WO2018190348A1 - 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a set of polypeptides used for light-dependent genetic recombination.
  • Cre protein which is a recombination enzyme, acts on a DNA sequence called a loxP sequence to cause site-specific gene recombination. Cre protein is an enzyme derived from bacteriophage P1, and is widely used in genetic engineering technology (Non-patent Document 1).
  • a control technique in which activity is reconstituted in a light-dependent manner or in the presence of a drug using split Cre obtained by dividing Cre protein into two polypeptides.
  • a technique using CRY2-CreN and CIBN-CreC which is a combination of a Cre / loxP system and an optical switch protein, is disclosed (Patent Document 1, Non-Patent Documents 2, 3).
  • the split-Cre-FRB / FKBP system is disclosed as a technique for controlling gene recombination in the presence of a drug (Non-patent Documents 4 and 5).
  • Non-Patent Documents 6 and 7 molecular control approaches that utilize photoactivation of proteins have emerged and are called optogenetics.
  • the present inventors have modified the Vivid protein derived from Neurospora crassa that forms a homodimer in a light-dependent manner and can precisely control the formation and dissociation of the dimer by light irradiation.
  • a set of two proteins forming a dimer was developed (Patent Document 2, Non-Patent Document 8).
  • two fragments of Cas9 which is used in the CRISPR-Cas9 system as a genome editing tool, are divided into two fragments and two polypeptides that form dimers in a light-dependent or drug presence.
  • a set of polypeptides was developed (Patent Document 3, Non-Patent Document 9).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a new set of polypeptides used for light-dependent gene recombination, which has a split Cre obtained by dividing a Cre protein into two polypeptides.
  • the inventor of the present invention splits the Cre protein into two, and the specific site of the N-terminal fragment (CreN) and C-terminal fragment (CreC) of the split Cre.
  • CreN N-terminal fragment
  • CreC C-terminal fragment
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment of the Cre protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are used for light-dependent genetic recombination, which binds to two proteins that form dimers in a light-dependent manner, respectively.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein are each a fragment having a cleavage site in the region from position 59 to position 68 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 A fragment having a cleavage site in the region of positions 101 to 111;
  • the C-terminal amino acid of the N-terminal fragment of Cre protein and the N-terminal amino acid of the C-terminal fragment of Cre protein each bind to two proteins that form a dimer in a light-dependent manner,
  • Two proteins that form a dimer in a light-dependent manner are each a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a variant thereof, and at least one protein located in the N-terminal ⁇ -helix in at least one protein A set of two polypeptides in which two amino acids are replaced.
  • the N-terminal fragment of the Cre protein has at least a region at positions 19 to 59 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the C-terminal fragment of the Cre protein has positions 68 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Has at least a region of The N-terminal fragment of Cre protein has at least a region from positions 19 to 101 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the C-terminal fragment of Cre protein has positions 111 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the set of two polypeptides according to [1] having at least a region in the position.
  • the N-terminal fragment of the Cre protein has at least a region at positions 19 to 59 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the C-terminal fragment of the Cre protein has positions 60 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal fragment of Cre protein has at least a region from positions 19 to 104 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the C-terminal fragment of Cre protein has positions 106 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the set of two polypeptides according to [1] having at least a region in the position.
  • the sequence number of at least one fragment includes one to several amino acid additions, substitutions, or deletions, or the sequence of at least one fragment corresponds : A set of two polypeptides according to any one of [1] to [4], which is a fragment having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence of 1.
  • [6] In one of the two proteins that form a dimer in a light-dependent manner, at least amino acids corresponding to positions 52 and / or 55 of SEQ ID NO: 2 are substituted with lysine, arginine, or histidine, and are light-dependent.
  • one polypeptide in the set of two polypeptides is an N-terminal fragment of the Cre protein—a protein that forms a dimer in a light-dependent manner—nuclear localization signal sequence—2A Having an amino acid sequence in the order of part of the peptide sequence;
  • Another polypeptide is part of the 2A peptide sequence from the N-terminal side to the C-terminal side-nuclear localization signal sequence-protein that forms a dimer in a light-dependent manner-of the C-terminal fragment of the Cre protein
  • the set of two polypeptides according to any one of [1] to [10], which have an amino acid sequence in order.
  • [13] A nucleic acid encoding the set of two polypeptides according to any one of [1] to [12].
  • [14] N-terminal fragment of Cre protein-protein that forms dimer in a light-dependent manner-nuclear localization signal sequence-2A peptide sequence-nuclear localization signal sequence-a protein that forms dimer in a light-dependent manner-
  • the nucleic acid according to [13] which encodes a polypeptide having an amino acid sequence in the order of a C-terminal fragment of Cre protein.
  • An expression vector comprising the nucleic acid according to [13] or [14].
  • [16] A set of two polypeptides according to any one of [1] to [12], a nucleic acid according to [13] or [14], or an expression vector according to [15], and a loxP sequence or a loxP variant sequence
  • a Cre-loxP system containing a nucleic acid that is [17] The Cre-loxP system according to [16], wherein the loxP mutant is selected from the group consisting of lox2722, lox66, lox71, JT15 and JTZ17.
  • FIG. 2 shows a conceptual diagram of a construct of a set of polypeptides (hereinafter sometimes referred to as “PA-Cre: photo-activatable Cre recombinase”) used for light-dependent genetic recombination according to the present invention.
  • PA-Cre photo-activatable Cre recombinase
  • Step 2 A construct that binds nMag to the N-terminal amino acid of CreN59 and a construct that binds nMag to the C-terminal amino acid of CreN59 are shown.
  • CreN and CreC respectively indicate an N-terminal fragment and a C-terminal fragment of split Cre obtained by dividing the Cre protein into two.
  • CreN59 represents an N-terminal fragment having a region from positions 19 to 59 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • CreC60 represents a C-terminal side having a region from positions 60 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • PMag and nMag represent two proteins that form dimers in a light-dependent manner, and NLS represents a nuclear localization signal sequence.
  • Step 3 Three different lengths of constructs that bind nMag to the C-terminal amino acid of CreN59 via a linker, and constructs that bind CreC60 to the C-terminal amino acid of pMag via a linker (16 A construct having a linker (SEQ ID NOs: 3 to 5) of aa, 19 aa, 2 aa) is shown.
  • Step 4 A construct that binds the nuclear localization signal sequence (NLS) to the N-terminal amino acid of CreN59 and a construct that binds to the C-terminal amino acid of nMag are shown.
  • NLS nuclear localization signal sequence
  • Step 5 Shows the amino acid sequence of the P2A peptide used as the 2A peptide (P2A peptide sequence, SEQ ID NO: 6).
  • P2A peptide sequence SEQ ID NO: 6
  • the evaluation result of the luciferase assay of each construct of PA-Cre shown in FIG. 1 is shown.
  • Step 1 When the Cre protein is cleaved between the 59th and 60th amino acids (59/60) and cleaved between the 104th and 106th amino acids (104/106) Results are shown.
  • Step 2 The results of a construct that binds nMag to the N-terminal amino acid of CreN59 and a construct that binds nMag to the C-terminal amino acid of CreN59 are shown.
  • Step 3 Three different lengths are used as linkers in the construct that binds the C-terminal amino acid of CreN59 and nMag via a linker and the construct that binds the C-terminal amino acid of pMag and CreC60 via a linker.
  • the results for each construct when using peptides of size (16 aa, 19 aa, 2 aa) are shown.
  • Step IV The results of the construct that binds the nuclear localization sequence (NLS) to the N-terminal amino acid of CreN59 and the construct that binds to the C-terminal amino acid of nMag are shown.
  • Step 5 Shows the result of the construct having the P2A peptide sequence.
  • PA-Cre The conceptual diagram of the optical manipulation of the DNA recombination reaction by PA-Cre is shown.
  • A The principle of DNA recombination with PA-Cre is shown. PA-Cre has no activity in the dark (Inactivate PA-Cre) but is activated by light irradiation (Activate PA-Cre) and catalyzes DNA recombination between two loxP sequences.
  • B An example of an expression vector for PA-Cre and an example of a reporter for evaluating DNA recombination by PA-Cre are shown. lox2722, lox66, lox71, JT15, and JTZ17 are loxP mutants.
  • PA-Cre can catalyze DNA recombination in the same way as loxP.
  • P2A is a 2A peptide sequence
  • PCMV is a CMV promoter
  • pA is a transcription termination sequence
  • Fluc is a luciferase cDNA.
  • the secondary structure of Cre protein and the cleavage site in the examples are shown. For example, the case of cutting between the 59th amino acid and the 60th amino acid (59/60) and the case of cutting between the 104th amino acid and the 106th amino acid (104/106) are shown.
  • loxP and loxP2 mutants lox2722, lox66, lox71, JT15, and JTZ17 are shown (respectively corresponding to the base sequences of SEQ ID NOs: 7 to 12, respectively).
  • lox72 SEQ ID NO: 13
  • JA15-JTZ17 SEQ ID NO: 14
  • PA-Cre The evaluation result of PA-Cre is shown.
  • A It shows that the DNA recombination activity of PA-Cre is induced by light irradiation. Evaluation was performed using a reporter (Floxed-STOP-Fluc in FIG.
  • FIG. 6c shows the results of experiments conducted by changing the series of luciferase reporters used in FIG. 6c to reporters that express the fluorescent protein mCherry by DNA recombination.
  • PA-Cre efficiently causes DNA recombination reaction with any loxP mutant, whereas CRY2-CIB1-split Cre has low DNA recombination efficiency.
  • E shows the results of PA-Cre evaluation in various cell types.
  • F shows the results of DNA recombination activity of PA-Cre depending on the light irradiation intensity. The result of the spatial control of the DNA recombination reaction by PA-Cre is shown.
  • a reporter (Floxed-STOP-Fluc in Fig. 3b) in which luciferase is expressed by DNA recombination is used.
  • the evaluation result of PA-Cre is shown.
  • A A conceptual diagram of a reporter design in which a luciferase gene is knocked out by DNA recombination is shown.
  • (b) The result of spatially controlling the DNA recombination reaction by applying pattern irradiation to cells cultured in 6 centimeters.
  • the reporter of FIG. 8a in which the luciferase gene is knocked out by DNA recombination, is used.
  • the kinetics of PA-Cre DNA recombination reaction is shown.
  • A The result of having evaluated the kinetics of the DNA recombination reaction by PA-Cre by irradiating cells expressing PA-Cre for various periods of time. Evaluation was performed using a reporter (Floxed-STOP-Fluc in FIG. 3b) in which luciferase is expressed by DNA recombination.
  • B The result of evaluating the kinetics of the DNA recombination reaction by PA-Cre using a reporter (Floxed-STOP-mCherry) expressed by fluorescent protein mCherry by DNA recombination is shown.
  • the examination result of the light irradiation condition in DNA recombination reaction by PA-Cre is shown.
  • A The example of various light irradiation conditions is shown.
  • B To compare the responsiveness of PA-Cre and CRY2-CIB1-split Cre to various light irradiation conditions, using a reporter (Floxed-STOP-Fluc in Figure 3b) that luciferase is expressed by DNA recombination evaluated.
  • PA-Cre can fully manipulate the DNA recombination reaction not only for long-time light irradiation but also for short-time light irradiation (1-shot) of about 30 seconds.
  • PA-Cre can efficiently induce luciferase expression even after 30 seconds of light irradiation from outside the body, but CRY2-CIB1-splitCre does not show any expression.
  • B After performing a short-time light irradiation for 30 seconds from the outside of the living body, the liver is extracted from the mouse, and an luminescence image of luciferase is shown. PA-Cre can efficiently induce luciferase expression, but CRY2-CIB1-splitCre does not show any expression.
  • C The examination of FIG. 12b was repeated and the results were summarized. The result of application of PA-Cre to mice is shown.
  • PA-Cre can induce luciferase expression efficiently, but CRY2-CIB1-splitCre shows almost no expression. PA-Cre does not express luciferase at all in room brightness.
  • C The examination of FIG. 13b was repeated and the results were summarized.
  • the amino acid sequence of PA-Cre according to the present invention when the Cre protein is cleaved between the 59th amino acid and the 60th amino acid is shown.
  • the amino acid sequence of PA-Cre according to the present invention when the Cre protein is cleaved between the 104th amino acid and the 106th amino acid is shown.
  • the base sequence inserted into the PA-Cre vector according to the present invention when the Cre protein is cleaved between the 59th and 60th amino acids is shown.
  • the base sequence inserted into the PA-Cre vector according to the present invention when the Cre protein is cleaved between the 104th amino acid and the 106th amino acid is shown.
  • the set of two polypeptides according to the present invention includes two N-terminal fragments and a C-terminal fragment of the Cre protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, each of which forms a dimer in a light-dependent manner.
  • a set of two polypeptides used for light-dependent genetic recombination that bind The N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein are each a fragment having a cleavage site in the region from position 59 to position 68 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the C-terminal amino acid of the N-terminal fragment of Cre protein and the N-terminal amino acid of the C-terminal fragment of Cre protein each bind to two proteins that form a dimer in a light-dependent manner, Two proteins that form a dimer in a light-dependent manner are each a polypeptide consisting of
  • two magnet proteins that form dimers in a light-dependent manner by binding the N-terminal fragment of the Cre protein to one of the two proteins that form a dimer in a light-dependent manner with the C-terminal amino acid.
  • a C-terminal fragment of the Cre protein is bound to the other protein at the N-terminal amino acid.
  • two proteins that form a dimer in a light-dependent manner form a dimer by light irradiation to form a dimer in a light-dependent manner.
  • the N-terminal fragment of the Cre protein that binds to the two proteins and the C-terminal fragment of the Cre protein are reconstituted as a Cre protein to restore the recombinase activity of the Cre protein. Therefore, the set of two polypeptides according to the present invention can be used for light-dependent gene recombination.
  • being used for gene recombination means a gene recombination technique using the Cre / loxP system.
  • the Cre protein has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is within the region of positions 59 to 68 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or from the 101st position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 the N-terminal fragment in SEQ ID NO: 1
  • CreC Cre protein C-terminal fragment
  • SEQ ID NO: 1 has the amino acid sequence of the N-terminal region.
  • the C-terminal amino acid of the N-terminal fragment of Cre protein is an amino acid on the N-terminal side of the N-terminal amino acid of the C-terminal fragment in the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment of Cre protein may each be a fragment consisting of a partial sequence of Cre protein or a sequence containing a mutation in the partial sequence.
  • a fragment consisting of a partial sequence of Cre protein is an amino acid sequence from the N-terminal amino acid to the amino acid at the cleavage site in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 when the Cre protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is cleaved. It means a fragment having a partial sequence or having a partial sequence in the amino acid sequence from the amino acid at the cleavage site to the C-terminal amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are fragments consisting of partial sequences, in each fragment, the amino acid at the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and / or Or it means that it is not necessary to have the C-terminal amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may have a sequence containing a mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the mutation in the partial sequence of the Cre protein You may have the arrangement
  • the set of two polypeptides according to the present invention is the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the N-terminal fragment and C-terminal fragment of the Cre protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the respective amino acid sequences. May have an amino acid sequence that is 100%, may have an amino acid sequence that is mutated from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and in each fragment, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may have an amino acid sequence that becomes a partial sequence, and each fragment may have an amino acid sequence that is mutated from the amino acid sequence that becomes a partial sequence with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of Cre protein may be cleaved at the C-terminal of the N-terminal fragment and the N-terminal of the C-terminal fragment.
  • the fragment may be cleaved so as to delete one to several amino acids linking the N-terminus of the fragment.
  • the Cre protein is known to have a secondary structure as shown in FIG.
  • the 59th to 68th positions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 correspond to the amino acids between B- ⁇ -helix and C- ⁇ -helix of the Cre protein, and the 101st to 111th positions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Corresponds to the amino acid between Cre protein D- ⁇ -helix and E- ⁇ -helix.
