WO2018123856A1 - 真菌におけるタンパク質の選択的分泌技術 - Google Patents

真菌におけるタンパク質の選択的分泌技術 Download PDF

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target substance
fungus
gpi
secretory
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尚▲徳▼ 玉置
泰基 二神
正孝 岩元
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国立大学法人鹿児島大学
カクイ株式会社
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • the present invention provides a modified fungus that expresses a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding a GPI-added signal sequence is linked to a polynucleotide encoding an endogenous secretase, and produces the target substance using the modified fungus It relates to methods.
  • Fungi particularly filamentous fungi
  • the culture supernatant is used as an enzyme preparation.
  • contamination of an undesired enzyme derived from a fungus, for example, an enzyme having an activity of degrading a target substance becomes a problem.
  • purification or separation processes are required, so the fungal-derived enzyme preparations are expensive and the production volume is not constant and stable supply is difficult. There was a problem.
  • GPI glycolipid added to the C-terminus of a protein by post-translational modification and has a function of immobilizing (anchor) a certain protein on the cell surface. So far, GPI has been shown to be used to display proteins on the cell surface in yeast (Patent Document 1), but it has been completely considered to apply GPI to endogenous secreted enzymes. It was not done.
  • the present invention uses a method for obtaining a culture supernatant in which the amount of undesirable enzymes is reduced without significantly impairing fungal growth, a microorganism that can be used in the method, and the microorganism or culture supernatant.
  • the purpose is to provide a method for producing the target substance.
  • the present inventor By adding a GPI-added signal sequence to a gene encoding an endogenous secretory enzyme, the present inventor stays on the cell surface and reduces the amount of the endogenous secreted enzyme in the culture supernatant. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following aspects. (1) expressing a fusion polynucleotide in which an exogenous polynucleotide encoding a glycosylphosphatidylinositol (GPI) additional signal sequence is linked to the 3 ′ end of a polynucleotide encoding an endogenous secretase, thereby A modified fungus characterized in that a secreted enzyme is immobilized on the cell surface by GPI. (2) The fungus according to (1), which belongs to a filamentous fungus.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • the fungus according to (2) which belongs to a filamentous fungus selected from the group consisting of the genus Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Monascus, and Thermoascus.
  • the fungus according to (3) which belongs to the Trichoderma reesei species.
  • Fungi are used for the production of the target substance, and the target substance and the secretory enzyme are in the following combinations: (A) the target substance is sugar and the secretory enzyme is glycosidase; (B) the target substance is lipid and the secretory enzyme is lipase; (C) the target substance is a protein and the secreted enzyme is a protease; and (d) the target substance is a nucleic acid and the secreted enzyme is a nuclease; The fungus according to any one of (1) to (5), selected from the group consisting of: (7) The fungus according to (6), wherein the target substance is cellobiose and the secretory enzyme is ⁇ -glucosidase.
  • (8) including a step of culturing the fungus according to any one of (1) to (5) in a medium, and a step of recovering a culture supernatant in which the amount of endogenous secreted enzyme is reduced from the cultured fungus
  • (9) a step of producing a target substance from the source substance by contacting the source substance with the fungus according to any one of (1) to (5) or the fungal culture supernatant according to (8) How to produce the substance.
  • the target substance and secretory enzyme are combined as follows: (A) the target substance is sugar and the secretory enzyme is glycosidase; (B) the target substance is lipid and the secretory enzyme is lipase; (C) the target substance is a protein and the secreted enzyme is a protease; and (d) the target substance is a nucleic acid and the secreted enzyme is a nuclease; The method according to (9). (11) The method according to (10), wherein the target substance is cellobiose and the secretory enzyme is ⁇ -glucosidase. (12) The method according to any one of (9) to (11), comprising a step of recovering a target substance.
  • the present invention it is possible to obtain a culture supernatant in which the amount of undesirable endogenous secreted enzyme is reduced, and this can be used as it is as an enzyme preparation.
  • the method can be applied to various enzymes secreted by fungi, so that the combination of secreted enzymes can be easily customized. Application to material production may be possible.
  • FIG. 1 shows the results of electrophoresis when PCR was performed on a wild-type strain and a mutant strain (Bgl1-GPI strain) prepared in Examples. By observing a shift-up due to sequence insertion in the Bgl1-GPI strain, it was confirmed that a foreign polynucleotide encoding a GPI-added signal sequence was added to the bgl1-gene in the Bgl1-GPI strain.
  • FIG. 2 shows the lyophilized cell weight (A) of the wild strain and the mutant strain (Bgl1-GPI strain) prepared in the Examples, and the measurement results (B) of the Bgl1 activity of the culture supernatants of both strains.
  • FIG. 1 shows the results of electrophoresis when PCR was performed on a wild-type strain and a mutant strain (Bgl1-GPI strain) prepared in Examples.
  • FIG. 3 shows the measurement results (C) of CMCase activity (A), CBH activity (B), and Bgl1 activity of the culture supernatant of the wild strain and the mutant strain (Bgl1-GPI strain) prepared in the example.
  • FIG. 4 shows changes over time in the ratio of glucose / cellobiose produced from cellulose in the wild strain and the mutant strain (Bgl1-GPI strain) prepared in the example.
  • Modified fungus In one aspect, the invention relates to a modified fungus.
  • the modified fungus of the present invention is genetically modified by linking an exogenous polynucleotide encoding a glycosylphosphatidylinositol (GPI) addition signal sequence to the 3 ′ end of the polynucleotide encoding an endogenous secretase. ing.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • endogenous secretory enzyme refers to any enzyme that is originally secreted by a fungus that has not been genetically modified, particularly an enzyme whose secretion is not desirable.
  • endogenous secreted enzymes include, but are not limited to, glycosidases (particularly glucosidases), lipases, proteases, and nucleases, preferably glycosidases (particularly glucosidases), lipases, proteases, more preferably glycosidases (particularly glucosidases), Examples include cellobiohydrase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4), and ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.21).
  • the endogenous secreted enzyme is preferably ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.21), preferably the secreted ⁇ -glucosidase Bgl1, Cel3b, Cel3e, Cel3f, and Cel3g At least one, and particularly preferably Bgl1.
  • the activities of these enzymes can be measured by methods known to those skilled in the art, for example, using a substrate that is decomposed by these enzymes to produce a fluorescent substance or a light absorbing substance.
  • the activity of ⁇ -glucosidase can be measured using a substrate such as p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside that is decomposed by an enzyme having ⁇ -glucosidase activity to generate a light-absorbing substance.
  • Trichoderma reesei Bgl1 ( ⁇ -glucosidase 1) The amino acid sequence shown by number 13 is included. Further, the polynucleotide encoding Trichoderma reesei Bgl1 comprises the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • Bgl1 is a functional equivalent of the above amino acid sequence, for example, (i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, for example, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% Or an amino acid sequence having 99% or more identity, (ii) an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, and / or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13; (iii) An amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide containing the polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 may be included.
  • a polynucleotide encoding Bgl1 is a functional equivalent of the above polynucleotide sequence, for example, (i) a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, for example, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, A polynucleotide sequence having 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity, (ii) addition or deletion of one or more nucleotides in the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, And / or a substituted polynucleotide sequence, (iii) a polynucleotide sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the identity value relating to the amino acid sequence and the base sequence indicates a value calculated with default settings using software (for example, FASTA, DANASYS, and BLAST) that calculates identity between a plurality of sequences. .
  • software for example, FASTA, DANASYS, and BLAST
  • identity is determined, see, for example, Altschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977 and Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990 .
  • the range of “one or more” regarding the amino acid sequence and the base sequence is 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably several. One to four or one to three, or one or two.
  • stringent conditions mean conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • the stringent conditions can be appropriately determined with reference to, for example, Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • stringent conditions may be set according to the temperature at the time of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution, and the temperature at the time of the washing step of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution. More specifically, stringent conditions include, for example, a sodium concentration of 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and a temperature of 42 to 68 ° C., preferably 42 to 65 ° C. More specifically, 5 ⁇ SSC (where 1 ⁇ SSC is 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) and a temperature of 42 ° C. may be mentioned.
  • glycosyl phosphatidylinositol (hereinafter, also simply referred to as “GPI”) is a glycolipid containing an oligosaccharide chain and inositol phospholipid, and immobilizes (anchors) a certain protein on the cell surface. It has a function. GPI basically contains ethanolamine, phosphate, trimannoside, glucosamine, and inositol phospholipids in this order (see, for example, Hiroh IKEZAWA, Biol. Pharm. Bull. 25 (4) 409-417). It is known that variations of the side chain of the GPI sugar chain part and the molecular species of the lipid part are recognized depending on the biological species, cells or proteins.
  • GPI is synthesized in the endoplasmic reticulum and linked to the C-terminus of the protein.
  • the protein to which the GPI anchor is added usually contains a GPI addition signal sequence (also referred to as “GPI addition signal”) at the C terminus in addition to the N-terminal signal peptide.
  • GPI addition signal also referred to as “GPI addition signal”
  • This GPI-added signal sequence is cleaved, and the ethanolamine part of GPI synthesized in the endoplasmic reticulum is linked to the newly generated carboxy terminus (called “ ⁇ site”). Thereafter, the protein to which the GPI anchor is added is transported to the cell surface while undergoing further modification.
  • a secretory enzyme is immobilized on the cell surface by GPI by linking an exogenous polynucleotide encoding a GPI-added signal sequence to the 3 ′ end of the polynucleotide encoding the endogenous secretory enzyme.
  • the exogenous polynucleotide encoding the GPI additional signal sequence may be directly linked to the 3 ′ end side of the polynucleotide encoding the endogenous secretase, or an appropriate intervening sequence such as 1 to 300, 5 to 200, Alternatively, about 10 to 100 nucleotides may be added and linked so as not to shift the reading frame.
  • the modified fungus of the present invention can reduce the secretion amount of the endogenous secretory enzyme relative to the wild type.
  • only a polynucleotide encoding one endogenous secretase may be modified, or a polynucleotide encoding a plurality of endogenous secretases may be modified.
  • a polynucleotide encoding a plurality of endogenous secretase enzymes for example, a polynucleotide encoding two, three, four, or five or more endogenous secretase enzymes can be modified.
  • the degree of reduction in the amount of endogenous secreted enzyme by the above modification is not particularly limited, but for example, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, preferably 50% or less, 40% or less of the wild type
  • the expression level may be 30% or less, 20% or less, or 10% or less, or it may completely eliminate the secretion of the endogenous secretory enzyme.
  • the secretion amount of the endogenous secretory enzyme can be reduced, but the endogenous secretory enzyme is present on the cell surface and the expression itself is not reduced. Therefore, the growth of the fungus as compared with gene knockout and expression suppression It is thought that there is little influence on.
  • the viability of the modified fungus of the present invention may be comparable to the wild type or inferior to the wild type.
  • the viability of the modified fungus of the present invention is determined by the lyophilized cell weight after culturing (g), the turbidity at a specific time after culturing or during culture (OD 660 ), the specific time after culturing or during culturing.
  • the viability measured by viable cell count (cfu / ml), preferably lyophilized cell weight (g) after culture is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% compared to the wild type. % Or more, preferably 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% or more.
  • exogenous polynucleotide refers to a polynucleotide that is not included in a natural polynucleotide encoding “endogenous secretory enzyme”. Therefore, the “exogenous polynucleotide” may be derived from the same species as the organism expressing the “endogenous secretory enzyme” or may be derived from a different species.
  • the “exogenous polynucleotide” is from the same genus as the organism that expresses the “endogenous secretory enzyme”, more preferably from the same species as the organism that expresses the “endogenous secretory enzyme”.
  • GPI-added signal sequences There are no consensus sequences for GPI-added signal sequences, but many of the GPI-added signal sequences have the following four characteristics: (i) amino acids with small side chains as the site ( ⁇ site) to which the ethanolamine part of GPI is linked (Ii) The amino acid of ⁇ + 2 (2 residues C-terminal side from the ⁇ site, the same shall apply hereinafter) is also used for the amino acid with a small side chain such as Gly, Ala, Ser, (iii) ⁇ + 3 (Iv) 10 to 20 amino acids up to the C-terminal are hydrophobic regions (Morihisa Fujita, Biochemical Vol. 85, No. 11, pp.985) -995, 2013). In recent years, many programs for predicting GPI-added signal sequences have been published, and those skilled in the art can easily obtain GPI-added signal sequences from public databases.
  • GPI-added signal sequences include, for example, a GPI-added signal sequence containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15 derived from Trichoderma reesei, a GPI-added signal sequence containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 derived from Aspergillus kawachii, derived from Penicillium chrysogenum A GPI-added signal sequence including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • GPI-added signal sequences include: (i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 17, or 19 and, for example, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, Amino acid sequence having 98% or more, or 99% or more identity, (ii) one or more amino acids are added, deleted, and / or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 17, or 19 (Iii) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, 17, or 19. Is mentioned.
  • polynucleotides that encode GPI-added signal sequences include polynucleotides comprising the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 16, 18, and 20 that encode the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 17, and 19, respectively. .
  • Examples of a polynucleotide encoding a GPI-added signal sequence include: (i) a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, 18, or 20 and, for example, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, 95% Or more, 97% or more, 98% or more, or a polynucleotide sequence having 99% or more identity, (ii) one or more nucleotides added in the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, 18, or 20, A polynucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide comprising the deleted and / or substituted polynucleotide sequence, (iii) the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 18, or 20 Nucleotide sequences are mentioned.
  • the genus and species of the fungus from which the modified fungus of the present invention is derived are not particularly limited, but are preferably yeasts or filamentous fungi.
  • yeast include the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, and Yarrowia.
  • the modified fungus is preferably a filamentous fungus.
  • filamentous fungi include, but are not limited to, the genus Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Monascus, Thermoascus, Cephalosporium ), Acremonium, and Neurospora, preferably Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Monascus, and Thermoscus, Trichoderma seisei, Aspergillus kawachii, and Penicillium chrysogenum.
  • the modified fungus of the present invention is particularly preferably a filamentous fungus of the genus Trichoderma, such as Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma koningii (Trichoderma koningii), Trichoderma ⁇ ⁇ koningii (Trichoderma koningii), Trichoderma ⁇ ⁇ koningii (Trichoderma koningii), Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum), Trichoderma viride, or Trichoderma atroviride, and more preferably Trichoderma ⁇ ⁇ atroviride.
  • Trichoderma reesei Trichoderma harzianum
  • Trichoderma koningii Trichoderma koningii
  • Trichoderma ⁇ ⁇ koningii Trichoderma koningii
  • Trichoderma koningii Trichoderma koningii
  • Trichoderma koningii Trichoderma longibrachiat
  • the strain of the fungus from which the modified fungus of the present invention is derived is not limited, and an isolated strain may be used, or a strain distributed from a depository organization such as ATCC and NBRC, for example, Trichoderma reesei NBRC 31327 may be used. .
  • the modified fungi of the present invention can be produced by any method known to those skilled in the art (for example, Sambrook et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual fourth edition”, Cold Spring Harber Laboratory Press for details of genetic recombination techniques). , See 2012).
  • the modified fungus of the present invention can be produced, for example, according to the method for producing a modified fungus described below.
  • the present invention relates to a method for producing the above-mentioned modified fungus in which an endogenous secreted enzyme is immobilized on the cell surface by GPI.
  • This method for producing a modified fungus expresses a fusion polynucleotide in which an exogenous polynucleotide encoding a glycosylphosphatidylinositol (GPI) addition signal sequence is linked to the 3 ′ end of the polynucleotide encoding an endogenous secretase. So as to modify the fungus.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • the modification step may be performed by using, for example, gene recombination technology and homologous recombination technology, about 1 to upstream of the gene that may include a part or all of the endogenous secretory enzyme gene derived from the wild-type fungal genome.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • the gene cassette can be introduced into a locus where a wild-type fungus has a polynucleotide encoding an endogenous secreted enzyme.
  • the gene cassette contains an exogenous polynucleotide encoding the GPI-added signal sequence and linked to the 3 ′ end of the polynucleotide encoding the secreted enzyme, the gene cassette is homologous recombination method.
  • the cassette can be introduced so as to be linked to the 3 ′ end of the polynucleotide encoding the wild-type endogenous secretory enzyme, or to replace the polynucleotide encoding the wild-type endogenous secretory enzyme. .
  • the endogenous secretory enzyme of the wild-type fungus may be knocked out, and the gene cassette may be introduced into a locus different from the locus where the wild-type fungus has a polynucleotide encoding the endogenous secretory enzyme.
  • the gene cassette introduced into the fungus may further contain a selection marker such as a hygromycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, or a kanamycin resistance gene in order to facilitate selection of the modified fungus.
  • a selection marker such as a hygromycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, or a kanamycin resistance gene in order to facilitate selection of the modified fungus.
  • the gene cassette may be an appropriate vector such as a plasmid derived from E. coli (eg, pGEM (registered trademark) -T) Easy, pET22b (+), pBR322, pUC118, and pBluescript), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), And yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YCp50, etc.) can be used to introduce into fungi.
  • Introduction of a gene cassette or vector can be performed by methods known to those skilled in the art, such as protoplast-PEG method, electroporation method, and metal treatment method.
  • the method for producing a modified fungus of the present invention may include a step of selecting a modified fungus in addition to the modification step.
  • the selection step can be performed, for example, by introducing a gene cassette or vector containing a selection marker as described above, transforming a fungus, and growing the transformed fungus under selective pressure.
  • the method for producing a modified fungus of the present invention may include a step of determining whether or not a desired genetic modification has been made in the modified fungus, in addition to or in addition to the step of selecting the modified fungus. This step can be performed, for example, by confirmation of nucleotide insertion by PCR and electrophoresis, or by sequence analysis by PCR.
  • the present invention includes the steps of culturing the fungus described herein in a medium and recovering the culture supernatant from which the amount of endogenous secreted enzyme is reduced from the cultured fungus.
  • the present invention relates to a method for producing a culture supernatant in which the amount of secreted enzyme is reduced.
  • the culturing step in the present method is performed by, for example, a method known to a person skilled in the art in a suitable medium, by a small-scale or large-scale fermentation (such as continuous, batch, fed-batch, or solid fermentation).
  • a suitable medium such as continuous, batch, fed-batch, or solid fermentation.
  • an appropriate nutrient medium containing a carbon and nitrogen source and an inorganic salt for example, a commercially available medium or a medium prepared according to a published formulation can be used.
  • the step of collecting the culture supernatant can be performed by a method known to those skilled in the art, and can be performed, for example, by filtration or centrifugation. Moreover, this method may optionally include a step of purifying or separating a specific protein from the culture supernatant, in addition to the culture step and the recovery step.
  • the degree of reduction in the amount of endogenous secreted enzyme in the present method is not particularly limited, but for example, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, preferably 50% or less, 40% or less of the wild type.
  • the expression level may be 30% or less, 20% or less, or 10% or less, or the secretion level of the endogenous secretory enzyme may be completely eliminated.
  • the above-mentioned culture supernatant can be used as it is, or with other components added, as an enzyme preparation in which the amount of undesirable endogenous secreted enzyme is reduced.
  • other components that can be added include water, alcohols, preservatives, excipients, pH adjusters, minerals, antioxidants, solubilizers, binders, suspending agents, flavoring agents, surfactants , And fluidity promoters. These components can be used alone or in combination.
  • the culture supernatant can be further processed by filtration sterilization, concentration, purification or separation of a desired enzyme, and the like.
  • the modified fungus of the present invention or the culture supernatant can be used for production of a target substance.
  • the endogenous secretory enzyme immobilized on the cell surface by GPI in the modified fungus can be appropriately selected according to the target substance, and may be one or two or more.
  • the combination of the target substance and the secretory enzyme is as follows: (a) the target substance is a sugar, the secretory enzyme is a glycosidase; (b) the target substance is a lipid, and the secretory enzyme is a lipase; A combination selected from the group consisting of (c) the target substance is a protein (or peptide) and the secretory enzyme is a protease; and (d) the target substance is a nucleic acid and the secretory enzyme is a nuclease. It may be.
  • the combination of the target substance and the secretory enzyme may preferably be a combination selected from the group consisting of the above (a) to (c), more preferably the target substance is cellobiose and the secretory enzyme is Bgl1 .
  • the present invention includes a step of producing a target substance from a source substance by bringing the source substance into contact with the modified fungus or culture supernatant described in “1. , Relating to the production method of the target substance.
  • the raw material can be selected according to the target substance.
  • the target substance when the target substance is a sugar, the raw material may be a sugar having a higher molecular weight than the target substance, for example, a polysaccharide such as cellulose.
  • the target substance when the target substance is a lipid, the raw material may be a lipid having a larger molecular weight than the target substance, and when the target substance is a protein or peptide, the source substance is larger than the target substance. It may be a protein having a molecular weight, and when the target substance is a nucleic acid, the raw material may be a nucleic acid having a higher molecular weight than the target substance.
  • the combination of the target substance and the endogenous secretory enzyme is, for example, a combination selected from the group consisting of (a) to (d) or (a) to (c) as described above, preferably
  • the target substance is cellobiose
  • the secretory enzyme is ⁇ -glucosidase.
  • the process for producing the target substance from the raw material is not particularly limited.
  • the modified fungus described in the present specification may be cultured in a medium containing a raw material, or the culture supernatant described in the specification or an enzyme preparation containing the same may be cultured under appropriate conditions such as water.
  • the reaction may be carried out by contacting with a raw material substance at normal temperature (10 ° C. to 40 ° C., eg, 20 ° C. to 30 ° C.) or low temperature (4 to 10 ° C.) in a buffer solution.
  • the production method of the present invention may include a step of recovering the target substance in addition to the step of producing the target substance from the raw material.
  • the recovery step can be performed by removing the modified fungi, for example, by centrifugation or filtration.
  • the production method of the present invention may include a step of purifying or separating the raw material.
  • the purification or separation step may be performed by a conventional method, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reversed phase column chromatography, HPLC chromatography, ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, and immunoadsorption. Any one of the methods or a combination of two or more of them can be used.
  • Example 1 Construction of Bgl1-GPI strain and activity measurement ⁇ Materials and methods> (Used strain and medium)
  • Trichoderma reesei NBRC 31327 obtained from NBRC was used as a parent strain.
  • AM agar medium (10 g / L glucose, 6 g / L NaNO 3 , 0.52 g / L KCl, 0.52 g / L MgSO 4 (7H 2 O), 1.52) is used to obtain conidia for T. reesei. g / L KH 2 PO 4 , 2.11 g / L arginine, 5 ⁇ g / mL biotin, Hutner's trace elements, pH 6.5) was used.
  • TM liquid medium (10 g / L glucose, 10 g / L KH 2 PO 4 , 6 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / L MgSO was used for culturing the cells for protoplast preparation.
  • agar medium in which 0.5 M KCl as an osmotic pressure regulator and 150 ⁇ g / mL Hygromycin B as a selective pressure were added to a TM medium was used as a selective medium for transformants.
  • a medium in which the carbon source of the TM liquid medium was changed from 10 g / L glucose to 10 g / L cellobiose was used as a medium for measuring ⁇ -glucosidase activity.
  • a polynucleotide encoding a GPI-added signal sequence was added to the bgl1 gene on the chromosome of NBRC 31327 strain by homologous recombination.
  • the primer set of TRbgl1gpi-FC / TRbgl1gpi-R1, TRbgl1gpi-F2 / TRbgl1gpi-R2, and TRbgl1gpi-F4 / TRbgl1gpi-RC using the genomic DNA of NBRC 31327 as a template PCR was performed according to (Table 1) to amplify a partial sequence of the bgl1 gene, a polynucleotide encoding a GPI-added signal sequence, and a 3′UTR region of the bgl1 gene.
  • the hph gene encoding a hygromycin resistance marker was amplified using the plasmid pAN7.1 as a template and the primer set TRbgl1gpi-F3 / TRbgl1gpi-R3. These four PCR products were ligated by fusion PCR, and the product amplified by the primer set TRbgl1gpi-F1 / TRbgl1gpi-R4 was TA cloned into pGEM T-Easy vector (Promega) to obtain pG-bgl1-gpi. pG-bgl1-gpi was cleaved with restriction enzyme NotI and used for transformation of NBRC 31327 strain.
  • NBRC 31327 was transformed by protoplast-PEG method.
  • NBRC 31327 is cultured in TM liquid medium at 30 °C, 80 rpm, then collected and treated with 0.4 g / L Yatalase (Takara Bio) and 0.4 g / L Cellulase Onozuka R-10 (Yakult) did.
  • Transformants were selected using an agar medium in which 0.5 ⁇ M KCl and 150 ⁇ g / mL Hygromycin B were added to AM medium.
  • NBRC 31327 and Bgl1-GPI conidia 2 ⁇ 10 7 were inoculated into 100 mL of TM liquid medium containing cellobiose as a carbon source, and cultured at 30 ° C. and 140 rpm for 2 days.
  • the bacterial cells and the culture supernatant were separated by filtration, and the bacterial cells were lyophilized and weighed.
  • the culture supernatant was concentrated with a 10 kDa ultrafiltration filter unit (Vivacon 500, Sartorius), and buffer exchanged to 100 mM acetate buffer (pH 5.0).
  • the polynucleotide encoding the GPI-added signal sequence is added to the bgl1 gene. It was confirmed that the obtained strain was obtained (FIG. 1).
  • the NBRC 31327 strain (wild strain) and the obtained mutant strain (Bgl1-GPI strain) were cultured in a TM liquid medium using cellobiose as a carbon source for 2 days. After culturing, the cells and the culture supernatant were separated by filtration, and the cells were lyophilized and weighed. As a result, the lyophilized cell weight of the Bgl1-GPI strain tended to be lower than that of the wild strain, suggesting that the viability of the Bgl1-GPI strain is slightly lower than that of the wild strain (Figure 2A). ).
  • Example 2 Comparison of various enzyme activities of Bgl1-GPI strain ⁇ Materials and methods>
  • the Bgl1-GPI strain obtained in Example 1 and the spore 1 ⁇ 10 7 of the wild strain NBRC31327 were inoculated into 150 mL of the medium and cultured at 30 ° C. and 163 rpm for 2 days.
  • As the medium a medium having the following composition and adjusted to pH 6.0 with 10 N NaOH was used.
  • the cells were separated into cells and culture supernatant using a glass filter (IWAKI, 3G1), and the cells were freeze-dried and weighed.
  • the enzyme activity (CMCase activity, CBH activity, and BGL activity) of the culture supernatant was measured as follows and calculated as the enzyme activity per protein amount.
  • the BGL activity was measured by quantifying glucose produced by a reaction at a substrate cellobiose concentration of 1%, pH 5.0, 50 ° C. for 10 minutes by an enzymatic method (Wako Pure Chemical Industries: Glucose CII Test Wako).
  • CMC degradation activity is determined by quantification method (DNS method) using 3,5-dinitrosalicylic acid on reducing sugar produced by carboxymethylcellulose from Sigma and reacting for 10 minutes at a substrate concentration of 1%, pH 5.0, 50 ° C. Quantified with glucose as standard. CBH activity was reduced by reaction using KC Flock (W-400G) or Sigma Avicel (PH-101) manufactured by Nippon Paper Industries at a substrate concentration of 1 (w / v)%, pH 5.0, 50 ° C for 10 minutes. Sugar was quantified with glucose as a standard by quantification method using 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS method).
  • Example 3 Comparison of cellobiose productivity in Bgl1-GPI strain and wild strain ⁇ Materials and Methods> Strains were cultured in the same manner as in Example 2, and separated into cells and culture supernatant using a glass filter.
  • the cotton supernatant obtained by pulverizing the culture supernatant and kakui absorbent cotton was reacted (in 0.25% cotton, acetate buffer [pH 5.0], the reaction was carried out at 50 ° C.). Sampling was performed at 1 hour, 4 hours, and 10 hours.
  • the reaction solution of the obtained culture supernatant and cotton cellulose was filtered using a cellulose acetate membrane filter (Advantech, 25CS020AS) manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd., and the filtrate was measured by HPLC.
  • the peak of glucose and cellobiose Each concentration and the ratio of cellobiose and glucose were determined from the area.
  • a culture supernatant in which the amount of a specific endogenous secreted enzyme is reduced can be obtained, and this can be used as it is as an enzyme preparation.
  • this method by applying this method to various enzymes secreted by fungi, a combination of secreted enzymes can be easily customized, so that enzyme preparations suitable for various purposes can be produced. Since the efficiency of substance production can be improved by using an enzyme preparation with a reduced amount of undesirable enzymes, the industrial applicability of the present invention is great.

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Abstract

本発明は、望ましくない酵素の量が低減された培養上清を簡便に得るための方法、該方法に用いられ得る微生物、及び該微生物を用いて目的の物質を生産する方法等を提供すること等を目的とする。　本発明は、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドに、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現する改変真菌、及び該改変真菌を用いて目的の物質を生産する方法等に関する。

Description

真菌におけるタンパク質の選択的分泌技術
　本発明は、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドに、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現する改変真菌、及び該改変真菌を用いて目的の物質を生産する方法等に関する。
　真菌、特に糸状菌は多種多様な酵素を分泌生産するため、その培養上清が酵素製剤として使用されている。しかしながら、真菌の培養上清を酵素製剤として使用する場合には、真菌由来の望ましくない酵素、例えば目的物質を分解する活性を有する酵素の混入が問題となる。培養上清から望ましくない酵素を除去するには、精製又は分離プロセス等が必要になるため、真菌由来の酵素製剤には、コストが高く、生産量が一定せず安定供給が難しいという2つの大きな問題があった。また、望ましくない酵素の量を低減する方法として、該酵素をコードする遺伝子を破壊した株を用いる方法も考えられるが、この方法では真菌の増殖性が顕著に低下する可能性がある。したがって、真菌の増殖性を顕著に損ねることなく、望ましくない酵素の量が低減された培養上清を得る方法が求められていた。
　一方、GPI（グリコシルホスファチジルイノシトール）は、翻訳後修飾によってタンパク質のC末端に付加される糖脂質であり、ある種のタンパク質を細胞表面に固定化（アンカー）する機能を有する。これまでに、GPIは、酵母においてタンパク質を細胞表面にディスプレイさせるために用いることが示されているが（特許文献１）、GPIを内在性の分泌酵素に適用することは、これまでに全く考えられていなかった。
特表2012-511920号公報
　本発明は、真菌の増殖性を顕著に損ねることなく、望ましくない酵素の量が低減された培養上清を得るための方法、該方法に用いられ得る微生物、及び該微生物又は培養上清を用いて目的の物質を生産する方法を提供すること等を目的とする。
　本発明者は、内在性の分泌酵素をコードする遺伝子にGPI付加シグナル配列を付加することによって、内在性の分泌酵素が細胞表層に留まり、培養上清中の内在性の分泌酵素の量が低減されることを見出し、本願発明を完成させた。
　したがって、本願発明は以下の態様を包含する。
（１）内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現し、それによって、前記分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定されたことを特徴とする改変真菌。
（２）糸状菌に属する、（１）に記載の真菌。
（３）Trichoderma属、Aspergillus属、Penicillium属、Monascus属、及びThermoascus属からなる群から選択される糸状菌に属する、（２）に記載の真菌。
（４）Trichoderma reesei種に属する、（３）に記載の真菌。
（５）分泌酵素がグリコシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼからなる群から選択される、（１）～（４）のいずれかに記載の真菌。
（６）真菌が目的の物質の生産に用いられるものであり、目的の物質と分泌酵素が、以下の組み合わせ：
　（a）目的の物質が糖であり、分泌酵素がグリコシダーゼである；
　（b）目的の物質が脂質であり、分泌酵素がリパーゼである；
　（c）目的の物質がタンパク質であり、分泌酵素がプロテアーゼである；及び
　（d）目的の物質が核酸であり、分泌酵素がヌクレアーゼである；
からなる群から選択される、（１）～（５）のいずれかに記載の真菌。
（７）目的の物質がセロビオースであり、分泌酵素がβグルコシダーゼである、（６）に記載の真菌。
（８）（１）～（５）のいずれかに記載の真菌を培地で培養する工程、及び
培養された該真菌から内在性分泌酵素の量が低減された培養上清を回収する工程
を含む、内在性分泌酵素の量が低減された真菌培養上清を生産する方法。
（９）原料物質を、（１）～（５）のいずれかに記載の真菌又は（８）に記載の真菌培養上清と接触させ、原料物質から目的の物質を生産する工程
を含む、目的の物質を生産する方法。
（１０）目的の物質と分泌酵素が、以下の組み合わせ：
　（a）目的の物質が糖であり、分泌酵素がグリコシダーゼである；
　（b）目的の物質が脂質であり、分泌酵素がリパーゼである；
　（c）目的の物質がタンパク質であり、分泌酵素がプロテアーゼである；及び
　（d）目的の物質が核酸であり、分泌酵素がヌクレアーゼである；
（９）に記載の方法。
（１１）目的の物質がセロビオースであり、分泌酵素がβグルコシダーゼである、（１０）に記載の方法。
（１２）目的の物質を回収する工程を含む、（９）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現するように真菌を改変する工程を含む、前記分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定された改変真菌の作製方法。
（１４）真菌がTrichoderma reesei種に属する、（１３）に記載の方法。
（１５）分泌酵素がグリコシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼからなる群から選択される、（１３）又は（１４）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-252330号の開示内容を包含する。
　本発明の一実施形態において、望ましくない内在性の分泌酵素の量が低減された培養上清を得ることができ、これを酵素製剤としてそのまま用いることができる。また、一実施形態において、本方法を真菌が分泌する様々な酵素に適用することで、分泌される酵素の組み合わせを容易にカスタマイズすることができるため、様々な目的に合った酵素製剤の生産及び物質生産への応用が可能となり得る。
図1は、野生株、及び実施例で作製した変異株（Bgl1-GPI株）に対してPCRを行った際の電気泳動の結果を示す。Bgl1-GPI株において配列挿入によるシフトアップを観察することによって、Bgl1-GPI株においてbgl1遺伝子にGPI付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが付加されたことを確認した。 図2は、野生株、及び実施例で作製した変異株（Bgl1-GPI株）の凍結乾燥菌体重量（Ａ）、及び両株の培養上清のBgl1活性の測定結果（Ｂ）を示す。 図3は、野生株、及び実施例で作製した変異株（Bgl1-GPI株）の培養上清のCMCase活性（Ａ）、CBH活性（Ｂ）、及びBgl1活性の測定結果（Ｃ）を示す。 図4は、野生株、及び実施例で作製した変異株（Bgl1-GPI株）の、セルロースから産生されたグルコース／セロビオースの比の経時的変化を示す。
１．改変真菌
　一態様において、本発明は改変真菌に関する。
　本発明の改変真菌は、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドを連結することによって、遺伝子的に改変されている。
　本明細書において、「内在性分泌酵素」とは、遺伝子的に改変されていない真菌が、もともと分泌するあらゆる酵素、特にその分泌が望ましくない酵素を指す。その分泌が「望ましくない」酵素の例として、例えば本発明の改変真菌が物質生産に用いられる場合、目的の物質を分解する活性を有するもの、目的の物質の生産を阻害するもの、目的の物質の活性に干渉するもの等が挙げられる。内在性分泌酵素の具体例として、限定するものではないが、グリコシダーゼ（特にグルコシダーゼ）、リパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼ、好ましくはグリコシダーゼ（特にグルコシダーゼ）、リパーゼ、プロテアーゼ、さらに好ましくはグリコシダーゼ（特にグルコシダーゼ）、例えばセロビオヒドラーゼ（EC3.2.1.91）、エンドグルカナーゼ（EC3.2.1.4）、及びβグルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）が挙げられる。改変真菌がトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）である場合、内在性分泌酵素は好ましくはβグルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）、好ましくは分泌性のβグルコシダーゼであるBgl1、Cel3b、Cel3e、Cel3f、及びCel3gの少なくとも一つであり、特に好ましくはBgl1である。これらの酵素の活性は当業者に公知の方法により、例えばこれらの酵素により分解されて蛍光物質又は吸光物質を生ずる基質を用いて測定することができる。例えば、βグルコシダーゼの活性は、βグルコシダーゼ活性を有する酵素により分解されて吸光物質を生ずるp-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside等の基質等を用いて、測定することができる。
　内在性分泌酵素の配列は、公のデータベース（例えば、NCBI（米国）、DDBJ（日本）、EMBL（欧州））より、入手することができ、例えばTrichoderma reeseiのBgl1（βグルコシダーゼ1）は、配列番号13で示されるアミノ酸配列を含む。また、Trichoderma reeseiのBgl1をコードするポリヌクレオチドは、配列番号14で示されるポリヌクレオチド配列を含む。Bgl1は、上記アミノ酸配列の機能的等価体、例えば（i）配列番号13で示されるアミノ酸配列と例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、（ii）配列番号13で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、（iii）配列番号13で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。同様に、Bgl1をコードするポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチド配列の機能的等価体、例えば（i）配列番号14で示されるポリヌクレオチド配列と例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列、（ii）配列番号14で示されるポリヌクレオチド配列において1若しくは複数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／若しくは置換されたポリヌクレオチド配列、（iii）配列番号14で示されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
　本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列に関する同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。
　また、本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列に関する「１若しくは複数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは数個、例えば1から4個又は1から3個、あるいは1個又は2個である。
　また、本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定すればよい。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度25～500mM、好ましくは25～300mM、かつ温度42～68℃、好ましくは42～65℃が挙げられる。より具体的には、5×SSC（ここで、1×SSCは150mM NaCl及び15mMクエン酸ナトリウムである)、温度42℃が挙げられる。
　本明細書において、グリコシルホスファチジルイノシトール（以下、単に「GPI」とも記載する）とは、オリゴ糖鎖とイノシトールリン脂質を含む糖脂質であり、ある種のタンパク質を細胞表面に固定化（アンカー）する機能を有する。GPIは基本的に、エタノールアミン、リン酸、トリマンノシド、グルコサミン、及びイノシトールリン脂質をこの順序で含む（例えば、Hiroh IKEZAWA, Biol. Pharm. Bull. 25(4)409-417を参照されたい）。GPIの糖鎖部分の側鎖、及び脂質部分の分子種については、生物種、細胞又はタンパク質に応じてバリエーションが認められることが知られている。
　GPIは小胞体において合成され、タンパク質のC末端に連結される。GPIアンカーが付加されるタンパク質は、通常、N末端のシグナルペプチドに加え、C末端にGPI付加シグナル配列（「GPI付加シグナル」とも呼ばれる）を含む。このGPI付加シグナル配列が切断され、新たに生じたカルボキシ末端（「ω部位」と呼ばれる）に、小胞体で合成されたGPIのエタノールアミン部分が連結する。その後、GPIアンカーが付加されたタンパク質は、さらなる修飾を受けながら、細胞表面へ輸送される。
　本発明の改変真菌は、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、GPI付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結することによって、分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定されている。GPI付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドは、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に直接連結してもよいし、適当な介在配列、例えば1～300、5～200、又は10～100程度のヌクレオチドを読み枠がずれないように加えて連結してもよい。
　上記改変の結果として、本発明の改変真菌は、内在性分泌酵素の分泌量が野生型に対して低減され得る。本発明の改変真菌は、一つの内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドのみが改変されていてもよいし、複数の内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドが改変されてもよい。複数の内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチド改変する場合、例えば、2個、3個、4個、又は5個以上の内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチド改変することができる。
　上記改変による内在性分泌酵素の分泌量の低減の程度は特に限定しないが、例えば、野生型に対し90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、好ましくは50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10％以下の発現量であってよく、また内在性分泌酵素の分泌を完全に消失させるものであってもよい。
　本発明の改変真菌においては、内在性分泌酵素の分泌量が低減され得るが、内在性分泌酵素は細胞表面に存在し、発現自体は低減されないため、遺伝子ノックアウトや発現抑制に比べ、真菌の生育に与える影響が少ないと考えられる。
　本発明の改変真菌の生育性は、野生型と同程度であってもよく、野生型と比べて劣るものであってもよい。例えば、本発明の改変真菌の生育性は、培養後の凍結乾燥菌体重量（g）、培養後又は培養中の特定の時期の濁度（OD660）、培養後又は培養中の特定の時期の生菌数（cfu/ml）、好ましくは培養後の凍結乾燥菌体重量（g）で測定される生育性が、野生型に比較して50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、98%以上、99%以上、又は100%以上であってよい。
　本明細書において、GPI付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドの種類及び配列は特に限定しない。本明細書において、「外来性ポリヌクレオチド」とは、「内在性分泌酵素」をコードする天然のポリヌクレオチドには含まれないポリヌクレオチドを指す。したがって、「外来性ポリヌクレオチド」は、「内在性分泌酵素」を発現する生物と同種に由来してもよいし、異種に由来してもよい。好ましくは、「外来性ポリヌクレオチド」は、「内在性分泌酵素」を発現する生物と同じ属に由来し、さらに好ましくは、「内在性分泌酵素」を発現する生物と同じ種に由来する。
　GPI付加シグナル配列にはコンセンサス配列はないが、多くのGPI付加シグナル配列の特徴として、以下の四つの特徴：（i）GPIのエタノールアミン部分が連結する部位（ω部位）として側鎖の小さいアミノ酸が用いられる、（ii）ω+2（ω部位から2残基C末端側、以下同じ）のアミノ酸もGly、Ala、Serのような側鎖の小さいアミノ酸が用いられる、（iii）ω+3から6～10アミノ酸の親水性領域がある、（iv）その後のC末端までの10～20アミノ酸が疎水領域である、が挙げられる（藤田盛久、生化学第85巻第11号、pp.985-995、2013）。近年、GPI付加シグナル配列を予測するプログラムが多数公開されており、また当業者であれば、公のデータベースから、容易にGPI付加シグナル配列を入手することができる。
　GPI付加シグナル配列の例として、例えばTrichoderma reesei由来の配列番号15で示されるアミノ酸配列を含むGPI付加シグナル配列、Aspergillus kawachii由来の配列番号17で示されるアミノ酸配列を含むGPI付加シグナル配列、Penicillium chrysogenum由来の配列番号19で示されるアミノ酸配列を含むGPI付加シグナル配列が挙げられる。また、GPI付加シグナル配列の例として、（i）配列番号15、17、又は19で示されるアミノ酸配列と例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、（ii）配列番号15、17、又は19で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、（iii）配列番号15、17、又は19で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列が挙げられる。
　GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの例として、配列番号15、17、及び19で示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする配列番号16、18、及び20で示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。また、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの例として、（i）配列番号16、18、又は20で示されるポリヌクレオチド配列と例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列、（ii）配列番号16、18、又は20で示されるポリヌクレオチド配列において1若しくは複数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／若しくは置換されたポリヌクレオチド配列、（iii）配列番号16、18、又は20で示されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列が挙げられる。
　本発明の改変真菌の由来となる真菌の属及び種は特に限定しないが、好ましくは酵母又は糸状菌である。酵母の例として、サッカロミセス（Saccharomyces）属、クルイウェロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ピチア（Pichia）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、及びヤロウィア（Yarrowia）属からなる群から選択される属の酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces　cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、及びピチア・パストリス種（Pichia pastoris）が挙げられる。
　改変真菌は、好ましくは糸状菌である。糸状菌の例として、限定するものではないが、トリコデルマ（Trichoderma）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、モナスカス（Monascus）属、サーモアスカス（Thermoascus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、アクレモニウム（Acremonium）属、及びニューロスポラ（Neurospora）属、好ましくはトリコデルマ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、モナスカス属、及びサーモアスカス属からなる群から選択される属の糸状菌、例えばトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、及びペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）が挙げられる。本発明の改変真菌は、特に好ましくは、Trichoderma属の糸状菌、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンジブラチアトウム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、又はトリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）であり、さらに好ましくはトリコデルマ・リーセイである。本発明の改変真菌の由来となる真菌の株は限定されず、単離株を用いてもよいし、ATCC及びNBRC等の寄託機関から分譲された株、例えばTrichoderma reesei NBRC 31327を用いてもよい。
　本発明の改変真菌は、当業者に知られる任意の方法により作製することができる（例えば、遺伝子組み換え技術の詳細についてはSambrookら,“Molecular Cloning, A Laboratory Manual fourth edition”, Cold Spring Harber Laboratory Press, 2012を参照されたい）。本発明の改変真菌は、例えば以下に記載する改変真菌の作製方法に従って作製することができる。
　一態様において、本発明は、内在性分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定された上記改変真菌の作製方法に関する。本改変真菌の作製方法は、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現するように真菌を改変する工程を含む。
　例えば、本改変工程は、例えば遺伝子組換え技術及び相同組換え技術を利用して、野生型真菌ゲノム由来の、内在性分泌酵素遺伝子の一部又は全部を含んでもよい該遺伝子の上流約1～3kbpのDNA及び該遺伝子の下流約1～3kbpのDNAのそれぞれを、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドの5'側及び3'側にフランキングしたDNAを含む遺伝子カセットを野生型真菌細胞内に導入することにより得ることができる。遺伝子カセットは、野生型の真菌が内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドを有する遺伝子座に導入することができる。この場合、上記遺伝子カセットにおいて、上記GPI付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドを、上記分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端に連結して含む場合には、相同組換え法によって該遺伝子カセットを、野生型の内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に連結される様に、又は野生型の内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドを置換する様に導入することができる。あるいは、野生型の真菌の内在性分泌酵素をノックアウトし、野生型の真菌が内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドを有する遺伝子座とは異なる遺伝子座に遺伝子カセットを導入してもよい。
　真菌に導入する遺伝子カセットは、改変真菌の選択を容易にするため、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、又はカナマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーをさらに含んでいてもよい。
　遺伝子カセットは適当なベクター、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばpGEM（登録商標）-T Easy、pET22b(+)、pBR322、pUC118、及びpBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、及び酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等）等を利用して、真菌に導入することができる。遺伝子カセット又はベクターの導入は、例えば、プロトプラスト-PEG法、エレクトロポレーション法、及び金属処理法等の当業者に知られる方法により行うことができる。
　本発明の改変真菌の作製方法は、上記改変工程に加えて、改変真菌を選抜する工程を含んでもよい。選抜工程は、例えば選択マーカーを含む遺伝子カセット又はベクターを上記の通り導入して真菌を形質転換し、形質転換された真菌を選択圧下で増殖させることにより行うことができる。
　本発明の改変真菌の作製方法は、改変真菌を選抜する工程に加えて、又は選抜工程とは別に、改変真菌において所望の遺伝子改変がなされたか否かを決定する工程を含んでよい。本工程は、例えばPCR法及び電気泳動によるヌクレオチド挿入の確認、又はPCR法による配列解析等により行うことができる。
　一態様において、本発明は、本明細書に記載の真菌を培地で培養する工程、及び培養された該真菌から内在性分泌酵素の量が低減された培養上清を回収する工程を含む内在性分泌酵素の量が低減された培養上清を生産する方法に関する。
　本方法における培養工程は、例えば、真菌細胞を、小スケール又は大スケール発酵（連続式、バッチ式、供給バッチ式、又は固状発酵等）により、適当な培地中で当業者に知られる方法により実施することができる。培地としては、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適当な栄養培地、例えば市販の培地又は公開された処方に従って調製された培地を用いることができる。
　培養上清を回収する工程は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば濾過又は遠心等によっておこなうことができる。また、本方法は、培養工程及び回収工程以外に、培養上清から特定のタンパク質を精製又は分離する工程を任意に含んでよい。
　本方法における内在性分泌酵素の分泌量の低減の程度は特に限定しないが、例えば、野生型に対し90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、好ましくは50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10％以下の発現量であってよく、また内在性分泌酵素の分泌量を完全に消失させるものであってもよい。
　上記培養上清は、望ましくない内在性分泌酵素の量が低減された酵素製剤として、そのまま、或いは他の成分を加えて用いることができる。添加し得る他の成分の例として、水、アルコール類、保存剤、賦形剤、pH調整剤、ミネラル類、抗酸化剤、可溶化剤、結合剤、懸濁剤、矯臭剤、界面活性剤、及び流動性促進剤等が挙げられる。これらの成分は単独で、または組み合わされて使用され得る。また、上記培養上清に対し、濾過滅菌、濃縮、所望の酵素の精製又は分離等のさらなる処理を行うこともできる。
　本発明の改変真菌又は上記培養上清は、目的の物質の生産に用いることができる。改変真菌においてGPIにより細胞表面に固定される内在性分泌酵素は、目的の物質に応じて適宜選択することができ、一つであっても、二つ以上であってもよい。例えば、目的の物質と分泌酵素の組み合わせは、以下：（a）目的の物質が糖であり、分泌酵素がグリコシダーゼである；（b）目的の物質が脂質であり、分泌酵素がリパーゼである；（c）目的の物質がタンパク質（又はペプチド）であり、分泌酵素がプロテアーゼである；及び（d）目的の物質が核酸であり、分泌酵素がヌクレアーゼである；からなる群から選択される組み合わせであってよい。目的の物質と分泌酵素の組み合わせは好ましくは上記（a）～（c）からなる群から選択される組み合わせであってよく、さらに好ましくは、目的の物質はセロビオースであり、分泌酵素はBgl1である。
２．目的の物質の生産方法
　一態様において、本発明は、原料物質を、上記「１．改変真菌」に記載の改変真菌又は培養上清と接触させ、原料物質から目的の物質を生産する工程を含む、目的の物質の生産方法に関する。
　本方法において、原料物質は、目的の物質に応じて選択することができる。例えば目的の物質が糖である場合、原料物質は目的の物質よりも大きな分子量を有する糖、例えばセルロース等の多糖であってよい。同様に、目的の物質が脂質である場合、原料物質は目的の物質よりも大きな分子量を有する脂質であってよく、目的の物質がタンパク質又はペプチドである場合、原料物質は目的の物質よりも大きな分子量を有するタンパク質であってよく、目的の物質が核酸である場合、原料物質は目的の物質よりも大きな分子量を有する核酸であってよい。
　本方法において、目的の物質と、内在性分泌酵素の組み合わせは上記の通り、例えば上記（a）～（d）又は（a）～（c）からなる群から選択される組み合わせであり、好ましくは目的の物質はセロビオースであり、分泌酵素はβグルコシダーゼである。
　本発明の生産方法において、原料物質から目的の物質を生産する工程は特に限定しない。例えば、本明細書に記載の改変真菌を原料物質を含む培地で培養することにより行ってもよいし、本明細書に記載の培養上清又はこれを含む酵素製剤を、適当な条件、例えば水又は緩衝液中、常温（10℃～40℃、例えば20℃～30℃）又は低温（4～10℃）で原料物質と接触させ、反応させてもよい。
　本発明の生産方法は、原料物質から目的の物質を生産する工程に加えて、目的の物質を回収する工程を含んでよい。回収工程は、例えば遠心又は濾過等により改変真菌を除くことにより行うことができる。また、本発明の生産方法は、原料物質を精製又は分離する工程を含んでよい。精製又は分離工程は、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法のいずれか一つ、又はこれらを二以上組み合わせて用いることによって行うことができる。
実施例1:Bgl1-GPI株の構築と活性測定
＜材料と方法＞
（使用菌株と培地）
　本実験では、親株としてTrichoderma reesei NBRC 31327（NBRCから入手）を用いた。T. reeseiの分生子の取得のための培養にはAM寒天培地（10 g/L グルコース、6 g/L NaNO3、0.52 g/L KCl、0.52 g/L MgSO4（7H2O）、1.52 g/L KH2PO4、2.11 g/L アルギニン、5μg/mL ビオチン、Hutner’s trace elements、pH 6.5）を用いた。次に、プロトプラスト調製用の菌体の培養には、TM液体培地（10 g/L glucose、10 g/L KH2PO4、6 g/L (NH4)2SO4、1 g/L MgSO4（7H2O）、3 g/L tri-sodium citrate（2H2O）、5 mg/L FeSO4（7H2O）、2.5 mg/L MnSO4（5H2O）、1.4 mg/L ZnSO4（7H2O）、2 mg/L CaCl2（2H2O）、pH 6.0）を用いた。また、形質転換体の選択培地には、TM培地に浸透圧調節剤として0.5 M KClと選択圧として150 μg/mL Hygromycin Bを添加した寒天培地を用いた。さらに、β-グルコシダーゼ活性を測定するための培地としてTM液体培地の炭素源を10 g/L グルコースから10 g/L セロビオースに変更した培地を用いた。
（Bgl1にGPI付加シグナル配列を付加した株の構築）
　NBRC 31327株のβグルコシダーゼ1（Bgl1）のC末端にGPI付加シグナル配列が連結されたアミノ酸（配列番号11、本アミノ酸配列をコードするcDNAは配列番号12で示す塩基配列を有する）を発現する変異株を、以下の方法に従って調製した。
　NBRC 31327株の染色体上のbgl1遺伝子に、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを相同組換えにより付加した。相同組換えに用いるDNAカセットを作成するために、NBRC 31327株のゲノムDNAを鋳型として、TRbgl1gpi-FC/TRbgl1gpi-R1、TRbgl1gpi-F2/TRbgl1gpi-R2、およびTRbgl1gpi-F4/TRbgl1gpi-RCのプライマーセット（表1）によりPCRを行い、それぞれbgl1遺伝子の部分配列、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、及びbgl1遺伝子の3’UTR領域を増幅した。また、プラスミドpAN7.1を鋳型としてプライマーセットTRbgl1gpi-F3/TRbgl1gpi-R3によりハイグロマイシン耐性マーカーをコードするhph遺伝子を増幅した。これらの4つのPCR産物をfusion PCRにより連結して、プライマーセットTRbgl1gpi-F1/TRbgl1gpi-R4により増幅した産物を、pGEM T-Easyベクター（Promega）にTAクローニングし、pG-bgl1-gpiとした。pG-bgl1-gpiを制限酵素NotIで切断して、NBRC 31327株の形質転換に用いた。NBRC 31327の形質転換は、プロトプラスト-PEG法により行った。NBRC 31327株をTM液体培地で30℃、80 rpmで培養後、集菌して0.4 g/L Yatalase（Takara Bio）と0.4 g/L Cellulase Onozuka R-10（Yakult）で処理することによりプロトプラスト化した。形質転換体は、AM培地に0.5 M KClと150 μg/mL Hygromycin Bを添加した寒天培地を用いて選択した。bgl1遺伝子にGPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが付加した株の取得の確認は、プライマーセットTRbgl1gpi-FC/TRbgl1gpi-RによるPCRにより行った。その際、野生株の遺伝子型の場合、4.4 kb、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを付加した株の遺伝子型の場合、8.4 kbのサイズのPCR産物が増幅することを判断基準とした。取得したGPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを付加した株は、Bgl1-GPI株とした。
　本実験で用いたプライマーを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（β-グルコシダーゼ活性の測定）
　セロビオースを炭素源とするTM液体培地 100 mLにNBRC 31327株とBgl1-GPI株の分生子2×107を接種して、30℃、140 rpmで2日間培養した。菌体と培養上清をろ過により分離して、菌体を凍結乾燥して重量を測定した。一方、培養上清を10 kDaの限外ろ過フィルターユニット（Vivacon 500、Sartorius）により濃縮し、100 mM酢酸バッファー（pH5.0）にバッファー交換した。これを150 mM p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside（Sigma）と反応（50℃、1時間）させた後、吸光度（Abs = 400 nm）を測定した。
＜結果＞
　上記の通り、bgl1遺伝子の部分配列、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、bgl1遺伝子の3’UTR領域、及びhph遺伝子を含むpG-bgl1-gpiを形質転換し、ハイグロマイシンによって選択することによって、Trichoderma reesei NBRC 31327株の変異株を構築した。野生株及び変異株に対してPCRを行い、マーカー遺伝子とGPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの配列挿入によるシフトアップを観察することによって、bgl1遺伝子にGPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが付加した株が得られたことを確認した（図1）。
　続いて、NBRC 31327株（野生株）と得られた変異株（Bgl1-GPI株）を、セロビオースを炭素源とするTM液体培地で2日間培養した。培養後、菌体と培養上清をろ過により分離して、菌体を凍結乾燥して重量を測定した。その結果、Bgl1-GPI株の凍結乾燥菌体重量が野生株より低い傾向が認められたことから、Bgl1-GPI株は野生株に比べて生育性がやや低下することが示唆された（図2A）。
　続いて、野生株及びBgl1-GPI株の培養上清のBgl活性を、p-nitrophenyl-β-D-glucopyranosideを基質として用いて測定した。その結果、Bgl1-GPI株の培養上清のBgl活性は、野生株に比べて顕著に低下していた（図2B）。
実施例2:Bgl1-GPI株の各種酵素活性の比較
＜材料と方法＞
　実施例1で得られたBgl1-GPI株と、野生株であるNBRC31327株の胞子1×107を培地150mLに接種し、30℃、163 rpmで2日間培養した。培地としては、以下の組成を有し、10 N NaOHでpHを6.0に調整した培地を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　培養後、ガラス濾過器（IWAKI、3G1）により菌体と培養上清に分けて、菌体を凍結乾燥して重量を測定した。また、培養上清の酵素活性（CMCase活性、CBH活性、およびBGL活性）を以下の通り測定し、タンパク質量あたりの酵素活性として計算した。具体的には、BGL活性は、基質セロビオース濃度1％、pH5.0、50℃、10分間の反応により生成したグルコースを酵素法（和光純薬：グルコースCIIテストワコー）で定量し測定した。CMC分解活性は、Sigma社のカルボキシメチルセルロースを用い、基質濃度1％、pH5.0、50℃、10分間の反応により生成した還元糖を3,5-ジニトロサリチル酸を用いる定量法(DNS法)でグルコースを標準にして定量した。CBH活性は日本製紙製のKCフロック（W-400G)あるいはシグマAvicel(PH-101)を用い、基質濃度1(w/v)％、pH5.0、50℃、10分間の反応により生成した還元糖を3,5-ジニトロサリチル酸を用いる定量法(DNS法)でグルコースを標準にして定量した。
＜結果＞
　凍結乾燥菌体重量は、野生株では0.12 g、Bgl1-GPI株では0.1 gであった。培養上清の酵素活性の測定結果を図3に示す。図3に示す通り、CMCase活性（A）、及びCBH活性（B）は低下せず、BGL活性（C）のみ顕著に低下したことから、Bgl1がGPIアンカー付加されたことにより培養上清へのBgl1の放出が抑えられたことが示された。
実施例3:Bgl1-GPI株と野生株におけるセロビオース生産性の比較
＜材料と方法＞
　実施例2と同様の方法で菌株を培養し、ガラス濾過器により菌体と培養上清に分けた。続いて、培養上清とカクイ製脱脂綿を粉砕して得られたコットンセルロースを反応させて（0.25%コットン、酢酸バッファー[pH5.0]中、反応は50℃で行った）、継時的（1時間、4時間、10時間）にサンプリングを行った。得られた培養上清とコットンセルロースの反応液を、東洋濾紙製の口径0.2 μmの酢酸セルロースメンブレンフィルター（アドバンテック、25CS020AS）を用いて濾過し、その濾液をHPLCにより測定し、グルコースとセロビオースのピーク面積からそれぞれの濃度とセロビオースとグルコースの割合を求めた。
＜結果＞
　グルコース／セロビオースの生産比を測定結果を図4に示す。コットンセルロースから生産されるセロビオースに対するグルコースの比率は、野生株では継時的に上昇したが、Bgl1-GPIアンカー付加株においては、上昇しなかった。このことから、Blg1-GPIアンカー株により生産される酵素が、セルロースからのセロビオース生産、及びグルコースの生産抑制に効果的であることが示唆された。
　本発明により、特定の内在性の分泌酵素の量が低減された培養上清を得ることができ、これを酵素製剤としてそのまま用いることができる。また、本方法を真菌が分泌する様々な酵素に適用することで、分泌される酵素の組み合わせを容易にカスタマイズすることができるため、様々な目的に合った酵素製剤の生産が可能となる。望ましくない酵素の量が低減された酵素製剤を用いることで物質生産の効率が向上し得るため、本発明の産業上の利用可能性は大きい。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現し、それによって、前記分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定されたことを特徴とする改変真菌。
  2. 　糸状菌に属する、請求項１に記載の真菌。
  3. 　Trichoderma属、Aspergillus属、Penicillium属、Monascus属、及びThermoascus属からなる群から選択される糸状菌に属する、請求項２に記載の真菌。
  4. 　Trichoderma reesei種に属する、請求項３に記載の真菌。
  5. 　分泌酵素がグリコシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の真菌。
  6. 　真菌が目的の物質の生産に用いられるものであり、目的の物質と分泌酵素が、以下の組み合わせ：
    　（a）目的の物質が糖であり、分泌酵素がグリコシダーゼである；
    　（b）目的の物質が脂質であり、分泌酵素がリパーゼである；
    　（c）目的の物質がタンパク質であり、分泌酵素がプロテアーゼである；及び
    　（d）目的の物質が核酸であり、分泌酵素がヌクレアーゼである；
    からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の真菌。
  7. 　目的の物質がセロビオースであり、分泌酵素がβグルコシダーゼである、請求項６に記載の真菌。
  8. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の真菌を培地で培養する工程、及び
    培養された該真菌から内在性分泌酵素の量が低減された培養上清を回収する工程
    を含む、内在性分泌酵素の量が低減された真菌培養上清を生産する方法。
  9. 　原料物質を、請求項１～５のいずれか一項に記載の真菌又は請求項８に記載の真菌培養上清と接触させ、原料物質から目的の物質を生産する工程
    を含む、目的の物質を生産する方法。
  10. 　目的の物質と分泌酵素が、以下の組み合わせ：
    　（a）目的の物質が糖であり、分泌酵素がグリコシダーゼである；
    　（b）目的の物質が脂質であり、分泌酵素がリパーゼである；
    　（c）目的の物質がタンパク質であり、分泌酵素がプロテアーゼである；及び
    　（d）目的の物質が核酸であり、分泌酵素がヌクレアーゼである；
    請求項９に記載の方法。
  11. 　目的の物質がセロビオースであり、分泌酵素がβグルコシダーゼである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　目的の物質を回収する工程を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現するように真菌を改変する工程を含む、前記分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定された改変真菌の作製方法。
  14. 　真菌がTrichoderma reesei種に属する、請求項１３に記載の方法。
  15. 　分泌酵素がグリコシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201054B (zh) * 2021-05-21 2022-07-05 华南农业大学 蛋白FoUPE1在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06503960A (ja) * 1990-12-10 1994-05-12 ジェネンコア　インターナショナル　インコーポレーテッド ＴＲＩＣＨＯＤＥＲＭＡ　ＲＥＥＳＥＩのβ−グルコシダーゼ遺伝子のクローニングおよび増幅によるセルロースの改良糖化
JP2012511920A (ja) 2008-12-16 2012-05-31 ノバルティス アーゲー 酵母ディスプレイ系
WO2014157141A1 (ja) * 2013-03-25 2014-10-02 国立大学法人神戸大学 細胞表層発現用ポリヌクレオチド

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103464A (en) * 1990-12-10 2000-08-15 Genencor International, Inc. Method of detecting DNA encoding a β-glucosidase from a filamentous fungus
CN1836038B (zh) * 2003-05-02 2011-04-06 诺维信股份有限公司 制备分泌型多肽的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06503960A (ja) * 1990-12-10 1994-05-12 ジェネンコア　インターナショナル　インコーポレーテッド ＴＲＩＣＨＯＤＥＲＭＡ　ＲＥＥＳＥＩのβ−グルコシダーゼ遺伝子のクローニングおよび増幅によるセルロースの改良糖化
JP2012511920A (ja) 2008-12-16 2012-05-31 ノバルティス アーゲー 酵母ディスプレイ系
WO2014157141A1 (ja) * 2013-03-25 2014-10-02 国立大学法人神戸大学 細胞表層発現用ポリヌクレオチド

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADACHI, TAKASHI ET AL.: "Construction of an aspergillus oryzae cell -surface display system using a putative GPI-anchored protein", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 81, no. 4, 24 September 2008 (2008-09-24), pages 711 - 719, XP019654174 *
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
ALTSCHUL ET AL., NUC. ACIDS. RES., vol. 25, 1977, pages 3389 - 3402
HIROH IKEZAWA, BIOL. PHARM. BULL., vol. 25, no. 4, pages 409 - 417
MORIHISA FUJITA, BIOCHEMISTRY, vol. 85, no. 11, 2013, pages 985 - 995
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2012, COLD SPRING HARBER LABORATORY PRESS
See also references of EP3564358A4
SU , J. C. ET AL.: "Construction of a cell -surface expression system in Trichoderma reesei", ACTA MICROBIOLOGICA SINICA, vol. 53, no. 1, 2013, pages 38 - 46, XP9515322 *

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