WO2018155969A1 - 배위적으로 불포화된 자리에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 포함하는 산화반응용 촉매 및 이의 용도 - Google Patents

배위적으로 불포화된 자리에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 포함하는 산화반응용 촉매 및 이의 용도 Download PDF

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peroxidase
amine
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조경호
황영규
황동원
장종산
이우황
홍도영
이수경
발레카아닐하리바우
사히브레바툴레바그완
박현규
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한국화학연구원
한국과학기술원
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    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03017—Choline oxidase (1.1.3.17)
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    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01007—Acetylcholinesterase (3.1.1.7)

Definitions

  • the present invention provides a catalyst for oxidation reaction using a peroxide comprising an iron-containing porous organic-inorganic hybrid having an amine introduced at a coordinatively unsaturated site (CUS) as an active ingredient, hydrogen peroxide and choline containing the catalyst. And it relates to a composition for detecting acetylcholine, and a composition for diagnosing cerebral neurological disease comprising the composition.
  • a peroxide comprising an iron-containing porous organic-inorganic hybrid having an amine introduced at a coordinatively unsaturated site (CUS) as an active ingredient, hydrogen peroxide and choline containing the catalyst.
  • CCS coordinatively unsaturated site
  • HRP Horseradish peroxidase
  • metal oxides having redox properties such as Fe 3 O 4 , Pt, Co 3 O 4 , CeO 2 in the form of nanoparticles, carbon nanodots, and graphene oxides in the modified form.
  • single-wall carbon nanotubes have been researched and developed. Although these materials have improved stability compared to HRP, the manufacturing method has the disadvantages of complexity, high cost, and low activity compared to HRB.
  • MOF metal-organic framework
  • the present inventors have attempted to find a catalyst having improved peroxidase mimic activity by modifying a porous organic-inorganic hybrid containing metal.
  • the catalyst which introduced amine on CUS through post-treatment process to MIL-100 (Fe), an iron-containing porous organic-inorganic hybrid capable of hydrothermal stability and mass synthesis, was based on the significantly improved stability compared to HRP.
  • the present invention was completed by confirming that it can detect trace amounts of hydrogen peroxide, choline and acetylcholine with not only its activity over a wide temperature and pH range but also with significantly improved activity.
  • One object of the present invention is to provide a catalyst for oxidation reaction using a peroxide comprising an iron-containing porous organic-inorganic hybrid having an amine introduced at a coordinatively unsaturated site (CUS) as an active ingredient.
  • a peroxide comprising an iron-containing porous organic-inorganic hybrid having an amine introduced at a coordinatively unsaturated site (CUS) as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is the catalyst; And it provides a composition for detecting hydrogen peroxide, comprising a substrate oxidized by a peroxidase.
  • Another object of the present invention is the catalyst; Substrates oxidized by peroxidase; And choline oxidase (cholineoxidase), to provide a composition for choline detection.
  • Another object of the present invention is the catalyst; Substrates oxidized by peroxidase; Cholineoxidase; And acetylcholinesterase (acetylcholinesterase), to provide a composition for detecting acetylcholine.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cerebral neurological disease, which is related to the secretion of choline or acetylcholine, including the composition.
  • the catalyst of the present invention is prepared by introducing an amine through a simple post-treatment process based on a porous organic-inorganic hybrid, in order to simulate the activity of a peroxidase, an enzyme that catalyzes a protein-based oxidation reaction. As such, it can exhibit catalytic activity over a wider temperature and / or pH range based on significantly increased stability.
  • amines introduced into a coordinatively unsaturated site (CUS) facilitate the access of the substrate to the active site of the catalyst by controlling the pore size and changing the surface charge, resulting in significantly improved catalytic activity. It is characteristic to show.
  • choline or acetylcholine which generates hydrogen peroxide by the action of enzymes, can be detected with high sensitivity, and thus can be usefully used for diagnosing cerebral neurological diseases caused by changes in its expression.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the grafting of amines at coordination unsaturated sites of MIL-100 (Fe) according to one embodiment of the invention.
  • Figure 2 is a view showing the characterization results of the amine introduced MIL-100 (Fe) and untreated MIL-100 (Fe) according to the present invention. a) shows the XRD pattern, b) shows N 2 physisorption at 77K, and c) shows pore size distribution by DFT analysis.
  • FIG. 3 is a diagram showing an XRD pattern of MIL-127 (Fe) according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating N 2 physical adsorption at 77K of MIL-127 (Fe) according to the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of FT-IR spectra and b) XPS analysis (N1s) of a) 423K of amine-incorporated MIL-100 (Fe) and untreated MIL-100 (Fe) according to the present invention.
  • 1 to 4 represent untreated MIL-100 (Fe), ethylenediamine (ED), N, N'-dimethyl-1,3-propanediamine (N, N'-dimethyl-1,3-propanediamine; DMPDA, respectively).
  • N-N, N ', N'-tetramethyl-1,4-butanediamine N, N, N', N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA
  • MIL-100 Fe
  • Figure 6 is a diagram showing the comparison of the peroxidase-simulated activity on the TMB substrate of the amine-introduced MIL-100 (Fe) and untreated MIL-100 (Fe) according to the present invention by absorbance measurement.
  • 1 and 2 are spectra of TMB alone, TMB and H 2 O 2 mixtures, respectively, and 3 to 6 are MIL-100 (Fe) and untreated MIL-100 (with TMBDA, DMPDA and ED introduced into the TMB and hydrogen peroxide mixtures, respectively).
  • Each solution was selectively mixed with 1 mM H 2 O 2 , 0.2 mg / mL MOF, and 1 mM TMB in 5 mM Tris Acetate buffer at pH 4 for 20 minutes at 40 ° C., and then absorbed at 350 to 700 nm. Measured.
  • FIG. 7 is a diagram showing a comparison of the peroxidase-simulated activity on the TMB substrates of various amine-incorporated MIL-100 (Fe) and untreated MIL-100 (Fe) according to the present invention.
  • 1 to 5 are the results for MIL-100 (Fe) introduced untreated MIL-100 (Fe) as MOF and ED, DMPDA, TMBDA, 1,8-octanediamine (ODA) as amine, respectively Indicates.
  • TMBDA-MIL-100 (Fe) is a diagram showing the peroxidase-like activity on the AUR substrate of MIL-100 (Fe) (TMBDA-MIL-100 (Fe)) to which TMBDA was introduced according to the present invention.
  • 5 mM Tris Acetate buffer (pH 7), 1 mM H 2 O 2 , 0.2 mg / mL MOF, 50 ⁇ M AUR were mixed in a combination of the compositions described for 20 minutes at 25 ° C. and then in the range of 450-600 nm. Absorbance was measured.
  • FIG. 9 is a diagram showing the peroxidase-like activity according to a) temperature, b) pH, c) MOF concentration, and d) buffer concentration of TMBDA-MIL-100 (Fe) according to the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing reproducibility for repeated use at optimized reaction parameters of TMBDA-MIL-100 (Fe), MOF concentration 0.2 mg / mL, temperature 60 ° C. and pH 7 according to the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of reaction conditions on the overall reaction in the presence of choline.
  • the reaction mixture was prepared in tris acetate buffer (5 mM, pH 7) with cholineoxidase (ChOx, 0.5 U / mL), TMBDA-MIL-100 (Fe) (0.2 mg / mL), choline (1 ⁇ M) and AUR. (50 ⁇ M) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, followed by excitation at 540 nm and fluorescence at 588 nm.
  • ChOx cholineoxidase
  • TMBDA-MIL-100 Fe
  • AUR. 50 ⁇ M
  • Figure 13 shows the effect of a) ChOx concentration, b) TMBDA-MIL-100 (Fe) concentration, c) temperature, and d) pH on the catalytic activity of TMBDA-MIL-100 (Fe) according to the present invention It is also.
  • Figure b shows the effect of b) temperature and c) pH on catalytic activity.
  • the present invention provides an oxidation reaction using a peroxide comprising an iron-containing porous organic-inorganic hybrid in which an amine is introduced into a coordinatively unsaturated site (CUS) as an active ingredient.
  • a peroxide comprising an iron-containing porous organic-inorganic hybrid in which an amine is introduced into a coordinatively unsaturated site (CUS) as an active ingredient.
  • CVS coordinatively unsaturated site
  • the present invention exhibits excellent catalytic activity of peroxidase by introducing a porous organic-inorganic hybrid in which amine is introduced into CUS by a simple post-treatment method in which an iron-containing porous organic-inorganic hybrid is dispersed in a solvent, and an amine compound is added thereto and stirred.
  • the catalyst based on the porous organic-inorganic hybrid according to the present invention can detect hydrogen peroxide up to 0.3 ppm level, and when choline oxidase and optionally acetylcholinesterase are further included, choline and acetylcholine from 0.02 to As it can detect up to 0.03 ppm level, it can be used as a sensitive biosensor for their detection, and further suggest that it can be useful for the diagnosis of neurological diseases, diseases related to these substances.
  • the amine may be an alkylenediamine derivative having 2 to 10 carbon atoms, and may include, without limitation, primary amine, secondary amine and tertiary amine.
  • amines having more than 10 carbon atoms are difficult to enter into the pores due to the increased size, it is difficult to introduce into the CUS by the modification after synthesis, or even if introduced into the CUS to cover the neighboring CUS besides the CUS to which they are bound, the introduction rate of the amine compound Lower and thus lower activity.
  • the alkylene diamine derivative having 2 to 10 carbon atoms may be selected from ethylenediamine (ED), N, N'-dimethyl-1,3-propanediamine (N, N'-dimethyl-1,3-propanediamine; DMPDA) , N, N, N ', N'-tetramethyl-1,4-butanediamine (N, N, N', N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA) or 1,8-octanediamine (1 , 8-octanediamine; ODA), but is not limited thereto. More specifically, the alkylene diamine derivative having 2 to 10 carbon atoms may be TMBDA.
  • the catalyst for oxidation reaction of the present invention maintains excellent crystallinity of the porous organic-inorganic hybrid itself even when amine is introduced into the CUS of the iron-containing porous organic-inorganic hybrid, and thus its properties are also maintained.
  • the iron-containing porous organic-inorganic hybrid is MIL-53, MIL-88, MIL-89, MIL-96, MIL- containing iron which is a kind of metal-organic framework (MOF) 100, MIL-101, MIL-102, MIL-126, MIL-127 and its functionalized MOF may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • MOFs which do not contain unsaturated metal sites by themselves, but which are modified to allow amines to be introduced at the sites by forming a defect in the MOF crystals by chemical treatment or heat treatment such as an acid or a base are also limited to the scope of the present invention. Included without.
  • an amine compound having a pore of a predetermined size so that alkylene diamine having 2 to 10 carbon atoms can enter and exit, and includes a CUS to which the amine compound can bind can be used without limitation.
  • MOFs may be treated with acids or bases to form defects in the MOF crystals:
  • MOFs usable in the present invention are shown in Table A below.
  • X is as defined above. These compounds may be purchased and used commercially, or may be synthesized and used by the methods described in the following references or as appropriately modified:
  • the oxidation catalyst of the present invention confirmed that the negative potential of the surface was increased by introducing an amine into the CUS of the iron-containing porous organic-inorganic hybrid, and the increased negative charge on the particles was positively charged through the electrostatic attraction. It can have a higher binding force with the substrate.
  • the zeta potential has a more negative value when various amine compounds are introduced into the iron-containing porous organic-inorganic hybrid.
  • This property can be beneficial to induce positively charged substrates to be adjacent to catalytically active sites through electrostatic attraction. That is, the catalyst for oxidation reaction of the present invention is more negatively charged by the amine introduced therein, and thus can exhibit more efficient catalytic activity based on the improved binding to the substrate.
  • the catalyst may exhibit a peroxidase mimic activity.
  • the catalyst can carry out catalytic oxidation of the substrate, which is oxidized by peroxidase in the presence of hydrogen peroxide.
  • the catalyst for oxidation reaction of the present invention shows only a small decrease in activity even after repeated use, but still shows excellent catalytic activity, and can be recovered and recycled in a simple process by centrifugation. Furthermore, this slight decrease in activity is believed to be due to the loss due to incomplete recovery of the catalyst in the process of centrifugation of the highly diluted solution. This was confirmed from the fact that the structure of the catalyst remained unchanged even after recycling, as shown by the SEM analysis result.
  • the present invention is a catalyst; And it provides a composition for detecting hydrogen peroxide, comprising a substrate oxidized by a peroxidase.
  • the presence of hydrogen peroxide can be detected with a low detection limit of 0.3 ppm.
  • the bar (10) at 588 nm from the oxidation to the concentration of H 2 O 2 at a low concentration of up to 30 ppm substrate hayeotneun sure showing the relationship between the fluorescence intensity is directly proportional, in the range of concentrations of H 2 O 2 Qualitative as well as quantitative analysis can be performed.
  • a pH 4 to 12 buffer may be further included to provide favorable conditions for the catalytic oxidation of the substrate by H 2 O 2 .
