WO2018143648A2 - Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법 - Google Patents

Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법 Download PDF

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이현철
구봉성
서형종
김진숙
박아름
장승원
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(주)포바이오코리아
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Definitions

  • the present invention relates to a method for expressing and purifying CRM197 protein, and more particularly, to a method for overexpressing and purifying soluble CRM197 protein in the cytoplasm of Escherichia coli.
  • CRM197 is Corynebacterium diphtheria (Corynebacterium the diphtheria toxin (diphtheria toxin proteinaceous exotoxin which is synthesized and secreted from the pathogenic strains of diphtheriae); a non-toxic form of DT) to a single protein of the amino acid to lower the bonding force toxicity is removed in the form of a NAD important coenzyme by the substitution G52E of .
  • Corynebacterium diphtheria Corynebacterium the diphtheria toxin (diphtheria toxin proteinaceous exotoxin which is synthesized and secreted from the pathogenic strains of diphtheriae); a non-toxic form of DT) to a single protein of the amino acid to lower the bonding force toxicity is removed in the form of a NAD important coenzyme by the substitution G52E of .
  • CRM197 has been shown to have an excellent effect on enhancing immunogenicity, and thus, among other vaccine supplements, CRM197 is most widely used as a conjugation form to increase the efficiency of currently used vaccines.
  • Pvenizer 13 Pulmococcal polysaccharide conjugate vaccine
  • CRM197 production method is a method using a strain of Corynebacterium engineered to produce CRM197 from the mutant strains of the existing Corynebacterium diphtheria is currently registered patents for strains and production (US Patent No. 5,614,382) .
  • US Patent No. 5,614,382 a strain of Corynebacterium engineered to produce CRM197 from the mutant strains of the existing Corynebacterium diphtheria is currently registered patents for strains and production (US Patent No. 5,614,382) .
  • recombinant production methods have been studied. Among them, Pfenex-patented Pseudomonas fluorescens strains are known for producing at high levels. Patent No. 8,530,171).
  • E. coli is also currently being studied.
  • Escherichia coli as known, is an BL1-level organism that is less cultivated and propagated than any other species, and because it is the strain most studied by researchers, production methods using E. coli may be advantageous over previously mentioned methods.
  • CRM197 is expressed in the form of insoluble protein in E. coli, and several attempts have been reported to overcome this.
  • the method of first expressing insoluble protein and collecting and refolding it again (European Patent No. 2445930), although it is possible to obtain a soluble protein, has a limited aspect in production yield and economic efficiency.
  • the present invention is to provide a production method for obtaining a high yield by overexpressing the soluble CRM197 protein in the cytoplasm from E. coli .
  • the present invention under conditions suitable for recombinant CRM197 protein expression, histidine-tag is added to the C-terminus of CRM197 and maltose-binding protein (Maltose-binding protein) to the N-terminus; It provides a method for producing a recombinant CRM197 protein soluble in the cytoplasm, comprising culturing the recombinant E. coli comprising an expression plasmid comprising a gene sequence encoding the recombinant CRM197 protein added with MBP).
  • the expression plasmid also provides a method characterized by having the genetic map of FIG.
  • the E. coli provides a method characterized in that BL21 (DE3) without endotoxin.
  • the recombinant E. coli provides a method characterized in that the BC-mC1h (Accession Number: KCCM11958P).
  • the culture step further comprises a purification step, wherein the purification step is treated with a Tobacco Etch Virus (TEV) protease to remove the maltose-binding protein and the histidine-tag through histidine-tag adsorption chromatography.
  • TSV Tobacco Etch Virus
  • the present invention provides a recombinant E. coli gene sequence encoding a recombinant CRM197 protein having a histidine-tag added to the C-terminus of CRM197 and a maltose-binding protein (MBP) added to the N-terminus.
  • MBP maltose-binding protein
  • Example 2 is an amino acid sequence of active CRM197 from which MBP is removed in Example 1 of the present invention
  • Figure 3 is a photograph showing the result of confirming the soluble protein expression of MBP-CRM197 and purified protein by MBP-adsorption chromatography in Example 2 of the present invention
  • Figure 4 is a photograph showing the results of the SDS-PAGE analysis of the purified protein in Example 3 of the present invention.
  • Example 5 is a graph showing the results of SEC analysis of the purified CRM197 in Example 4 of the present invention.
  • Figure 6 is a photograph showing the Western blot results using the anti-diphtheria toxin (DT) for each sample obtained in each purification step in Example 5 of the present invention
  • Example 7 is a photograph and graph showing the result of ELISA analysis of purified CRM197 using antidiphtheria toxin in Example 6 of the present invention.
  • Figure 8 is a photograph and graph showing the result of measuring the binding force of HB-EGF using ELISA in Example 7 of the present invention.
