftpc遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにより測定した。また、対照として、表1に示す遺伝子の代わりにGFPのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。
図2は、各遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞におけるSftpc遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。図2中、「GFP」は対照細胞の結果を示し、「14Factors」は表1に示す14種類の遺伝子を全て導入した結果を示す。また、「14F-#1」は表1に示す14種類の遺伝子から、表1の番号1の遺伝子を除いた13種類の遺伝子を導入した結果を示し、以下同様である。また、「NO transfect」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。
その結果、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)の発現ベクターを除くと、Sftpc遺伝子のmRNAの発現量が低下することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にNkx2-1遺伝子の発現が必須であることを示す。
[実験例3]
(体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討3)
実験例2の結果から、体細胞から肺胞上皮細胞への分化にNkx2-1遺伝子の発現が必須であることが明らかとなった。そこで、Nkx2-1遺伝子と、表1に示すNkx2-1遺伝子以外の13種類の遺伝子から選択した1種類の遺伝子との組み合わせをマウス線維芽細胞に導入し、肺胞上皮細胞のマーカーであるSftpc遺伝子及びScgb1a1遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにより測定した。また、対照として、表1に示す遺伝子の代わりにGFPのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。
図3(a)はSftpc遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図3(b)はScgb1a1遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。図3(a)及び(b)中、「GFP」は対照細胞の結果を示し、「#1+#2」は表1の番号1の遺伝子及び番号2の遺伝子を組み合わせて導入した結果を示し、以下同様である。また、「NO transfect」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。
その結果、Nkx2-1遺伝子と組み合わせて、番号2の因子(Foxa1遺伝子)、番号8の因子(Gata6遺伝子)等を導入した線維芽細胞では、Sftpc遺伝子及びScgb1a1遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にこれらの遺伝子の組み合わせの発現が重要であることを示す。
[実験例4]
(体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討4)
実験例2、3の結果に基づいて、体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討を更に行った。具体的には、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号2の因子(Foxa1遺伝子)、番号3の因子(Foxa3遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)を様々な組み合わせでマウス線維芽細胞に導入し、肺胞上皮細胞のマーカーであるSftpc遺伝子及びScgb1a1遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにより測定した。また、対照として、表1に示す遺伝子の代わりにGFPのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。
図4(a)はSftpc遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図4(b)はSCGB1A1遺伝子のmRNAの発現量を測定した結果を示すグラフである。図4(a)及び(b)中、「GFP」は対照細胞の結果を示し、「#1」は表1の番号1の遺伝子を導入した結果を示し、「#1+#2+#3」は表1の番号1、2及び3の遺伝子を組み合わせて導入した結果を示し、以下同様である。また、「NO transfect」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。
その結果、これらの遺伝子を組み合わせて導入した線維芽細胞では、Sftpc遺伝子及びScgb1a1遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にこれらの遺伝子の組み合わせの発現が重要であることを示す。
[実験例5]
(体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討1)
SPC-GFPマウスは、SPC(Sftpc)遺伝子のプロモーターの下流にGFP遺伝子が連結されたコンストラクトが導入されたトランスジェニックマウスである。SPC-GFPマウスでは、Sftpc遺伝子を発現する細胞でGFPの蛍光が観察される。そこで、体細胞として、SPC-GFPマウスの胎仔由来の線維芽細胞を使用して肺胞上皮細胞への分化条件の検討を行った。
まず、SPC-GFPマウスの線維芽細胞に、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号2の因子(Foxa1遺伝子)、番号3の因子(Foxa2遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)を様々な組み合わせで導入して2日間2次元培養し、GFPの蛍光を観察した。
