WO2018147446A1 - イソプレノイド化合物の製造方法 - Google Patents

イソプレノイド化合物の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018147446A1
WO2018147446A1 PCT/JP2018/004729 JP2018004729W WO2018147446A1 WO 2018147446 A1 WO2018147446 A1 WO 2018147446A1 JP 2018004729 W JP2018004729 W JP 2018004729W WO 2018147446 A1 WO2018147446 A1 WO 2018147446A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
seq
polynucleotide
amino acid
full
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/004729
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
西尾　陽介
恵 西山
葛山　智久
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of WO2018147446A1 publication Critical patent/WO2018147446A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an isoprenoid compound.
  • Isopentenyl diphosphate isomerase isopentenyl diphosphate delta isomerase: EC: 5.3.3.2
  • DMAPP dimethylallyl diphosphate
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • Non-Patent Documents 1 and 2 each include Streptomyces sp. It has been described that CL190 and Streptomyces glycerosporeus (Kitasatosporia griseola) MF730-N6 strain have isopentenyl diphosphate isomerase.
  • Non-Patent Document 3 describes that the amount of lycopene and astaxanthin produced can be increased by expressing a mevalonate pathway gene cluster derived from Streptomyces bacteria containing an isopentenyl diphosphate isomerase gene in E. coli. ing.
  • Kaneda K, Kuzuyama T, Takagi M, Hayaka Y, Seto H. An unusual isopentenyl diphosphate isomerase found in the mevalonate pathway gene cluster from Streptomyces sp. strain CL190. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jan 30; 98 (3): 932-7 Hamano Y, Dairi T, Yamamoto M, Kawasaki T, Kaneda K, Kuzuyama T, Itoh N, Seto H. Cloning of a gene cluster encoding encodings respondable for the mevalonate pathway from terpenoid-antibiotic-production streptomyces. Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Jul; 65 (7): 1627-35.
  • An object of this invention is to provide the efficient manufacturing method of an isoprenoid compound.
  • a method for producing an isoprenoid compound comprising culturing a bacterium expressing a protein selected from the group consisting of the following (A-1) to (B-3) in a culture medium to produce an isoprenoid compound.
  • A-1) a protein comprising the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 13;
  • A-2) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and having isopentenyl diphosphate isomerase activity;
  • A-3) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted in the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and having isopentenyl diphosphate isomerase activity ;
  • B-1) a protein comprising the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
  • B-2) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and having isopentenyl diphosphate isomerase activity;
  • B-3) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted in the full-length amino acid sequence of SEQ
  • A-1) a polynucleotide comprising the full-length base sequence of SEQ ID NO: 9;
  • A-2) a polynucleotide comprising a base sequence having 90% or more identity with the full-length base sequence of SEQ ID NO: 9 and encoding a protein having isopentenyl diphosphate isomerase activity;
  • A-3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the full-length base sequence of SEQ ID NO: 9 and encodes a protein having isopentenyl diphosphate isomerase activity;
  • B-1) a polynucleotide comprising the full-length base sequence of SEQ ID NO: 10;
  • B-2) a polynucleotide comprising a base sequence having 90% or more identity with the full-length base sequence of SEQ ID NO: 10 and encoding a protein having isopentenyl diphosphate isomerase activity;
  • a host cell comprising the expression vector according to [13].
  • a method for producing a protein comprising producing the protein using the host cell according to [14].
  • a bacterium comprising a heterologous expression unit comprising a polynucleotide encoding the protein of [10] or [11] and a promoter operably linked thereto.
  • the bacterium according to [16] wherein the bacterium belongs to the family Enterobacteriaceae.
  • an excellent isoprenoid compound production system can be established.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the alignment and matching degree between cs79IDI and gfgk858IDI.
  • FIG. 2 is a diagram showing the molecular mass analysis results of ecIDI, cs79IDI, and fgk858IDI by SDS-PAGE.
  • M indicates a molecular weight marker
  • 1 indicates a result of ecIDI
  • 2 indicates a result of cs79IDI
  • 3 indicates a result of fgk858IDI.
  • FIG. 3 shows a 1 H-NMR chart before the start of the reaction (left diagram) and after the addition of the enzyme (right diagram).
  • FIG. 4 is a graph showing stoichiometry in the isomerization reaction of IPP and DMAPP of each enzyme.
  • the graph on the left shows the isomerization reaction of each enzyme using IPP and the graph on the right shows DMAPP as the starting substrate.
  • the present invention provides a method for producing an isoprenoid compound.
  • the method of the invention comprises culturing a microorganism expressing isopentenyl diphosphate isomerase in a culture medium to produce an isoprenoid compound.
  • the isoprenoid compound consists of one or more isoprene units having the molecular formula (C 5 H 8 ) n .
  • the precursor of the isoprene unit is isopentenyl pyrophosphate or dimethylallyl pyrophosphate.
  • 30,000 isoprenoid compounds have been identified and new compounds have been identified.
  • Isoprenoid compounds are also referred to as “terpenes” or “terpenoids”. The difference between terpenes and terpenoids is that terpenoids are hydrocarbons, whereas terpenoids contain additional functional groups.
  • Terpenes are classified according to the number of isoprene units in the molecule [for example, hemiterpene (C5), monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), diterpene (C20), sesterterpene (C25), triterpene (C30), Sescal terpenes (C35), tetraterpenes (C40), polyterpenes, norisoprenoids].
  • monoterpenes include pinene, nerol, citral, camphor, menthol, limonene, and linalool.
  • sesquiterpenes include nerolidol and farnesol.
  • diterpenes include phytol and vitamin A1.
  • Squalene is an example of a triterpene and carotene (provitamin A1) is a tetraterpene (Nature Chemical Biology 2,674 to 681 (2006); Nature Chemical Biology 5,283 to 291 (2009); Nature Reviews 9 Microbiols 37 Adv Biochem Eng Biotechmol (DOI: 10.1007 / 10 — 2014 — 288)
  • Irregular isoprenoids and polyterpenes have been reported and are also included in the isoprenoid compounds: “isoprenoid”, “isoprenoid compound”, “ The terms terpene, terpene compound, terpenoid, and terpenoid compound are They are used interchangeably in writing.
  • Isopentenyl diphosphate isomerase isopentenyl diphosphate delta isomerase: EC: 5.3.3.2
  • DMAPP dimethylallyl diphosphate
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • the present inventors have found that the proteins described below have higher isomerization activity than the previously reported isopentenyl diphosphate isomerase.
  • the protein of the invention is: (A-1) a protein comprising the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (B-1) a protein comprising the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • SEQ ID NO: 13 is an actinomycete Streptomyces sp. It is the amino acid sequence of FGK858-derived isopentenyl diphosphate isomerase FGK858IDI.
  • SEQ ID NO: 14 is an actinomycete Streptomyces sp. It is the amino acid sequence of isopentenyl diphosphate isomerase CS79IDI derived from CS79. The identity obtained by using EMBOSS Stretcher (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/help/index-protein.html) is 75.8%, and the homology is 83. 7% (see FIG. 1, Example 3 and Table 7), both having many common sequence portions.
  • the protein of the present invention is a homologous protein of the protein of (A-1) or (B-1).
  • homologous proteins include the following: (A-2) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and having isopentenyl diphosphate isomerase activity; and (B-2) a full-length amino acid of SEQ ID NO: 14 A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with a sequence and having isopentenyl diphosphate isomerase activity.
  • The% identity with the amino acid sequence may be 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more.
  • the protein of the present invention is a modified protein of the protein of (A-1) or (B-1).
  • modified proteins include the following: (A-3) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted in the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and having isopentenyl diphosphate isomerase activity And (B-3) an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted in the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and have isopentenyl diphosphate isomerase activity Protein.
  • one or several amino acid residues can be modified by 1, 2, 3 or 4 mutations selected from the group consisting of deletion, substitution, addition and insertion of amino acid residues.
  • the amino acid residue mutation may be introduced into one region in the amino acid sequence, or may be introduced into a plurality of different regions.
  • the term “one or several” refers to a number that does not significantly impair the activity of the protein.
  • the number represented by the term “one or several” is, for example, 1 to 100, preferably 1 to 80, more preferably 1 to 50, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10 or 1 to 5 (eg, 1, 2, 3, 4, or 5).
  • isopentenyl diphosphate isomerase activity refers to an enzyme activity that isomerizes isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP) with each other.
  • the protein isopentenyl diphosphate isomerase activity of the present invention is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more of the isopentenyl diphosphate isomerase activity of the protein (A-1) or (B-1). 90% or more, or preferably 95% or more.
  • reaction time when the concentration of IPP and DMAPP is 1 1 in the same reaction solution (eg, 50 mM imidazole (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 , 6.7 mM IPP, and 1.0 mg / ml enzyme).
  • reaction time when the concentration of IPP and DMAPP reaches an equilibrium state is not particularly limited, but is about 1.1 times or less, about 1.2 times or less, about 1.3 times or less, about 1 .4 times or less, or about 1.5 times or less.
  • the protein of the present invention may have mutations introduced at sites in the catalytic domain and at sites other than the catalytic domain as long as the target activity can be maintained.
  • the positions of amino acid residues to which mutations can be introduced that can retain the desired activity will be apparent to those skilled in the art. Specifically, a person skilled in the art compares 1) the amino acid sequences of a plurality of proteins having the same type of activity (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 14 and the amino acid sequence of other isopentenyl diphosphate isomerase).
  • amino acid residue substitution may be a conservative substitution.
  • conservative substitution refers to the replacement of a given amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art.
  • such families include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having uncharged polar side chains (Eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chain Amino acids (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), amino acids having side groups containing hydroxyl groups (eg, alcoholic, phenolic) ( Example, serine, thread Nin, tyrosine), and amino acids (e.g.
  • the conservative substitution of amino acids is a substitution between aspartic acid and glutamic acid, a substitution between arginine and lysine and histidine, a substitution between tryptophan and phenylalanine, and between phenylalanine and valine. Or a substitution between leucine, isoleucine and alanine, and a substitution between glycine and alanine.
  • the protein of the present invention may also be a fusion protein linked to a heterologous moiety via a peptide bond.
  • heterogeneous moieties include peptide components that facilitate the purification of the target protein (eg, tag sections such as histidine tag, Strep-tag II, etc .; purification of target proteins such as glutathione-S-transferase, maltose binding protein, etc. ), Peptide components that improve the solubility of the target protein (eg, Nus-tag), peptide components that act as chaperones (eg, trigger factor), peptide components that have other functions (eg, full-length protein or its protein) Some), as well as linkers.
  • tag sections such as histidine tag, Strep-tag II, etc .
  • target proteins such as glutathione-S-transferase, maltose binding protein, etc.
  • Peptide components that improve the solubility of the target protein eg, Nus-tag
  • the proteins of the invention can also be post-translationally modified (eg, glycosylated) proteins, or post-translationally unmodified (eg, non-glycosylated) proteins, depending on the type of host cell in which production of the protein of the invention is desired. There may be. Since the protein of the present invention is derived from the eukaryotic ginkgo, it is considered that it may be post-translationally modified (eg, glycosylated) in nature. In prokaryotes, proteins are not post-translationally modified, and in animal cells, plant cells, insect cells (eg, Sf9 cells), and lower eukaryotes (eg, yeast), the post-translational modification of proteins is very different.
  • Examples of the protein of the present invention as described above include proteins derived from actinomycetes, naturally occurring homologues, or artificially produced mutant proteins.
  • the mutant protein can be obtained, for example, by introducing a mutation into DNA encoding the target protein and producing the mutant protein using the obtained mutant DNA.
  • Examples of the mutagenesis method include site-specific mutagenesis and random mutagenesis treatment (eg, treatment with a mutagen and ultraviolet irradiation).
  • the actinomycete herein for example, Streptomyces genus, Kitasatospora spp, Streptacidiphilus genus, Pseudonocardia sp, Actinoalloteichus genus, Actinokineospora genus, Actinomycetospora genus, Actinophytocola genus, Actinosynnema spp, Alloactinosynnema genus, Allokutzneria genus, Amycolatopsis sp, Crossiella genus, Goodfellowiella Genus, Haloechinothrix, Kidelosporangium, Kutzneria, Labedaea, Lechevaleria, Lentzea, Lo gimycelium genus Prauserella genus Saccharomonospora genus Saccharopolyspora genus Saccharothrix genus Sciscionella genus Streptoalloteich
  • the polynucleotide may be DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • the polynucleotide of the present invention can be derived from actinomycetes.
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the protein.
  • the polynucleotide described below may be used.
  • the polynucleotide of the present invention is: (A-1) a polynucleotide comprising the full-length base sequence of SEQ ID NO: 9; and (b-1) a polynucleotide comprising the full-length base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 9 encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 10 encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • start codon refers to a codon that specifies the start of protein synthesis.
  • start codon include, for example, a codon encoding a methionine residue (eg, AUG), a codon encoding a valine residue (eg, GUG), a codon encoding an isoleucine residue (eg, AUA), and a leucine residue Are codons (eg, UUG), and a codon (eg, AUG) encoding a methionine residue is preferred.
  • nucleotide residue “U” should be used as described above.
  • T is substituted for nucleotide residue “U”. Should be used.