  • the present invention is a cell, a composition and a method for producing a recombinant protein
  • the inventors of the present invention has been intensively studied about the production method for obtaining a high yield by overexpressing the soluble CRM197 protein in the cytoplasm from E. coli, E. coli, which does not contain endotoxin as a cell, is used to culture recombinant E. coli containing an expression plasmid comprising a gene sequence encoding a recombinant CRM 197 protein with a specific tag and protein inserted into CRM 197 and purifying it by a specific method. It has been found that the present invention can be implemented by the present invention.
  • a histidine-tag is added to the C-terminus of CRM197 and a maltose-binding protein (MBP) is added to the N-terminus under conditions suitable for expression of recombinant CRM197 protein.
  • MBP maltose-binding protein
  • a method of producing a recombinant CRM197 protein that is soluble in the cytoplasm comprising culturing a recombinant E. coli comprising an expression plasmid comprising a gene sequence encoding a CRM197 protein.
  • a method for purifying a recombinant CRM197 protein soluble in the cytoplasm further comprises a purification step after the culture, wherein the purification step to remove the maltose-binding protein by treating the Tobacco Etch Virus (TEV) protease (TE)
  • TSV Tobacco Etch Virus
  • TE protease
  • a purification method comprising the step of removing the histidine-tag by step and histidine-tag adsorption chromatography.
  • the technology embodied in the present invention includes overexpressing and purifying CRM197 protein as an soluble protein in the cytoplasm of E. coli without endotoxin (BL21 ClearColi), which includes additional peptide sequences but is removed during purification. It can be designed to produce overexpressed CRM197 in the cytoplasm structurally and immunologically in the same protein form as native CRM197.
  • the CRM197 protein produced in the present invention is soluble in E. coli cytoplasm and is not bound as an insoluble inclusion body of cells.
  • the present invention includes recombinant E. coli as a preferred expression system for expressing and producing CRM197 protein, and the preferred expression system includes a cell containing a synthetic CRM197 coding sequence as a recombinant cell.
  • Preferred recipient cells are E. coli (BL21 ClearColi) free of endotoxin.
  • the yield is typically expressed as mg for cell culture L.
  • the yield of CRM197 protein according to the method of the present invention is at least 180 mg / L, preferably at least 500 mg / L in flask culture, more preferably at least 3 g / L, even more preferably at 10 g in jar fermentor culture. / L or more
  • the expression plasmid is recombinant by adding a histidine-tag to the C-terminus of CRM197 and a maltose-binding protein (MBP) to the N-terminus.
  • An expression plasmid comprising the gene sequence encoding the CRM197 protein may have a genetic map of FIG. 1, which may be codon-optimized to obtain a synthetic CRM197 gene, for example, and then identified at both ends of the acquired gene.
  • the CRM197 gene and the expression plasmid can be cut and inserted into the corresponding position of the expression plasmid using the restriction enzyme, wherein the histidine at the C-terminus of CRM197 for purification after expression of the protein.
  • a gene containing a maltose-binding protein (MBP) and a TEV protease cleavage site for insertion of soluble expression was inserted using a specific restriction enzyme.
  • the final desired expression plasmid can be produced by this.
  • the expression plasmid prepared as described above may be transformed into E. coli (BL21 ClearColi) from which genes related to endotoxin have been removed as a recipient cell to secure a transformed E. coli strain producing soluble CRM197 through a transformation method.
  • a method for purifying CRM197 in high yield comprises the step of removing the maltose-binding protein by treating a Tobacco Etch Virus (TEV) protease (TEV) and histidine- Removing the histidine-tag by tag adsorption chromatography.
  • TEV Tobacco Etch Virus
  • TAV Tobacco Etch Virus
  • the purification in the present invention can be carried out using multi-step chromatography, each step of the multi-step chromatography is separated from soluble CRM197 MBP adsorption chromatography, fusion partner separation through TEV enzyme, His-tag adsorption chromatography Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC), and Size-Exclusion Chromatography (SEC).
  • IMAC Immobilized-Metal Affinity Chromatography
  • SEC Size-Exclusion Chromatography
  • Synthetic CRM197 gene was obtained by codon optimization of CRM197 protein derived from Corynebacterium diphtheriae for proper expression in E. coli. After the Bam HI and HindIII restriction enzyme sequences were added to both ends of the obtained gene by PCR, the CRM197 gene and the expression plasmid were cut using the restriction enzyme and inserted into the corresponding positions of the expression plasmid pET21a. In this case, the histidine-tag was added to the C-terminus of CRM197 for purification after expression of the protein (see FIG. 1).
  • amino acid sequence encoded from the gene sequence is identical to the sequence shown in FIG. 2 except for the MBP fusion partner that is removed during purification (MW 60.94 kD) and provides efficient purification with the C-terminal His-tag for purification.
