WO2018106142A1 - Пептидный модулятор пуринергических рецепторов - Google Patents
Пептидный модулятор пуринергических рецепторов Download PDFInfo
- Publication number
- WO2018106142A1 WO2018106142A1 PCT/RU2017/000279 RU2017000279W WO2018106142A1 WO 2018106142 A1 WO2018106142 A1 WO 2018106142A1 RU 2017000279 W RU2017000279 W RU 2017000279W WO 2018106142 A1 WO2018106142 A1 WO 2018106142A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cys
- lys
- receptors
- pain
- gly
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 108010080192 Purinergic Receptors Proteins 0.000 title abstract description 11
- 102000000033 Purinergic Receptors Human genes 0.000 title abstract description 10
- 102100040460 P2X purinoceptor 3 Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 101710189970 P2X purinoceptor 3 Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 abstract description 51
- 230000036407 pain Effects 0.000 abstract description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001696 purinergic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 102100040479 P2X purinoceptor 2 Human genes 0.000 description 19
- 101710189968 P2X purinoceptor 2 Proteins 0.000 description 19
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 102000002294 Purinergic P2X Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010000836 Purinergic P2X Receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 7
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 101710094933 Purotoxin-1 Proteins 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- KECTXGMVIXOQAO-UHFFFAOYSA-N purotoxin 1 Chemical compound N1C(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)CNC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C)NC(=O)C(NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)CN)CSSCC(C(NC(C(=O)NCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)N2)C(C)O)=O)NC(=O)C(NC3=O)CSSCC(C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(N)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CC=4C=CC(O)=CC=4)NC(=O)CNC(=O)C(CO)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(N)=O)NC4=O)CSSCC4NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C2CSSCC1C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC3CC1=CNC=N1 KECTXGMVIXOQAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- CAWZRIXWFRFUQB-IOSLPCCCSA-N α,β Methylene ATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)CP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O CAWZRIXWFRFUQB-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 4
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 206010065390 Inflammatory pain Diseases 0.000 description 3
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- MISVBCMQSJUHMH-UHFFFAOYSA-N pyrimidine-4,6-diamine Chemical class NC1=CC(N)=NC=N1 MISVBCMQSJUHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 3
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- VQGBOYBIENNKMI-LJAQVGFWSA-N 5-[(3-phenoxyphenyl)methyl-[(1s)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl]carbamoyl]benzene-1,2,4-tricarboxylic acid Chemical compound C1=C(C(O)=O)C(C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C1C(=O)N([C@@H]1C2=CC=CC=C2CCC1)CC1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 VQGBOYBIENNKMI-LJAQVGFWSA-N 0.000 description 2
- 208000006561 Cluster Headache Diseases 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 2
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 229940126202 P2X3 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004550 Postoperative Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010065347 Premenstrual pain Diseases 0.000 description 2
- 101710094935 Purotoxin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102400001227 Spinorphin Human genes 0.000 description 2
- 101800001235 Spinorphin Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940058936 antimalarials diaminopyrimidines Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 208000018912 cluster headache syndrome Diseases 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002708 spider venom Substances 0.000 description 2
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- VEKPWANJVWWTMM-DYDSHOKNSA-N spinorphin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1[C]2C=CC=CC2=NC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VEKPWANJVWWTMM-DYDSHOKNSA-N 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical class OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004371 toothache Diseases 0.000 description 2
- 208000009935 visceral pain Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 125000001894 2,4,6-trinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJWWHDAQGDJZKY-UHFFFAOYSA-N 3-phenyl-1H-thieno[3,2-c]pyrazole Chemical compound C1(=CC=CC=C1)C1=NNC2=C1SC=C2 BJWWHDAQGDJZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101000844262 Alopecosa marikovskyi Purotoxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001012451 Homo sapiens Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101000614332 Homo sapiens P2X purinoceptor 3 Proteins 0.000 description 1
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N ITP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100037644 Kelch-like protein 41 Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100040444 P2X purinoceptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710189973 P2X purinoceptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037601 P2X purinoceptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710189967 P2X purinoceptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100037602 P2X purinoceptor 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710189965 P2X purinoceptor 7 Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 241000094374 Thomisus onustus Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- QTPILKSJIOLICA-UHFFFAOYSA-N bis[hydroxy(phosphonooxy)phosphoryl] hydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O QTPILKSJIOLICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001057 ionotropic effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037324 pain perception Effects 0.000 description 1
- 230000008058 pain sensation Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229940075993 receptor modulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the invention relates to medicine and pharmacology, in particular to biologically active peptides that modify purinergic signaling and can be used for the prevention and treatment of diseases whose pharmacological target are purinergic receptors.
- NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
- corticosteroid steroidal (corticosteroid) drugs
- antidepressants and anticonvulsants
- strong or weak opiates NSAIDs form the most prescribed class of therapeutic drugs in the world due to their high effectiveness, both in relation to the inflammatory process and in relation to pain itself. They are used for all types of inflammatory pain, both acute and chronic.
- NSAIDs are very effective, nevertheless, they remain a serious source of unwanted side effects, which limits the use of NSAIDs in numerous clinical situations.
- many types of pain remain slightly sensitive to known analgesics, therefore, the development of new analgesic agents with a new mechanism of action is an important and urgent task.
- Ionotropic purinergic receptors are ligand-controlled ion channels, the natural agonist of which is adenosine triphosphate (ATP), applied from the extracellular side. These receptors are found in various organs and tissues, of particular physiological importance is their function in the nervous system [Surprenant A., North RA Signaling at purinergic P2X receptors // Annu. Rev. Physiol., 2009, Vol. 71, p. 333-359]. They are expressed in sensitive neurons, and ATP released from damaged or inflamed tissues activates P2X receptors and initiates pain signals. Purinergic signaling is believed to play an important role in pain conditions associated with injuries, tumors, inflammation, migraines, and respiratory diseases.
- ATP adenosine triphosphate
- Selective modulators of the function of purinergic receptors which are able to modulate the work of only certain isoforms, are the basis for the creation of drugs for the treatment of diseases in the development of which these receptors participate, and are also necessary for studying the functions of purinergic receptors.
- receptor antagonists inhibitors
- P2X3 receptors receptor antagonists (inhibitors) have the greatest pharmacological potential, since it is precisely the decrease in their activity that is required for the treatment of a number of pain syndromes.
- P2X3 receptors many low molecular weight antagonists of P2X3 receptors are known, for example: 2 ', 3'-0- (2,4,6-trinitrophenyl) -ATP [Virginio C. et al. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2 / 3 receptors // Mol. Pharmacol., 1998, Vol. 53, p. 969-973], other derivatives of mono- and dinucleotides [Ford K.K. et al.
- P2X3 antagonist P1, P5-di [inosine-5 '] pentaphosphate binds to the desensitized state of the receptor in rat dorsal root ganglion neurons // J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005, Vol. 315, p. 405-413; US 6.881, 725], analogues of suramin [Hausmann R. et al.
- the suramin analog 4,4 ', 4 ", 4'” - (carbonylbis (imino-5,1 > 3-benzenetriylbis (carbonylimimino))) tetra-kis-benzenesulfonic acid (NF110) potently blocks P2X3 receptors: subtype selectivity is determined by location of sulfonic acid groups // Mol. Pharmacol., 2006, Vol. 69, p. 2058-2067], antagonist A-317491 [Jarvis MF et al. A-317491, a novel potent and selective non-nucleotide antagonist of P2X3 and P2X2 / 3 receptors, reduces chronic inflammatory and neuropathic pain in the rat // Proc.
- P2X3 receptors are also known substances of a protein nature: spinorphin, a fragment of the hemoglobin ⁇ -chain, which also affects other targets [Jung KY et al. Structure-activity relationship studies of spinorphin as a potent and selective human P2X3 receptor antagonist // J. Med. Chem., 2007, Vol. 50, p. 4543-4547], and two components of the poison of the spider Alopecosa marikovskyi - purotoxin-1 (PT1) [Grishin EV et al. Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and inflammatory pain // Ann. Neurol., 2010, Vol. 67, p.
- PT1 spider Alopecosa marikovskyi - purotoxin-1
- PT1 is the closest analogue of the claimed compounds. This peptide consists of 35 amino acid residues and selectively inhibits the activity of P2X3 receptors by stabilizing their desensitized state. Recombinant PT1 can be obtained in the bacterial expression system [Grishin EV et al. Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and inflammatory pain // Ann. Neurol., 2010, Vol. 67, p. 680-683; RU2422459; RU257194].
- the objective of the invention is to develop and obtain new effective antagonists of purinergic P2X3 receptors, promising for use in clinical practice.
- the technical result of the invention is to obtain new effective peptides that modulate the activity of P2X3 purinergic receptors, as well as having selectivity for P2X3, high stability and are promising for use in the treatment of diseases or conditions of a mammal, the pharmacological target of which are P2X3 purinergic receptors, in particular pain of various etiologies.