  • the results of crystal structure analysis for the 59th to 68th positions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the 101st to 111th positions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Guo, F., et al., Nature, 389), respectively.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein are fragments having a cleavage site in the region from position 59 to position 68 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It means that the cleavage site should be within the region from position 68 to position 68, and the N-terminal fragment of the Cre protein is a fragment containing an amino acid sequence up to at least the 59th amino acid, The C-terminal fragment is a fragment containing an amino acid sequence at least after the 68th amino acid.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of Cre protein are fragments having a cleavage site in the region of positions 101 to 111 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Means that the cleavage site should be within the region from position 111 to position 111, and the N-terminal fragment of the Cre protein is a fragment containing an amino acid sequence of at least the 101st amino acid,
  • the C-terminal fragment is a fragment containing an amino acid sequence after at least the 111th amino acid.
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment of Cre protein may each be designed to include the region of positions 1 to 59 and positions 68 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be designed to include the region of positions 1 to 101 and positions 111 to 343 of the amino acid sequence of 1.
  • the N-terminal amino acid in the N-terminal fragment of the Cre protein and the C-terminal amino acid in the C-terminal fragment of the Cre protein restore the gene recombination activity in a light-dependent manner.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is not particularly limited.
  • the partial sequence in the region from position 1 to position 59 and from position 68 to position 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is respectively the N-terminal fragment and the C-terminal side of the Cre protein.
  • the fragment may have.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein may have a mutation in the amino acid sequence in the region of positions 1 to 59 and in the region of positions 68 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it may be a fragment having a mutation and a partial sequence thereof.
  • the region from position 60 to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 all the amino acids in the region, or a part of the amino acid fragments of either the N-terminal fragment or the C-terminal fragment of the Cre protein May have.
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment of Cre protein have part or all of the region from position 60 to position 67, there may be a mutation in the amino acid sequence in the region from position 60 to position 67 .
  • the partial sequence in the region from position 1 to position 101 and the region from position 111 to position 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are respectively the N-terminal fragment and the C-terminal side of the Cre protein.
  • the fragment may have.
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein may be mutated in the amino acid sequence in the region of positions 1 to 101 and in the region of positions 111 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it may be a fragment having a mutation and a partial sequence thereof.
  • the region from position 102 to position 110 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 all amino acids in the region, or a part of the amino acid fragments of either the N-terminal fragment or the C-terminal fragment of the Cre protein May have.
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment of Cre protein have part or all of the region from position 102 to position 110, there may be a mutation in the amino acid sequence in the region from position 102 to position 110 .
  • the C-terminal amino acid of the Cre protein N-terminal fragment and the N-terminal amino acid of the C-terminal fragment are respectively It is preferably an amino acid hitting the cleavage site.
  • the N-terminal fragment of the Cre protein has at least the region of positions 19 to 59 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the C-terminal fragment of the Cre protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Or at least the region from position 68 to position 343, The N-terminal fragment of Cre protein has at least a region from positions 19 to 101 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the C-terminal fragment of Cre protein has positions 111 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • it is a set of polypeptides having at least a region.
  • the N-terminal fragment of the Cre protein has at least the region of positions 19 to 59 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the C-terminal fragment of the Cre protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal fragment of Cre protein has at least the region of positions 19 to 104 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the C-terminal fragment of the Cre protein is a set of polypeptides having at least a region at positions 106 to 343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the region overlapping with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. % Or more, 100%, or 100% or more.
  • the N-terminal fragment is composed of amino acids at positions 19 to 59 of SEQ ID NO: 1 and the C-terminal fragment is composed of amino acids at positions 60 to 343, positions 19 to 59 And 325 amino acids, which is the sum of 284 amino acids from positions 60 to 343, and approximately 95% of 325/343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is an overlapping region.
  • the N-terminal fragment is composed of amino acids at positions 19 to 104 in SEQ ID NO: 1 and the C-terminal fragment is composed of amino acids at positions 106 to 343, from position 19 It consists of 86 amino acids at position 104 and 324 amino acids, which is the sum of 238 amino acids from positions 106 to 343, and a region in which about 94% of 324/343 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 overlaps Become.
  • the overlapping region between the N-terminal fragment and / or the C-terminal fragment and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is aligned so that the most amino acids match by a method known to those skilled in the art.
  • the ratio of overlapping amino acids can be obtained for 343 amino acids of Cre protein.
  • a fragment consisting of an amino acid sequence containing addition, substitution, or deletion of one to several amino acids with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 The same applies to a fragment consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity.
  • the N-terminal fragment is composed of amino acid at position 19 to 59 in SEQ ID NO: 1
  • the C-terminal fragment is composed of amino acid at position 60 to 343, for example, one
  • the alignment results in overlapping regions of 324/343 (about 94%) to 316/343 (about 92%), respectively.
  • the N-terminal fragment is composed of amino acid at position 19 to amino acid 104 in SEQ ID NO: 1
  • the fragment at the C-terminal is composed of amino acid at position 106 to amino acid 343, for example. If there are amino acid additions, substitutions or deletions, the alignment results in overlapping regions of 323/343 (about 94%) to 315/343 (about 92%), respectively.
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment of Cre protein may be any combination of the following.
  • amino acid is used in its broadest sense, and includes derivatives and artificial amino acids in addition to natural amino acids.
  • examples of the “amino acid” in the present specification include natural proteinaceous L-amino acids; unnatural amino acids; chemically synthesized compounds having properties known in the art that are characteristic of amino acids.
  • Non-natural amino acids include, for example, ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids (such as ⁇ -methylalanine), N-alkyl- ⁇ -amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -Hydroxy acids, amino acids whose side chain structure is different from the natural type (norleucine, homohistidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain ("homo" amino acids, homophenylalanine, homohistidine, etc.) and side chains Examples include, but are not limited to, amino acids in which a carboxylic acid functional amino acid is substituted with a sulfonic acid group (such as cysteic acid).
  • amino acids may be represented by conventional one-letter code or three-letter code. Amino acids represented by one-letter code or three-letter code may include respective mutants and derivatives.
  • an amino acid sequence when an amino acid sequence includes 1 to several amino acid additions, substitutions or deletions, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 It means that one or nine amino acids have been added (inserted), substituted or deleted at the terminal or non-terminal of the sequence.
  • the number of amino acids to be added, substituted, or deleted is not particularly limited as long as the resulting polypeptide exhibits the effects in the present invention.
  • the number of sites that are added, substituted, or deleted may be one or two or more.
  • sequence identity with a certain amino acid sequence when the sequence identity with a certain amino acid sequence is 80% or more, the sequence identity may be 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more.
  • Sequence identity can be determined by alignment alignment according to methods known to those skilled in the art.
  • the set of two polypeptides according to the present invention shows gene recombination activity in a light-dependent manner, but can be used in combination with a loxP sequence or a loxP mutant sequence to perform gene recombination in a light-dependent manner. it can.
  • two proteins that form a dimer in a light-dependent manner is a protein that forms a heterodimer when irradiated with light. It is a pair.
  • the magnet forms a heterodimer by irradiating light, preferably blue light, and the heterodimer rapidly dissociates by stopping the light irradiation, so that the two polypeptides of the present invention
  • the formation and dissociation of dimers in the set can be precisely controlled and restores the recombinase activity of the Cre protein in a light-dependent manner.
  • the two proteins that form a dimer in a light-dependent manner are each a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a variant thereof.
  • the N-terminal ⁇ -helix A set of two different polypeptides in which at least one amino acid located at is substituted.
  • each magnet is derived from a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a variant thereof.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a Vivid protein, and SEQ ID NO: A polypeptide variant consisting of two amino acids can be rephrased as a Vivid protein variant.
  • Vivid protein variants include, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more It may be a protein having sequence identity.
  • the magnet may be a Vivid protein and Vivid protein pair, a Vivid protein and Vivid protein mutant pair, a Vivid protein mutant and a Vivid protein mutant pair, and at least one of the pair.
  • the polypeptide at least one amino acid located in the N-terminal ⁇ -helix is substituted.
  • a variant of the Vivid protein is a polypeptide having a sequence different from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at a place other than the N-terminal ⁇ -helix.
  • the variant of the Vivid protein may be a polypeptide with a truncated N-terminus (polypeptide composed of amino acids 37 to 186 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2).
  • substitution of amino acids in the N-terminal ⁇ -helix in the magnet may be any number of substitutions as long as the desired dimer formation efficiency and dissociation rate can be realized.
  • the number of substituted amino acids is, for example, 1 or 2 It can be 3, 4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10. When two or more amino acids are substituted, they may be the same amino acid or different amino acids.
  • the N-terminal ⁇ -helix is preferably an amino acid at positions 47 to 56 in SEQ ID NO: 2, and the two proteins that form a light-dependent dimer according to the present invention are at least one of the proteins, It is preferable that at least one amino acid in the 47th to 56th amino acids in SEQ ID NO: 2 is substituted, and in two proteins, at least one of the 47th to 56th amino acids in SEQ ID NO: 2 respectively. More preferably, the amino acid is substituted.
  • the mutation in the N-terminal ⁇ -helix is preferably a mutation in at least one amino acid of amino acids 47, 48, 50, 51, 52, 54, and 55 of SEQ ID NO: 2.
  • At least one amino acid in the N-terminal ⁇ -helix is replaced with an amino acid having a positive charge on the side chain, and in the other protein of the magnet, at least one amino acid in the N-terminal ⁇ -helix is replaced by a side chain
  • the amino acid is substituted with an amino acid having a negative charge.
  • the amino acid having a positive charge in the side chain may be a natural amino acid or a non-natural amino acid, and examples of natural amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • the amino acid having a negative charge in the side chain may be a natural amino acid or a non-natural amino acid, and examples of natural amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the amino acid corresponding to position 52 of SEQ ID NO: 2 and / or the amino acid corresponding to position 55 is preferably substituted in at least one protein, and in two proteins, position 52 of SEQ ID NO: 2 is substituted. More preferably, the amino acid corresponding to and / or the amino acid corresponding to position 55 is substituted. Substitutions in amino acids corresponding to positions 52 and 55 of SEQ ID NO: 2 may be substituted with the same amino acid or may be substituted with different amino acids.
  • amino acid corresponding to the X position of SEQ ID NO: 2 means a sequence when two proteins constituting the magnet have the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2 before amino acid substitution. Number: means the amino acid at position X in 2.
  • amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 before amino acid substitution specifically, when the two proteins are mutants of Vivid protein, Means the amino acid corresponding to the X position.
  • the amino acid at the X position of SEQ ID NO: 2 is appropriately determined by sequence alignment or the like.
  • the amino acid corresponding to position 52 of SEQ ID NO: 2 is preferably substituted with an amino acid having a positive charge in the side chain.
  • SEQ ID NO: The amino acid corresponding to position 52 of 2 is more preferably substituted with an amino acid having a negative charge on the side chain or a neutral amino acid, and more preferably substituted with an amino acid having a negative charge on the side chain.
  • the amino acid corresponding to position 55 of SEQ ID NO: 2 in at least one protein is preferably substituted with an amino acid having a positive charge in the side chain. It is more preferable that the amino acid corresponding to position 55 of No.
  • the amino acids corresponding to positions 52 and 55 of SEQ ID NO: 2 are preferably the same or different and substituted with amino acids having a positive charge in the side chain.
  • the amino acids corresponding to positions 52 and 55 of SEQ ID NO: 2 are more preferably the same or different and substituted with an amino acid having a negative charge in the side chain or a neutral amino acid.
  • amino acids corresponding to positions 52 and 55 of SEQ ID NO: 2 when they are substituted with amino acids having a negative charge in the side chain or neutral amino acids, they are preferably substituted differently. More preferably, one amino acid is substituted with an amino acid having a negative charge in the side chain, and the other amino acid is substituted with a neutral amino acid, and the amino acid corresponding to position 52 of SEQ ID NO: 2 is More preferably, the amino acid is substituted with an amino acid having a negative charge in the chain, and the amino acid corresponding to position 55 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a neutral amino acid.
  • amino acid corresponding to position 52 and / or position 55 of SEQ ID NO: 2 When the amino acid corresponding to position 52 and / or position 55 of SEQ ID NO: 2 is substituted with an amino acid having a positive charge in the side chain, it is the same or different and is substituted with lysine, arginine, or histidine. It is preferable that it is substituted with arginine, and more preferable.
  • amino acid corresponding to positions 52 and / or 55 of SEQ ID NO: 2 is substituted with an amino acid having a negative charge in the side chain, it is the same or different and is substituted with aspartic acid or glutamic acid. It is more preferable that it is substituted with aspartic acid.
  • amino acid corresponding to positions 52 and / or 55 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a neutral amino acid, it is more preferably substituted with glycine.
  • the amino acid corresponding to position 52 of SEQ ID NO: 2 is preferably substituted with aspartic acid or glutamic acid, more preferably substituted with aspartic acid, and simultaneously corresponds to position 55 of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid to be substituted is preferably substituted with a neutral amino acid, and more preferably substituted with glycine.
  • Ile at position 52 and Met at position 55 have a sequence substituted with an amino acid having a positive charge in the side chain, and in the other protein of the magnet, position 52 Examples include those in which Ile and Met at position 55 are substituted with an amino acid having a negative charge in the side chain and / or a neutral amino acid.
  • two proteins developed by the present inventors based on the Vivid protein disclosed in JP-A-2015-165776 can be used.
  • the magnet include the following.
  • Examples of one protein of the magnet having a sequence in which Ile at position 52 and Met at position 55 are substituted with amino acids having a positive charge in the side chain include pMag, pMagHigh1, pMagFast1, and pMagFast2, etc., and Ile at position 52
  • Examples of the other protein of the magnet having a sequence in which Met at position 55 is substituted with a negative amino acid and / or a neutral amino acid in the side chain include nMag, nMagHigh1, nMagFast1, and nMagFast2.
  • the magnet is preferably a combination of one protein selected from pMag, pMagHigh1, pMagFast1 and pMagFast2 and one protein selected from nMag, nMagHigh1, nMagFast1 and nMagFast2.
  • pMag is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 having mutations of I52R and M55R
  • pMagHigh1 is a sequence having further mutations of M135I and M165I in the amino acid sequence of pMag.
  • No. 16 is a polypeptide having the amino acid sequence.
  • pMagFast1 is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 further having an I85V mutation in the amino acid sequence of pMag.
  • pMagFast2 is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, further having mutations of I74V and I85V in the amino acid sequence of pMag.
  • nMag is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 having mutations of I52D and M55G
  • nMagHigh1 is a sequence having further mutations of M135I and M165I in the amino acid sequence of nMag.
  • nMagFast1 is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 further having an I85V mutation in the amino acid sequence of nMag.
  • nMagFast2 is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, which further has I74V and I85V mutations in the amino acid sequence of nMag.
  • Each polypeptide of the magnet and the N-terminal fragment and C-terminal fragment of Cre protein can be combined by a known method. For example, there can be mentioned a method in which nucleic acids encoding each are appropriately linked and expressed as a fusion polypeptide.
  • a polypeptide serving as a linker may be interposed between any polypeptide of the magnet and the N-terminal fragment or C-terminal fragment.
  • a linker may be used, but each polypeptide of the magnet is linked to the C-terminal amino acid of the N-terminal fragment of the Cre protein and the N-terminal amino acid of the C-terminal fragment.
  • the set of two polypeptides according to the present invention includes two N-terminal fragments and C-terminal fragments of the Cre protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, each of which forms a dimer in a light-dependent manner.
  • binding here is that the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of the Cre protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are dimers in a light-dependent manner, respectively. It is directly bound to the two proteins that form or is bound via a linker.
  • the set of two polypeptides in the present invention depends on light from the amino acid at the C-terminal of the N-terminal fragment of the Cre protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with or without a linker.