  • MBP fusion partner that is removed during purification
  • KLAAALE linker peptide
  • the molecular weight of MBP-CRM197 was found to be 103 kD in the soluble fraction, and it can be seen that most of the soluble proteins. It was also confirmed that the soluble fraction was separated through MBP adsorption chromatography.
  • CRM197 protein was purified using multi-step chromatography using 1 L of the culture.
  • Each step of the multistage chromatography is followed by separation of soluble CRM197 followed by MBP adsorption chromatography, fusion partner separation with TEV enzyme, His-tag adsorption chromatography (Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC), size-exclusion chromatography) Exclusion Chromatography (SEC).
  • IMAC Immobilized-Metal Affinity Chromatography
  • SEC Size-exclusion Chromatography
  • the cells are suspended in 20 mM Tris-HCl (pH7.4) buffer, and then the cells containing the expressed protein are crushed using an ultrasonic mill, and the supernatant containing the soluble protein is centrifuged at 13,000 rpm for 15 minutes. Was taken (FIG. 4, lane 1).
  • flow rate 1 ml / min was used with Washing Buffer A (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 200 mM NaCl, mM EDTA) and Elution Buffer B (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 200 mM NaCl, mM EDTA, 10 mM maltose). Conditions were separated using the concentration gradient of elution buffer B (Fig. 4, lane 2).
  • MBP-CRM197 fraction recovered through MBP purification was treated with TEV enzyme (SIGMA, 20U) 1 ⁇ l per 10 ⁇ g of protein for separation from MBP for 14 hours at 20 ° C. (FIG. 4, lane 3). As shown in Figure 4, the isolated protein and TEV was confirmed.
  • TEV enzyme SIGMA, 20U
  • SEC size-exclusion chromatography
  • the results of calculating the final yield for each step of purification from the culture medium 1L are shown in Table 1 below.
  • the final yield of the finally expressed CRM197 protein was found to be approximately 28.9% when calculated after excluding the reflecting the molecular weight of the fusion partner MBP of the initial protein.
  • the results of the culture and purification using 3L culture medium in the 5-L jar (jar) are shown in Table 2 below, and the growth and production of cells were improved due to the improvement of environmental conditions.
  • 20g / l yeast extract was added based on the LB medium used for the culture of the flask, and a medium containing trace elements (Zn, Fe, Co, and Cu) of 0.01 to 0.1 mg / l level was used, and 34 ° C.
  • the aeration was adjusted to 1vvm (Vessel Volumes per Minute), and cultured at 240 rpm for 4 hours after 10% seed culture inoculation and at 500 rpm after 0.1 mM IPTG induction for 24 hours. Under these culture conditions, the yield increased to 3 g / l or more, and purified from the cells obtained from the final culture solution according to the above-described purification procedure.
  • purified CRM197 was analyzed by size exclusion HPLC (TOSOH, TSKgel-G3000Swx1) method.
  • a flow rate wash and elution buffer 200 mM NaCl at 20 mM potassium phosphate pH 6.0
  • CRM197 was found at the molecular weight 61kD position, as shown in Figure 5, it can be seen that no other protein peak (peak).
  • CRM197 was attached to a 96 well plate for 1 hour and then washed with PBS-BSA (0.5%) solution to remove excess unattached protein.
  • a mouse antidiphtheriatoxin monoclonal antibody was attached as a primary antibody and a goat anti mouse IgG-HRP polyclonal antibody was attached as a secondary antibody.
  • OPD O-Phenylenediamine
  • MBP-GCN4 used as a control contains MBP, a fusion partner, and therefore, there is no possibility of detection of false positive signals by MBP even in the analysis of MBP-CRM197.
  • CRM197 is known by Mitamura et al. To bind HB-EGF (Human heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor) in the correct structural state (J. Biol. Chem. 1995, 270, 1015-9). Accordingly, in order to confirm the folding of the purified protein well, the binding ability with HB-EGF was determined by ELISA method according to the correct folding method of CRM protein specified in US Patent Publication No. 2016/333057 and presented as a standard test method of KFDA. Measured through.
  • HB-EGF Human heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor
  • HB-EGF was bound to the 96 well plate attached with CRM197 purified according to the standard test method, and the rabbit anti-HB-EGF monoclonal antibody and the anti-rabbit IgG- The HRP polyclonal antibody was used as a sandwich ELISA method, and the results are shown in FIG. 8.
  • HB-EGF was bound to a concentration range of 0-2.0 ⁇ g / ml to a 96 well plate to which purified CRM197 and a standard product (D2189, CRM197 from Sigma) were attached. Secondary antibodies can be used to detect correct folding. Accordingly, as illustrated above, CRM197 purified from soluble protein expressed in Escherichia coli through multi-step chromatography is folded to the correct structure, and thus, antigenicity and immunogenicity equivalent to that of native protein.