  • the polynucleotide of the present invention is a homologous polynucleotide of the polynucleotide of (a) or (b).
  • homologous polynucleotides include the following: (A-2) a polynucleotide comprising a base sequence having 90% or more identity with the full-length base sequence of SEQ ID NO: 9 and encoding a protein having isopentenyl diphosphate isomerase activity; and (b-2) sequence A polynucleotide encoding a protein comprising a base sequence having 90% or more identity with the full-length base sequence of No. 10 and having isopentenyl diphosphate isomerase activity.
  • The% identity with the base sequence may be 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more.
  • the polynucleotide of the present invention is an analog polynucleotide of the polynucleotide of (a-3) or (b-3).
  • analog polynucleotides include the following: (A-3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the full-length nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and encodes a protein having isopentenyl diphosphate isomerase activity; (B-3) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the full-length base sequence of SEQ ID NO: 10 and encodes a protein having isopentenyl diphosphate isomerase activity.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • stringent conditions include hybridization at about 45 ° C. in 6 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), followed by 50 ⁇ 65 ° C. in 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. 1 or 2 or more washing
  • the polynucleotide of the invention is a degenerate polynucleotide.
  • degenerate polynucleotides include the following: (C) A degenerate variant of a polynucleotide selected from the group consisting of (a-1) to (b-3).
  • the term “degenerate variant” refers to another codon in which at least one codon encoding a given amino acid residue in a polynucleotide before mutation encodes the same amino acid residue. Refers to a polynucleotide variant that has been altered to. Since such a degenerate mutant is a mutant based on a silent mutation, the protein encoded by the degenerate mutant is the same as the protein encoded by the polynucleotide before the mutation.
  • a degenerate variant is a polynucleotide variant in which the codons have been altered to match the codon usage of the host cell into which it is to be introduced.
  • a gene is expressed in a heterologous host cell (eg, a microorganism)
  • the corresponding tRNA molecular species are not sufficiently supplied due to the difference in codon usage, resulting in decreased translation efficiency and / or incorrect translation (eg, translation). Stop) may occur.
  • the low frequency codons shown in Table 1 are known.
  • a degenerate mutant that matches the codon usage of the host cell (eg, microorganism) as described below can be used.
  • the codon encoding one or more amino acid residues selected from the group consisting of arginine residues, glycine residues, isoleucine residues, leucine residues, and proline residues is changed. It may be what was done.
  • the degenerate mutant of the present invention has one or more codons selected from the group consisting of low frequency codons (eg, AGG, AGA, CGG, CGA, GGA, AUA, CUA, and CCC). It may have been changed.
  • the degenerate variant may comprise one or more (eg, 1, 2, 3, 4 or 5) codon changes selected from the group consisting of: i) Change of at least one codon selected from the group consisting of four codons encoding Arg (AGG, AGA, CGG, and CGA) to another codon encoding Arg (CGU or CGC); ii) changing one codon (GGA) encoding Gly to another codon (GGG, GGU, or GGC); iii) changing one codon (AUA) encoding Ile to another codon (AUU, or AUC); iv) changing one codon (CUA) encoding Leu to another codon (UUG, UUA, CUG, CUU, or CUC); and v) one codon (CCC) encoding Pro. Change to another codon (CCG, CCA, or CCU).
  • codon changes selected from the group consisting of: i) Change of at least one codon selected from the group consisting of four cod
  • nucleotide residue “U” When the degenerate variant of the present invention is RNA, the nucleotide residue “U” should be used as described above. However, when the degenerate variant of the present invention is DNA, the nucleotide residue “U” is substituted. “T” should be used.
  • the number of nucleotide residue mutations for adapting to the codon usage of the host cell is not particularly limited as long as it encodes the same protein before and after the mutation. For example, 1 to 500, 1 to 400, 1 to 300 1 to 200, or 1 to 100.
  • a degenerate variant may include a change from a low frequency codon to a non-low frequency codon (eg, a high frequency codon).
  • a non-low frequency codon eg, a high frequency codon.
  • there are known methods for designing mutants in consideration of not only low-frequency codons but also factors such as suitability of the production strain to the genomic GC content (Alan Villabos et al., Gene Designer: a synthetic). biology tool for constructing artificial DNA segments, BMC Bioinformatics. 2006 Jun 6; 7: 285.), such a method may be used.
  • the above-described mutant can be appropriately prepared according to the type of any host cell into which it can be introduced (for example, a microorganism as described below).
  • a host commonly used for fermentation production of heterologous proteins. It may be made to fit the cell type.
  • host cells widely used for fermentative production of heterologous proteins include any microorganism described below, and bacteria and yeasts are preferred. Examples of such bacteria and yeasts include bacteria belonging to the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, bacteria belonging to the genus Corynebacterium such as Corynebacterium glutamicum, and Escherichia coli.
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli
  • Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis
  • Enterobacter cerevisiae such as Enterobacter aerogenes (Saccha Omyces cerevisiae) Saccharomyces (Saccharomyces) genus, and the like
  • Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces pombe
  • Schizosaccharomyces Schizosaccharomyces such
  • yeasts of the genus include yeasts of the genus. Therefore, consideration of factors such as changing the low frequency codons to non-low frequency codons in such microorganisms (eg, bacteria, yeast) and suitability for genomic GC content is preferable.
  • the expression vector of the present invention contains a polynucleotide encoding the protein of the present invention or the polynucleotide of the present invention.
  • heterologous promoter refers to a promoter other than the natural promoter of the isopentenyl diphosphate isomerase gene derived from actinomycetes. Therefore, examples of heterologous promoters include promoters of actinomycetes-derived genes other than actinomycetes-derived isopentenyl diphosphate isomerase genes, promoters derived from organisms other than actinomycetes (eg, microorganisms, animals, insects, and plants), Examples include virus-derived promoters as well as artificially synthesized promoters.
  • heterologous promoter a promoter widely used for heterologous protein production may be used.
  • promoters include PhoA promoter, PhoC promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, PR promoter, PL promoter, SP6 promoter, arabinose inducible promoter, cold A shock promoter and a tetracycline inducible promoter are mentioned.
  • the expression vector of the present invention may further contain a terminator downstream of the polynucleotide.
  • terminators include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, and Escherichia coli trpA gene terminator.
  • the expression vector of the present invention may further contain a ribosome binding site (eg, Shine-Dalgarno sequence) upstream of the start codon.
  • a ribosome binding site eg, Shine-Dalgarno sequence
  • the expression vector of the present invention may further contain a polynucleotide encoding a drug resistance gene.
  • drug resistance genes include resistance genes for drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, and phosphinothricin.
  • Examples of the expression vector of the present invention include a cell-based vector for expressing a protein in a host and a cell-free vector utilizing a protein translation system.
  • the expression vector can also be a plasmid, viral vector, phage, integrative vector, or artificial chromosome.
  • An integrative vector may be a type of vector that is integrated entirely into the genome of the host cell.
  • the integrative vector may be a vector in which only a part (eg, an expression unit described later) is integrated into the host cell genome.
  • the expression vector may further be a DNA vector or an RNA vector.
  • a known expression vector suitable for the host is used as the cell-based vector.
  • examples of such vectors include pUC (eg, pUC19, pUC18), pSTV, pBR (eg, pBR322), pHSG (eg, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF (eg, RSF1010), pACYC (eg, PACYC177, pACYC184), pMW (eg, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE (eg, pQE30), and derivatives thereof.
  • the cell-free vector examples include an expression vector having a T7 or T3 promoter, a wheat cell-free protein synthesis vector such as a pEU-based plasmid having an SP6 promoter and the like.
  • bacterium that expresses the protein of the present invention or expresses the polynucleotide of the present invention to produce the protein is used.
  • the bacterium of the present invention is a host cell containing an expression unit comprising the polynucleotide of the present invention.
  • the expression unit containing the polynucleotide of the present invention refers to the expression of the protein encoded by the polynucleotide of the present invention, including the polynucleotide of the present invention and a promoter operably linked thereto (eg, homologous promoter, heterologous promoter). A unit that makes possible.
  • Examples of the bacterium containing the expression unit containing the polynucleotide of the present invention include host cells (transformants) containing the expression vector of the present invention.
  • the host cell is not particularly limited as long as it can express the protein of the present invention.
  • the host cell may be homologous or heterologous to the protein of the present invention and the polynucleotide of the present invention, but is preferably heterologous.
  • the host cell may also be homologous or heterologous to the promoter, but is preferably heterologous.
  • Examples of host cells include animal cells, plant cells, insect cells, and microorganisms, with microorganisms being preferred.
  • Examples of the microorganism include bacteria such as bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae and fungi.
  • the bacterium may be a gram positive bacterium or a gram negative bacterium.
  • Gram-positive bacteria examples include Bacillus bacteria, Listeria bacteria, Staphylococcus bacteria, Streptococcus bacteria, Enterococcus bacteria, Clostridium bacteria, Clostridium bacteria, and Clostridium bacteria.
  • Gram-positive bacteria examples include Bacillus bacteria, Listeria bacteria, Staphylococcus bacteria, Streptococcus bacteria, Enterococcus bacteria, Clostridium bacteria, Clostridium bacteria, and Clostridium bacteria.
  • bacteria belonging to the genus Corynebacterium and bacteria belonging to the genus Streptomyces examples include bacteria belonging to the genus Bacillus and bacteria belonging to the genus Corynebacterium are preferred.
  • bacteria belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and the like, and more preferably Bacillus subtilis.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium carnae, and Corynebacterium. Is more preferable.
  • Examples of the gram-negative bacteria include Escherichia bacteria, Pantoea bacteria, Salmonella bacteria, Vibrio bacteria, Serratia bacteria, Enterobacter bacteria, and the like. Among them, Escherichia bacteria, Pantoea bacteria, Enterobacter bacteria are preferable.
  • Escherichia bacterium Escherichia coli is preferable.
  • Pantoea examples include Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, Pantoea citrea, Pantoea citreato Pantoea ananatis) and Pantoea citrea are preferred.
  • Pantoea bacterium strains exemplified in European Patent Application Publication No. 09522121 may be used.
  • Pantoea ananatis AJ13355 strain (FERM BP-6614), Pantoea ananatis AJ13356 strain (FERM BP-6615) disclosed in European Patent Application Publication No.
  • Pantoea Ananatis SC17 (0) strain Pantoea Ananatis SC17 (0) strain (Katashkina JI et al., BMC Mol Biol., 2009; 10:34) was published on 21 September 2005, Russian National Collection of Industrial My Croorganism (Russian National). Registration of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika) (Address: Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1) is registered as the accession number VKPM B-9246.
  • Enterobacter bacteria examples include Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, and the like, with Enterobacter aerogenes being preferred. Further, as the Enterobacter bacterium, a strain exemplified in European Patent Application Publication No. 09522121 may be used. Representative strains of Enterobacter bacteria include, for example, Enterobacter agglomerans ATCC 12287 strain, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 strain, Enterobacter aerogenes NBRC 12010 strain (Sakai S et al., Biotechnol. Bioeng., Vol. 98, pp. 340-348, 2007), and Enterobacter aerogenes AJ11037 (FERM BP-10955) strain.
  • Enterobacter aerogenes AJ110737 is an independent administrative corporation, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (now National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), Patent Biological Depositary Center (Tsukuba, Ibaraki, 305-8586, Japan) Deposited as FERM P-21348 at 1-chome, 1-Chome, 1st, 6th), transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on March 13, 2008, and given a receipt number of FERM BP-10955 .
  • fungi examples include the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Yarrowia, the genus Trichoderma, the genus Aspergillus, the genus Aspergillus, Preferred are microorganisms of the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Yarrowia, or the genus Trichoderma.
  • Saccharomyces The Saccharomyces (Saccharomyces) microorganisms of the genus, Saccharomyces carlsbergensis (Saccharomyces carlsbergensis), Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), Saccharomyces Deer statics (Saccharomyces diastaticus), Saccharomyces Dougurashi (Saccharomyces douglasii), Saccharomyces Kuruibera (Saccharomyces reteyveri), Saccharomyces norbensis, and Saccharomyces obiformis.
  • Karomisesu cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) is preferable.
  • Schizosaccharomyces pombe is preferable.
  • Yarrowia lipolytica is preferable.
  • Trichoderma The Trichoderma (Trichoderma) microorganisms of the genus, Trichoderma Harujianumu (Ttichoderma harzianum), Trichoderma Koningi (Trichoderma koningii), Trichoderma Rongiburakiamu (Trichoderma longibrachiatum), Trichoderma reesei (Trichoderma reesei), Trichoderma viride (Trichoderma viride) are And Trichoderma reesei is preferred.
  • DMAPP dimethylallyl diphosphate
  • the host used in the present invention includes an isoprenoid diphosphate through the mevalonic acid (MVA) pathway and / or the methylerythritol phosphate (MEP) pathway involved in the synthesis of dimethylallyl diphosphate, which is a substrate for isopentenyl diphosphate isomerase. It is not particularly limited as long as it has the ability to synthesize acid (IPP) and / or dimethylallyl diphosphate (DMAPP), and may be insect cells, animal cells, plant cells, and the like.