- an additional technical result is that the peptides according to the invention are simple in structure compared to the prototype, and can be easily obtained in the bacterial expression system, therefore, the peptides according to the invention are promising for creating drugs based on them.
- the specified technical result is achieved through the development and preparation of a peptide that modulates the activity of P2X3 purinergic receptors having the following amino acid sequence:
- the peptide modulating the activity of P2X3 purinergic receptors has the following amino acid sequence:
- the peptide modulating the activity of P2X3 purinergic receptors has the following amino acid sequence:
- the present invention also relates to the use of the subject peptides as modulators of P2X3 purinergic receptors.
- the present invention also relates to the use of the subject peptides as antagonists of P2X3 purinergic receptors.
- the present invention also relates to the use of the subject peptides for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of conditions associated with P2X3 purinergic receptors, for example, in the treatment of pain of various etiologies and / or symptoms of pain, in particular pain after inflammation, postoperative pain, visceral pain, toothache, premenstrual pain, pain caused by burns, migraine or cluster headache, pain with nerve damage, neuritis, neuralgia, pain with cancer diseases or pain associated with irritable bowel syndrome.
- the invention also includes the preparation of the peptides of the invention. These peptides can be obtained by genetic engineering or chemical synthesis.
- PT6 peptide refers to a peptide having the following amino acid sequence:
- modulate means changing the functional characteristics of P2X purinergic receptors (in particular, inhibiting, blocking, decreasing or preventing physiological effects caused by the binding of an agonist (including an endogenous agonist) to the receptor), in particular, P2X3 receptors.
- modulator means a substance capable of modulating, that is, altering the functional characteristics of P2X purinergic receptors (in particular, inhibiting, blocking, decreasing or preventing physiological effects caused by binding of an agonist (including an endogenous agonist) to the receptor), in particular P2X3 receptors.
- antagonist in biochemistry and pharmacology is meant a subtype of ligands for cell receptors.
- a ligand with receptor antagonist properties is a ligand that inhibits, blocks, reduces or prevents the physiological effects caused by the binding of an agonist (including an endogenous agonist) to the receptor.
- a “selective” antagonist is called if it inhibits a specific receptor or receptor subtype. The degree of selectivity may vary.
- homologous in the present invention is synonymous with the term “identity” and means the similarity of sequences of peptide molecules.
- identity means the similarity of sequences of peptide molecules.
- the degree of sequence identity means a comparison between amino acid sequences and is determined by comparing two optimally aligned sequences in the comparison window, while part of the amino acid sequence in the comparison window may contain inserts or deletions (i.e. spaces) compared to the control sequence (not containing insertions or deletions) to optimally align the two sequences.
- the degree of identity can be calculated by determining the number of positions at which identical amino acid residues are found in both sequences, obtaining the number of matching positions, dividing the number of matching positions by the total number of positions in the comparison window, and multiplying the result by 100, obtaining the degree of sequence identity in percent.
- Professionals should be aware that there are many established algorithms for aligning two sequences. Examples of algorithms suitable for determining the degree of sequence identity are BLAST and BLAST 2.0 [Altschul SF et al. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol., 1990, Vol. 215, p. 403-410; Altschul SF et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res., 1997, Vol. 25, p. 3389-3402].
- homologous peptides have identical or similar amino acid sequences.
- similar residues are “conservative substitutions” or “allowed point mutations” of the corresponding amino acid residues in the control sequence.
- Conservative substitutions of residues in the control sequence are those that are physically or functionally similar to the corresponding control residue, for example, have a similar size, shape, electric charge, chemical properties, including the ability to form covalent or hydrogen bonds, and the like.
- all homologous peptide sequences that are the subject of the invention have the ability to effectively modulate the activity of P2X3 receptors.
- treatment means a method of obtaining favorable or desired clinical results.
- favorable or desired clinical results include, but are not limited to, one or more of the following aspects: reducing any manifestation, in particular, pain of various etiologies, including the intensity of the pain, relieving one or more symptoms of pain, including any symptom pain, such as reducing the duration of pain and / or reducing the perception or sensation of pain, temporarily relieving and / or slowing the development of pain.
- reducing the manifestation” of pain means any means of alleviating pain (which may include reducing the need for drugs and / or reducing the number of other drugs commonly used in these conditions), reducing the duration, intensity and / or frequency of pain (including, for example , an increase in the time until the subject has pain of various etiologies).
- the term “decrease in intensity” of pain of various etiologies means the weakening or improvement of one or more symptoms of pain compared with pain that occurs without the introduction of a modulator of P2X3 receptors.
- the term “decrease in intensity” also means a decrease in the duration of the symptom.
- the term "temporary relief" of pain of various etiologies or of one or more symptoms of pain means a decrease in the degree of manifestation of one or several undesirable clinical signs of pain in one or more subjects treated with a P2X3 receptor modulator in accordance with the present invention.
- the term "slowing down" the development of pain of various etiologies means inhibiting, inhibiting, delaying, stabilizing and / or delaying the progression of pain. Such a slowdown may vary in time depending on the medical history and / or subject to be treated. As should be obvious to a person skilled in the art, a significant or significant slowdown may in fact include the prevention of pain, expressed in that the subject does not experience pain.
- the method of "slowing down" the development of a symptom is a method that reduces the likelihood of a symptom occurring in a given period of time and / or reduces the degree of symptom manifestation in a given period of time compared to a situation where this method is not applied. Such comparisons are usually based on clinical trials involving a sufficient number of subjects to obtain a statistically significant result.
- FIGURE 2 Effect of the PT6 peptide on currents mediated by P2X receptors in a culture of neurons from the ganglia of the dorsal roots of the rat spinal cord.
- the histogram shows the relative value of the residual currents (I) mediated by homogeneous P2X3, heteromeric P2X2 / 3 and homomeric P2X2 receptors when RTb is applied at a concentration of 50 nM compared to control currents in the absence of PT6 (l 0 ).
- the problem of this invention is solved by obtaining peptides according to the invention, modulating the activity of P2X3 purinergic receptors.
- the sequence of the PT6 peptide is determined by analysis of mRNA from the poisonous glands of araneomorphic spiders, namely, the indicated sequence of the PT6 peptide is determined by analysis of the codNA library of the glands of the spider Thomisus onustus.
- the peptides of the invention, and in particular the PT6 peptide are substances of a polypeptide (protein) nature and can be obtained by chemical synthesis or by genetic engineering. It was unexpectedly discovered that the claimed peptides are able to inhibit P2X3 purinergic receptors. So, in particular, the PT6 peptide at a concentration of 50 nM causes 80% inhibition of currents mediated by P2X3 receptors in rat sensory neurons. PT6 is a selective antagonist of P2X3 purinergic receptors.
- the peptide-based preparations of the invention are promising for use in the treatment of pains of various etiologies, in particular, pain with inflammation, postoperative pain, visceral pain, toothache, premenstrual pain, pain caused by burns, migraine or cluster headache, pain with nerve damage , neuritis, neuralgia, pain with cancer or pain associated with irritable bowel syndrome.
- the peptides of the invention can be used, in particular, to reduce the manifestation of pain, to reduce the intensity of pain, to temporarily relieve pain or to slow the development of pain of various etiologies.
- the peptide PT6 is characterized by an extremely stable structure.
- the amino acid sequence of the PT6 peptide is converted to its corresponding nucleotide sequence, taking into account the frequency of codon use in Escherichia coli.
- Several oligonucleotide fragments up to 50 nucleotides in length are synthesized, overlapping the entire sequence of the PT6 gene, while the terminal ones contain restriction sites for cloning into the pET-32b plasmid (Novagen, USA): f1, 5'-TTTCGGTACCGGCTATTGCGCGACCAAAGGCATTAAATGCAA-3 ',
- PCR polymerase chain reaction
- phosphorylation of the 3'-ends of the fragments is carried out using polynucleotide kinase (Promega, USA) at 37 ° C for 30 minutes
- ligation is carried out using phage T4 DNA ligase (Promega, USA) for 18 hours at 16 ° C.
- PCR is carried out according to the standard procedure on a PCR-amplifier RTS-200 (MJ Research, USA).
- the reaction mixture contains a PCR buffer solution (50 mM KCI, 1, 5 mM MgCI 2 , 0.1% Tween 20, 50 mM Tris-HCI, pH 8.6), a mixture of four deoxynucleotides (Promega, USA), primer (terminal ) oligonucleotides (5'-GGCTATTGCGCGACCA-3 'and S'-TTAGCCTTTCACGCACAC-S'), template DNA (ligase mixture) and Taq polymerase.
- PCR conditions denaturation (96 ° C) - 20 sec .; annealing (50 ° ⁇ ) - 20 sec .; elongation (72 ° C) - 30 sec., 25 cycles.
- the obtained plasmids are used to transform E. coli cells of strain XL1 Blue using the Cellject electroporator (Eurogentec, Belgium).