  • a buffer of pH 5 to 9 but is not limited thereto.
  • the buffer may be tris acetate buffer, and the concentration of tris acetate buffer may be about 5 mM, but is not limited thereto.
  • the concentration of tris acetate is less than 2.5 mM or greater than 12.5 mM, the catalytic activity may be relatively reduced in part, but still sensitive H 2 O 2 detection may be possible.
  • the substrate that is oxidized by the peroxidase may be used a material that changes color or generates fluorescence in the oxidation state.
  • the oxidation state changing color and / or fluorescence by using the substrate for generating H 2 O 2 catalytic oxidation reaction of the before / after measuring the absorbance and / or fluorescence spectra can detect H 2 O 2.
  • fluorescence is a sensitive method that can be detected even in a small amount of samples among spectroscopic detection methods, more sensitive detection may be possible when using a substrate that is oxidized to generate fluorescence.
  • the substrate oxidized by the peroxidase is 1- (3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl) ethanone (1- (3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10- yl) ethanone), 10-acetyl-10H-phenoxazine-3,7-diyl diacetate or 3,3 ', 5,5'-tetramethyl Benzidine (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine; TMB) may be used, but is not limited thereto.
  • a product commercially available under the trade names Amplex ® UltraRed or Amplex ® Red which are substrates used in conventional peroxidase activity assays, may be used, but is not limited thereto.
  • 1- (3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl) ethanone (1- (3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl) ethanone)
  • 10-acetyl-10H -Phenoxazine-3,7-diyl diacetate 10-acetyl-10H-phenoxazine-3,7-diyl diacetate
  • resorufin 3H-phenoxazin-3-one
  • Its absorption spectrum shows an additional peak with maximum absorption wavelength at 570 nm as well as a fluorescence spectrum showing maximum intensity at 588 nm, thus the presence of H 2 O 2 which causes the reaction by measuring absorbance or fluorescence and
  • TMB does not fluoresce in the oxidized state, but is almost colorless in solution as it is, but becomes blue when two amine groups are converted to imine groups by catalytic oxidation with H 2 O 2 , and in the visible light region thereof.
  • the absorption spectrum of has a maximum absorption peak at 650 nm. Therefore, the presence and / or content of H 2 O 2 can be confirmed by measuring the change in absorbance at the corresponding wavelength.
  • the present invention is the catalyst; Substrates oxidized by peroxidase; And choline oxidase (cholineoxidase), provides a composition for detecting choline.
  • the choline is a kind of vitamin B, involved in brain development, muscle movement and body metabolism. It is also a precursor of acetylcholine, an important neurotransmitter in the peripheral nervous system. Despite being produced in the human body, dietary supplementation is required to maintain proper function. Thus, choline is widely added to foods such as milk and dietary supplements. Lack of choline in the body leads to diseases such as neural tube defects, Alzheimer's disease and fatty liver disease. Therefore, it is important to keep choline in the body at an appropriate level and there is a need for an effective detection method thereof.
  • the choline detection composition of the present invention can be used to diagnose diseases such as diseases related to the amount of choline in the body, such as neural tube defects, Alzheimer's disease and fatty liver disease. Furthermore, it may be used to detect choline in food and to determine its content.
  • the presence of choline can be detected with a detection limit of 0.025 ppm.
  • concentration of choline and the fluorescence intensity at 588 nm from the oxidized substrate were not only directly proportional to the concentration of choline at a low concentration of 10 ppm or less, but were also detectable at a recovery rate of 100% with a relative error rate of less than 1%.
  • qualitative analysis of choline may be performed in the concentration range as well as quantitative analysis.
  • the present invention is the catalyst; Substrates oxidized by peroxidase; Cholineoxidase; And acetylcholinesterase (acetylcholinesterase), to provide a composition for detecting acetylcholine.
  • the acetylcholine plays an important role in both the peripheral nervous system and the central nervous system. It is involved in brain functions such as alertness, learning and memory. Decreased acetylcholine levels have been identified in patients with neurological diseases such as Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease, schizophrenia and progressive dementia. In order to diagnose and treat these diseases early, the determination of acetylcholine in biological samples such as blood and nerve cells is very important.
  • AD Alzheimer's disease
  • Parkinson's disease Parkinson's disease
  • schizophrenia and progressive dementia progressive dementia
  • the presence of acetylcholine can be detected with a detection limit of 0.035 ppm.
  • concentration of acetylcholine and the fluorescence intensity at 588 nm from the oxidized substrate at a low concentration of less than 10 ppm shows a direct relationship (Fig. 16), qualitative analysis of acetylcholine in the concentration range Even quantitative analysis can be performed.
  • the choline or acetylcholine detection composition of the present invention may be used as a substrate to change the color or fluorescence in the oxidation state for the convenience of detection.
  • Examples of specific usable substrates and methods of detection are as described above.
  • the present invention provides a method for detecting H 2 O 2 , choline and acetylcholine.
  • the detection method reacting the sample by mixing with the H 2 O 2 detection composition, choline detection composition and acetylcholine detection composition, respectively and observe the color of the reaction solution It may include the step.
  • the compositions include a substance that changes color or fluoresces in an oxidized state as a substrate, and the composition reacts with H 2 O 2 , choline and acetylcholine, respectively, to be detected in a sample. Thereby forming a substrate in an oxidized state, which can be identified by color change.
  • the color change can be visually observed to confirm the presence of a substance to be detected.
  • the absorbance and / or fluorescence spectrum of the reaction solution may be measured to quantify the presence of the substance to be detected as well as the content thereof.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cranial nerve disease, comprising the composition.
  • compositions of the present invention include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, multiple sclerosis, MS, amyotrophic sclerosis Lateral sclerosis; ALS, aka Lou Gehrig's disease, Pick disease, Creutzfeld-Jakob disease (CJD), schizophrenia, progressive dementia, stroke Or apoplexy, palsy, and dementia, but is not limited thereto.
  • the compositions of the present invention can sensitively detect and / or quantify trace amounts of choline or acetylcholine, and therefore can be used without limitation in the diagnosis of diseases associated with their secretion.
  • most of the above listed neurological diseases are diseases caused by reduced secretion of choline and / or acetylcholine in vivo. Therefore, by using the diagnostic composition of the present invention quantitative choline and / or acetylcholine in a biological sample collected from the suspected onset, and compared with the measured value for the biological sample taken from a normal subject a certain level or more As low as it can be determined that the disease has occurred.
  • the type and measurement method of the substrate can be used as described above.
  • the present invention provides a kit for diagnosing cranial nerve disease, comprising the composition for diagnosing cranial nerve disease.
  • the present invention provides a biosensor for diagnosing cranial nerve disease, comprising the composition for diagnosing cranial nerve disease.
  • the brain neurological disease diagnostic kit and biosensor of the present invention may provide a space for performing a reaction of the brain neurological disease diagnostic composition and a sample to be diagnosed, and may further include a transparent container capable of visual or spectroscopic analysis.
  • the transparent container is not limited to the material as long as it can provide transparency to observe the color change of the solution when the naked eye is to be judged.
  • the transparent container may be a cell of quartz material to be advantageous for sensitive absorbance and fluorescence measurement, but is not limited thereto.
  • Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) solution was obtained from Junsei.
  • Amplex ® UltraRed Reagent (AUR) was obtained from Life Technology. All compounds were used for assay grade without further purification.
  • the aqueous solution was prepared using ultra pure DNase / RNase free distilled water (Invitrogen).
  • MIL-127 (Fe) nanoporous body H 2 O and 112 g of 3,3 ', 5,5'-azobenzenetetracarboxylic acid were added thereto, stirred at room temperature for 30 minutes, and then synthesized at reflux at 130 ° C. for 17 hours.
  • the mixture was filtered and dried several times with distilled water and ethanol to obtain MIL-127 (Fe) powder.
  • Purified MIL-100 (Fe) (1.0 g) obtained from Preparation Example 1 was dehydrated in vacuo at 150 ° C. for 12 hours and suspended in anhydrous toluene (60 mL). 2.5 mmol / g ethylenediamine (ED) was added and the reaction mixture was stirred at reflux for 24 h. After the reaction was completed, the solid was washed thoroughly with water and ethanol to remove unreacted amine compound and solvent from the solid. The solid obtained was dried overnight at 110 ° C. under vacuum. The peroxidase-simulated catalyst activity of the MIL-100 (Fe) (ED-MIL-100 (Fe)) sample functionalized with ED was tested as described above.
  • MIL functionalized with ED by reacting in the same manner as in Example 1, except that purified MIL-127 (Fe) (1.0 g) obtained from Preparation Example 2 was used instead of MIL-100 (Fe).
  • -127 (Fe) (ED-MIL-127 (Fe)) was prepared and its peroxidase-simulated catalytic activity was tested.
  • DMPDA-MIL-100 (Fe) DMPDA-MIL-100 (Fe) sample was synthesized and tested for its peroxidase-simulated catalytic activity.
  • N, N, N ', N'-tetramethyl-1,4-butanediamine N, N, N', N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA
  • TMBDA ethylenediamine
  • TMBDA-MIL-100 (Fe) samples functionalized with TMBDA in the same manner as in Example 1 and tested its peroxidase-simulated catalytic activity.
  • MIL-100 (Fe) ODA-MIL-100 (ODA-MIL-100) functionalized with ODA in the same manner as in Example 1, except that 1,8-octanediamine (ODA) was used instead of ethylenediamine.
  • Fe 1,8-octanediamine
  • the pore size distribution was determined by applying a density functional theory method. Morphological properties of MOFs were studied using scanning electron microscopy (SEM, Tescan Mira 3 LMU FEG with an accelerating voltage of 10 kV). Nitrogen content in amine functionalized MOFs was determined by elemental analysis (EA). FTIR analysis was used to confirm amine introduction on MIL-100 (Fe), compressed into a self-supported wafer to prepare a sample for this, and purging with He overnight at 423 K.
  • X- X-ray photoelectron spectroscopy
  • DLD Kratos Axis Ultra
  • XPS Ray photoelectron spectroscopy
  • Choline analysis was performed using the catalyst of the present invention according to the following single step reaction. Specifically, dissolved in various concentrations of choline (1-200 ⁇ M) and ChOx (0.6 U / mL), TMBDA-MIL-100 (Fe) (0.2 mg / mL) and Tris acetate buffer (5 mL, pH 7) Fluorescence was measured in the range of 570-650 nm for 50 ⁇ L reaction solution containing AUR (50 ⁇ M) and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • acetylcholine analysis was performed using the catalyst of the present invention according to the following single step reaction. Specifically, various concentrations of Ach (1 to 500 ⁇ M) and AChE (5 U / mL), ChOx (0.5 U / mL), TMBDA-MIL-100 (Fe) (0.2 mg / mL) and Tris Acetate buffer (5 Fluorescence was measured in the range of 570 to 650 nm for 50 ⁇ L reaction solution containing AUR (50 ⁇ M) dissolved in mL, pH 7) and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Fluorescence intensity was measured using Tecan Infinite M200 pro microplaters (Mnnedorf, Switzerland) and black, 384-well grenier Bio-one microplates (ref: 781077, courtaboeuf, France) with excitation wavelengths.
  • the Michaelis-Menten constant was derived using a Lineweaver-Burk plot of the double reciprocal of the Michaelis-Menten equation:
  • V max represents the maximum reaction rate
  • C corresponds to the concentration of the substrate
  • K m is the Michaelis constant
  • Diamine compounds include ethylenediamine (ED), N, N'-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPDA) and N, N, N ', N'-tetramethyl-1,4-butanediamine (TMBDA). Mainly used. These compounds were divided into primary amines such as ED, secondary amines such as DMPDA and tertiary amines such as TMBDA based on the number of alkyl groups attached to the nitrogen atom. These molecules have different molecular sizes, and the molecular size increases in the order ED ⁇ DMPDA ⁇ TMBDA due to the extension of the carbon chain connected between the two amine groups in the molecule.
  • the pore window (5 and 9 ⁇ s) of the MIL-100 is sufficient for smaller diamines, such as ED, to access the CUS present in the pores of the MIL-100, thus the smaller pore size and pore of the MIL-100 compared to MIL-101.
  • the role of creativity could be excluded.
  • Cabello et al. Also successfully introduced high content (N content 4.2 mmol / g) of ethylenediamine on MIL-100 (Cr) CUS. This indicates that the change in metal center (Fe instead of Cr) in the MIL-100 backbone affects the chelating reaction of amines with metals in MOFs. This may also be supported by the electronic configuration of Fe (III) centers present in MIL-100 (Fe).
  • the octahedral units of Fe (III) have a high spin state, so that the electrons in the subshell have a large exchange energy.
  • the chelating reaction of the electron-rich amine with the active center of MIL-100 (Fe) requires higher energy and leads to a lower introduction rate of amine to Fe (III).
  • the low content (0.02 mmol / g) anchoring of "N" -containing polymers on the surface of MIL-100 (Fe) affects the magnetic resonance imaging activity used in therapeutic applications.