  • MVA mevalonic acid
  • MEP methylerythritol phosphate
  • IPP synthesize acid
  • DMAPP dimethylallyl diphosphate
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis may inherently have the ability to synthesize isoprenoid diphosphate and dimethylallyl diphosphate through the methylerythritol phosphate pathway.
  • Streptomyces sp. Actinomycetes such as CL190
  • Streptomyces davawensis may inherently have the ability to synthesize isoprenoid diphosphate and dimethylallyl diphosphate via the mevalonate pathway.
  • the bacterium of the present invention is further introduced with an expression vector for one or more enzymes involved in the mevalonate pathway and / or the methylerythritol phosphate pathway that produces IPP and / or DMAPP, which are substrates for isopentenyl diphosphate isomerase. It may be.
  • Such enzyme expression vectors may be plasmids or integrative vectors.
  • Such enzyme expression vectors may also be DNA vectors or RNA vectors.
  • Such an enzyme expression vector further expresses a plurality of (eg, 1, 2, 3 or 4 or more) enzymes involved in the mevalonate pathway and / or the methylerythritol phosphate pathway.
  • it may be an expression vector for polycistronic mRNA.
  • the origin of one or more enzymes involved in the mevalonate pathway and / or the methylerythritol phosphate pathway may be homologous or heterologous to the host.
  • the origin of the enzyme involved in the mevalonate pathway and / or the methylerythritol phosphate pathway is heterologous to the host, for example, the host is a bacterium as described above (eg, Escherichia coli), and mevalonic acid
  • At least one enzyme involved in the pathway may be derived from a fungus (eg, Saccharomyces cerevisiae).
  • one or more expression vectors introduced into the host are involved in the mevalonate pathway (eg, 1 type, 2 types). (3 types or 4 types or more) of enzymes may be expressed.
  • Examples of enzymes involved in the mevalonate (MVA) pathway include, for example, mevalonate kinase (EC: 2.7.1.36; Example 1, Erg12p, ACCESSION ID NP — 013935; Example 2, AT5G27450, ACCESSION ID NP — 001190411), phosphomevalonic acid Kinase (EC: 2.7.4.2; Example 1, Erg8p, ACCESSION ID NP_013947; Example 2, AT1G31910, ACCESSION ID NP_001185124), diphosphomevalonate decarboxylase (EC: 4.1.1.33; Example 1, Mvd1p , ACCESSION ID NP_014441; Example 2, AT2G38700, ACCESSION ID NP_181404; Example 3, AT3G54250, A CESSION ID NP_566995), acetyl-CoA-C-acetyltransferase (EC: 2.3.1.9; Example 1, Erg10p,
  • Examples of enzymes involved in the methylerythritol phosphate (MEP) pathway include 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (EC: 2.2.1.7, Example 1, Dxs, ACCESSION ID NP_414954; Example 2, AT3G21500, ACCESSION ID NP_566686; Example 3, AT4G15560, ACCESSION ID NP_193291; Example 4, AT5G11380, ACCESSION ID NP_001078570), 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (EC: 1.1.
  • Example 1 Dxr, ACCESSION ID NP_414715; Example 2, AT5G62790, ACCESSION ID NP_001190600), 4 Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase (EC: 2.7.7.60; Example 1, IspD, ACCESSION ID NP_417227; Example 2, AT2G02500, ACCESSION ID NP_565286), 4-diphosphocytidyl-2-C- Methyl-D-erythritol kinase (EC: 2.7.1.148; Example 1, IspE, ACCESSION ID NP_415726; Example 2, AT2G26930, ACCESSION ID NP_180261), 2-C-methyl-D-erythritol-2,4- Cyclodiphosphate synthase (EC: 4.6.1.12; Example 1, IspF, ACCESSION ID NP_417226;
  • the introduction (transformation) of an expression vector into which a gene has been incorporated into a host can be performed using a conventionally known method.
  • a competent cell method using microbial cells treated with calcium, an electroporation method, and the like can be mentioned.
  • a phage vector may be used to infect and introduce into a microbial cell.
  • the bacterium of the present invention preferably has an ability to synthesize isoprenoid compounds from IPP and / or DMAPP.
  • the bacterium of the present invention may be introduced with an expression vector for one or more enzymes involved in the synthesis of isoprenoid compounds from IPP and / or DMAPP.
  • Such enzyme expression vectors may be plasmids or integrative vectors.
  • Such enzyme expression vectors may also be DNA vectors or RNA vectors.
  • Such an enzyme expression vector may further express a plurality of (eg, one, two, three, or four or more) enzymes involved in isoprenoid compound synthesis.
  • polycistronic It may be an mRNA expression vector.
  • the origin of one or more enzymes involved in isoprenoid compound synthesis may be the same or different from the host.
  • the origin of an enzyme involved in isoprenoid compound synthesis is heterologous to the host, for example, the host is a bacterium as described above (eg, Escherichia coli), and at least one enzyme involved in isoprenoid compound synthesis May be derived from a fungus (eg, Saccharomyces cerevisiae).
  • the host may inherently produce an enzyme involved in isoprenoid compound synthesis.
  • Isoprene synthase EC: 4.2.2.37
  • DMAPP dimethylallyl diphosphate
  • isoprene synthase for example, Pueraria montana var.
  • Populus tremula Populus alba
  • Populus tremula x Populus alba Populus tremuloides
  • Populus tremuloides (American mountain conditioned), Populus Examples include plant-derived isoprene synthase such as trichocarpa (black cotton wood) and Salix discoror (cat willow).
  • GPP GPP synthesis using dimethylallyl diphosphate and isopentenyl diphosphate as substrates and producing geranyl diphosphate (GPP) having 10 carbon atoms through a head-to-tail type condensation reaction Enzymes. Further, by repeating this reaction in sequence, a farnesyl diphosphate (FPP) having 15 carbon atoms, a geranylgeranyl diphosphate (GGPP) having 20 carbon atoms, and a geranyl farnesyl diphosphate (GFPP) having 25 carbon atoms are obtained. Examples thereof include FPP synthase, GGPP synthase, and GFPP synthase.
  • FPP farnesyl diphosphate
  • GGPP geranylgeranyl diphosphate
  • GFPP geranyl farnesyl diphosphate
  • the chain alcohol diphosphate ester having 10 to 25 carbon atoms produced in this manner is a precursor of each terpenoid.
  • Another example is a squalene synthase that combines FPP bimolecules to synthesize squalene.
  • Squalene is known to be a common precursor for triterpenoids and steroids.
  • Another example is phytoene synthase, which synthesizes phytoene by dimerization of GGPP.
  • Phytoene is known to be a common precursor for carotenoid compounds such as astaxanthin.
  • Examples of monoterpenoid synthases using GPP as a precursor include, for example, geraniol synthase, linalool synthase, limonene synthase, myrcene synthase, oximen synthase, ⁇ -pinene synthase, ⁇ -pinene synthase, sabinene synthase, ⁇ - Examples include terpinene synthase and terpinolene synthase.
  • Examples of synthesizing enzymes of sesquiterpenoids using FPP as a precursor include farnesol synthase, valencene synthase, amorphadiene synthase, nerolidol synthase, and patchoulol synthase.
  • diterpenoid synthases having GGPP as a precursor include, for example, abietadiene synthase, fusicoccadiene synthase, kaurene synthase, taxadiene synthase, and abietadiene synthase.
  • enzymes involved in biosynthesis of isoprenoid compounds include enzymes that convert other terpenoid compounds using the generated terpenoid compounds as a substrate, in addition to enzymes that use chain alcohol diphosphate as a precursor.
  • limonene 6-monooxygenase adds a hydroxyl group to the 6-position of limonene to produce carbeol.
  • Carveol dehydrogenase generates carvone from carveol.
  • certain cytochrome P450s use valencene as a substrate to produce nootkatol.
  • certain alcohol dehydrogenases oxidize nootkatol and produce nootkatones.
  • genomic regions include, for example, the crt operon (encoding isoprenoid biosynthetic pathways such as polyprenyl synthetase, beta-carotene hydroxylase, phytoene synthase, phytoene dehydrogenase, lycopene cyclase), amp gene (eg, ampC gene, Or ampH gene).
  • the destruction of the crt operon can be advantageous because it can suppress the production of isoprenoid compounds.
  • the disruption of the amp gene can be advantageous as an ampicillin resistance gene (drug resistance selection marker) becomes available.
  • the term “disruption” for a gene means that the gene coding region is modified so that the function or expression of the protein encoded by the gene is reduced or completely lost.
  • the term “disruption” for an operon means that the genomic region corresponding to the operon has been modified to reduce or completely eliminate the function of the operon.
  • the function of an operon that can act as an enhancer eg, the crt operon described above
  • the expression of a protein encoded by a gene operably linked to the operon can be reduced or completely lost.
  • the function of an operon that can act as a repressor is reduced or completely eliminated, the expression of a protein encoded by a gene operably linked to the operon can be improved.
  • modifications include, but are not limited to, insertions, deletions and exchanges, for example.
  • the genomic region may be destroyed, for example, by introducing the above-described gene (eg, isopentenyl diphosphate isomerase gene) into the genomic region according to a known gene targeting method.
  • the above-described gene eg, isopentenyl diphosphate isomerase gene
  • Isopentenyl diphosphate isomerase may be purified from the bacterium of the present invention.
  • the purification method include a salting-out method and a method using various chromatographies.
  • an isopentenyl diphosphate isomerase can be obtained by affinity column using a metal such as nickel or a substance having affinity for the heterogeneous moiety.
  • the purity of the protein of the present invention can be increased by appropriately combining methods such as ion exchange chromatography and gel filtration chromatography.
  • the present invention provides a method for producing an isoprenoid compound, comprising producing an isoprenoid compound using the protein of the present invention.
  • the method for producing an isoprenoid compound of the present invention can be performed using the protein of the present invention itself.
  • a natural protein or a recombinant protein can be used as the protein of the present invention.
  • the recombinant protein can be obtained, for example, using a cell-free vector or from the bacterium of the present invention.
  • the protein of the present invention can be used as an unpurified, crudely purified or purified protein.
  • the method for producing an isoprenoid compound of the present invention can be performed using the bacterium of the present invention.
  • Isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate which are raw materials for the isoprenoid compound, are synthesized by the mevalonate pathway or the methyl erythritol phosphate pathway in the host, with the carbon source in the medium as the basis.
  • isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate may be added to the medium.
  • the medium for culturing the bacterium of the present invention preferably contains a carbon source for conversion to mevalonic acid or isoprene.
  • Carbon sources include carbohydrates such as monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides; invert sugars obtained by hydrolyzing sucrose; glycerol; methanol, formaldehyde, formate, carbon monoxide, carbon dioxide, and the like.
  • C1 compound oil such as corn oil, palm oil, soybean oil; acetate; animal oil; animal oil; fatty acid such as saturated fatty acid and unsaturated fatty acid; lipid; phospholipid; glycerolipid;
  • examples include glycerin fatty acid esters such as monoglycerides, diglycerides, and triglycerides; polypeptides such as microbial proteins and plant proteins; renewable carbon sources such as hydrolyzed biomass carbon sources; yeast extracts; or combinations thereof .
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like
  • it is desirable to contain an appropriate amount of a required substance such as vitamin B1, L-homoserine or a yeast extract.
  • a small amount of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion or the like is added as necessary.
  • the medium used in the present invention may be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace components as required.
  • monosaccharides include trioses such as ketotriose (dihydroxyacetone) and aldtriose (glyceraldehyde); tetroses such as ketotetrose (erythrulose) and aldetetrose (erythrose and threose); ketopentose (ribulose and xylulose), aldpentose ( Pentose such as ribose, arabinose, xylose, lyxose), deoxy sugar (deoxyribose); ketohexose (psicose, fructose, sorbose, tagatose), aldohexose (allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose) ), Deoxy sugars (fucose, fucose, rhamnose) and other hexoses; heptose such as sedoheptulose,
  • disaccharide examples include sucrose, lactose, maltose, trehalose, tunulose, and cellobiose, and sucrose and lactose are preferable.
  • oligosaccharides examples include trisaccharides such as raffinose, melezitose, and maltotriose; tetrasaccharides such as acarbose and stachyose; and other oligosaccharides such as fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS), and mannan oligosaccharide (MOS).
  • trisaccharides such as raffinose, melezitose, and maltotriose
  • tetrasaccharides such as acarbose and stachyose
  • other oligosaccharides such as fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS), and mannan oligosaccharide (MOS).
  • FOS fructooligosaccharide
  • GOS galactooligosaccharide
  • MOS mannan oligosacchari
  • polysaccharide examples include glycogen, starch (amylose, amylopectin), cellulose, dextrin, and glucan ( ⁇ 1,3-glucan), and starch and cellulose are preferable.
  • microbial proteins examples include polypeptides derived from yeast or bacteria.
  • Plant proteins include polypeptides derived from soybean, corn, canola, jatropha, palm, peanut, sunflower, coconut, mustard, cottonseed, palm kernel oil, olive, safflower, sesame and flaxseed.
  • lipids include substances containing one or more saturated or unsaturated fatty acids of C4 or higher.
  • the oil contains one or more saturated or unsaturated fatty acids of C4 or higher, and is preferably a lipid that is liquid at room temperature.