- the parameters of the electric pulse are set according to the recommendations of the manufacturer of the electroporator.
- the cell suspension is transferred to a Petri dish with solid LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCI, 1, 5% agar, 10 mM Tris-HCI, pH 7.6) with the addition of ampicillin (70 ⁇ g / ml) as a selective factor. Plates are incubated at 37 ° C for 18 hours.
- coli XL1 Blue colonies obtained on selective medium after transformation are scattered by streaks on a new Petri dish with solid LB medium and ampicillin (70 ⁇ g / ml).
- the plates are incubated for 18 hours at 37 ° C.
- PCR is performed with sequence-specific oligonucleotide primers (5'-GGCTATTGCGCGACCA-3 'and 5'- TTAGCCTTTCACGCACAC-3 '), total nucleic acid from the obtained cell mass is used as a matrix.
- Selected transformants are used to obtain an overnight liquid culture in 5 ml of LB liquid medium with the addition of ampicillin (70 ⁇ g / ml), the suspension is incubated for 18 h at 37 ° C.
- the preparative isolation of plasmid DNA is carried out using the Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System reagent kit (Promega, USA) in accordance with the manufacturer's procedure.
- the production of the chimeric protein is carried out using the controlled expression of the corresponding gene in E. coli cells of strain BL21 (DE3).
- Cells are pelleted by centrifugation (10 min, 4500 rpm) and resuspended in 25 ml of start affinity chromatography buffer (see below) with the addition of 1% Triton X-100.
- the destruction of cell structures is carried out using an ultrasonic disintegrator CPX 750 (Cole-Parmer Instruments, USA).
- Isolation of the fusion protein is carried out using affinity chromatography.
- the cell lysate is applied in the start buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8, 300 mM NaCI) onto a 3 ml column with TALON Superflow Metal Affinity Resin resin (Clontech, USA) at a flow rate of 1 ml / min.
- a buffer containing 50 mM Tris-HCI, pH 8, 300 mM NaCI, 150 mM imidazole is used. Detection is carried out by optical absorption of the eluate at 280 nm. The isolation and purification of the hybrid protein is controlled by electrophoresis of aliquots of the obtained fractions in a polyacrylamide gel.
- the resulting protein is subjected to desalination on a Jupiter C 4 column (10 * 250 mm, 300 A, 10 ⁇ m; Phenomenex, USA). Elution is carried out by a stepwise change in the concentration of acetonitrile (0-70%) in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) with a flow rate of 2 ml / min.
- TFA trifluoroacetic acid
- the protein is dried in a vacuum concentrator, dissolved in 50 mm Tris-HCI, pH 8, the final protein concentration is ⁇ 1 mg / ml.
- To solution protein add a solution of the catalytic subunit of human enteropeptidase at the rate of 1 unit per 1 mg of protein, hydrolysis is carried out at room temperature for 18 hours.
- the individuality of the obtained PT6 preparation is confirmed by repeated chromatography on a Vydac 218TP54 C 18 column column (4.6x250 mm, 300 A, 5 ⁇ m; Separations Group, USA) in a linear gradient of acetonitrile concentration (0-30% for 30 min) in 0.1% TFA at a flow rate of 1 ml / min ( Figure 1 B).
- the result is a recombinant PT6 yield of 5 mg with 1 L of bacterial culture.
- the structure of the recombinant peptide is confirmed by mass spectrometry and ⁇ -terminal sequencing.
- mice The peptides of the invention were tested for their ability to modulate P2X receptor activity.
- Experimental neurons are isolated from the ganglia of the dorsal roots of the spinal cord (posterior radicular ganglia) of 9-12-day-old Wistar rats.
- the ganglia are placed in a Petri dish filled with an extracellular solution (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCI 2 , 2 mM gCI 2 , 20 mM HEPES, pH 7.4) at room temperature, and then in an enzyme solution (1 mg trypsin and 2 mg of collagenase in 2 ml of extracellular solution), heated to 35 ° C, incubated for 10 minutes Then the ganglia are thoroughly washed with a clean (without enzymes) extracellular solution in another Petri dish. Single cells are isolated from the washed ganglia using thin needles. A single-cell cup is transferred to an electrophysiological setup. The experiments begin after all the cells have settled to the bottom of the plate after 30 minutes. after isolation.
- an extracellular solution 130 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCI 2 , 2 mM gCI 2 , 20 mM HEPES, pH 7.4
- an enzyme solution (1 mg tryp
- Electrophysiological testing is carried out using the classical method of local potential clamping (patch clamp) in the configuration of voltage removal from the whole cell (whole cell) using the approach of rapid application of a substance (agonist), which binds to P2X3 receptors and causes the opening of the ion channel.
- the electrophysiological installation consists of three parts: a microscope, a system for applying substances to the cell (“jumping table”; Pharma Robot, Ukraine) and registration systems for currents flowing through channels in the plasma membrane of a cell. Isolated neurons in a Petri dish are placed under a microscope with phase contrast on the setup. For the experiment, cells with a diameter of 8-12 ⁇ m are selected.
- a glass pipette electrode filled with an intracellular solution (120 mM CsF, 10 mM Tris-HCI, pH 7.2) is brought to the selected cell, as a result, a tight contact is formed between the pipette and the cell membrane with a resistance of the order of G ⁇ . Then the cell on the pipette is lifted from the bottom of the cup and placed in the application tube.
- the solutions used in the experiment are in the chambers of the bouncing table.
- solution 1 the basic extracellular solution in which the obtained cells are stored
- solution 2 the basic solution with the addition of an agonist in the required concentration
- solution 3 the basic solution with the PT6 peptide in the required concentration
- solution 4 the basic solution with agonist and peptide PT6 in the required concentrations.
- the washing procedure is carried out at least 15 times over 3 minutes. After 3 minutes after application of the agonist, the procedure is repeated. After obtaining control currents, a PT6 peptide is applied to the cell. Next, repeat the procedure for applying the agonist with PT6. After application of the agonist together with PT6, washing of the cells from the agonist is also carried out against the background of PT6.
- the sequential application of an agonist with PT6 is stopped when the amplitude of the P2X-mediated current remains unchanged.
- the ratio of the amplitude of the control current to the steady-state amplitude of the current against the background of a certain concentration of PT6 is an indicator of the effectiveness of the given concentration of PT6.
- Currents are recorded at a supported potential of -60 mV and room temperature using a model 2400 amplifier (AM Systems, USA). Electrodes for electrophysiological studies are made of borosilicate glass on a P-97 Flamming / Brown installation (Sutter Instrument, USA); their resistance is 3-5 M ⁇ .
- As an agonist cytidine triphosphate (CTF) is used in a saturating concentration (100 ⁇ M).
- a current with a fast rise phase (up to 12 ms) and a fast decline phase (up to 500 ms) corresponds to a current mediated by P2X3 receptors.
- the activation time of the receptors is 2-4 ms
- the desensitization time is 20-100 ms
- the release time of the receptors from desensitization is about 2 minutes for CTF.
- the binding of the PT6 peptide to P2X3 receptors in a desensitized state leads to a significant decrease in the current amplitude.
- PT6 leads to a decrease in the amplitude of the current mediated by P2X3 receptors by 80% ( Figure 2).
- the PT6 peptide is a modulator, namely an antagonist, of P2X3 purinergic receptors.
- the exit time from desensitization of P2X3 receptors is very long compared with P2X2 and P2X2 / 3 receptors.
- P2X2 and P2X2 / 3 receptors When applying an agonist with a period of 1 min, all the observed responses, except the first, are mediated by P2X2 and P2X2 / 3 receptors.
- the sensitivity of the P2X2 / 3 receptor to ATP and to ⁇ , ⁇ -methylene-ATP is approximately the same (Kd ⁇ 30 ⁇ M), and the minimum concentration of ⁇ , ⁇ -methylene-ATP required for activation of P2X2 receptors is at least 100 ⁇ M.
- the equivalence of ion currents observed in response to the alternate application of ATP and ⁇ , ⁇ -methylene-ATP indicates a significant predominance of P2X2 / 3 receptors in the cell membrane.
- the membrane contains mainly P2X2 receptors.
- PT6 does not affect the ionic currents mediated by P2X2 / 3 and P2X2 receptors ( Figure 2).
- the PT6 peptide acts selectively on P2X3 isoform receptors and is a selective antagonist of P2X3 purinergic receptors.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и фармакологии, а именно к биологически активным пептидам, модулирующим пуринергическую сигнализацию. Для этого предложен пептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Gly1-Tyr2-Cys3-Ala4-Thr5-Lys6-Gly7-Ile8-Lys9-Cys10-Asn11-Asp12-Ile13-His14-Cys15-Cys16-Ser17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Asp22-Ser23-Lys24-Arg25-Lys26-Val27-Cys28-Val29-Lys30Gly31, или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере, на 90%. Пептиды по изобретению могут применяться для профилактики и лечения заболеваний, развитие которых опосредовано пуринергическими рецепторами. Указанные пептиды могут быть использованы для разработки на их основе новых лекарственных средств, например, анальгетиков, а также использованы для изучения механизмов возникновения боли, для обнаружения и тестирования новых модуляторов рецептора Р2Х3. Получение пептидов по изобретению может осуществляться химическим синтезом или биотехнологически на основании нуклеотидной последовательности соответствующего гена.