  • the amine introduction in the amine introduced MIL-100 (Fe) catalyst according to the invention was confirmed by FT-IR spectroscopy. After removing the solvent and water contained FT-IR spectrum was measured at 423K.
  • 5A shows the spectrum of untreated MIL-100 (Fe) as compared to MIL-100 (Fe) compounds with amine introduced in different amounts. Despite the presence of the amine moiety in the backbone, no significant change in the FT-IR pattern was observed due to the low amine introduction rate.
  • two amine-introduced samples, ED-MIL-100 (Fe) and DMPDA-MIL-100 (Fe) have a region of 3250-3350 cm -1 due to the characteristic NH stretching vibration mode as shown in FIG. 5A.
  • X-ray photoelectron spectroscopy was performed, which is an effective means for surface characterization of materials. N 1s peaks near 397 eV attributable to amine groups were observed in all amine introduced samples, indicating the occurrence of amine moieties at the surface of amine introduced MIL-100 (Fe).
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • MIL-100 Fe
  • MOF platform The selection of MIL-100 (Fe) as a MOF platform can be described based on chemical stability and biocompatibility in its aqueous medium, which is a prerequisite step for the selected reaction conditions.
  • ED-MIL-100 Fe
  • DMPDA-MIL-100 Fe
  • TMBDA-MIL-100 Fe
  • the same various amine-incorporated MOFs were used as peroxidase simulated nanomaterials to perform oxidation of TMB in the presence of H 2 O 2 . As shown in FIG. 6, no color change was observed in the TMB or TMB-H 2 O 2 solution without the catalyst.
  • the increased negative charge on the amine functionalized MOFs particles is advantageous for improving the affinity for positively charged TMB molecules through electrostatic attraction. This phenomenon has been reported to use materials with various negatively charged surfaces for TMB substrates.
  • TMBDA-MIL-100 (Fe) exhibits the highest peroxidase mimic catalytic activity, followed by DMPDA and ED modified MIL-100 (Fe).
  • DMPDA-MIL-100 (Fe) showed lower peroxidase mimic activity than TMBDA-MIL-100 (Fe), This indicates that the increased negative potential may not be the only reason for improved catalytic activity.
  • Diamines introduced differ in molecular size and differ in hydrophobicity due to extension of the carbon chain between two nitrogen atoms and substitution of hydrogen by methyl groups on the nitrogen atom.
  • the peroxidase-like activity of the amine introduced MIL-100 (Fe) increased with increasing molecular size and hydrophobicity of the introduced amine (ED ⁇ DMPDA ⁇ TMBDA). This indicates that differences in the size and hydrophobicity of the diamines introduced may also contribute to the catalytic activity of MOFs with electrostatic attraction. Abedi et al. Reported that slight hydrophobic changes in the environment near the reaction center of the MOF structure can alter substrate selectivity in aldol-type condensation reactions.
  • ODA 1,8-octanediamine
  • TMBDA-MIL-100 Fe
  • Amplex ultrared ® AUR, 1- (3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl) in the presence of H 2 O 2 . ethanone
  • TMBDA-MIL-100 Peroxidase simulation activity of TMBDA-MIL-100 (Fe) was further analyzed by steady-state kinetic reaction. Within the appropriate range of H 2 O 2 and TMB concentrations, the Michaelis-Menten curves typical for TMBDA-MIL-100 (Fe) were obtained. Lineweaver-Burk plots were used to derive kinetic parameters such as maximum initial velocity (V max ) and Michaelis-Menten constant (K m ) (Table 4).
  • K m values indicate the binding force of the enzyme to the substrate, and smaller K m values indicate the strong binding force between the enzyme and the substrate.
  • the apparent K m of TMB and TMBDA-MIL-100 (Fe) as substrates was at least 5 times lower than horseradish peroxidase (HRP) and untreated MIL-100 (Fe), which was TMBDA-MIL-100 (Fe). It has a relatively higher binding force than HRP and MIL-100 (Fe).
  • HRP horseradish peroxidase
  • MIL-100 Fe
  • HRP and MIL-100 Fe
  • the K m values of H 2 O 2 and TMBDA-MIL-100 (Fe) as substrates were at least two times lower than those of HRP and MIL-100 (Fe), and other peroxidase-simulations.
  • TMBDA-MIL-100 is TMBDA-MIL-100 (Fe) is having a relatively higher affinity than HRP and MIL-100 (Fe) for the H 2 O 2 It represents.
  • the better catalytic performance of TMBDA-MIL-100 (Fe) can be attributed to the presence of interfacial amine moieties on the surface of the MOF, which assists the substrate to approach adjacent active centers through electrostatic and hydrophobic interactions. . This phenomenon was similar to natural enzymes with extraordinary catalytic activity due to their ability to attract substrates close to the active center.
  • TMBDA-MIL-100 As with HRP, the peroxidase mimicking activity of TMBDA-MIL-100 (Fe) changed significantly with pH, temperature and concentration (FIG. 9). Peroxidase-like activity of TMBDA-MIL-100 (Fe) was measured with varying conditions at a pH range of 2-12 and a temperature range of 293-353K. As a result, TMBDA-MIL-100 (Fe) showed particularly high catalytic activity at neutral and basic pH (up to 9) and was found to be an effective catalyst over a wide temperature range (293 to 333K). This indicates that the catalyst of the present invention can carry out the reaction of high temperature and pH.
  • Peroxidase activity was simulated using the optimal conditions for the detection of H 2 O 2 in the solution can be facilitated by the H 2 O 2 of TMBDA-MIL-100 (Fe) . Under these conditions, the effect of the concentration of H 2 O 2 on the catalytic activity of TMBDA-MIL-100 (Fe) was confirmed. At the excitation wavelength of 588 nm, the fluorescence intensity increased rapidly with increasing H 2 O 2 concentration in the range of 1 to 500 ⁇ M (FIG. 10). As shown in the inset of FIG.
  • TMBDA-MIL-100 (Fe) catalyst system can be used in analytical systems involving H 2 O 2 oxidation.
  • TMBDA-MIL-100 (Fe) showed excellent recyclability with low loss in catalyst activity in up to five recycling tests (FIG. 11). The minor loss in this activity is believed to be due to incomplete recovery of the MOF nanoparticles by centrifugation from the highly diluted reaction solution after each cycle. The SEM analysis confirmed that the structure of the MOF remained unchanged even after five recycling tests.
  • Equation 1 choline can be hydrolyzed by cholineoxidase and used for the catalytic oxidation of AUR to produce oxidized AUR using TMBDA-MIL-100 (Fe). , H 2 O 2 can be produced.
  • OxAUR generates fluorescence at 588 nm, which is readily used for choline detection and qualitative analysis.
  • choline in milk was detected through a standard addition method, and the results are shown in Table 6 below.
  • the mean recovery of choline was about 100%. This indicates that the choline detection method according to the present invention can be usefully applied for choline detection in food inspection.
  • choline in milk was detected through a standard addition method, and the results are shown in Table 6 below.
  • the mean recovery of choline was about 100%. This indicates that the choline detection method according to the present invention can be usefully applied for choline detection in food inspection.
  • Acetylcholine plays an important role in both the peripheral and central nervous system, and a decrease in acetylcholine levels has been identified in patients with various neurological diseases. Therefore, in order to treat these diseases, acetylcholine quantification in biological samples such as blood and nerve cells is very important.

Abstract

본 발명은 배위적으로 불포화된 자리(coordinatively unsaturated site; CUS)에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 유효성분으로 포함하는 과산화물을 이용한 산화반응용 촉매, 상기 촉매를 포함하는 과산화수소, 콜린 및 아세틸콜린 검출용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 뇌신경질환 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

배위적으로 불포화된 자리에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 포함하는 산화반응용 촉매 및 이의 용도
본 발명은 배위적으로 불포화된 자리(coordinatively unsaturated site; CUS)에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 유효성분으로 포함하는 과산화물을 이용한 산화반응용 촉매, 상기 촉매를 포함하는 과산화수소, 콜린 및 아세틸콜린 검출용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 뇌신경질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
산화제로서 과산화물을 이용하여 기질을 탈수소화시키는 촉매반응에 관여하는 효소인 HRP(horseradish peroxidase)는 환원 헤마틴 함유 효소로 알려져 있다. 이는 H2O2와 같은 과산화물을 이용한 산화 반응에 효과적이므로 널리 연구되었으며, 상업화하고자 하는 시도가 있었다. 그러나, 상기 HRP는 단백질을 기반으로하는 효소이므로, 촉매 자체의 안정성이 낮아, 실질적으로 다양한 반응 조건에서 사용하기 어려운 문제점이 있다. 따라서, 상기 페록시다아제를 모방한 촉매를 제조하기 위한 노력이 지속되고 있다. 예컨대, 나노입자 형태의 Fe3O4, Pt, Co3O4, CeO2 등과 같은 산화-환원 특성의 금속산화물이나, 개질된 형태의 탄소 나노점(carbon nanodot), 산화그래핀(graphene oxide), 단일벽 탄소나노튜브(single-wall carbon nanotube) 등이 연구 개발되었다. 이와 같은 물질들은 HRP에 비해 안정성이 개선되기는 하였으나, 제조 방법이 복잡하고 비용이 높으며 HRB에 비해 활성이 낮은 단점이 있었다.
최근에는 무기-유기물이 결합된 형태의 효소 모방 센서물질이 보고되었고, 특히 금속-유기 골격체(metal-organic framework; MOF)는 구조적인 특성으로 인해 합성 후 개질(post synthetic modification)을 통해 기능화 및/또는 기공도를 조절하여 촉매 활성을 부여하거나 조절할 수 있으므로, 금속-유기 골격체의 개질을 통한 바이오센서 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이에 본 발명자들은, 종래 무기물을 이용하여 제조한 페록시다아제 모방 촉매의 단점을 극복하기 위하여, 금속이 함유된 다공성 유무기 혼성체를 개질하여 향상된 페록시다아제 모방 활성을 갖는 촉매를 발굴하고자 예의 연구 노력한 결과, 수열안정성 및 대량합성이 가능한 철 함유 다공성 유무기 혼성체인 MIL-100(Fe)에 후처리 공정을 통해 이의 CUS 상에 아민을 도입한 촉매가 HRP에 비해 현저히 향상된 안정성을 토대로 보다 넓은 온도 및 pH 범위에서 활성을 나타낼 뿐만 아니라 현저히 향상된 활성으로 미량의 과산화수소, 콜린 및 아세틸콜린을 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 배위적으로 불포화된 자리(coordinatively unsaturated site; CUS)에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 유효성분으로 포함하는 과산화물을 이용한 산화반응용 촉매를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 촉매; 및 페록시다아제에 의해 산화되는 기질을 포함하는, 과산화수소 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 촉매; 페록시다아제에 의해 산화되는 기질; 및 콜린산화효소(cholineoxidase)을 포함하는, 콜린 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 촉매; 페록시다아제에 의해 산화되는 기질; 콜린산화효소(cholineoxidase); 및 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)를 포함하는, 아세틸콜린 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 콜린 또는 아세틸콜린의 분비와 관련된, 뇌신경질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 촉매는, 종래 단백질 기반의 산화반응을 촉매하는 효소인 페록시다아제의 활성을 모사하기 위하여, 다공성 유무기 혼성체를 기반으로 하여, 간단한 후처리 공정을 통해 아민을 도입하여 제조한 것으로, 현저히 증가된 안정성을 토대로 보다 넓은 온도 및/또는 pH 범위에서 촉매 활성을 나타낼 수 있다. 구체적으로 배위적으로 불포화된 자리(coordinatively unsaturated site; CUS)에 도입된 아민은 기공의 크기를 조절하는 동시에 표면 전하를 변화시킴으로써 촉매의 활성점에 대한 기질의 접근을 용이하게 하여 현저히 향상된 촉매 활성을 나타내는 것이 특징이다. 따라서, 과산화수소는 물론, 효소의 작용에 의해 과산화수소를 발생시키는 콜린이나 아세틸콜린을 높은 민감도로 검출할 수 있으므로, 이의 발현의 변화로 유발되는 뇌신경질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 MIL-100(Fe)의 배위적으로 불포화된 자리에서 아민의 도입(grafting)을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 아민 도입된 MIL-100(Fe)과 비처리 MIL-100(Fe)의 특성분석 결과를 나타낸 도이다. a)는 XRD 패턴을, b)는 77K에서 N2 물리흡착을, c)는 DFT 분석에 의한 기공 크기 분포를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 MIL-127(Fe)의 XRD 패턴을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 MIL-127(Fe)의 77K에서 N2 물리흡착을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 아민 도입된 MIL-100(Fe)과 비처리 MIL-100(Fe)의 a) 423K에서의 FT-IR 스펙트럼 및 b) XPS 분석(N1s) 결과를 나타낸 도이다. 1 내지 4는 각각 비처리 MIL-100(Fe)과 에틸렌디아민(ethylenediamine; ED), N,N'-디메틸-1,3-프로판디아민(N,N'-dimethyl-1,3-propanediamine; DMPDA), 및 N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-부탄디아민(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA) 도입된 MIL-100(Fe)에 대한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 아민 도입된 MIL-100(Fe)과 비처리 MIL-100(Fe)의 TMB 기질에 대한 페록시다아제-모사 활성을 흡광도 측정을 통해 비교하여 나타낸 도이다. 1과 2는 각각 TMB 단독, TMB와 H2O2 혼합물의 스펙트럼을, 3 내지 6은 TMB와 과산화수소 혼합물에 각각 TMBDA, DMPDA 및 ED가 도입된 MIL-100(Fe) 및 비처리 MIL-100(Fe)를 첨가한 용액의 스펙트럼을, 7은 TMB에 TMBDA가 도입된 MIL-100(Fe)를 첨가한 용액의 스펙트럼을 나타낸다. 각 용액은 pH 4의 5 mM 트리스 아세테이트 완충액에 1 mM H2O2, 0.2 mg/mL MOF, 1 mM TMB를 선택적으로 혼합하여 40℃에서 20분 동안 반응시킨 후 350 내지 700 nm 범위에서 흡광도를 측정하였다.
도 7은 본 발명에 따른 다양한 아민 도입된 MIL-100(Fe)과 비처리 MIL-100(Fe)의 TMB 기질에 대한 페록시다아제-모사 활성을 비교하여 나타낸 도이다. 1 내지 5는 MOF로 각각 비처리 MIL-100(Fe)와 아민으로서 ED, DMPDA, TMBDA, 1,8-옥탄디아민(1,8-octanediamine; ODA) 도입된 MIL-100(Fe)에 대한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 TMBDA가 도입된 MIL-100(Fe)(TMBDA-MIL-100(Fe))의 AUR 기질에 대한 페록시다아제-유사 활성을 나타낸 도이다. 5 mM 트리스 아세테이트 완충액(pH 7), 1 mM H2O2, 0.2 mg/mL MOF, 50 μM AUR을 기재한 조성의 조합으로 혼합하여 25℃에서 20분 동안 반응시킨 후 450 내지 600 nm 범위에서 흡광도를 측정하였다.
도 9는 본 발명에 따른 TMBDA-MIL-100(Fe)의 a) 온도, b) pH, c) MOF 농도, 및 d) 완충액 농도에 따른 페록시다아제-유사 활성을 나타낸 도이다.
도 10은 H2O2 농도 의존적인 형광 세기(λmax=588 nm)의 변화를 나타낸 도이다. 삽입도는 1 내지 30 μM H2O2 농도 범위에서 선형적인 상관관계를 나타낸다.
도 11은 본 발명에 따른 TMBDA-MIL-100(Fe)의 최적화된 반응 변수, MOF 농도 0.2 mg/mL, 온도 60℃ 및 pH 7에서 반복 사용에 대한 재현성을 나타낸 도이다.
도 12는 콜린 존재시 전체적인 반응에 대한 반응 조건의 효과를 나타낸 도이다. 반응 혼합물은 트리스 아세테이트 완충액(5 mM, pH 7)에 콜린산화효소(cholineoxidase; ChOx, 0.5 U/mL), TMBDA-MIL-100(Fe)(0.2 mg/mL), 콜린(1 μM) 및 AUR(50 μM)을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 여기시키고 588 nm에서 형광을 측정하였다.
도 13은 본 발명에 따른 TMBDA-MIL-100(Fe)의 촉매 활성에 대한 a) ChOx 농도, b) TMBDA-MIL-100(Fe) 농도, c) 온도, 및 d) pH에 따른 효과를 나타낸 도이다.
도 14는 콜린 농도 의존적인 형광 세기(λmax=588 nm)의 변화를 나타낸 도이다. 삽입도는 1 내지 10 μM 콜린 농도 범위에서 선형적인 상관관계를 나타낸다.
도 15는 본 발명에 따른 TMBDA-MIL-100(Fe)의 a) 아세틸콜린이 존재 및 부재하는 반응 혼합물의 시간 의존적 형광 세기(λmax=588 nm), 및 TMBDA-MIL-100(Fe)의 촉매 활성에 대한 b) 온도 및 c) pH의 효과를 나타낸 도이다.
도 16은 아세틸콜린(Ach) 농도 의존적인 형광 세기(λmax=588 nm)의 변화를 나타낸 도이다. 삽입도는 1 내지 10 μM 아세틸콜린 농도 범위에서 선형적인 상관관계를 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 배위적으로 불포화된 자리(coordinatively unsaturated site; CUS)에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 유효성분으로 포함하는 과산화물을 이용한 산화반응용 촉매를 제공한다.
본 발명은 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 용매 중에 분산시키고 이에 아민 화합물을 첨가하고 교반하는 단순한 후처리 방법에 의해 CUS에 아민을 도입한 다공성 유무기 혼성체가 우수한 페록시다아제 모사 촉매활성을 나타냄을 발견한 것에 기초한다. 나아가, 상기 본 발명에 따른 다공성 유무기 혼성체를 기반으로 한 촉매는 과산화수소를 0.3 ppm 수준까지 검출 가능하며, 콜린산화효소 및 선택적으로 아세틸콜린에스테라아제를 더 포함하는 경우, 콜린 및 아세틸콜린을 0.02 내지 0.03 ppm 수준까지 검출할 수 있으므로, 이들의 검출을 위한 민감한 바이오센서로서 활용할 수 있으며, 나아가 이들 물질과 관련된 질환인 뇌신경질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 제시한다.
구체적으로, 상기 아민은 탄소수 2 내지 10의 알킬렌디아민 유도체일 수 있으며, 일차 아민, 이차 아민 및 3차 아민을 제한 없이 포함할 수 있다. 한편, 탄소수 10 초과의 아민은 증가된 크기로 인해 기공 내로 진입이 어려워 합성 후 개질에 의해 CUS에 도입이 어렵거나, CUS에 도입하더라도 이들이 결합된 CUS 이외에 이웃한 CUS를 가리움으로써 아민 화합물의 도입율을 낮추고 이에 따라 활성이 낮아지는 역효과를 나타낼 수 있다. 예컨대, 상기 탄소수 2 내지 10의 알킬렌디아민 유도체는 에틸렌디아민(ethylenediamine; ED), N,N'-디메틸-1,3-프로판디아민(N,N'-dimethyl-1,3-propanediamine; DMPDA), N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-부탄디아민(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA) 또는 1,8-옥탄디아민(1,8-octanediamine; ODA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 탄소수 2 내지 10의 알킬렌디아민 유도체는 TMBDA일 수 있다.
본 발명의 산화반응용 촉매는 철 함유 다공성 유무기 혼성체의 CUS에 아민이 도입되어도 상기 다공성 유무기 혼성체 자체의 우수한 결정성을 유지하며, 따라서 이의 특성 역시 그대로 유지된다.
구체적으로, 상기 철 함유 다공성 유무기 혼성체는 금속-유기 골격체(metal-organic framework; MOF)의 일종인 철을 포함하는 MIL-53, MIL-88, MIL-89, MIL-96, MIL-100, MIL-101, MIL-102, MIL-126, MIL-127 및 이의 기능화된 MOF로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 자체로서는 불포화된 금속자리를 포함하지 않으나, 산 또는 염기와 같은 화학적 처리 또는 열 처리하여 MOF 결정에 결함을 형성함으로써 해당 자리에 아민이 도입될 수 있도록 개질한 MOF도 본 발명의 범주에 제한 없이 포함된다.
예컨대, 철을 함유하는 유무기 혼성체로서, 아민 화합물 예컨대, 탄소수 2 내지 10의 알킬렌디아민이 출입할 수 있도록 소정의 크기의 기공을 가지며, 상기 아민 화합물이 결합할 수 있는 CUS를 포함하는 물질을 제한 없이 사용할 수 있다. 또는 상기 철 함유 다공성 유무기 혼성체는 MIL-101(Fe)_NH2(Fe3OX[O2C-C6H3NH2-CO2]3·nH2O, 0<n<100, X=OH-, Cl-, F-, I-, Br-, SO4 2-, NO3 - 등) 조성을 갖는 벤젠링에 아민을 포함하고, 추가적으로 Fe CUS 자리에 추가 아민을 담지한 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또는, 하기 MOF들을 산 또는 염기로 처리하여 MOF 결정에 결함을 형성한 것을 사용할 수 있다:
Fe3OX[O2C-C2H2-CO2]3, Fe3OX[O2C-C6H4-CO2]3, Fe3OX[O2C-C10H6-CO2]3, Fe3OX[O2C-C12H8-CO2]3, Fe3OX[O2C-C4H4-CO2]3, Fe(OH)[O2C-C4H4-CO2], Fe12O(OH)18(H2O)3[C6H3-(CO2)3]6, Fe3OX[C6H3-(CO2)3]2, Fe3OX[O2C-C6H4-CO2]3, Fe6O2X2[C10H2-(CO2)4]3, 또는 Fe6O2X2[C14H8N2-(CO2)4]3일 수 있고, 여기서 X는 상기 정의한 바와 같다.
본 발명에서 사용 가능한 MOF들의 예를 하기 표 A에 나타내었다.
Phase 조성
MIL-88A (fumarate) Fe3OX[O2C-C2H2-CO2]3·nH2O
MIL-88B (terephthalate) Fe3OX[O2C-C6H4-CO2]3·nH2O
MIL-88C (2,6-naphthalenedicarboxylate) Fe3OX[O2C-C10H6-CO2]3·nH2O
MIL-88D (4,4'-biphenyldicarboxylate) Fe3OX[O2C-C12H8-CO2]3·nH2O
MIL-89 (trans,trans Muconate) Fe3OX[O2C-C4H4-CO2]3·nH2O
MIL-88B-Cl (2-chloroterephthalate) Fe3OX[O2C-C6H3(Cl)-CO2]3·nH2O
MIL-88B-Br (2-bromoterephthalate) Fe3OX[O2C-C6H3(Br)-CO2]3·nH2O
MIL-88B-NO2 (2-nitroterephthalate) Fe3OX[O2C-C6H3(NO2)-CO2]3·nH2O
MIL-88B-NH2 (2-aminoterephthalate) Fe3OX[O2C-C6H3(NH2)-CO2]3·nH2O
MIL-88B-2OH (2,5-dihydroxyterephthalate) Fe3OX[O2C-C6H2(OH)2-CO2]3·nH2O
MIL-88B-4F (tetrafluoroterephthalate) Fe3OX[O2C-C6F4-CO2]3·nH2O
MIL-88B-4CH3 (tetramethylterephthalate) Fe3OX[O2C-C6(CH3)4-CO2]3·nH2O
MIL-88F (2,5-thiophenedicarboxylate) Fe3O[C4H2S-(CO2)2]3X·nH2O
MIL-88G (4,4'-azobenzenedicarboxylate) Fe3OX[C12H8N2-(CO2)2]3·nH2O
MIL-88G-2Cl(3,3'-dichloro-4,4'-azobenzenedicarboxylate) Fe3OX[C12H6Cl2N2-(CO2)2]3·nH2O
MIL-96 (trimesate) Fe12O(OH)18(H2O)3[C6H3-(CO2)3]6·nH2O
MIL-100 (trimesate) Fe3OX[C6H3-(CO2)3]2·nH2O
MIL-101 (terephthalate) Fe3OX[O2C-C6H4-CO2]3·nH2O
MIL-102 (1,4,5,8-naphthalenetetracarboxylate) Fe6O2X2[C10H2-(CO2)4]3·nH2O
MIL-126 (4,4'-biphenyldicarboxylate) Fe3OX[O2C-C12H8-CO2]3·nH2O
MIL-127 (3,3'-5,5'-azobenzenetetracarboxylate) Fe6O2X2[C12H6N2-(CO2)4]3·nH2O
MIL-53 (terephthalate) Fe(OH)[C6H4-(CO2)2]·nH2O
이들 예에서, X는 상기 정의된 바와 같다.이들 화합물은 상용화된 것을 구입하여 사용하거나, 하기 문헌들에 기재된 방법으로 또는 이를 적절히 변경하여 합성하여 사용할 수 있다:
i) Serre, C. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43: 6286,
ii) Surble,S. et al., Chem. Comm., 2006, 284,
iii) Loiseau, T. et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128: 10223,
iv) Horcajada, P. et al., Chem. Comm., 2007, 2820,
v) Ferey, G. et al., Science, 2005, 309: 2040,
vi) Surble,S. et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128: 14890,
vii) Whitfield, T. R. et al., Solid State Sci., 2005, 7: 1096,
viii) Chui, S. S.-Y. et al., Science, 1999, 283: 1148.
본 발명의 산화반응용 촉매는 철 함유 다공성 유무기 혼성체의 CUS에 아민을 도입함으로써 표면의 음의 전위가 증가되는 것을 확인하였고, 입자 상의 증가된 음의 전하는 정전기적 인력을 통해 양으로 하전된 기질과 보다 높은 결합력을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 철 함유 다공성 유무기 혼성체에 다양한 아민 화합물을 도입하였을 때, 제타전위가 보다 음의 값을 갖는 것을 확인하였다. 이러한 특성은 정전기적 인력을 통해 양으로 하전된 기질을 촉매 활성자리에 인접하도록 유도하는데 유리할 수 있다. 즉, 본 발명의 산화반응용 촉매는 이에 도입된 아민에 의해 보다 음의 전하를 띄게 되고, 이에 따라 향상된 기질과의 결합력을 바탕으로 보다 효율적인 촉매 활성을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 상기 촉매는 페록시다아제 모사 활성을 나타낼 수 있다.
예컨대, 상기 촉매는 과산화수소 존재시 페록시다아제에 의해 산화되는 기질의 촉매적 산화반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 H2O2 존재 하에 당업계에 공지된 페록시다아제 기질인 TMB 및 AUR과 반응시켜, 이들을 산화시키는 촉매활성을 갖는 것을 확인하였다. 특히, 종래 널리 사용되는 페록시다아제인 HRP(horseradish peroxidase)와 비교하여 현저히 향상된 촉매 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 4).
본 발명의 산화반응용 촉매는 반복하여 사용하여도 적은 활성 감소를 나타낼 뿐 여전히 우수한 촉매 활성을 나타내므로 원심분리에 의한 간단한 공정으로 회수하여 재활용할 수 있다. 나아가, 상기 약간의 활성 감소는 매우 희석된 용액을 원심분리하여 회수하는 과정에서 촉매의 불완전한 회수로 인한 손실에 기인하는 것으로 사료된다. 이는, SEM 분석 결과 나타난 바와 같이, 재활용 후에도 촉매의 구조가 변화하지 않고 유지되는 것으로부터 확인하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 촉매; 및 페록시다아제에 의해 산화되는 기질을 포함하는, 과산화수소 검출용 조성물을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 촉매를 이용하는 경우, 0.3 ppm의 낮은 검출한계로 과산화수소의 존재를 검출할 수 있다. 뿐만 아니라, 30 ppm 이하의 낮은 농도에서 H2O2의 농도와 산화된 기질로부터의 588 nm에서 형광 세기가 정비례 관계를 나타내는 것을 확인하였는 바(도 10), 해당 농도 범위에서는 H2O2의 정성분석은 물론 정량분석까지도 수행할 수 있다.
바람직하게, H2O2에 의한 기질의 촉매적 산화 반응에 유리한 조건을 제공할 수 있도록, pH 4 내지 12의 완충액을 더 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 pH 5 내지 9의 완충액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 완충액은 트리스 아세테이트 완충액일 수 있고, 상기 트리스 아세테이트 완충액의 농도는 약 5 mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 트리스 아세테이트의 농도가 2.5 mM 미만 또는 12.5 mM 초과인 경우 상대적으로 촉매 활성이 일부 감소할 수 있으나, 여전히 민감한 H2O2 검출이 가능할 수 있다.
검출의 편의를 위하여, 상기 페록시다아제에 의해 산화되는 기질로는 산화 상태에서 색상이 변경되거나 형광을 발생하는 물질을 사용할 수 있다. 산화 상태에서 색상 변경 및/또는 형광 발생하는 기질을 사용함으로써 H2O2와의 촉매적 산화 반응 전/후의 흡광도 및/또는 형광 스펙트럼을 측정함으로써 H2O2를 검출할 수 있다. 특히, 분광학적 검출방법 중에서도 형광은 미량의 시료로도 검출 가능한 민감한 방법이므로, 산화되어 형광을 발생하는 기질을 사용하는 경우 보다 민감한 검출이 가능할 수 있다.
상기 페록시다아제에 의해 산화되는 기질로는 1-(3,7-디히드록시-10H-페녹사진-10-일)에타논(1-(3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl)ethanone), 10-아세틸-10H-페녹사진-3,7-디일 디아세테이트(10-acetyl-10H-phenoxazine-3,7-diyl diacetate) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; TMB)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 종래 페록시다아제 활성 분석에 사용되는 기질인 Amplex®UltraRed 또는 Amplex®Red의 상표명으로 시판되는 제품을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 1-(3,7-디히드록시-10H-페녹사진-10-일)에타논(1-(3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl)ethanone), 10-아세틸-10H-페녹사진-3,7-디일 디아세테이트(10-acetyl-10H-phenoxazine-3,7-diyl diacetate)는 산화되어 형광을 나타내는 레조루핀(resorufin; 3H-phenoxazin-3-one)으로 전환되어, 이의 흡수 스펙트럼에서 570 nm에서 최대 흡수파장을 갖는 추가적인 피크를 나타낼 뿐만 아니라 588 nm에서 최대 세기를 나타내는 형광 스펙트럼을 나타내므로, 흡광도 또는 형광을 측정함으로써 상기 반응을 유발하는 H2O2의 존재 및/또는 함량을 확인할 수 있다. 한편, TMB는, 산화 상태에서 형광을 나타내지는 않으나, 자체로서 용액 상태에서 거의 무색이나, H2O2와의 촉매적 산화에 의해 2개의 아민기가 이민기로 전환되면서 파란색을 띄며, 이의 가시광선 영역에서의 흡수 스펙트럼은 650 nm에서 최대 흡수 피크를 갖는다. 따라서, 해당 파장에서의 흡광도 변화를 측정함으로써 H2O2의 존재 및/또는 함량을 확인할 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 상기 촉매; 페록시다아제에 의해 산화되는 기질; 및 콜린산화효소(cholineoxidase)을 포함하는, 콜린 검출용 조성물을 제공한다.
상기 콜린(Choline)은 비타민 B의 일종으로, 두뇌 개발, 근육 운동 및 신체 대사에 관여한다. 또한, 이는 말초신경계(peripheral nervous system)에서 중요한 신경전달물질(neurotransmitter)인 아세틸콜린(acetylcholine)의 전구체이다. 인체 내에서 생산됨에도 불구하고, 적정 기능을 유지하기 위해서는 식이 보충(dietary supplementation)이 요구된다. 이에, 콜린은 우유 및 식이 보조제(dietary supplement)와 같은 음식에 널리 첨가된다. 체내에서 콜린의 부족은 신경관결손(neural tube defect), 알츠하이머병 및 지방간 질환과 같은 질환을 야기한다. 따라서, 체내 콜린을 적정 수준으로 유지하는 것은 중요하며, 이의 효과적인 검출 방법이 필요하다.
이에, 본 발명의 콜린 검출용 조성물은 체내 콜린의 양과 관련된 질환, 예컨대 신경관결손, 알츠하이머병 및 지방간 질환 등의 질환을 진단하는데 활용될 수 있다. 나아가, 식품 내의 콜린의 검출 및 이의 함량을 측정하는데 사용될 수도 있다.
상기 본 발명에 따른 촉매를 이용하는 경우, 0.025 ppm의 검출한계로 콜린의 존재를 검출할 수 있다. 뿐만 아니라, 10 ppm 이하의 낮은 농도에서 콜린의 농도와 산화된 기질로부터의 588 nm에서 형광 세기가 정비례 관계를 나타내는 것은 물론 1% 이내의 상대오차율로 100%에 가까운 회수율로 검출 가능한 것을 확인하였는 바(도 14), 해당 농도 범위에서는 콜린의 정성분석은 물론 정량분석까지도 수행할 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 상기 촉매; 페록시다아제에 의해 산화되는 기질; 콜린산화효소(cholineoxidase); 및 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)를 포함하는, 아세틸콜린 검출용 조성물을 제공한다.
상기 아세틸콜린은 말초신경계 및 중추신경계 모두에서 중요한 역할을 한다. 이는 각성(alertness), 학습 및 기억과 같은 뇌 기능에 관여한다. 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson diseases), 조현병(schizophrenia) 및 진행성 치매(progressive dementia)와 같은 신경 질환을 가진 환자에서 아세틸콜린 수준 감소가 확인되었다. 이들 질환을 조기에 진단하고 치료하기 위하여, 혈액 및 신경세포와 같은 생물 시료 중의 아세틸콜린 정량이 매우 중요하다.
상기 본 발명에 따른 촉매를 이용하는 경우, 0.035 ppm의 검출한계로 아세틸콜린의 존재를 검출할 수 있다. 뿐만 아니라, 10 ppm 이하의 낮은 농도에서 아세틸콜린의 농도와 산화된 기질로부터의 588 nm에서 형광 세기가 정비례 관계를 나타내는 것을 확인하였는 바(도 16), 해당 농도 범위에서는 아세틸콜린의 정성분석은 물론 정량분석까지도 수행할 수 있다.
상기 본 발명의 콜린 또는 아세틸콜린 검출용 조성물은, 전술한 바와 같이, 검출의 편의를 위하여 기질로서 산화 상태에서 색상이 변경되거나 형광을 발생하는 물질을 사용할 수 있다. 구체적인 사용가능한 기질의 예 및 검출 방법은 전술한 바와 같다.
또 다른 양태로서 본 발명은 H2O2, 콜린 및 아세틸콜린의 검출방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 검출방법은, 검출하고자 하는 대상에 따라 시료를, 각각 H2O2 검출용 조성물, 콜린 검출용 조성물 및 아세틸콜린 검출용 조성물과 혼합하여 반응시키는 단계 및 상기 반응 용액의 색상을 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 조성물들은 기질로서 산화 상태에서 색상이 변경되거나 형광을 발생하는 물질을 포함하는 바, 상기 조성물은 각각 시료 중에 검출하고자 하는 H2O2, 콜린 및 아세틸콜린 존재 시 이들과 반응하여 산화 상태의 기질을 형성하며, 이는 색상 변화로 확인 가능하다. 예컨대, 색상 변화를 육안으로 관찰하여 검출하고자 하는 물질의 존재를 확인할 수 있다. 또는 분광기를 이용하여 분석하는 경우, 반응 용액의 흡광도 및/또는 형광 스펙트럼을 측정하여 검출하고자 하는 물질의 존재는 물론 그 함량의 정량까지도 수행할 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뇌신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 조성물을 이용하여 진단할 수 있는 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성경화증(multiple sclerosis, MS), 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS, 일명 루게릭병; Lou Gehrig's disease), 피크병(Pick disease), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease; CJD), 조현병(schizophrenia), 진행성 치매(progressive dementia), 뇌졸중(stroke 또는 apoplexy), 중풍(palsy) 및 치매(dementia)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 미량의 콜린 또는 아세틸콜린을 민감하게 검출 및/또는 정량할 수 있으므로, 이의 분비와 관련된 질환의 진단에 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 열거한 뇌신경질환의 대부분은 생체 내에서 콜린 및/또는 아세틸콜린의 분비가 감소되어 발병하는 질환들이다. 따라서, 본 발명의 진단용 조성물을 이용하여 발병이 의심되는 개체로부터 채취한 생체 시료 중의 콜린 및/또는 아세틸콜린을 정량하고, 이를 정상 개체로부터 채취한 생체 시료에 대해 측정된 값과 비교하여 일정 수준 이상으로 낮은 경우 상기 질환이 발병한 것으로 판단할 수 있다. 이때 사용가능한 기질의 종류 및 측정 방법은 전술한 바와 같다.
또 다른 양태로서 본 발명은 상기 뇌신경질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌신경질환 진단용 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 뇌신경질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌신경질환 진단용 바이오센서를 제공한다.
상기 본 발명의 뇌신경질환 진단용 키트 및 바이오센서는 뇌신경질환 진단용 조성물과 진단하고자 하는 검체의 반응을 수행할 수 있는 공간을 제공하고, 육안으로 또는 분광학적 분석이 가능한 투명한 용기를 더 포함할 수 있다. 상기 투명한 용기는 육안으로 판단하고자 하는 경우 용액의 색상 변화를 관찰할 수 있는 투명도를 제공할 수 있는 한, 그 재질에 제한되지 않는다. 한편, 분광학적 분석을 필요로 하는 경우, 상기 투명한 용기는 민감한 흡광도 및 형광 측정에 유리하도록 퀄츠 재질의 셀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<물질>
Fe(NO3)3·9H2O(98%), 1,3,5-벤젠트리카르복시산(1,3,5-benzenetricarboxylic acid; H3BTC, 95%), 불화암모늄(ammonium fluoride, 98%), 에틸렌디아민(ethylenediamine; ED, 99%), N,N'-디메틸-1,3-프로판디아민(N,N'-dimethyl-1,3-propanediamine; DMPDA, 97%), N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-부탄디아민(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA), 톨루엔(99.8%), 1,8-옥탄디아민(1,8-Octanediamine; ODA, 98%), 아르트로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) 유래의 콜린 옥시다아제(Choline Oxidase; ChOx), 염화콜린(Choline chloride), 전기뱀장어(Electrophorus electricus) 유래의 아세틸콜린에스테라아제(Acetylcholinesterase; AchE), 아세틸콜린(Acetylcholine; Ach), 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor) 유래의 락카아제(laccase), 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; TMB)은 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 과산화수소(Hydrogen peroxide; H2O2) 용액은 준세이로부터 입수하였다. Amplex®UltraRed 시약(AUR)은 라이프테크놀로지로부터 획득하였다. 모든 화합물은 분석용 등급을 추가적인 정제 없이 사용하였다. 수용액은 초순수(ultrapure) DNase/RNase 프리 증류수(Invitrogen)를 사용하여 준비하였다.
제조예 1: MIL-100(Fe)의 합성
본 발명자들이 이전에 보고한 대량생산 방법을 사용하여 불소 없이(Fluorine free) 생체적합성 MIL-100(Fe)를 합성하였다(Microporous and Mesoporous Materials, 157 (2012) 137-145). 간략하게, 금속 전구체 Fe(NO3)3·9H2O를 물에 완전히 용해시킨 후, 상기 금속 전구체 수용액에 트리메스산(trimesic acid)을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 최종 조성은 Fe(NO3)3·9H2O: BTC: H2O=1: 0.67: x(x = 55-280)의 비율이었다. 상기 반응물 혼합물을 테플론-마감된 압력용기(Teflon-lined pressure vessel)에 붓고 160℃에서 12시간 동안 가열하였다. 합성된 고체를 여과하여 증류수로 세척하였다. 증류수와 에탄올로 70℃에서 추가적인 세척을 수행하고 38 mM NH4F 용액으로 70℃에서 3시간 동안 정제하였다. 마지막으로 수득한 고체를 100℃ 이하의 대기 중에서 밤새도록 건조하였다.
제조예 2: MIL-127(Fe)의 합성
다른 철 함유 다공성 유무기 혼성체로서, MIL-127(Fe) 나노세공체를 제조하기 위하여, 3구-둥근바닥플라스크에 466g의 DMF(N,N-dimethylformamide)와 175g Fe(ClO4)3·H2O 및 112g의 3,3',5,5'-아조벤젠테트라카르복실산을 넣고 실온에서 30분 동안 교반한 후, 130℃에서 17시간 동안 환류 조건에서 합성을 진행하였고, 잔f류하는 금속 전구체 및 리간드를 세척하기 위해서 증류수와 에탄올을 이용하여 수차례 여과하고 건조하여 MIL-127(Fe) 분말을 수득하였다.
실시예 1: MOF 시료로서 에틸렌디아민(ED)이 도입(grafting)된 MIL-100(Fe)의 제조
상기 제조예 1로부터 수득한 정제된 MIL-100(Fe)(1.0 g)를 150℃에서 12시간 동안 진공에서 탈수하고, 무수 톨루엔(anhydrous toluene, 60 mL)에 현탁하였다. 2.5 mmol/g의 에틸렌디아민(ethylenediamine; ED)을 첨가하고 반응 혼합물을 24시간 동안 환류 하에 교반하였다. 반응을 완료한 후, 고체를 물과 에탄올로 완전히 세척하여 고체로부터 미반응 아민 화합물과 용매를 제거하였다. 수득한 고체는 진공 하에 110℃에서 밤새도록 건조하였다. 이상과 같이 제조한, ED로 기능화한 MIL-100(Fe)(ED-MIL-100(Fe)) 시료의 페록시다아제-모사 촉매 활성을 테스트하였다.
실시예 2: MOF 시료로서 에틸렌디아민(ED)이 도입된 MIL-127(Fe)의 제조
MIL-100(Fe) 대신에 상기 제조예 2로부터 수득한 정제된 MIL-127(Fe)(1.0 g)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 ED로 기능화한 MIL-127(Fe)(ED-MIL-127(Fe))를 제조하고, 이의 페록시다아제-모사 촉매 활성을 테스트하였다.
실시예 3: MOF 시료로서 DMPDA 도입된 MIL-100(Fe)의 제조
에틸렌디아민 대신에 N,N'-디메틸-1,3-프로판디아민(N,N'-dimethyl-1,3-propanediamine; DMPDA)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 DMPDA로 기능화한 MIL-100(Fe)(DMPDA-MIL-100(Fe)) 시료를 합성하고 이의 페록시다아제-모사 촉매 활성을 테스트하였다.
실시예 4: MOF 시료로서 TMBDA 도입된 MIL-100(Fe)의 제조
에틸렌디아민 대신에 N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-부탄디아민(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 TMBDA로 기능화한 MIL-100(Fe)(TMBDA-MIL-100(Fe)) 시료를 합성하고 이의 페록시다아제-모사 촉매 활성을 테스트하였다.
실시예 5: MOF 시료로서 ODA 도입된 MIL-100(Fe)의 제조
에틸렌디아민 대신에 1,8-옥탄디아민(1,8-Octanediamine; ODA)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 ODA로 기능화한 MIL-100(Fe)(ODA-MIL-100(Fe)) 시료를 합성하고 이의 페록시다아제-모사 촉매 활성을 테스트하였다.
실험예 1: MOF의 특성분석
상기 제조예 1 및 실시예 1, 3 내지 5에 따라 준비한 MOF 시료, 비처리 MIL-100(Fe)와 ED, DMPDA, TMBDA 및 ODA로 기능화한 MIL-100(Fe)의 결정성 및 순도를 X-선 분말 회절 분석(X-ray powder diffraction analysis; XRPD; Rigaku, Ni-filtered Cu Kα radiation)으로 확인하였다. Micromeritics Tristar 3000을 사용하여 77K에서 N2 물리흡착 등온선(physisorption isotherms)을 얻었다. N2 흡습에 앞서 각 시료를 진공 하에 423K에서 12시간 동안 탈수시켰다. Brunauer-Emmett-Teller (BET) 방법으로 표면적을 산출하였으며, P/P0 = 0.99에서 단일지점법(single point method)에 의해 기공 부피를 결정하였다. 밀도 함수 이론 방법(Density functional theory method)을 적용하여 기공 크기 분포를 결정하였다. MOFs의 형태적 성질은 주사전자현미경(scanning electron microscopy; SEM, Tescan Mira 3 LMU FEG with an accelerating voltage of 10 kV)을 사용하여 연구하였다. 아민 기능화된 MOFs 내의 질소 함량을 원소분석(elemental analysis; EA)에 의해 결정하였다. MIL-100(Fe) 상에 아민 도입을 확인하기 위하여 FTIR 분석을 사용하였으며, 자기-지지 웨이퍼(self-supported wafer)로 압축하여 이를 위한 시료를 준비하고, 423 K에서 밤새도록 He로 배기(purging) 후, 동일 온도에서 Nicolet FT-IR 분광기(iS50)를 사용하여 스펙트럼을 기록하였다. 여기원(exciting source, 1486.6 eV)으로 AlKa를 사용하여 약 5×10-9 토르의 압력에서 15 kV 및 10 mA로 구동되는 Kratos Axis Ultra (DLD) 광전자 분광계를 이용한 X-선 광전자 분광(X-Ray photoelectron spectroscopy; XPS) 분석을 수행하여 MOFs의 표면 상에서 아민기의 존재를 검출하였다.
실험예 2: AUR 또는 TMB 기질에 대한 MOF 촉매의 페록시다아제 모사 활성 분석
H2O2(1 mM), MOF(0.2 mg/mL), 및 트리스 아세테이트 완충액(5 mM, pH 7)에 용해시킨 AUR(50 μM) 또는 TMB(1 mM)을 포함하는 50 μL 반응용액에서 일련의 MOFs의 페록시다아제 모사 활성을 흡광도 및/또는 형광 스펙트럼 측정을 통해 확인하였다. 구체적으로, 350 내지 700 nm 파장에서 흡광도를, 570 내지 650 nm 범위에서 형광을 측정하였다.
실험예 3: 콜린 및 아세틸콜린의 정량
본 발명의 촉매를 이용하여 하기의 단일 단계 반응에 따라 콜린 분석을 수행하였다. 구체적으로, 다양한 농도의 콜린(1 내지 200 μM)과 ChOx(0.6 U/mL), TMBDA-MIL-100(Fe)(0.2 mg/mL) 및 트리스 아세테이트 완충액(5 mL, pH 7)에 용해시킨 AUR(50 μM)을 포함하며, 37℃에서 30분 동안 반응시킨, 50 μL 반응 용액에 대해 570 내지 650 nm 범위에서 형광을 측정하였다.
또한, 본 발명의 촉매를 이용하여 하기의 단일 단계 반응에 따라 아세틸콜린 분석을 수행하였다. 구체적으로, 다양한 농도의 Ach(1 내지 500 μM)과 AChE(5 U/mL), ChOx(0.5 U/mL), TMBDA-MIL-100(Fe)(0.2 mg/mL) 및 트리스 아세테이트 완충액(5 mL, pH 7)에 용해시킨 AUR(50 μM)을 포함하며, 37℃에서 30분 동안 반응시킨, 50 μL 반응 용액에 대해 570 내지 650 nm 범위에서 형광을 측정하였다.
형광 세기는 588 nm를 여기 파장으로 Tecan Infinite M200 pro 마이크로플레이트리더(Mnnedorf, Switzerland) 및 블랙, 384-웰 grenier Bio-one 마이크로플레이트(ref: 781077, courtaboeuf, France)를 사용하여 측정하였다.
미카엘리스-멘텐 방정식의 이중 역비례(double reciprocal)의 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 플롯을 사용하여 미카엘리스-멘텐 상수를 도출하였다:
Figure PCTKR2018002293-appb-I000001
.
이때, v는 초기 속도(initial velocity), Vmax는 최대 반응 속도를 나타내며, C는 기질의 농도에 상응하고, Km은 미카엘리스 상수이다.
<결과>
1. MIL-100(Fe)의 CUS 상에서 아민 도입
도 1에 나타난 바와 같이, MIL-100(Fe)의 CUS 상에서의 디아민 결합에 의해, 합성 후 아민 기능화(post synthetic amine functionalization)를 수행하였다. 디아민 화합물로는 에틸렌디아민(ED), N,N'-디메틸-1,3-프로판디아민(DMPDA) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-부탄디아민(TMBDA)을 주로 사용하였다. 이들 화합물은 질소 원자에 부착된 알킬기의 수에 기초하여 일차 아민(primary amine, 예컨대 ED), 이차 아민(secondary amine, 예컨대 DMPDA) 및 3차 아민(tertiary amine, 예컨대 TMBDA)으로 구분되었다. 이들 분자는 상이한 분자 크기를 가지며, 분자 크기는 분자 내에서 2개 아민기 사이에 연결된 탄소사슬의 연장으로 인해 ED< DMPDA<TMBDA 순으로 증가한다.
아민 개질된 MIL-100(Fe) 골격의 안정성을 XRPD를 사용하여 확인하였다(도 2). 기능화된 시료의 분말 회절 패턴은 피크 세기 감소를 나타내었다. 이는 MOF의 기공 내에서 디아민의 결합으로 인해 피크 세기가 감소한다는 이전의 보고와 일치하는 것이었다. 그러나, 구조는 기능화 후에도 우수한 결정성을 가진 채로 여전히 보존되었다. 비처리 및 아민 기능화된 시료의 조직 특성(textural properties)을 하기 표 2에 나타내었다.
시료 SBET(m2/g) PV(cm3/g) "N" 함량(mmol/g) 아민 함량(mmol/g) 제타 전위(mV)
MIL-100(Fe) 2060 1.07 0.0 NA -21.5
ED-MIL-100(Fe) 1504 0.74 0.71 0.36 -23.7
DMPDA-MIL-100(Fe) 1309 0.64 0.64 0.32 -30.3
TMBDA-MIL-100(Fe) 1270 0.63 0.57 0.29 -27.3
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 비처리 MIL-100(Fe)는 2060 m2/g의 BET 표면적 및 1.07 cm3/g의 기공 부피를 나타내었다. 아민 기능화 후, 표면적과 기공 부피 모두 기공 표면에 부착된 디아민의 분자 크기에 따라 감소하였으며, 부분적으로 기공이 차단되었다. 그러나, N2 흡착 등온선(adsorption isotherm) 패턴은, 도 2에 나타난 바와 같이, 기능화 후에도 그대로 유지되었다. 밀도 함수 이론(Density Functional Theory; DFT)으로부터 산출된 기공 크기 분포 프로파일은 아민 도입 후 MIL-100(Fe)의 기공 크기에 눈에 띄는 변화가 없음을 나타내었으며(도 2), 이는 "N" 함량으로부터 결정된 보다 낮은 아민 도입(loading)에 기인하는 것으로 사료되었다(표 2). MIL-100(Fe)의 CUS 상에서 디아민의 도입은 MIL-101(Cr)의 배위적으로 불포화된 자리(CUS) 상의 디아민 도입(Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 4144-4148; Bull.Korean Chem. Soc. 2011, 32, 2073)과 비교하여 더 낮았다. 상기 MOFs 모두는 각 클러스터에, 열적 활성화 후 CUS를 형성하는, 2개 말단 물분자를 갖는 삼량체적 8면체 클러스터(trimeric octahedral clusters)를 보유하며, 열적 활성화시 불충분한 물분자의 제거는 MIL-100(Fe)에서 보다 낮은 아민 도입(loading)을 유발할 수 있다. MIL-100의 기공창(5 및 9Å)은 ED와 같은 더 작은 디아민이 MIL-100의 기공에 존재하는 CUS로 접근하기에는 충분하므로, MIL-101와 비교하여 MIL-100의 보다 작은 기공 크기 및 기공 창의 역할은 배제할 수 있었다. 또한, Cabello 등은 MIL-100(Cr)의 CUS 상에 고함량(N content 4.2 mmol/g)의 에틸렌디아민을 성공적으로 도입하였다. 이는 MIL-100 골격에서 금속 중심의 변화(Cr 대신에 Fe)가 MOFs 내에서 아민의 금속과의 킬레이팅 반응에 영향을 미침을 나타내는 것이다. 이는 또한 MIL-100(Fe) 내에 존재하는 Fe (III) 중심의 전자적 배열(electronic configuration)에 의해 뒷받침될 수 있다. Fe (III)의 8면체 단위는 높은 스핀 상태를 가지며, 이에 따라 부껍질(subshell) 내의 전자는 큰 교환 에너지를 갖는다. 결과적으로, 전자가 풍부한 아민의 MIL-100(Fe)의 활성 중심과의 킬레이팅 반응은 보다 높은 에너지를 필요로 하며, Fe (III)에 대한 아민의 보다 낮은 도입율을 유도한다. 그럼에도 불구하고, MIL-100(Fe)의 표면 상에서 "N" 함유 고분자의 낮은 함량(0.02 mmol/g)의 고정(anchoring)은 치료진단 분야(theranostic application)에서 이용되는 자기공명이미징 활성에 영향을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 아민 도입된 MIL-100(Fe) 촉매에서 아민 도입을 FT-IR 분광법으로 확인하였다. 함유된 용매와 물을 제거한 후 423K에서 FT-IR 스펙트럼을 측정하였다. 도 5a에는 다른 양으로 아민 도입된 MIL-100(Fe) 화합물들과 비교하여 비처리 MIL-100(Fe)의 스펙트럼을 나타내었다. 골격에서 아민 모이어티의 존재에도 불구하고, 낮은 아민 도입율로 인해 FT-IR 패턴에서 큰 변화는 관찰되지 않았다. 그러나, 2가지 아민 도입된 시료, ED-MIL-100(Fe) 및 DMPDA-MIL-100(Fe)는 도 5a에 도시한 바와 같이 특징적인 N-H 신축 진동 모드에 기인하는 3250-3350 cm-1 영역에서 작은 추가적인 흡수띠를 나타내었다. TMBDA-MIL-100(Fe)에서 N-H 결합의 결여는 상기 영역에서 추가적인 피크를 나타내지 않았다. 비처리 MIL-100(Fe)는, 자유 트리메스산(trimesic acid)의 존재를 나타내는, C=O 신축에 상응하는 1739 cm-1에서 흡수 피크를 나타내었으며, 일차(ED) 및 이차(DMPDA) 아민으로 개질 후 상기 흡수 피크의 세기는 감소하였고, 더 낮은 파장 1733 cm- 1으로 다소 이동하였다. 이는 이들 아민기가 자유 트리메스산과 수소 결합을 형성함을 나타내는 것이다. TMBDA-MIL-100(Fe)는 TMBDA 내의 수소 결합을 위한 N-H 결합 부재로 인해 C=O 신축 주파수에서 어떠한 변화도 나타나지 않았다. MIL-100(Fe) 표면 상의 아민의 존재를 나타내기 위하여, 물질의 표면 특성분석을 위한 효과적인 수단인 X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy; XPS)을 수행하였다. 아민기에 기인하는 397 eV 근처에서의 N 1s 피크가 모든 아민 도입된 시료에서 관찰되었으며, 이는 아민 도입된 MIL-100(Fe)의 표면에서 아민 모이어티의 발생을 나타내는 것이다. 따라서, 이들 혼성 나노물질(hybrid nanomaterial)은 이들의 표면 구조에서 아민과 Fe (III) 자리의 존재로 인한 이중 기능성을 갖는다. 이는 MIL-100(Fe)의 계면의 표면 개질을 이해하는데 매우 유용하다. 표면 아민 기능성의 존재는 MIL-100(Fe) 입자의 표면 전하에 영향을 미치며, 이는 수성 매질 중의 중성 pH에서 측정된 제타전위로 나타났다(표 2). 모든 3 종의 아민 개질된 MOFs의 음의 전위는 개질되지 않은 대응물에 비해 증가되었다. 이는 아민 도입된 MIL-100(Fe) 입자의 표면 전하가 아민의 성질에 의존적임을 명확히 나타내며, 이에 따라 다른 페록시다아제 모사 활성을 나타낼 수 있음을 나타내는 것이다.
2. 아민 도입된 MIL-100(Fe)의 페록시다아제-모사 활성
MOF 플랫폼으로서 MIL-100(Fe)의 선택은, 선택된 반응 조건을 위한 전제조건 단계(prerequisite step)인, 이의 수성 매질에서의 화학적 안정성 및 생체적합성을 기초로 설명될 수 있다. 생물분자의 검지를 위한 새로운 방법을 고안하기 위하여, 순수한 MIL-100(Fe)와 함께 ED-MIL-100(Fe), DMPDA-MIL-100(Fe), 및 TMBDA-MIL-100(Fe)와 같은 다양한 아민 도입된 MOFs를 페록시다아제 모사 나노물질로 사용하여 H2O2 존재 하에 TMB의 산화반응을 수행하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 촉매를 첨가하지 않은 TMB 또는 TMB-H2O2 용액에서 색 변화가 전혀 관찰되지 않았다. 반대로, 모든 MOFs-TMB-H2O2 시스템은 진한 푸른색을 나타내었다. TMB의 산화에 기인하는, 370 nm 및 650 nm에 중심이 있는 두 개의 대표적인 흡수 피크가 관찰되었다. 활성 금속 중심으로 Fe (III)을 갖는 Fe-MOFs는 H2O2의 촉매적 분해로부터 생성되는 ·OH를 통해 TMB 분자를 산화할 수 있으며, 동시에 푸른 색의 산화된 TMB(oxTMB)를 생성하였다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, MIL-100(Fe)의 페록시다아제 활성은 아민으로 기능화한 후 현저히 향상되었다.
아민 기능화된 MOFs 입자 상의 증가된 음의 전하는 정전기적 인력을 통해 양으로 하전된 TMB 분자에 대한 결합력(affinity)을 향상시키는데 유리하다. 이러한 현상은 TMB 기질에 대해 다양한 음으로 하전된 표면을 갖는 물질을 사용하는 것으로 보고되었다. 아민 도입된 MOFs 중에서, TMBDA-MIL-100(Fe)은, DMPDA 및 ED 개질된 MIL-100(Fe) 순으로 이어지는, 가장 높은 페록시다아제 모사 촉매 활성을 나타낸다. 테스트한 MOFs 중 가장 큰 음의 전위(-30.3 eV)를 갖는 대신에, DMPDA- MIL-100(Fe)은 TMBDA-MIL-100(Fe)에 비해 더 낮은 페록시다아제 모사 활성을 나타내었으며, 이는 증가된 음의 전위가 향상된 촉매 활성의 유일한 이유는 아닐 수 있음을 나타내는 것이다. 도입된 디아민들은 분자 크기가 상이하며, 2개 질소 원자 사이의 탄소 사슬의 연장 및 질소 원자 상에서 메틸기에 의한 수소의 치환으로 인한 소수성에서도 차이가 있다. 아민 도입된 MIL-100(Fe)의 페록시다아제-유사 활성은 도입된 아민의 분자 크기 및 소수성이 증가함에 따라 증가하였다(ED< DMPDA<TMBDA). 이는 도입된 디아민의 크기 및 소수성의 차이가 또한 정전기적 인력과 함께 MOFs의 촉매 활성에 기여할 수 있음을 나타내는 것이다. Abedi et al.은 MOF 구조의 반응 중심 근처 환경의 약간의 소수성 변화가 알돌형(aldol-type) 축합 반응에서 기질 선택성을 변화시킬 수 있음을 보고하였다.
이를 확인하기 위하여, MIL-100(Fe)의 CUS에 1,8-옥탄디아민(1,8-octanediamine; ODA)을 도입하였다(표 3). ODA는 TMBDA에 비해 더 큰 분자 크기 및 보다 소수성을 갖는 긴 탄소 사슬 디아민이다. 나아가, 이의 페록시다아제 유사 활성을 테스트하였으며, 모든 다른 아민으로 개질된 MIL-100(Fe)에 비해 낮은 활성을 나타내었으나, 여전히 비처리 MIL-100(Fe)에 비해서는 높은 활성을 갖는 것을 확인하였다(도 7). 아민에서 보다 긴 탄소 사슬의 존재는 TMB 분자를 산화시키는 MOF 표면에 존재하는 활성 철 도메인을 부분적으로 가리울 수 있으며, 결과적으로 촉매 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 철 산화물 나노입자의 페록시다아제 활성에 대한 코팅 효과를 연구하고, 코팅은 촉매 활성을 향상시키는 철 산화물 표면에 음의 전하를 부여함에도 불구하고 보다 두꺼운 코팅은 입자 표면에서 활성 철 도메인을 가리움으로써 페록시다아제-유사 활성을 방해할 수 있음을 규명한 Yu등에 의한 결과와 유사하다. 따라서, 증가된 음의 표면 전하 및 MIL-100(Fe) 상에 도입되는 디아민의 조절된 분자 크기의 시너지적 효과는 페록시다아제 활성의 현저한 향상을 유도할 수 있었다. 나아가, TMBDA-MIL-100(Fe)의 페록시다아제-유사 활성을 H2O2 존재 하에 고도로 민감한 Amplex ultrared®(AUR, 1-(3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl)ethanone) 기질의 산화반응을 촉매함으로써 확인하였다. AUR과의 반응 역시 전형적인 색상 변화를 나타내었다(도 8).
시료 SBET(m2/g) PV(cm3/g) "N" 함량(mmol/g) 아민 함량(mmol/g) 제타 전위(mV)
ODA-MIL-100(Fe) 1146 0.75 1.0 0.5 -
3. 아민 도입된 MIL-100(Fe)의 정류상태 동력학 분석(steady-state kinetic assay)
TMBDA-MIL-100(Fe)의 페록시다아제 모사 활성을 정류상태 동력학 반응(steady-state kinetic reaction)으로 더 분석하였다. 적정 범위의 H2O2 및 TMB 농도 내에서, TMBDA-MIL-100(Fe)에 대해 전형적인 미카엘리스-멘텐 곡선을 획득하였다. 라인위버-버크 플롯을 이용하여 최대 초기 속도(Vmax) 및 미카엘리스-멘텐 상수(Km)와 같은 동력학 변수(kinetic parameters)를 도출하였다(표 4).
촉매 Km/mM Vmax/10-8 MS-1 출처
H2O2 TMB H2O2 TMB
HRP 0.55 0.317 2.43 3.30 1
MIL-100(Fe) 0.64 0.424 1.4 2.1 -
TMBDA-MIL-100(Fe) 0.28 0.062 23.3 45 -
MIL-53(Fe) by CE 0.04 1.08 1.86 8.78 2
MIL-53(Fe) by MW 0.03 0.28 0.96 4.48 3
Fe-MIL-88-NH2 0.206 0.284 7.04 10.47 1
1: Y. L. Liu et al., Analyst, 2013, 138: 4526.2: L. Ai et al., Chem. Eur.J., 2013, 19: 15105.
3: W. Dong et al., RSC Adv., 2015, 5: 17451.
Km 값은 기질에 대한 효소의 결합력을 나타내며, 보다 작은 Km 값은 효소와 기질 간의 강한 결합력을 의미한다. 기질로서 TMB와 TMBDA-MIL-100(Fe)의 겉보기 Km은 HRP(horseradish peroxidase) 및 비처리 MIL-100(Fe) 보다 최소 5배 더 낮았으며, 이는 TMBDA-MIL-100(Fe)이 TMB에 대해 HRP 및 MIL-100(Fe) 보다 상대적으로 더 높은 결합력을 가짐을 나타내는 것이다. 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 기질로서 H2O2와 TMBDA-MIL-100(Fe)의 Km 값은 HRP 및 MIL-100(Fe) 보다 최소 2배 더 낮았고, 다른 페록시다아제-모사 Fe-MOFs의 값과 일치하였으며, 이는 TMBDA-MIL-100(Fe)가 TMBDA-MIL-100(Fe)이 H2O2에 대해 HRP 및 MIL-100(Fe) 보다 상대적으로 더 높은 결합력을 가짐을 나타내는 것이다. 이와 같이 TMBDA-MIL-100(Fe)의 더 나은 촉매 성능은, 정전기적 및 소수성 상호작용을 통해 인접한 활성 중심으로 기질이 접근하는 것을 돕는, MOF 표면 상의 계면 아민 모이어티의 존재에 기인할 수 있다. 이러한 현상은 활성 중심과 근접하게 기질을 유치하는 능력으로 인해 비범한 촉매 활성을 갖는 천연 효소와 유사하였다.