  • Soybean, corn, canola, jatropha, palm, peanut, sunflower, coconut, mustard, cottonseed, palm kernel oil examples include olives, safflowers, sesame, flaxseed, oily microbial cells, peanuts, or combinations of two or more thereof.
  • fatty acid examples include compounds represented by the formula RCOOH (“R” represents a hydrocarbon group).
  • the unsaturated fatty acid is a compound having at least one carbon-carbon double bond in “R”, and examples thereof include oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, palmitate acid, and arachidonic acid.
  • the saturated fatty acid is a compound in which “R” is a saturated aliphatic group, and examples thereof include docosanoic acid, icosanoic acid, octadecanoic acid, hexadecanoic acid, tetradecanoic acid, and dodecanoic acid.
  • fatty acids containing one or more C2 to C22 fatty acids are preferred, and those containing C12 fatty acids, C14 fatty acids, C16 fatty acids, C18 fatty acids, C20 fatty acids and C22 fatty acids are more preferred.
  • examples of the carbon source include salts of these fatty acids, derivatives, and salts of derivatives.
  • examples of the salt include lithium salt, potassium salt, sodium salt and the like.
  • examples of the carbon source include lipids, oils, fats and oils, fatty acids, combinations of glycerin fatty acid esters and carbohydrates such as glucose.
  • Renewable carbon sources include hydrolyzed biomass carbon sources.
  • Biomass carbon sources include cellulosic substrates such as wood, paper, and pulp waste, foliar plants, and pulp; plant parts such as stems, grains, roots, and tubers.
  • Plants used as a biomass carbon source include legumes such as corn, wheat, rye, sorghum, triticate, rice, millet, barley, cassava, pea, potato, sweet potato, banana, sugar cane, tapioca and the like.
  • pretreatment is preferably performed.
  • the pretreatment include enzymatic pretreatment, chemical pretreatment, and a combination of enzymatic pretreatment and chemical pretreatment.
  • examples of the carbon source include yeast extract or a combination of yeast extract and another carbon source such as glucose, and a combination of yeast extract and C1 compound such as carbon dioxide or methanol is preferable.
  • the method of culturing bacteria is preferably a method of culturing in a standard medium containing physiological saline and nutrient sources.
  • the culture medium is not particularly limited, and examples thereof include commercially available conventional culture media such as Luria Bertani (LB) broth, Sabouraud Dextrose (SD) broth, and Yeast medium (YM) broth.
  • LB Luria Bertani
  • SD Sabouraud Dextrose
  • YM Yeast medium
  • a medium suitable for cultivation of a specific host can be appropriately selected and used.
  • the cell culture medium includes suitable minerals, salts, cofactors, buffers, and ingredients known to those skilled in the art to be suitable for culture or to promote isoprene production. It is desirable.
  • the bacterium of the present invention it is preferable to add sugar, metal salt, antibacterial substance and the like to the medium in order to maintain the expression of the target protein.
  • the culture conditions of the bacterium of the present invention are not particularly limited as long as the target protein can be expressed, and standard cell culture conditions can be used.
  • the culture temperature is preferably 20 ° C. to 37 ° C.
  • the gas composition is preferably a CO 2 concentration of about 6% to about 84%, and a pH of about 5 to about 9.
  • the culture under aerobic, anoxic, or anaerobic conditions depending on the nature of the host.
  • Examples of the culture method include a method of culturing bacteria using a known fermentation method such as a batch culture method, a fed-batch culture method, or a continuous culture method.
  • the batch culture method is a method in which a medium composition is prepared at the start of fermentation, a host is inoculated into the medium, and bacteria are cultured while controlling pH, oxygen concentration, and the like.
  • the bacteria go from a mild induction phase to a logarithmic growth phase and finally to a stationary phase where the growth rate is reduced or stopped. Isoprenoid compounds are produced by transformants in the logarithmic growth phase or stationary phase.
  • the fed-batch culture method is a method in which a carbon source is gradually added as the fermentation process proceeds in addition to the batch method described above.
  • the fed-batch culture method is effective when the metabolism of bacteria tends to be suppressed by catabolite suppression and it is preferable to limit the amount of carbon source in the medium.
  • the fed-batch culture method can be performed using a limited or excessive amount of a carbon source such as glucose.
  • the continuous culture method is a culture method in which a predetermined amount of culture medium is continuously supplied to the bioreactor at a constant rate, and at the same time, the same amount of culture solution is withdrawn.
  • the culture can be kept at a constant high density, and the bacteria in the culture are mainly in the logarithmic growth phase.
  • nutrients can be replenished by replacing part or all of the medium, and accumulation of metabolic byproducts and dead cells that can adversely affect the growth of bacteria can be prevented.
  • an inducing agent such as IPTG (isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside) is added to the culture solution to express the target protein. May be induced.
  • Examples of a method for evaluating the production amount of isoprene monomer obtained by culturing the bacterium of the present invention include a method of collecting a gas phase by a headspace method and analyzing the gas phase by a gas chromatography method.
  • the isoprenoid compound in the head space when cultured in a sealed vial while shaking the culture solution containing bacteria is analyzed using standard gas chromatography.
  • the area obtained from the gas chromatography measurement curve is converted into the amount of bacterial isoprene monomer produced.
  • the method for recovering the isoprene monomer obtained by culturing the bacterium of the present invention includes gas stripping, fractional distillation, desorption of the isoprene monomer adsorbed on the solid phase from the solid phase by heat or vacuum, or by a solvent. Extraction etc. are mentioned.
  • isoprene gas is continuously removed from the outgas.
  • isoprene gas can be removed by various methods, such as adsorption to a solid phase, separation into a liquid phase, or a method of directly condensing isoprene gas.
  • the recovery of isoprene monomer can be performed in one stage or in multiple stages.
  • the separation of the isoprene monomer from the outgas and the conversion of the isoprene monomer into a liquid phase are performed simultaneously.
  • Isoprene monomer can also be condensed directly from the outgas into a liquid phase.
  • the separation of the isoprene monomer from the off-gas and the conversion of the isoprene monomer into a liquid phase are sequentially performed.
  • a method in which isoprene monomer is adsorbed on a solid phase and extracted from the solid phase with a solvent can be mentioned.
  • the method for recovering the isoprene monomer may include a step of purifying the isoprene monomer.
  • the purification step include separation from a liquid phase extract by distillation and various chromatographies.
  • the present invention also provides a method for producing an isoprene polymer.
  • the method for producing the isoprene polymer of the present invention includes the following (I) and (II): (I) producing an isoprene monomer by the method of the present invention; (II) polymerizing isoprene monomers to produce isoprene polymers.
  • Step (I) can be performed in the same manner as the above-described method for producing the isoprene monomer of the present invention.
  • the polymerization of the isoprene monomer in the step (II) can be performed by any method known in the art (eg, organic chemical synthesis method).
  • Example 1 (1-1) Construction of Escherichia coli-derived IDI expression plasmid
  • the isoprene synthase expression plasmid pSTV28-Ptac-ispS (M) -Mmamvk (WO2015 / 056813A1) shown in SEQ ID NO: 1 is used as a template, and SEQ ID NOS: 2 and 3 are used.
  • PCR Principal Sequence (registered trademark) GXL DNA polymerase; 92 ° C. for 10 seconds, 54 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 60 seconds, 40 cycles) was performed, and a DNA fragment except for the mvk (mva) gene (A ).
  • the amino acid sequence of IDI derived from Escherichia coli is set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the DNA fragment (A) and the Escherichia coli idi gene fragment (B) were ligated using In-Fusion® HD Cloning Kit, and the isoprene synthase and Escherichia coli idi co-expression plasmid pSTV28-Ptac-ispS ( M) -ecoIDI was constructed.
  • the base sequence of pSTV28-Ptac-ispS (M) -ecoIDI is set forth in SEQ ID NO: 8.
  • actinomycete-derived IDI expression plasmids Two types of idi gene fragments encoding actinomycetes-derived IDI were obtained. Two different actinomycetes-derived IDIs were obtained by artificial gene synthesis. The FGK858idi and CS79idi genes shown in SEQ ID NOs: 9 and 10 were artificially synthesized, and pUC-FGK858IDI (SEQ ID NO: 11) and pUC-CS79IDI (SEQ ID NO: 12) cloned into pUC57 were obtained (synthesis request from GenScript). The amino acid sequences of FGK858IDI and CS79IDI are set forth in SEQ ID NOs: 13 and 14.
  • PCR PrimeSTAR (registered trademark) GXL DNA polymerase; 92 ° C. 10 seconds, 54 ° C. 20 seconds, 72 ° C. 60 seconds, 40 cycles
  • PCR PrimeSTAR (registered trademark) GXL DNA polymerase; 92 ° C. 10 seconds, 54 ° C. 20 seconds, 72 ° C. 60 seconds, 40 cycles
  • SEQ ID NOS: 15 and 16 The FGK858idi gene fragment (C) was obtained.
  • the DNA fragment (A) obtained in the previous section and the actinomycete-derived FGK858idi gene fragment (C) are ligated using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit, and isoprene synthase and actinomycete-derived FGK858IDI co-expression plasmid pSTV28- Ptac-ispS (M) -FGK858IDI was constructed.
  • the base sequence of pSTV28-Ptac-ispS (M) -FGK858IDI is set forth in SEQ ID NO: 17.
  • CS79idi gene was cloned.
  • PCR PrimeSTAR (registered trademark) GXL DNA polymerase: 92 ° C. 10 seconds, 54 ° C. 20 seconds, 72 ° C. 60 seconds, 40 cycles
  • PCR PrimeSTAR (registered trademark) GXL DNA polymerase: 92 ° C. 10 seconds, 54 ° C. 20 seconds, 72 ° C. 60 seconds, 40 cycles
  • the CS79idi gene fragment (D) was obtained.
  • the DNA fragment (A) obtained in the previous section and the actinomycete-derived CS79idi gene fragment (D) are combined using an In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit, and isoprene synthase and actinomycete-derived CS79IDI co-expression plasmid pSTV28- Ptac-ispS (M) -CS79IDI was constructed.
  • the base sequence of pSTV28-Ptac-ispS (M) -CS79IDI is set forth in SEQ ID NO: 20.
  • strains were MG1655 / pSTV28-Ptac-ispS (M) -ecoIDI strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-ispS (M) -FGK858IDI strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-ispS (M) -CS79ID strain, MG1655 / It was named pSTV28-Ptac-ispS (M).
  • Pantoea ananatis-derived isoprene-producing bacteria Pantoea ananatis-derived isoprene-producing bacteria
  • Pantoea ananatis to which isoprene-producing ability was imparted was constructed as in the previous section.
  • the obtained strains were SC17 (0) / pSTV28-Ptac-ispS (M) -ecoIDI strain, SC17 (0) / pSTV28-Ptac-ispS (M) -FGK858IDI strain, SC17 (0) / pSTV28-Ptac-ispS, respectively. It was named (M) -CS79IDI strain, SC17 (0) / pSTV28-Ptac-ispS (M) strain.
  • M) strain was evenly applied to an LB plate containing 40 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 34 ° C. for 16 hours.
  • Headspace Sampler (Turbo Matrix 40 manufactured by Perkin Elmer) Vial insulation temperature 40 ° C Vial incubation time 30 min Pressurization time 3.0min Injection time 0.02min Needle temperature 70 °C Transfer temperature 80 °C Carrier gas pressure (high purity helium) 124kPa
  • Example 2 (Measurement of activity of isopentenyl diphosphate isomerase (IDI)) (2-1) IDI gene cloning Primers such as those shown in Table 5 were designed and Streptomyces sp.
  • the target gene fragment was obtained by PCR using genomic DNA of CS79 strain and FGK858 strain as a template.
  • the amplified fragment was cloned into pT7Blue T-vector (Novagen), and after confirming the base sequence, the protein expression vector pHIS8 [Biochemistry. , Vol. 39, no. 5, pp. 890-902, 2000].
  • E. coli strain into which an expression plasmid was introduced was introduced.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was used. Culture conditions and purification methods are described below.
  • E. coli-derived IDI used for activity measurement as a control has already been constructed an expression plasmid obtained by subcloning the ecIDI gene into pQE-30 vector (QIAGEN) (Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 98, no. 3, pp. 932-937, 2000), according to a conventional method.
  • a recombinant protein was prepared using E. coli strain JM109.
  • E. coli BL21 (DE3) strain into which a recombinant protein expression plasmid was introduced was precultured in LB + 50 ⁇ g / ml kanamylcin medium, and then 2% planted in TB + 50 ⁇ g / ml kanamylcin medium.
  • the culture was collected, suspended in Wash Buffer, and then sonicated.
  • the bacterial cell lysate is centrifuged at 45,100 g for 20 minutes, the collected supernatant is applied to an open column of Ni-NTA superflow (QIAGEN), washed with Wash Buffer, and then the target protein is eluted with Election Buffer. Elute. The fraction containing the target protein was concentrated with VIVA SPIN20 (10,000 MWCO PES) to obtain the target soluble protein (see FIG. 2).