Description
Пептидный модулятор пуринергических рецепторов
Область техники
Изобретение относится к медицине и фармакологии, а именно к биологически активным пептидам, которые модифицируют пуринергическую сигнализацию и могут применяться для профилактики и лечения заболеваний, фармакологической мишенью при которых являются пуринергические рецепторы.
Уровень техники
Изучение и лечение боли являются существенными аспектами улучшения качества жизни пациентов. Лечение боли основывается главным образом на назначении противовоспалительных препаратов, которые могут быть нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП) или стероидными (кортикостероидными) препаратами, антидепрессантов и антиконвульсантов, а также сильных или слабых опиатов. НПВП образуют наиболее назначаемый в мире класс терапевтических препаратов в связи с их высокой эффективностью, как в отношении воспалительного процесса, так и в отношении самой боли. Их применяют при всех типах воспалительных болей, как острых, так и хронических. Хотя НПВП являются очень эффективными средствами, тем не менее, они остаются серьезным источником нежелательных побочных эффектов, что ограничивает применение НПВП в многочисленных клинических ситуациях. Несмотря на большое количество существующих терапевтических средств, многие виды боли остаются мало чувствительными к известным анальгетикам, поэтому разработка новых анальгетических средств с новым механизмом действия является важной и актуальной задачей.
Ионотропные пуринергические рецепторы (Р2Х) являются лиганд-управляемыми ионными каналами, природным агонистом которых выступает аденозинтрифосфат (АТФ), прикладываемый с внеклеточной стороны. Эти рецепторы встречаются в различных органах и тканях, особое физиологическое значение имеет их функция в нервной системе [Surprenant A., North R.A. Signaling at purinergic P2X receptors // Annu. Rev. Physiol., 2009, Vol. 71 , p. 333-359]. Они экспрессируются в чувствительных нейронах, и АТФ, освобожденный из поврежденных или воспаленных тканей, активирует Р2Х рецепторы и инициирует болевые сигналы. Полагают, что пуринергическая сигнализация играет важную роль в болевых состояниях, связанных с травмами, опухолями, воспалением, мигренью и респираторными заболеваниями. У человека известно семь изоформ Р2Х рецепторов, среди которых изоформы Р2Х2, Р2ХЗ, Р2Х4 и Р2Х7, как полагают, участвуют в системе восприятия боли [Donnelly-Roberts D. et al. Painful purinergic receptors // J.
Pharmacol. Exp. Ther., 2008, Vol. 324, p. 409-415]. Среди семи изоформ пуринергических рецепторов Р2ХЗ представляется важным и хорошо изученным «участником» болевых состояний [Wirkner К. et al. Р2ХЗ receptor involvement in pain states // Mol. Neurobiol., 2007, Vol. 36, p. 165-183].
Селективные модуляторы функции пуринергических рецепторов, которые способны модулировать работу только определенных изоформ, являются основой для создания лекарственных препаратов для лечения заболеваний, в развитии которых принимают участие данные рецепторы, а также необходимы для изучения функций пуринергических рецепторов. В случае Р2ХЗ рецепторов наибольшим фармакологическим потенциалом обладают антагонисты (ингибиторы) рецепторов, поскольку именно снижение их активности требуется для терапии целого ряда болевых синдромов.
В настоящее время известны многие низкомолекулярные антагонисты Р2ХЗ рецепторов, например: 2',3'-0-(2,4,6-тринитрофенил)-АТФ [Virginio С. et al. Trinitrophenyl- substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1 , P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors // Mol. Pharmacol., 1998, Vol. 53, p. 969-973], другие производные моно- и динуклеотидов [Ford К.К. et al. The P2X3 antagonist P1 , P5-di[inosine-5'] pentaphosphate binds to the desensitized state of the receptor in rat dorsal root ganglion neurons // J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005, Vol. 315, p. 405-413; US 6,881 ,725], аналоги сурамина [Hausmann R. et al. The suramin analog 4,4',4",4'"-(carbonylbis(imino-5,1 >3-benzenetriylbis (carbonylimino)))tetra-kis-benzenesulfonic acid (NF110) potently blocks P2X3 receptors: subtype selectivity is determined by location of sulfonic acid groups // Mol. Pharmacol., 2006, Vol. 69, p. 2058-2067], антагонист A-317491 [Jarvis M.F. et al. A-317491 , a novel potent and selective non-nucleotide antagonist of P2X3 and P2X2/3 receptors, reduces chronic inflammatory and neuropathic pain in the rat // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2002, Vol. 99, p. 17179-17184], производные диаминопиримидина [Carter D.S. et al. Identification and SAR of novel diaminopyrimidines. Part 1: The discovery of RO-4, a dual P2X3/P2X2/3 antagonist for the treatment of pain // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, Vol. 19, p. 1628-1631 ; Jahangir A. et al. Identification and SAR of novel diaminopyrimidines. Part 2: The discovery of RO-51 , a potent and selective, dual P2X3/P2X2/3 antagonist for the treatment of pain // Bioorg. Med. Chem. Lett, 2009, Vol. 19, p. 1632-1635; US 7,589,090; US 7,531 ,547], тетразола и ариламидов [US 7,595,405], а также пиперазина и фенилтиенопиразола [Brotherton-Pleiss СЕ. Discovery and optimization of RO-85, a novel drug-like, potent, and selective P2X3 receptor antagonist // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2010, Vol. 20, p. 1031-1036; US 7,491 ,821].
Среди ингибиторов P2X3 рецепторов известны также вещества белковой природы: спинорфин, фрагмент β-цепи гемоглобина, воздействующий также на другие мишени [Jung K.Y. et al. Structure-activity relationship studies of spinorphin as a potent and
selective human P2X3 receptor antagonist // J. Med. Chem., 2007, Vol. 50, p. 4543-4547], и два компонента яда паука Alopecosa marikovskyi - пуротоксин-1 (РТ1) [Grishin E.V. et al. Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and inflammatory pain // Ann. Neurol., 2010, Vol. 67, p. 680-683; RU2422459] и пуротоксин-2 (PT2) [Kabanova N.V. et al. Modulation of P2X3 receptors by spider toxins // Biochim. Biophys. Acta, 2012, Vol. 1818, p. 2868-2875]. PT1 является наиболее близким аналогом заявляемых соединений. Этот пептид состоит из 35 аминокислотных остатков и селективно угнетает активность Р2ХЗ рецепторов за счет стабилизации их десенситизированного состояния. Рекомбинантный РТ1 может быть получен в бактериальной системе экспрессии [Grishin E.V. et al. Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and inflammatory pain // Ann. Neurol., 2010, Vol. 67, p. 680-683; RU2422459; RU257194].
Несмотря на достаточно большое количество известных соединений, способных ингибировать Р2ХЗ рецепторы, в настоящее время, тем не менее, нет ни одного препарата, действующего как модулятор Р2ХЗ, разрешенного для применения в клинической практике. В то же время, поиск новых лекарственных средств, эффективно и безопасно купирующих боль различного происхождения, является актуальной задачей современной медицины. Одним из подходов к решению данной задачи может быть создание и внедрение в клинику новых эффективных и селективных модуляторов Р2ХЗ рецепторов.
Раскрытие изобретения
Задачей данного изобретения является разработка и получение новых эффективных антагонистов пуринергических рецепторов Р2ХЗ, перспективных для применения в клинической практике.
Техническим результатом изобретения является получение новых эффективных пептидов, модулирующих активность пуринергических рецепторов Р2ХЗ, а также обладающих селективностью по отношению к Р2ХЗ, высокой стабильностью и являющихся перспективными для применения в терапии заболеваний или состояний млекопитающего, фармакологической мишенью при которых являются пуринергические рецепторы Р2ХЗ, в частности, болей различной этиологии.
Кроме того, дополнительным техническим результатом является то, что пептиды по изобретению отличаются простотой структуры по сравнению с прототипом, и могут быть легко получены в бактериальной системе экспрессии, поэтому пептиды по изобретению являются перспективными для создания на их основе лекарственных препаратов.
Указанный технический результат достигается посредством разработки и получения пептида, модулирующего активность пуринергических рецепторов Р2ХЗ, имеющего следующую аминокислотную последовательность:
Gly'-Tyr'-Cys'-Ala^Thr'-Lys^Gly^lle^Lys^Cys^-Asn^-Asp^-lle^-His^-Cys^-Cys16- Ser17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Asp22-Se^
NO:1
или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере, на 90%.