  • One polypeptide, which is two proteins that form a dimer is arranged, and from the N-terminal amino acid of the C-terminal fragment of the Cre protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, via a linker, or
  • the other polypeptide, which is two proteins that form a dimer in a light-dependent manner without being intervened, is arranged.
  • the C-terminal fragment of the Cre protein when the N-terminal fragment of the Cre protein binds to pMag, pMagHigh1, pMagFast1 or pMagFast2 with or without a linker at the C-terminal amino acid, the C-terminal fragment of the Cre protein
  • the N-terminal amino acid is linked to nMag, nMagHigh1, nMagFast1, or nMagFast2 via a linker or not
  • the N-terminal fragment of the Cre protein is the C-terminal amino acid nMag, nMagHigh1, nMagFast1, or
  • the C-terminal fragment of the Cre protein is the N-terminal amino acid of pMag, pMagHigh1, pMagFast1 or pMagFast2, via a linker or not Bonding is preferred.
  • the N-terminal fragment of the Cre protein is its C-terminal amino acid nMag, nMagHigh1, nMagFast1, or nMagFast2, and the C-terminal fragment of the Cre protein is its linker via a linker. More preferably, the N-terminal amino acid is linked to pMag, pMagHigh1, pMagFast1 or pMagFast2 via a linker.
  • Linker In the present invention, the set of two polypeptides according to the present invention, as well as a linker in the binding between the N-terminal fragment or the C-terminal fragment of the Cre protein and two proteins that form a dimer in a light-dependent manner. When the domains constituting the respective polypeptides are bound to each other, a linker that intervenes the binding between the domains may be present between the domains.
  • the linker used in the present invention is not particularly limited as long as it is a known linker, but a linker having an amino acid sequence containing a large amount of glycine and serine in the sequence is used.
  • a linker containing glycine as a main component is generally used, but a linker containing a hydrophilic amino acid such as serine or threonine is preferable.
  • a linker containing a hydrophilic amino acid such as serine or threonine is preferable.
  • domains and domains when domains and domains are bound via a linker, they can be bound using a restriction enzyme recognition site as a genetic engineering technique. Since most restriction enzyme recognition sites are composed of six base sequences, two amino acids are introduced between the domains when the restriction enzyme recognition sites are used to bind the domains. Such a restriction enzyme recognition site can also be used as a linker in the present invention.
  • the linker is not particularly limited, but may be composed of 2 to 16 amino acids.
  • a domain refers to an N-terminal fragment and a C-terminal fragment of the Cre protein that constitute two sets of polypeptides according to the present invention, and two proteins that form a dimer in a light-dependent manner.
  • Examples of other domains include a nuclear localization signal sequence and a 2A peptide sequence.
  • the set of two polypeptides according to the present invention may have a nuclear localization signal sequence.
  • the C-terminal amino acid of one polypeptide which is a two-dimerized protein that binds to the C-terminal amino acid of the N-terminal fragment of the Cre protein when a nuclear localization signal sequence is present
  • the other is a protein that forms a dimer in a light-dependent manner that binds to the N-terminal amino acid of the C-terminal fragment of the Cre protein, which may be linked via a linker or not.
  • the polypeptide may be bound to the N-terminal amino acid of the polypeptide via a linker or not.
  • the nuclear localization signal sequence may be present in one polypeptide of the set of two polypeptides according to the present invention, or may be present in the two polypeptides.
  • the nuclear localization signal sequence is not particularly limited, and an amino acid sequence of VPKKKRKV (SEQ ID NO: 23) and an amino acid sequence of KRTADGSEFESPKKKRKVEAS (SEQ ID NO: 24) can be exemplified.
  • the set of two polypeptides according to the present invention is preferably cleaved autocatalytically and the ratio of the amount of protein before and after binding through the N-terminal amino acid and C-terminal amino acid is 1: 1. It is expressed using a polypeptide called 2A peptide. Therefore, it is preferable that the set of two polypeptides according to the present invention each have an amino acid sequence (2A peptide sequence) derived from an autocatalytically cleaved 2A peptide.
  • the two sets of polypeptides according to the present invention have a 2A peptide sequence means that each polypeptide constituting the set of two polypeptides has a partial sequence of 2A peptide that is cleaved by cotranslational. Means.
  • Examples of the 2A peptide include, but are not limited to, peptides described in Kim, JH, et al., PLoS One. 6 (4), e18556 (2011) .
  • Polypeptides such as E2A peptide and F2A peptide are known. As shown in FIG.
  • the set of two polypeptides according to the present invention is expressed as an amino acid sequence in which each domain is arranged, and is obtained by autocatalytic cleavage of the P2A peptide. It is preferable that The P2A peptide sequence will be described as an example.
  • the P2A peptide sequence GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 6) is cleaved to cotranslational between the C-terminal GP sequences, and the polypeptide that binds to the N-terminal amino acid of the P2A peptide sequence
  • GSGATNFSLLKQAGDVEENPG SEQ ID NO: 6
  • P remains for the polypeptide that binds to the C-terminal amino acid of the P2A peptide sequence.
  • one polypeptide in the set of two polypeptides is an N-terminal fragment of Cre protein from the N-terminal side to the C-terminal side-a light-dependent dimer That forms a protein-nuclear localization signal sequence-an amino acid sequence in the order of part of the 2A peptide sequence, and another polypeptide from the N-terminal side to the C-terminal side-part of the 2A peptide sequence-nucleus It is preferable to have the amino acid sequence in the order of localization signal sequence-protein that forms a dimer in a light-dependent manner-C-terminal fragment of Cre protein.
  • N-terminal fragment of Cre protein “C-terminal fragment of Cre protein”, “protein that forms a dimer in a light-dependent manner”, “nuclear localization signal sequence” recognized as domains in the present specification
  • 2A peptide sequence may be arranged in the polypeptide in the order described, and an amino acid sequence serving as a linker may exist between the domains.
  • domains are arranged from the N-terminal to the C-terminal, and in detail, between each domain, in detail, it is dimerized light-dependently with the N-terminal fragment of Cre protein.
  • the bond to the C-terminal fragment of Cre protein may be a bond through a linker.
  • the set of two polypeptides according to the present invention is a set of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 It is preferable to be a polypeptide set and a polypeptide set having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.
  • These amino acid sequences are shown in FIGS.
  • the underlined “MA” sequence means a sequence derived from the start codon and the Kozak sequence
  • the other underlined amino acid sequences are amino acid sequences of linkers between domains. Means.
  • nucleic acid The present invention also provides nucleic acids encoding the polypeptides that make up the set of two polypeptides.
  • nucleic acid includes DNA, RNA, DNA / RNA chimeras, and artificial nucleic acids such as locked nucleic acid (LNA) and peptide nucleic acid (PNA) unless otherwise specified.
  • LNA locked nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • nucleic acid examples include a nucleic acid encoding a fusion polypeptide of one polypeptide of a magnet and an N-terminal fragment of Cre protein, and the other polypeptide of the magnet and the C-terminal side of Cre protein.
  • a nucleic acid encoding a fusion polypeptide with a fragment It may be a nucleic acid that also encodes a linker between any polypeptide of the magnet and a fusion polypeptide of the N-terminal fragment or C-terminal fragment of the Cre protein.
  • the nucleic acid according to the present invention may be a nucleic acid that encodes a nuclear localization signal sequence and a 2A peptide sequence together, or a nucleic acid that encodes a polypeptide having a linker between domains. .
  • the nucleic acid according to the present invention comprises an N-terminal fragment of Cre protein—a protein that forms a dimer in a light-dependent manner—a nuclear localization signal sequence—a 2A peptide sequence—a nuclear localization signal sequence—a light-dependent two A protein that forms a monomer-a nucleic acid that encodes a polypeptide having an amino acid sequence in the order of the C-terminal fragment of the Cre protein, and encodes a polypeptide in which an amino acid sequence serving as a linker exists between the domains. It may be a nucleic acid.
  • An example of the base sequence of the nucleic acid is shown as SEQ ID NOs: 29 and 30 (FIGS. 16 and 17).
  • the nucleic acid according to the present invention can be synthesized according to methods known to those skilled in the art.
  • the present invention also includes an expression vector containing the nucleic acid according to the present invention.
  • an expression vector containing the nucleic acid according to the present invention either one of the nucleic acids encoding each of the two sets of polypeptides according to the present invention may be inserted, and each of the two sets of polypeptides according to the present invention is inserted. Both encoding nucleic acids may be inserted into one vector. Examples of the nucleic acid inserted into the vector include the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 29 and 30.
  • the nucleic acid of the present invention can be inserted directly into the expression vector promoter, as it is, after digestion with a restriction enzyme, or with a linker.
  • vectors include E. coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pBluescript II, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, pC1912, pTP4, pE194, pC194 etc.), yeast-derived plasmids ( pSH19, pSH15, YEp, YRp, YIp, YAC, etc., bacteriophage ( ⁇ phage, M13 phage, etc.), virus (retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus , Baculovirus, etc.) and cos
  • the promoter can be appropriately selected depending on the type of host.
  • a promoter derived from SV40 simian virus 40
  • CMV cytomegalovirus
  • Escherichia coli trp promoter, T7 promoter, lac promoter and the like can be used.
  • Expression vector encodes DNA replication origin (ori), selection marker (antibiotic resistance, auxotrophy, etc.), enhancer, splicing signal, poly A addition signal, tag (FLAG, HA, GST, GFP, etc.) Nucleic acid or the like may be incorporated.
  • a transformant can be obtained by transforming a suitable host cell with the expression vector of the present invention.
  • the host can be appropriately selected in relation to the vector.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus sp.), Yeast, insects or insect cells, animal cells and the like are used.
  • animal cells for example, HEK293T cells, CHO cells, COS cells, myeloma cells, HeLa cells, and Vero cells may be used. Transformation can be performed according to a known method such as a lipofection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, a microinjection method, or a particle gun method, depending on the type of host.
  • the target polypeptide is expressed by culturing the transformant according to a conventional method.
  • Protein purification from the transformant culture involves collecting cultured cells, suspending them in an appropriate buffer, disrupting the cells by sonication, freeze-thawing, etc., and roughly extracting by centrifugation or filtration Obtain a liquid. When the polypeptide is secreted into the culture solution, the supernatant is collected. Purification from a crude extract or culture supernatant is a known method or a method equivalent thereto (for example, salting out, dialysis method, ultrafiltration method, gel filtration method, SDS-PAGE method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, Reversed phase high performance liquid chromatography).
  • a set of two polypeptides according to the present invention is used in combination with a nucleic acid that is a loxP sequence and a loxP variant sequence, thereby providing a novel Cre-loxP system used for light-dependent genetic recombination.
  • gene recombination can be performed in the same manner as the Cre-loxP system, except that the Cre protein is divided into an N-terminal fragment and a C-terminal fragment.
  • the Cre-loxP system according to the present invention may be a system in which the nucleic acid according to the present invention and a nucleic acid that is a loxP sequence and a loxP mutant sequence may be combined.
  • the Cre-loxP system according to the present invention may be a Cre-loxP system containing the expression vector according to the present invention and a nucleic acid that is a loxP sequence or a loxP mutant sequence.
  • loxP mutant a nucleic acid having a sequence selected from the group consisting of lox2722, lox66, lox71, JT15, and JTZ17 may be used.
  • the present invention also provides animals having two sets of polypeptides according to the present invention.
  • a set of two polypeptides according to the present invention may exist as a combination of two proteins as an N-terminal fragment and a C-terminal fragment in the animal, and the polypeptides constituting the two polypeptide sets May be present as a nucleic acid encoding or as an expression vector.
  • the animal according to the present invention may have the nucleic acid according to the present invention, may have the nucleic acid according to the present invention as an expression vector, and has the Cre-loxP system according to the present invention. May be.
  • the two sets of polypeptides according to the present invention have unexpectedly superior gene recombination activity than the conventional light-dependent controlled split Cre, the two sets of polypeptides according to the present invention are incorporated in the body. Gene recombination can also be controlled efficiently by irradiating light from outside the body into an animal incorporated into the animal. That is, according to the set of two polypeptides according to the present invention, gene recombination by the Cre / loxP system can be accurately controlled not only in vitro but also in vivo by turning on / off light irradiation. .
  • the animal incorporating the Cre / loxP system according to the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal, but is preferably a rodent as an experimental animal.
  • the animal incorporating the Cre / loxP system according to the present invention is not particularly limited.
  • the gene function is knocked out by light stimulation, or the mutant gene is restored to normal by light stimulation.
  • the effect can be evaluated, or a reporter gene such as a fluorescent protein can be activated by light stimulation to label living tissue and the cells constituting it.
  • Step 1 Creation of PA-Cre construct Cre split position (Step 1), split Cre N-terminal fragment (CreN) and C-terminal fragment (CreC) binding position of magnet (pMag and nMag) (Step 2), length of linker Now (Step 3), we examined the binding position of the nuclear localization signal sequence (NLS) (Step 4), the binding of the P2A peptide sequence (Step 5), etc., and evaluated various constructs as PA-Cre by luciferase assay (Fig. 1, 2).
  • COS-7 cells are seeded in 96-well microplates (Corning, Corning, NY, USA) at a cell density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / well, at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • iCre N-terminal fragment of the split Cre (CREN) and C-terminal fragment (Crec) from cDNA refinement of Cre (iCre).
  • the iCre cDNA was synthesized by Invitrogen (Carlsbad, CA, UAS) to optimize codons to enhance expression in mammalian cells. Specifically, ATGGCC (encoding MA, SEQ ID NO: 31) was added to realize the start codon and Kozak sequence.
  • the CRY2 -CreN 19-104 plasmid (# 26888) and the CIB1-CreC 106-343 plasmid (# 26889) were obtained from Addgene.
  • the cDNA encoding CreN 19-59 , CreC 60-343 , CreN 19-104 , CreC 106-343 , Magnet system (pMag and nMag), and nuclear localization signal sequence (NLS) are common PCR and restriction enzymes. It was prepared by processing and ligation. PA-Cre and its related constructs were introduced into a pcDNA3.1 vector (Invitrogen) with a CMV promoter.
  • the single-floxed-invertedFluc, double-floxed-inverted Fluc, lox66 / lox71-floxed invertedFluc, and JT15 / JTZ17-floxed invertedFluc constructs have two or four loxP sequences or loxP mutant sequences in reverse orientation.
  • a luciferase (Fluc) cDNA was inserted in between.
  • Fluc luciferase
  • Floxed-STOP-Fluc single-floxed-inverted Fluc
  • double-floxed-invertedFluc double-floxed-invertedFluc
  • lox66 / lox71-floxed invertedFluc lox66 / lox71-floxed invertedFluc
  • JT15 / JTZ17-floxed invertedFluc were introduced into the pcDNA3.1 vector.
  • the reporter using the fluorescent protein mCherry is the reporter using the above-mentioned Fluc (floxed-STOP-Fluc, single-floxed-inverted Fluc, double-floxed-inverted Fluc, lox66 / lox71-floxed inverted Fluc, JT15 / JTZ17-floxed inverted Fluc) was prepared by replacing the Fluc cDNA with the mCherry cDNA.
  • Cell culture COS-7 cells, HEK-293 cells, NIH / 3T3 cells, HeLa cells (all ATCC) are 10% FBS (GIBCO, Carlsbad, CA, USA), 100 unit / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin ( The cells were cultured using Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma Aldrich) supplemented with GIBCO) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • CHO-K1 cells ATCC were cultured in Ham's F-12 medium (GIBCO) supplemented with 10% FBS, 100 unit / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • An LED light source (470 ⁇ 20 nm; CCS, Kyoto, Japan) was used to irradiate cells and mice expressing the light source PA-Cre (FIGS. 6 to 10, 12, and 13).
  • a white fluorescent lamp was used to examine the response of PA-Cre to room light (Fig. 13).