  • the enzyme reaction solution shown in Table 6 (with no enzyme added) was transferred to an NMR sample tube ( ⁇ 3 mm), and 1 H-NMR was measured with a JEOL ECA-600 spectrometer. Thereafter, an enzyme was added to the reaction solution in the sample tube, and the reaction was carried out for 60 to 120 minutes in the NMR apparatus (maintaining around 27 ° C.). During this time, 1 H-NMR measurement was performed at intervals of 10 to 15 minutes, and the time-dependent changes in the peak areas of the 5-position hydrogen atom (1.65 ppm) of IPP and the 5-position hydrogen atom (1.60 ppm) of DMAPP was recorded (FIG. 3), and the stoichiometry was calculated.
  • FIG. 4 shows the stoichiometry calculated from the peak area of 1 H-NMR.
  • the graph on the left shows IPP and the graph on the right shows the isomerization reaction of each enzyme using DMAPP as the starting substrate.
  • DMAPP 2: 3 when the equilibrium state was reached in all reaction systems regardless of the added enzyme.
  • cs79IDI and fgk858IDI reached equilibrium earlier than ecIDI in any reaction system using IPP or DMAPP as the starting substrate.
  • Example 3 (Identification of amino acid sequences of various isopentenyl diphosphate isomerases) The homology analysis of the amino acid sequences of isopentenyl diphosphate isomerase listed below was performed. The analysis conditions and results are shown in Table 7.
  • CS79 Streptomyces sp. Isopentenyl diphosphate isomerase derived from CS79 (SEQ ID NO: 14)
  • FGK858 Streptomyces sp. Isopentenyl diphosphate isomerase derived from FGK858 (SEQ ID NO: 13)
  • E. E. coli Isopentenyl diphosphate isomerase derived from Escherichia coli MG1655 (SEQ ID NO: 25)
  • Streptomyces sp. Isopentenyl diphosphate isomerase derived from FGK858 and Streptomyces sp.
  • the isopentenyl diphosphate isomerase from CS79 showed high identity. Such a high identity means that this numerical value is calculated according to Streptomyces sp.
  • the method of the present invention is useful for the production of isoprenoid compounds.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、配列番号１３の全長アミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号１４の全長アミノ酸配列を含むタンパク質、及びこれらと類似又は相同の配列を含みかつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質を発現する細菌を培養培地中で培養してイソプレノイド化合物を生成することを含む、イソプレノイド化合物の製造方法を提供する。

Description

イソプレノイド化合物の製造方法
　本発明は、イソプレノイド化合物の製造方法などに関する。
　イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ：ＥＣ：５．３．３．２）は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の間の異性化反応を触媒する酵素である。非特許文献１と２にはそれぞれ、放線菌であるストレプトマイセス・ｓｐ．ＣＬ１９０、およびストレプトマイセス・グリセロスポレウス（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ　ｇｒｉｓｅｏｌａ）ＭＦ７３０－Ｎ６株がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼを有することが記載されている。
　非特許文献３には、大腸菌においてイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子を含むストレプトマイセス属細菌由来のメバロン酸経路遺伝子クラスターを発現させることにより、リコピンやアスタキサンチンの産生量が増大し得ることが記載されている。
Ｋａｎｅｄａ　Ｋ，Ｋｕｚｕｙａｍａ　Ｔ，Ｔａｋａｇｉ　Ｍ，Ｈａｙａｋａｗａ　Ｙ，Ｓｅｔｏ　Ｈ．，Ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌ　ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　ＣＬ１９０．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２００１　Ｊａｎ　３０；９８（３）：９３２－７ Ｈａｍａｎｏ　Ｙ，Ｄａｉｒｉ　Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ，Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｔ，Ｋａｎｅｄａ　Ｋ，Ｋｕｚｕｙａｍａ　Ｔ，Ｉｔｏｈ　Ｎ，Ｓｅｔｏ　Ｈ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｒｏｍ　ａ　ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ－ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｒａｉｎ．Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１　Ｊｕｌ；６５（７）：１６２７－３５． Ｈａｒａｄａ　Ｈ，Ｙｕ　Ｆ，Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｓ，Ｋｕｚｕｙａｍａ　Ｔ，Ｕｔｓｕｍｉ　Ｒ，Ｍｉｓａｗａ　Ｎ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９　Ｊａｎ；８１（５）：９１５－２５
　しかし、従来知られている放線菌由来イソペンテニル二リン酸イソメラーゼを異種発現させても、イソプレノイド化合物を十分に効率的に産生することができなかった。本発明は、イソプレノイド化合物の効率的な製造方法を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の（Ａ－１）～（Ｂ－３）からなる群より選ばれるタンパク質を発現する細菌を培養培地中で培養してイソプレノイド化合物を生成することを含む、イソプレノイド化合物の製造方法。
（Ａ－１）配列番号１３の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ａ－２）配列番号１３の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ａ－３）配列番号１３の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｂ－１）配列番号１４の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ－２）配列番号１４の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｂ－３）配列番号１４の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔２〕前記タンパク質が放線菌に由来する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記細菌は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ－１）～（ｃ）からなる群より選ばれる１または２以上のポリヌクレオチドである、〔３〕に記載の方法。
（ａ－１）配列番号９の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ａ－２）配列番号９の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ－３）配列番号９の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ－１）配列番号１０の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ－２）配列番号１０の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ－３）配列番号１０の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ－１）～（ｂ－３）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔５〕前記細菌が、メチルエリスリトールリン酸経路および／またはメバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸またはジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕前記細菌は、イソプレノイド化合物合成活性を有するタンパク質をさらに発現する細菌である、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕前記細菌は、腸内細菌科に属する細菌である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕前記細菌は、エシェリヒア属またはパントエア属に属する細菌である、〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記細菌がエシェリヒア・コリまたはパントエア・アナナティスである、〔７〕または〔８〕に記載の方法。
〔１０〕以下の（Ａ－１）～（Ｂ－３）からなる群より選ばれるタンパク質：
（Ａ－１）配列番号１３の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ａ－２）配列番号１３の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ａ－３）配列番号１３の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｂ－１）配列番号１４の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ－２）配列番号１４の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｂ－３）配列番号１４の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔１１〕放線菌に由来する、〔１０〕に記載のタンパク質。
〔１２〕以下の（ａ－１）～（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド：
（ａ－１）配列番号９の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ａ－２）配列番号９の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ－３）配列番号９の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ－１）配列番号１０の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ－２）配列番号１０の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ－３）配列番号１０の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ－１）～（ｂ－３）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔１３〕〔１０〕または〔１１〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または〔１２〕に記載のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結された異種プロモーターを含む、発現ベクター。
〔１４〕〔１３〕に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
〔１５〕〔１４〕に記載の宿主細胞を用いて前記タンパク質を産生することを含む、タンパク質の製造方法。
〔１６〕〔１０〕または〔１１〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、細菌。
〔１７〕前記細菌は、腸内細菌科に属する細菌である、〔１６〕に記載の細菌。
〔１８〕エシェリヒア属またはパントエア属に属する細菌である、〔１６〕または〔１７〕に記載の細菌。
〔１９〕エシェリヒア・コリまたはパントエア・アナナティスである、〔１６〕～〔１８〕のいずれか１項に記載の細菌。
　本発明によれば、優れたイソプレノイド化合物生産系を確立することができる。
図１は、ｃｓ７９ＩＤＩとｇｆｇｋ８５８ＩＤＩのアライメントと一致度を示す図である。 図２は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるｅｃＩＤＩとｃｓ７９ＩＤＩとｆｇｋ８５８ＩＤＩの分子質量の解析結果を示す図である。図中、Ｍはｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｒｋｅｒを、１はｅｃＩＤＩの結果を、２はｃｓ７９ＩＤＩの結果を、３はｆｇｋ８５８ＩＤＩの結果をそれぞれ示す。 図３は、反応開始前（左図）および酵素添加後（右図）の1Ｈ－ＮＭＲチャートを示す図である。図中、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、ピーク上部の数値はピーク面積の相対値を表す。 図４は、各酵素のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの異性化反応におけるストイキオメトリーを示すグラフである。左側のグラフはＩＰＰを、右側のグラフはＤＭＡＰＰを、それぞれ開始基質とした各酵素の異性化反応を示す。
　本発明は、イソプレノイド化合物の製造方法を提供する。本発明の方法は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼを発現する微生物を培養培地中で培養してイソプレノイド化合物を生成することを含む。
　イソプレノイド化合物は、分子式（Ｃ5Ｈ8）nを有する１以上のイソプレン単位からなる。イソプレン単位の前駆体は、イソペンテニルピロリン酸、またはジメチルアリルピロリン酸である。３０，０００種のイソプレノイド化合物が同定されており、新たな化合物が同定されている。イソプレノイド化合物は、「テルペン」または「テルペノイド」とも呼ばれる。テルペンとテルペノイドとの相違は、テルペンが炭化水素であるのに対し、テルペノイドはさらなる官能基を含む点にある。テルペンは、分子中のイソプレン単位数により分類される〔例えば、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セステルテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、セスカルテルペン（Ｃ３５）、テトラテルペン（Ｃ４０）、ポリテルペン、ノルイソプレノイド〕。モノテルペンとしては、例えば、ピネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネン、およびリナロールが挙げられる。セスキテルペンとしては、例えば、ネロリドール、およびファルネソールが挙げられる。ジテルペンとしては、例えば、フィトール、およびビタミンＡ１が挙げられる。スクアレンはトリテルペンの例であり、カロテン（プロビタミンＡ１）はテトラテルペンである（Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２，６７４～６８１（２００６）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５，２８３～２９１（２００９）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３，９３７～９４７（２００５）；Ａｄｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌ（ＤＯＩ：１０．１００７／１０＿２０１４＿２８８）。不規則なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されており、これらもイソプレノイド化合物に含まれる。「イソプレノイド」、「イソプレノイド化合物」、「テルペン」、「テルペン化合物」、「テルペノイド」、および「テルペノイド化合物」という表現は、本明細書で互換的に使用される。
　イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ：ＥＣ:５．３．３．２）は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の間の異性化反応を触媒する酵素である。本発明者らは、後述のタンパク質が、既報のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼに比し、異性化活性が高いことを見出した。
＜イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質＞
　一実施形態では、本発明のタンパク質は、以下である：
（Ａ－１）配列番号１３の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；および
（Ｂ－１）配列番号１４の全長アミノ酸配列を含むタンパク質。
　配列番号１３は、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＦＧＫ８５８由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼＦＧＫ８５８ＩＤＩのアミノ酸配列である。配列番号１４は、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＳ７９由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼＣＳ７９ＩＤＩのアミノ酸配列である。ＥＭＢＯＳＳ　Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ／ｈｅｌｐ／ｉｎｄｅｘ－ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）を使用して得られる両者の同一性は７５．８％、相同性は８３．７％であり（図１、実施例３および表７参照）、両者は多くの共通の配列部分を有している。
　別の実施形態では、本発明のタンパク質は、（Ａ－１）または（Ｂ－１）のタンパク質の相同タンパク質である。このような相同タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる：
（Ａ－２）配列番号１３の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｂ－２）配列番号１４の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
　アミノ酸配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
　上述したアミノ酸配列および後述する塩基配列の相同性（即ち、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、相同性を計算してもよい。また、相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ　Ｓｉｚｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　１９７０；４８：４４３－４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ　ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ　ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
　さらに別の実施形態では、本発明のタンパク質は、（Ａ－１）または（Ｂ－１）のタンパク質の改変タンパク質である。このような改変タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる：
（Ａ－３）配列番号１３の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｂ－３）配列番号１４の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
　上記タンパク質では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１～１００個、好ましくは１～８０個、より好ましくは１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個または１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
　本明細書中で用いられる場合、用語「イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性」とは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を相互に異性化する酵素活性をいう。本発明のタンパク質イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性は、（Ａ－１）または（Ｂ－１）のタンパク質のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。一方、同一反応液〔例、５０ｍＭ　イミダゾール（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ2、６．７ｍＭ　ＩＰＰ、および１．０ｍｇ／ｍｌ酵素〕でＩＰＰとＤＭＡＰＰの濃度が１：１になる時の反応時間が、上記（Ａ－１）または（Ｂ－１）のタンパク質の場合の反応時間に対し約１．１倍以下、約１．２倍以下、約１．３倍以下、約１．４倍以下、約１．５倍以下、約１．６倍以下、約１．７倍以下、約１．８倍以下、約１．９倍以下、約２．０倍以下、約２．１倍以下、約２．２倍以下、約２．３倍以下、約２．４倍以下、または約２．５倍以下であってもよい。あるいは、同一反応液〔例、５０ｍＭ　イミダゾール（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、６．７ｍＭ　ＤＭＡＰＰ、および１．０ｍｇ／ｍｌ酵素〕でＩＰＰとＤＭＡＰＰの濃度が平衡状態に達する時の反応時間が、上記（Ａ－１）または（Ｂ－１）のタンパク質の場合の反応時間に対し、特に限定されないが、約１．１倍以下、約１．２倍以下、約１．３倍以下、約１．４倍以下、約１．５倍以下であってもよい。
　本発明のタンパク質は、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に、変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号１３または１４のアミノ酸配列、および他のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
　アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　本発明のタンパク質はまた、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ　ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
　本発明のタンパク質はまた、本発明のタンパク質の産生が所望される宿主細胞の種類に応じて、翻訳後修飾（例、グリコシル化）タンパク質、または翻訳後非修飾（例、非グリコシル化）タンパク質であってもよい。本発明のタンパク質は、真核生物であるギンコウバイに由来するので、天然では翻訳後修飾（例、グリコシル化）される可能性があると考えられる。原核生物では、タンパク質が翻訳後修飾されないこと、ならびに動物細胞、植物細胞、昆虫細胞（例、Ｓｆ９細胞）、および下等真核生物（例、酵母）では、タンパク質の翻訳後修飾が大きく異なることが一般に知られている〔例、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９），３０（１９），３－２００を参照〕。したがって、天然で植物細胞に由来するタンパク質を、このような異種宿主細胞で産生させた場合、天然では生じ得ない、翻訳後非修飾タンパク質、または異なる翻訳後修飾を有するタンパク質を入手し得ると考えられる。
