WO2018161741A1 - 一种ape1抑制剂及其在制备用于治疗肿瘤和血管异常增生性疾病药物中的应用 - Google Patents

一种ape1抑制剂及其在制备用于治疗肿瘤和血管异常增生性疾病药物中的应用 Download PDF

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Definitions

  • APE1 inhibitors are combined with clinically available anti-tumor drugs, such as cisplatin, artemisinin and other anti-tumor drugs through other mechanisms of action, these compounds mainly act by inhibiting APE1, such administration
  • anti-tumor drugs such as cisplatin, artemisinin and other anti-tumor drugs through other mechanisms of action
  • these compounds mainly act by inhibiting APE1, such administration
  • the method should fall within the scope of protection of the present invention.
  • vascular proliferation at the bottom of the retina can cause macular degeneration, which is the leading cause of blindness in the elderly.
  • the blood concentration of conventional oral administration or injection administration is often unable to maintain an effective onset concentration in the eye, resulting in poor drug efficacy.
  • a conventional VEGF antagonist is administered by injection, the therapeutic effect is poor or the therapeutic time is short, and the administration mode is not as varied as the small molecule inhibitor.
  • APE1 inhibitors are very effective in animal models of macular degeneration.
  • structural analogs of C10 and C10 can inhibit diseases of abnormal vascular proliferation such as macular degeneration by inhibiting the redox end function of APE1.
  • Figure 2 is a graph showing the inhibition of the redox end of APE1 by C10 and E3330:
  • the cDNAs of APE1 and c-fos were cloned into the N-terminal His-tagged pET-28a vector, and c-jun was cloned into the GST-tagged pGEX-4T-1 vector.
  • Each plasmid was transferred to Roseta E. coli and cultured in LB medium. When the bacterial density OD reached 0.6, it was induced with 1 mM IPTG.
  • E. coli transferred to APE-1 was incubated at 37 ° C for 4 h, and E. coli transfected with c-jun and c-fos was incubated at 25 ° C for 4 h. The bacterial solution was lysed with a lysate with PMSF.
  • KSHV-PDLSC was treated with the drug for 24 hours, and the drug-containing medium was removed.
  • the cells were cultured for 24 hours, and the supernatant was collected.
  • the ELISA kit was used to detect the cytokine secretion levels of cells treated with different drug concentrations. The change.

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Abstract

一种APE1抑制剂及其在制备用于治疗肿瘤和血管异常增生性疾病药物中的应用，该APE1抑制剂具有如下式1所示的结构，其选择性的抑制APE1的氧化还原端。

Description

一种APE1抑制剂及其在制备用于治疗肿瘤和血管异常增生性疾病药物中的应用 技术领域
本发明属于分子生物、生化和病原学领域，具体涉及一种APE1抑制剂及其在制备用于治疗依赖APE1氧化还原端功能的相关的肿瘤和血管异常增生性疾病药物中的应用。
背景技术
脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(APE-1)是一个极其重要的胞内双功能蛋白。其C端参与DNA错配后的碱基切除修复；N端含有氧化还原的活性，可以将氧化态无活性的转录因子还原成还原态有活性的转录因子，有活性的转录因子可以结合下游DNA的启动子序列启动下游基因的表达，对细胞增殖、凋亡和分化有着重要的影响。其下游调控的转录因子包括有HIF-1α、Egr-1、AP-1、NF-κB、CREB(cAMP response element bindingprotein)、p53等。
研究发现，APE-1与肿瘤的关系非常密切。已经发现APE-1的蛋白表达水平在多种恶性肿瘤中均有升高如胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部癌症等。临床上常采用普通的化疗和放疗对上述肿瘤进行治疗。但是复发率均很高，并且易产生耐药性。这与肿瘤处的高表达的APE1密切相关。APE1可以修复放疗造成的肿瘤细胞的DNA损伤，还原放疗产生的超氧离子，维持肿瘤处的抗氧化状态。这为我们开辟了一条新的思路，可以以APE1为作用靶标，使用APE1的抑制剂对上述肿瘤进行治疗。在细胞学水平使用APE1的氧化还原端抑制剂E3330可以抑制胰腺癌细胞，神经胶质瘤细胞的增殖，促进细胞的凋亡。该项研究，有待进一步在动物学水平进行验证。此外，在部分肿瘤组织中的APE-1与正常组织的亚细胞定位不一样；如：在肿瘤干细 胞中APE-1主要分布在细胞核；在肺癌，膀胱癌中APE-1则在核和包浆中都有分布，膀胱癌患者在血液中都能检测到APE1的蛋白水平，提示APE1可以以某种形式向外分泌。临床上，有报道可以用血清中APE-1蛋白的表达水平作为膀胱癌的生物标记物用于膀胱癌恶性程度的诊断，还可以根据其表达水平对治疗效果进行评估。
有研究证明，APE-1的氧化还原功能与体内异常的血管增生有关联，使用APE-1的N端抑制剂E3330可以减少血管相关细胞因子VEGF的分泌，减少细胞表面VEGF-R的表达来抑制血管的新生。除此之外，E3330还可抑制内皮前体细胞向CD31+的内皮细胞分化，抑制内皮细胞和内皮前体细胞的增殖。老年黄斑病变是导致老年人失明的首要原因，而老年黄斑病变主要是由于视网膜底部血管的异常增生导致的。直接使用VEGF的拮抗剂只能产生短暂的疗效并不能从根本上根治该疾病。体内和体外研究表明，APE1的氧化还原端抑制剂E3330可以阻断视网膜细胞的成管能力，并在动物学水平使用眼部血管增生模型得到了验证。这提示我们APE1的抑制剂有利于治疗血管增生异常的疾病。
此外，APE1与炎症也有关系，APE-1可以通过AP-1调控IL-6、IL-8等炎症细胞因子的分泌，通过调控微环境来影响炎症性疾病的发生。
卡波氏肉瘤是一种特殊的肿瘤，卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是导致该病发生的病原体。卡波氏肉瘤在发病早期还不能称之为肉瘤，因为从病人身上取下的肿瘤组织不具备无性克隆增殖的能力，不能分离得到一株卡波氏肉瘤的细胞系，发病晚期以肿瘤损伤处丰富的血管生成因子，紊乱的炎症细胞因子和恶性增殖的纺锤状细胞为特征。同时具备异常血管增生，炎症侵润和恶性增殖的肿瘤细胞，是一种很好的模型用来研究APE1与肿瘤，血管和炎症性疾病的关系。
APE1的功能对于肿瘤的生存和生长至关重要，而现在以APE1的氧化还原端为靶标的抑制剂屈指可数，大多都是E3330的结构类似物。
发明内容
为了解决现有技术中的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种APE1抑制剂。
本发明的另一目的在于提供上述APE1抑制剂的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种APE1抑制剂，该APE1抑制剂具有如下式1所示的结构(以下全文称之为C10化合物)：
Figure PCTCN2018074656-appb-000001
该APE1抑制剂具有如下式2所示的结构：
Figure PCTCN2018074656-appb-000002
其中R 1与R 2分别为五元环、六元环或者苯并联化合物，五元环为呋喃、噻吩、吡咯、噻唑或咪唑，六元环为吡啶、吡嗪、嘧啶或哒嗪，苯并联化合物为吲哚或异吲哚类化合物。所述R 1与R 2分别优选为环己基或取代的环己基。
该APE1抑制剂具有如下式3所示的结构：
Figure PCTCN2018074656-appb-000003
其中R为C、N、S或O元素；R 1、R 2、R 3、R 4、R 5或R 6分别为氢，或各种饱和或者不饱和、含环或者不含环、环上有取代基或者无取代基的烷基化合物。
该APE1抑制剂具有如下式4所示的结构：
Figure PCTCN2018074656-appb-000004
其中R为C、N、S或O元素；R 1、R 2、R 3、R 4、R 5或R 6分别为氢，或各种饱和或者不饱和、含环或者不含环、环上有取代基或者无取代基的烷基化合物。
上述APE1抑制剂在制备用于治疗依赖APE1氧化还原端功能的相关性疾病药物中的应用。该APE1抑制剂以APE1为作用靶标，可以抑制APE的氧化还原端功能。
上述APE1抑制剂在制备用于治疗肿瘤和血管异常增生性疾病药物中的应用。
所述肿瘤包括卡波氏肉瘤、鼻咽癌或宫颈癌这些由于病毒引起的肿瘤。
所述肿瘤还包括胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、卵巢癌或乳腺癌。
所述血管异常增生性疾病包括老年黄斑病变。
上述APE1抑制剂可以通过药物制剂的方式制备成各种类型的药物用于治疗相关肿瘤和血管增生性疾病。
以上述APE1抑制剂为有效成分，以抑制APE1的氧化还原端为特异性的作用机理，将这些化合物通过药物制剂的方式做成任何片剂、凝胶剂、胶囊、分散剂、注射剂、喷雾剂、口服液等药学上可接受的载体和/或赋形剂均属于本发明的保护范畴。
上述化合物药学上可接受的盐类或酯类，如将上述APE1抑制剂做成盐酸盐，磷酸呀，硫酸盐，碳酸盐等；以抗APE1的氧化还原端为作用机理用来治疗上述肿瘤和血管增生性疾病，也同样属于本发明的保护范畴。
同时，发明提供了上述APE1抑制剂的药物组合物，或者复方制剂，凡是 以上述APE1抑制剂为药物主要有效成分者，用来抑制APE1的氧化还原端治疗上述疾病均属于本发明的保护范畴。
将上述APE1抑制剂与临床上现有的抗肿瘤药物联合用药，如顺铂，青蒿素等抗肿瘤药物是通过其他的作用机理，这些化合物主要通过抑制APE1来起作用的，此类给药方式应属于本发明的保护范畴。
本发明的原理是：
在早期的大规模药物筛选中，本发明人发现C10化合物和C10化合物的结构类似物具有非常好的抑制APE1氧化还原端的能力而不影响APE1的DNA修复功能。是一种特性性的抑制剂，选择性的抑制APE1的氧化还原端。
通过在细胞水平的进一步实验发现，C10化合物可以有效抑制KSHV和EBV裂解复制，且细胞毒性很小。在动物学水平以C10化合物对小鼠进行口服给药能有效阻止鼠的γ疱疹病毒在小鼠体内的复制。C10化合物在细胞水平和动物水平能有效抑制KSHV诱导的血管异常性增生和炎症因子的分泌，能从多个方面同时阻断KSHV促进的病理进程。以C10化合物对其他肿瘤细胞的药效进行评估，发现C10化合物能同时抑制鼻咽癌，骨肉瘤等肿瘤细胞的增殖。
这一新型APE1的抑制剂C10化合物或C10的结构类似物可用于治疗KSHV、EBV感染引起的相关肿瘤，其中包括：卡波西氏肉瘤(经典型卡波氏肉瘤、艾滋病相关型卡波西氏肉瘤、器官移植相关型卡波西氏肉瘤、医源性的卡波氏肉瘤)，原发性渗出性淋巴瘤，多中心型Castleman病，Burkitt’s淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌等；治疗血管异常增生性疾病如老年性黄斑变性；治疗其他肿瘤如：膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的效果：
(1)C10化合物或者C10的类似物丰富了现有APE1氧化还原端抑制剂的结构形式。
(2)C10化合物或者C10的类似物疗效高且毒性较小；与现有APE1的抑制剂相比，C10在多种活性方面均有明显改善。
(3)C10化合物结构简单、易合成、具有很好的成药特性；
基于本发明的研究结果，本发明所述的化合物将在以下方面具有良好的应用前景：
1.治疗KSHV导致的相关恶性肿瘤。
KSHV可以导致多种恶性肿瘤，其中卡波氏肉瘤表现为丰富的血管浸润，炎症因子分泌及恶性增殖的纺锤状细胞。首先，KSHV在纺锤状细胞中的持续潜伏依赖于病毒的裂解复制。病毒的裂解复制持续性释放感染性的病毒颗粒维持病毒的潜伏感染。潜伏感染的细胞可以维持肿瘤细胞的生存、促进肿瘤细胞的增殖。临床上直接使用抑制病毒裂解复制的药物可以减少KS的发生。但是在单独使用抗病毒裂解复制的药物进行临床研究时，也有不少分子活性很低疗效不好。这与化合物抗病毒裂解复制的药效有关系。KS还有血管增生，侵袭性强等特征，如果能同时针对KS的多个特性联合用药，这可能为KS的靶向治疗提供一个新的途径。APE1的氧化还原活性调控下游多个转录因子的活性。这些转录因子分布于KSHV促进疾病发生发展的各个过程。因此APE1的抑制剂能从多个方面同时针对KS的特征靶向治疗KS。
首先，APE1的氧化还原端抑制剂C10可以阻断KSHV的裂解复制。KSHV在裂解复制的过程中首先表达RTA，RTA是病毒即早期基因，RTA的顺利表达才能保证病毒裂解复制的顺利进行。即早期基因RTA的启动子上有AP1转录因子的结合序列。病毒的裂解周期顺利进行依赖于RTA的表达。MAPK信号通路下游AP1的转录因子的活性，病毒AP1的活性与RTA的表达直接相关。APE1通过控制AP1转录因子的活性来调控病毒裂解生命周期的顺利进行。
其次，C10化合物和C10的类似物还可以高效抑制KSHV诱导的血管增生。阻断肿瘤部位的营养供给，改善肿瘤处的微环境。在细胞模型中，KSHV 感染口腔间充质干细胞以后可以诱导细胞向血管内皮细胞分化，增加细胞的成血管能力，还可以通过促进口腔间充质干细胞分泌成血管增长因子，通过旁分泌诱导血管新生。使用APE1的氧化还原端抑制剂C10化合物处理KSHV感染的口腔间充质干细胞以后，可以阻断KSHV诱导的血管新生，阻断KSHV通过旁分泌诱导的血管新生，阻断促血管生长因子VEGF,IL-6，IL-8的分泌。这将有利于该化合物在临床上使用时，改善KS局部异常增生的血管特征，改善局部出血管生成的微环境。从而抑制KS肿瘤的进程。
C10化合物还可以通过抑制APE1的氧化还原端功能影响KSHV促进的细胞的侵袭能力。肿瘤细胞的侵袭能力与肿瘤的转移密切相关，使用C10化合物处理APE1以后，可以阻断KSHV感染促进的细胞的侵袭能力。这可能与APE1促进VEGF的分泌有关，VEGF细胞因子能促进细胞的侵袭能力。
因此使用C10化合物和C10的结构类似物可以高效抑制KSHV裂解复制的同时还可以特异性阻断KS发生过程中诱导微环境内的细胞成管和侵袭能力增强，比起单纯的使用抗病毒裂解复制的化合物用于治疗KS，C10和C10的类似物具有很多优势。
2.治疗EBV引起的相关疾病：
在95％以上的成人中EBV均为阳性感染，但常表现为潜伏感染并不产生症状。当宿主的免疫力下降时，EBV可以导致多种疾病的发生，如：传染性单核细胞增多症、AIDS相关的淋巴瘤、移植性的淋巴细胞增殖病、霍奇金淋巴瘤、伯基利淋巴瘤、还有地方性的鼻咽癌等等。
EBV导致的鼻咽癌在广东地区高发，目前的治疗方式采用传统的放疗化疗为主，此类方法副作用大，治标不治本还易导致疾病的复发。针对鼻咽癌处紊乱的炎症因子，高抗氧化性等特性，使用APE1的氧化还原端抑制剂能直接抑制鼻咽癌的诱因EBV的裂解复制，还可以改善鼻咽癌并病患处的肿瘤微环境与其他抗肿瘤药物共同使用有很好的应用前景。
3.治疗膀胱癌，胰腺癌，神经胶质瘤等恶性肿瘤。
APE1在这些恶性肿瘤中表达量很高。其原因可能如下：1)肿瘤处细胞处于高频分裂状态，单位时间内能产生更多的DNA突变，因此上调的DNA修复蛋白有助于肿瘤细胞的生存。2)肿瘤部位低氧的微环境能减少细胞有氧呼吸诱导的超氧离子的产生，减少超氧离子对肿瘤细胞的DNA造成损伤，减少肿瘤细胞的凋亡，维持肿瘤细胞的生存。APE1的氧化还原端调控低氧诱导的转录因子HIF-1a的活性，促进基因在低氧条件下的正常表达对于肿瘤细胞的正常生长至关重要。3)肿瘤处丰富的血管增生为肿瘤的生长提供营养。APE1可以促进VEGF等血管增长因子的分泌，调控血管的增生，维持肿瘤的生长。因此，使用APE1的氧化还原端抑制剂能从多个方面同时阻断肿瘤的生长，从而达到治疗肿瘤的目的。
4.治疗血管增生性疾病。
血管的增生表面上能为组织部位带来营养物质，但是异常的血管增生通常会导致一些列的疾病。如视网膜底部的血管增生会导致黄斑性病变，是目前老年人失明的首要原因。由于眼部的血管量少，常规的口服给药或者注射给药的血药浓度在眼部常不能维持有效的起效浓度而导致药物疗效差等。如常规的VEGF拮抗剂通过注射给药往往疗效差或者疗效时间短，给药方式不如小分子抑制剂那么形式多变。细胞水平和动物水平实验表明APE1的抑制剂对于黄斑性病变的动物模型疗效很好。因此C10和C10的结构类似物可以通过抑制APE1的氧化还原端功能来抑制黄斑性病变这类的血管异常增生的疾病。
附图说明
图1为C10与APE1蛋白的相互作用图：
A.DSF检测化合物与APE1相互作用图；B.CD检测化合物与APE1相互作用图；C.SPR检测化合物与APE1的亲和常数图。
图2为C10和E3330抑制APE1氧化还原端的活性图：
A.C10抑制APE1氧化还原端的活性图；B.E3330抑制APE1氧化还 原端的活性图。
图3中的左图为APE1C端DNA修复作用模式图；右图为C10不抑制APE1的DNA修复端活性图。
图4为C10和E3330抑制KSHV裂解复制活性比较图；
A.C10抑制KSHV的裂解复制活性图；B.E3330抑制KSHV的裂解复制活性图；C.C10抑制细胞内转录因子AP-1的活性图；D.E3330抑制细胞内转录因子AP-1的活性图。
图5为C10和E3330抑制KSHV诱导的细胞成血管能力比较图；
A.C10与E3330抑制KSHV诱导的细胞成血管能力比较图；B.C10与E3330抑制KSHV旁分泌诱导细胞成血管能力比较图；C.C10抑制小鼠体内KSHV-PDLSC的成管能力图。
图6为C10和E3330抑制KSHV-PDLSC诱导分泌的细胞因子能力比较图；
A.C10抑制KSHV-PDLSC分泌VEGF-A，IL-6，IL-8；B.E3330抑制KSHV-PDLSC分泌VEGF-A，IL-6，IL-8。
图7为C10抑制KSHV诱导的细胞侵袭能力图；
A.KSHV促进PDLSC的侵袭能力图；B.KSHV通过旁分泌促进PDLSC的侵袭能力图；C.敲除APE1后抑制KSHV-PDLSC侵袭能力图；D.敲除APE1后抑制KSHV-PDLSC旁分泌诱导的侵袭能力图；E.C10抑制KSHV-PDLSC的侵袭能力图。
图8为C10抑制骨肉瘤细胞的增殖图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
1.C10与APE1的相互作用
本发明人使用计算机虚拟筛选了广东小分子化合物库，找到与现有APE1抑制剂结构完全不同的小分子C10。E3330是现在公认的APE1抑制剂。我们在具体实施过程中均以C10与E3330互相比较进行。首先，我们在体外水平 评价了小分子化合物C10和与APE1的相互作用。C10能使APE1的熔解温度下降1.3度，相比E3330使APE1的熔解温度下降1度，C10能使APE1的蛋白结构不稳定(图1A)。C10在10μM的药物浓度即可使APE1蛋白产生偏转光，而E3330在500mM(图1B)。C10与APE1的亲和常数为170nM，E3330位1.63μM(图1C)。以上证据表明，通过差异热量扫描法(DSF)，圆二色谱(CD)和表面等离子共振(SPR)的方式，本发明人不仅验证了C10能与APE1相互作用，且C10相比E3330能与APE1更好的结合。
差异热量扫描法(DSF)
将纯化的APE1蛋白稀释为2μM，并与不同浓度的C10在37℃下孵育30min。将荧光染料SYPRO orange加入到蛋白溶液中。用Lightcycler 480进行扫描，以25-95℃min-1运行。运用
Figure PCTCN2018074656-appb-000005
480软件绘制熔融曲线，并获得每个浓度下的Tm值。从而实时分析C10与APE1的相互作用
圆二色谱(CD)
通过圆二色仪，获得在225-260nm间隔内的远紫外光圆二色光谱图。在含有10mM磷酸盐缓冲液的0.1cm厚度比色皿中，5μM的APE1分别与10μM的C10发生反应。在20-90℃范围内，检测230nm处的热变性曲线。从而检测加入药物干扰前后APE1蛋白的偏转光谱发生变化的情况。
表面等离子共振(SPR)
通过ProteOn XPR36 TM SPR装置分析APE1和C10的相互作用。溶解于醋酸钠缓冲液的APE1被固定于EDAC/Sulfo-NHS激活的GLH生物传感器芯片通道L1并用1M乙醇胺阻断其表面。APE1最终固定的水平为12,000RU。用EDAC/Sulfo-NHS激活GLH生物传感器芯片通道L2并用1M乙醇胺阻断。溶于PBST的化合物以20ml/min持续240s输入通道，以0.85％H 3PO 4和runing buffer修复芯片表面。在各个动力学研究中，以6个浓度研究C10与APE1的相互作用。采用ProtedOn ManagerTM 2.0收集化合物的浓度数据。采用1:1朗缪尔结合模型分析每个传感器来获得动力学速率常数(Kon和Koff)。通过每个反应，获得 动力学速率常数(ka和kd)，再计算平衡解离常数KD＝kd/ka。从而获得化合物与APE1相互作用的亲和常数。
2.C10是APE1氧化还原端的特异性抑制剂，不影响DNA修复端的活性
验证了C10能与APE1结合后，本发明人分别在体外分子水平评价了C10对APE1C端和N端的活性。通过APE1可以增加AP-1转录因子的DNA结合活性的原理。人工合成一段带有荧光标记的AP-1DNA序列，使用EMSA实验发现，AP-1结合DNA后，能与DNA形成更大的分子复合物通过凝胶电泳可以区分未结合的DNA和AP-1结合的DNA，从而判断AP-1的活性，间接反应APE1的氧化还原活性。C10相比E3330能在更低的浓度抑制APE1还原AP-1(如图2)。APE1的DNA修复作用模式图(如图3左)。APE1切割DNA底物以后，通过凝胶电泳可以区分18Mer和40Mer的条带从而反应APE1的切割效率。C10并不影响APE1的DNA切割1(如图3右)，因此化合物C10是APE1氧化还原端的特异性抑制剂。
E.coli中表达纯化APE1和AP-1(c-jun and c-fos)
APE1和c-fos的cDNA被克隆到N端带有His标签的pET-28a载体，c-jun被克隆到带有GST标签的pGEX-4T-1载体。各质粒分别被转入Roseta E.coli，置于LB培养基中培养，等到菌密度OD值达到0.6时，再用1mM IPTG进行诱导。转入APE-1的E.coli在37℃下培养4h，转有c-jun和c-fos的E.coli在25℃下培养4h。用带有PMSF的裂解液裂解菌液。用Ni2+-NTA-resin来纯化带His标签的APE-1和c-fos，在用含咪唑的buffer进行洗脱。用谷胱甘肽的磁珠纯化带GST标签的c-jun，并用含低浓度的谷胱甘肽buffer洗脱。利用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化蛋白的浓度。
APE1的N端活性检测
使用原核表达的蛋白，首先将APE1用0.25mM DTT处理过夜使其处于还原态，其次将在EMSA结合缓冲液中将AP-1与APE1在37度孵育20min，此过程期间加入不同浓度的药物处理，之后加入AP-1的DNA底物序列37度继续孵育 30分钟。TBE-PAGE胶电泳，使用Odessy仪器检测DNA的荧光信号。
APE1的C端活性检测
体外合成一段含有突变位点的DNA序列，首先使用UDG酶对错配的碱基进行处理，暴露AP位点(APE-1C端具有核酸内切酶的特征，能够识别AP位点，进行切割)。再用APE-1酶进行处理，同时加入不用药物梯度的APE-1抑制剂。通过PAGE胶电泳，评估切割效率，推算APE-1抑制剂对APE-1C端活性的影响。
3.对比C10与E3330的多种细胞活性
1)KSHV裂解复制抑制活性测定(细胞内裂解复制，胞外病毒颗粒的释放和细胞毒性检测)
之后我们在细胞学水平对比了C10和E3330的活性。首先我们检测了C10和E3330对KSHV裂解复制的影响。BCBL-1(KSHV阳性细胞)使用20ng/ml Tetradecanoyl phorbol acetate(TPA)诱导3小时后，对细胞进行不同浓度的化合物(上述化合物)处理，每个浓度设3个平行复孔，并设不进行TPA诱导和不经化合物处理的对照组进行比较。药物诱导2天后检测病毒在细胞内裂解复制的情况。药物诱导5天后检测完整病毒颗粒释放到体外的情况(如图4A，B)。此外，我们还检测了细胞内C10和E3330抑制AP-1的结合能力实验，结果显示C10比E3330更能有效抑制细胞内AP-1的DNA结合活性(如图4C，D)，其中AP-1为细胞内KSHV进行病毒裂解复制所必须。
细胞内裂解复制检测方法
细胞经诱导2天后收集细胞，提取细胞总DNA。应用实时定量PCR技术，分别检测上述细胞总DNA中LANA和GAPDH的拷贝数，并计算LANA/GAPDH的相对比值来评估细胞内KSHV病毒DNA的相对复制情况。按照公式：KSHV裂解复制相对抑制数＝(LANA/GAPDH TPA+&compound+－LANA/GAPDH TPA-&compound+)/(LANA/GAPDHTPA +&compound-－LANA/GAPDH TPA-&compound-)计算各化合物在不同浓度下的KSHV裂解复制相 对抑制数。以病毒的相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对病毒裂解复制的抑制曲线图，并计算各药物复制的半数抑制剂量(IC 50)以评价各化合物对病毒裂解复制的抑制活性。
细胞外裂解复制检测方法
细胞经TPA诱导处理5天后，收集细胞培养液1,000rpm离心5min，弃除细胞沉淀。上清经0.45uM滤膜过滤后，再次100,000g离心1h，弃除上清，使用200ul PBS重悬病毒颗粒。使用DNase I在37℃处理浓缩病毒液1小时，去除病毒颗粒外的杂质DNA分子。随后用蛋白酶K和裂解病毒颗粒的裂解液处理病毒浓缩液，并用酚氯仿法抽提KSHV病毒的DNA。提取得到的病毒DNA经冰乙醇沉淀后，最终使用50ul TE缓冲液溶解。应用实时定量PCR技术，LANA引物检测细胞培养液上清中的病毒DNA拷贝数，以评价疱疹病毒的产毒水平。按照公式：KSHV产毒相对抑制数＝(LANA TPA+&compound+－LANA TPA+&compound-)/(LANA TPA+&compound-－LANA TPA-&compound-)EBV产毒相对抑制数＝(EBNA-1 TPA+&compound+－EBNA-1 TPA+&compound-)/(EBNA-1 TPA+&compound-－EBNA-1 TPA-&compound-)计算各化合物不同浓度下的KSHV的相对产毒抑制数。以产毒相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对产毒的抑制曲线图，并计算各化合物的产毒半数抑制剂量(EC 50)以评价各化合物对疱疹病毒颗粒释放的抑制活性。
细胞毒性测定
调整BCBL-1细胞密度为3×10 5cells/ml，使用不同浓度各化合物处理细胞，每个浓度设3个平行复孔，2天后使用台盼蓝染色，光镜下计数活细胞数。结果处理。按照公式：相对毒性＝1－live cell compound+/live cell compound-计算各化合物不同浓度下的相对毒性和半数致死剂量(CC 50)，用于评价各化合物的细胞毒性。另按照公式：选择抑制常数(SI)＝CC 50/EC 50计算各化合物的选择抑制常数，以评价各化合物的用药安全性。
2)KSHV-PDLSC的成管实验及药物对成管能力的药效学测定
肿瘤组织处丰富的血管增生，肿瘤细胞强的细胞侵袭能力以及肿瘤微环境中血管生成因子和炎症因子对于肿瘤的发生发展，恶性转化转移至关重要。KSHV是一种致肿瘤病毒，KSHV感染PDLSC以后可以显著提高PDLSC的细胞成血管能力和细胞侵袭能力以及分泌细胞因子的能力。病毒诱导的这些细胞活性对于KSHV促进KS的发生至关重要。我们运用KSHV感染PDLSC这一模型，来评价小分子化合物用来治疗KS及其他肿瘤的潜力。
实验结果显示，C10在1μM即可高效抑制KSHV感染PDLSC所诱导的成血管活性。E3330需要至少50μM才能基本达到类似的效果(图5A)。此外，C10处理后的KSHV-PDLSC的条件培养基相比于KSHV-PDLSC的条件培养对PDLSC的成血管诱导能力减弱(图5B)，说明C10可以影响KSHV-PDLSC通过分泌细胞因子来影响微环境中细胞的成血管。我们还直接在动物上对C10抑制KSHV诱导的成管进行了评估，动物实验表明，C10可以高效抑制KSHV-PDLSC的在体内的成血管(图5C)。由于肿瘤微环境中存在大量适合肿瘤生长的细胞因子和趋化因子，因此我们直接评价了C10和E3330影响KSHV-PDLSC的释放细胞因子的能力，结果表明C10可以阻断VEGF，IL-6，IL-8等细胞因子的分泌，C10抑制KSHV-PDLSC释放细胞因子的能力比E3330好(图6A，B)。AIDS-KS常常表现出扩散性强等特征，使用KSHV感染PDLSC以后发现KSHV-PDLSC的侵袭能力明显增加(图7A，B)，基因敲除APE1以后可以抑制KSHV促进的细胞侵袭能力(图7C，D)。使用C10处理KSHV-PDLSC以后细胞的侵袭能力明显下降(图7E)。我们在骨肉瘤细胞系上用C10进行了处理，发现C10在1μM可以抑制骨肉瘤细胞系的增值(图8)。综上所述，我们发现了一个全新结构的APE1的抑制剂C10，C10有潜力成为一个治疗KS的有效小分子化合物。
KSHV病毒的准备
使用iSLK.219细胞系(KSHV.219潜伏感染的细胞系)，使用DOX和丁酸钠盐使得iSLK.219中潜伏感染的病毒进入裂解复制。第五天收集诱导细胞上 清，使用0.45uM的滤膜对上清进行过滤，去除掉细胞碎片。10000g超速离心1小时以后，弃上清使用PBS重悬病毒颗粒，将其冻存与-80度备用。
KSHV病毒的感染
使用预先准备好的KSHV病毒感染PDLSC，KSHV以MOI＝20感染PSLDC，病毒加入细胞培养液后，添加终浓度为5ug/ml的polybrene，增加病毒的感染效率，2500rpm离心60分钟后换液。
成血管实验方法
预先将基质胶铺与48孔板中，37度凝固1小时以后，将KSHV-PDLSC和PDLSC以相同的细胞数种与基质胶上，4-8小时后根据二者之间的实际成管情况使用显微镜拍照记录。如需测定化合物对KSHV诱导的成管能力的影响，则在成管过程中添加相应浓度的化合物，观察有无化合物时对KSHV诱导的成管能力的影响。
侵袭能力的评价
利用Transwell系统，预先将基质胶平铺与Transwell小室中，细胞用无血清的培养基接种于上室中，下层小室用含有10％-20％FBS的培养基造成浓度梯度差。16h-24h后，使用结晶紫对侵袭到下层的细胞进行染色。
KSHV-PDLSC的条件培养基诱导PDLSC的成血管实验
KSHV感染PDLSC以后，分别收集KSHV-PDLSC和PDLSC的条件培养基。将基质胶预先铺与48孔板，37度凝固一小时后，将收集得到的KSHV-PDLSC和PDLSC的条件培养基分别重悬相同数量的PDLSC，观察PDLSC在二者条件培养基中的成管能力变化。
检测药物对KSHV-PDLSC旁分泌调控的成管实验
KSHV-PDLSC和PDLSC分别运用C10或者E3330处理24h，弃掉上层含药物的培养基，使用PBS洗一遍，换上低血请的正常培养基，重新收集24小时的条件培养基。按条件培养基对PDLSC成管能力影响的实验操作，评价药物处理后的条件培养基与未处理组的条件培养基对PDLSC成管能力的影响。
ELISA检测细胞因子的分泌实验
KSHV-PDLSC用药物处理24h后撤去含有药物的培养基，换成新的低血清培养基继续培养细胞24h后，收集上清，运用ELISA试剂盒检测不同药物浓度处理后的细胞其细胞因子分泌水平的变化。
体内基质胶成血管实验
将形同数量的，5-10X10^7个PDLSC或者KSHV-PDLSC与500μl的基质胶混匀后注射入小鼠的腹股沟处。7天收取出小鼠体内的基质胶观察基质胶内血管的形成情况。可以在基质胶内混匀相应浓度的药物观察药物在体内对KSHV诱导的成管的影响。
C10抑制骨肉瘤，鼻咽癌细胞增殖的实验
将骨肉瘤细胞或者鼻咽癌细胞谱与96孔板中，加入相应浓度的药物，待C10或者其类似物处理了细胞48h后，弃去上清换上无血清的培养基加入MTT，37度孵育4h，随后再次弃去上清加入150ulDMSO溶解有色沉淀，590nm处检测有色物的吸光度来评价活细胞的数量从而检测药物抑制肿瘤细胞增殖的影响。
上述为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述内容的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

  1. 一种APE1抑制剂，其特征在于：该APE1抑制剂具有如下式1所示的结构：
    Figure PCTCN2018074656-appb-100001
  2. 根据权利要求1所述的一种APE1抑制剂，其特征在于：该APE1抑制剂具有如下式2所示的结构：
    Figure PCTCN2018074656-appb-100002
    其中R 1与R 2分别为五元环、六元环或者苯并联化合物，五元环为呋喃、噻吩、吡咯、噻唑或咪唑，六元环为吡啶、吡嗪、嘧啶或哒嗪，苯并联化合物为吲哚或异吲哚类化合物。
  3. 根据权利要求2所述的一种APE1抑制剂，其特征在于：所述R 1与R 2分别为环己基或取代的环己基。
  4. 根据权利要求1所述的一种APE1抑制剂，其特征在于：该APE1抑制剂具有如下式3所示的结构：
    Figure PCTCN2018074656-appb-100003
    其中R为C、N、S或O元素；R 1、R 2、R 3、R 4、R 5或R 6分别为氢，或各种饱和或者不饱和、含环或者不含环、环上有取代基或者无取代基的烷基化合物。
  5. 根据权利要求1所述的一种APE1抑制剂，其特征在于：该APE1抑制剂具有如下式4所示的结构：
    Figure PCTCN2018074656-appb-100004
    其中R为C、N、S或O元素；R 1、R 2、R 3、R 4、R 5或R 6分别为氢，或各种饱和或者不饱和、含环或者不含环、环上有取代基或者无取代基的烷基化合物。
  6. 根据权利要求1所述的一种APE1抑制剂在制备用于治疗依赖APE1氧化还原端功能的相关性疾病药物中的应用。
  7. 根据权利要求1所述的一种APE1抑制剂在制备用于治疗肿瘤和血管异常增生性疾病药物中的应用。
  8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括卡波氏肉瘤、鼻咽癌或宫颈癌。
  9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、卵巢癌或乳腺癌。
  10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述血管异常增生性疾病包括老年黄斑病变。
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