4. TMBDA -MIL-100(Fe)의 페록시다아제-유사 활성의 최적화 및 재활용 연구
HRP와 같이, TMBDA-MIL-100(Fe)의 페록시다아제 모사 활성은 pH, 온도 및 농도에 따라 현저하게 변화하였다(도 9). 2 내지 12의 pH 범위 및 293 내지 353K의 온도 범위에서 각각의 조건을 변화시키면서 TMBDA-MIL-100(Fe)의 페록시다아제-유사 활성을 측정하였다. 그 결과, TMBDA-MIL-100(Fe)는 중성 및 염기성 pH(up to 9)에서 특히 높은 촉매 활성을 나타내며, 넓은 온도 범위(293 내지 333K)에 걸쳐 효과적인 촉매임을 확인하였다. 이는 본 발명의 촉매가 높은 온도 및 pH의 반응을 수행할 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, MOF 및 완충액 농도의 효과를 각각 0.05 내지 2 mg/mL 및 1 내지 25 mM 범위에서 확인하였다. 그 결과, 2 mg/mL MOF 및 5 mM 트리스 아세테이트 완충액 농도에서 최대 촉매 활성이 관찰되었다. 적정 조건은 약 pH 7, 313 K, 2 mg/mL MOF 및 5mM 완충액이었다.
TMBDA-MIL-100(Fe)의 페록시다아제 모사 활성은 H2O2에 의해 촉진될 수 있으므로, 용액 중의 H2O2의 검출을 위한 최적의 조건을 사용하였다. 이러한 조건 하에, TMBDA-MIL-100(Fe)의 촉매 활성에 대한 H2O2의 농도에 따른 효과를 확인하였다. 588 nm의 여기 파장에서 형광 세기를 1 내지 500 μM 범위에서 H2O2 농도가 증가함에 따라 급격히 증가하였다(도 10). 도 10의 삽입도에 나타난 바와 같이, 1 내지 30 μM 범위에 걸쳐 형광 세기와 H2O2 농도 사이에서 검출한계 0.329 μM의 선형 관계(R2=0.9904)를 확인하였으며, 이는 TMBDA-MIL-100(Fe) 촉매 시스템이 H2O2 산화와 관련된 분석 시스템에 사용될 수 있음을 나타내는 것이다. 나아가, TMBDA-MIL-100(Fe)는 5회까지 재활용 테스트에서 촉매 활성에서 손실이 적은 우수한 재활용성을 나타내었다(도 11). 이와 같은 활성에서의 적은(minor) 손실은 각 사이클 후 매우 희석된 반응 용액으로부터 원심분리에 의한 MOF 나노입자의 불완전한 회수에 기인하는 것으로 여겨진다. MOF의 구조는 5회 재활용 테스트 후에도 변화하지 않고 유지됨을 SEM 분석으로 확인하였다.
5. MBDA -MIL-100(Fe)을 이용한 콜린의 검출
전술한 H2O2 검출을 위한 TMBDA-MIL-100(Fe)의 적정한(competent) 페록시다아제-모사 활성에 기초하여, 콜린 검출을 위한 단순 형광 기법을 개발하였다. 하기 식 1 및 2에 나타난 바와 같이, 콜린은 콜린산화효소(cholineoxidase)에 의해 가수분해되어, TMBDA-MIL-100(Fe)를 이용하여 산화된 AUR을 생산하는 AUR의 촉매적 산화에 사용될 수 있는, H2O2를 생성할 수 있다. OxAUR은, 콜린 검출 및 정성분석에 용이하게 이용되는, 588 nm에서 형광을 발생시킨다.
Figure PCTKR2018002293-appb-I000002
시간과 민감도를 감소시키기 위하여, 단일 단계 및 2단계 반응 시스템을 비교하였다. 단일 단계 반응 시스템의 경우, 상기 실험예 1에서와 같이, 모든 반응 성분을 동시에 첨가하는 반면, 2단계 반응 시스템에서는 AUR을 제외한 모든 다른 반응 성분을 먼저 첨가하고, 30분의 인큐베이션 후, AUR을 반응 배지에 첨가하였다. 단일 단계 반응 시스템은 2단계 반응 시스템 보다 나은 신호를 나타내었다(도 12).
먼저, 콜린 검출을 위한 반응 조건을 최적화하고, 최적화된 조건 하에서 우유 중의 콜린 검출을 달성하였다. 최적화된 조건을 찾기 위하여, pH, 온도, 및 ChOx 및 TMBDA-MIL-100(Fe)농도를 변화시켰다(도 13). 획득한 최적화된 조건은 0.6 U/mL ChOx, 0.2 mg/mL TMBDA-MIL-100(Fe), 7 pH 및 310K이었다. 나아가, 도 14에 나타난 바와 같이, 형광 세기와 0.5 내지 10 μM 범위의 콜린 농도 간의 우수한 선형의 상관관계 (R2=0.9907)를 나타내었다. 본 발명에 따른 바이오센서에 대한 검출한계(limitation of detection; LOD, 0.027 μM)는 이전에 보고된 콜린 검출을 위한 많은 다른 바이오센서보다 더 낮았다(표 5).
방법 바이오센서 LOD(μM) 검출 범위(μM) R2 출처
비색법 PtNPs 2.5 6 내지 400 0.998 4
형광 탄소점 0.025 0.025 내지 50 0.9939 5
형광 탄소점 0.1 0.1 내지 40 0.9935 6
형광 양자점 0.1 5 내지 150 N 7
전류법 F127M 5.0 5.0 내지 800 0.99 8
형광 TMBDA-MIL-100(Fe) 0.027 0.1 내지 10 0.9907 -
4: S. B. He et al., Biosens. Bioelectron, 2014, 62: 331-336.5: X. Ren et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2015, 125: 90-95.
6: J. Wei et al., Biosensors and Bioelectronics, 2014, 52: 304-309.
7: Z. Chen et al., Biosensors and Bioelectronics, 2011, 28: 50-55.
8: T. Shimomura et al., Talanta, 2009, 78: 217-220.
나아가, 본 발명의 방법의 실현가능성을 확인하기 위하여, 표준 첨가 방법(standard addition method)을 통해 우유 중의 콜린을 검출하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 콜린의 평균 회수율(mean recovery)은 약 100%였다. 이는 본 발명에 따른 콜린 검출 방법이 식품 검사(food inspection)에서 콜린 검출에 유용하게 적용될 수 있음을 나타내는 것이다.
나아가, 본 발명의 방법의 바이오센서로서의 실현가능성을 확인하기 위하여, 표준 첨가 방법(standard addition method)을 통해 우유 중의 콜린을 검출하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 콜린의 평균 회수율(mean recovery)은 약 100%였다. 이는 본 발명에 따른 콜린 검출 방법이 식품 검사(food inspection)에서 콜린 검출에 유용하게 적용될 수 있음을 나타내는 것이다.
시료 콜린 첨가량(μM) 측정값(μM) RSD(%, n=3) 회수율(%) 상대오차(%)
1 4 4.03 8 100.94 0.94
2 6 6.05 15 100.91 0.91
3 8 8.03 8 100.38 0.38
6. MBDA -MIL-100(Fe)을 이용한 아세틸콜린( Ach )의 검출
아세틸콜린은 말초신경계 및 중추신경계 모두에서 중요한 역할을 하며, 다양한 신경 질환을 가진 환자에서 아세틸콜린 수준 감소가 확인되었다. 따라서, 이들 질환을 치료하기 위하여, 혈액 및 신경세포와 같은 생물 시료 중의 아세틸콜린 정량이 매우 중요하다.
Figure PCTKR2018002293-appb-I000003
아세틸콜린은 아세틸콜린에스테라아제(Acetylcholinesterase; AChE)에 의해 콜린으로 변환될 수 있으며(식 3 참조), 이어서 콜린은 콜린산화효소에 의해 H2O2를 생성할 수 있고(식 1 참조), 식 2에서와 같이 MOF는 H2O2를 이용하여 AUR를 산화시켜 형광을 발생할 수 있다. 이를 실행하기 위하여, 먼저 아세틸콜린 존재 및 부재시 시간 의존적 동력학을 확인하고 온도 및 pH를 310 K 및 7에서 각각 최적화하였다(도 15). 또한 도 16에 나타난 바와 같이, 형광 세기와 1 내지 10 μM 범위에서 검출한계 0.036 μM의 아세틸콜린 농도 간의 선형 관계(R2=0.9904)를 확인하였다. 이러한 LOD는 이전에 보고된 아세틸콜린 검출에 사용된 바이오센서에 비해 현저히 낮다(표 7).
방법 바이오센서 LOD(nM) 검출 범위(μM) R2 출처
전류법 Ni-C 나피온 나노복합체 49.33 0.24 내지 828 0.9994 9
화학발광법 [Cn-D] 복합체 50 0.05 내지 100 Not given 10
비색법 PtNPs 2840 10 내지 200 0.998 4
형광 TMBDA-MIL-100(Fe) 36 0.1 내지 10 0.9907 -
9: N. Sattarahmady et al., Biosensors and Bioelectronics, 2010, 25: 2329-2335.10: N. Korbakov et al., Langmuir, 2008, 24: 2580-2587.
아세틸콜린 검출에 대한 본 발명의 검출 시스템의 높은 민감성으로부터 출발하여 표준첨가법을 통한 혈청(serum, 10%) 중의 아세틸콜린 검출을 시도하였다. 그 결과(표 8), 아세틸콜린에 대해 약 97 내지 103%의 회수율을 나타내어 첨가된 아세틸콜린과 잘 일치하였으며, 이는 형광 분석법이 혈청의 시료 매트릭스 효과로부터 가장 자유로운 방법임을 나타내는 것이다.
시료 아세틸콜린 첨가량(μM) 측정값(μM) RSD(%, n=3) 회수율(%) 상대오차(%)
1 2 1.94 3.11 97.23 -2.76
2 4 4.15 3.30 103.85 3.85
3 6 6.07 4.48 101.22 1.22

Claims (16)

  1. 배위적으로 불포화된 자리(coordinatively unsaturated site; CUS)에 아민이 도입된 철 함유 다공성 유무기 혼성체를 유효성분으로 포함하는 과산화물을 이용한 산화반응용 촉매.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아민은 탄소수 2 내지 10의 알킬렌디아민 유도체인 것인 산화반응용 촉매.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 탄소수 2 내지 10의 알킬렌디아민 유도체는 에틸렌디아민(ethylenediamine; ED), N,N'-디메틸-1,3-프로판디아민(N,N'-dimethyl-1,3-propanediamine; DMPDA), N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-부탄디아민(N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-butanediamine; TMBDA) 및 1,8-옥탄디아민(1,8-octanediamine; ODA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 촉매.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 철 함유 다공성 유무기 혼성체는 철을 포함하는 금속-유기 골격체(metal-organic framework; MOF)인 MIL-53, MIL-88, MIL-89, MIL-96, MIL-100, MIL-101, MIL-102, MIL-126, MIL-127 및 이의 기능화된 MOF로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 촉매.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 촉매는 페록시다아제 모사 활성을 갖는 것인 촉매.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 촉매는 과산화수소 존재시 페록시다아제에 의해 산화되는 기질의 촉매적 산화반응을 수행하는 것인 촉매.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 촉매; 및
    페록시다아제에 의해 산화되는 기질을 포함하는,
    과산화수소 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    0.3 ppm의 검출한계를 갖는 것인 과산화수소 검출용 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    pH 4 내지 12의 완충액을 더 포함하는 것인 과산화수소 검출용 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 페록시다아제에 의해 산화되는 기질은 산화 상태에서 색상이 변경되거나, 형광을 발생하는 것인 과산화수소 검출용 조성물.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 페록시다아제에 의해 산화되는 기질은 1-(3,7-디히드록시-10H-페녹사진-10-일)에타논(1-(3,7-dihydroxy-10H-phenoxazin-10-yl)ethanone), 10-아세틸-10H-페녹사진-3,7-디일 디아세테이트(10-acetyl-10H-phenoxazine-3,7-diyl diacetate) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; TMB)인 것인 과산화수소 검출용 조성물.
  12. 제1항의 촉매;
    페록시다아제에 의해 산화되는 기질; 및
    콜린산화효소(cholineoxidase)을 포함하는,
    콜린 검출용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    0.025 ppm의 검출한계를 갖는 것인 콜린 검출용 조성물.
  14. 제1항의 촉매;
    페록시다아제에 의해 산화되는 기질;
    콜린산화효소(cholineoxidase); 및
    아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)를 포함하는,
    아세틸콜린 검출용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    0.035 ppm의 검출한계를 갖는 것인 아세틸콜린 검출용 조성물.
  16. 제12항 또는 제14항의 조성물을 포함하는, 콜린 또는 아세틸콜린의 분비와 관련된, 뇌신경질환 진단용 조성물.
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