　上述したような本発明のタンパク質としては、例えば、放線菌に由来するタンパク質、天然に生じるそのホモログ、または人為的に作出された変異タンパク質が挙げられる。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、例えば、部位特異的変異導入、ならびに無作為変異導入処理（例、変異剤による処理、および紫外線照射）が挙げられる。
　本明細書において放線菌としては例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ属、Ｓｔｒｅｐｔａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属、Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ属、Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｔｉｎｏｐｈｙｔｏｃｏｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ属、Ａｌｌｏａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ属、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ属、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属、Ｃｒｏｓｓｉｅｌｌａ属、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｅｌｌａ属、Ｈａｌｏｅｃｈｉｎｏｔｈｒｉｘ属、Ｋｉｂｄｅｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ属、Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ属、Ｌａｂｅｄａｅａ属、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ属、Ｌｅｎｔｚｅａ属、Ｌｏｎｇｉｍｙｃｅｌｉｕｍ属、Ｐｒａｕｓｅｒｅｌｌａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ属、Ｓｃｉｓｃｉｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ属、Ｔａｍａｒｉｃｉｈａｂｉｔａｎｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｕｎｉｃａ属、Ｕｍｅｚａｗａｅａ属、Ｙｕｈｕｓｈｉｅｌｌａ属等の微生物が挙げられ、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物（例：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｕｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｅｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ．ｌｉｍｏｎｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＳ７９、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＦＧＫ８５８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＬ１９０）である。
＜イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードするポリヌクレオチド＞
　本発明においてポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、放線菌に由来し得る。本発明のポリヌクレオチドは、前記タンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、以下に述べるポリヌクレオチドであってもよい。
　一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、以下である：
（ａ－１）配列番号９の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ－１）配列番号１０の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド。
　配列番号９の塩基配列は、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする。配列番号１０の塩基配列は、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする。
　本明細書中で用いられる場合、用語「開始コドン」とは、タンパク質の合成開始を指定するコドンをいう。開始コドンとしては、例えば、メチオニン残基をコードするコドン（例、ＡＵＧ）、バリン残基をコードするコドン（例、ＧＵＧ）、イソロイシン残基をコードするコドン（例、ＡＵＡ）、およびロイシン残基をコードするコドン（例、ＵＵＧ）が挙げられるが、メチオニン残基をコードするコドン（例、ＡＵＧ）が好ましい。本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明のポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。
　別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドである。このような相同ポリヌクレオチドとしては、例えば、以下が挙げられる：
（ａ－２）配列番号９の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ－２）配列番号１０の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　塩基配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
　さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ａ－３）または（ｂ－３）のポリヌクレオチドのアナログポリヌクレオチドである。このようなアナログポリヌクレオチドとしては、例えば、以下が挙げられる：
（ａ－３）配列番号９の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ－３）配列番号１０の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ストリンジェント条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０～６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
　なおさらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、縮重ポリヌクレオチドである。このような縮重ポリヌクレオチドとしては、例えば、以下が挙げられる：
（ｃ）（ａ－１）～（ｂ－３）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
　本明細書中で用いられる場合、用語「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。
　好ましくは、縮重変異体は、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体である。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表１に示される低頻度コドンが知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　したがって、本発明では、後述するような宿主細胞（例、微生物）のコドン使用頻度に適合する縮重変異体を利用することができる。例えば、本発明の縮重変異体は、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、本発明の縮重変異体は、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、縮重変異体は、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
　本発明の縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明の縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１～５００個、１～４００個、１～３００個、１～２００個、または１～１００個である。
　低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、縮重変異体は、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮して変異体を設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ　Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：　ａ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ，　ＢＭＣ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．　２００６　Ｊｕｎ　６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、上述の変異体は、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できるが、例えば、異種タンパク質の発酵生産に汎用される宿主細胞の種類に適合するように作製されてもよい。異種タンパク質の発酵生産に汎用される宿主細胞としては、例えば、後述する任意の微生物が挙げられるが、細菌および酵母が好ましい。このような細菌および酵母としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）等のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等のエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ならびにサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が挙げられる。したがって、このような微生物（例、細菌、酵母）における低頻度コドンの非低頻度コドンへの変更、およびゲノムＧＣ含量適合性等の要素の考慮が好ましい。
＜発現ベクター＞
　本発明の発現ベクターは、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含む。
　本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターをさらに含んでいてもよい。用語「異種プロモーター」とは、放線菌由来イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子の天然プロモーター以外のプロモーターをいう。したがって、異種プロモーターとしては、例えば、放線菌由来イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子以外の放線菌由来遺伝子のプロモーター、放線菌以外の他の生物（例、微生物、動物、昆虫、および植物）由来プロモーター、ウイルス由来プロモーター、ならびに人工合成プロモーターが挙げられる。異種プロモーターとしてはまた、異種タンパク質生産に汎用されるプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。
　本発明の発現ベクターはまた、上記ポリヌクレオチドの下流にターミネーターをさらに含んでいてもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
　本発明の発現ベクターはまた、開始コドンの上流にリボゾーム結合部位（例、シャイン・ダルガノ配列）をさらに含んでいてもよい。
　本発明の発現ベクターはまた、薬剤耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
　本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、後述の発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
　細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。
　無細胞系ベクターとしては、例えば、Ｔ７またはＴ３プロモーターを有する発現ベクター、ＳＰ６プロモーター等を有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
＜細菌（宿主細胞、形質転換体）＞
　本発明においては、本発明のタンパク質を発現する、または本発明のポリヌクレオチドを発現してタンパク質を産生できる細菌を用いる。具体的には、本発明の細菌は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である。本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位とは、本発明のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする単位をいう。本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む細菌としては、例えば、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞（形質転換体）が挙げられる。宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現できる限り特に限定されない。宿主細胞は、本発明のタンパク質および本発明のポリヌクレオチドに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞はまた、上記プロモーターに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および微生物が挙げられるが、微生物が好ましい。微生物としては、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌等の細菌、および真菌が挙げられる。細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。
　グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
　バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
　コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
　グラム陰性細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
　エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が好ましい。
　パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ　ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ　ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１４）、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１５）、およびパントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株が挙げられる。パントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）は、２００５年９月２１にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイ　クロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（ＶＫＰＭ），　ＧＮＩＩ　Ｇｅｎｅｔｉｋａ）（住所：Ｒｕｓｓｉａ，　１１７５４５　Ｍｏｓｃｏｗ，　１　Ｄｏｒｏｚｈｎｙ　ｐｒｏｅｚｄ．　１）に受託番号ＶＫＰＭ　Ｂ－９２４６として登録されている。
　エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｓａｋａｉ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．９８，ｐｐ．３４０－３４８，２００７）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人　産業技術総合研究所（現：国立研究開発法人　産業技術総合研究所）　特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９５５の受領番号が付与されている。
　真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
　サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
　シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
　ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
　トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
　表現「ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能」については、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ　Ｃ　Ｙ　Ｃｈａｎｇ　およびＪａｙ　Ｄ　Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２，６７４－６８１（２００６）を参照のこと。
　表現「メバロン酸（ＭＶＡ）経路」については、Ｋｕｚｕｙａｍａ　ＴおよびＳｅｔｏ　Ｈ，　Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８８，４１－５２（２０１２）；Ｍｉｚｉｏｒｋｏ　ＨＭ，Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．５０５，１３１－１４３（２０１１）を参照のこと。
　表現「メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路」については、Ｋｕｚｕｙａｍａ　ＴおよびＳｅｔｏ　Ｈ，Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８８，４１－５２（２０１２）；Ｇｒaｗｅｒｔ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．６８，３７９７－３８１４（２０１１）を参照のこと。
　本発明に用いられる宿主としては、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼの基質であるジメチルアリル二リン酸の合成に関与するメバロン酸（ＭＶＡ）経路および／またはメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路によるイソプレノイド二リン酸（ＩＰＰ）および／またはジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能を備えていれば特に限定されず、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等であってもよい。例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌は、メチルエリスリトールリン酸経路によるイソプレノイド二リン酸およびジメチルアリル二リン酸の合成能を固有に有し得る。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　ＣＬ１９０、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｄａｖａｗｅｎｓｉｓ等の放線菌は、メバロン酸経路によるイソプレノイド二リン酸およびジメチルアリル二リン酸の合成能を固有に有し得る。
　本発明の細菌は、さらにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの基質であるＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰを生産するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、導入されていてもよい。このような酵素の発現ベクターは、プラスミド、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはまた、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数（例、１種、２種、３種または４種以上）の酵素を発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、エシェリヒア・コリ）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する１または複数（例、１種、２種、３種または４種以上）の酵素を発現するものであってもよい。
　メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル－ＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　Ｐ１３７０２）、アセチル－ＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。
　メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１０７８５７０）、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１９０６００）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６５２８６）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１８０２６１）、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール－２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６４８１９）、１－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル－４－二リン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１１９４６７）、４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。
　遺伝子が組込まれた発現ベクターの宿主への導入（形質転換）は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
　本発明の細菌は、ＩＰＰおよび／あるいはＤＭＡＰＰからのイソプレノイド化合物の合成能を備えていることが好ましい。本発明の細菌には、ＩＰＰおよび／あるいはＤＭＡＰＰからのイソプレノイド化合物合成に関与する１以上の酵素の発現ベクターが導入されていてもよい。このような酵素の発現ベクターは、プラスミド、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはまた、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、イソプレノイド化合物合成に関与する複数（例、１種、２種、３種または４種以上）の酵素を発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。イソプレノイド化合物合成に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。イソプレノイド化合物合成に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、エシェリヒア・コリ）であり、かつ、イソプレノイド化合物合成に関与する少なくとも１つの酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主は、イソプレノイド化合物合成に関与する酵素を固有に産生するものであってもよい。
　イソプレノイド化合物合成に関与する酵素としては、例えば、イソプレンシンターゼが挙げられる。イソプレンシンターゼ（ＥＣ：４．２．３．２７）は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに転換する酵素である。イソプレンシンターゼとしては、例えば、Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｍｏｎｔａｎａ　ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）、Ｍｕｃｕｎａ　ｐｕｒｕｒｉｅｎｓ（ムクナ）、Ｔｒｕｅ　ｍｙｒｔｌｅ（ギンコウバイ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ａｌｂａ（ギンドロ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｎｉｇｒａ（セイヨウハコヤナギ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｅｍｕｌａ　ｘ　Ｐｏｐｕｌｕｓ　ａｌｂａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｅｍｕｌａ　ｘ　Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（アメリカヤマナラシ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（ブラックコットンウツド）、Ｓａｌｉｘ　ｄｉｓｃｏｌｏｒ（ネコヤナギ）等の植物由来のイソプレンシンターゼが挙げられる。別の例として、例えば、ジメチルアリル二リン酸とイソペンテニル二リン酸を基質として利用し、ｈｅａｄ　ｔｏ　ｔａｉｌ型の縮合反応により、炭素原子数１０のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を生成するＧＰＰ合成酵素が挙げられる。更に、順次、この反応を繰り返すことにより炭素原子数１５のファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、炭素原子数２０のゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、炭素原子数２５のゲラニルファルネシル二リン酸（ＧＦＰＰ）を生成するＦＰＰ合成酵素、ＧＧＰＰ合成酵素、ＧＦＰＰ合成酵素が挙げられる。このようにして生成した炭素原子数１０から炭素原子数２５までの鎖状アルコール二リン酸エステルは、それぞれのテルペノイドの前駆体となることが知られている。別の例として、ＦＰＰ二分子を結合し、スクワレンを合成するスクワレン合成酵素が挙げられる。スクワレンはトリテルペノイドやステロイドの共通前駆体である事が知られている。別の例として、ＧＧＰＰの二量化によりフィトエンを合成するフィトエン合成酵素が挙げられる。フィトエンはアスタキサンチン等のカロテノイド化合物の共通前駆体であることが知られている。