  • COS-7 cells were seeded in 96-well microplates (Corning, Corning, NY, USA) at a cell density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / well at 37 ° C, Culture was performed for 24 h under conditions of 5% CO 2 (FIGS. 6, 9, and 10). The cells were transfected with a cDNA encoding PA-Cre (or CRY2-CIB1-split Cre) and a luciferase reporter plasmid at a ratio of 1: 9 at 37 ° C. The total amount of DNA used for transfection is 0.05 ⁇ g / well. For this transfection, X-tremeGENE 9 reagent was used.
  • the cells were irradiated with blue light (1.0 W m ⁇ 2 ) for 24 h.
  • blue light 1.0 W m ⁇ 2
  • the medium was replaced with Hanks' balanced salt solution (HBSS, Grand Island Biological, Grand Island, NY, USA) containing 0.2 mM D-luciferin potassium salt (Wako, Japan). Bioluminescence was measured at room temperature for 10 seconds using a Centro XS 3 LB 960 plate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany).
  • COS-7 cells were seeded on a microplate with a cell density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / well and BR> na 96-WELL and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 h. (Fig. 6).
  • the cells were transfected with the cDNA encoding PA-Cre-Y324F (iCre or pcDNA3.1 vector) and the luciferase reporter plasmid at a ratio of 1: 9 at 37 ° C.
  • 0.05 ⁇ g / well of DNA was used, and transfection was performed with X-tremeGENE9 reagent.
  • the cDNA encoding PA-Cre and Floxed-STOP-Fluc plasmid were transfected into the cells at a ratio of 1: 9 at 37 ° C.
  • transfection 0.05 ⁇ g / well of DNA was used, and transfection was performed with X-tremeGENE9 reagent. 24 hours after transfection, the cells were irradiated with blue light (1.0 W m ⁇ 2 ) for 24 h, and bioluminescence was measured.
  • HEK-293 cells, NIH / 3T3 cells, and CHO-K1 cells were seeded in a 96-well microplate at a cell density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / well.
  • HeLa cells were seeded on a 96-well microplate at a cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / well. These cells were cultured for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • HEK-293 cells were transfected with cDNA encoding PA-Cre and Floxed-STOP-Fluc plasmid at a ratio of 1: 9 at 37 ° C.
  • transfection 0.05 ⁇ g / well of DNA was used, and transfection was performed with X-tremeGENE9 reagent.
  • NIH / 3T3 cells, HeLa cells, and CHO-K1 cells were transfected with PA-Cre-encoding cDNA and Floxed-STOP-Fluc plasmid at a ratio of 1: 9 at 37 ° C.
  • transfection 0.3 ⁇ g / well of DNA was used, and transfection was performed using Lipofectamine3000 reagent. 24 hours after transfection, the cells were irradiated with blue light (1.0 W m ⁇ 2 ) for 24 h, and bioluminescence was measured.
  • COS-7 cells were seeded in Lab-Tek 8-well chambered coverglasses (Thermo Scientific, Waltham, USA) at a cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / well and the cells were 37 The cells were cultured for 24 h under the conditions of ° C and 5% CO 2 (FIGS. 6 and 9).
  • the cDNA encoding PA-Cre or CRY2-CIB1-split Cre and the respective reporter plasmid were transfected at a ratio of 1: 9 at 37 ° C.
  • 0.15 ⁇ g / well of DNA was used, and transfection was performed with X-tremeGENE9 reagent.
  • the cells were irradiated with blue light (1.0 W m ⁇ 2 ) for 24 h.
  • the medium was replaced with HBSS immediately before fluorescence imaging.
  • Fluorescence imaging was performed with an LSM 710 confocal laser-scanning microscope (CarlZeiss, Jena, Germany) equipped with a 63 ⁇ oil objective. HeNe laser (543 nm) was used for fluorescence imaging of mCherry.
  • Pattern-illuminated COS-7 cells were seeded in a 6 cm culture dish (Thermo Scientific) at a cell density of 1.4 ⁇ 10 6 cells / dish, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 h. ( Figures 7 and 8).
  • the culture dish was made by using various patterns of light masks (STRIPE, STAR, SMILEY, MOUNTAIN, LETTERS) with black vinyl tape on the bottom.
  • CDNA encoding PA-Cre and Floxed-STOP-Fluc plasmid were transfected at a ratio of 1: 9 at 37 ° C.
  • cDNA encoding PA-Cre and Floxed-Fluc-hCL1-hPEST plasmid were transfected at a ratio of 1: 4 at 37 ° C.
  • transfection 2.5 ⁇ g / dish of DNA was used, and transfection was performed using X-tremeGENE9 reagent. 24 hours after transfection, the cells were irradiated with blue light (1.0 W m ⁇ 2 ) for 48 h. Prior to bioluminescence imaging, the medium was replaced with HBSS containing 1 mM D-luciferin.
  • Bioluminescence imaging was performed for 5 min using a Lumazone bioluminescence imager (NipponRoper, Tokyo, Japan) equipped with an Evolve 512 EMCCD camera (Photometrics). Data were analyzed using slidebook 4.2 software (Intelligent Innovations Inc., Denver, CO) and Image-J software.
  • the cells were irradiated with blue light (1.0 W m -2 ) for various times (0, 1.5, 3, 6, 12, 24, 48 h). Then, the medium was replaced with HBSS containing 0.2 mM D-luciferin. Bioluminescence was measured at room temperature for 10 seconds using a Centro XS 3 LB 960 plate reader. For control experiments, bioluminescence measurement was performed by transfecting COS-7 cells with pcDNA3.1 vector (Mock) and Floxed-STOP-Fluc plasmid under the same conditions as described above.
  • COS-7 cells were seeded in 8-well chambered coverglass at a cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / well, 37 ° C, 5% CO 2 Under the conditions, culture was performed for 24 h (FIG. 9). The cells were transfected with cDNA encoding PA-Cre and Floxed-STOP-mCherry plasmid at a ratio of 1: 9 at 37 ° C. For transfection, 0.15 ⁇ g / well of DNA was used, and transfection was performed with X-tremeGENE9 reagent.
  • the cells were irradiated with blue light (1.0 W m -2 ) for various times (0, 1.5, 3, 6, 12, 24, 48 h).
  • the medium was replaced with HBSS immediately before fluorescence imaging.
  • Fluorescence imaging was performed with an LSM 710 confocal laser-scanning microscope (CarlZeiss, Jena, Germany) equipped with a 63 ⁇ oil objective. HeNe laser (543 nm) was used for fluorescence imaging of mCherry.
  • COS-7 cells were transfected with pcDNA3.1 vector (Mock) and Floxed-STOP-mCherry plasmid under the same conditions as described above, and fluorescence imaging was performed.
  • COS-7 cells were seeded at a cell density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / dish in a 35 mm culture dish (IWAKI, Tokyo, Japan), under conditions of 37 ° C and 5% CO 2 Then, the cells were cultured for 24 hours (FIG. 10).
  • the cDNA encoding PA-Cre and Floxed-STOP-Fluc plasmid were transfected into the cells at a ratio of 1: 9 at 37 ° C. For transfection, 1.0 ⁇ g / dish of DNA was used, and transfection was performed with X-tremeGENE9 reagent.
  • the cells were irradiated with blue light in various time patterns as follows: the cells were irradiated with 50 W m -2 blue light for 30 s. Later, it was incubated for 24 h in the dark and bioluminescence was measured. In addition, the cells were irradiated with blue light of 50 W m ⁇ 2 for 30 s at 30 min intervals for 3 or 6 times, and then incubated in a dark place to perform bioluminescence measurement. For the 1-shotillumination experiment, 15 min, 1 h, and 3 h of blue light irradiation (50 W m ⁇ 2 ) were examined in addition to 30 s.
  • mice 5-week-old female BALB / c mice (Sankyo Lab Service Corporation, Inc., Tokyo, Japan) were used (FIGS. 12 and 13). The hair of the abdomen of the mouse was removed using a hair removal cream, and the mice were raised in cages for 24 hours. Then, cDNA encoding PA-Cre and Floxed-STOP-Fluc plasmid were injected into the tail vein of mice at a ratio of 1: 9 at 37 ° C. This hydrodynamic injection was performed according to the manual using TransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution (MirusBio LLC, Madison, Wis., USA).
  • mice were raised for 8 h in the dark and irradiated with blue LED light source (470 ⁇ 20 nm, 200 W m -2 ) for 16 h or 30 s in a cage. Mice irradiated for 30 s were further bred in the dark for 16 h. For light irradiation with room light, mice subjected to hydrodynamic injection were raised for 24 h under white fluorescence (0.05 W m -2 ). Mouse bioluminescence imaging was performed 24 h after hydrodynamic injection.
  • D-luciferin solution is 10 ⁇ L / mouse weight (g).
  • bioluminescence imaging was performed for 5 min with a Lumazone bioluminescence imager (Nippon Roper) equipped with an Evolve 512 EMCCD camera (Photometrics).
  • a Lumazone bioluminescence imager Nippon Roper
  • EMCCD camera Photometrics
  • mice were anesthetized with isoflurane (AbbVie, Tokyo, Japan) to suppress mouse movement.
  • livers were removed from the mice for ex vivo analysis.
  • the liver was placed in PBS containing 1 mM D-luciferin.
  • a 6-well culture plate (Thermo Scientific) was used.
  • images of the extracted livers of the anterior and posterior were taken for 5 min using a Lumazone bioluminescence imager (Nippon Roper). Data was analyzed with slidebook 4.2 software (Intelligent Innovations Inc.).
  • SEQ ID NO: 1 This shows the amino acid sequence of Cre protein.
  • SEQ ID NO: 2 This shows the amino acid sequence of Vivid protein.
  • SEQ ID NOs: 3-5 This shows the amino acid sequence of the linker.
  • SEQ ID NO: 6 This shows the amino acid sequence of the P2A peptide (P2A peptide sequence).
  • SEQ ID NOs: 7 to 12 This shows the base sequences of loxP and loxP mutants (lox2722, lox66, lox71, JT15, and JTZ17).
  • SEQ ID NOs: 13, 14 This shows the base sequences of lox72 and JA15-JTZ17, which are products of DNA recombination.
  • SEQ ID NOs: 15 to 22 show amino acid sequences of pMag, pMagHigh1, pMagFast1, pMagFast2, nMag, nMagHigh1, nMagFast1, and nMagFast2.
  • SEQ ID NO: 23, 24 This shows the amino acid sequence of the exemplified nuclear localization signal sequence.
  • SEQ ID NOs: 25 to 28 This shows the amino acid sequences of the polypeptides constituting two sets of polypeptides (PA-Cre) according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 29, 30 This shows the base sequence inserted into the vector of the two polypeptide sets (PA-Cre) according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 31 This shows the base sequence encoding the MA amino acid sequence that is the start codon of Komak and PA-Cre.

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Abstract

本発明は、配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合する、光依存的遺伝子組換えに用いられる2つのポリペプチドのセットに関する。

Description

光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット
　本発明は、光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット等に関する。
　遺伝子工学技術として、Cre/loxPシステムを利用した技術は有力なツールである。
　Cre/loxPシステムにおいては、loxP配列と呼ばれるDNA配列に対し組換え酵素であるCreタンパク質が働いて、部位特異的遺伝子組換えが起こる。
　Creタンパク質は、バクテリオファージP1に由来する酵素であって、遺伝子工学技術において、幅広く用いられている（非特許文献１）。
　Cre/loxPシステムにおいて、Creタンパク質を2つのポリペプチドに分割して得られるスプリットCreを用い、光依存的に、あるいは、薬物存在下に、活性を再構成させる制御技術が知られている。
　具体的には、光依存的制御技術として、Cre/loxPシステムと光スイッチタンパク質の組合せであるCRY2-CreNとCIBN-CreCを用いる技術が開示されている（特許文献１、非特許文献２、３）。
　また、薬物存在下で遺伝子組換えを制御する技術として、split-Cre-FRB/FKBPシステムが開示されている（非特許文献４、５）。
　近年、タンパク質の光活性化を利用する分子制御アプローチが出現し、オプトジェネティクスと呼ばれている（非特許文献６、７）。
　本発明者らは、光依存的にホモ二量体を形成するNeurospora crassa由来のVividタンパク質を改変し、光の照射により二量体の形成及び解離を精密に制御することができる光依存的に二量体を形成する２つのタンパク質のセットを開発した（特許文献２、非特許文献８）。また、ゲノム編集ツールとしてCRISPR-Cas9システムに利用されるCas9を2つに分割したフラグメントと、光依存的に又は薬物存在下で二量体を形成する2つのポリペプチドとを融合させた2つのポリペプチドのセットを開発した（特許文献３、非特許文献９）。
国際公開第２０１１／１３０５４０号 特開２０１５－１６５７７６号公報 国際公開第２０１６／１６７３００号
Meinke, G. et al., Chem. Rev. 116, 12785-12820 (2016) Kennedy, M. J., et al., Nat. Methods, 7(12), 973 (2010) Schindler S. E, et.al., Scientific Reports, 5, 13627 (2015) Jullien, N., et al., Nucleic Acids Research, 31(21), e131 (2003) Jullien, N., et al., PLoS One. 2(12), e1355 (2007) Toettcher, J. E. et al., Nat. Methods 8, 35-38 (2011). Mueller, K. et al., Mol. BioSyst. 9, 596-608 (2013). Kawano, F. et al., Nat. Commun. 6, 6256 (2015). Nihongaki, Y. et al., Nat. Biotech., 33, 755 (2015).
　本発明の解決しようとする課題は、Creタンパク質を2つのポリペプチドに分割して得られるスプリットCreを有する、光依存的遺伝子組換えに用いられる新たなポリペプチドのセットを提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Creタンパク質を2つに分割して得られるスプリットCreのN末端側フラグメント（CreN）とC末端側フラグメント（CreC）の特定の部位に、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質を結合させることにより、従来の光依存的に制御されたスプリットCreよりも予想外に優れた遺伝子組換え活性を有するポリペプチドのセットを提供することができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は以下のとおりである。
〔１〕
　配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合する、光依存的遺伝子組換えに用いられる2つのポリペプチドのセットであって、
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるか、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであり、
　Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸とCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸で、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合し、
　光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、それぞれ配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つのポリペプチドのセット。
〔２〕
　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の68位～343位の領域を少なくとも有するか、
　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～101位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の111位～343位の領域を少なくとも有する、〔１〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔３〕
　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の60位～343位の領域を少なくとも有する、〔１〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔４〕
　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～104位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の106位～343位の領域を少なくとも有する、〔１〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔５〕
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むか、少なくとも1つのフラグメントの配列が対応する配列番号：1のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するフラグメントである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔６〕
　光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の一方のタンパク質において、少なくとも配列番号：2の52位及び／又は55位に対応するアミノ酸が、リシン、アルギニン又はヒスチジンで置換され、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の他方のタンパク質において、少なくとも配列番号：2の52位及び／又は55位に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシンで置換されている、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔７〕
　光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、pMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、nMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、の組合せである、〔６〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔８〕
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、ぞれぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質とリンカーを介して結合する、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔９〕
　核局在化シグナル配列が、Creタンパク質のN末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のC末端のアミノ酸で、及び／又はCreタンパク質のC末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のN末端のアミノ酸で、リンカーを介して、あるいは、リンカーを介さずに結合する、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔１０〕
　2Aペプチド配列をさらに有する、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔１１〕
　2つのポリペプチドのセットにおける1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、Creタンパク質のN末端側フラグメント－光依存的に二量体を形成するタンパク質－核局在化シグナル配列－2Aペプチド配列の一部の順にアミノ酸配列を有し、
　もう1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、2Aペプチド配列の一部－核局在化シグナル配列－光依存的に二量体を形成するタンパク質－Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有する、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット。
〔１２〕
　Creタンパク質のN末端側フラグメントと光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、光依存的に二量体を形成するタンパク質と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と2Aペプチド配列の一部との結合、2Aペプチド配列の一部と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、及び光依存的に二量体を形成するタンパク質とCreタンパク質のC末端側フラグメントとの結合が、リンカーを介した結合である、〔１１〕に記載の2つのポリペプチドのセット。
〔１３〕
　〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセットをコードする核酸。
〔１４〕
　Creタンパク質のN末端側フラグメント－光依存的に二量体を形成するタンパク質－核局在化シグナル配列－2Aペプチド配列－核局在化シグナル配列－光依存的に二量体を形成するタンパク質－Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする、〔１３〕に記載の核酸。
〔１５〕
　〔１３〕又は〔１４〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔１６〕
　〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット、〔１３〕若しくは〔１４〕に記載の核酸、又は〔１５〕に記載の発現ベクター、及びloxP配列又はloxP変異体配列である核酸を含有する、Cre-loxPシステム。
〔１７〕
　loxP変異体が、lox2722、lox66、lox71、JT15及びJTZ17からなる群から選択される、〔１６〕に記載のCre-loxPシステム。
〔１８〕
　〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の2つのポリペプチドのセット、〔１３〕若しくは〔１４〕に記載の核酸、又は〔１５〕に記載の発現ベクター、又は〔１６〕若しくは〔１７〕に記載のCre-loxPシステムを有する動物。
〔１９〕
　げっ歯類である、〔１８〕に記載の動物。
　本発明によれば、Creタンパク質を2つのポリペプチドに分割して得られるスプリットCreを有する、光依存的遺伝子組換えに用いられる新たなポリペプチドのセットを提供することができる。
本発明に係る光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット（以下、「PA-Cre：photo-activatable Cre recombinase」と記載する場合がある）のコンストラクトの概念図を示す。（Step 2）CreN59のN末端のアミノ酸にnMagを結合するコンストラクトとCreN59のC末端のアミノ酸にnMagを結合するコンストラクトを示す。CreNとCreCは、Creタンパク質を2つに分割して得られるスプリットCreのN末端側フラグメントとC末端側フラグメントをそれぞれ示す。CreN59は、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～59位の領域を有するN末端側フラグメントを示し、CreC60は、配列番号：1のアミノ酸配列の60位～343位の領域を有するC末端側フラグメントを示す。また、pMagとnMagは光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質を示し、NLSは核局在化シグナル配列を示す。（Step 3）CreN59のC末端のアミノ酸にnMagを、リンカーを介して結合するコンストラクトと、pMagのC末端のアミノ酸にCreC60を、リンカーを介して結合するコンストラクトにおいて，3種類の異なる長さ（16 a.a., 19 a.a., 2 a.a.）のリンカー（配列番号：3～5）を有するコンストラクトを示す。（Step4）核局在化シグナル配列（NLS）をCreN59のN末端のアミノ酸に結合するコンストラクトとnMagのC末端のアミノ酸に結合するコンストラクトを示す。（Step 5）2Aペプチドとして用いたP2Aペプチドのアミノ酸配列（P2Aペプチド配列、配列番号：6）を示す。 図１に示すPA-Creの各コンストラクトのルシフェラーゼアッセイの評価結果を示す。（Step 1）Creタンパク質を59番目のアミノ酸と60番目のアミノ酸の間で切断した場合（59/60）と，104番目のアミノ酸と106番目のアミノ酸の間で切断した場合（104/106）の結果を示す。（59/60）は、CreN59とCreC60を用いた結果を示し、（104/106）は、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～104位の領域を有するN末端側フラグメントと、配列番号：1のアミノ酸配列の106位～343位の領域を有するC末端側フラグメントをスプリットCreとして用いた結果を示す。（Step 2）CreN59のN末端のアミノ酸にnMagを結合するコンストラクトと、CreN59のC末端のアミノ酸にnMagを結合するコンストラクトの結果を示す。（Step 3）CreN59のC末端のアミノ酸とnMagを、リンカーを介して結合するコンストラクトと、pMagのC末端のアミノ酸とCreC60を、リンカーを介して結合するコンストラクトにおいて、リンカーとして、3種類の異なる長さ（16 a.a., 19 a.a., 2 a.a.）のペプチドを用いた場合の各コンストラクトにおける結果を示す。（Step 4）核局在化配列（NLS）をCreN59のN末端のアミノ酸に結合するコンストラクトと、nMagのC末端のアミノ酸に結合するコンストラクトの結果を示す。（Step 5）P2Aペプチド配列を有するコンストラクトの結果を示す。 PA-CreによるDNA組換え反応の光操作の概念図を示す。（a）PA-CreによるDNA組換えの原理を示す。PA-Creは暗所では活性を持たないが（Inactivate PA-Cre）、光照射によって活性化し（Activate PA-Cre）、2つのloxP配列の間でのDNA組換えを触媒する。（b）PA-Creの発現ベクターの一例とPA-CreによるDNA組換えを評価するためのレポーターの例を示す。lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17はloxPの変異体である。いずれの変異体もloxP同様にPA-CreがDNA組換えを触媒できる。P2Aは2Aペプチド配列、PCMVはCMVプロモーター、pAは転写停止配列、FlucはルシフェラーゼのcDNAを示す。 Creタンパク質の二次構造と実施例における切断場所を示す。59番目のアミノ酸と60番目のアミノ酸の間で切断する場合（59/60）と、104番目のアミノ酸と106番目のアミノ酸の間で切断する場合（104/106）を例として示している。 loxPとloxP変異体であるlox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17の塩基配列を示す（それぞれ、順に、配列番号：7～12の塩基配列に対応する）。lox72（配列番号：13）はlox66とlox71のDNA組換えによる生成物であり、JA15-JTZ17（配列番号：14）はJT15とJTZ17のDNA組換えによる生成物を示す。 PA-Creの評価結果を示す。（a）PA-CreのDNA組換え活性が光照射で誘導されることを示す。DNA組換えによってルシフェラーゼが発現するレポーター（図3bのFloxed-STOP-Fluc）を用いて評価した。PA-Cre-Y324F：DNA組換え活性を欠失させた変異体、CRY2-CIB1-split Cre：スプリットCreと光スイッチタンパク質CRY2-CIB1を用いた光依存的DNA組換えシステム（非特許文献２参照）、iCre：全長体のCreタンパク質に核局在化シグナル配列を連結したタンパク質をそれぞれ示し、iCreをコントロールとした。（b）図6aで用いたルシフェラーゼレポーターをDNA組換えにより蛍光タンパク質のmCherryを発現するレポーター（Floxed-STOP-mCherry）に置き換えて行なった実験の結果を示す。図6aと同様に、PA-CreのDNA組換え活性が光制御できることを示す。（c）様々なloxP変異体に対する応答性をPA-CreとCRY2-CIB1-split Creの間で比較するために、DNA組換えによってルシフェラーゼが発現する図3bで開示するレポーターを用いて評価した。PA-CreはどのloxP変異体に対しても効率よくDNA組換え反応を起こすのに対して、CRY2-CIB1-split CreはDNA組換え効率が低い。特に、CRY2-CIB1-split Creでは、lox66、lox71、JT15、JTZ17を用いたレポーターに対するDNA組換え効率が著しく低い。（d）図6cで用いた一連のルシフェラーゼレポーターをDNA組換えにより蛍光タンパク質のmCherryを発現するレポーターに変えて行なった実験の結果を示す。図6cと同様に、PA-CreはどのloxP変異体に対して効率よくDNA組換え反応を起こすのに対して、CRY2-CIB1-split CreはDNA組換え効率が低い。（e）様々な細胞種でのPA-Creの評価の結果を示す。（f）光照射強度に依存したPA-CreのDNA組換え活性の結果を示す。 PA-CreによるDNA組換え反応の空間制御の結果を示す。6センチディッシュに培養した細胞にパターン照射を施し、DNA組換え反応を空間制御した結果を示す。DNA組換えによってルシフェラーゼが発現するレポーター（図3bのFloxed-STOP-Fluc）を用いている。 PA-Creの評価結果を示す。（a）DNA組換えによってルシフェラーゼの遺伝子がノックアウトされるレポーターの設計の概念図を示す。(b）6センチディッシュに培養した細胞にパターン照射を施し、DNA組換え反応を空間制御した結果を示す。DNA組換えによってルシフェラーゼの遺伝子がノックアウトされる図8aのレポーターを用いている。 PA-CreのDNA組換え反応のキネティクスを示す。（a）PA-Creを発現する細胞に様々な時間の光照射を施し、PA-CreによるDNA組換え反応のキネティクスを評価した結果を示す。DNA組換えによってルシフェラーゼが発現するレポーター（図3bのFloxed-STOP-Fluc）を用いて評価した。（b）DNA組換えによって蛍光タンパク質のmCherryが発現するレポーター（Floxed-STOP-mCherry）を用いて、PA-CreによるDNA組換え反応のキネティクスを評価した結果を示す。 PA-CreによるDNA組換え反応における光照射条件の検討結果を示す。（a）様々な光照射条件の例を示す。（b）様々な光照射条件に対するPA-CreとCRY2-CIB1-split Creの応答性の比較するために、DNA組換えによってルシフェラーゼが発現するレポーター（図3bのFloxed-STOP-Fluc）を用いて評価した。PA-Creは長時間の光照射はもとより、30秒程度の短時間の光照射（1-shot）でも十分にDNA組換え反応を光操作できる。（c）様々な光照射強度で30秒程度の短時間の光照射（1-shot）を行なった場合のPA-CreによるDNA組換え反応の効率を評価した。（d）30秒程度の短時間の光照射を繰り返し行なった場合のPA-CreによるDNA組換え反応の効率を評価した。（e）光照射の時間を変えた場合のPA-CreによるDNA組換え反応の効率を評価した。 PA-Creのマウスへの応用の概念図を示す。（a）PA-Creを用いてマウスの生体深部でDNA組換え反応を光操作するための実験手順の概要を示す。（b）LED光源を用いた生体外からの非侵襲的な光照射を行った実験である。 PA-Creによるマウスの生体深部でのDNA組換えの光操作の結果を示す。（a）PA-CreとCRY2-CIB1-splitCreを用いてマウスの肝臓でのDNA組換えの光操作した場合の比較した結果を示す。DNA組換えによってルシフェラーゼが発現するレポーター（図3bのFloxed-STOP-Fluc）を用いて評価した。生体外からの30秒間の短時間の光照射でもPA-Creは効率よくルシフェラーゼの発現を誘導できるが、CRY2-CIB1-splitCreでは全く発現が見られない。（b）生体外から30秒間の短時間の光照射を施した後、マウスから肝臓を摘出してルシフェラーゼの発光のイメージング図を示す。PA-Creは効率よくルシフェラーゼの発現を誘導できるが、CRY2-CIB1-splitCreでは全く発現が見られない。（c）図12bの検討を繰り返し行い、その結果をまとめた。 PA-Creのマウスへの応用の結果を示す。（a）PA-CreとCRY2-CIB1-split Creを用いてマウスの肝臓でのDNA組換えの光操作した場合の比較した結果を示す。DNA組換えによってルシフェラーゼが発現するレポーター（図3bのFloxed-STOP-Fluc）を用いて評価した。生体外からの光照射（16 h）でPA-Creは効率よくルシフェラーゼの発現を誘導できるが、CRY2-CIB1-split Creではルシフェラーゼの発現が非常に弱い。また、PA-Creは室内の明るさでは全くルシフェラーゼを発現しない。（b）生体外から光照射を施した後、マウスから肝臓を摘出してルシフェラーゼの発光のイメージング図を示す。PA-Creは効率よくルシフェラーゼの発現を誘導できるが、CRY2-CIB1-splitCreではほとんど発現が見られない。また、PA-Creは室内の明るさでは全くルシフェラーゼを発現しない。（c）図13bの検討を繰り返し行い、その結果をまとめた。 Creタンパク質を59番目のアミノ酸と60番目のアミノ酸の間で切断した場合の本発明に係るPA-Creのアミノ酸配列を示す。 Creタンパク質を104番目のアミノ酸と106番目のアミノ酸の間で切断した場合の本発明に係るPA-Creのアミノ酸配列を示す。 Creタンパク質を59番目のアミノ酸と60番目のアミノ酸の間で切断した場合の本発明に係るPA-Creのベクターに挿入される塩基配列を示す。 Creタンパク質を104番目のアミノ酸と106番目のアミノ酸の間で切断した場合の本発明に係るPA-Creのベクターに挿入される塩基配列を示す
　本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合する、光依存的遺伝子組換えに用いられる2つのポリペプチドのセットであって、
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるか、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであり、
　Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸とCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸で、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合し、
　光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、それぞれ配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つの異なるポリペプチドのセットである。
　すなわち、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の一方のタンパク質にCreタンパク質のN末端側フラグメントがC末端のアミノ酸で結合し、光依存的に二量体を形成する2つのマグネットタンパク質のもう一方のタンパク質にCreタンパク質のC末端側フラグメントがN末端のアミノ酸で結合している。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおいては、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、光照射により二量体を形成することにより、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合するCreタンパク質のN末端側フラグメントと、Creタンパク質のC末端側フラグメントがCreタンパク質として再構成されて、Creタンパク質のレコンビナーゼ活性を回復する。よって、本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、光依存的遺伝子組換えに用いることができる。
　本明細書において遺伝子組換えに用いられるとは、Cre/loxPシステムによる遺伝子組換え技術であることを意味する。
　本発明において、Creタンパク質は、配列番号：1で示されるアミノ酸配列を有し、配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位の領域内か、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位の領域内に切断部位を有し、Creタンパク質が当該いずれかの領域内で切断されることで、スプリットCreである2つのフラグメントが生じる。切断された2つのフラグメントのうち、配列番号：1におけるN末端側のフラグメントをCreタンパク質のN末端側フラグメント（CreN）といい、C末端側のフラグメントをCreタンパク質のC末端側フラグメント（CreC）という。
　すなわち、本発明において、Creタンパク質のN末端側フラグメントにおけるアミノ酸配列と、Creタンパク質のC末端側フラグメントのアミノ酸配列を比較すると、Creタンパク質のN末端側フラグメントは、Creタンパク質のC末端側フラグメントに比して、配列番号：1において、N末端側の領域のアミノ酸配列を有する。Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸は、配列番号：1の配列において、C末端側フラグメントのN末端のアミノ酸よりもN末端側のアミノ酸である。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、それぞれCreタンパク質の部分配列又は部分配列に変異を含む配列からなるフラグメントであってよい。
　Creタンパク質の部分配列からなるフラグメントとは、配列番号：1のアミノ酸配列を有するCreタンパク質を切断した場合に、配列番号：1のアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸から切断部のアミノ酸までのアミノ酸配列における部分配列を有するか、あるいは配列番号：1のアミノ酸配列において切断部のアミノ酸からC末端のアミノ酸までのアミノ酸配列における部分配列を有するフラグメントであることを意味する。
　配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、部分配列からなるフラグメントである場合、それぞれのフラグメントにおいて、配列番号：1のアミノ酸配列のN末端のアミノ酸及び／又は配列番号：1のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸を有さなくてもよいことを意味する。
　配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、配列番号：1のアミノ酸配列に変異を含む配列を有していてもよく、Creタンパク質の部分配列に変異を含む配列を有していてもよい。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、それぞれのアミノ酸配列において、配列番号：1のアミノ酸配列と相同性が１００％となるアミノ酸配列を有していてもよく、配列番号：1のアミノ酸配列から変異されたアミノ酸配列を有していてもよく、各フラグメントにおいて、配列番号：1のアミノ酸配列に対して部分配列となるアミノ酸配列を有していてもよく、各フラグメントにおいて、配列番号：1のアミノ酸配列に対して部分配列となるアミノ酸配列から変異されたアミノ酸配列を有していてもよい。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントにおいては、N末端側フラグメントのC末端とC末端側フラグメントのN末端とで切断されていてもよく、N末端側フラグメントのC末端とC末端側フラグメントのN末端とを連結する１～数個のアミノ酸を欠失する形で切断されていてもよい。
　Creタンパク質は、図4において示すような二次構造を有していることが知られている。
　配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位は、Creタンパク質のB-α-helixとC-α-helixの間にあたるアミノ酸に相当し、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位は、Creタンパク質のD-α-helixとE-α-helixの間にあたるアミノ酸に相当する。
　配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位と、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位は、それぞれ、結晶構造解析の結果（Guo, F., et al., Nature, 389, 40-46 (1997)）から，α-helix間のフレキシブルなループ構造であることが明らかになっている領域である。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるとは、配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位の領域内に切断部位を有していればよいことを意味し、Creタンパク質のN末端側フラグメントは、少なくとも59位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含有するフラグメントであり、Creタンパク質のC末端側フラグメントは、少なくとも68位のアミノ酸以降のアミノ酸配列を含有するフラグメントである。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるとは、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位の領域内に切断部位を有していればよいことを意味し、Creタンパク質のN末端側フラグメントは、少なくとも101位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含有するフラグメントであり、Creタンパク質のC末端側フラグメントは、少なくとも111位のアミノ酸以降のアミノ酸配列を含有するフラグメントである。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、それぞれが、配列番号：1のアミノ酸配列の1位～59位と68位～343位の領域を含むよう設計してもよく、配列番号：1のアミノ酸配列の1位～101位と111位～343位の領域を含むよう設計してもよい。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントにおけるN末端のアミノ酸及びCreタンパク質のC末端側フラグメントにおけるC末端のアミノ酸は、N末端側フラグメントとC末端側フラグメントとが、光依存的に遺伝子組換え活性を回復することができるものであれば、配列番号：１のアミノ酸配列において、特に限定されるものではない。
　配列番号：1のアミノ酸配列の1位～59位の領域及び68位～343位の領域を含むよう設計するとは、スプリットCreが二量化した際に、Creタンパク質のレコンビナーゼ活性を保持しているのであれば、特に限定されず、配列番号：1のアミノ酸配列の1位～59位の領域内及び68位～343位の領域内の部分配列をそれぞれ、Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが有していてもよい。また、Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、配列番号：1のアミノ酸配列の1位～59位の領域内及び68位～343位の領域内にアミノ酸配列において変異があってもよく、あるいは、変異を有し、かつ、その部分配列であるフラグメントであってもよい。
　配列番号：1のアミノ酸配列の60位～67位の領域については、領域内の全てのアミノ酸を、あるいは、一部のアミノ酸をCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントのいずれかのフラグメントが有していてもよい。Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、60位～67位の領域の一部又は全部を有する場合には、60位～67位の領域内のアミノ酸配列において変異があってもよい。
　配列番号：1のアミノ酸配列の1位～101位の領域及び111位～343位の領域を含むよう設計するとは、スプリットCreが二量化した際に、Creタンパク質のレコンビナーゼ活性を保持しているのであれば、特に限定されず、配列番号：1のアミノ酸配列の1位～101位の領域内及び111位～343位の領域内の部分配列をそれぞれ、Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが有していてもよい。また、Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、配列番号：1のアミノ酸配列の1位～101位の領域内及び111位～343位の領域内のアミノ酸配列において変異があってもよく、あるいは、変異を有し、かつ、その部分配列であるフラグメントであってもよい。
　配列番号：1のアミノ酸配列の102位～110位の領域については、領域内の全てのアミノ酸を、あるいは、一部のアミノ酸をCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントのいずれかのフラグメントが有していてもよい。Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、102位～110位の領域の一部又は全部を有する場合には、102位～110位の領域内のアミノ酸配列において変異があってもよい。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが部分配列からなるフラグメントである場合に、Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸と、C末端側フラグメントのN末端のアミノ酸は、それぞれ、切断部位に当るアミノ酸であることが好ましい。
　本発明においては、Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の68位～343位の領域を少なくとも有するか、
　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～101位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の111位～343位の領域を少なくとも有するポリペプチドのセットであることが好ましい。
　本発明においては、Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の60位～343位の領域を少なくとも有するポリペプチドのセットであることがより好ましく、Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～104位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の106位～343位の領域を少なくとも有するポリペプチドのセットであることがより好ましい。
　N末端側フラグメントとC末端側フラグメントは、配列番号：1のアミノ酸配列との重複する領域が、配列番号：1のアミノ酸配列の70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上、100％、又は100％以上となるよう設計してもよい。例えば、N末端側フラグメントが配列番号：1の19位のアミノ酸から59位のアミノ酸で構成され、C末端側フラグメントが60位のアミノ酸から343位のアミノ酸で構成される場合、19位から59位のアミノ酸の41アミノ酸と、60位から343位の284アミノ酸の合計である325アミノ酸で構成されることとなり、配列番号：1のアミノ酸配列の325/343の約95％が重複する領域となる。また、例えば、N末端側フラグメントが配列番号：1の19位のアミノ酸から104位のアミノ酸で構成され、C末端側フラグメントが106位のアミノ酸から343位のアミノ酸で構成される場合、19位から104位のアミノ酸の86アミノ酸と、106位から343位の238アミノ酸の合計である324アミノ酸で構成されることとなり、配列番号：1のアミノ酸配列の324/343の約94％が重複する領域となる。
　本明細書において、「N末端側フラグメント及び／又はC末端側フラグメントと、配列番号：1のアミノ酸配列との重複する領域」は、当業者に公知の方法で最もアミノ酸が一致するようにアライメントして、Creタンパク質の343個のアミノ酸に対して、重複するアミノ酸の割合を求めることができる。
　本明細書において、配列番号：1のアミノ酸配列に対して、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列からなるフラグメント、又は、配列番号：1のアミノ酸配列に対して、80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるフラグメントという場合に同様である。
　なお、N末端側フラグメントが配列番号：1の19位のアミノ酸から59位のアミノ酸で構成され、C末端側フラグメントが60位のアミノ酸から343位のアミノ酸で構成される場合において、例えば、1個～9個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失がある場合、それぞれ、アラインメントの結果として、324/343（約94％）～316/343（約92％）が重複する領域となる。N末端側フラグメントが配列番号：1の19位のアミノ酸から104位のアミノ酸で構成され、C末端側フラグメントが106位のアミノ酸から343位のアミノ酸で構成される場合において、例えば、1個～9個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失がある場合、それぞれ、アラインメントの結果として、323/343（約94％）～315/343（約92％）が重複する領域となる。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが以下のいずれかの組合せであってもよい。
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位の領域内に切断部位を有するフラグメントの組合せ；
　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位の領域内に切断部位を有するフラグメントの組合せ；
　配列番号：1のアミノ酸配列における19位～59位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、60位～343位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組合せ；
　配列番号：1のアミノ酸配列における19位～104位のアミノ酸からなるN末端フラグメントと、106位～343位のアミノ酸からなるC末端フラグメントの組合せ；
　当該組合せにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む組合せ；
　当該組合せにおいて、2つのフラグメントそれぞれの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む組合せ；
　当該組合せにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列が上記配列と80％以上の配列同一性を有するフラグメントである組合せ；並びに
　当該組合せにおいて、2つのフラグメントそれぞれ
の配列が上記配列と80％以上の配列同一性を有するフラグメントである組合せ
であってもよい。
　本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸を含む。本明細書における「アミノ酸」としては、天然タンパク質性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。
　非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α－二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、Ｎ－アルキル－α－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、α－ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書においてアミノ酸は、慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。一文字表記又は三文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれの変異体や誘導体を含む場合もある。
　本明細書において、あるアミノ酸配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むという場合、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個又は9個のアミノ酸が、その配列の末端又は非末端において、付加（挿入）、置換、又は欠失されていることを意味する。付加、置換、又は欠失されるアミノ酸の数は、結果として得られるポリペプチドが本発明における効果を奏する限り特に限定されない。また、付加、置換、又は欠失される部位は、1ヶ所であっても2ヶ所以上であってもよい。
　本明細書において、あるアミノ酸配列と配列同一性が80％以上であるという場合、配列同一性は、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上であってもよい。配列同一性は、当業者に公知の方法に従ってアラインメントアラインメントすることにより求めることができる。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、光依存的に遺伝子組換え活性を示すが、loxP配列又はloxP変異体配列と組合せて用いることにより、光依存的に、遺伝子組換えを行うことができる。
（光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質）
　本明細書において、「光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質」（以下、「マグネット」と記載する場合がある）は、光を照射することによってヘテロ二量体を形成するタンパク質のペアである。マグネットは、光、好ましくは、青色光を照射することによってヘテロ二量体を形成し、光照射を止めることによりヘテロ二量体が迅速に解離することで、本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおける二量体の形成及び解離を精密に制御することができ、光依存的に、Creタンパク質のレコンビナーゼ活性を回復させる。
　本発明においては、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質は、それぞれ配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つの異なるポリペプチドのセットである。
　本発明において、マグネットは、それぞれ配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体に由来するが、配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Vividタンパク質であり、配列番号：2のアミノ酸からなるポリペプチドの変異体は、Vividタンパク質の変異体と、それぞれ言い換えることができる。
　Vividタンパク質の変異体は、例えば、配列番号：2のアミノ酸配列と、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
　マグネットは、Vividタンパク質とVividタンパク質のペア、Vividタンパク質とVividタンパク質の変異体のペア、Vividタンパク質の変異体とVividタンパク質の変異体のペアのいずれのペアであってもよく、ペアの少なくとも一方のポリペプチドにおいて、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている。
　本明細書において、Vividタンパク質の変異体は、N末端αヘリックス以外の場所において、配列番号：2のアミノ酸配列とは異なる配列を有するポリペプチドである。Vividタンパク質の変異体には、N末端を切断したポリペプチド（配列番号：2のアミノ酸配列のうち、37位から186位のアミノ酸で構成されるポリペプチド）であってもよい。
　マグネットにおけるN末端αヘリックスにおけるアミノ酸の置換は、所望の二量体形成効率及び解離速度を実現できる限り、何個置換されていてもよく、置換されるアミノ酸の個数は、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個とすることができる。2個以上のアミノ酸が置換される場合、同一のアミノ酸でもよいし、異なるアミノ酸であってもよい。
　N末端αヘリックスとしては、配列番号：2における47位～56位のアミノ酸であることが好ましく、本発明に係る光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質は、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：2における47位～56位のアミノ酸のうち少なくとも1つのアミノ酸が置換されていることが好ましく、2つのタンパク質において、それぞれ配列番号：2における47位～56位のアミノ酸のうち少なくとも1つのアミノ酸が置換されていることがより好ましい。
　N末端αへリックスにおける変異は、配列番号：2の47位、48位、50位、51位、52位、54位、及び55位のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸における変異であることが好ましい。
　マグネットの一方のタンパク質において、N末端αヘリックスにおける少なくとも1つのアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、マグネットの他方のタンパク質において、N末端αヘリックスにおける少なくとも1つのアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されていることが好ましく、かかる構成により、マグネットにおける2つのタンパク質の親和性を高め、二量体形成効率を向上させることが可能となる。
　側鎖に正電荷を有するアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよく、天然のアミノ酸の場合には、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが挙げられる。側鎖に負電荷を有するアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよく、天然のアミノ酸の場合には、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。
　マグネットは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：2の52位に対応するアミノ酸及び／又は55位に対応するアミノ酸が置換されていることが好ましく、2つのタンパク質において、配列番号：2の52位に対応するアミノ酸及び／又は55位に対応するアミノ酸が置換されていることがより好ましい。
　配列番号：2の52位と55位のそれぞれに対応するアミノ酸における置換は、同じアミノ酸に置換されていてもよいし、異なるアミノ酸に置換されていてもよい。
　本明細書において、「配列番号：2のX位に対応するアミノ酸」とは、マグネットを構成する2つのタンパク質が、アミノ酸置換前に、配列番号：2と同一のアミノ酸配列を有する場合は、配列番号：2におけるX位のアミノ酸を意味する。
　また、マグネットを構成する2つのタンパク質が、アミノ酸置換前に、配列番号：2とは異なるアミノ酸配列を有する場合は、具体的には、Vividタンパク質の変異体である場合は、配列番号：2のX位に対応するアミノ酸を意味する。
　変異体において「配列番号：2のX位のアミノ酸」は、配列のアライメント等により適宜決定される。
　マグネットは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：2の52位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換されていることが好ましく、所望により、他方のタンパク質において、配列番号：2の52位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されていることがより好ましく、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されていることがさらに好ましい。
　また、マグネットは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：2の55位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換されていることが好ましく、所望により、他方のタンパク質において、配列番号：2の55位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されていることがより好ましく、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されていることがさらに好ましい。
　マグネットは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：2の52位及び55位に対応するアミノ酸が、同一又は異なって、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換されていることが好ましく、所望により、他方のタンパク質において、配列番号：2の52位及び55位に対応するアミノ酸が、同一又は異なって、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されていることがより好ましい。マグネットの一方のタンパク質において、配列番号：2の52位及び55位に対応するアミノ酸が側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されている場合、異なって置換されていることが好ましく、一方のアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されていることがより好ましく、配列番号：2の52位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換され、配列番号：2の55位に対応するアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されていることがさらに好ましい。
　配列番号：2の52位及び／又は55位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換されている場合には、同一又は異なって、リシン、アルギニン、又はヒスチジンで置換されていることが好ましく、アルギニンで置換されていることがより好ましい。
　配列番号：2の52位及び／又は55位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている場合には、同一又は異なって、アスパラギン酸又はグルタミン酸で置換されていることが好ましく、アスパラギン酸で置換されれていることがより好ましい。
　配列番号：2の52位及び／又は55位に対応するアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されている場合には、グリシンで置換されれていることがより好ましい。
　配列番号：2の52位に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸で置換されていることが好ましく、アスパラギン酸で置換されれていることがより好ましく、同時に、配列番号：2の55位に対応するアミノ酸が、中性アミノ酸で置換されていることが好ましく、グリシンで置換されれていることがより好ましい。
　具体的には、マグネットの一方のタンパク質において、52位のIle及び55位のMetが、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換された配列を有し、マグネットの他方のタンパク質において、52位のIle及び55位のMetが、側鎖に負電荷を有するアミノ酸及び／又は中性アミノ酸で置換された配列を有するものが挙げられる。
　マグネットとしては、特開２０１５－１６５７７６号公報に開示される、Vividタンパク質を基に本発明者らが開発した2つのタンパク質を用いることができる。
　マグネットの具体例としては、以下のものが挙げられる。
　52位のIle及び55位のMetが、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換された配列を有するマグネットの一方のタンパク質としては、pMag、pMagHigh1、pMagFast1及びpMagFast2等が挙げられ、52位のIle及び55位のMetが、側鎖に負電荷を有するアミノ酸及び／又は中性アミノ酸で置換された配列を有するマグネットの他方のタンパク質としては、nMag、nMagHigh1、nMagFast1及びnMagFast2等が挙げられる。
　マグネットは、pMag、pMagHigh1、pMagFast1及びpMagFast2から選ばれる1種のタンパク質と、nMag、nMagHigh1、nMagFast1及びnMagFast2から選ばれる1種のタンパク質の組合せであることが好ましい。
　本明細書においては、pMagは、I52R及びM55Rの変異を有する、配列番号：15のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、pMagHigh1は、pMagのアミノ酸配列において、さらにM135I及びM165Iの変異を有する、配列番号：16のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。pMagFast1は、pMagのアミノ酸配列において、さらにI85Vの変異を有する配列番号：17のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。pMagFast2は、pMagのアミノ酸配列において、さらにI74VとI85Vの変異を有する、配列番号：18のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
　本明細書においては、nMagは、I52D及びM55Gの変異を有する、配列番号：19のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、nMagHigh1は、nMagのアミノ酸配列において、さらにM135I及びM165Iの変異を有する、配列番号：20のアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。nMagFast1は、nMagのアミノ酸配列において、さらにI85Vの変異を有する配列番号：21のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。nMagFast2は、nMagのアミノ酸配列において、さらにI74VとI85Vの変異を有する、配列番号：22のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
　マグネットのそれぞれのポリペプチドと、Creタンパク質のN末端側フラグメント及びC末端フラグメントは、公知の方法で結合させることができる。例えば、それぞれをコードする核酸を適宜連結し、融合ポリペプチドとして発現させる方法が挙げられる。この場合、マグネットのいずれかのポリペプチドと、N末端側フラグメント又はC末端側フラグメントとの間には、リンカーとなるポリペプチドを介在させてもよい。
　本発明においては、リンカーを介していてもよいが、マグネットのそれぞれのポリペプチドは、Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸と、C末端フラグメントのN末端のアミノ酸と連結している。
　すなわち、本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合しているが、ここで、「結合」の意味としては、配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に直接結合しているか、リンカーを介して結合していることを意味する。
　言い換えれば、本発明における2つのポリペプチドのセットにおいては、配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸より、リンカーを介して、あるいは、介さずに、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である一方のポリペプチドが配置され、配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸より、リンカーを介して、あるいは、介さずに、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である他方のポリペプチドが配置されている。
　本発明においては、Creタンパク質のN末端側フラグメントがそのC末端のアミノ酸でpMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合する場合、Creタンパク質のC末端側フラグメントがそのN末端のアミノ酸でnMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合しているか、Creタンパク質のN末端側フラグメントがそのC末端のアミノ酸でnMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合する場合、Creタンパク質のC末端側フラグメントがそのN末端のアミノ酸でpMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合していることが好ましい。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおいては、Creタンパク質のN末端側フラグメントがそのC末端のアミノ酸でnMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、リンカーを介して、Creタンパク質のC末端側フラグメントがそのN末端のアミノ酸でpMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、リンカーを介して結合していることがより好ましい。
（リンカー）
　本発明において、Creタンパク質のN末端側フラグメント又はC末端側フラグメントと、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質との結合におけるリンカーだけではなく、本発明に係る2つのポリペプチドのセットのそれぞれのポリペプチドを構成するドメインとドメインとが結合している場合、ドメインとドメインとの間に両者の結合を介在させるリンカーが存在していてもよい。
　本発明において用いられるリンカーとしては、公知のリンカーであれば特に限定することなく用いることができるが、グリシン及びセリンをその配列中に多く含むアミノ酸配列を有するリンカーが用いられる。グリシンを主成分としているリンカーが一般に用いられるが、親水性アミノ酸であるセリンやトレオニンを含むリンカーであることが好適である。
　本発明において、ドメインとドメインをリンカーを介して結合させる場合、その遺伝子工学的手法として、制限酵素認識サイトを利用して結合させることができる。制限酵素認識サイトの多くは、6つの塩基配列からなるため、制限酵素認識サイトを利用してドメインとドメインを結合させる場合、2つのアミノ酸がドメインとドメインの間に導入されることになる。
　かかる制限酵素認識サイトを、本発明においては、リンカーとして用いることもできる。
　本発明において、リンカーは、特に限定されるものではないが、２～１６のアミノ酸で構成されていてもよい。
　本発明において、ドメインとは、本発明に係る2つのポリペプチドのセットを構成するCreタンパク質のN末端側フラグメント及びC末端側フラグメントと、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質とが挙げられ、その他のドメインとしては、例えば、核局在化シグナル配列及び2Aペプチド配列等が挙げられる。
（核局在化シグナル配列）
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、核局在化シグナル配列を有していてもよい。
　核局在化シグナル配列が存在する場合、Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸に結合する光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である一方のポリペプチドのC末端のアミノ酸に、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合していてもよく、Creタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸に結合する光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質である他方のポリペプチドのN末端のアミノ酸に、リンカーを介して、あるいは、介さずに結合していてもよい。
　核局在化シグナル配列は、本発明に係る2つのポリペプチドのセットの一方のポリペプチドに存在していてもよく、2つのポリペプチドに存在していてもよい。
　核局在化シグナル配列としては、特に限定されるものではなく、VPKKKRKV（配列番号：23）のアミノ酸配列や、KRTADGSEFESPKKKRKVEAS（配列番号：24）のアミノ酸配列が例示できる。
（2Aペプチド配列）
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、好適には、自己触媒的に切断され、そのN末アミノ酸及びC末端のアミノ酸を介してそれぞれ結合する前後のタンパク質の量の比を1:1にすることができる2Aペプチドと呼ばれるポリペプチドを用いて発現される。
　したがって、本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、自己触媒的に切断された2Aペプチドに由来するアミノ酸配列（2Aペプチド配列）をそれぞれ有していることが好ましい。本発明に係る2つのポリペプチドのセットが2Aペプチド配列を有するとは、cotranslationalに切断される2Aペプチドの部分配列を、2つのポリペプチドのセットを構成するそれぞれのポリペプチドが有していることを意味する。
　2Aペプチドとしては、特に限定されるものではないが、Kim, J. H., et al., PLoS One. 6(4), e18556 (2011)に記載されるペプチドが挙げられ、例えば、P2Aペプチド、T2Aペプチド、E2Aペプチド、及びF2Aぺプチドなどのポリペプチドが知られている。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、図3bに示すように、ドメインをそれぞれ配置したアミノ酸配列として発現され、P2Aペプチドが自己触媒的に切断されることによって得られる2つのポリペプチドのセットであることが好ましい。P2Aペプチド配列を例示して説明すると、P2Aペプチド配列であるGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号：6）うちC末端のGP配列の間でcotranslationalに切断され、P2Aペプチド配列のN末端のアミノ酸と結合するポリペプチドに対して、「GSGATNFSLLKQAGDVEENPG」が残存し、P2Aペプチド配列のC末端のアミノ酸と結合するポリペプチドに対して、「P」が残存する。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットとしては、2つのポリペプチドのセットにおける1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、Creタンパク質のN末端側フラグメント－光依存的に二量体を形成するタンパク質－核局在化シグナル配列－2Aペプチド配列の一部の順にアミノ酸配列を有し、もう1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、2Aペプチド配列の一部－核局在化シグナル配列－光依存的に二量体を形成するタンパク質－Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有することが好ましい。
　本明細書においてドメインとして認識される「Creタンパク質のN末端側フラグメント」、「Creタンパク質のC末端側フラグメント」「光依存的に二量体を形成するタンパク質」、「核局在化シグナル配列」及び「2Aペプチド配列」は、記載する順にポリペプチド中に配列されていればよく、各ドメイン間には、リンカーとなるアミノ酸配列が存在していてもよい。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットにおいては、N末端からC末端へとドメインが配置されているが、各ドメイン間において、詳しくは、Creタンパク質のN末端側フラグメントと光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、光依存的に二量体を形成するタンパク質と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と2Aペプチド配列の一部との結合、2Aペプチド配列の一部と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、及び光依存的に二量体を形成するタンパク質とCreタンパク質のC末端側フラグメントとの結合が、リンカーを介した結合であってもよい。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、配列番号：25のアミノ酸配列を有するポリぺプチド及び配列番号：26のアミノ酸配列を有するポリペプチドのセットであるか、配列番号：27のアミノ酸配列を有するポリぺプチド及び配列番号：28のアミノ酸配列を有するポリペプチドのセットであることが好適である。これらアミノ酸配列を図14及び15に示す。なお、各アミノ酸配列において、下線を付した「MA」配列は、開始コドンとKozak配列に由来する配列を意味し、その他の下線を付したアミノ酸配列は、ドメイン間のリンカーのアミノ酸配列であることを意味する。
（核酸）
　本発明は、2つのポリペプチドのセットを構成するポリペプチドをコードする核酸も提供する。
　本明細書において用語「核酸」は、特に記載されていない限り、DNA、RNA、DNA/RNAのキメラ、及び、locked nucleic acid（LNA）やペプチド核酸（PNA）などの人工核酸を含む。
　このような核酸としては、例えば、マグネットの一方のポリペプチドと、Creタンパク質のN末端側フラグメントとの融合ポリペプチドをコードする核酸、及び、マグネットの他方のポリペプチドと、Creタンパク質のC末端側フラグメントとの融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。マグネットのいずれか一方のポリペプチドと、Creタンパク質のN末端側フラグメント又はC末端側フラグメントとの融合ポリペプチドとの間のリンカーもあわせてコードする核酸であってもよい。
　また、本発明に係る核酸は、核局在化シグナル配列及び2Aぺプチド配列をあわせてコードする核酸であってもよく、ドメイン間にリンカーが存在するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。
　本発明に係る核酸は、Creタンパク質のN末端側フラグメント－光依存的に二量体を形成するタンパク質－核局在化シグナル配列－2Aペプチド配列－核局在化シグナル配列－光依存的に二量体を形成するタンパク質－Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする核酸であってもよく、各ドメイン間にリンカーとなるアミノ酸配列が存在するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。核酸の塩基配列の一例を、配列番号：29及び30として示す（図16及び17）。
　本発明に係る核酸は、当業者が公知の方法にしたがって合成することができる。
　本発明は、本発明に係る核酸を含む発現ベクターも包含する。本発明に係る発現ベクターにおいては、本発明に係る2つのポリペプチドのセットのそれぞれをコードする核酸のいずれか一方が挿入されていてもよく、本発明に係る2つのポリペプチドのセットのそれぞれをコードする核酸の双方が1つのベクターに挿入されていてもよい。ベクターに挿入される核酸の例としては、配列番号：29及び30の塩基配列が挙げられる。
　本発明の核酸はそのまま、又は制限酵素で消化し、又はリンカーを付加して、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（λファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。
　プロモーターは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、SV40（simian virus 40）由来プロモーター、CMV（cytomegalovirus）由来プロモーターを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター等を用いることができる。
　発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込んでもよい。
　本発明の発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いてもよい。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。
　形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするポリペプチドが発現する。
　形質転換体の培養物からのタンパク質の精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
　粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS－PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
　本発明においては、本発明に係る2つのポリペプチドのセットを、loxP配列及びloxP変異体配列である核酸と組み合わせて用いることにより、新規な光依存的遺伝子組み換えに用いられるCre-loxPシステムをも提供する。
　本発明においては、Creタンパク質がN末端側フラグメントとC末端側フラグメントに分割されている以外は、Cre-loxPシステムと同様にして遺伝子組換えを行うことができる。
　本発明に係るCre-loxPシステムは、本発明に係る核酸と、loxP配列及びloxP変異体配列である核酸とを組み合わせたシステムであってもよく、本発明に係る核酸としては、本発明に係る2つのポリペプチドのセットをコードする核酸であることが好ましい。本発明に係るCre-loxPシステムは、本発明に係る発現ベクターと、loxP配列又はloxP変異体配列である核酸とを含有する、Cre-loxPシステムであってもよい。
　loxP変異体としては、lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17からなる群から選択される配列を有する核酸を用いてもよい。
　本発明においては、本発明に係る2つのポリペプチドのセットを有する動物をも提供する。本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、当該動物において、N末端側フラグメントとC末端側フラグメントとして2つのタンパク質の組合せとして存在していてもよく、2つのポリペプチドのセットを構成するポリペプチドをコードする核酸として存在していてもよく、発現ベクターとして存在していてもよい。
　また、本発明に係る動物は、本発明に係る核酸を有していてもよく、本発明に係る核酸を発現ベクターとして有していてもよく、本発明に係るCre-loxPシステムを有していてもよい。
　本発明に係る2つのポリペプチドのセットは、従来の光依存的に制御されたスプリットCreよりも予想外に優れた遺伝子組換え活性を有するため、本発明に係る2つのポリペプチドのセットを体内に組み込んだ動物に対して体外から光照射することでも、効率よく遺伝子組換えをコントロールすることができる。
　すなわち、本発明に係る2つのポリペプチドのセットによれば、光照射をオン／オフすることでCre/loxPシステムによる遺伝子組換えをin vitroだけでなくin vivoにおいても正確に制御することができる。
　本発明に係るCre/loxPシステムを組み込んだ動物としては、哺乳動物であれば特に限定されるものではないが、実験動物としてのげっ歯類であることが好ましい。
　本発明に係るCre/loxPシステムを組み込んだ動物により、特に限定されるものではないが、例えば，光刺激で遺伝子の働きをノックアウトしたり，逆に変異型の遺伝子を光刺激で正常に戻してその影響を評価できるようにしたり，あるいは蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を光刺激で働かせて生体組織やそれを構成する細胞を標識することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
PA-Creのコンストラクトの作成
　Creの分割位置（Step1）、スプリットCreのN末端側フラグメント（CreN）とC末端側フラグメント（CreC）に対するマグネット（pMagおよびnMag）の結合位置（Step2）、リンカーの長さ（Step3）、核局在化シグナル配列（NLS）の結合位置（Step4）、P2Aペプチド配列の結合（Step5）などを検討して、PA-Creとして様々なコンストラクトをルシフェラーゼアッセイで評価した（図1，2）。この目的のために、COS-7細胞を1.5× 104細胞/wellの細胞密度で96-wellマイクロプレート（Corning, Corning, NY, USA）に播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った。PA-Creの様々なコンストラクトをそれぞれコードするcDNAとルシフェラーゼレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたDNAの総量は、0.05 μg/wellとした。このトランスフェクションにはX-tremeGENE 9 reagentを用いた。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光（1.0 W m-2）での照射を施した。ルシフェラーゼアッセイの直前に、0.2 mM D-luciferin potassium salt（Wako,Japan）を含んだHanks’ balanced salt solution（HBSS, Grand Island Biological, Grand Island, NY, USA）で培地を置換した。生物発光は、Centro XS3 LB 960 プレートリーダー（BertholdTechnologies, Bad Wildbad, Germany）を用いて10 秒間、室温での測定を行なった（図2）。
プラスミドの作製
　PA-Creのコンストラクトを作製するために、スプリットCreのN末端側フラグメント（CreN）とC末端側フラグメント（CreC）をコードするcDNAをCreの改良版（iCre）のcDNAから作製した。なお、iCreのcDNAは哺乳類細胞での発現を高めるためにコドンを最適化するようInvitrogen（Carlsbad, CA, UAS）で合成を行なった。具体的には、開始コドンとKozak配列を実現するためにATGGCC（MAをコード、配列番号：31）をつけた。
　CRY2-CIB1-splitCreのコンストラクトを作製するために、CRY2-CreN19-104のplasmid（#26888）とCIB1-CreC106-343のplasmid（#26889）をAddgeneより入手した。CreN19-59、CreC60-343、CreN19-104、CreC106-343、Magnetシステム（pMag及びnMag）、核局在化シグナル配列（NLS）をそれぞれコードするcDNAは一般的なPCRや制限酵素処理、ライゲーションにより作製した。
　PA-Creとその関連のコンストラクトは、CMVプロモーターを有するpcDNA3.1ベクター（Invitrogen）に導入した。なお、ネガティブコントロールのPA-Cre-Y324Fのコンストラクトを作製するために、Multi Site-Directed Mutagenesis（MBL）を用いて、当該キットのマニュアルに従って、324番目のチロシン残基のフェニルアラニンへの置換を行なった。CRY2-CIB1-splitCreはpcDNA3.1ベクターに導入した。
　Floxed-STOP-Flucのコンストラクトは、転写停止配列であるポリアデニル化配列（pA）を2つの同じ向きのloxP配列で挟んで作製した。一方、single-floxed-invertedFluc，double-floxed-inverted Fluc，lox66/lox71-floxed invertedFluc，JT15/JTZ17-floxed invertedFlucのコンストラクトは2つもしくは4つのloxP配列やloxP変異体の配列を逆向きにしてホタルルシフェラーゼ（Fluc）のcDNAを挟んで作製した。なお、Floxed-STOP-Flucのコンストラクトの作製には、Addgeneから入手したplasmid（#22797）を利用した。FlucのcDNAはpGL4.31ベクター（Promega）から得た。Floxed-STOP-Fluc，single-floxed-inverted Fluc，double-floxed-invertedFluc，lox66/lox71-floxed invertedFluc，JT15/JTZ17-floxed invertedFlucのそれぞれのコンストラクトはpcDNA3.1ベクターに導入した。なお、蛍光タンパク質のmCherryを用いたレポーターは、上述のFlucを用いたレポーター（floxed-STOP-Fluc，single-floxed-inverted Fluc，double-floxed-inverted Fluc，lox66/lox71-floxed inverted Fluc，JT15/JTZ17-floxed inverted Fluc）のFlucのcDNAをmCherryのcDNAで置き換えて作製した。
細胞の培養
　COS-7細胞、HEK-293細胞、NIH/3T3細胞、HeLa細胞（いずれもATCC）は10% FBS（GIBCO, Carlsbad, CA, USA）、100 unit/mLpenicillin、100 μg/mL streptomycin（GIBCO）を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，Sigma Aldrich）を用いて37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。CHO-K1細胞 （ATCC）は10%FBS、100 unit/mL penicillin、100μg/mL streptomycinを添加したHam’s F-12 medium（GIBCO）を用いて37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。
光源
　PA-Creを発現する細胞やマウスに対する光照射のために、LED光源（470 ± 20 nm;CCS, Kyoto, Japan）を用いた（図6～10，12，13）。室内光に対するPA-Creの応答性を調べるために、白色蛍光ランプを用いた（図13）。 
PA-Creの評価
　ルシフェラーゼアッセイを行うために、COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレート（Corning, Corning, NY, USA）に播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った（図6， 9，10）。PA-Cre（又はCRY2-CIB1-split Cre）をコードするcDNAとルシフェラーゼレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションに用いたDNAの総量は、0.05 μg/wellである。なお、このトランスフェクションにはX-tremeGENE 9 reagent を用いた。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光（1.0 W m-2）での照射を施した。ルシフェラーゼアッセイの直前に、0.2 mM D-luciferin potassium salt（Wako,Japan）を含んだHanks’ balanced salt solution（HBSS, Grand Island Biological, Grand Island, NY, USA）で培地を置換した。生物発光は、Centro XS3 LB 960 プレートリーダー（BertholdTechnologies, Bad Wildbad, Germany）を用いて10 秒間、室温での測定を行なった。
　コントロール実験のために、COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度・BR>ナ96-WELL マイクロプレートに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った（図6）。PA-Cre-Y324F（iCre又はpcDNA3.1ベクター）をコードするcDNAとルシフェラーゼレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。なお、トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクショ
ンを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光（1.0 W m-2）での照射を施し、生物発光を測定した。iCreの場合、トランスフェクションから48時間、細胞を暗所でインキュベーションして生物発光を測定した。
　PA-Creの制御に対する光照射の強度依存性を調べるために、96-well マイクロプレートを40%、33%、25%、10%の透過率のNDフィルター（Fujifilm, Tokyo, Japan）でマスクした（図6）。COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレートに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。なお、トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光（1.0 W m-2）での照射を施し、生物発光を測定した。
　様々な細胞種においてPA-Creの光応答性を調べるために、HEK-293細胞、NIH/3T3細胞、CHO-K1細胞を1.5× 104細胞/wellの細胞密度で96-wellマイクロプレートに播種した（図6）。HeLa細胞は3.0 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレートに播種した。これらの細胞は37 °C、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った。HEK-293細胞はPA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。NIH/3T3細胞、HeLa細胞、CHO-K1細胞は、PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには0.3 μg/wellのDNAを用い、Lipofectamine3000 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して24 h、青色光（1.0 W m-2）での照射を施し、生物発光を測定した。
　蛍光イメージングに基づいて評価を行うために、COS-7細胞を3.0 × 104細胞/wellの細胞密度でLab-Tek 8-well chamberedcoverglasses（Thermo Scientific, Waltham, USA）に播種し、当該細胞を37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養した（図6， 9）。PA-CreもしくはCRY2-CIB1-split CreをコードするcDNAとそれぞれのレポーターのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには0.15 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して 24 h、青色光（1.0 W m-2）での照射を施した。蛍光イメージングの直前に培地をHBSSで置換した。蛍光イメージングは63 × oil objective を搭載したLSM 710 confocal laser-scanning microscope（CarlZeiss, Jena, Germany）で行った。mCherryの蛍光イメージングにはHeNe laser（543 nm）を用いた。
パターン照明
　COS-7細胞を1.4 × 106細胞/dishの細胞密度で6 cm 培養ディッシュ（Thermo Scientific）に播種し、当該細胞を37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養した（図7，8）。なお、培養ディッシュは、その底面に黒いビニールテープで様々なパターンの光マスク（STRIPE，STAR，SMILEY，MOUNTAIN，LETTERS）を作製して利用した。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでトランスフェクションした。もしくは、PA-CreをコードするcDNAとFloxed-Fluc-hCL1-hPESTのplasmidを1:4の割合で37 °Cでトランスフェクションした。トランスフェクションには2.5 μg/dishのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して48 h、青色光（1.0 W m-2）での照射を施した。生物発光イメージングの前に、1 mM D-luciferinを含んだHBSSで培地を置換した。生物発光イメージングはEvolve 512 EMCCD camera（Photometrics）を搭載したLumazone bioluminescence imager（NipponRoper, Tokyo, Japan）を用いて5 min行った。データはslidebook 4.2 software（IntelligentInnovations Inc., Denver, CO）とImage-J softwareを用いて解析した。 
PA-CreのDNA組換え反応のキネティクスの計測
　ルシフェラーゼアッセイを行うために、COS-7細胞を1.5 × 104細胞/wellの細胞密度で96-well マイクロプレートに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った（図9）。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションには0.05 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して様々な時間（0，1.5，3，6，12，24，48 h）、青色光（1.0 W m-2）での照射を施した。そして、0.2 mM D-luciferinを含んだHBSSで培地を置換した。生物発光は、Centro XS3 LB 960 プレートリーダーを用いて10 秒間、室温での測定を行なった。コントロール実験のために、COS-7細胞にpcDNA3.1ベクター（Mock）とFloxed-STOP-Flucのplasmidを上述と同様の条件でトランスフェクションして生物発光計測を行った。
　PA-CreによるDNA組換え反応を蛍光で評価するために、COS-7細胞を3.0 × 104細胞/wellの細胞密度で8-well chambered coverglassに播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った（図9）。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-mCherryのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションには0.15 μg/wellのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して様々な時間（0，1.5，3，6，12，24，48 h）、青色光（1.0 W m-2）での照射を施した。蛍光イメージングの直前に培地をHBSSで置換した。蛍光イメージングは63 × oil objective を搭載したLSM 710 confocal laser-scanning microscope（CarlZeiss, Jena, Germany）で行った。 mCherryの蛍光イメージングには HeNe laser（543 nm）を用いた。 コントロール実験のために、COS-7細胞にpcDNA3.1ベクター（Mock）とFloxed-STOP-mCherryのplasmidを上述と同様の条件でトランスフェクションして蛍光イメージングを行った。
光の照射時間依存性の検討
　COS-7細胞を2.0 × 105細胞/dishの細胞密度で35 mm culture dish（IWAKI, Tokyo, Japan）に播種し、37 °C 、5% CO2の条件下で、24 h培養を行った（図10）。PA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cで当該細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションには1.0 μg/dishのDNAを用い、X-tremeGENE9 reagentでトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24 h後から、細胞に対して、次のように様々な時間パターンで青色光照射を施した：細胞に対して50 W m-2の青色光で30 s、光照射を施した後に、暗所に24 hインキュベーションし、生物発光計測を行った。また、細胞に対して50 W m-2の青色光で30 s、30 minのインターバルで3回、もしくは6回の光照射を施した後に、暗所でインキュベーションし、生物発光計測を行った。1-shotilluminationの実験については、30 sに加えて、15min、1 h、3 hの青色光照射（50 W m-2）も検討した。コントロール実験として、青色光（1.0W m-2）での24 h照射も行った。生物発光計測の前に、0.2 mM D-luciferinを含んだHBSSで培地を置換した。生物発光は、GloMax 96 microplate luminometer（Promega）を用いて1.0 秒間、室温での測定を行なった。
マウスでのDNA組換え反応
　実験では5週齢のメスのBALB/cマウス（SankyoLabo Service Corporation, Inc., Tokyo, Japan）を用いた（図12，13）。除毛クリームを用いてマウスの腹部の毛を除き、 24 h、ケージの中で飼育した。そしてPA-CreをコードするcDNAとFloxed-STOP-Flucのplasmidを1:9の割合で37 °Cでマウスの尾静脈にインジェクションした。このハイドロダイナミックインジェクションにはTransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution（MirusBio LLC, Madison, WI, USA）を用い、マニュアルに従って行った。インジェクションしたDNAの量と溶液の体積はそれぞれ300 μg/mouse weight (g)、0.1 mL/mouse weight(g)である。ハイドロダイナミックインジェクションの後、マウスを8 h、暗所で飼育し、青色LED光源（470 ± 20 nm, 200 W m-2）で16 hもしくは30 s、ケージの中で光照射した。30 s光照射したマウスは、さらに16 h、暗所で飼育した。室内光での光照射については、ハイドロダイナミックインジェクションを施したマウスを白色蛍光（0.05 W m-2）の元で24 h、飼育した。マウスの生物発光イメージングは、ハイドロダイナミックインジェクションの24 h後に行った。生物発光イメージングの前に、100 mM D-luciferinをマウスの尾静脈にインジェクションした。D-luciferin溶液は10 μL/mouse weight (g)である。D-luciferinのインジェクションから3 min後、 Evolve 512 EMCCD camera（Photometrics）を搭載したLumazone bioluminescence imager（Nippon Roper）で5 min、生物発光イメージングを行なった。D-luciferin の尾静脈注射と生物発光イメージングの間、マウスにはisoflurane（AbbVie, Tokyo, Japan）で麻酔を行い、マウスの動きを抑制した。In vivoでのマウスの生物発光イメージングの後、ex vivoでの解析を行うために、当該マウスから肝臓を摘出した。肝臓は1 mM D-luciferinを含んだPBSの中に入れた。なお、実験には6-well culture plate（Thermo Scientific）を利用した。そして、anteriorとposteriorの摘出肝臓のイメージをLumazone bioluminescence imager（Nippon Roper）を用いて5 min、撮影した。データはslidebook 4.2 software（Intelligent Innovations Inc.）で解析した。
　配列番号：1　Creタンパク質のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：2　Vividタンパク質のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：3～5　リンカーのアミノ酸配列を示す。
　配列番号：6　P2Aペプチドのアミノ酸配列（P2Aペプチド配列）を示す。
　配列番号：7～12　loxPとloxP変異体（lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17）の塩基配列を示す。
　配列番号：13、14　DNA組換えによる生成物であるlox72及びJA15-JTZ17の塩基配列を示す。
　配列番号：15～22　pMag、pMagHigh1、pMagFast1、pMagFast2、nMag、nMagHigh1、nMagFast1及びnMagFast2のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：23、24　例示される核局在化シグナル配列のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：25～28　本発明に係る2つのポリペプチドのセット（PA-Cre）を構成するポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
　配列番号：29、30　本発明に係る2つのポリペプチドのセット（PA-Cre）のベクターに挿入される塩基配列を示す。
　配列番号：31　PA-Creの開始コドンとKozak配列であるMAアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。

Claims (19)

  1. 　配列番号：1のアミノ酸配列のCreタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合する、光依存的遺伝子組換えに用いられる2つのポリペプチドのセットであって、
    　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、それぞれ、配列番号：1のアミノ酸配列の59位～68位の領域内に切断部位を有するフラグメントであるか、配列番号：1のアミノ酸配列の101位～111位の領域内に切断部位を有するフラグメントであり、
    　Creタンパク質のN末端側フラグメントのC末端のアミノ酸とCreタンパク質のC末端側フラグメントのN末端のアミノ酸で、それぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質に結合し、
    　光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、それぞれ配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその変異体であり、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、2つのポリペプチドのセット。
  2. 　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の68位～343位の領域を少なくとも有するか、
    　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～101位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の111位～343位の領域を少なくとも有する、請求項１に記載の2つのポリペプチドのセット。
  3. 　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～59位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の60位～343位の領域を少なくとも有する、請求項１に記載の2つのポリペプチドのセット。
  4. 　Creタンパク質のN末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の19位～104位の領域を少なくとも有し、Creタンパク質のC末端側フラグメントが、配列番号：1のアミノ酸配列の106位～343位の領域を少なくとも有する、請求項１に記載の2つのポリペプチドのセット。
  5. 　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントにおいて、少なくとも1つのフラグメントの配列に1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むか、少なくとも1つのフラグメントの配列が対応する配列番号：1のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するフラグメントである、請求項１～４のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット。
  6. 　光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の一方のタンパク質において、少なくとも配列番号：2の52位及び／又は55位に対応するアミノ酸が、リシン、アルギニン又はヒスチジンで置換され、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質の他方のタンパク質において、少なくとも配列番号：2の52位及び／又は55位に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシンで置換されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット。
  7. 　光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質が、pMag、pMagHigh1、pMagFast1又はpMagFast2と、nMag、nMagHigh1、nMagFast1又はnMagFast2と、の組合せである、請求項６に記載の2つのポリペプチドのセット。
  8. 　Creタンパク質のN末端側フラグメントとC末端側フラグメントが、ぞれぞれ、光依存的に二量体を形成する2つのタンパク質とリンカーを介して結合する、請求項１～７のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット。
  9. 　核局在化シグナル配列が、Creタンパク質のN末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のC末端のアミノ酸で、及び／又はCreタンパク質のC末端側フラグメントに結合する光依存的に二量体を形成するタンパク質のN末端のアミノ酸で、リンカーを介して、あるいは、リンカーを介さずに結合する、請求項１～８のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット。
  10. 　2Aペプチド配列をさらに有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット。
  11. 　2つのポリペプチドのセットにおける1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、Creタンパク質のN末端側フラグメント－光依存的に二量体を形成するタンパク質－核局在化シグナル配列－2Aペプチド配列の一部の順にアミノ酸配列を有し、
    　もう1つのポリペプチドが、N末端側からC末端側へ、2Aペプチド配列の一部－核局在化シグナル配列－光依存的に二量体を形成するタンパク質－Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット。
  12. 　Creタンパク質のN末端側フラグメントと光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、光依存的に二量体を形成するタンパク質と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と2Aペプチド配列の一部との結合、2Aペプチド配列の一部と核局在化シグナル配列との結合、核局在化シグナル配列と光依存的に二量体を形成するタンパク質との結合、及び光依存的に二量体を形成するタンパク質とCreタンパク質のC末端側フラグメントとの結合が、リンカーを介した結合である、請求項１１に記載の2つのポリペプチドのセット。
  13. 　請求項１から１２のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセットをコードする核酸。
  14. 　Creタンパク質のN末端側フラグメント－光依存的に二量体を形成するタンパク質－核局在化シグナル配列－2Aペプチド配列－核局在化シグナル配列－光依存的に二量体を形成するタンパク質－Creタンパク質のC末端側フラグメントの順にアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする、請求項１３に記載の核酸。
  15. 　請求項１３又は１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
  16. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット、請求項１３若しくは１４に記載の核酸、又は請求項１５に記載の発現ベクター、及びloxP配列又はloxP変異体配列である核酸を含有する、Cre-loxPシステム。
  17. 　loxP変異体が、lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17からなる群から選択される、請求項１６に記載のCre-loxPシステム。
  18. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の2つのポリペプチドのセット、請求項１３若しくは１４に記載の核酸、請求項１５に記載の発現ベクター、又は請求項１６若しくは１７に記載のCre-loxPシステムを有する動物。
  19. 　げっ歯類である、請求項１８に記載の動物。
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