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Abstract

대장균(E. coli)으로부터 세포질내에서 용해성의 CRM197 단백질을 과량 발현시켜 고수율로 수득하기 위한 생산 방법이 개시된다. 본 발명은 재조합 CRM197 단백질 발현에 적합한 조건에서, CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가되고 N-말단에 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)이 부가된 재조합 CRM197 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 포함하는 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하여, 세포질내에서 용해성인 재조합 CRM197 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

CRM197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법
본 발명은 CRM197 단백질 발현 및 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장균의 세포질내에서 용해성의 CRM197 단백질을 과량 발현 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
CRM197은 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)의 병원성 균주로부터 합성 및 분비되는 단백질성 외독소인 디프테리아 톡신(diphtheria toxin; DT)의 무독성 형태로, 하나의 아미노산 치환 G52E에 의하여 중요한 조효소인 NAD의 결합력을 낮춰 독성이 제거된 형태의 단백질이다.
백신 투여에 있어 다수의 항원들은 소아 및 노령층의 취약한 면역원성을 가지고 있다고 알려져 있다. 따라서 다양한 다당체, 단백질, 스쿠알렌 등과 같은 백신보조제를 접합 혹은 병행 투여하는 방법을 통해 보완하고자 하는 연구들이 진행되어 왔다. 이 가운데 CRM197은 면역원성을 증강시키는 탁월한 효과가 입증되어 여타의 백신보조제 중에서도 현재 사용되는 백신의 효율을 높이기 위해 접합 형태로 가장 널리 사용되고 있다. 대표적인 예로 폐렴쌍구균의 백신으로 사용되는 Pfizer사의 13종 이하의 캡슐 다당류로 구성된 Prevenar 13(Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine)에 적용되어 사용되고 있다.
CRM197의 생산 방법은 기존의 코리네박테리움 디프테리아의 변이주로부터 CRM197을 생산할 수 있도록 조작된 코리네박테리움 균주를 이용하는 방법으로 현재 균주 및 생산에 관하여 특허가 등록되어 있다(미국 등록특허 제5,614,382호). 그러나 생산성과 안전성에 관한 문제로 인해 재조합으로 생산하는 방법들이 연구되었고 그 중 Pfenex사에서 특허권 가지고 있는 방법인 재조합 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 균주로부터 고수준으로 생산하는 방법이 대표적으로 알려져 있다(미국 등록특허 제8,530,171호).
또한 대장균을 이용하는 방법도 현재 연구중에 있다. 대장균은 알려진 바와 같이 다른 어떤 종에 비해서도 배양 및 증식이 저렴한 BL1 레벨의 유기체이며 가장 많이 연구자들에 의해 다루어진 균주이기 때문에 대장균을 이용한 생산 방법이 이전에 언급한 방법에 비해 유리할 수 있다. 그러나 현재까지 재조합 CRM197의 세포질내에서 용해성 발현으로 생산에 성공한 사례는 없다. 가장 유리한 생산균주임에도 불구하고 대장균에서 CRM197은 불용성 단백질의 형태로 발현되는 단점이 있어 이를 극복하기 위해 몇 가지 시도가 보고되었다. 먼저 불용성 단백질로 발현시키고 이를 수집하여 다시 리폴딩(refolding)하는 방법(유럽 공개특허 제2445930호)은 용해성 단백질을 얻을 수 있기는 하지만 그 생산수율과 경제성에 있어 제한적인 측면이 있다. 이에 비해 대장균의 분비신호를 이용하여 세포질보다 더 산화적인 페리플라즘 공간(periplasmic space)으로 분비하여 용해성 단백질을 얻는 방법(미국 공개특허 제2016/333057호)이 리폴딩 방법보다 효율적인 방법으로 제안되어 왔으나, 이 방법 역시 세포질에 비해 상대적으로 생산량이 적은 주변세포질(periplasmic space)에 분비하여 생산성 면에서 다소 떨어지는 방법으로 사료된다.
이에 따라 대장균에서 보다 효율적이고 비용효과적인 방식으로 CRM197을 생산하는 방법이 요구되고 있다.
따라서 본 발명은 대장균(E. coli)으로부터 세포질내에서 용해성의 CRM197 단백질을 과량 발현시켜 고수율로 수득하기 위한 생산 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 재조합 CRM197 단백질 발현에 적합한 조건에서, CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가되고 N-말단에 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)이 부가된 재조합 CRM197 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 포함하는 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하여, 세포질내에서 용해성인 재조합 CRM197 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한 상기 발현 플라스미드는 도 1의 유전자지도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 대장균은 내독소(endotoxin)가 없는 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 재조합 대장균은 BC-mC1h(수탁번호: KCCM11958P)인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 배양 후 정제 단계를 더 포함하되, 상기 정제 단계는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제(protease)를 처리하여 상기 말토오스-결합 단백질을 제거하는 단계 및 히스티딘-태그 흡착 크로마토그래피를 통해 상기 히스티딘-태그를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 재조합 대장균으로서 CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가되고 N-말단에 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)이 부가된 재조합 CRM197 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 포함하는 재조합 대장균을 이용함으로써 세포질내에서 용해성인 재조합 CRM197 단백질을 과량 발현시켜 고수율로 수득할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 용해성 CRM197의 발현 플라스미드의 유전자지도,
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 MBP가 제거된 활성 CRM197의 아미노산 서열,
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 MBP-CRM197의 용해성 단백질 발현 및 MBP-흡착크로마토그래피에 의한 정제 단백질의 확인 결과를 나타낸 사진,
도 4는 본 발명의 실시예 3에서 정제 단계별 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 사진,
도 5는 본 발명의 실시예 4에서 정제된 CRM197의 SEC 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 본 발명의 실시예 5에서 각 정제 단계별로 수득한 시료별 항-디프테리아 톡신(Anti-diphtheria toxin(DT))을 이용한 웨스턴 블롯(western blot) 결과를 나타낸 사진,
도 7은 본 발명의 실시예 6에서 항디프테리아톡신을 이용한 정제된 CRM197의 ELISA 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프,
도 8은 본 발명의 실시예 7에서 ELISA를 이용한 HB-EGF와 결합력 측정 결과를 나타낸 사진 및 그래프.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 재조합 단백질을 생산하기 위한 세포, 조성물 및 방법으로서, 본 발명자들은 대장균으로부터 세포질내에서 용해성의 CRM197 단백질을 과량 발현시켜 고수율로 수득하기 위한 생산 방법에 관해 예의 연구를 거듭한 결과, 수용 세포로서 내독소(endotoxin)를 포함하지 않은 대장균을 이용하여 CRM197에 특정 태그 및 단백질이 삽입된 재조합 CRM197 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 포함하는 재조합 대장균을 배양시키고 이를 특정 방법으로 정제함으로써 구현될 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명은 재조합 CRM197 단백질 발현에 적합한 조건에서, CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가되고 N-말단에 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)이 부가된 재조합 CRM197 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 포함하는 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하여, 세포질내에서 용해성인 재조합 CRM197 단백질을 생산하는 방법을 개시한다.
또한 세포질내에서 용해성인 재조합 CRM197 단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 배양 후 정제 단계를 더 포함하되, 상기 정제 단계는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제(protease)를 처리하여 상기 말토오스-결합 단백질을 제거하는 단계 및 히스티딘-태그 흡착 크로마토그래피를 통해 상기 히스티딘-태그를 제거하는 단계를 포함하는 정제 방법을 개시한다.
본 발명에서 구현된 기술은 CRM197 단백질을 내독소(endotoxin)가 없는 대장균(BL21 ClearColi)에서 세포질내에서 용해성 단백질로 과량 발현하여 정제하는 내용을 포함하고 있으며, 추가적인 펩타이드 서열이 포함되지만 정제 과정중에 제거될 수 있도록 설계하여 세포질에서 과량 발현된 CRM197을 구조적으로 면역학적으로 천연(native) CRM197과 동일한 단백질 형태로 생산할 수 있다.
본 발명에서 생산되는 CRM197 단백질은 대장균 세포질내에서 용해성이며, 세포의 불용성 봉입체로서 결합되지 않은 것이다.
본 발명은 CRM197 단백질을 발현 및 생산하기 위한 바람직한 발현 시스템으로서 재조합 대장균을 포함하며, 바람직한 발현 시스템은 재조합 세포로서, 합성 CRM197 코딩 서열을 함유한 세포를 포함한다. 바람직한 수용 세포는 내독소(endotoxin)가 없는 대장균(BL21 ClearColi)이다.
본 발명에 따르면, CRM197을 다량 생산하는 방법으로서, 생산량은 전형적으로 세포 배양물 L에 대한 mg으로서 표시된다. 본 발명의 방법에 따른 CRM197 단백질의 생산량은 플라스크 배양에서 180mg/L 이상, 바람직하게는 500mg/L 이상이고, 자(jar) 발효기 배양에서 더욱 바람직하게는 3g/L 이상, 더욱 더 바람직하게는 10g/L 이상이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 발현 플라스미드는 CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가되고 N-말단에 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)이 부가된 재조합 CRM197 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 플라스미드로서 도 1의 유전자지도를 가질 수 있으며, 이러한 발현 플라스미드는 예컨대, 코돈 최적화를 수행하여 합성 CRM197유전자를 확보한 후, 확보된 유전자의 양 말단에 특정 제한효소 서열을 추가한 후, 해당 제한효소를 이용해 CRM197 유전자와 발현 플라스미드를 절단하여 발현 플라스미드의 해당위치에 삽입하여 제작될 수 있으며, 이때 해당 단백질의 발현 후 정제를 위해 CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가된 형태로 발현할 수 있도록 제작할 수 있다. 이와 함께 발현 플라스미드에 삽입된 CRM197 유전자의 N-말단에는 용해성 발현을 위해 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)과 TEV 프로테아제(protease) 절단부위를 포함하는 유전자를 특정 제한효소를 이용하여 삽입함으로써 최종 목적하는 발현 플라스미드를 제작할 수 있다.
상기와 같이 제작된 발현 플라스미드는 내독소(endotoxin)와 관련된 유전자가 제거된 대장균(BL21 ClearColi)을 수용 세포로 하여 형질전환 방법을 통해 용해성 CRM197을 생산하는 형질전환 대장균 균주가 확보되도록 할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, CRM197을 고수율로 정제하는 방법이 개시되며, 상기 정제 단계는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제(protease)를 처리하여 상기 말토오스-결합 단백질을 제거하는 단계 및 히스티딘-태그 흡착 크로마토그래피를 통해 상기 히스티딘-태그를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 정제는 다단계 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있으며, 다단계 크로마토그래피의 각 단계는 용해성 CRM197을 분리한 후 MBP 흡착 크로마토그래피, TEV 효소를 통한 퓨전 파트너 분리, His-tag 흡착 크로마토그래피(Immobilized-Metal Affinity Chromatography; IMAC), 크기-배제 크로마토그래피(Size-Exclusion Chromatography; SEC)의 순서로 진행될 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1: 발현 플라스미드 및 재조합 대장균 균주 제작
코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)으로부터 유래한 CRM197 단백질을 대장균에서의 발현이 적합하도록 코돈 최적화를 수행하여 합성CRM197 유전자를 확보하였다. 확보된 유전자의 양 말단에 PCR을 통하여 BamHⅠ과 HindⅢ 제한효소 서열을 추가한 후, 해당 제한효소를 이용해 CRM197 유전자와 발현 플라스미드를 절단하여 발현 플라스미드 pET21a의 해당위치에 삽입하였다. 이때 해당 단백질의 발현 후 정제를 위해 CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가된 형태로 발현할 수 있도록 제작하였다(도 1 참조). 이와 함께 발현 플라스미드에 삽입된 CRM197 유전자의 N-말단에는 용해성 발현을 위해 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)과 TEV 프로테아제(protease) 절단부위를 포함하는 유전자를 NdeⅠ과 BamHⅠ의 제한효소를 이용하여 삽입함으로써 pET-mCRMh를 제작하였다. 이 pET-mCRMh 플라스미드를 내독소(endotoxin)와 관련된 유전자가 제거된 대장균(BL21 ClearColi)을 수용 세포로 하여 CaCl2 형질전환 방법을 통해 용해성 CRM197을 생산하는 형질전환 대장균 균주 BC-mC1h를 확보하고, 2017년 01월 03일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms; KCCM)로부터 수탁번호 KCCM11958P를 부여받았다. 유전자 서열로부터 코딩된 아미노산 서열은 정제 시 제거되는 MBP 퓨전 파트너(fusion partner)를 제외하고 도 2에 나타낸 서열과 같으며(MW 60.94kD), 정제를 위한 C-말단의 His-tag과 효율적인 정제를 위한 링커펩타이드(KLAAALE)를 제외하고 알려진 CRM197 서열과 동일하다.
실시예 2: MBP-흡착 크로마토그래피에 의한 정제 단백질의 확인
발현된 용해성 단백질의 단일 폴리펩타이드 확인을 위하여 SDS-PAGE 분석을 통해 대장균에서 발현된 용해성 단백질로부터 정제 단계별로 전개하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, MBP-CRM197의 분자량은 용해성 분획에서 103kD으로 확인되었으며 대부분 용해성 단백질임을 알 수 있었다. 또한 용해성 분획은 MBP 흡착 크로마토그래피를 통해 분리됨을 확인할 수 있었다.
실시예 3: CRM197 단백질의 정제
정제 공정에 따른 평균 수율 확인을 위하여 1L의 배양액을 이용하여 CRM197 단백질을 다단계 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
다단계 크로마토그래피의 각 단계는 용해성 CRM197을 분리한 후 MBP 흡착 크로마토그래피, TEV 효소를 통한 퓨전파트너 분리, His-tag 흡착 크로마토그래피(Immobilized-Metal Affinity Chromatography; IMAC), 크기-배제 크로마토그래피(Size-Exclusion Chromatography; SEC)의 순서로 진행되었다.
도 3에서 제시한 SDS-PAGE 분석 결과에 따르면 MBP-CRM197(103 kD)의 용해성 발현과 MBP 흡착 크로마토그래피에 의한 1단계 정제만으로는 적정 순도에 미치지 못하기 때문에, TEV 효소를 이용하여 퓨전 파트너인 MBP와 CRM197을 분리하고 절단된 단백질 중 CRM197을 C-말단의 his-tag을 이용하여 정제하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적인 정제 방법은 다음과 같다.
먼저 20mM Tris-HCl(pH7.4) 완충용액에 세포를 현탁시킨 뒤, 초음파 분쇄기를 이용하여 발현 단백질이 포함된 세포를 파쇄하여, 13,000rpm으로 15분 동안 원심분리를 통해 용해성 단백질이 포함된 상등액을 취하였다(도 4, lane 1). MBP 정제를 위하여 세척 완충액 A(20mM Tris-HCl pH 7.4, 200mM NaCl, mM EDTA)와 용출 완충액 B(20mM Tris-HCl pH 7.4, 200mM NaCl, mM EDTA, 10mM maltose)를 이용하여 유속 1ml/min의 조건에서 용출 완충액 B의 농도 구배를 이용하여 분리하였다(도 4, lane 2).
MBP 정제를 통해 회수된 MBP-CRM197 분획은 MBP와의 분리를 위해 TEV 효소(SIGMA, 20U)를 단백질 10㎍당 1㎕를 처리하여 20℃에서 14시간 동안 처리하였다(도 4, lane 3). 도 4에 나타낸 바와 같이, 분리된 단백질과 TEV를 확인할 수 있었다.
이후, 반응액에 대하여 UF(Ultra Filtration)을 통해 완충액 교환 후 His-tag 흡착 크로마토그래피(IMAC)를 통해 절단된 CRM197만을 정제하였다(도 4, lane 4). His-tag 흡착 크로마토그래피는 세척 완충액 A(20mM 인산소듐완충액 pH7.4, 500mM NaCl)와 용출 완충액 B(20mM 인산소듐완충액 pH7.4, 500mM NaCl, 250mM imidazole)를 유속 1ml/min로 하여 분리함으로써 수행되었다.
이후, His-tag 흡착 크로마토그래피로 수득한 활성 분획의 고순도 정제를 위하여 크기-배제 크로마토그래피(Size-Exclusion Chromatography; SEC)를 통해 분리하였다(도 4, lane 5). SEC은 완충액(20mM 인산칼륨 pH 6.0, 200mM NaCl)을 유속 1ml/min로 흘려줌으로써 분자량에 따라 분리하여 수행되었다.
상술한 구체적인 방법에 따라 배양액 1L로부터 정제 단계별로 최종 수율을 산출한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 최종적으로 발현된 CRM197 단백질에 대해서 최종 수율은 초기 단백질 중 퓨전 파트너인 MBP 분자량을 반영하여 제외한 후 산출하였을 때 약 28.9%임을 확인하였다.
또한 5-L 자(jar)에서 배양액 3L를 이용하여 배양 및 정제를 수행한 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 환경조건의 개선으로 인해 세포의 성장 및 생산량이 향상되었다. 구체적으로, 플라스크 배양에 사용된 LB 배지를 기반으로 효모추출물 20g/l를 추가하고 0.01~0.1mg/l 수준의 미량원소(Zn, Fe, Co 및 Cu)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 34℃에서 통기량 1vvm (Vessel Volumes per Minute)으로 조절하였고, 10% 종배양액 접종 후 4시간 동안 240rpm으로, 0.1mM IPTG 유도 후 500rpm으로 24시간 배양하였다. 이 배양조건에서 생산량은 3g/l 이상으로 증가하였으며, 최종 배양액으로부터 수득한 세포로부터 상술한 정제과정에 따라 정제하였다.
Figure PCTKR2018001293-appb-T000001
Figure PCTKR2018001293-appb-T000002
실시예 4: 정제된 CRM197의 SEC 분석
최종적으로 분리 정제한 CRM197을 크기 배제(size exclusion) HPLC(TOSOH, TSKgel-G3000Swx1) 방법에 의해 분석하였다. SEC 크로마토그래피 분석을 위하여 유속 세척 및 용출 완충액(20mM 인산칼륨 pH 6.0에 200mM NaCl)을 1ml/min의 유속으로 전개하여 자외선 파장 220nm에서 검출하여 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
SEC 크로마토그램 결과에서도 CRM197은 분자량 61kD 위치에서 확인되었고, 도 5에 나타낸 바와 같이, 다른 단백질 피크(peak)는 확인되지 않음을 알 수 있다.