　ＧＰＰを前駆体としたモノテルペノイド類の合成酵素の例として、例えば、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α－ピネンシンターゼ、β－ピネンシンターゼ、サビネンシンターゼ、γ－テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼが挙げられる。
　ＦＰＰを前駆体としたセスキテルペノイド類の合成酵素の例として、例えば、ファルネソールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロールシンターゼが挙げられる。
　ＧＧＰＰを前駆体としたジテルペノイド類の合成酵素の例として、例えば、アビエタジエンシンターゼ、フシコッカジエンシンターゼ、カウレンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼが挙げられる。
　イソプレノイド化合物生合成に関与する酵素として、鎖状アルコール二リン酸エステルを前駆体とした酵素以外にも、生成したテルペノイド類化合物を基質として、別のテルペノイド類化合物に変換する酵素が挙げられる。例えば、リモネン　６－モノオキシゲナーゼはリモネンの６位に水酸基を付与し、カルベオールを生成する。カルベオールデヒドロゲナーゼはカルベオールからカルボンを生成する。別の例として、ある種のシトクロムＰ４５０はバレンセンを基質とし、ヌートカトールを生成する。更に、ある種のアルコールデヒドロゲナーゼはヌートカトールを酸化し、ヌートカトンを生成する。
　本発明の細菌では、１箇所または複数（例、２、３、４または５箇所）の特定のゲノム領域（例、コーディングまたはノンコーディング領域）が、破壊されていてもよい。このようなゲノム領域としては、例えば、ｃｒｔオペロン（ポリプレニルシンテターゼ、ベータ－カロテンヒドロキシラーゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、リコペンシクラーゼ等のイソプレノイド生合成経路をコードする）、ａｍｐ遺伝子（例、ａｍｐＣ遺伝子、またはａｍｐＨ遺伝子）が挙げられる。例えば、ｃｒｔオペロンの破壊は、イソプレノイド化合物の生成を抑制できるので有利であり得る。ａｍｐ遺伝子の破壊は、アンピシリン耐性遺伝子（薬剤耐性選択マーカー）が利用可能になるので有利であり得る。
　遺伝子について用語「破壊」とは、遺伝子よりコードされるタンパク質の機能または発現を低下または完全消失させるように、遺伝子コーディング領域が改変されることを意味する。オペロンについて用語「破壊」とは、オペロンの機能を低下または完全消失させるように、オペロンに対応するゲノム領域が改変されることを意味する。エンハンサーとして作用し得るオペロン（例、上述したｃｒｔオペロン）の機能が低下または完全消失すると、当該オペロンに作動可能に連結されている遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が低下または完全消失し得る。一方、リプレッサーとして作用し得るオペロンの機能が低下または完全消失すると、当該オペロンに作動可能に連結されている遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が向上し得る。当該改変としては、例えば、挿入、欠失および交換が挙げられるが、これらに限定されない。
　ゲノム領域は、例えば、既知の遺伝子ターゲティング法に従い上述の遺伝子（例、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子）を当該ゲノム領域に導入することにより、破壊されてもよい。
　イソペンテニル二リン酸イソメラーゼは、本発明の細菌から精製されてもよい。精製方法としては、例えば、塩析法、および各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼがヒスチジンタグ等の異種部分を含むように設計されている場合、ニッケル等の金属、または異種部分に親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムにより、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼを精製することができる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせて精製することにより、本発明のタンパク質の純度を高めることができる。
＜イソプレノイド化合物の製造方法＞
　本発明は、本発明のタンパク質を用いてイソプレノイド化合物を生成することを含む、イソプレノイド化合物の製造方法を提供する。
　一実施形態では、本発明のイソプレノイド化合物の製造方法は、本発明のタンパク質自体を用いて行うこともできる。本発明のタンパク質として、天然タンパク質または組換えタンパク質を利用することができる。組換えタンパク質は、例えば、無細胞系ベクターを用いて、または本発明の細菌から得ることができる。本発明のタンパク質は、未精製、粗精製または精製タンパク質として利用することができる。
　別の実施形態では、本発明のイソプレノイド化合物の製造方法は、本発明の細菌を用いて行うことができる。イソプレノイド化合物の原料となるイソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主内のメバロン酸経路またはメチルエリスリトールリン酸経路で合成される。あるいは、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸を培地に加えてもよい。
　本発明の細菌を培養する培地としては、メバロン酸またはイソプレンに転換されるための炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素原子数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；またはこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ－ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
　単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
　二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
　オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
　多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３－グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
　微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
　植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
　脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
　オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質が好ましく、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、またはこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
　脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
　不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素－炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
　飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
　中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
　また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
　また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
　再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
　バイオマス炭素源としては、木、紙、およびパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
　バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
　バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、前処理することが好ましい。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
　再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
　また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
　本発明において、細菌の培養方法としては、生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養する方法が好ましい。
　培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ　ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
　細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、および培養に適していること、またはイソプレン産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
　本発明の細菌において、目的タンパク質の発現を維持するために、糖、金属塩、抗菌物質等を培地に添加しておくことが好ましい。
　本発明の細菌の培養条件としては、目的タンパク質の発現が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
　培養温度としては、２０℃～３７℃が好ましく、ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％～約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５～約９であることが好ましい。
　また、宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
　培養方法としては、細菌をバッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。
　バッチ培養法は、発酵開始時に培地組成物に仕込み、宿主を培地に植菌し、ｐＨや酸素濃度等の制御を行いながら細菌の培養を行う方法である。バッチ培養法による培養において、細菌は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。イソプレノイド化合物は、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。
　流加培養法は、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する方法である。流加培養法は、カタボライト抑制により細菌の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。流加培養法は、制限された量または過剰な量のグルコース等の炭素源を用いて行うことができる。
　連続培養法は、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養法では培養物を一定の高密度に保つことができ、培養液中の細菌は主に対数増殖期にある。
　適宜、培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ、細菌の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、および死細胞の蓄積を防ぐことができる。
　発現ベクターがｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターを有している場合には、培養液中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）等の誘導剤を添加して、目的タンパク質の発現を誘導してもよい。
　以下、イソプレノイド化合物がイソプレンモノマーである場合を例にとり、これらの方法を説明する。本発明の細菌を培養することにより得られるイソプレンモノマーの生産量の評価方法としては、ヘッドスペース法により気相を採取し、この気相をガスクロマトグラフィー法で分析する方法が挙げられる。
　詳細には、密封したバイアル中で細菌を含む培養液を振蕩しながら培養したときのヘッドスペース中のイソプレノイド化合物を、標準的なガスクロマトグラフィーを用いて分析する。次いで、検量線を用いて、ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、細菌のイソプレンモノマー生産量に換算する。
　本発明の細菌を培養することにより得られるイソプレンモノマーの回収方法としては、ガスストリッピング、分留、あるいは、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱若しくは真空による固相からの脱着、または溶媒による抽出等が挙げられる。
　ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、またはイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。
　イソプレンモノマーの回収は一段階または多段階で行うことができる。イソプレンモノマーを一段階で回収する場合には、アウトガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換を同時に行う。イソプレンモノマーをアウトガスから直接凝縮させて液相にすることもできる。イソプレンモノマーを多段階で回収する場合には、オフガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンモノマーを固相に吸着させ、溶媒で固相から抽出する方法が挙げられる。
　更に、イソプレンモノマーの回収方法は、イソプレンモノマーを精製する工程が含まれていてもよい。精製工程としては、液相抽出物からの蒸留による分離や各種クロマトグラフィーが挙げられる。
　本発明はまた、イソプレンポリマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
　工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法（例、有機化学的な合成法）により行うことができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１－１）エシェリヒア・コリ由来ＩＤＩ発現プラスミドの構築
　配列番号１で示したイソプレンシンターゼ発現プラスミドｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－Ｍｍａｍｖｋ（ＷＯ２０１５／０５６８１３Ａ１）を鋳型に、配列番号２、３に示したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；９２℃　１０秒、５４℃　２０秒、７２℃　６０秒、４０サイクル）を実施し、ｍｖｋ（ｍｖａ）遺伝子を除くＤＮＡ断片（Ａ）を取得した。次に、エシェリヒア・コリ由来ＩＤＩをコードするｉｄｉ遺伝子断片の取得を実施した。エシェリヒア・コリＫ－１２株のゲノムの全塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮＯ．Ｕ０００９６）は既に明らかにされている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３－１４７４（１９９７））。本配列を基にｉｄｉ遺伝子のクローニングを行った。配列番号４、５に示したオリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６，ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、エシェリヒア・コリ由来ｉｄｉ遺伝子断片（Ｂ）（配列番号６）を得た。エシェリヒア・コリ由来ＩＤＩのアミノ酸配列を配列番号７に記載する。ＤＮＡ断片（Ａ）とエシェリヒア・コリ由来ｉｄｉ遺伝子断片（Ｂ）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｒ）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結させ、イソプレンシンターゼとエシェリヒア・コリ由来ｉｄｉの共発現プラスミドｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩを構築した。ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩの塩基配列を配列番号８に記載する。
（１－２）放線菌由来ＩＤＩ発現プラスミドの構築
　放線菌由来ＩＤＩをコードする２種類のｉｄｉ遺伝子断片の取得を実施した。２種類の異なる放線菌由来ＩＤＩを人工遺伝子合成により取得した。配列番号９、１０で示したＦＧＫ８５８ｉｄｉとＣＳ７９ｉｄｉ遺伝子を人工合成し、ｐＵＣ５７にクローニングされたｐＵＣ－ＦＧＫ８５８ＩＤＩ（配列番号１１）、ｐＵＣ－ＣＳ７９ＩＤＩ（配列番号１２）を取得した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成依頼）。ＦＧＫ８５８ＩＤＩとＣＳ７９ＩＤＩのアミノ酸配列を、配列番号１３、１４に記載する。ｐＵＣ－ＦＧＫ８５８ＩＤＩを鋳型に、配列番号１５、１６で示したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；９２℃　１０秒、５４℃　２０秒、７２℃　６０秒、４０サイクル）を実施し、ＦＧＫ８５８ｉｄｉ遺伝子断片（Ｃ）を取得した。前項で得られたＤＮＡ断片（Ａ）と放線菌由来ＦＧＫ８５８ｉｄｉ遺伝子断片（Ｃ）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結させ、イソプレンシンターゼと放線菌由来ＦＧＫ８５８ＩＤＩの共発現プラスミドｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩを構築した。ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩの塩基配列を配列番号１７に記載する。
　同様にＣＳ７９ｉｄｉ遺伝子のクローニングを実施した。ｐＵＣ－ＣＳ７９ＩＤＩを鋳型に、配列番号１８、１９で示したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；９２℃　１０秒、５４℃　２０秒、７２℃　６０秒、４０サイクル）を実施し、ＣＳ７９ｉｄｉ遺伝子断片（Ｄ）を取得した。前項で得られたＤＮＡ断片（Ａ）と放線菌由来ＣＳ７９ｉｄｉ遺伝子断片（Ｄ）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて結合させ、イソプレンシンターゼと放線菌由来ＣＳ７９ＩＤＩの共発現プラスミドｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤＩを構築した。ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤＩの塩基配列を配列番号２０に記載する。
（１－３）エシェリヒア・コリ由来イソプレン生産菌の構築
　イソプレン生産能が付与されたエシェリヒア・コリを構築した。上記で得られた３種類の共発現プラスミド、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤＩ、とｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ(Ｍ)（ＷＯ２０１３／１７９７２２の実施例３参照）をエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に電気パルス法により導入した。その後、クロラムフェニコール４０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３４℃で約１６時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）と命名した。
（１－４）パントエア・アナナティス由来イソプレン生産菌の構築
　前項と同様に、イソプレン生産能が付与されたパントエア・アナナティスを構築した。上記で得られた３種類の共発現プラスミド、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤＩとｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）（ＷＯ２０１３／１７９７２２）を用いて、パントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株に電気パルス法により導入した。その後、クロラムフェニコール４０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３４℃で約１６時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩ株、ＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩ株、ＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤＩ株、ＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）株と命名した。
（１－５）エシェリヒア・コリ由来イソプレン生産菌のイソプレン生産量の測定
　エシェリヒア・コリにおいて、各ＩＤＩの発現強化がイソプレン生産能に及ぼす影響を評価した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤＩ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）株を、クロラムフェニコール４０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１６時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて４８時間培養を行った。培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定し、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｕ－２９００）によって６００ｎｍで測定した。表３に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。
　以下にガスクロマトグラフィーの分析条件とＭ９培地の組成を記載する。
Ｈｅａｄｓｐａｃｅ　Ｓａｍｐｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製　Ｔｕｒｂｏ　Ｍａｔｒｉｘ　４０）
バイアル保温温度　４０℃
バイアル保温時間　３０ｍｉｎ
加圧時間　３．０ｍｉｎ
注入時間　０．０２ｍｉｎ
ニードル温度　７０℃
トランスファー温度　８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム）　１２４ｋＰａ
ガスクロマトグラフィー（島津社製　ＧＣ－２０１０　Ｐｌｕｓ　ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）－１ｍｓ：長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ　ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度　３７℃
圧力　２４．８ｋＰａ
カラム流量　５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法　スプリット　１：０（実測１：１８）
トランスファー流量　９０ｍＬ
ＧＣ注入量　１．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量　０．１ｍＬ
注入口温度　２５０℃
検出機　ＦＩＤ（水素　４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気　４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス　ヘリウム　３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度　２５０℃
（１－６）イソプレン標準試料の調製
　試薬イソプレン（比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調製した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　培地を調製後、フィルター滅菌を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表中の各値は、ｎ＝４の平均値を表す。