因子の組み合わせとしては、番号1、番号2、番号3及び番号8の因子の組み合わせ、番号1、番号2及び番号8の因子の組み合わせ、番号1、番号3及び番号8の因子の組み合わせを検討した。
その結果、GFPの蛍光は明確には検出されなかった。一方、Sftpc遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにより測定した結果、Sftpc遺伝子のmRNAの発現量が増加したことが確認された。
[実験例6]
(体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討2)
SPC-GFPマウスの線維芽細胞に、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号2の因子(Foxa1遺伝子)、番号3の因子(Foxa3遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)の合計4種類の遺伝子を導入して1~2日間2次元培養した。
その後、マトリゲルを用いた3次元培養を行った。3次元培養の培地には、各種液性因子を添加した。表2に、使用した液性因子及び終濃度を示す。
Figure 0007356626000002
その結果、遺伝子導入から14日後にGFP蛍光陽性の細胞が認められるようになった。また、遺伝子導入から28日後には、5~7%の細胞がGFP蛍光陽性となった。
図5(a)~(c)は、遺伝子導入から26日後の細胞の顕微鏡写真である。図5(a)は明視野観察画像であり、図5(b)はGFPの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であり、図5(c)は図5(a)及び図5(b)の画像をマージした画像である。
続いて、得られたGFP蛍光陽性の細胞をセルソーターで回収し、電子顕微鏡で観察した。図6(a)及び(b)は代表的な電子顕微鏡写真である。図6(b)は図6(a)の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。その結果、GFP蛍光陽性の細胞にはラメラ体と呼ばれる構造体が存在することが明らかとなった。図6(b)中、矢印はラメラ体を示す。ラメラ体は、II型肺胞上皮細胞に特徴的な構造体であることが知られている。この結果から、体細胞から誘導した細胞が、形態的にも肺胞上皮細胞であることが明らかとなった。
同様の実験を繰り返し行った結果、体細胞からGFP蛍光陽性の細胞を得るためには、液性因子の中でも、特にデキサメタゾン及びFGFファミリータンパク質(FGF2、FGF7、FGF10)の存在が重要であると考えられた。更に、FGFファミリータンパク質の中でも、特にFGF7の存在が重要であると考えられた。
以上の結果から、遺伝子導入後の体細胞を3次元培養することや、デキサメタゾン及びFGFファミリータンパク質の存在下で培養すること等により、体細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導効率を顕著に上昇させることができることが明らかとなった。
[実験例7]
(体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討3)
SPC-GFPマウスの線維芽細胞に、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号2の因子(Foxa1遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)の合計3種類の遺伝子、又は番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号3の因子(Foxa2遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)の合計3種類の遺伝子をそれぞれ導入し、実験例6と同様に3次元培養した。
図7(a)は、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号2の因子(Foxa1遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)の合計3種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入し、遺伝子導入から12日後に顕微鏡観察し、明視野観察画像及びGFPの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真をマージした画像である。
その結果、遺伝子導入から12日後にGFP蛍光陽性の細胞がクラスターを形成したことが確認された。クラスターの形成は、増殖能を有する肺胞上皮細胞が得られたことを示す。
また、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号3の因子(Foxa2遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)の合計3種類の遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞においても、遺伝子導入から12日後にGFP蛍光陽性の細胞がクラスターを形成したことが確認された。
以上の結果から、3種類の遺伝子の組み合わせの導入によっても、肺胞上皮細胞が得られることが明らかとなった。
続いて、表1に示す番号1の因子(Nkx2-1遺伝子)、番号2の因子(Foxa1遺伝子)及び番号8の因子(Gata6遺伝子)の合計3種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入して得られたGFP蛍光陽性の細胞を蛍光免疫染色し、SP-C(Sftpc)タンパク質及びAquaporin 5(AQP5、NCBI Reference SequenceはNP_033831.1である。)タンパク質の発現を検討した。また、細胞の核を4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色した。
図7(b)は、蛍光免疫染色によりSP-Cタンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、GFP蛍光陽性の細胞が、SP-Cタンパク質を発現していることが確認された。SP-Cは主にII型肺胞上皮細胞に発現するため一般的にはII型肺胞上皮細胞マーカーとされる。
また、図7(c)は、蛍光免疫染色によりAQP5タンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、GFP蛍光陽性の細胞が、AQP5タンパク質を発現していることが確認された。AQP5は主としてI型肺胞上皮細胞に発現するため一般的にはI型肺胞上皮細胞のマーカーとされる。
以上の結果から、体細胞から誘導した細胞が、I型肺胞上皮細胞及びII型肺胞上皮細胞の双方を含むことが示された。
[実験例8]
(分化誘導した肺胞上皮細胞のインフルエンザマウスへの移植)
マウス馴化インフルエンザウイルス(A/H1N1、PR8)を、200p.f.u./マウスの投与量で点鼻感染させた。また、対照として、インフルエンザウイルスの代わりにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を投与したマウスを用意した。
続いて、1時間後に、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を1×10個ずつ経気管支投与した。また、比較のために、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を1×10個ずつ経気管支投与したマウス、及び、PBSを投与したマウスも用意した。
《体重及び生存率の検討》
続いて、各群のマウスの体重及び生存率の推移を観察した。図8(a)は、各群のマウスの体重の推移を示すグラフであり、図8(b)は、各群のマウスの生存率の推移を示すグラフである。図8(a)及び(b)中、「Flu+iPUL」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞(iPUL)を投与した群の結果であることを示し、「Flu+MEF」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群の結果であることを示し、「Flu+PBS」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、PBSを投与した群の結果であることを示し、「PBS+iPUL」は、マウスにPBSを投与し、続いて胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群の結果であることを示し、「PBS+MEF」は、マウスにPBSを投与し、続いて分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群の結果であることを示す。
その結果、インフルエンザウイルスを感染させたマウスに、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群、PBSを投与した群の間で、インフルエンザウイルスの感染による体重減少には有意差は認められなかった。一方、インフルエンザウイルスを感染させたマウスに胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与すると、インフルエンザウイルスの感染による死亡を有意に抑制したことが明らかとなった。「Flu+MEF」群の生存率に対する「Flu+iPUL」群の生存率には、P=0.008で有意差が認められた。
《肺組織切片の組織化学的解析》
マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群(Flu+iPUL群)、及び、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群(Flu+MEF群)の各群のマウスについて、インフルエンザウイルスの感染から5日目にそれぞれ肺を摘出した。続いて、摘出した肺を4%パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィン包埋組織切片を作製した。続いて、各群の組織切片を、エタノール及び純水にて脱パラフィン処理を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色し、光学顕微鏡で観察した。
図9(a)は、Flu+iPUL群の肺の組織切片の顕微鏡写真である。また、図9(b)は、Flu+MEF群の肺の組織切片の顕微鏡写真である。その結果、Flu+iPUL群では、インフルエンザウイルスの感染による肺損傷が抑制されたことが明らかとなった。一方、Flu+MEF群では、インフルエンザウイルスの感染による肺損傷を抑制することができなかったことが明らかとなった。
《肺組織切片の蛍光免疫染色》
続いて、Flu+iPUL群の肺の組織切片を免疫染色し、GFPタンパク質及びSP-Cタンパク質の発現を検討した。
図10(a)及び(b)は、免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。
(a)及び(b)はそれぞれ視野及び倍率が異なっている。図10(a)及び(b)中、GFPタンパク質及びSP-Cタンパク質の二重陽性細胞を矢印で示す。
その結果、GFPタンパク質及びSP-Cタンパク質の二重陽性細胞の存在が確認された。この結果から、Flu+iPUL群の肺に、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞が生着していることが確認された。
[実験例9]
(ヒト線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導)
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞(細胞名「HDFa」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)に、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA1遺伝子、ヒトFOXA2遺伝子、ヒトGATA6遺伝子を組み合わせて導入し、マウスと同様に肺胞上皮細胞に分化誘導できるか否かを検討した。
遺伝子の組み合わせとしては、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA1遺伝子及びヒトGATA6遺伝子の3遺伝子の組み合わせ、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA2遺伝子及びヒトGATA6遺伝子の3遺伝子の組み合わせ、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA1遺伝子、ヒトFOXA2遺伝子及びヒトGATA6遺伝子の4遺伝子の組み合わせを検討した。
各遺伝子の導入には、レトロウイルスシステム(型式「pMX」、Cell Biolabs社)を使用した。また、パッケージング細胞にはPlat-GP細胞(Cell Biolabs社)を使用した。
各遺伝子を導入したHDFa細胞は、遺伝子導入から2日目にマトリゲルを用いた3次元培養を開始した。続いて、遺伝子の導入から11日目及び17日目に、各細胞におけるSFTPC遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにより測定した。
図11は、定量的RT-PCRの結果を示すグラフである。図11中、SFTPC遺伝子の発現量は、遺伝子を導入していないHDFa細胞におけるSFTPC遺伝子の発現量を1とした相対値で示す。
その結果、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA1遺伝子及びヒトGATA6遺伝子の3遺伝子の組み合わせを導入したHDFa細胞では、遺伝子導入から17日目に、SFTPC遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないHDFa細胞の約630倍に達したことが明らかとなった。
また、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA2遺伝子及びヒトGATA6遺伝子の3遺伝子の組み合わせを導入したHDFa細胞では、遺伝子導入から17日目に、SFTPC遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないHDFa細胞の約290倍に達したことが明らかとなった。
また、ヒトNKX2-1遺伝子、ヒトFOXA1遺伝子、ヒトFOXA2遺伝子及びヒトGATA6遺伝子の4遺伝子の組み合わせを導入したHDFa細胞では、遺伝子導入から17日目に、SFTPC遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないHDFa細胞の約520倍に達したことが明らかとなった。
以上の結果から、ヒトにおいても、マウスと同様に、NK2ホメオボックスファミリー遺伝子、Foxファミリー遺伝子、Gataファミリー遺伝子の組み合わせを体細胞に発現させることにより、体細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導を行うことができることが明らかとなった。
本発明によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することができる。

Claims (8)

  1. NK2ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びFoxファミリー遺伝子の発現ベクターを含み、
    前記NK2ホメオボックスファミリー遺伝子がNK2 Homeobox 1(Nkx2-1)遺伝子であり、
    前記Foxファミリー遺伝子がForkhead Box A1(Foxa1)遺伝子又はForkhead Box A2(Foxa2)遺伝子である、
    マウス胎仔由来線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
  2. Gataファミリー遺伝子の発現ベクターを更に含み、
    前記Gataファミリー遺伝子がGata Binding Protein 6(Gata6)遺伝子である、請求項1に記載のマウス胎仔由来線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
  3. マウス胎仔由来線維芽細胞にNK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させることと、
    強制発現後の前記マウス胎仔由来線維芽細胞を培養することと、
    を備え、
    前記NK2ホメオボックスファミリー遺伝子がNkx2-1遺伝子であり、
    前記Foxファミリー遺伝子がFoxa1遺伝子又はFoxa2遺伝子である、
    肺胞上皮細胞の製造方法。
  4. 前記NK2ホメオボックスファミリー遺伝子及びFoxファミリー遺伝子を強制発現させることにおいて、Gataファミリー遺伝子を更に強制発現させ、
    前記Gataファミリー遺伝子がGata6遺伝子である、
    請求項3に記載の製造方法。
  5. 前記培養する工程を3次元培養により行う、請求項3又は4に記載の製造方法。
  6. 前記培養する工程を、デキサメタゾン及びFibroblast Growth Factor(FGF)ファミリータンパク質の存在下で行う、請求項3~5のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 請求項3~6のいずれか一項に記載の製造方法により製造された肺胞上皮細胞。
  8. 請求項7の肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬。
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