실시예 5: CRM197의 항원성 및 면역원성 확인
항원성 및 면역원성 확인을 위하여 각 정제 단계별로 수득한 시료별 항-디프테리아 톡신(Anti-diphtheria toxin(DT))을 이용한 웨스턴 블롯(western blot)을 실시하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
정제 단계별로 수득된 시료를 이용하여 SDS-PAGE로 전개한 후(도 6(a)), 기기(semi-dry transfer, Biorad)를 이용하여 면역-블롯 PVDF 막(Immuno-blot poly-binyl difluoride membrane)에 단백질을 흡착시킨 후 1차 항체로 마우스 항디프테리아톡신 단클론 항체(mouse monoclonal anti-diphtheria toxin)를 사용하고, 검출을 위한 2차 항체로 염소 항마우스 IgG-HRP 다클론 항체(goat polyclonal anti-mouse-IgG-HRP)를 사용하여 웨스턴 블롯(Western blot) 방법에 의하여 분석하였다(도 5(b)). Lane 1-3에서 시그널(WB signal)이 다소 약한 것은 100kD 이상에서 막 이동(membrane transfer) 효율 감소 때문으로 사료되며, 정제되지 않은 시료에서 불특정 밴드(unspecific band)가 확인되었으나 정제 순도가 높아짐에 따라 CRM197과 결합을 명확하게 확인할 수 있었다.
실시예 6: CRM197의 항원 특이성 확인
웨스턴 블롯(Western blot) 분석과 함께 CRM197의 항원 특이성을 확인하기 위하여 정제된 CRM197을 부착한 96 웰 플레이트(well plate)에 마우스 항디프테리아톡신 단클론 항체를 이용하여 특이성이 없는 MBP-GCN4 단백질을 대조구로 하여 ELISA를 실시하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
구체적으로, 96 웰 플레이트에 1시간 동안 CRM197을 부착한 뒤, PBS-BSA(0.5%) 용액으로 세척하여 부착되지 않은 여분의 단백질을 제거하였다. 1차 항체로 마우스 항디프테리아톡신 단클론 항체, 2차 항체로 염소 항마우스 IgG-HRP 다클론 항체를 부착시켰다. 검출을 위하여 O-페닐렌디아민(O-Phenylenediamine; OPD)을 기질로 사용하여 실온에서 10분간 반응 후, 4.5N H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시키고 이 96 웰 플레이트에 대하여 UV 490nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 정제된 CRM197은 마우스 항디프테리아톡신 단클론 항체와 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었으며, 대조구인 MBP-GCN4에서는 항원 특이성이 전혀 나타나지 않았다. 특히 대조구로 사용된 MBP-GCN4의 경우 퓨전파트너인 MBP가 포함되어 있어 발현 형태인 MBP-CRM197의 분석에서도 MBP에 의한 위양성 신호(false positive signal)로 검출될 가능성은 없다고 사료된다.
실시예 7: 정제 단백질의 폴딩 확인
CRM197은 HB-EGF(Human heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor)와 올바른 구조 상태에서 결합한다는 것이 Mitamura 등에 의해 알려졌다(J. Biol. Chem. 1995, 270, 1015-9). 이에 따라 정제된 단백질의 폴딩이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 미국 공개특허 제2016/333057호에 명시되고 식약처의 표준시험법으로 제시된 CRM 단백질의 올바른 폴딩 규명법에 따라 HB-EGF와의 결합력을 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 구체적으로 표준시험법에 따라 정제된 CRM197을 부착한 96 웰 플레이트에 HB-EGF를 농도별로 결합시키고 검출을 위해 이에 대한 1차 항체로 토끼 항 HB-EGF 단클론항체와 2차 항체로 항 토끼 IgG-HRP 다클론항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 실시하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조하면, 정제된 CRM197과 표준품(D2189, Sigma사의 CRM197)을 부착시킨 96 웰 플레이트에 0-2.0㎍/ml의 농도 범위로 HB-EGF를 결합시켜 결합이 일어난 양을 1차 항체와 2차 항체를 이용하여 검출하여 올바른 폴딩 여부를 판단할 수 있다. 이에 따라 앞서 예시된 바와 같이 대장균에서 발현된 용해성 단백질을 다단계 크로마토그래피를 거쳐 정제한 CRM197은 올바른 구조로 폴딩되어 천연 단백질(native protein)과 동등한 항원성 및 면역원성을 보이는 것으로 사료된다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11958P
수탁일자 : 20170103
[기탁증]
Figure PCTKR2018001293-appb-I000001
[기탁증 번역문]
Figure PCTKR2018001293-appb-I000002

Claims (5)

  1. 재조합 CRM197 단백질 발현에 적합한 조건에서, CRM197의 C-말단에 히스티딘-태그(histidine-tag)가 부가되고 N-말단에 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein; MBP)이 부가된 재조합 CRM197 단백질을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 포함하는 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하여, 세포질내에서 용해성인 재조합 CRM197 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현 플라스미드는 도 1의 유전자지도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 대장균은 내독소(endotoxin)가 없는 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 대장균은 BC-mC1h(수탁번호: KCCM11958P)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양 후 정제 단계를 더 포함하되, 상기 정제 단계는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제(protease)를 처리하여 상기 말토오스-결합 단백질을 제거하는 단계 및 히스티딘-태그 흡착 크로마토그래피를 통해 상기 히스티딘-태그를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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