（１－７）パントエア・アナナティス由来イソプレン生産菌のイソプレン生産量の測定
　前項と同様に、パントエア・アナナティスにおいて、各ＩＤＩの発現強化がイソプレン生産能に及ぼす影響を評価した。ＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｅｃｏＩＤＩ株、ＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＦＧＫ８５８ＩＤＩ株、ＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ＣＳ７９ＩＤＩ株、ＳＣ１７（０）／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）株を、クロラムフェニコール４０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１６時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて４８時間培養を行った。培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定し、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｕ－２９００）によって６００ｎｍで測定した。表４に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表中の各値は、ｎ＝４の平均値を表す。
実施例２（イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）の活性測定）
（２－１）ＩＤＩの遺伝子クローニング
　表５のようなプライマーを設計し、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＳ７９株およびＦＧＫ８５８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことで目的遺伝子断片を得た。増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、塩基配列を確認後、タンパク質発現用ベクターｐＨＩＳ８［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，ｖｏｌ．３９，ｎｏ．５，ｐｐ．８９０－９０２，２０００］にサブクローニングした。Ｎ末端にヒスチジンタグを付加した組換えタンパク質の生産には、発現用プラスミドを導入したＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。培養条件や精製方法を以下に記す。
　なお、コントロールとして活性測定に使用する大腸菌由来ＩＤＩ（ｅｃＩＤＩ）は、ｐＱＥ－３０　ｖｅｃｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ）にｅｃＩＤＩ遺伝子をサブクローニングした発現用プラスミドが構築済みであり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．９８，ｎｏ．３，ｐｐ．９３２－９３７，２０００）、定法に従いＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を用いて組換えタンパク質を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２－２）組換えタンパク質の発現と精製
　組換えタンパク質発現用プラスミドを導入したＥ.ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、ＬＢ＋５０μｇ／ｍｌ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ培地で前培養後、ＴＢ＋５０μｇ／ｍｌ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ培地に２％植菌してＯＤ600＝０．５になるまで培養し、そののち終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加して、さらに１８℃で１６時間振盪培養（１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ）した。培養液を集菌し、Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、超音波破砕した。菌体破砕液は４５，１００ｇで２０分遠心し、回収した上清をＮｉ－ＮＴＡ　ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ)のオープンカラムにアプライし、Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒで洗浄を行った後、Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて目的タンパク質を溶出させた。目的タンパク質を含む画分をＶＩＶＡ　ＳＰＩＮ２０（１０，０００　ＭＷＣＯ　ＰＥＳ）で濃縮し、目的の可溶性タンパク質を得た（図２を参照）。
（Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ）
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ８．０)
　０．５Ｍ　ＮａＣｌ
　２０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０)
（Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ）
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ８．０)
　０．５Ｍ　ＮａＣｌ
　２５０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０）
（２－３）イソペンテニル２リン酸イソメラーゼの活性測定
　ｅｃＩＤＩ（コントロール）、ｃｓ７９ＩＤＩ、ｆｇｋ８５８ＩＤＩの３種類のＩＤＩについて、ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの異性化反応およびＤＭＡＰＰからＩＰＰへの異性化反応がそれぞれどのような割合で進行するかを明らかにするため、そのストイキオメトリーを検討した。
　表６に示した酵素反応溶液（酵素は添加せず）をＮＭＲサンプルチューブ（φ３ｍｍ）に移し、ＪＥＯＬ　ＥＣＡ－６００　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで1Ｈ－ＮＭＲを測定した。その後、サンプルチューブ内の反応溶液に酵素を添加し、ＮＭＲ機器内（２７℃前後を維持）で６０～１２０分間反応させた。この間、１０～１５分の間隔で1Ｈ－ＮＭＲの測定を行い、ＩＰＰの５位水素原子（１．６５ｐｐｍ）、およびＤＭＡＰＰの５位水素原子（１．６０ｐｐｍ）のそれぞれのピーク面積の経時変化を記録することで（図３）、そのストイキオメトリーを算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２－４）結果
　1Ｈ－ＮＭＲのピーク面積から算出したストイキオメトリーを図４に示す。左側のグラフはＩＰＰを、右側のグラフはＤＭＡＰＰを開始基質とした各酵素の異性化反応を示している。実験の結果、添加した酵素にかかわらず、すべての反応系において平衡状態に達した時の基質と生成物の割合はほぼＩＰＰ：ＤＭＡＰＰ＝２：３となることがわかった。さらに、ＩＰＰまたはＤＭＡＰＰを開始基質に用いたいずれの反応系においても、ｃｓ７９ＩＤＩおよびｆｇｋ８５８ＩＤＩはｅｃＩＤＩよりも早く平衡状態に到達した。
　図４左図（ＩＰＰ→ＤＭＡＰＰ）において、ＩＰＰとＤＭＡＰＰの濃度が１：１の時の反応時間を比較すると、ｅｃＩＤＩが約７５分後であるのに対し、ｃｓ７９ＩＤＩで約２２分後、ｆｇｋ８５８ＩＤＩで約３０分後となっている。逆反応（ＤＭＡＰＰ→ＩＰＰ）でも同様に、ｃｓ７９ＩＤＩおよびｆｇｋ８５８ＩＤＩの異性化反応はｅｃＩＤＩよりも進行が早く、反応を開始して３０～４０分後には平衡に達している。以上のｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験の結果より、放線菌の二次代謝関連遺伝子クラスター内に存在するｃｓ７９ＩＤＩおよびｆｇｋ８５８ＩＤＩは、大腸菌由来ｅｃＩＤＩと比較して優れたＩＰＰとＤＭＡＰＰの異性化活性を有していることが明らかである。
実施例３（種々のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列の同一性確認）
　以下に列記するイソペンテニル二リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列の相同性分析を行った。分析条件および結果を表７に示す。
　・ＣＳ７９：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＳ７９由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（配列番号１４）
　・ＦＧＫ８５８：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＦＧＫ８５８由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（配列番号１３）
　・ＣＬ１９０：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＬ１９０由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（非特許文献１、ＧｅｎＰｅｐｔ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＢ０７７９３．１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｖｉｅｗｅｒ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｔｅｒｍ＝ＢＡＢ０７７９３．１＆ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｅｎｐｅｐｔ）
　・Ｋ．ｇｒｉｓｅｏｌａ：Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ　ｇｒｉｓｅｏｌａ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（非特許文献２、ＧｅｎＰｅｐｔ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＢ０７８２０．１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｖｉｅｗｅｒ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｔｅｒｍ＝ＢＡＢ０７８２０．１＆ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｅｎｐｅｐｔ）
　・Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｕｓｎｉｇｅｒ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｏｌａｃｅｕｓｎｉｇｅｒ　Ｔｕ　４１１３由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ＧｅｎＰｅｐｔ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：ＡＥＭ８２５４２．１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｖｉｅｗｅｒ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｔｅｒｍ＝ＡＥＭ８２５４２．１＆ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｅｎｐｅｐｔ）
　・Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（配列番号２５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
〔表７の脚注〕
　一致度：ペアワイズアラインメントにおいて｛一致した残基数｝／｛アラインメント全長｝、およびその結果を％にて表記
　ギャップ：ペアワイズアラインメントにおいて｛ギャップを生じた残基数｝／｛アラインメント全長｝、およびその結果を％にて表記
　アラインメントはＥＭＢＯＳＳのｎｅｅｄｌｅを利用した。同プログラムはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ／ｎｅｅｄｌｅにて利用可能である。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＦＧＫ８５８由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＳ７９由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼは高い同一性を示した。斯かる同一性が高いことは、この数値を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＦＧＫ８５８由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＣＳ７９由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼのそれぞれと、既知で最も同一性の高いＳ．ｖｉｏｌａｃｅｕｓｎｉｇｅｒ由来の同酵素との同一性を比較することにより明白であった。
　本発明の方法は、イソプレノイド化合物の製造に有用である。

Claims (19)

  1. 　以下の（Ａ－１）～（Ｂ－３）からなる群より選ばれるタンパク質を発現する細菌を培養培地中で培養してイソプレノイド化合物を生成することを含む、イソプレノイド化合物の製造方法。
    （Ａ－１）配列番号１３の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
    （Ａ－２）配列番号１３の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
    （Ａ－３）配列番号１３の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
    （Ｂ－１）配列番号１４の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
    （Ｂ－２）配列番号１４の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
    （Ｂ－３）配列番号１４の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　前記タンパク質が放線菌に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細菌は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ－１）～（ｃ）からなる群より選ばれる１または２以上のポリヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
    （ａ－１）配列番号９の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
    （ａ－２）配列番号９の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ａ－３）配列番号９の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ－１）配列番号１０の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
    （ｂ－２）配列番号１０の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ－３）配列番号１０の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）（ａ－１）～（ｂ－３）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
  5. 　前記細菌が、メチルエリスリトールリン酸経路および／またはメバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸またはジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記細菌は、イソプレノイド化合物合成活性を有するタンパク質をさらに発現する細菌である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記細菌は、腸内細菌科に属する細菌である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記細菌は、エシェリヒア属またはパントエア属に属する細菌である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記細菌がエシェリヒア・コリまたはパントエア・アナナティスである、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　以下の（Ａ－１）～（Ｂ－３）からなる群より選ばれるタンパク質：
    （Ａ－１）配列番号１３の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
    （Ａ－２）配列番号１３の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
    （Ａ－３）配列番号１３の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
    （Ｂ－１）配列番号１４の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
    （Ｂ－２）配列番号１４の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質；
    （Ｂ－３）配列番号１４の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
  11. 　放線菌に由来する、請求項１０に記載のタンパク質。
  12. 　以下の（ａ－１）～（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド：
    （ａ－１）配列番号９の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
    （ａ－２）配列番号９の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ａ－３）配列番号９の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ－１）配列番号１０の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
    （ｂ－２）配列番号１０の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ－３）配列番号１０の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）（ａ－１）～（ｂ－３）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
  13. 　請求項１０または１１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結された異種プロモーターを含む、発現ベクター。
  14. 　請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  15. 　請求項１４に記載の宿主細胞を用いて前記タンパク質を産生することを含む、タンパク質の製造方法。
  16. 　請求項１０または１１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、細菌。
  17. 　前記細菌は、腸内細菌科に属する細菌である、請求項１６に記載の細菌。
  18. 　エシェリヒア属またはパントエア属に属する細菌である、請求項１６または１７に記載の細菌。
  19. 　エシェリヒア・コリまたはパントエア・アナナティスである、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の細菌。
PCT/JP2018/004729 2017-02-10 2018-02-09 イソプレノイド化合物の製造方法 Ceased WO2018147446A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017023633 2017-02-10
JP2017-023633 2017-02-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018147446A1 true WO2018147446A1 (ja) 2018-08-16

Family

ID=63107208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/004729 Ceased WO2018147446A1 (ja) 2017-02-10 2018-02-09 イソプレノイド化合物の製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2018147446A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115851693A (zh) * 2022-10-24 2023-03-28 湖北大学 葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011505841A (ja) * 2007-12-13 2011-03-03 ダニスコ・ユーエス・インク イソプレンを産出する組成物及び方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011505841A (ja) * 2007-12-13 2011-03-03 ダニスコ・ユーエス・インク イソプレンを産出する組成物及び方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GenBank 12 March 2014 (2014-03-12), "isopentenyl-diphosphate delta-isomerase [Streptomyces sp. PRh5", XP055533112, Database accession no. EXU63102 *
DATABASE GenBank 31 December 2015 (2015-12-31), "IPP isomerase [Streptomyces sp. MA37", XP055533110, Database accession no. ALL53316 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115851693A (zh) * 2022-10-24 2023-03-28 湖北大学 葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用
CN115851693B (zh) * 2022-10-24 2024-05-24 湖北大学 葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6254728B2 (ja) イソプレンシンターゼおよびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにイソプレンモノマーの製造方法
JP6750629B2 (ja) リナロールの製造方法
CN102906268A (zh) 用6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(pgl)来增加异戊二烯及其他产物的产量的组合物和方法
US10941420B2 (en) Linalool composition and method of producing therefor
US20210403954A1 (en) Method of producing isoprenoid compound
Wang et al. Combined bioderivatization and engineering approach to improve the efficiency of geraniol production
US8962296B2 (en) Isoprene synthase and gene encoding the same, and method for producing isoprene monomer
JP6520954B2 (ja) イソプレンモノマーの製造方法
CN110317765A (zh) 一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用
EP3072967B1 (en) Modified isoprene synthase
JP2017104099A (ja) リモネンの製造方法
WO2017022856A1 (ja) イソプレンモノマーの製造方法
JP7742602B2 (ja) イソプレノイド類産生能を有する遺伝子改変微生物およびこれを用いたイソプレノイド類製造方法
JPWO2015080273A1 (ja) イソプレンモノマーの製造方法
WO2024116153A1 (en) Compositions and methods for using previously cultured cells
JP7216396B2 (ja) 新規メバロン酸経路を有する非古細菌生物
CN120290608A (zh) 产法尼烯的重组菌株及构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18751896

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18751896

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP