WO2018179578A1 - ゲノム編集によるエクソンスキッピング誘導方法 - Google Patents

ゲノム編集によるエクソンスキッピング誘導方法 Download PDF

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WO2018179578A1
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crispr
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紅梅 李
典子 笹川
秋津 堀田
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国立大学法人京都大学
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to genetic recombination technology, and relates to a method for inducing exon skipping by genome editing that is useful in research and medical fields.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • the skeletal muscle isoform (Dp427m) of the dystrophin gene is composed of 79 exons, but the dystrophin protein cannot be made normally due to a shift in the reading frame of the gene due to a lack of this exon. This causes wrinkles that cause DMD (Non-patent Document 1).
  • dystrophin full-length cDNA has a size of 14 kb
  • mini dystrophin and micro dystrophin reduced by cutting down unnecessary domain parts are prepared, and various gene transfer vectors (AAV, lentivirus, Sleeping Beauty transposon vector, etc.) Attempts have been made to introduce it into muscle tissue.
  • AAV lentivirus, Sleeping Beauty transposon vector, etc.
  • genome editing techniques such as TALEN and CRISPR-Cas systems have been developed as methods for repairing genes themselves. These recognize nonspecific homologous recombination (Non-homologous end joining, NHEJ) and homologous recombination (Homology directed repair, HDR) by recognizing a specific sequence location from the genome sequence and inducing DNA double strand breaks. It is a technology that allows bases to be added to or deleted from the cut site by locally inducing a DNA repair mechanism via the.
  • CRISPR-Cas genome editing technology is widely used for Type II or Type IV V CRISPR systems possessed by bacteria and archaea, and binds to target DNA depending on the spacer sequence contained in the guide RNA (gRNA or sgRNA). Double-strand DNA breakage can be induced by the action of a nuclease (Cas9 in the case of Type II, Cpf1 in the case of Type V).
  • the guide RNA is a complex of crRNA and tracrRNA, or sgRNA (single guide RNA) in which crRNA and tracrRNA are linked.
  • Non-patent Documents 2 and 3 There is a report that exon skipping of dystrophin using genome editing technology was performed in myoblasts [Non-patent Documents 2 and 3] and mdx mouse level [Non-patent Documents 4 to 7].
  • the present inventors previously used (1) exon skipping, (2) frameshift induction, (3) and deletion exon of DMD patient-derived iPS cells by using genome editing techniques such as TALEN and CRISPR-Cas9. It has been reported that dystrophin gene mutation can be repaired by knock-in [Non-patent Document 8].
  • the method (1) employs a method of deleting the exon splice acceptor, and if one gRNA can induce a deletion of several bases to several tens of bases, exon skipping can be sufficiently induced. It is superior to the methods reported in Non-Patent Documents 2 to 7], and is superior in three points, that is, the risk of side effect mutation is small and only a few DNA bases are deleted.
  • Splice acceptors are attractive target sites for inducing exon skipping, but contain polypyrimidine (T / C contiguous) sequences and have similar sequences in many exon sequences. Therefore, there is a problem that it is difficult to design a highly specific gRNA. Double nicking with increased specificity by combining two nickase-modified CRISPR-Cas that induce single-strand breaks rather than double-strand breaks by introducing mutations into the DNA break domain of CRISPR-Cas [Mali P et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31 (9): 833-8.] [Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12; 154 (6): 1380-9.] ing.
  • Type V AsCpf1 is known to have higher specificity in human cells than Type II SpCas9 [Kleinstiver BP et al., Nat Biotechnol, 2016 Aug; 34 (8): 869-74 .
  • the cleavage activity and the cleavage length differ depending on the spacer sequence of the guide RNA and the type of CRISPR-Cas, and the rule of thumb for the guide sequence and the design method that can efficiently induce exon skipping was unknown.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently performing exon skipping. Another object of the present invention is to provide a method for easily performing exon skipping evaluation.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • a target gene for exon skipping a marker gene in which a sequence containing the first intron, the exon to be analyzed and the second intron is inserted in the coding region is used, and the marker gene is designed to function when the exon is skipped.
  • exon skipping can be analyzed efficiently based on the phenotype of the marker gene.
  • the cleavage site by CRISPR-Cas is within 80 bases from the splice acceptor site or splice donor site of the target exon. It has been found that the efficiency of exon skipping can be improved by setting the guide RNA so that it is arranged, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following.
  • [1] A method for skipping a target exon of a target gene on a genome using CRISPR-Cas and a guide RNA, wherein the guide RNA is a splice donor site immediately before the target exon at the cleavage site by CRISPR-Cas
  • a method comprising a spacer sequence arranged within 80 bases from a splice acceptor site immediately after a target exon.
  • the method according to [1] wherein two or more types of the guide RNA are used.
  • CRISPR-Cas is a nickase-modified Cas in which the nuclease active residue of the RuvC domain is substituted, and uses a guide RNA for the sense strand of the target gene and a guide RNA for the anti-sense strand.
  • a reagent for skipping a target exon of a target gene on the genome including CRISPR-Cas and a guide RNA, wherein the guide RNA is a splice donor site where the cleavage site by CRISPR-Cas is immediately before the target exon.
  • a reagent having a spacer sequence arranged within 80 bases from the splice acceptor site immediately after the target exon [12]
  • a method for evaluating exon skipping wherein a marker gene in which a sequence containing a first intron, an exon to be analyzed, and a second intron is inserted in a coding region is used, and the exon to be analyzed is skipped
  • the method according to [12], wherein the exon skipping is exon skipping using CRISPR-Cas and guide RNA.
  • the efficiency of exon skipping can be improved in exon skipping using genome editing technology, which is effective in treating diseases.
  • a target gene for exon skipping a marker gene in which a sequence containing the first intron, the exon to be analyzed and the second intron is inserted in the coding region is used, and the marker gene functions so that the exon is skipped.
  • FIG. 1 shows the principle of repair of dystrophin protein by genome editing exon skipping method.
  • Fig. 2 shows that the sequence specificity of the splice acceptor sequence site is generally low, and that similar sequences are also present elsewhere in the genome. Design a highly specific CRISPR guide RNA, etc. Indicates that it is difficult. Create a unique sequence (Unique k-mer) database that exists only in the human genome sequence (hg19) from any DNA sequence with a length of 10 to 16 bases, and distribute the distribution of this unique sequence to human RefSeq Plots were made according to the relative positions in all exons of the gene.
  • Unique k-mer Unique k-mer
  • FIG. 3 shows a part of the sequence of a reporter vector that detects the exon skipping efficiency of the dystrophin gene.
  • CAG G
  • the sequence near the splicing donor (SD) immediately after exon 44 of the dystrophin gene ("+” sign) ), Exon 45 (">" mark), the intron sequences before and after, and the splice acceptor (SA) sequence ("+” mark) immediately before exon 46 are designed in this order.
  • the restriction enzyme sites (NarI, AgeI, SalI) used for the construction of the vector are marked with a # mark.
  • the Luc sequence was modified by introducing a mutation so that splicing occurs only at the inserted dystrophin sequence site.
  • the background level of luciferase activity decreased due to the introduction of G967A V (V323I) mutation, and this made it possible to detect exon skipping with low frequency and high sensitivity.
  • vectors of various lengths were constructed in order to examine the effect of intron length around exon 45 on splicing.
  • the luciferase reporter is mounted on a piggyBac vector, and stable integration into the host cell chromosome is possible by co-introducing this vector with a piggyBac transferase expression vector.
  • a puromycin resistance gene is also loaded after IRES so that only cells into which the reporter vector has been introduced can be enriched.
  • FIG. 9 shows the target sequence of CRISPR SpCas9 gRNA for the splice acceptor site of exon 45 in the human dystrophin gene.
  • FIG. 10 shows the target DNA cleavage activity when CRISPR-SpCas9 and CRISPR-SpCas9 (D10A) were used in human 293T cells as measured by SSA assay.
  • CRISPR-SpCas9 CRISPR-SpCas9
  • cleavage activity is observed in any of guide RNAs 1 to 5.
  • nickase-modified SpCas9 (D10A) is used, cleavage activity is not observed as expected with only a single guide RNA.
  • FIG. 11 shows a cutting pattern by cutting sequence analysis.
  • Plasmid DNA expressing CRISPR-Cas9 and the guide RNA was introduced into DMD-iPS cells by electroporation, and after extracting genomic DNA, the genomic DNA cleavage pattern was analyzed using a MiSeq sequencer. The position where the base is missing is shown as a stacked line graph.
  • the exon skipping efficiency of sgRNA-DMD1-5 was measured in 293T cells using Luc2 ⁇ (G967A) + hEx45 (0.7 kb) as an exon skipping reporter.
  • luciferase activity increased with a significant difference of P ⁇ 0.01 in sgRNA-DMD1, sgRNA-DMD4, and sgRNA-DMD2.
  • gRNA target sequences derived from various CRISPR-Cas (SpCas9, SaCas9, AsCpf1) designed near the splice acceptor of dystrophin exon 45. PAM sequences are underlined.
  • b Image diagram of AsCpf1 gRNA expression cassette.
  • G or A
  • TSS transcription start point
  • AsCpf1 and gRNA were introduced into 293T cells, and the cleavage activity of the target DNA was measured by SSA assay. First, the cleavage activity was increased by increasing the transcription start point (TSS) G from 1 to 3 bases.
  • AsCpf1-gRNA-DMD1 and AsCpf1-gRNA-DMD2 with TTTT as PAM sequence have very low cleavage activity
  • AsCpf1-gRNA-DMD3 and AsCpf1-gRNA-DMD4 with TTTG (TTTV) as PAM are SpCas9-
  • the cleavage activity was equal to or better than that of gRNA-DMD1.
  • (d) Using Luc2 (G967A) + hEx45 (0.7 kb) as an exon skipping reporter, the exon skipping efficiency was measured in 293T cells using the Double Nicking method, SaCas9 / gRNA, and AsCpf1 / gRNA.
  • exon skipping activity was higher when sgRNA-DMD4 and sgRNA-DMD5 were used in pairs by SpCas9 (D10A) double nicking method. Furthermore, high exon skipping efficiency could also be induced by using AsCpf1 sgRNA-DMD-3 and sgRNA-DMD-4.
  • Twenty-six types of gRNA were prepared at the target site of SpCas9-gRNA that can be designed on dystrophin exon 45.
  • Each gRNA was introduced into 293T cells together with SpCas9 expression vector and Luc2 (G967A) + hEx45 (0.7 kb) exon skipping reporter vector, and the following primers (Luc2-Fwd-Splice: TGCCCACACTATTTAGCTTC (SEQ ID NO: 1), : GTCGATGAGAGCGTTTGTAG) (SEQ ID NO: 2) was used to perform T7E1 assay, and the DNA cleavage activity of the target site on the reporter vector of each gRNA was measured (T7E1 Indel activity [%]). Exon skipping efficiency was also measured (Exon skipping Luc activity [A.U.]).
  • the method of the present invention is a method for skipping a target exon of a target gene on a genome using CRISPR-Cas and a guide RNA, wherein the guide RNA ⁇ is spliced immediately before the target exon at the cleavage site by CRISPR-Cas. It has a spacer sequence that is located within 80 bases from the splice acceptor site immediately after the donor site or target exon.
  • Class 1 in which multiple factors work in a complex and Class 2 in which a single factor works are also known.
  • Class 1 includes Type I, Type III, and Type IV. Includes Type II, Type V, and Type VI (Makarova KS et al., Nat Rev Microbiol. 2015
  • Class 2 CRISPR-Cas acting on a single factor is mainly used for genome editing in mammalian cells, with Type II Cas9 and Type V Cpf1 being representative examples.
  • Class 2 Type II Cas9 derived from Streptococcus pyogenes which is widely used as a genome editing tool, can be used, but Class 2 Type II Cas9 derived from other bacteria has also been reported.
  • Cas9 derived from Staphylococcus aureus, Sa Cas9 derived from Neisseria meningitidis, Nm
  • Cas9 derived from Thermophilus (Streptococcus thermophilus, St) can be used.
  • An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.
  • Cpf1 has been identified as a CRISPR-Cas system of Class 2 Type V. Genomic editing in human cells is dependent on gRNA sequence by using Cpf1 derived from Acidaminococcus sp., As and Cpf1 derived from Lachnospiraceae Has been reported to be possible. Therefore, these CRISPR-Cpf1 can also be used.
  • Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System.Cell. 2015 Oct 22; 163 (3): 759-71
  • CRISPR-Cas9 has two nuclease domains, a RuvC domain and an HNH domain, and each domain is responsible for breaking each strand of double-stranded DNA.
  • CRISPR-Cpf1 has a RuvC domain and a Nuc domain.
  • Streptococcus pyogenes-derived Cas9 replacing the 10th Asp of the RuvC domain with Ala (D10A), the DNA strand to which gRNA does not bind is not cut, and replacing the 840th His of the HNH domain with Ala (H840A), The DNA strand to which gRNA binds is not cleaved [Jinek M et al., Science.
  • Double nicking (or paired nickases) method was developed [Mali P et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31 (9): 833-8.] [Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12; 154 ( 6): 1380-9.].
  • D10A Cas9 Nickase can be used as CRISPR-Cas9, and two types of guide RNAs for cleaving the sense strand and the antisense strand can be used (Double nicking method).
  • Nickase-type Cas9 and Nickase-type Cpf1 that can be used for the double nicking method can be obtained by introducing mutations into the active amino acid residues of the RuvC domain.
  • the DNA encoding CRISPR-Cas as described above can be obtained by cloning based on the sequence encoding CRISPR-Cas registered in GenBank or the like.
  • a commercially available plasmid containing CRISPR-Cas may be obtained from Addgene or the like, or a DNA encoding CRISPR-Cas may be obtained by PCR using the plasmid as a template, which is known to those skilled in the art. These may be artificially produced using the artificial gene synthesis technique, and the method for obtaining them is not limited.
  • the DNA encoding Cas Nickase can be obtained by introducing mutations into the active amino acid residues of the nuclease domain of CRISPR-Cas using known molecular biological techniques, or CRISPR-Cas in which mutations have been introduced beforehand You may clone and use from the plasmid etc. which contain a gene. CRISPR-Cas may be codon-modified to improve the expression efficiency in the host.
  • CRISPR-Cas may be introduced into cells as mRNA, protein, or DNA.
  • Guide RNA may be introduced into cells as RNA or DNA.
  • vectors used for introduction using vectors include vectors that can replicate in eukaryotic cells, as well as vectors that maintain episomes or vectors that are integrated into the host cell genome. Examples thereof include virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors, adeno-associated virus vectors, and the like.
  • the transposon vector include piggyBac vector, piggyBat vector, Sleeping Beauty vector, TolII vector, LINE vector and the like.
  • introduction with a vector that is constantly expressed is not preferable because it increases the risk of side effects, and DNA cleavage should be induced immediately after administration, so introduction as Cas9 mRNA / gRNA or Cas9 protein / gRNA, episomal Introduction as a vector is preferred.
  • the vector may contain a selectable marker.
  • Selectable marker refers to a genetic element that provides a selectable phenotype to a cell into which the selectable marker has been introduced, and generally the resistance of the gene product to an agent that inhibits or kills the cell. It is a gene to be given.
  • Drugs useful for selecting the presence of a selectable marker include, for example, puromycin for the Puro resistance gene, G418 for the Neo resistance gene, hygromycin for the Hyg resistance gene, and the Bls gene. These include blasticidin, histidinol for hisD, xanthine for Gpt, and bleomycin for Ble.
  • the guide RNA (gRNA or sgRNA) is a complex of tracrRNA and crRNA in the CRISPR-Cas9 method, or an artificially linked tracrRNA and crRNA. [Jinek M et al., Science. 2012 Aug 17; 337 (6096): 816-21.] In the present invention, it means a concatenation of a spacer sequence having a sequence corresponding to a target gene and a scaffold sequence. To do.
  • the scaffold sequence of the guide RNA of SpCas9 a known sequence, for example, the sequence of 5′-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 3) can be used.
  • a modified scaffold sequence (Chen B et al., Cell, 2013 Dec 19; 155 (7): 1479-91) 5'-GTTTTAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 4) may be used.
  • the guide RNA does not require tracrRNA in CRISPR-Cpf1.
  • As the scaffold sequence of the guide RNA of AsCpf1 a known sequence such as 5′-GTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 5) or 5′-GGGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) can be used. It is.
  • the DNA may be artificially produced using an artificial gene synthesis technique known to those skilled in the art, and the method for obtaining the DNA is not limited.
  • the cleavage site by CRISPR-Cas is within 80 bases, preferably within 50 bases, more preferably within 30 bases from the splice donor site immediately before the target exon or the splice acceptor site immediately after the target exon.
  • the spacer sequence of the guide RNA is set so that it is arranged.
  • ESE Exonic Splicing Enhancer
  • a splice acceptor site is defined as two bases immediately before the target exon, for example, an AG sequence.
  • a splice donor site is defined as 2 bases immediately after the target exon, for example, a GT sequence.
  • the Exonic Splicing Enhancer (ESE) sequence is defined as the binding site for the SR protein (SRSF1-12 gene) present in the target exon. SR protein binding sites can be searched in a database, such as RESCUE-ESE [Fairbrother WG et al., Science, 2002], ESEfinder [Cartegni L. et al., NAR, 2003], etc. There is.
  • the spacer sequence of Type II Cas9 is the 3 'end of the base sequence immediately before the PAM sequence (for example, NGG for S. pyogenes Cas9 or NNGRRT for Staphylococcus aureus Cas9) in the sense or antisense strand of the target gene.
  • N is a spacer sequence
  • cleavage can occur even if the sequences do not match 100%, there may be 1 to 2 base mismatches (especially on the 5 ′ side).
  • the base at the 5 ′ end of the spacer sequence is preferably not C or T. If the corresponding base on the genome is C or T, it is converted to G. It is preferable to do.
  • Type V Cfp1 guide RNA it can be designed as an RNA having a continuous base sequence of 15 to 30 bases with the base immediately after the PAM sequence (for example, TTTV in the case of Acidaminococcus sp. Cpf1) as the 5 ′ end. (For example, TTTTVNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (sequence number 8)). In the case of Cpf1, tracrRNA is not required.
  • the DNA cleavage site by S. pyogenes Cas9 breaks between the 3rd base and the 4th base from the base when counting in the 3 ' ⁇ 5' direction with the 3 'terminal base of the spacer sequence as 1.
  • the cleavage site is located within 80 bases from the acceptor site or donor site of the target exon” means that the base of the acceptor site or donor site (for example, GT or AG (AC or CT in the case of antisense strand)) and spacer This means that the number of bases present between the fourth base counted from the base corresponding to the base at the 3 ′ end of the sequence in the 3 ′ ⁇ 5 ′ direction is within 80 bases.
  • a spacer sequence corresponding to 20 bases (atcttacagGAACTCCA / GGA) (SEQ ID NO: 10) immediately before the PAM sequence (TGG) is designed. In this case, there are 8 bases between the acceptor sequence (ag) and the cleavage site (A / G).
  • a spacer sequence corresponding to 20 bases (cagGAACTCCAGGATGG / CAT) (SEQ ID NO: 11) immediately before the PAM sequence (TGG) is designed. In this case, 14 bases exist between the acceptor sequence (ag) and the cleavage site (G / C).
  • Sp-sgRNA-DMD4 a spacer sequence corresponding to 20 bases (TCCAGGATGGCATTGGG / CAG) (SEQ ID NO: 12) immediately before the PAM sequence (CGG) is designed. In this case, 21 bases exist between the acceptor sequence (ag) and the cleavage site (G / C).
  • Sp-sgRNA-DMD5 is set as an antisense strand, and a spacer sequence corresponding to 20 bases (GTTCctgtaagatacca / aaa) (SEQ ID NO: 13) immediately before the PAM sequence (AGG) is designed. In this case, 11 bases exist between the acceptor sequence (ct) and the cleavage site (a / a).
  • T is read as U.
  • a guide RNA can be obtained by adding a scaffold sequence to the spacer sequence as described above. Plasmids that contain the scaffold sequence and can express the desired guide RNA by inserting a DNA sequence corresponding to an arbitrary spacer sequence are commercially available (such as Addgene plasmid 41824). It is easy to introduce guide RNA into cells.
  • Two or more types of guide RNA may be used. In that case, the condition that “the cleavage site by CRISPR-Cas is within 80 bases from the splice donor site immediately before the target exon or the splice acceptor site immediately after the target exon” is satisfied for one target site (target exon).
  • Two or more types of guide RNA can be used. When two or more different guide RNAs are used for the same site to be destroyed and DNA double-strand breaks are caused at two or more sites at the same time, exon skipping can be caused with very high efficiency.
  • Two or more kinds of guide RNAs may be set in one of the sense strand and the antisense strand, or may be set in both.
  • the distance between the guide RNA binding site (spacer sequence) of the sense strand and the guide RNA binding site (spacer sequence) of the antisense strand is preferably ⁇ 10 to 200 bases, more preferably 0 to 100 bases. It is preferable that an acceptor site or a donor site is disposed between the cleavage site of the sense strand and the cleavage site of the antisense strand.
  • the spacer sequence of the guide RNA for cleaving the sense strand and the spacer sequence of the guide RNA for cleaving the antisense strand may overlap each other, but preferably do not overlap.
  • the target gene having the target exon is not particularly limited, but is preferably a mammalian gene, more preferably a human gene, and examples thereof include genes related to diseases.
  • a mammalian gene more preferably a human gene
  • examples thereof include genes related to diseases.
  • the dystrophin gene which is the causative gene of Duchenne muscular dystrophy, and it is known that the phenotype of the mutant gene can be masked by skipping exon 45, so exon 45 of the human dystrophin gene.
  • it can be suitably used as an exon skip target.
  • An artificially synthesized gene containing exons and introns may be used as the target gene.
  • Examples of the base sequences of base numbers 17 to 39 of these base sequences or base sequences of base numbers 24 to 43 of any of the base sequences of SEQ ID NOs: 50 to 53 are exemplified. These complementary sequences may also be used.
  • preferred combinations of spacer sequences when using two types of guide RNAs in combination include, for example, sgRNA-DMD1 (base sequences 17 to 36 of SEQ ID NO: 17), sgRNA-DMD2 (SEQ ID NO: 18 base sequences of base numbers 17 to 36), sgRNA-DMD4 (base sequence of base numbers 17 to 36 of SEQ ID NO: 20), sgRNA-DMD8 (base sequence of base numbers 17 to 36 of SEQ ID NO: 24) or sgRNA- This is a combination of DMD9 (base sequence of base numbers 17 to 36 of SEQ ID NO: 25) and sgRNA-DMD23 (base sequence of base numbers 17 to 36 of SEQ ID NO: 39).
  • preferable spacer sequence combinations for use in the double nicking method include, for example, sgRNA-DMD4 (base sequence of base numbers 17 to 36 of SEQ ID NO: 20) and sgRNA-DMD5 (sequence of SEQ ID NO: 21). Base sequences of base numbers 17 to 36).
  • Transfection of cells with DNA, RNA, or a vector expressing them can be performed by using any known means, and commercially available transfection reagents may be used.
  • Lipofectamine2000 Thermo Fisher
  • StemFect STEMGEN
  • FuGENE 6 / HD Promega
  • jetPRIME Kit Polyplus transfection
  • DreamFect Ozbioscience
  • GenePorter3000 Ozbioscience
  • Calcium Phosphate Transfection Kit Oz
  • electroporation may be used, and for example, NEPA21 (Neppagene), 4D-Nucleofector (Lonza), Neon (Thermo Fisher), Gene Pulser Xcell (BioRad), ECM839 (BTX Harvard Apparatus) and the like can be used.
  • NEPA21 Neppagene
  • 4D-Nucleofector Loxza
  • Neon Thermo Fisher
  • Gene Pulser Xcell BioRad
  • ECM839 BTX Harvard Apparatus
  • a complex may be formed in advance between the CRISPR-Cas protein and gRNA, and the complex may be transfected into the cell. It is also possible to introduce DNA and RNA into fertilized eggs by microinjection or electroporation.
  • the cell may be a cell line or a primary cultured cell isolated from mammalian tissue, but may also be a pluripotent stem cell such as a mesenchymal cell or an induced pluripotent stem (iPS) cell.
  • a pluripotent stem cell such as a mesenchymal cell or an induced pluripotent stem (iPS) cell.
  • skeletal muscle cells, mesenchymal cells, or iPS cells derived from DMD patients are established, and guide RNA and CRISPR-Cas or guide RNA for inducing exon skipping of the present invention therein
  • guide RNA and CRISPR-Cas or guide RNA for inducing exon skipping of the present invention therein
  • exon skipping of the dystrophin gene can be induced to restore the dystrophin protein.
  • transplanting such a repair cell or a derivative product thereof into a patient it is possible to supplement a contracted muscle cell.
  • the exon skipping of the dystrophin gene is induced and the patient's body.
  • the dystrophin protein is recovered.
  • the present invention also relates to a method for evaluating exon skipping using CRISPR-Cas, guide RNA, and the like, wherein the sequence contains a first intron, an exon to be analyzed, and a second intron in the coding region.
  • a method that uses a gene and is designed so that the marker gene functions when the analysis exon is skipped (by the action of guide RNA and CRISPR-Cas set in the vicinity of the analysis exon) I will provide a.
  • Exon skipping can be induced by antisense nucleic acid or the like, and the evaluation target is not limited to genome editing.
  • Marker genes include genes containing enzymes such as luciferase and LacZ, genes encoding fluorescent proteins such as GFP, Ds-Red and mCherry, Puro resistance gene, Neo resistance gene, Hyg resistance gene, Bls gene, hisD gene Examples include, but are not limited to, drug resistance genes such as Gpt gene and Ble gene. If the splicing donor or acceptor sequence is the same or similar to the marker gene cDNA, it is necessary to modify the site so that splicing in the marker does not occur. It is preferable for the purpose of evaluation.
  • the insertion position of the sequence containing the first intron (including the donor site and the acceptor site), the exon to be analyzed and the second intron (including the donor site and the acceptor site) into the marker gene is determined by inserting the exon into the marker gene. Is no longer functional (the activity of the marker protein or the phenotype based on the marker gene disappears). It is sufficient to investigate in advance that the marker gene will not function due to exon insertion.
  • the portion of “@” in the CAG @ G or AAG @ G sequence is selected as the insertion site sequence, the splice acceptor sequence of the first intron and the splice acceptor sequence of the second intron are human splice acceptor.
  • the marker gene is expressed as an exon-inserted fusion protein (original activity is lost), or is not normally expressed by exon insertion. The gene does not function.
  • the marker gene is expressed as a normal type, and the activity of the marker protein or the phenotype based on the marker gene is observed. Therefore, it is possible to analyze whether an exon is skipped depending on the presence or absence of a marker gene function. This allows simple evaluation of exon skipping, and is useful for screening compounds that promote exon skipping.
  • transposon vectors include piggyBac vectors, piggyBat vectors, Sleeping Beauty vectors, TolII vectors, and LINE vectors.
  • virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, and adeno-associated virus vectors.
  • the type of exon is not particularly limited, and examples include exon 45 of the dystrophin gene as described above.
  • ⁇ Construction of SpCas9 cDNA expression vector> A pUC57-SphcCas9 vector containing the SV40 large T antigen-derived nuclear translocation signal peptide (PKKKRKV) (SEQ ID NO: 217) at the C-terminus and inserted with the Streptococcus pyogenes-derived Cas9 cDNA optimized for human codon frequency by DNA synthesis (GenScript) Produced. This was digested with SalI-XbaI restriction enzyme and ligated to the SalI-XbaI site of pENTR2B (A10463, Thermo Fisher) to construct a pENTR-SphcCas9 vector.
  • PKKRKV SV40 large T antigen-derived nuclear translocation signal peptide
  • PHL-EF1 ⁇ -SphcCas9-iC-A vector (SpCas9-IRES-mCheery-polyA), pHL-EF1 ⁇ -SphcCas9-iP-A vector (SpCas9-IRES-PuroR-polyA) (Addgene, 60599), and pHL- An EF1 ⁇ -SphcCas9-A vector (SpCas9-polyA) was constructed.
  • the EF1 ⁇ promoter is suitable because the expression level in pluripotent stem cells is higher than that of a virus-derived promoter (such as a CMV promoter).
  • the DNA sequence SphcCas9-D10A (NcoI-SbfI) in which GaC codon (Asp, D) was converted to GcC codon (Ala, A) was converted into gBlock (IDT).
  • the pENTR-SphcCas9-D10A vector was constructed by cleaving the SphcCas9-D10A (NcoI-SbfI) sequence with the NcoI-SbfI restriction enzyme and inserting it into the NcoI-SbfI site of the pENTR-SphcCas9 vector using the In-Fusion reaction.
  • the SphcCas9-D10A cDNA portion of the pENTR-SphcCas9-D10A vector is inserted into the pHL-EF1 ⁇ -GW-iC-A vector or pHL-EF1 ⁇ -GW-iP-A vector by the Gateway LR clonase reaction, and the pHL-EF1 ⁇ -SphcCas9-D10A-iC-A vector (SpCas9-IRES-mCheery-polyA) and pHL-EF1 ⁇ -SphcCas9-D10A-iP-A vector (SpCas9-IRES-PuroR-polyA) were constructed.
  • SphcCas9-D10A (NcoI-SbfI) 5'-ATTCAGTCGA CCATGG ATAAGAAATACAGCATTGGACTG GcC ATTGGGACAAACTCCGTGGGATGGGCCGTGATTACAGACGAATACAAAGTGCCTTCAAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTGATTGGAGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACAGCTGAAGCAACTCGGCTGAAAAGAACTGCTCGGAGAAGGTATACCCGCCGAAAGAATAGGATCTGCTA CCTGCAGG AGATTTTCAGCAA-3 '( SEQ ID NO: 14)
  • ⁇ SpCas9 gRNA expression vector construction> To clone SpCas9 gRNA into an expression vector, mix 10 pmol of each of the following Sp-sgRNA-XXX-fwd primers (any one of SEQ ID NOs: 17 to 42) and Sp-sgRNA-Universal-rev primer. , Perform thermal cycling reaction using KOD Plus Neo DNA polymerase (Toyobo) (98 °C: after 2min thermal denaturation, ⁇ 94 °C: 10 sec, 55 °C: 10 sec, 68 °C: 10 sec ⁇ ⁇ 35 cycles, then heat at 4 ° C).
  • KOD Plus Neo DNA polymerase Toyobo
  • the PCR product is electrophoresed on a 2% agarose gel, and a DNA band having a size of about 135 bp is excised and purified.
  • This purified PCR product was inserted into pHL-H1-ccdB-mEF1a-RiH vector (Addgene 60601) cleaved with BamHI-EcoRI using In-Fusion reaction (Takara-Clontech), and pHL-H1 expressing any gRNA -[SpCas9-gRNA] -mEF1a-RiH vector is constructed.
  • Sp-sgRNA-XXX-fwd GAGACCACTTGGATCCRNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTAGAGCTAGAAATAGCA SEQ ID NO: 16
  • Sp-sgRNA-DMD1-fwd GAGACCACTTGGATCCGggtatcttacaggaactccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA SEQ ID NO: 17
  • Sp-sgRNA-DMD3-fwd GAGACCACTTGGATCCGaggaactccaggatggcatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA SEQ ID NO: 19
  • Sp-sgRNA-DMD4-fwd GAGACCACTTGGATCCGCCAGGATGGCATTGGGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA SEQ ID NO: 20
  • the SaCas9 cDNA portion of the pUC-Kan-SahcCas9 vector was inserted into the pHL-EF1 ⁇ -GW-A or pHL-EF1 ⁇ -GW-iP-A vector by Gateway LR clonase reaction, and HL-EF1 ⁇ -SaCas9-A and HL -EF1 ⁇ -SaCas9-iC-A vectors were constructed respectively.
  • the PCR product is electrophoresed on a 2% agarose gel, and a DNA band having a size of about 135 bp is excised and purified.
  • This purified PCR product was inserted into pHL-H1-ccdB-mEF1a-RiH vector (Addgene 60601) cleaved with BamHI-EcoRI using In-Fusion reaction (Takara-Clontech), and pHL-H1 expressing any gRNA -[SaCas9-gRNA] -mEF1a-RiH vector is constructed.
  • sgRNA-DMD-SA-5 5'-GAGACCACTTGGATCCATTACAGGAACTCCAGGATGGCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAAT-3
  • sgRNA-DMD-SA-8 5'-GAGACCACTTGGATCCATTGCCGCTGCCCAATGCCATCCGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAAT-3
  • the hcAsCpf1 cDNA part of the pENTR-hcAsCpf1 vector is inserted into the pHL-EF1 ⁇ -GW-A or pHL-EF1 ⁇ -GW-iP-A vector by Gateway LR clonase reaction, and the HL-EF1 ⁇ -hcAsCpf1-A and HL-EF1 ⁇ -hcAsCpf1-iC-A vectors were constructed respectively.
  • any of the following AsCpf1-gRNA-XXX-rev primers (any of SEQ ID NOs: 50-53) and AsCpf1-gRNA-Universal-GGG-fwd primer (or AsCpf1-gRNA) -Universal-G-fwd primer) is mixed at 10 pmol, and thermal cycling reaction is performed using KOD Plus Neo DNA polymerase (Toyobo) (98 ° C: 2 min heat denaturation, then ⁇ 94 ° C: 10 sec , 55 °C: 10 sec, 68 °C: 10 sec ⁇ ⁇ 35 cycles, then kept at 4 °C).
  • KOD Plus Neo DNA polymerase Toyobo
  • the PCR product is electrophoresed on a 2% agarose gel, and a DNA band having a size of about 80 bp is cut out and purified.
  • This purified PCR product was inserted into pHL-H1-ccdB-mEF1a-RiH vector cleaved with BamHI-EcoRI using the In-Fusion reaction (Takara-Clontech), and pHL-H1- [AsCpf1-gRNA expressing AsCpf1 gRNA ] -mEF1a-RiH vector is constructed.
  • SSA-DMD-all-ss oligo DNA having the target sequence of Sp-gRNA-DMD1-5 and SSA-DMD-all-as oligo DNA are annealed and pGL4-SSA vector (Addgene The pGL4-SSA-DMD-all vector was constructed by ligation to the BsaI site present in Firefly Luc2 cDNA of 42962, Ochiai et al., Genes Cells, 2010).
  • the Firefly Luc2 cDNA is split and does not show Luc activity, but if the guide RNA induces cleavage of the target DNA portion of the pGL4-SSA vector, the SSA (Single strand annealing) pathway Repairs DNA breaks and restores Firefly Luc2 cDNA.
  • SSA-DMD-all-ss 5'-gtcgTGCCTTTTTGGTATCTTACAGGAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATggt-3 ' (SEQ ID NO: 54)
  • SSA-DMD-all-as 5'-cggtaccATGTTCTGACAACAGTTTGCCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACCAAAAAGGCA-3 ' (SEQ ID NO: 55)
  • FIGS. 10 and 13 (c) pGL4-SSA-DMD-All vector 100 ng, Renilla Luc expressing phRL-TK vector 20 ng, CRISPR-Cas expressing pHL-EF1a vector 200 ng, sgRNA expressing pHL-H1-sgRNA-mEF1a- Mix 200 ng of RiH vector and dilute with 25 ⁇ l of Opti-MEM. Dilute 0.7 ⁇ l of Lipofectamine 2000 with 25 ⁇ l of Opti-MEM, incubate at room temperature for 3-5 minutes, mix with the above DNA solution, and incubate at room temperature for another 20 minutes.
  • the number of cells of 293T cells suspended by trypsin-EDTA treatment was counted, diluted with medium to 60,000 cells / 100 ⁇ l, and added to 1 well of a 96-well plate containing the DNA-Lipofectamine complex. Seed 100 ⁇ l at a time. After culturing cells at 37 ° C in 5% CO 2 for 48 hours, add Dual-Glo Reagent to a 96-well plate that has been returned to room temperature, and incubate at room temperature for 30 minutes to thaw the cells and perform luciferase reaction. Wake me up.
  • Knockout SR (Thermo Fisher, 10828028), 2.5 mL L-glutamine (Thermo Fisher, 25030081), 2.5 mL non-essential amino acid mix (Thermo Fisher, 11140050), 0.5 mL 2-mercaptoethanol (Thermo Fisher, 21985023), 1.25 Cultured with mL penicillin-streptomycin (Thermo Fisher, 15140122) and 8 ng / ml human basic FGF (Wako, 6404541) ⁇ .
  • StemFit AK03N (Ajinomoto) medium may be used and cultured on iMatrix-511 (Nippi, 892014) without using feeder cells.
  • FIG. 1 ⁇ Analysis of genomic DNA cleavage pattern in DMD-iPS cells> FIG.
  • 10 ⁇ M Y-27632 Sigma was added to the medium for at least one hour before transfection.
  • iPS cells were detached with CTK solution, cells were separated using 0.25% trypsin-EDTA, cell count was performed, and 1 ⁇ 10 6 cells were prepared per condition .
  • pHL-EF1 ⁇ -SphcCas9-iP-A vector (Addgene, 60599) using NEPA21 electroporator (Neppagene) under conditions of perforation pulse voltage 125V, pulse width 5ms, number of pulses 2 times 5 ⁇ g and 5 ⁇ g of pHL-H1- [Sp-gRNA] -mEF1 ⁇ -RiH vector were electroporated.
  • electroporation of 5 ⁇ g of pHL-EF1 ⁇ -SphcCas9-D10A-iP-A vector and 5 ⁇ g of pHL-H1- [Sp-gRNA] -mEF1 ⁇ -RiH vector for a total of 10 ⁇ g did.
  • genomic DNA is extracted and subjected to primary PCR amplification using DMD-MiSeq-Rd1-fwd-X and DMD-MiSeq-Rd2-rev-X primers. Secondary PCR amplification was performed using Multiplex P5 fwd primer and Multiplex P7 rev primer.
  • the PCR product is gel-cut and purified, then quantified using the Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher) and the KAPA Library Quantification Kit for Illumina (KAPA Biosystems), mixed to an equal volume for each sample, and then the DNA concentration is 2
  • the DNA was alkali-denatured by adjusting to nM and treating with 0.2N NaOH for 5 minutes.
  • the denatured DNA sample was diluted to 12 pM, 4 pM PhiX spike-in DNA was added, and then MiSeq sequencing reaction was performed using MiSeq Reagent Kit v2 for 2 ⁇ 150 bp (Illumina).
  • DMD-MiSeq-Rd1-fwd-X (N is a barcode sequence according to the sample. See below) 5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3 '(SEQ ID NO: 56) DMD-MiSeq-Rd2-rev-X (N is a barcode sequence according to the sample.
  • the pENTR-D-TOPO-Luc2 vector was constructed by PCR amplification of Luc2 cDNA from pGL4-CMV-luc2 (Promega) and cloning into the pENTR-D-TOPO vector (Thermo Fisher Scientific Inc.).
  • the pENTR-D-TOPO-Luc2 vector was cleaved with NarI and AgeI, and the following intron sequence synthesized with gBlock (IDT) and DMD Exon 45 sequence were inserted, and pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron- Ex45 [+] vector was constructed.
  • the pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45 [-] vector was constructed by cleaving at two SalI sites on both sides of hEx45 in the gBlock sequence and re-ligating the vector side. .
  • the piggyBac 5'TR (Terminal repeat) and 3'TR sequence) derived from Trichoplusia ni were synthesized (IDT) into three divided gBlocks sequences (gBlock11 to 13-PV-3'TR-5'TR). After ligation by PCR, the pPV-synthesized vector was constructed by inserting it into the AatII-PvuII site of the pUC19 vector by In-Fusion reaction.
  • PB-EF1a-GW-iP vector (Masui H et al., PLOS ONE, 2014 Aug 15; 9 (8): e104957.) was cleaved with NheI-PacI and ligated to pPV-synthesized NheI-PacI site The pPV-EF1a-GW-iP vector was constructed.
  • pHL-PacI-rHBB-pA-IF-fw primer (5'-GTATACCTCGAGTTAAATTCACTCCTCAGGTGC-3 '(SEQ ID NO: 92)
  • pPV-PacI-rHBB-pA-IF-rev primer (5'-CGAGCTTGTTGGTTAATTAAGTCGAGGGATCTCCATAA-3' (SEQ ID NO: 93)) are used to amplify rabbit-derived hemoglobin poly A signal
  • pPV- The pPV-EF1a-GW-iP-A vector was constructed by inserting it into the PacI site of the EF1a-GW-iP vector using the In-Fusion reaction.
  • pPV-EF1a-GW-iP-A vector By Gateway LR reaction using pPV-EF1a-GW-iP-A vector and pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45 [+], pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45 [+]-iP- A vector was constructed.
  • pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45-[-] was obtained by Gateway-LR reaction using pPV-EF1a-GW-iP-A vector and pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45 [-].
  • -An iP-A vector was constructed.
  • the pPV-EF1a-Luc2 (V323I) -hDMD-Ex45 [-] vector was constructed by inserting it into the NcoI and SalI cleavage sites of the vector by In-Fusion reaction.
  • Luc2-NcoI-IF-Fwd GCCCCCTTCACCATGGAAG (SEQ ID NO: 94) Luc2-V323I-fwd CAGCAAGGAGATAGGTGAGG (SEQ ID NO: 95) Luc2-V323I-rev CCTCACCTATCTCCTTGCTG (SEQ ID NO: 96) Luc2-SalI-IF-Rev TAATGCAAACGTCGACAAATCAAAGAC (SEQ ID NO: 97)
  • DMD-Ex45-SalI-IF-F tctttgatttGTCGACcgtatc (SEQ ID NO: 98)
  • DMD-Ex45-SalI-IF-R taatgcaaacGTCGACgcc (SEQ ID NO: 99)
  • exon 45 and its surrounding introns were amplified using the following primers (HDMD-SR-XkbFrag-fwd & rev), and pPV-EF1a-Luc2 (V323I) -hDMD PPV-EF1a-Luc2 (V323I) -hDMD-Ex45 [+] (1kb), pPV-EF1a-Luc2 (V323I) -hDMD by inserting into the SalI cleavage site of -Ex45 [-] vector by In-Fusion reaction -Ex45 [+] (2 kb), pPV-EF1a-Luc2 (V323I) -hDMD-Ex45 [+] (4 kb) vectors were constructed.
  • HDMD-SR-1kbFrag-fwd tctttgatttGTCGAGGGATATCTTGATGGGATGCTCC (SEQ ID NO: 100)
  • HDMD-SR-1kbFrag-rev taatgcaaacGTCGAAAACCACTAACTAGCCACAAGT (SEQ ID NO: 101)
  • HDMD-SR-2kbFrag-fwd tctttgatttGTCGAATTGTGAGGCACCGTGTCAC (SEQ ID NO: 102)
  • HDMD-SR-2kbFrag-rev taatgcaaacGTCGACTCTTTGGCTCAAGTTCCCCT (SEQ ID NO: 103)
  • HDMD-SR-4kbFrag-fwd tctttgatttGTCGAGCTGCAGCATTAGTTTATAGCA (SEQ ID NO: 104)
  • exon 45 is not recognized during splicing, and the immediately following exon 46 is linked to exon 43 instead, resulting in dystrophin.
  • the reading frame of the protein can be restored.
  • the splice acceptor consists of a branching sequence, a polypyrimidine (C / U) sequence, and an “AG” acceptor sequence.
  • the “AG” acceptor sequence is most highly conserved during the splicing reaction, and exon skipping can be induced if these two bases can be deleted.
  • the splice activation is performed using the Unique k-mer method [Li HL et al., Stem Cell Reports, 2015]. Observation of the sequence specificity near the scepter revealed that the specificity near the splice acceptor was generally particularly low compared to the exon region and other intron regions (FIG. 2).
  • a reporter vector using Firefly luciferase (Luciferase, Luc) gene was constructed.
  • Luc cDNA was divided into two, and a vector (Luc + Int) into which a synthetic intron sequence was inserted, and a vector (Luc + hEx45) into which sequences before and after human dystrophin exon 45 were inserted were prepared (Fig. 3).
  • a vector Luc + Int
  • a vector Luc + hEx45
  • the splicing donor sequence and acceptor sequence are extracted from the entire exon sequence contained in the human dystrophin gene from the Ensemble Biomart database (http://www.ensembl.org), and the common base is weblogo When analyzed with the software (http://weblogo.threeplusone.com/), it was confirmed that it was in good agreement with known splicing donor and acceptor sequences (FIG. 4 (b)). Therefore, it was expected that if the “ G ” in the middle of the pseudo-splicing donor sequence “AG G TA” was converted into a “sequence other than G ”, it would not function as a splicing donor.
  • the splicing pattern was analyzed according to the length of the intron sequence around exon 45.
  • a vector in which the lengths of 1.0-kb, 2.0-kb, and 4.0 kb were inserted was constructed (FIG. 7).
  • FIG. 8 (a) When the splicing patterns of these vectors were analyzed (FIG. 8 (a)), most of the splicing patterns (468 bp band) were almost as expected in any of the vectors, but as the intron size increased, the intron There was a tendency for the remaining band (1166 bp) to disappear.
  • CRISPR types SpCas9, AsCpf1, etc.
  • genome editing methods double-nicking
  • FIG. 12 five types of SpCas9 gRNA sequences were tested, and in FIG. 13, SpCas9, SaCas9, AsCpf1, and SpCas9 double-nicking methods were compared and analyzed.
  • FIG. 14 26 types of gRNAs were designed in order to measure the efficiency of exon skipping with all sequences (sgRNA sequences including NGG PAM sequences) that can be designed for human exon 45 (FIG. 14 (a)).
  • gRNA-DMD6 had a low DNA cleavage activity, but other gRNAs basically showed a cleavage activity of 10% or more. Therefore, the exon skipping efficiency of 26 types of gRNA was measured in 293T cells using Luc2 (G967A) + hEx45 (0.7 kb) reporter. As a result, it was found that the efficiency of exon skipping depends on the gRNA design site and the distance from the splice acceptor or splicing donor (FIG. 14 (c)).

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Abstract

CRISPR-CasおよびガイドRNAを使用したゲノム上の目的遺伝子の標的エクソンをスキップするための方法であって、前記ガイドRNA は、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有することを特徴とする方法。

Description

ゲノム編集によるエクソンスキッピング誘導方法
　本発明は遺伝子組み換え技術に関し、研究分野や医療分野で有用なゲノム編集によるエクソンスキッピング誘導方法に関する。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Duchenne muscular dystrophy、以下DMD)はジストロフィン遺伝子の機能喪失によって、筋繊維が萎縮する疾患である。ジストロフィン遺伝子の骨格筋アイソフォーム(Dp427m)は79個のエクソンで構成されているが、この一部が欠損するなどして遺伝子の読み枠がずれてしまうことでジストロフィンタンパク質が正常に作られなくなることが原因となり、DMDが発症する (非特許文献１)。
　DMDの根治を目指し、機能不全の内在性ジストロフィン遺伝子に代えて、外部から機能性のジストロフィン遺伝子を添加する遺伝子治療法も様々な研究が行われている。ジストロフィンの全長cDNAのサイズは14 kbもあるため、不要なドメイン部分を切り詰めて小型化したミニジストロフィンやマイクロジストロフィンを作製し、様々な遺伝子導入ベクター(AAV, レンチウイルス、Sleeping Beautyトランスポゾンベクター、等)を用いて筋組織への導入が試みられている。しかし、巨大な遺伝子を導入するのは難しく、効果的な治療法の確立には至っていない。
　アンチセンス・オリゴヌクレオチドを使って、mRNAがスプライシングされる際に特定のエクソンを一部読まないようにすることで、正常な機能をもつジストロフィンへと修復する研究(エクソン・スキッピング)が進められているが、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの効果は一時的なものであり、根本的な治療としては遺伝子そのものを修復する方法が求められている。
　遺伝子そのものを修復する手法として近年、TALENやCRISPR-Casシステムというゲノム編集技術が開発されている。これらはゲノム配列の中から特定の配列箇所を認識してDNA二本鎖切断を誘導することにより、非相同組換え(Non-homologous end joining, NHEJ)や相同組換え(Homology directed repair, HDR)を介したDNA修復機構を局所的に誘導することで、その切断箇所に塩基を追加したり削除したりすることができる技術である。
　CRISPR-Casゲノム編集技術は、細菌や古細菌の持つType IIまたはType V CRISPRシステムが広く用いられており、ガイドRNA(gRNAまたはsgRNA)に含まれるスペーサー配列依存的にターゲットDNAに結合し、Casヌクレアーゼ(Type IIの場合はCas9、Type Vの場合はCpf1)の作用によって、二本鎖DNA切断を誘導できる。Type II CRISPRシステムにおいてガイドRNAは、crRNAとtracrRNAの複合体、またはcrRNAとtracrRNAが連結されたsgRNA(single guide RNA)である。
　ゲノム編集技術を利用したジストロフィンのエクソンスキッピングを筋芽細胞[非特許文献２、３]やmdxマウスレベル[非特許文献４～７]で行ったという報告がある。
　これらの研究では二つのガイドRNAを使用してスキッピングするエクソンの両端を切断し、エクソン丸ごと大きな欠損を誘導する方法を取っているが、この方法だとgRNAが二つ必要となる分、非特異的な切断が起こるリスクが増加する。また、どちらか一方のgRNAでの切断だけでは全くエクソンスキッピングを誘導出来ず、二つのgRNA配列が同一ゲノム上で働く必要がある。また、少なくとも数百塩基は削除する必要があり、その領域に未知の制御領域やmiRNAのコード領域が含まれている場合、予期せぬ副作用が発生するリスクもある。
　一方、本発明者らは以前、DMD患者由来iPS細胞において、TALENやCRISPR-Cas9といったゲノム編集技術を用いることによって、(1)エクソンスキッピング、(2)フレームシフト誘導、(3)および欠損エクソンのノックインにより、ジストロフィンの遺伝子変異を修復できることを報告した[非特許文献８]。この中で(1)の方法ではエクソンのスプライスアクセプターを削除する方法を採っており、一つのgRNAで数塩基から数十塩基の欠損を誘導できれば、十分エクソンスキッピングが誘導出来るため、上記の[非特許文献２～７]で報告されている方法より効率が良く、副作用変異リスクが小さく、ごく僅かなDNA塩基削除で済むという３つの点において優れている。
　一方で、スプライスアクセプターはエクソンスキッピングを誘導する上で魅力的なターゲット部位であるが、ポリピリミジン(T/Cの連続)配列を含んでおり、多くのエクソン配列で似た配列を持っていることから、特異性の高いgRNAの設計が困難であるという問題点があった。CRISPR-CasのDNA切断ドメインに変異を導入することにより、DNA二本鎖切断ではなく一本鎖切断を誘導するニッカーゼ改変型のCRISPR-Casを二つ組合せることで特異性を高めたダブルニッキング法[Mali P et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):833-8.][Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9.]が知られている。また、Type V AsCpf1はType II SpCas9と比較して、ヒト細胞中での特異性が高いことが知られており[Kleinstiver BP et al., Nat Biotechnol, 2016 Aug;34(8):869-74.| Kim D et al.,  Nat Biotechnol, 2016 Aug;34(8):863-8.]、ダブルニッキング法またはCpf1を使用してスプライシングアクセプター付近をターゲットすることにより、特異性の問題は回避できると考えた。
　また、ガイドRNAのスペーサー配列やCRISPR-Casの種類によって切断活性や切断長が異なる事が知られており、効率的にエクソンスキッピングを誘導できるガイド配列や設計方法の経験則は未知であった。
Pichavant et al., Mol Ther. 2011 May;19(5):830-40. Ousterout DG et al., Nat Commun. 2015 Feb 18;6:6244 Iyombe-Engembe JP Mol Ther Nucleic Acids. 2016 Jan 26;5:e283. Xu L et al., Mol Ther. 2016 Mar;24(3):564-9. Long C et al., Science, 2016 Jan 22;351(6271):400-3. Nelson CE et al., Science. 2016 Jan 22;351(6271):403-7 Tabebordbar M et al., Science. 2016 Jan 22;351(6271):407-11 Li HL et al., Stem Cell Reports. 2015 Jan 13;4(1):143-54.
　本発明は、効率よくエクソンスキッピングを行うための方法を提供することを課題とする。本発明はまた、エクソンスキッピングの評価を簡便に行うための方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。エクソンスキッピングの標的遺伝子として、コード領域内に第１イントロン、解析対象エクソンおよび第２イントロンを含む配列が挿入されたマーカー遺伝子を用い、エクソンがスキップされたときにマーカー遺伝子が機能するように設計することでマーカー遺伝子の表現型に基づいてエクソンスキッピングが効率よく解析できることを見出した。その結果、CRISPR-CasおよびガイドRNAを使用してゲノム上の目的遺伝子の標的エクソンスキッピングを行う際に、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンのスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位から８０塩基以内に配置されるようにガイドRNAを設定することで、エクソンスキッピングの効率を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］CRISPR-CasおよびガイドRNAを使用したゲノム上の目的遺伝子の標的エクソンをスキップするための方法であって、前記ガイドRNA は、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有することを特徴とする方法。
［２］前記ガイドRNA は２種類以上使用される、［１］に記載の方法。
［３］CRISPR-CasがRuvCドメインのヌクレアーゼ活性残基が置換されたニッカーゼ改変型Casであり、目的遺伝子のセンス鎖に対するガイドRNAおよびアンチセンス鎖に対するガイドRNAを使用し、両ガイドRNAは、目的遺伝子のセンス鎖における切断部位および目的遺伝子のアンチセンス鎖における切断部位がいずれも標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有する、［１］に記載の方法。
［４］CRISPR-CasがCas9である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］Cas9がStreptococcus pyogenes由来、あるいはStaphylococcus aureus由来である、［４］に記載の方法。
［６］CRISPR-CasがCpf1である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［７］Cpf1がAcidaminococcus sp. BV3L6由来、あるいはLachnospiraceae由来である、［６］に記載の方法。
［８］目的遺伝子がヒトジストロフィン遺伝子である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］標的エクソンがエクソン４５である、［８］に記載の方法。
［１０］前記ガイドRNAが配列番号１７～４２のいずれかの塩基配列の塩基番号１７～３６の塩基配列、配列番号４４～４５のいずれかの塩基配列の塩基番号１７～３９の塩基配列、または配列番号５０～５３のいずれかの塩基配列の塩基番号２４～４３の塩基配列からなるスペーサー配列を有する、［９］に記載の方法。
［１１］CRISPR-CasおよびガイドRNAを含む、ゲノム上の目的遺伝子の標的エクソンをスキップするための試薬であって、前記ガイドRNA は、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有することを特徴とする試薬。
［１２］エクソンスキッピングを評価するための方法であって、コード領域内に第１イントロン、解析対象エクソンおよび第２イントロンを含む配列が挿入されたマーカー遺伝子を使用し、解析対象エクソンがスキップされたときにマーカー遺伝子が機能するように設計されていることを特徴とする方法。
［１３］エクソンスキッピングがCRISPR-CasおよびガイドRNAを使用したエクソンスキッピングである、［１２］に記載の方法。
［１４］トランスポゾンベクターを用いることでマーカー遺伝子を解析対象細胞のゲノムに挿入する、［１２］または［１３］に記載の方法。
［１５］マーカー遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、［１２］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］解析対象エクソンがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４５である、［１２］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　本発明の方法によれば、ゲノム編集技術を利用したエクソンスキッピングにおいて、エクソンスキッピングの効率を向上させることができ、疾患の治療などに有効である。また、エクソンスキッピングの標的遺伝子として、コード領域内に第１イントロン、解析対象エクソンおよび第２イントロンを含む配列が挿入されたマーカー遺伝子を用い、エクソンがスキップされたときにマーカー遺伝子が機能するように設計することでマーカー遺伝子の表現型に基づいてエクソンスキッピングが効率よく解析できる。
図１は、ゲノム編集エクソンスキッピング法によるジストロフィンタンパク質の修復原理を示す。 図２は、スプライスアクセプター配列部位の配列特異性が一般的に低く、類似配列がゲノム上の別の場所にも存在することを表しており、特異性の高いCRISPRガイドRNA等をデザインすることは困難であることを示している。10塩基から16塩基の長さを持つ任意のDNA配列のうち、ヒトゲノム配列(hg19)に一箇所のみ存在するユニーク配列(Unique k-mer)データベースを作成し、このユニーク配列の分布を、ヒトRefSeq遺伝子の全エクソンにおける相対位置に応じてプロットした。ヒトのエクソン内部は総じてユニーク配列が多く集積しており特異性が高いが、スプライスアクセプター部分は特異性が大きく下がっていることが確認できる。 図３は、ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピング効率を検出するレポーターベクターの配列の一部を示す。Fireflyルシフェラーゼ遺伝子のcDNAの途中にある、エクソンエクソン接合部として最もよく見られる配列"CAG|G"を探し、ここへジストロフィン遺伝子のエクソン44の直後のスプライシングドナー(SD)付近配列("＋"印)、エクソン45("＞"印)と前後のイントロン配列、エクソン46直前のスプライスアクセプター(SA)配列("＋"印)の順となるよう配列を設計してある。ベクターの構築に用いた制限酵素サイト (NarI, AgeI, SalI)を＃印でマークしてある。 図４では、挿入したジストロフィン配列部位だけでスプライシングが起こるよう、Luc配列に変異を導入して改変した。(a) 図３のエクソンスキッピングベクターを293T細胞に導入してmRNAを抽出し、スプライシングパターンをサンガーシーケンス法で確認したところ、Luc遺伝子の途中 (図３の31番塩基)に偽スプライシングドナー配列があり、予期せぬスプライシングが起こっている(シーケンスエレクトログラムに余分な波形が混入している)ことが判明した。(b) ジストロフィン遺伝子の全エクソン配列をEnsemble BioMartより取得し、WebLogoを用いてスプライシングドナー部分とスプライスアクセプター部分のコンセンサス配列を解析したところ、一般的なヒト遺伝子の塩基配列と同様の傾向がみられ、スプライシングドナーには"GT"配列が、スプライスアクセプター配列には"AG"が最も頻度が高く保存されていることを確認した。(c) (a)の偽スプライシングドナー配列を機能させないようにするために、Luc cDNAの開始塩基から967番目"G"(図３の31番塩基)を"A"に改変した。この際、Lucタンパク質323番目のValアミノ酸は、Ileへと変更になった。 図５では、アミノ酸改変部位がFirefly Luciferaseの活性へ及ぼす影響を予測するために、Firefly Luciferaseタンパク質の結晶構造 (PDBコード: 1BA3)を解析した。323番目のVal残基(四角)は活性中心残基(丸印)[Branchini BR et al., JBC, 1997]から十分離れており直接的な相互作用は無いため、このアミノ酸を改変しても酵素活性への影響は少ないと予想された。またVal残基はαヘリックスの途中に位置していることから、αヘリックス構造を変化させにくく、構造や化学的性質の類似するIle残基へと変更した。 図６では、G967A (V323I)変異がスプライシングおよびLuc活性に及ぼす影響を調査した。(a) 比較解析に利用したLuc発現カセット。全て、piggyBacベクター（System Biosciences） pPV-EF1a-GW-iP-Aに挿入されている。＊がG967A (V323I)変異を示し、点線はイントロン、ボックスはエクソンを表す。(b) 各ベクターを293T細胞に導入し、mRNAを抽出してイントロン部分を含むプライマーでPCRを行うことにより、スプライシングパターンを解析した。Lu2にイントロンを挿入したレーン2では、期待通りのスプライシングが起こっているバンド(377 bp)とは別に、イントロンが残留したままのバンド(468 bp)も観察された。同様の傾向はジストロフィンのエクソン45を挿入したレーン４でも見られ、予想通りのスプライシングが起こった468 bpのバンドの他に、イントロンを含んだ1166 bpのバンドも観察された。Luc2 cDNA中に点変異 (G967A (V323I)変異)を導入したレーン３およびレーン５では、それぞれスプライシングがより効率良く起こっていることが確認できた。(c) Luc2 cDNAにG967A (V323I)変異を導入したことによる、ルシフェラーゼ活性への影響はほとんど見られなかった(2番目と3番目の比較)。一方、ジストロフィンエクソン45を挿入したLuc2ベクターでは、スプライシング効率が良くエクソン45がLuc2に取り込まれるほど、Luc2にフレームシフトが起こりルシフェラーゼ活性は下がる事が期待される。G967A (V323I)変異導入によりルシフェラーゼ活性のバックグラウンドレベルが下がっており、これにより感度良く低頻度のエクソンスキッピングを検出可能となった。 図７では、エクソン４５前後のイントロンの長さがスプライシングに及ぼす影響を調べるため、様々な長さのベクターを構築した。ルシフェラーゼレポーターはpiggyBacベクターに搭載されており、このベクターをpiggyBac転移酵素発現ベクターと共導入することによって、宿主細胞の染色体への安定組込が可能である。また、レポーターベクターが導入された細胞だけをエンリッチできるよう、IRESに続いてPuromycin耐性遺伝子も搭載している。 (a) 図７のエクソンスキッピングベクター(Luc2 G967A)を293T細胞にトランスフェクションし、2日後にmRNAを抽出してPCR解析によりスプライシングパターンを解析した。エクソン45の前後のイントロン長(0.7～4.0 kb)は、長いほどスプライシングされていないバンド(1166 bp)が減少する傾向が見られたが、いずれにおいても効率的なスプライシングバンド(468 bp)が観察された。また、gRNA1とSpCas9発現プラスミドも共導入することにより、エクソンスキッピングを誘導した(Exon skipping "+")。その結果、何れのイントロン長レポーターにおいても、スキッピングが誘導されたバンド(377 bp)が観察された。(b) ルシフェラーゼアッセイにより、エクソンスキッピングの誘導効率を測定した。G967A点変異を導入していないレポーターベクター(Luc2 +hEx45(0.7 kb))では、エクソンスキップを誘導しない時のバックグラウンドレベルが高く、誘導前後で差が見られないが、G967A変異を導入したエクソンスキッピングベクターでは、SpCas9とsgRNA-DMD1を発現するベクターを導入することでエクソンスキッピングが誘導され、ルシフェラーゼ活性の上昇を確認できた。 図９は、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソン４５のスプライスアクセプター部位に対するCRISPR SpCas9 gRNAのターゲット配列を示す。 図１０は、SSAアッセイにより測定した、ヒト293T細胞中でのCRISPR-SpCas9およびCRISPR-SpCas9(D10A)を用いた際のターゲットDNA切断活性を示す。CRISPR-SpCas9の場合、ガイドRNA１から５いずれにおいても切断活性が見られる。一方、ニッカーゼ改変型SpCas9(D10A)を用いた場合、単独のガイドRNAだけでは切断活性は期待通り観察されない。センス鎖に対するガイドRNA５およびアンチセンス鎖に対するガイドRNA４を組み合わせて使用した場合において、高いDNA切断活性が確認できた。 図１１は、切断配列解析による切断パターンを示す。DMD-iPS細胞へCRISPR-Cas9および当該ガイドRNAを発現するプラスミドDNAをエレクトロポレーションにて導入し、ゲノムDNAを抽出後、MiSeqシーケンサーを用いてゲノムDNA切断パターンを解析した。塩基が欠損している位置を積み上げ折れ線グラフとして表している。 図１２では、エクソンスキッピングレポーターとしてLuc2 (G967A) +hEx45 (0.7 kb)を利用して、293T細胞にてsgRNA-DMD1～5のエクソンスキッピング効率を測定した。その結果、gRNA無しのサンプルと比較して、sgRNA-DMD1, sgRNA-DMD4, sgRNA-DMD2でP < 0.01の有意差でルシフェラーゼ活性が上昇した。 (a) ジストロフィンエクソン45のスプライスアクセプター付近にデザインした各種CRISPR-Cas(SpCas9, SaCas9, AsCpf1)由来のgRNAのターゲット配列。PAM配列は下線で示す。(b)AsCpf1のgRNA発現カセットのイメージ図。H1プロモーターの転写開始点(TSS)にはG(またはA)が望ましい事が知られているが、Gを１塩基から３塩基に増やす事で、gRNAの発現量が増強されターゲットDNA切断効率が上昇することが期待された。(c)AsCpf1およびgRNAを293T細胞へ導入し、SSAアッセイによりターゲットDNAの切断活性を測定した。まず、転写開始点(TSS)のGを１塩基から３塩基に増やす事で切断活性の上昇が見られた。また、TTTTをPAM配列とするAsCpf1-gRNA-DMD1とAsCpf1-gRNA-DMD2は切断活性がとても低いが、TTTG(TTTV)をPAMとするAsCpf1-gRNA-DMD3とAsCpf1-gRNA-DMD4は、SpCas9-gRNA-DMD1と同等以上の切断活性を示した。(d) エクソンスキッピングレポーターとしてLuc2 (G967A) +hEx45 (0.7 kb)を利用して、293T細胞にてDouble nicking法、SaCas9/gRNA、およびAsCpf1/gRNAを用いた場合のエクソンスキッピング効率を測定した。その結果、SpCas9/ sgRNA-DMD1と比較して、SpCas9(D10A) double nicking法によりsgRNA-DMD4とsgRNA-DMD5をペアで使用した場合においてエクソンスキッピング活性が高かった。さらに、AsCpf1のsgRNA-DMD 3とsgRNA-DMD 4を使用することでも、高いエクソンスキッピング効率を誘導することができた。 (a) ジストロフィンエクソン45上にデザイン可能なSpCas9-gRNAのターゲット部位に、26種類のgRNAを作製した。 (b) (a)で用いたsgRNA-DMD1～26のターゲット配列およびスペーサー配列の一覧表。293T細胞にSpCas9発現ベクターとLuc2 (G967A) +hEx45 (0.7 kb)エクソンスキッピングレポーターベクターと共に各gRNAを導入し、下記のプライマー (Luc2-Fwd-Splice: TGCCCACACTATTTAGCTTC（配列番号１）, Luc2-Rev-Splice:GTCGATGAGAGCGTTTGTAG) （配列番号２）を用いてT7E1アッセイを行い、各gRNAのレポーターベクター上のターゲット部位のDNA切断活性を測定した(T7E1 Indel activity [%])。また、エクソンスキッピング効率についても測定を行った(Exon skipping Luc activity [A.U.])。 (c) エクソンスキッピングレポーターとしてLuc2 (G967A) +hEx45 (0.7 kb)を利用して、293T細胞にてsgRNA-DMD1～26のエクソンスキッピング効率を測定した。その結果、エクソン45のスプライスアクセプター付近をターゲットにするgRNA、およびスプライシングドナー付近をターゲットにするgRNAでエクソンスキッピング効率が高いことが判明した。 図１５では、図１４で使用した２種類のsgRNAの組合せについて、図１４と同様にしてSpCas9によるエクソンスキッピングの効率を評価した結果を示す。
　本発明の方法は、CRISPR-CasおよびガイドRNAを使用したゲノム上の目的遺伝子の標的エクソンをスキップするための方法であって、ガイドRNA が、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有することを特徴とする。
＜CRISPR-Casシステム＞
　CRISPRシステムとしては、複数因子が複合体を形成して働くClass 1と、単一因子でも働くClass 2が知られており、Class1にはType I, Type III, Type IVが含まれ、Class 2にはType II, Type V, Type VIが含まれる(Makarova KS et al., Nat Rev Microbiol. 2015 | Mohanraju P et al., Science, 2016)。現在、哺乳類細胞におけるゲノム編集用途では、単一因子で作用するClass 2のCRISPR-Casが主に使われており、Type II Cas9やType V Cpf1が代表例である。
　CRISPR-Cas9システムとしては、広くゲノム編集ツールとして使用されている化膿性レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)由来のClass 2 Type II Cas9が使用できるが、他の細菌由来のClass 2 Type II Cas9も報告されており、例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus, Sa)由来Cas9や、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis, Nm)由来Cas9、サーモフィラス菌(Streptococcus thermophilus, St)由来Cas9等も使用することができる。
［I］
An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.
Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Terns RM, Terns MP, White MF, Yakunin AF, Garrett RA, van der Oost J, Backofen R, Koonin EV.
Nat Rev Microbiol. 2015 Nov;13(11):722-36. doi: 10.1038/nrmicro3569.
［II］
Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.
Mohanraju P, Makarova KS, Zetsche B, Zhang F, Koonin EV, van der Oost J.Science. 2016 Aug 5;353(6299):aad5147. doi: 10.1126/science.aad5147
［III］
In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 2015 Apr 9;520(7546):186-91.
［IV］
Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21.
［V］
Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9.
［VI］
Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 systems enable specific editing of the human genome. Mol Ther. 2016 Mar;24(3):636-44.
　また、Class 2 Type VのCRISPR-CasシステムとしてCpf1が同定されており、アシダミノコッカス (Acidaminococcus sp., As)由来Cpf1やLachnospiraceae由来Cpf1を用いることで、gRNA配列依存的にヒト細胞でゲノム編集が可能であることが報告されている。したがって、これらのCRISPR-Cpf1を使用することもできる。
［V］
Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71
［VI］
Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat Biotechnol. 2017 Jan;35(1):31-34.
　CRISPR-Cas9はRuvCドメインとHNHドメインの二つのヌクレアーゼドメインを持ち、それぞれのドメインが二本鎖DNAの各鎖の切断を担っている。また、CRISPR-Cpf1はRuvCドメインとNucドメインを持つ。そして、Streptococcus pyogenes由来Cas9においてRuvCドメインの10番目のAspをAlaに置換(D10A)すると、gRNAが結合しないDNA鎖が切断されなくなり、HNHドメインの840番目のHisをAlaに置換(H840A)すると、gRNAが結合するDNA鎖が切断されなくなる[Jinek M et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.]。この特性を利用して、二本鎖DNAの一本鎖しか切断しないNickaseを二つ近接した状態で、各々別々のDNA鎖を切断することによって、目的の領域に二本鎖DNA切断を誘導するDouble nicking(またはpaired nickases)法が開発された[Mali P et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):833-8.][Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9.]。これにより、ターゲット部位以外の所へ配列変異を誘導するリスクを低下させつつ、任意の配列をノックインにて挿入するターゲティング等のゲノム編集を行うことが可能となった[WO 2014204725 A1]。
　したがって、本発明の方法においては、D10A Cas9 NickaseをCRISPR-Cas9として使用し、センス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ切断するための2種類のガイドRNAを使用することもできる（Double nicking法）。Streptococcus pyogenes由来Cas9以外でもRuvCドメインの活性アミノ酸残基に変異を導入することでDouble nicking法に使用できるNickase型Cas9やNickase型Cpf1を得ることができる。
　上記のようなCRISPR-Cas をコードするDNAは、GenBank等に登録されているCRISPR-Casをコードする配列に基づいてクローニングすることにより入手可能である。また、市販のCRISPR-Casを含むプラスミドをAddgene等から入手して使用してもよいし、当該プラスミドを鋳型としたPCRによりCRISPR-CasをコードするDNAを得てもよいし、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。Cas NickaseをコードするDNAは、公知の分子生物学的手法によりCRISPR-Casのヌクレアーゼドメインの活性アミノ酸残基へ変異を導入することによって入手することができるし、あらかじめ変異が導入されたCRISPR-Cas遺伝子を含むプラスミド等からクローニングして用いてもよい。また、CRISPR-Casは宿主における発現効率を向上させるためにコドン改変されてもよい。
　CRISPR-CasはmRNAやタンパク質、あるいはDNAとして細胞に導入されてもよい。ガイドRNAはRNAあるいはDNAとして細胞に導入されても良い。ベクターを用いて導入する場合に使用されるベクターとしては、真核生物細胞において複製可能なベクター、ならびにエピソームを維持するベクターあるいは宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターが挙げられるが、ウイルスベクターとして例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられる。また、トランスポゾンベクターとしては、piggyBacベクター、piggyBatベクター、Sleeping Beautyベクター、TolIIベクター、LINEベクター等が挙げられる。治療においては、恒常的に発現するベクターでの導入は副作用リスクが高まるため好ましくなく、投与直後にDNA切断が誘導されればよいため、Cas9 ｍRNA／ｇRNAやCas9タンパク質／ｇRNAとしての導入、エピソーマルベクターとしての導入等が好ましい。
　ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。「選択マーカー」とは、選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝エレメントをいい、一般には、遺伝子産物が細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を殺傷する薬剤に対する耐性を与える遺伝子である。具体的には、例えば、Ｐｕｒｏ耐性遺伝子、Ｎｅｏ耐性遺伝子、Ｈｙｇ耐性遺伝子、Ｂｌｓ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子およびＢｌｅ遺伝子が挙げられる。選択マーカーの存在を選択するために有用な薬物としては、例えば、Ｐｕｒｏ耐性遺伝子に対してはピューロマイシン、Ｎｅｏ耐性遺伝子に対してはＧ４１８、Ｈｙｇ耐性遺伝子に対してはハイグロマイシン、Ｂｌｓ遺伝子に対してはブラスチサイジン、ｈｉｓＤに対してはヒスチジノール、Ｇｐｔに対してはキサンチン、そしてＢｌｅに対してはブレオマイシンが挙げられる。
＜ガイドRNA＞
　ガイドRNA（ｇRNAまたはsgRNA）は、CRISPR-Cas9法におけるtracrRNAとcrRNAの複合体、またはtracrRNAとcrRNAを人工的に連結させたものである。[Jinek M et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.]本発明においては、標的遺伝子に対応する配列を有するスペーサー配列とスキャッフォールド配列を連結させたものを意味する。
　SpCas9のガイドRNAのスキャッフォールド配列は、公知の配列、例えば、5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’(配列番号３)の配列を使用することが可能である。または、改変されたスキャッフォールド配列 (Chen B et al., Cell, 2013 Dec 19;155(7):1479-91) 5'-GTTTTAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT-3'(配列番号４)でもよい。
　なお、ガイドRNAは、CRISPR-Cpf1においてtracrRNAは必要としない。
　AsCpf1のガイドRNAのスキャッフォールド配列は、公知の配列、例えば、5'-GTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'(配列番号５)または5'-GGGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'(配列番号６)の配列を使用することが可能である。たとえば、当業者に公知の人工遺伝子合成技術を用いて、当該DNAを人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。
　本発明の方法においては、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内、好ましくは５０塩基以内、より好ましくは３０塩基以内に配置されるようにガイドRNAのスペーサー配列を設定する。また、Exonic Splicing Enhancer (ESE)配列部分へ設計しても良い。
　このように設定することで、標的エクソンのスプライスアクセプター部位またはドナー部位の近傍で切断が起こり、その修復過程でスプライスアクセプター部位またはドナー部位が破壊され、Pre-mRNAがｍRNAへと成熟する過程でスプライシング反応が起こる際に標的エクソンのスキッピングが起こる。
　スプライスアクセプター部位は、標的エクソン直前の２塩基と定義され、例えば、AG配列である。
　スプライスドナー部位は、標的エクソン直後の２塩基と定義され、例えば、GT配列である。
　Exonic Splicing Enhancer (ESE)配列は標的エクソン中に存在するSRタンパク質(SRSF1～12遺伝子)の結合部位として定義される。SRタンパク質の結合部位はデータベースでのサーチが可能であり、そのようなデータベースとして例えばRESCUE-ESE [Fairbrother WG et al., Science, 2002]、ESEfinder [Cartegni L. et al., NAR, 2003]などがある。
　Type II Cas9のスペーサー配列は標的遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列において、PAM配列（例えば、S. pyogenes Cas9の場合はNGG、Staphylococcus aureus Cas9の場合はNNGRRT）の直前の塩基を３’末端とする１５～３０塩基の連続する塩基配列を有するRNAとして設計することができる(例えばNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG（配列番号７）)。(Nはスペーサー配列)
　ただし、配列が１００％一致していなくとも切断は起こりうるため、１～２塩基のミスマッチがあってもよい（特に５’側）。なお、ヒトH1 PolIIIプロモータからの転写開始点とするにはスペーサー配列の５’末端の塩基はCまたはTでないことが好ましく、もし、ゲノム上の相当する塩基がCまたはTの場合はGに変換することが好ましい。
　Type V Cfp1のガイドRNAの場合はPAM配列(例えばAcidaminococcus sp. Cpf1の場合、TTTV）の直後の塩基を５’末端とする１５～３０塩基の連続する塩基配列を有するRNAとして設計することができる(例えばTTTTVNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN（配列番号８）)。Cpf1の場合、tracrRNAは必要としない。
　S. pyogenes Cas9によるDNA切断部位は、スペーサー配列の３’末端の塩基を１として３’→５’の方向に数えると該塩基から３番目の塩基と４番目の塩基の間で切れるので、「切断部位が標的エクソンのアクセプター部位またはドナー部位から８０塩基以内に配置される」とは、アクセプター部位またはドナー部位の塩基（例えば、GTまたはAG（アンチセンス鎖の場合はACまたはCT））とスペーサー配列の３’末端の塩基に相当する塩基から３’→５’の方向に数えて４番目の塩基の間に存在する塩基数が８０塩基以内であることを意味する。
　AsCpf1によるDNA切断部位は、スペーサー配列の５’末端の塩基を１として５’→３’の方向に数えると該塩基から１９番目のセンス鎖塩基と２３番目のアンチセンス鎖塩基が切断される。
　図３で説明する。
　ヒトジストロフィン（hDMD）遺伝子のエクソン４５を標的とし、エクソン４５の直前のアクセプター部位を破壊し、エクソン４５のスキッピングを行う。
　この際、Sp-sgRNA-DMD1では、PAM配列（AGG）の直前の20塩基（tggtatcttacagGAAC/TCC）（配列番号９）に相当するスペーサー配列が設計される。この場合はアクセプター配列（ag）と切断部位（C/T）の間には４塩基が存在している。
　同様に、Sp-sgRNA-DMD2では、PAM配列（TGG）の直前の20塩基（atcttacagGAACTCCA/GGA）（配列番号１０）に相当するスペーサー配列が設計される。この場合はアクセプター配列（ag）と切断部位（A/G）の間には８塩基が存在している。
　同様に、Sp-sgRNA-DMD3では、PAM配列（TGG）の直前の20塩基（cagGAACTCCAGGATGG/CAT）（配列番号１１）に相当するスペーサー配列が設計される。この場合はアクセプター配列（ag）と切断部位（G/C）の間には１４塩基が存在している。
　同様に、Sp-sgRNA-DMD4では、PAM配列（CGG）の直前の20塩基（TCCAGGATGGCATTGGG/CAG）（配列番号１２）に相当するスペーサー配列が設計される。この場合はアクセプター配列（ag）と切断部位（G/C）の間には２１塩基が存在している。
　Sp-sgRNA-DMD5は、アンチセンス鎖に設定されており、PAM配列（AGG）の直前の20塩基（GTTCctgtaagatacca/aaa）（配列番号１３）に相当するスペーサー配列が設計される。
この場合はアクセプター配列（ct）と切断部位（a/a）の間には１１塩基が存在している。
　なお、各配列番号においてRNA配列を意味する場合はTをUに読み替えるものとする。
　上記のようなスペーサー配列にスキャッフォールド配列を付加することでガイドRNAを得ることができる。スキャッフォールド配列を内包し、任意のスペーサー配列に対応するDNA配列を挿入することにより所望のガイドRNAを発現させることができるプラスミドが市販されている（Addgeneプラスミド41824等）ので、それを使用してガイドRNAを細胞に導入することが簡便である。
　なお、ガイドRNAは２種類以上使用してもよい。その場合、１つの破壊対象部位（標的エクソン）に対し、「CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内」という条件を満たす２種類以上のガイドRNAを使用することができる。同じ破壊対象部位に対して２種またはそれ以上の異なるガイドRNAを使用し、同時に２ヶ所以上でＤＮＡ二本鎖の切断を起こす場合、非常に高い効率でエクソンスキッピングを引き起こすことができる。なお、２種類以上のガイドRNAはセンス鎖とアンチセンス鎖の一方に設定されてもよいし、両方に設定されてもよい。
　また、D10A Cas9 Nickaseを使用し、センス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ切断するための2種類のガイドRNAを使用する場合は、２種類のガイドRNAのうち少なくともどちらかの切断部位が標的エクソンの前後のアクセプター部位またはドナー部位から８０塩基以内という要件を満たすように設計する。その場合、センス鎖のガイドＲＮＡ結合部位(スペーサー配列)とアンチセンス鎖のガイドＲＮＡ結合部位(スペーサー配列)の間の距離は－１０～２００塩基であることが好ましく、より好ましくは０～１００塩基であり、センス鎖の切断部位とアンチセンス鎖の切断部位の間にアクセプター部位またはドナー部位が配置されることが好ましい。また、センス鎖を切断するためのガイドRNAのスペーサー配列とアンチセンス鎖を切断するためのガイドRNAのスペーサー配列は互いに重なっていても良いが、重ならないことが好ましい。
　標的エクソンを有する標的遺伝子は特に制限されないが、哺乳類の遺伝子であることが好ましく、ヒト遺伝子であることがより好ましく、例えば、疾患に関連する遺伝子が挙げられる。
　その一例として、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因遺伝子であるジストロフィン遺伝子が挙げられ、エクソン４５をスキップすることで変異型遺伝子の表現型をマスクすることができることが知られているので、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４５がエクソンスキップの対象としては好適に使用できる。
　なお、人工的に合成したエクソン及びイントロンを含む遺伝子を標的遺伝子としてもよい。
　本発明の方法において使用しうるガイドRNAに含まれるスペーサー配列の具体的配列としては、配列番号１７～４２のいずれかの塩基配列の塩基番号１７～３６の塩基配列、配列番号４４～４５のいずれかの塩基配列の塩基番号１７～３９の塩基配列、または配列番号５０～５３のいずれかの塩基配列の塩基番号２４～４３の塩基配列が例示される。なお、これらの相補配列でもよい。
　この中で、２種類のガイドRNA を組み合わせて使用するときに好ましいスペーサー配列の組み合わせとしては、例えば、sgRNA-DMD1（配列番号１７の塩基番号１７～３６の塩基配列）、sgRNA-DMD2（配列番号１８の塩基番号１７～３６の塩基配列）、sgRNA-DMD4（配列番号２０の塩基番号１７～３６の塩基配列）、sgRNA-DMD8（配列番号２４の塩基番号１７～３６の塩基配列）またはsgRNA-DMD9（配列番号２５の塩基番号１７～３６の塩基配列）と、sgRNA-DMD23（配列番号３９の塩基番号１７～３６の塩基配列）の組み合わせである。
　また、この中で、Double nicking法に使用するときに好ましいスペーサー配列の組み合わせとしては、例えば、sgRNA-DMD4（配列番号２０の塩基番号１７～３６の塩基配列）とsgRNA-DMD5（配列番号２１の塩基番号１７～３６の塩基配列）である。
　細胞へのDNA、RNAまたはこれらを発現するベクターのトランスフェクションは、公知の任意の手段を使用することにより可能であり、市販のトランスフェクション用試薬を使用してもよい。たとえば、Lipofectamine2000（Thermo Fisher）、StemFect（STEMGEN）、FuGENE 6/HD（プロメガ）、jetPRIME Kit（ポリプラストランスフェクション）、DreamFect（オズバイオサイエンス）、GenePorter3000（オズバイオサイエンス）、Calcium Phosphate Transfection Kit（オズバイオサイエンス）等を使用可能である。また、エレクトロポレーションでも良く、例えばNEPA21(ネッパジーン)、4D-Nucleofector(ロンザ)、Neon (Thermo Fisher)、Gene Pulser Xcell(バイオラッド)、ECM839(BTX Harvard Apparatus)等が使用可能である。細胞へのトランスフェクションは、CRISPR-Casタンパク質とgRNAとで予め複合体を形成させ、当該複合体を細胞にトランスフェクションしてもよい。また受精卵にマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによりDNA、RNAを導入することも可能である。
　細胞としては哺乳動物細胞が好ましく、ヒト細胞がより好ましい。細胞は株化細胞や哺乳動物組織から単離された初代培養細胞でもよいが、間葉系細胞や人工多能性幹(iPS)細胞などの多能性幹細胞でもよい。例えば、ジストロフィン遺伝子を標的とする場合、DMD患者由来の骨格筋細胞、間葉系細胞、またはiPS細胞を樹立し、そこへ当該発明のエクソンスキッピングを誘導するガイドRNAとCRISPR-Cas、またはガイドRNAペアとCas Nickaseを共導入することによりジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを誘導し、ジストロフィンタンパク質を回復させることができる。そして、このような修復細胞またはその誘導産物を患者に移植することで、萎縮した筋細胞の補充を行うことができる。
　また、DMD患者の筋組織に、当該発明のエクソンスキッピングを誘導するガイドRNAとCRISPR-Cas、またはガイドRNAペアとCas Nickaseを共導入することにより、ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを誘導し、患者の体内でジストロフィンタンパク質を回復させる態様も挙げられる。
＜エクソンスキッピングの評価方法＞
　本発明はまた、CRISPR-CasおよびガイドRNA等を使用したエクソンスキッピングを評価するための方法であって、コード領域内に第１イントロン、解析対象エクソンおよび第２イントロンを含む配列が挿入されたマーカー遺伝子を使用し、（解析対象エクソン近傍に設定されたガイドRNAとCRISPR-Casの作用により）解析対象エクソンがスキップされたときにマーカー遺伝子が機能するように設計されていることを特徴とする方法を提供する。
　なお、エクソンスキッピングはアンチセンス核酸等でも誘導可能であり、評価対象はゲノム編集に限定されない。
　マーカー遺伝子としては、ルシフェラーゼやLacZ等の酵素を含む遺伝子や、GFP、Ds-RedおよびmCherry等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子や、Ｐｕｒｏ耐性遺伝子、Ｎｅｏ耐性遺伝子、Ｈｙｇ耐性遺伝子、Ｂｌｓ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子およびＢｌｅ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が例示されるが、これらに限定されない。なお、マーカー遺伝子cDNA内にスプライシングドナーやアクセプター配列と同一又は類似配列が存在するときは、当該部位を改変してマーカー内でのスプライシングが起こらないようにしておくことが、挿入配列におけるスプライシングを特異的に評価する目的から好ましい。
　第１イントロン（ドナー部位およびアクセプター部位を含む）、解析対象エクソンおよび第２イントロン（ドナー部位およびアクセプター部位を含む）を含む配列のマーカー遺伝子への挿入位置は、エクソンが挿入されることによりマーカー遺伝子が機能しなくなる（マーカータンパク質の活性またはマーカー遺伝子に基づく表現型が消失する）ような位置である。エクソン挿入によりマーカー遺伝子が機能しなくなることは事前に調べておけばよい。また、挿入部位の配列として、CAG@GまたはAAG@Gという配列の"@"の部分を選択すれば、第１イントロンのスプライスドナー配列および第２イントロンのスプライスアクセプター配列が、ヒトスプライスアクセプター(MAG|GURAG)およびヒトスプライスアクセプター配列(NCAG|G)のコンセンサス(最頻度)配列となることから、より好ましい。
　本発明の方法において、スプライシングが正常に起こる場合は、マーカー遺伝子はエクソンが挿入された融合タンパク質（元の活性は失っている）として発現される、またはエクソンの挿入により正常に発現しないので、マーカー遺伝子は機能しない。
　一方、ゲノム編集によりエクソンがスキップされると、マーカー遺伝子は正常型として発現し、マーカータンパク質の活性またはマーカー遺伝子に基づく表現型が観察される。
　したがって、マーカー遺伝子の機能の有無によってエクソンがスキップされたかを解析できる。これにより、エクソンスキッピングの簡便な評価ができ、エクソンスキップを促進する化合物のスクリーニングなどにも有用である。
　改変マーカー遺伝子が導入された細胞において、挿入配列に応じたガイドRNAをCRISPR-Casとともに導入し、当該細胞のマーカー遺伝子に対応する表現型を解析することで、エクソンスキッピングが起こっているかを調べることができる。なお、改変マーカー遺伝子の染色体上への組み込みはトランスポゾンベクターまたはウイルスベクターを用いて行うことが好ましい。トランスポゾンベクターとしてはpiggyBacベクター、piggyBatベクター、Sleeping Beautyベクター、TolIIベクター、LINEベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられる。
　エクソンの種類は特に限定されず、例えば、上述のようなジストロフィン遺伝子のエクソン45などが挙げられる。
　以下、実施例を挙げて発明を具体的に説明するが本発明は以下の態様には限定されない。
＜方法＞
<Unique k-merデータベース>図２関連
　Perlスクリプトを用いて、10～16-mer (k-mer)の全組合せ塩基配列を生成した。Bowtieプログラム(Langmead et al., 2009)を用いて生成したk-mer配列を、ミスマッチを許容せずにヒトゲノムhg19へとマッピングした。次に、ヒトゲノムhg19に一回のみマッピングされたk-mer配列のみを抽出して、Unique k-merデータベースを構築した(Li HL et al., Stem Cell Reports, 2015)。R言語で動作するngs.plot.rプログラム(Shen L et al., BMC Genomics, 2014)を用いて、ヒト全エクソンの前後200bpにおけるUnique k-merの分布を調べ、プロットを行った。
<SpCas9 cDNA発現ベクター構築>
　DNA合成(GenScript社)により、C末端にSV40 large T抗原由来核移行シグナルペプチド(PKKKRKV)（配列番号２１７）を持ち、ヒトコドン頻度に最適化したStreptococcus pyogenes由来Cas9 cDNAを挿入したpUC57-SphcCas9ベクターを作製した。これをSalI-XbaI制限酵素で切断し、pENTR2B (A10463, Thermo Fisher)のSalI-XbaIサイトへライゲーションすることで、pENTR-SphcCas9ベクターを構築した。次に、pENTR-SphcCas9ベクターのSphcCas9 cDNA部分をGateway LRクロナーゼ反応によりpHL-EF1α-GW-iC-Aベクター、pHL-EF1α-GW-iP-Aベクター、またはpHL-EF1α-GW-Aベクターへ挿入し、pHL-EF1α-SphcCas9-iC-Aベクター(SpCas9-IRES-mCheery-polyA)、pHL-EF1α-SphcCas9-iP-Aベクター(SpCas9-IRES-PuroR-polyA)(Addgene, 60599)、およびpHL-EF1α-SphcCas9-Aベクター(SpCas9-polyA)を構築した。EF1αプロモーターは、ウイルス由来プロモーター(CMVプロモーター等)よりも多能性幹細胞での発現量が高く得られるため適している。
　また、SpCas9のD10A変異体（ニッカーゼ）を作製するために、GaCコドン(Asp, D)をGcCコドン(Ala, A)に変換したDNA配列SphcCas9-D10A(NcoI-SbfI)をgBlock(IDT)で合成した。
SphcCas9-D10A(NcoI-SbfI)配列をNcoI-SbfI制限酵素で切断し、pENTR-SphcCas9ベクターのNcoI-SbfIサイトにIn-Fusion反応を用いて挿入することで、pENTR-SphcCas9-D10Aベクターを構築した。次に、pENTR-SphcCas9-D10AベクターのSphcCas9-D10A cDNA部分をGateway LRクロナーゼ反応によりpHL-EF1α-GW-iC-Aベクター、またはpHL-EF1α-GW-iP-Aベクターへ挿入し、pHL-EF1α-SphcCas9-D10A-iC-Aベクター(SpCas9-IRES-mCheery-polyA)、およびpHL-EF1α-SphcCas9-D10A-iP-Aベクター(SpCas9-IRES-PuroR-polyA)を構築した。
SphcCas9-D10A(NcoI-SbfI)
5'-ATTCAGTCGACCATGGATAAGAAATACAGCATTGGACTGGcCATTGGGACAAACTCCGTGGGATGGGCCGTGATTACAGACGAATACAAAGTGCCTTCAAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTGATTGGAGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACAGCTGAAGCAACTCGGCTGAAAAGAACTGCTCGGAGAAGGTATACCCGCCGAAAGAATAGGATCTGCTACCTGCAGGAGATTTTCAGCAA-3'（配列番号１４）
<SpCas9 gRNA発現ベクター構築>
　SpCas9のgRNAを発現ベクターへクローニングするために、下記の任意のSp-sgRNA-XXX-fwdプライマー(配列番号１７～４２のいずれか)と、Sp-sgRNA-Universal-revプライマーを10 pmolずつ混合し、KOD Plus Neo DNAポリメラーゼ(Toyobo)を用いてサーマルサイクリング反応を行う(98℃: 2 min熱変性を行った後、{94℃: 10 sec, 55℃: 10 sec, 68℃: 10 sec}×35サイクル, その後、4℃で保温)。PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、135bp付近のサイズのDNAバンドを切り出し精製する。この精製PCR産物をBamHI-EcoRIで切断したpHL-H1-ccdB-mEF1a-RiHベクター(Addgene 60601)にIn-Fusion反応(Takara-Clontech)を用いて挿入し、任意のgRNAを発現するpHL-H1-[SpCas9-gRNA]-mEF1a-RiHベクターを構築する。
PCR産物配列 (135 bp)
GAGACCACTTGGATCCRNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCAAACCCGGGC（配列番号１５）
Sp-sgRNA-XXX-fwd
GAGACCACTTGGATCCRNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号１６）
Sp-sgRNA-DMD1-fwd
GAGACCACTTGGATCCGggtatcttacaggaactccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号１７）
Sp-sgRNA-DMD2-fwd
GAGACCACTTGGATCCGtcttacaggaactccaggaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号１８）
Sp-sgRNA-DMD3-fwd
GAGACCACTTGGATCCGaggaactccaggatggcatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号１９）
Sp-sgRNA-DMD4-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCCAGGATGGCATTGGGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２０）
Sp-sgRNA-DMD5-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTTCCTGTAAGATACCAAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２１）
Sp-sgRNA-DMD6-fwd
GAGACCACTTGGATCCGcaTTTTTGTTTTGCCTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２２）
Sp-sgRNA-DMD7-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTGCCTTTTTGGTATCTTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２３）
Sp-sgRNA-DMD8-fwd
GAGACCACTTGGATCCAGGAACTCCAGGATGGCATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２４）
Sp-sgRNA-DMD9-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCCGCTGCCCAATGCCATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２５）
Sp-sgRNA-DMD10-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTCAGAACATTGAATGCAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２６）
Sp-sgRNA-DMD11-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCAGAACATTGAATGCAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２７）
Sp-sgRNA-DMD12-fwd
GAGACCACTTGGATCCGAGAACATTGAATGCAACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２８）
Sp-sgRNA-DMD13-fwd
GAGACCACTTGGATCCAATACTGGCATCTGTTTTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号２９）
Sp-sgRNA-DMD14-fwd
GAGACCACTTGGATCCAACAGATGCCAGTATTCTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３０）
Sp-sgRNA-DMD15-fwd
GAGACCACTTGGATCCGAATTTTTCCTGTAGAATACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３１）
Sp-sgRNA-DMD16-fwd
GAGACCACTTGGATCCGAGTATTCTACAGGAAAAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３２）
Sp-sgRNA-DMD17-fwd
GAGACCACTTGGATCCAGTATTCTACAGGAAAAATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３３）
Sp-sgRNA-DMD18-fwd
GAGACCACTTGGATCCAATTGGGAAGCCTGAATCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３４）
Sp-sgRNA-DMD19-fwd
GAGACCACTTGGATCCGGGGAAGCCTGAATCTGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３５）
Sp-sgRNA-DMD20-fwd
GAGACCACTTGGATCCAAGCCTGAATCTGCGGTGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３６）
Sp-sgRNA-DMD21-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCTGAATCTGCGGTGGCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３７）
Sp-sgRNA-DMD22-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCTCCTGCCACCGCAGATTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３８）
Sp-sgRNA-DMD23-fwd
GAGACCACTTGGATCCAGCTGTCAGACAGAAAAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号３９）
Sp-sgRNA-DMD24-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTCAGACAGAAAAAAGAGGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号４０）
Sp-sgRNA-DMD25-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCAGACAGAAAAAAGAGGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号４１）
Sp-sgRNA-DMD26-fwd
GAGACCACTTGGATCCGGTAGGGCGACAGATCTAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA（配列番号４２）
Sp-sgRNA-Universal-rev
GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAA（配列番号４３）
<SaCas9 cDNA発現ベクター構築> 図１３関連
　DNA合成(GenScript)により、Ｎ末端にSV40 large T NLSを、Ｃ末端にNucleoplasmin NLSと３×HAタグを持つ、ヒトコドン頻度に最適化したStaphylococcus aureus由来Cas9 cDNAをGateway attL1サイトとattL2サイトの間に挿入したpUC-Kan-SahcCas9ベクターを作製した。次に、pUC-Kan-SahcCas9ベクターのSaCas9 cDNA部分をGateway LRクロナーゼ反応によりpHL-EF1α-GW-AまたはpHL-EF1α-GW-iP-Aベクターへ挿入し、HL-EF1α-SaCas9-AおよびHL-EF1α-SaCas9-iC-Aベクターをそれぞれ構築した。
<SaCas9 gRNA発現ベクター構築>
　SaCas9のgRNAを発現ベクターへクローニングするために、下記の任意のsgRNA-DMD-SA-X-fwdプライマー(配列番号４４～４５のいずれか)と、SA1-gRNA-Universal-Revプライマーを10 pmolずつ混合し、KOD Plus Neo DNAポリメラーゼ(Toyobo)を用いてサーマルサイクリング反応を行う(98℃: 2 min熱変性を行った後、{94℃: 10 sec, 55℃: 10 sec, 68℃: 10 sec}×35サイクル, その後、4℃で保温)。PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、135bp付近のサイズのDNAバンドを切り出し精製する。この精製PCR産物をBamHI-EcoRIで切断したpHL-H1-ccdB-mEF1a-RiHベクター(Addgene 60601)にIn-Fusion反応(Takara-Clontech)を用いて挿入し、任意のgRNAを発現するpHL-H1-[SaCas9-gRNA]-mEF1a-RiHベクターを構築する。
sgRNA-DMD-SA-5
5’-GAGACCACTTGGATCCATTACAGGAACTCCAGGATGGCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAAT-3’ （配列番号４４）
sgRNA-DMD-SA-8
5’-GAGACCACTTGGATCCATTGCCGCTGCCCAATGCCATCCGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAAT-3’ （配列番号４５）
SA1-gRNA-Universal-Rev
5’-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAA-3’ （配列番号４６）
<AsCpf1 cDNA発現ベクター構築> 図１３関連
　DNA合成(GenScript)により、Gateway attL1サイトとattL2サイトの間に、Ｃ末端にNucleoplasmin NLS(KRPAATKKAGQAKKKK)（配列番号２１８）と3×HAタグ(YPYDVPDYA YPYDVPDYA YPYDVPDYA)（配列番号２１９）配列を持ち、ヒトコドン頻度に最適化したAcidaminococcus sp. BV3L6由来Cpf1 cDNAを挿入したpUC57-hcAsCpf1ベクターを作製した。次に、pENTR-hcAsCpf1ベクターのhcAsCpf1 cDNA部分をGateway LRクロナーゼ反応によりpHL-EF1α-GW-AまたはpHL-EF1α-GW-iP-Aベクターへ挿入し、HL-EF1α-hcAsCpf1-AおよびHL-EF1α-hcAsCpf1-iC-Aベクターをそれぞれ構築した。
<AsCpf1 gRNA発現ベクター構築>
　AsCpf1のgRNAを発現ベクターへクローニングするために、下記の任意のAsCpf1-gRNA-XXX-revプライマー(配列番号５０～５３のいずれか)とAsCpf1-gRNA-Universal-GGG-fwdプライマー(またはAsCpf1-gRNA-Universal-G-fwdプライマー)を10 pmolずつ混合し、KOD Plus Neo DNAポリメラーゼ(Toyobo)を用いてサーマルサイクリング反応を行う(98℃: 2 min熱変性を行った後、{94℃: 10 sec, 55℃: 10 sec, 68℃: 10 sec}×35サイクル, その後、4℃で保温)。PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、80bp付近のサイズのDNAバンドを切り出し精製する。この精製PCR産物をBamHI-EcoRIで切断したpHL-H1-ccdB-mEF1a-RiHベクターにIn-Fusion反応(Takara-Clontech)を用いて挿入し、AsCpf1 gRNAを発現するpHL-H1-[AsCpf1-gRNA]-mEF1a-RiHベクターを構築する。
AsCpf1-gRNA-Universal-GGG-fwd (GGG at TSS)
5'-GAGACCACTTGGATCCGGGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'（配列番号４７）
AsCpf1-gRNA-Universal-G-fwd (G at TSS)
5'-GAGACCACTTGGATCCGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'（配列番号４８）
AsCpf1-gRNA-XXX-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'（配列番号４９）
AsCpf1-gRNA-DMD1-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAAGGAGTTCCTGTAAGATACCAATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'（配列番号５０）
AsCpf1-gRNA-DMD2-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAATGGAGTTCCTGTAAGATACCATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'（配列番号５１）
AsCpf1-gRNA-DMD3-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAACTGGAGTTCCTGTAAGATACATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'（配列番号５２）
AsCpf1-gRNA-DMD4-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAAAGGATGGCATTGGGCAGCGGATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'（配列番号５３）
<SSAベクターの構築> 図１０関連
　Sp-gRNA-DMD1～5のターゲット配列を持つSSA-DMD-all-ssオリゴDNAとSSA-DMD-all-asオリゴDNAをアニーリングさせ、pGL4-SSAベクター(Addgene 42962, Ochiai et al., Genes Cells, 2010)のFirefly Luc2 cDNA内に存在するBsaIサイトへライゲーションすることで、pGL4-SSA-DMD-allベクターを構築した。pGL4-SSA-DMD-allベクターにおいてFirefly Luc2 cDNAは分割されておりLuc活性を示さないが、ガイドRNAによりpGL4-SSAベクターのターゲットDNA部分の切断が誘導されると、SSA(Single strand annealing)経路によりDNA切断が修復されFirefly Luc2 cDNAが回復する。
SSA-DMD-all-ss
5'-gtcgTGCCTTTTTGGTATCTTACAGGAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATggt-3'
（配列番号５４）
SSA-DMD-all-as
5'-cggtaccATGTTCTGACAACAGTTTGCCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACCAAAAAGGCA-3'
（配列番号５５）
<SSAアッセイによるターゲットDNA切断活性>図１０，図１３(c)
　pGL4-SSA-DMD-Allベクター100 ng、Renilla Lucを発現するphRL-TKベクターを20 ng、CRISPR-Casを発現するpHL-EF1aベクターを200 ng、sgRNAを発現するpHL-H1-sgRNA-mEF1a-RiHベクターを200 ng混合し、Opti-MEM 25 μlで希釈する。Lipofectamine 2000 0.7 μlをOpti-MEM 25 μlで希釈し、3-5分室温でインキュベートした後、上記のDNA溶液と混合し、室温でさらに20分インキュベートする。そこへ、トリプシン-EDTA処理によって懸濁した293T細胞の細胞数を計測し、60,000細胞/100μlとなるように培地で希釈して、上記DNA-Lipofectamine複合体を含む96-wellプレートの1 wellに100 μlずつ播種する。48時間、5% CO2、37℃で細胞を培養した後、室温に戻した96-wellプレートへDual-Glo Reagentを添加し、室温で30分インキュベートすることで細胞を融解してルシフェラーゼ反応を起こさせる。上清100 μlを白色96-wellプレートに移し、Centro LB960(ベルトールドテクノロジー社)を用いてFireflyとRenillaの発光強度を測定する。Firefly LucはCRISPRによりDNA切断が誘導された場合にのみ発光するので、Fireflyの発光値をRenillaの発光値でノーマライズした値をDNA切断効率として測定する。
<細胞培養>
　293T細胞はDMEM培地に5～10%FBSを添加して培養した。
　DMD-iPS細胞(クローンID: CiRA00111)は、マイトマイシンC処理により細胞増殖を止めたSNLフィーダー細胞上にて、Knockout SR培地{200 mLのDMEM/F12培地(Thermo Fisher, 10565018)に、50 mLのKnockout SR (Thermo Fisher, 10828028)、2.5 mLのL-グルタミン (Thermo Fisher, 25030081)、2.5 mLの非必須アミノ酸ミックス (Thermo Fisher, 11140050)、0.5 mL 2-メルカプトエタノール (Thermo Fisher, 21985023)、1.25 mLのペニシリン-ストレプトマイシン (Thermo Fisher, 15140122)、そして8 ng/ml human basic FGF (Wako, 6404541)を添加}を用いて培養した。あるいは、StemFit AK03N (Ajinomoto)培地を用い、フィーダー細胞を使用せずにiMatrix-511 (Nippi, 892014)上で培養しても良い。
<DMD-iPS細胞におけるゲノムDNA切断パターンの解析>図１１
　エクソン44を欠損するDMD患者より樹立したiPS細胞に対し、トランスフェクションを行う一時間以上前から培地中に10 μMのY-27632 (Sigma)を添加した。エレクトロポレーションを行う直前に、iPS細胞をCTK溶液で剥離し、0.25%トリプシン-EDTAを用いて細胞をばらばらにした後、細胞カウントを行い、一条件あたり1×106個の細胞を用意した。ここへ、NEPA21エレクトロポレーター（ネッパジーン社）を用いて、穿孔パルス電圧125V、パルス幅5ミリ秒、パルス数２回の条件にて、pHL-EF1α-SphcCas9-iP-Aベクター(Addgene, 60599)５μｇとpHL-H1-[Sp-gRNA]-mEF1α-RiHベクター５μｇをエレクトロポレーションした。また、ダブルニッキングを行う場合は、pHL-EF1α-SphcCas9-D10A-iP-Aベクター５μｇと、pHL-H1-[Sp-gRNA]-mEF1α-RiHベクターを５μｇずつ２種類で合計１０μｇをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションしたiPS細胞は数日以上培養後、ゲノムDNAを抽出し、DMD-MiSeq-Rd1-fwd-XおよびDMD-MiSeq-Rd2-rev-Xプライマーを用いて一次PCR増幅を行った後、Multiplex P5 fwdプライマーおよびMultiplex P7 revプライマーを用いて二次PCR増幅を行った。PCR産物はゲル切り出し精製した後、Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher)およびKAPA Library Quantification Kit for Illumina (KAPA Biosystems)を用いて定量し、サンプル毎に等量となるように混合した後、DNA濃度を2 nMに調製し、0.2N NaOHで5分間処理することでDNAをアルカリ変性させた。変性したDNAサンプルを12 pMに希釈し、4 pMのPhiX spike-in DNAを加えた後、MiSeq Reagent Kit v2 for 2 ×150bp（Illumina）を用いてMiSeqシーケンス反応を行った。シーケンスの結果生成されたFASTQシーケンスファイルから、クオリティの低いリードをFASTX- Toolkit中のfastq_quality_filterプログラムを用いて除去した。スパイクインとして用いたPhiX配列を除去した後、fastx_barcode_splitterプログラムを用いて、バーコード配列に応じてサンプル毎に分割を行った。各サンプルの配列はBWAプログラムを用いてマッピングし、配列の挿入欠損パターンはCIGARコードのMDタグ情報より抽出を行った。
DMD-MiSeq-Rd1-fwd-X (Nにはサンプルに応じたバーコード配列が入る。下記参照)
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'（配列番号５６）
DMD-MiSeq-Rd2-rev-X (Nにはサンプルに応じたバーコード配列が入る。下記参照)
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号５７）
Multiplex P5 fwd
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3'（配列番号５８）
Multiplex P7 rev
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC-3'（配列番号５９）
上記Xのバーコードを含む具体的配列
DMD-MiSeq-Rd1-fwd1-AGTC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTagtcAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６０）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd2-GTCA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgtcaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６１）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd3-TCAG
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtcagAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６２）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd4-CAGT
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcagtAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６３）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd5-ATGC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatgcAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６４）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd6-TGCA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtgcaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６５）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd7-GCAT
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcatAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６６）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd8-CATG
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcatgAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６７）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd9-AACG
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTaacgAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６８）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd10-ACGA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTacgaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号６９）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd11-CGAA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcgaaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号７０）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd12-GAAC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgaacAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号７１）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd13-TACC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtaccAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号７２）
DMD-MiSeq-Rd1-fwd14-ACCT
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTacctAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3’ （配列番号７３）
DMD-MiSeq-Rd2-rev1-AGTC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTagtcCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号７４）
DMD-MiSeq-Rd2-rev2-GTCA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgtcaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号７５）
DMD-MiSeq-Rd2-rev3-TCAG
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtcagCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号７６）
DMD-MiSeq-Rd2-rev4-CAGT
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcagtCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号７７）
DMD-MiSeq-Rd2-rev5-ATGC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTatgcCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号７８）
DMD-MiSeq-Rd2-rev6-TGCA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtgcaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号７９）
DMD-MiSeq-Rd2-rev7-GCAT
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgcatCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８０）
DMD-MiSeq-Rd2-rev8-CATG
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcatgCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８１）
DMD-MiSeq-Rd2-rev9-AACG
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTaacgCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８２）
DMD-MiSeq-Rd2-rev10-ACGA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTacgaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８３）
DMD-MiSeq-Rd2-rev11-CGAA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcgaaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８４）
DMD-MiSeq-Rd2-rev12-GAAC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgaacCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８５）
DMD-MiSeq-Rd2-rev13-TACC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtaccCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８６）
DMD-MiSeq-Rd2-rev14-ACCT
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTacctCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'（配列番号８７）
<Lucレポーターを利用したエクソンスキッピング検出ベクターの構築>
　pGL4-CMV-luc2(プロメガ)からLuc2 cDNAをPCR増幅し、pENTR-D-TOPOベクター（Thermo Fisher Scientific Inc.）にクローニングすることで、pENTR-D-TOPO-Luc2ベクターを構築した。pENTR-D-TOPO-Luc2ベクターをNarIとAgeIで切断して、gBlock(IDT社)で合成した下記のイントロン配列とDMD Exon 45配列を挿入し、pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[+]ベクターを構築した。次に、gBlock配列中hEx45の両側に二箇所存在するSalIサイトで切断して、ベクター側を再ライゲーションすることで、pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[-]ベクターを構築した。
NarI-AgeI-DMD-Ex45-gBlock (図６の配列)
GCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGTAAGTCTTTGATTTGTCGACCGTATCCACGATCACTAAGAAACCCAAATACTTTGTTCATGTTTAAATTTTACAACATTTCATAGACTATTAAACATGGAACATCCTTGTGGGGACAAGAAATCGAATTTGCTCTTGAAAAGGTTTCCAACTAATTGATTTGTAGGACATTATAACATCCTCTAGCTGACAAGCTTACAAAAATAAAAACTGGAGCTAACCGAGAGGGTGCTTTTTTCCCTGACACATAAAAGGTGTCTTTCTGTCTTGTATCCTTTGGATATGGGCATGTCAGTTTCATAGGGAAATTTTCACATGGAGCTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAGTACAACTGCATGTGGTAGCACACTGTTTAATCTTTTCTCAAATAAAAAGACATGGGGCTTCATTTTTGTTTTGCCTTTTTGGTATCTTACAGGAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATTGAATGCAACTGGGGAAGAAATAATTCAGCAATCCTCAAAAACAGATGCCAGTATTCTACAGGAAAAATTGGGAAGCCTGAATCTGCGGTGGCAGGAGGTCTGCAAACAGCTGTCAGACAGAAAAAAGAGGTAGGGCGACAGATCTAATAGGAATGAAAACATTTTAGCAGACTTTTTAAGCTTTCTTTAGAAGAATATTTCATGAGAGATTATAAGCAGGGTGAAAGGCGTCGACGTTTGCATTAACAAATAGTTTGAGAACTATGTTGGAAAAAAAAATAACAATTTTATTCTTCTTTCTCCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGG（配列番号８８）
　Trichoplusia ni由来のpiggyBac 5'TR(Terminal repeat)と3'TR配列 は、３分割したgBlocks配列(gBlock11～13-PV-3'TR-5'TR)として合成(IDT)し、その３断片をPCRで連結した後、 pUC19ベクターのAatII-PvuIIサイトへIn-Fusion反応で挿入し、pPV-synthesizedベクターを構築した。 
gBlock11-PV-3'TR-5'TR
GAAAAGTGCCACCTGACGTCATCTGTTAACATTATACGCGTTTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTAAACATTCTCTCTTTTACAAAAATAAACTTATTTTGTACTTTAAAAACAGTCATGTTGTATTATAAAATAAGTAATTAGCTTAACCTATACATAATAGAAACAAATTATACTTA（配列番号８９）
gBlock12-PV-3'TR-5'TR
CCTATACATAATAGAAACAAATTATACTTATTAGTCAGTCAGAAACAACTTTGGCACATATCAATATTATGCTCTGCTAGCGATATCTGTAAAACGACGGCCAGTTCTAGACTTAAGCTTCATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTCGAGTTAATTAACCAACAAGCTCGTCATCGCTTTGCAGAAGAGCAGAGAGGATATGCTCATCGTCTAAAGAACTACCCATTTTATTATATATTAGTCACGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATA（配列番号９０）
gBlock13-PV-3'TR-5'TR
ATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATACGTATAATACATATGATTCAGCTGCATTAATGAATC（配列番号９１）
　PB-EF1a-GW-iPベクター(Masui H et al., PLOS ONE, 2014 Aug 15;9(8):e104957.)をNheI-PacIで切断し、pPV-synthesizedのNheI-PacIサイトへライゲーションを行い、pPV-EF1a-GW-iPベクターを構築した。次に、pCXLE-EGFPベクター(Okita K et al., Nat Methods, 2011 May;8(5):409-12.)からpHL-PacI-rHBB-pA-IF-fw プライマー(5'-GTATACCTCGAGTTAAATTCACTCCTCAGGTGC-3'（配列番号９２）)およびpPV-PacI-rHBB-pA-IF-revプライマー(5'-CGAGCTTGTTGGTTAATTAAGTCGAGGGATCTCCATAA-3'（配列番号９３）)を用いて、ウサギ由来 hemoglobin poly A signalを増幅し、pPV-EF1a-GW-iPベクターのPacIサイトへIn-Fusion反応を用いて挿入することで、pPV-EF1a-GW-iP-Aベクターを構築した。pPV-EF1a-GW-iP-AベクターとpENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[+]を用いたGateway LR反応により、pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[+]-iP-Aベクターを構築した。また、pPV-EF1a-GW-iP-AベクターとpENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[-]を用いたGateway LR反応により、pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45-[-]-iP-Aベクターを構築した。
<Luc2 V323I (G867A)変異の導入>
　piggyBacベクターpPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[-]ベクターを鋳型にして、プライマーLuc2-NcoI-IF-Fwd と Luc2-V323I-fwdの組合せ、及びLuc2-V323I-revとLuc2-SalI-IF-Revの組み合わせでそれぞれ別々にPCRを行った。増幅された2つの断片を混合して両端のプライマー（Luc2-NcoI-IF-Fwd とLuc2-SalI-IF-Rev）で変異の入った断片を作成し、pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[-]ベクターのNcoIとSalI切断部位にIn-Fusion反応で挿入することで、pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-]ベクターを構築した。
Luc2-NcoI-IF-Fwd　GCCCCCTTCACCATGGAAG（配列番号９４）
Luc2-V323I-fwd　　CAGCAAGGAGATAGGTGAGG （配列番号９５）
Luc2-V323I-rev　　CCTCACCTATCTCCTTGCTG（配列番号９６）
Luc2-SalI-IF-Rev　TAATGCAAACGTCGACAAATCAAAGAC（配列番号９７）
<1kb, 2kb, 4kb, 0.7kbのhDMD exon 45および周辺イントロン配列の挿入>
　pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[+]-iP-Aを鋳型にして、DMD-Ex45-SalI-IF-FとDMD-Ex45-SalI-IF-Rプライマーを用いてPCR増幅し、pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-]ベクターのSalI切断サイトにIn-Fusion反応で挿入することで、pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](0.7 kb)ベクターを構築した。
DMD-Ex45-SalI-IF-F　tctttgatttGTCGACcgtatc（配列番号９８）
DMD-Ex45-SalI-IF-R　taatgcaaacGTCGACgcc（配列番号９９）
　1383D2 細胞から調製したヒトゲノムDNAを鋳型にして、下記のプライマー(HDMD-SR-XkbFrag-fwd & rev)を用いることでexon 45 とその周辺イントロンを増幅し、pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-]ベクターのSalI切断部位にIn-Fusion反応で挿入することで、pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](1kb)、pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](2kb)、pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](4kb)ベクターを構築した。
HDMD-SR-1kbFrag-fwd　tctttgatttGTCGAGGGATATCTTGATGGGATGCTCC（配列番号１００）
HDMD-SR-1kbFrag-rev　taatgcaaacGTCGAAAACCACTAACTAGCCACAAGT（配列番号１０１）
HDMD-SR-2kbFrag-fwd　tctttgatttGTCGAATTGTGAGGCACCGTGTCAC（配列番号１０２）
HDMD-SR-2kbFrag-rev　taatgcaaacGTCGACTCTTTGGCTCAAGTTCCCCT（配列番号１０３）
HDMD-SR-4kbFrag-fwd　tctttgatttGTCGAGCTGCAGCATTAGTTTATAGCA（配列番号１０４）
HDMD-SR-4kbFrag-rev　taatgcaaacGTCGAAACTTTGGCAAGGGGTGTGT（配列番号１０５）
構築したエクソンスキップレポーターcDNA部分の配列を下記に示す。
Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-]
ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGaTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGgtaagtctttgatttGTCGACgtttgcattaacaaatagtttgagaactatgttggaaaaaaaaataacaattttattcttctttctccagGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA（配列番号１０６）
 
Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+]
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Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](1kb)
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Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](2kb)
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Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](4kb)
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<Lucレポーターを利用したエクソンスキッピングレポーターアッセイ>
　pPV-EF1a-Luc2(V323I)hDMD-Ex45[+]ベクター40 ng、Renilla Lucを発現するphRL-TKベクターを20 ng、CRISPR-Casを発現するpHL-EF1aベクター（Addgene）を280 ng、ガイドRNAを発現するpHL-H1-sgRNA-mEF1a-RiHベクターを280 ng混合し、Opti-MEM 25 μlで希釈する。Lipofectamine 2000 0.7 μlをOpti-MEM 25 μlで希釈し、3-5分室温でインキュベートした後、上記のDNA溶液と混合し、室温でさらに20分インキュベートする。そこへ、トリプシン-EDTA処理によって懸濁した293T細胞の細胞数を計測し、60,000細胞/100μlとなるように培地で希釈して、上記DNA-Lipofectamine複合体を含む96-wellプレートの1 wellに100 μlずつ播種する。48時間、5% CO2、37℃で細胞を培養した後、室温に戻した96-wellプレートへDual-Glo Reagentを添加し、室温で30分インキュベートすることで細胞を融解してルシフェラーゼ反応を起こさせる。上清100 μlを白色96-wellプレートに移し、Centro LB960(ベルトールドテクノロジー社)を用いてFireflyとRenillaの発光強度を測定する。Firefly Lucはエクソンスキッピングが誘導された場合にのみ発光するので、Fireflyの発光値をRenillaの発光値でノーマライズした値をエクソンスキッピング効率として測定する。
＜結果＞
　Duchenne型筋ジストロフィーに対する治療法を開発するために、ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピング誘導を検討した。図１に概要を示す。
(1) 健常人の正常ジストロフィン遺伝子の骨格筋アイソフォーム(Dp427m)では79個のエクソンがスプライシングにより連結され、3685アミノ酸からなるジストロフィンタンパク質をコードしている。
(2) 一方、エクソン４４を欠損するDMD患者の場合、エクソン４４のサイズが３の倍数では無いためタンパク質読み枠がずれてしまい、直後のエクソン４５に停止コドンが発生してしまうため、ジストロフィンタンパク質が途切れた形となる。
(3) ここで、エクソン４５のスプライスアクセプター配列部分をゲノム編集にて破壊すれば、エクソン４５がスプライシングの際に認識されず、直後のエクソン４６が代わりにエクソン４３と連結され、結果としてジストロフィンタンパク質の読み枠を回復させることができる。
　スプライスアクセプターはブランチング(分岐)配列、ポリピリミジン(C/U)配列、そして"AG"アクセプター配列から構成される。この中で特に、"AG"アクセプター配列がスプライシング反応の際に最も高度に保存されており、この二塩基を削除することが出来れば、エクソンスキッピングを誘導することができる。
　CRISPR システムのgRNAを設計するにあたり、ゲノム上におけるターゲット配列以外を認識切断してしまうオフターゲットリスクを鑑み、Unique k-mer法[Li HL et al., Stem Cell Reports, 2015]を用いてスプライスアクセプター付近の配列特異性を観察したところ、一般的にスプライスアクセプター付近の特異性は、エクソン領域やその他のイントロン領域と比較しても特に低いことが明らかとなった（図２）。
　ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピング効率を簡便かつ高感度に検出するために、Firefly ルシフェラーゼ (Luciferase, Luc)遺伝子を用いたレポーターベクターの構築を行った。Luc cDNAを二つに分割し、そこへ合成イントロン配列を挿入したベクター(Luc + Int)と、さらにヒトジストロフィンエクソン45の前後の配列を挿入したベクター(Luc + hEx45)を作製した（図３）。このベクターを293T細胞へ導入し、mRNAを回収して逆転写した後にPCR増幅したところ、前半Luc cDNAに偽スプライシングドナー配列が含まれ、余分なスプライシングが起こっていることが判明した（図４(a)）。この偽スプライシングドナー配列を破壊すべく、ヒトジストロフィン遺伝子に含まれる全エクソン配列からスプライシングドナー配列とアクセプター配列をEnsemble Biomartデータベース(http://www.ensembl.org)から抽出し、共通する塩基をWeblogoソフト(http://weblogo.threeplusone.com/)で解析したところ、既知のスプライシングドナーおよびアクセプター配列とよく一致していることを確認した（図４(b)）。従って、偽スプライシングドナー配列"AGGTA"の真ん中の"G"を"G以外の配列"に変換へと変換すれば、スプライシングドナーとして機能しなくなることが期待された。但し、この塩基はValアミノ酸をコードするコドン"GTA"の最初の塩基であり、この塩基を改変すると必然的にアミノ酸配列が変わってしまう。"A"に変更すると"ATA"でIleアミノ酸（図４(c)）、"C"まはた"T"に変更すると"CTA"または"CTA"でLeuアミノ酸をコードするコドンとなる。我々はこのアミノ酸変換がLuc活性へ影響を及ぼさないか確認するために、ルシフェラーゼタンパク質の立体構造(PDBコード: 1BA3)をPDBデータベースからダウンロードし、Chimeraソフトを利用することでG967A(V323I)変異アミノ酸部位が活性残基[Branchini BR et al., J Biol Chem. 1997 Aug 1;272(31):19359-64.]から離れていて直接相互作用が無いことを確認した（図５）。
　次に、実際に予想されたスプライシングパターンが起こっているかどうかを確認するため、図６(a)に示す各種ベクターを293T細胞に導入してmRNAを抽出し、逆転写後にPCRを行いcDNAのサイズをゲル電気泳動で確認したところ、G967A(V323I)変異を導入していないベクター(Lane 2, 4)ではスプライシングの起こっていない転写産物に相当するバンドが濃く出ているのに対し、G967A(V323I)変異を導入したベクター(Lane 3, 5)では、ほぼ全ての転写産物で目的サイズでのスプライシングが起こっていることを確認できた（図６(b)）。さらに、各ベクターのルシフェラーゼ活性を調べたところ、イントロン配列の挿入およびG967A(V323I)変異を導入ではほとんど変化は見られなかった。一方、ヒトエクソン45配列を挿入した場合、G967A(V323I)変異が無いベクターでは偽スプライシングドナーを介したルシフェラーゼ活性が僅かに見られ、バックグラウンドレベルが高くなっているが、G967A(V323I)変異を導入することによりヒトエクソン45を含んだLuc cDNA配列が大多数となったお陰で、非常に低いルシフェラーゼ活性を示すことが確認できた（図６(c)）。
　次に、エクソン45の前後のイントロン配列の長さによるスプライシングパターンの解析を行った。最初に構築した0.7 kbの配列の他、1.0 kb、2.0 kb、4.0kbのそれぞれの長さを挿入したベクターを構築した（図７）。これらのベクターのスプライシングパターンを解析したところ（図８(a)）、何れのベクターもほぼ期待通りのスプライシングパターン(468 bpのバンド)が大多数であったが、イントロンサイズが大きくなるにつれて、イントロン残存バンド(1166 bp)が消失していく傾向が見られた。一方で、ルシフェラーゼ活性を確認したところ、イントロンサイズが大きくなると細胞への導入活性が下がり、結果としてバックグラウンド活性がやや高くなる様子が観察された。何れのベクターを用いても、CRISPR-sgRNA-DMD1 を用いてエクソンスキッピングを誘導した場合にはルシフェラーゼ活性の上昇がみられ（図８(b)）、簡便かつ高感度に測定できるレポーターベクターとして有用であることが判明した。
　オフターゲットのリスクを最小限にしつつ、ジストロフィンのエクソンスキッピングを誘導するために、エクソン４５のスプライスアクセプター部位に、複数のgRNAを設計し（図９）、通常の野生型SpCas9とgRNAによる切断パターン、およびD10A Nickase型SpCas9とgRNAを二つ組み合わせた場合について、SSA(Single Strand Annealing)アッセイを行い、目的箇所のDNA切断活性を測定した。その結果、図１０に示すように、５種類のgRNAでいずれも高いDNA 切断活性を示し、さらに、Double nicking法では二つのgRNAが重なっている場合は切断活性が低く、ある程度の距離が離れて初めて効率的なDNA切断が誘導できることがわかった。
　次に、各条件においてDNA切断パターンを調査するため、ターゲット部位をPCRで増幅し、次世代シーケンサーMiSeqによる配列解析を行った。その結果、Double nicking法で二つのgRNAを適切な距離に設計した場合、各gRNAのNicking誘導部位の間が削除されるDNA切断パターンが多く観察され、ここにスプライスアクセプター配列、特に"AG"アクセプター配列を含むことにより、効率的にエクソンスキッピングが誘導できることを見出した（図１１）。
　エクソンスキッピングを効率的に誘導できるgRNA配列やCRISPRの種類(SpCas9, AsCpf1など)、ゲノム編集方法(double-nicking)を検証するために、上記で開発したエクソンスキッピングレポーターを用いて検証を行った。
　図１２ではSpCas9のgRNA配列を5種類試し、図１３ではSpCas9、SaCas9、AsCpf1およびSpCas9 double-nicking法を比較解析した。また、図１４ではヒトエクソン45にデザイン可能なすべての配列(NGG PAM配列を含むsgRNA配列)でエクソンスキッピングの効率を測定するために、26種類のgRNAをデザインした（図１４(a)）。
　26種類のgRNAについてヒト293T細胞へ導入し、ターゲットDNAの切断活性をT7E1アッセイにて測定した（図１４(b)）。その結果、sgRNA-DMD6はDNA切断活性が低かったものの、それ以外のgRNAは基本的に10%以上の切断活性を示した。そこで、26種類のgRNAについて、Luc2 (G967A)  +hEx45 (0.7 kb)レポーターを用いて293T細胞でエクソンスキッピング効率測定を行った。その結果、エクソンスキッピングの効率は、gRNAのデザイン部位およびスプライスアクセプターまたはスプライシングドナーからの距離が重要であることが判明した（図１４(ｃ)）。
　さらに、単独でエクソンスキッピング活性を示した7種類のgRNA(DMD#1,2,4,8,9,20,23)を選択し、この中から任意の2つのsgRNAの組合せについて、Luc2 (G967A) +hEx45 (0.7 kb)レポーターを用いて293T細胞でエクソンスキッピング効率測定を行った。その結果、二種類のgRNAを共導入することにより、エクソンスキッピング効率をより効率化できることが判明した(図１５)。
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Claims (16)

  1. CRISPR-CasおよびガイドRNAを使用したゲノム上の目的遺伝子の標的エクソンをスキップするための方法であって、前記ガイドRNA は、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有することを特徴とする方法。
  2. 前記ガイドRNA は２種類以上使用される、請求項１に記載の方法。
  3. CRISPR-CasがRuvCドメインのヌクレアーゼ活性残基が置換されたニッカーゼ改変型Casであり、目的遺伝子のセンス鎖に対するガイドRNAおよびアンチセンス鎖に対するガイドRNAを使用し、両ガイドRNAは、目的遺伝子のセンス鎖における切断部位および目的遺伝子のアンチセンス鎖における切断部位がいずれも標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有する、請求項１に記載の方法。
  4. CRISPR-CasがCas9である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. Cas9がStreptococcus pyogenes由来、あるいはStaphylococcus aureus由来である、請求項４に記載の方法。
  6. CRISPR-CasがCpf1である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. Cpf1がAcidaminococcus sp. BV3L6由来、あるいはLachnospiraceae由来である、請求項６に記載の方法。
  8. 目的遺伝子がヒトジストロフィン遺伝子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 標的エクソンがエクソン４５である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ガイドRNAが配列番号１７～４２のいずれかの塩基配列の塩基番号１７～３６の塩基配列、配列番号４４～４５のいずれかの塩基配列の塩基番号１７～３９の塩基配列、または配列番号５０～５３のいずれかの塩基配列の塩基番号２４～４３の塩基配列からなるスペーサー配列を有する、請求項９に記載の方法。
  11. CRISPR-CasおよびガイドRNAを含む、ゲノム上の目的遺伝子の標的エクソンをスキップするための試薬であって、前記ガイドRNA は、CRISPR-Casによる切断部位が標的エクソンの直前のスプライスドナー部位または標的エクソンの直後のスプライスアクセプター部位から８０塩基以内に配置されるようなスペーサー配列を有することを特徴とする試薬。
  12. エクソンスキッピングを評価するための方法であって、コード領域内に第１イントロン、解析対象エクソンおよび第２イントロンを含む配列が挿入されたマーカー遺伝子を使用し、解析対象エクソンがスキップされたときにマーカー遺伝子が機能するように設計されていることを特徴とする方法。
  13. エクソンスキッピングがCRISPR-CasおよびガイドRNAを使用したエクソンスキッピングである、請求項１２に記載の方法。
  14. トランスポゾンベクターを用いることでマーカー遺伝子を解析対象細胞のゲノムに挿入する、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. マーカー遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 解析対象エクソンがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４５である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
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