В некоторых вариантах воплощения изобретения пептид, модулирующий активность пуринергических рецепторов Р2ХЗ, имеет следующую аминокислотную последовательность:
Gly'-Ty -Cys'-Ala^Thr^Lys^Gly^lle^Lys^Cys^-Asn^-Asp^-lle^-His^-Cys^-Cys16- Ser^-Gly^-Leu^-Lys^-Cys^-Asp^-Se^-Lys^-Arg^-Lys^-Val^-Cys^-Va -Lys^-Gly31
или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере, на 95%.
Еще в одном варианте воплощения изобретения пептид, модулирующий активность пуринергических рецепторов Р2ХЗ, имеет следующую аминокислотную последовательность:
Gly -Tyi^-Cys3-Ala4-Thr5-Lys6-G^^
Ser17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys2 -Asp2^ SEQ ID
NO:1.
Настоящее изобретение также относится к применению пептидов, являющихся предметом изобретения, в качестве модуляторов пуринергических рецепторов Р2ХЗ.
Настоящее изобретение также относится к применению пептидов, являющихся предметом изобретения, в качестве антагонистов пуринергических рецепторов Р2ХЗ.
Настоящее изобретение также относится к применению пептидов, являющихся предметом изобретения, для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения состояний, ассоциированных с пуринергическими рецепторами Р2ХЗ, например, в терапии болей различной этиологии и/или симптомов боли, в частности боли при воспалении, постоперационной боли, висцеральной боли, зубной боли, предменструальный боли, болей, вызванных ожогами, мигрени или кластерной головной боли, боли при повреждении нерва, неврите, невралгии, боли при онкологических заболеваниях или боли, связанной с синдромом раздраженного кишечника.
Изобретение также включает получение пептидов, являющихся предметом изобретения. Указанные пептиды могут быть получены генно-инженерным способом или химическим синтезом.
Определение и термины
Как используется в настоящем документе, термин «пептид РТ6» относится к пептиду, имеющему следующую аминокислотную последовательность:
Gly1-Tyi^-Cys3-Ala4-Thr5-Lys6-Gly^^
Ser17-Gly18-Leu19-Lys20-^ SEQ ID NO:1.
Термин «модулировать» в настоящем документе означает изменять функциональные характеристики пуринергических рецепторов Р2Х (в частности ингибировать, блокировать, снижать или предотвращать вызываемые связыванием агониста (в том числе эндогенного агониста) с рецептором физиологические эффекты), в частности Р2ХЗ рецепторов.
Термин «модулятор» в настоящем документе означает вещество, способное модулировать, то есть изменять функциональные характеристики пуринергических рецепторов Р2Х (в частности ингибировать, блокировать, снижать или предотвращать вызываемые связыванием агониста (в том числе эндогенного агониста) с рецептором физиологические эффекты), в частности Р2ХЗ рецепторов.
Под «антагонистом» (антагонистом рецепторов) в биохимии и фармакологии подразумевается подтип лигандов к клеточным рецепторам. Лиганд, обладающий свойствами антагониста рецепторов, - это такой лиганд, который ингибирует, блокирует, снижает или предотвращает вызываемые связыванием агониста (в том числе эндогенного агониста) с рецептором физиологические эффекты.
«Селективным» антагонист называют в том случае, если он ингибирует конкретный рецептор либо подтип рецепторов. Степень селективности может различаться.
Термин «гомологичный» (или «гомологичность») в настоящем изобретении является синонимом термину «идентичность» и означает сходство последовательностей пептидных молекул. В настоящем изобретении степень идентичности последовательностей означает сравнение между аминокислотными последовательностями и определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, при этом часть аминокислотной последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (т.е. пробелы) в сравнении с контрольной последовательностью (не содержащей вставок или делеции) для оптимально выравнивания двух последовательностей. Степень идентичности можно рассчитать путем определения числа положений, по которым в обеих последовательностях находятся идентичные аминокислотные остатки, получая число совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100, получая степень идентичности последовательностей в процентах. Специалистам должно быть известно,
что существует много установленных алгоритмов для выравнивания двух последовательностей. Примерами алгоритмов, подходящих для определения степени идентичности последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol., 1990, Vol. 215, p. 403-410; Altschul S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res., 1997, Vol. 25, p. 3389-3402].
Гомологичные пептиды имеют идентичные или сходные аминокислотные последовательности. В контексте настоящего изобретения сходные остатки представляют собой «консервативные замены» или «разрешенные точечные мутации» соответствующих аминокислотных остатков в контрольной последовательности. Консервативные замены остатков в контрольной последовательности являются такими заменами, которые физически или функционально сходны с соответствующим контрольным остатком, например, имеют сходный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность к образованию ковалентных или водородных связей, и т.п. Для специалиста в данной области техники очевидно, что все гомологичные пептидные последовательности, являющиеся предметом изобретения, обладают способностью эффективно модулировать активность Р2ХЗ рецепторов.
В используемом здесь значении термин «лечение» означает способ получения благоприятных или желаемых клинических результатов. В соответствии с целями настоящего изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают, не ограничиваясь ими, один или несколько нижеследующих аспектов: уменьшение любого проявления, в частности, болей различной этиологии, в том числе интенсивности боли, ослабление одного или нескольких симптомов боли, включая любой признак боли, такой как сокращение продолжительности боли и/или уменьшение восприятия или ощущения боли, временное облегчение и/или замедление развития боли.
Термин «уменьшение проявления» боли означает любые способы ослабления боли (которые могут включать уменьшение потребности в лекарственных средствах и/или сокращение количества других лекарственных средств, обычно применяемых в данных условиях), уменьшения продолжительности, интенсивности и/или частоты возникновения боли (включая, например, увеличение времени до появления у субъекта боли различной этиологии).
Термин «уменьшение интенсивности» боли различной этиологии означает ослабление или улучшение одного или нескольких симптомов боли по сравнению с болью, имеющей место без введения модулятора рецепторов Р2ХЗ. Термин «уменьшение интенсивности» означает также уменьшение продолжительности симптома.
Термин «временное облегчение» боли различной этиологии или одного или нескольких симптомов боли означает уменьшение степени проявления одного или
нескольких нежелательных клинических признаков боли у одного или нескольких субъектов, подвергаемых лечению модулятором рецепторов Р2ХЗ в соответствии с настоящим изобретением.
В используемом здесь значении термин «замедление» развития боли различной этиологии, означает торможение, препятствование, задержку, стабилизацию и/или отсрочку прогрессирования боли. Подобное замедление может быть различным по времени в зависимости от истории болезни и/или субъекта, подлежащего лечению. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, существенное или значительное замедление может в действительности включать предотвращение боли, выражающееся в том, что у субъекта не возникает боль. Способ «замедления» развития симптома является способом, который уменьшает вероятность возникновения симптома в данный период времени и/или уменьшает степень проявления симптома в данный период времени по сравнению с ситуацией, когда данный способ не применяется. Такие сравнения обычно основаны на клинических исследованиях с участием числа субъектов, достаточного для получения статистически значимого результата.
Описание чертежей
Рисунок 1. Получение рекомбинантного пептида РТ6:
(А) Разделение продуктов гидролиза гибридного белка энтеропептидазой на колонке Jupiter С4 (10x250 мм). Отмечена фракция, соответствующая РТ6 (*).
(Б) Повторная хроматография выделенного РТ6 на колонке Vydac С18 (4,6x250 м).
РИСУНОК 2. Влияние пептида РТ6 на токи, опосредованные Р2Х рецепторами в культуре нейронов из ганглиев дорсальных корешков спинного мозга крыс. Гистограмма показывает относительную величину остаточных токов (I), опосредованных гомомерными Р2ХЗ, гетеромерными Р2Х2/3 и гомомерными Р2Х2 рецепторами, при приложении РТб в концентрации 50 нМ по сравнению с контрольными токами в отсутствии РТ6 (l0).
Подробное раскрытие изобретения
Поставленная задача данного изобретения решается за счет получения пептидов по изобретению, модулирующих активность пуринергических рецепторов Р2ХЗ. Так, в частности, последовательность пептида РТ6 определена посредством анализа мРНК из ядовитых желез аранеоморфных пауков, а именно, указанная последовательность пептида РТ6 определена посредством анализа библиотеки кДНК желез паука Thomisus onustus. Пептиды по изобретению, и в частности пептид РТ6, являются веществами полипептидной (белковой) природы и могут быть получены химическим синтезом или генно-инженерным способом.
Неожиданно было обнаружено, что заявляемые пептиды способны ингибировать пуринергические рецепторы Р2ХЗ. Так, в частности, пептид РТ6 в концентрации 50 нМ вызывает 80%-е ингибирование токов, опосредованных Р2ХЗ рецепторами в сенсорных нейронах крыс. РТ6 является селективным антагонистом пуринергических рецепторов Р2ХЗ.
Препараты на основе пептидов по изобретению являются перспективными для применения в терапии болей различной этиологии, в частности, боли при воспалении, постоперационной боли, висцеральной боли, зубной боли, предменструальный боли, болей, вызванных ожогами, мигрени или кластерной головной боли, боли при повреждении нерва, неврите, невралгии, боли при онкологических заболеваниях или боли, связанной с синдромом раздраженного кишечника. Пептиды по изобретению могут применяться, в частности, для уменьшения проявления боли, для уменьшения интенсивности боли, для временного облегчения боли или для замедления развития боли различной этиологии.
Кроме того, пептид РТ6 характеризуется чрезвычайно стабильной структурой
(содержит мотив так называемого «цистинового узла»), легко может быть получен в бактериальной системе экспрессии и отличается простотой структуры по сравнению с прототипом (пептид РТ1 , RU2422459): он короче на четыре остатка и содержит на одну дисульфидную связь меньше, нежели пептид РТ1 , РТ6 содержит шесть остатков цистеина, образующих три внутримолекулярные дисульфидные связи. Это служит основанием для предположения высокого потенциала РТ6 с точки зрения создания лекарственных препаратов.
Осуществление изобретения
Возможность объективного достижения технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера. Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.
Получение реко бинантного пептида РТ6
Аминокислотную последовательность пептида РТ6 преобразуют в соответствующую ей нуклеотидную последовательность с учетом частоты использования кодонов у Escherichia coli. Синтезируют несколько олигонуклеотидных фрагментов длиной до 50 нуклеотидов, перекрывающие полную последовательность гена РТ6, при этом концевые из них содержат сайты рестрикции для клонирования в плазмиду рЕТ-32Ь (Novagen, США):
f1 , 5'-TTTCGGTACCGGCTATTGCGCGACCAAAGGCATTAAATGCAA-3',
f2, 5'-CGATATTCATTGCTGCAGCGGCCTGAAATGCGATAGCAAACGCAAAGTGT-3', r1 , 5'-CTGCAGCAATGAATATCGTTGCATTTAATGCCTTTG-3',
r2, 5'-ATACGGATCCTTAGCCTTTCACGCACACTTTGCGTTTGCTAT-3,.
Синтез полноразмерной последовательности гена, кодирующего пептид РТ6, осуществляют с помощью методов лигирования олигонуклеотидов друг с другом и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого проводят фосфорилирование З'-концов фрагментов с помощью полинуклеотидкиназы (Promega, США) при 37°С в течение 30 мин, лигирование осуществляют с использованием ДНК-лигазы фага Т4 (Promega, США) в течение 18 ч при 16°С. ПЦР проводят по стандартной процедуре на ПЦР- амплификаторе РТС-200 (MJ Research, США). Реакционная смесь содержит буферный раствор для ПЦР (50 мМ KCI, 1 ,5 мМ MgCI2, 0,1% Твин 20, 50 мМ Трис-HCI, рН 8,6), смесь четырех дезоксинуклеотидов (Promega, США), праймерные (концевые) олигонуклеотиды (5'-GGCTATTGCGCGACCA-3' и S'-TTAGCCTTTCACGCACAC-S'), матричную ДНК (лигазную смесь) и Taq-полимеразу. Условия ПЦР: денатурация (96°С) - 20 сек.; отжиг (50°С) - 20 сек.; элонгация (72°С) - 30 сек., 25 циклов. Затем проводят рестрикцию ПЦР- продукта и плазмиды рЕТ-32Ь в буфере MultiCore, оптимальном для работы ферментов SamHI и Крп\ (Promega, США). В качестве контроля проводят рестрикцию плазмиды каждым из ферментов по отдельности, результат оценивают по изменению подвижности вектора при электрофорезе в агарозном геле. Очистку рестрицированных фрагментов ДНК и вектора проводят с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим выделением ДНК из геля с использованием набора реактивов Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США) в соответствии с методикой фирмы-производителя. Синтетический ген РТ6 и вектор рЕТ-32Ь лигируют друг с другом с помощью ДНК-лигазы фага Т4. В результате получают плазмиду, кодирующую химеру белка тиоредоксина с РТ6 под контролем Т7 промотора.
Полученные плазмиды используют для трансформации клеток Е. coli штамма XL1 Blue с помощью электропоратора Cellject (Eurogentec, Бельгия). Параметры электроимпульса выставляют согласно рекомендациям фирмы-производителя электропоратора. Суспензию клеток переносят на чашку Петри с твердой средой LB (1% бактотриптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCI, 1 ,5% агара, 10 мМ Трис-HCI, рН 7,6) с добавлением ампициллина (70 мкг/мл) в качестве селективного фактора. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 ч. Колонии Е. coli XL1 Blue, полученные на селективной среде после проведения трансформации, рассеивают штрихами на новой чашке Петри с твердой средой LB и ампициллином (70 мкг/мл). Чашки инкубируют 18 ч при 37°С. Проводят ПЦР со специфичными к интересующей последовательности олигонуклеотидными праймерами (5'-GGCTATTGCGCGACCA-3' и 5'-
TTAGCCTTTCACGCACAC-3'), в качестве матрицы используют тотальную нуклеиновую кислоту из полученной клеточной массы. Отобранные трансформанты используют для получения ночной жидкой культуры в 5 мл жидкой среды LB с добавлением ампициллина (70 мкг/мл), суспензию инкубируют 18 ч при 37°С. Процедуру препаративного выделения плазмидной ДНК проводят с использованием набора реактивов Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, США) в соответствии с методикой фирмы- производителя.
Правильность сборки и лигирования проверяют секвенированием по методу Сэнгера на приборе Model 373 DNA Sequencer (Applied Biosystems, США) с использованием реактивов ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction kit, ДНК-полимеразы AmpliTaq DNA polymerase, FS (Perkin Elmer, США) и праймера pET- HindSeq (5'-CTTCCTTTCGGGCTTTG-3') в соответствии с рекомендациями указанных производителей.
Наработку химерного белка проводят с помощью контролируемой экспрессии соответствующего гена в клетках Е. coli штамма BL21 (DE3). Ночную культуру клеток, трансформированных экспрессионным вектором рЕТ-32Ь, содержащим вставку гена РТ6, разбавляют в 200 раз жидкой питательной средой LB с ампициллином (100 мкг/мл). Клетки инкубируют при 37°С и перемешивании (200 об/мин) до достижения оптической плотности OD62o = 0,6, после чего к культуре добавляют индуктор (изопропил- -0-1- тиогалактопиранозид, ИПТГ; 0,2 мМ) и инкубируют при комнатной температуре в течение 18 ч.
Клетки осаждают центрифугированием (10 мин, 4500 об/мин) и ресуспендируют в 25 мл стартового буфера для аффинной хроматографии (см. ниже) с добавлением 1 % Тритона Х-100. Разрушение клеточных структур проводят с использованием ультразвукового дезинтегратора СРХ 750 (Cole-Parmer Instruments, США). Выделение гибридного белка проводят с помощью аффинной хроматографии. Клеточный лизат наносят в стартовом буфере (50 мМ Трис-HCI, рН 8, 300 мМ NaCI) на колонку объемом 3 мл со смолой TALON Superflow Metal Affinity Resin (Clontech, США) со скоростью потока 1 мл/мин. Для элюции целевого белка используют буфер, содержащий 50 мМ Трис-HCI, рН 8, 300 мМ NaCI, 150 мМ имидазол. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению элюата при 280 нм. Контроль за выделением и очисткой гибридного белка ведут с помощью электрофореза аликвот получаемых фракций в полиакриламидном геле.
Полученный белок подвергают обессоливанию на колонке Jupiter С4 (10*250 мм, 300 А, 10 мкм; Phenomenex, США). Элюцию осуществляют ступенчатым изменением концентрации ацетонитрила (0-70%) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (ТФУ) со скоростью потока 2 мл/мин. Белок высушивают на вакуумном концентраторе, растворяют в 50 мМ Трис-HCI, рН 8, конечная концентрация белка составляет ~1 мг/мл. К раствору
белка добавляют раствор каталитической субъединицы энтеропептидазы человека из расчета 1 ед. на 1 мг белка, гидролиз проводят при комнатной температуре в течение 18 ч. Разделение продуктов гидролиза гибридного белка проводят на колонке Jupiter С4 (250x10 мм, 300 А, 10 мкм; P enomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (0-24% за 24 мин, 23-60% за 1 мин) в 0, %-ной ТФУ при скорости потока 2 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению элюата при 210 нм (рисунок 1А). Индивидуальность полученного препарата РТ6 подтверждают повторной хроматографией на колонке Vydac 218ТР54 С18 column (4,6x250 мм, 300 А, 5 мкм; Separations Group, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (0-30% за 30 мин) в 0,1%-ной ТФУ при скорости потока 1 мл/мин (рисунок 1 Б). В результате получают выход рекомбинантного РТ6 5 мг с 1 л бактериальной культуры. Структуру рекомбинантного пептида подтверждают при помощи масс-спектрометрии и Ν-концевого секвенирования.
Для специалиста в данной области техники понятно, что все пептиды, являющиеся предметом изобретения и имеющие последовательность, гомологичную последовательности пептида РТ6, по меньшей мере, на 90%, в частности, на 95%, могут быть получены аналогичным способом.
Исследование активности РТ6 в отношении Р2Х рецепторов
Пептиды по изобретению исследовались на способность модулировать активность Р2Х рецепторов. Нейроны для экспериментов выделяют из ганглиев дорсальных корешков спинного мозга (заднекорешковых ганглиев) 9-12-тидневных крыс линии Wistar. Ганглии помещают в чашку Петри, наполненную внеклеточным раствором (130 мМ NaCI, 5 мМ KCI, 2 мМ CaCI2, 2 мМ gCI2, 20 мМ HEPES, рН 7,4) комнатной температуры, а затем - в раствор ферментов (1 мг трипсина и 2 мг коллагеназы в 2 мл внеклеточного раствора), нагретый до 35°С, инкубируют в течение 10 мин. Затем ганглии тщательно промывают чистым (без ферментов) внеклеточным раствором в другой чашке Петри. Из промытых ганглиев выделяют одиночные клетки с помощью тонких игл. Чашка с одиночными клетками переносится в электрофизиологическую установку. Эксперименты начинают после того, как все клетки осядут на дно чашки через 30 мин. после выделения.
Электрофизиологическое тестирование проводится с использованием классического метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) в конфигурации отведения напряжения от целой клетки (whole cell) с применением подхода быстрого приложения вещества (агониста), которое связывается с Р2ХЗ рецепторами и вызывает открытие ионного канала. Электрофизиологическая установка состоит из трех частей: микроскопа, системы приложения веществ на клетку («прыгающий столик»; Pharma
Robot, Украина) и системы регистрации токов, протекающих через каналы в плазматической мембране клетки. Выделенные нейроны в чашке Петри располагают под микроскопом с фазовым контрастом на установке. Для эксперимента выбирают клетки диаметром 8-12 мкм. К выбранной клетке подводят стеклянную пипетку-электрод, заполненный внутриклеточным раствором (120 мМ CsF, 10 мМ Трис-HCI, рН 7,2), в результате формируется плотный контакт между пипеткой и клеточной мембраной с сопротивлением порядка ГОм. Затем клетку на пипетке поднимают со дна чашки и помещают в аппликационную трубку. Растворы, используемые в эксперименте, находятся в камерах прыгающего столика. В опыте используются четыре типа растворов: раствор 1 - базовый внеклеточный раствор, в котором хранятся полученные клетки, раствор 2 - базовый раствор с добавлением агониста в необходимой концентрации, раствор 3 - базовый раствор с пептидом РТ6 в необходимой концентрации, раствор 4 - базовый раствор с агонистом и пептидом РТ6 в необходимых концентрациях. Процедуру отмывки проводят не менее 15 раз на протяжении 3 мин. Через 3 мин. после приложения агониста процедуру повторяют. После получения контрольных токов к клетке прикладывают пептид РТ6. Далее повторяют процедуру прикладывания агониста вместе с РТ6. После прикладывания агониста вместе с РТ6 отмывку клетки от агониста также проводят на фоне РТ6. Последовательное приложение агониста с РТ6 прекращают, когда амплитуда Р2Х-опосредованого тока остается неизменной. Отношение амплитуды контрольного тока к установившейся амплитуде тока на фоне определенной концентрации РТ6 является показателем эффективности действия данной концентрации РТ6. Токи регистрируют при поддерживаемом потенциале -60 мВ и комнатной температуре с помощью усилителя модели 2400 (А-М Systems, США). Электроды для электрофизиологических исследований изготовляют из боросиликатного стекла на установке Р-97 Flamming/Brown (Sutter Instrument, США), их сопротивление составляет 3-5 МОм. В качестве агониста используют цитидинтрифосфат (ЦТФ) в насыщающей концентрации (100 мкМ). Ток с быстрой фазой нарастания (до 12 мсек) и быстрой фазой спада (до 500 мсек) соответствует току, опосредованному Р2ХЗ рецепторами. Время активации рецепторов составляет 2-4 мсек, время десенситизации - 20-100 мсек, а время выхода рецепторов из десенситизации - порядка 2 мин для ЦТФ.
В результате проведенного эксперимента неожиданно обнаружено, что связывание пептида РТ6 с Р2ХЗ рецепторами в десенситизированном состоянии приводит к значительному уменьшению амплитуды тока. В концентрации 50 нМ РТ6 приводит к уменьшению амплитуды тока, опосредованного Р2ХЗ рецепторами, на 80% (рисунок 2). Таким образом, пептид РТ6 является модулятором, а именно антагонистом, пуринергических рецепторов Р2ХЗ.
В мембранах нейронов ганглиев дорсальных корешков спинного мозга кроме Р2ХЗ рецепторов присутствуют также Р2Х2 и Р2Х2/3 рецепторы [Burgard Е.С. et al. Р2Х receptor-mediated ionic currents in dorsal root ganglion neurons // J. Neurophysiol., 1999, V. 82, P. 1590-1598]. Время выхода из десенситизации Р2ХЗ рецепторов очень велико по сравнению с Р2Х2 и Р2Х2/3 рецепторами. При приложении агониста с периодом в 1 мин все наблюдаемые ответы, кроме первого, опосредованы Р2Х2 и Р2Х2/3 рецепторами. Чувствительность Р2Х2/3 рецептора к АТФ и к α,β-метилен-АТФ приблизительно одинакова (Kd ~30 мкМ), а минимальная концентрация α,β-метилен-АТФ, необходимая для активации Р2Х2 рецепторов, составляет не менее 100 мкМ. Эквивалентность ионных токов, наблюдаемых в ответ на поочередное приложение АТФ и α,β-метилен-АТФ, свидетельствует о значительном преобладании Р2Х2/3 рецепторов в мембране клетки. В клетках, которые генерируют ионные токи разной амплитуды, большей - в ответ на приложение АТФ и очень малой - в ответ на приложение α,β-метилен-АТФ, мембрана содержит в основном Р2Х2 рецепторы. В результате эксперимента было обнаружено, что РТ6 не влияет на ионные токи, опосредованные Р2Х2/3 и Р2Х2 рецепторами (рисунок 2). Таким образом, неожиданно было установлено, что пептид РТ6 действует селективно на рецепторы изоформы Р2ХЗ и является селективным антагонистом пуринергических рецепторов Р2ХЗ. Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Claims
1. Пептид, модулирующий активность пуринергических рецепторов Р2ХЗ, имеющий следующую аминокислотную последовательность:
Gly1-Ty^-Cys3-Ala -Thr5-Lys6-G^
Ser17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Asp^
или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере, на 90%.
2. Пептид по п.1 , характеризующийся тем, что имеет последовательность, гомологичную, по меньшей мере, на 95% последовательности:
Gly1-Tyi^-Cys3-Ala4-Thr ys6-Gly7-lle8-^
Ser17-Gly18-Leu19-Lys20-Cy^
3. Пептид по п.1 , характеризующийся тем, что имеет следующую аминокислотную последовательность:
Gly1-Tyi^-Cys3-Ala4-Thr5-Lys6-Gly7^
Ser17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Asp^
4. Применение пептида по любому из п. п.1-3 в качестве модулятора пуринергических рецепторов Р2ХЗ.
5. Применение по п.4, в котором модулятор представляет собой антагонист пуринергических рецепторов Р2ХЗ.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16/466,885 US10981958B2 (en) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | Peptide modulator of purinergic receptors |
| JP2019531251A JP6870091B2 (ja) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | プリン受容体のペプチドモジュレータ |
| KR1020197019434A KR102237590B1 (ko) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | 퓨린성 수용체의 펩티드 조절자 |
| EA201991365A EA037272B1 (ru) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | Пептидный модулятор пуринергических рецепторов |
| CA3045790A CA3045790C (en) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | Peptide modulator of purinergic receptors |
| EP17877931.0A EP3584254A4 (en) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | PEPTIDE MODULATOR OF PURINERGIC RECEPTORS |
| AU2017371488A AU2017371488B2 (en) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | Peptide modulator of purinoceptors |
| CN201780076067.5A CN110062763B (zh) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | 嘌呤能受体的肽调节剂 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147736 | 2016-12-06 | ||
| RU2016147736A RU2650780C1 (ru) | 2016-12-06 | 2016-12-06 | Пептидный модулятор пуринергических рецепторов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018106142A1 true WO2018106142A1 (ru) | 2018-06-14 |
Family
ID=61976543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2017/000279 WO2018106142A1 (ru) | 2016-12-06 | 2017-05-31 | Пептидный модулятор пуринергических рецепторов |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10981958B2 (ru) |
| EP (1) | EP3584254A4 (ru) |
| JP (1) | JP6870091B2 (ru) |
| KR (1) | KR102237590B1 (ru) |
| CN (1) | CN110062763B (ru) |
| AU (1) | AU2017371488B2 (ru) |
| CA (1) | CA3045790C (ru) |
| EA (1) | EA037272B1 (ru) |
| RU (1) | RU2650780C1 (ru) |
| WO (1) | WO2018106142A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2714114C1 (ru) * | 2019-08-30 | 2020-02-11 | Общество с ограниченной ответственностью «Анальгетики будущего» | Способ получения пептида, модулирующего активность пуринергических рецепторов |
| CN113151128B (zh) * | 2021-03-11 | 2022-04-05 | 厦门宝太生物科技股份有限公司 | 一种用于新型冠状病毒n蛋白表达的大肠杆菌表达培养基 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6881725B2 (en) | 2002-02-01 | 2005-04-19 | Inspire Pharmaceuticals Inc. | Method for treating pain |
| US7491821B2 (en) | 2005-08-15 | 2009-02-17 | Roche Palo Alto Llc | Inhibitors of P2X3 |
| US7531547B2 (en) | 2005-09-01 | 2009-05-12 | Roche Palo Alto Llc | Diaminopyrimidines as P2X3 and P2X2/3 modulators |
| US7589090B2 (en) | 2007-02-28 | 2009-09-15 | Roche Palo Alto Llc | Diaminopyrimidines as P2X3 and P2X2/3 modulators |
| US7595405B2 (en) | 2006-06-29 | 2009-09-29 | Roche Palo Alto Llc | Tetrazole-substituted arylamides as P2X3 and P2X2/3 antagonists |
| RU2422459C1 (ru) | 2010-06-01 | 2011-06-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | Пептидный модулятор пуринергических рецепторов |
| RU2571942C2 (ru) * | 2013-11-14 | 2015-12-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Способ получения рекомбинантного анальгетического пептида |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2624379A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Merck & Co., Inc. | Nucleic acids encoding a functional mammalian purinoreceptor, p2x3, methods of production and use thereof |
| KR101698153B1 (ko) * | 2010-04-26 | 2017-01-23 | 광주과학기술원 | Ｐ2ｘ1 및 ｐ2ｘ3 수용체 길항제로 사용되는 신규한 피리딘 카르복실산계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물 |
-
2016
- 2016-12-06 RU RU2016147736A patent/RU2650780C1/ru active
-
2017
- 2017-05-31 US US16/466,885 patent/US10981958B2/en active Active
- 2017-05-31 CN CN201780076067.5A patent/CN110062763B/zh active Active
- 2017-05-31 EA EA201991365A patent/EA037272B1/ru unknown
- 2017-05-31 AU AU2017371488A patent/AU2017371488B2/en active Active
- 2017-05-31 WO PCT/RU2017/000279 patent/WO2018106142A1/ru unknown
- 2017-05-31 EP EP17877931.0A patent/EP3584254A4/en active Pending
- 2017-05-31 CA CA3045790A patent/CA3045790C/en active Active
- 2017-05-31 KR KR1020197019434A patent/KR102237590B1/ko active IP Right Grant
- 2017-05-31 JP JP2019531251A patent/JP6870091B2/ja active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6881725B2 (en) | 2002-02-01 | 2005-04-19 | Inspire Pharmaceuticals Inc. | Method for treating pain |
| US7491821B2 (en) | 2005-08-15 | 2009-02-17 | Roche Palo Alto Llc | Inhibitors of P2X3 |
| US7531547B2 (en) | 2005-09-01 | 2009-05-12 | Roche Palo Alto Llc | Diaminopyrimidines as P2X3 and P2X2/3 modulators |
| US7595405B2 (en) | 2006-06-29 | 2009-09-29 | Roche Palo Alto Llc | Tetrazole-substituted arylamides as P2X3 and P2X2/3 antagonists |
| US7589090B2 (en) | 2007-02-28 | 2009-09-15 | Roche Palo Alto Llc | Diaminopyrimidines as P2X3 and P2X2/3 modulators |
| RU2422459C1 (ru) | 2010-06-01 | 2011-06-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | Пептидный модулятор пуринергических рецепторов |
| RU2571942C2 (ru) * | 2013-11-14 | 2015-12-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Способ получения рекомбинантного анальгетического пептида |
Non-Patent Citations (18)
| Title |
|---|
| ALTSCHUL S.F. ET AL.: "Basic local alignment search tool", J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410, XP002949123, DOI: doi:10.1006/jmbi.1990.9999 |
| ALTSCHUL S.F. ET AL.: "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402, XP002905950, DOI: doi:10.1093/nar/25.17.3389 |
| BROTHERTON-PLEISS C.E.: "Discovery and optimization of RO-85, a novel drug-like, potent, and selective P2X3 receptor antagonist", BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 20, 2010, pages 1031 - 1036, XP026861861 |
| BURGARD E.C. ET AL.: "P2X receptor-mediated ionic currents in dorsal root ganglion neurons", J. NEUROPHYSIOL., vol. 82, 1999, pages 1590 - 1598 |
| CARTER D.S. ET AL.: "Identification and SAR of novel diaminopyrimidines. Part 1: The discovery of RO-4, a dual P2X3/P2X2/3 antagonist for the treatment of pain", BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 19, 2009, pages 1628 - 1631, XP026005841, DOI: doi:10.1016/j.bmcl.2009.02.003 |
| DONNELLY-ROBERTS D. ET AL.: "Painful purinergic receptors", J. PHARMACOL. EXP. THER., vol. 324, 2008, pages 409 - 415 |
| FORD K.K. ET AL.: "The P2X3 antagonist P1, P5-di[inosine-5'] pentaphosphate binds to the desensitized state of the receptor in rat dorsal root ganglion neurons", J. PHARMACOL. EXP. THER., vol. 315, 2005, pages 405 - 413 |
| GRISHIN E.V. ET AL.: "Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and inflammatory pain", ANN. NEUROL., vol. 67, 2010, pages 680 - 683, XP055510237, DOI: doi:10.1002/ana.21949 |
| GRISHIN E.V. ET AL.: "Novel Peptide from Spider Venom Inhibits P2X3 Receptors and Inflammatory Pain", ANNALS OF NEUROLOGY, vol. 67, no. 5, 2010, pages 680 - 683, XP055510237 * |
| HAUSMANN R. ET AL.: "The suramin analog 4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis (carbonylimino)))tetra-kis-benzenesulfonic acid (NF110) potently blocks P2X3 receptors: subtype selectivity is determined by location of sulfonic acid groups", MOL. PHARMACOL., vol. 69, 2006, pages 2058 - 2067 |
| JAHANGIR A. ET AL.: "Identification and SAR of novel diaminopyrimidines. Part 2: The discovery of RO-51, a potent and selective, dual P2X3/P2X2/3 antagonist for the treatment of pain", BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 19, 2009, pages 1632 - 1635, XP026005842, DOI: doi:10.1016/j.bmcl.2009.01.097 |
| JARVIS M.F. ET AL.: "A-317491, a novel potent and selective non-nucleotide antagonist of P2X3 and P2X2/3 receptors, reduces chronic inflammatory and neuropathic pain in the rat", PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A., vol. 99, 2002, pages 17179 - 17184, XP008113908, DOI: doi:10.1073/pnas.252537299 |
| JUNG K.Y. ET AL.: "Structure-activity relationship studies of spinorphin as a potent and selective human P2X3 receptor antagonist", J. MED. CHEM., vol. 50, 2007, pages 4543 - 4547 |
| KABANOVA N.V. ET AL.: "Modulation of P2X3 receptors by spider toxins", BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1818, 2012, pages 2868 - 2875 |
| See also references of EP3584254A4 |
| SURPRENANT A.NORTH R.A.: "Signaling at purinergic P2X receptors", ANNU. REV. PHYSIOL., vol. 71, 2009, pages 333 - 359 |
| VIRGINIO C. ET AL.: "Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors", MOL. PHARMACOL., vol. 53, 1998, pages 969 - 973, XP002919965 |
| WIRKNER K. ET AL.: "P2X3 receptor involvement in pain states", MOL. NEUROBIOL., vol. 36, 2007, pages 165 - 183, XP055478666, DOI: doi:10.1007/s12035-007-0033-y |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US10981958B2 (en) | 2021-04-20 |
| CA3045790C (en) | 2021-08-10 |
| CN110062763B (zh) | 2022-11-15 |
| JP6870091B2 (ja) | 2021-05-12 |
| EP3584254A1 (en) | 2019-12-25 |
| JP2020504098A (ja) | 2020-02-06 |
| CN110062763A (zh) | 2019-07-26 |
| EA037272B1 (ru) | 2021-03-02 |
| EA201991365A1 (ru) | 2019-11-29 |
| AU2017371488A1 (en) | 2019-07-18 |
| EP3584254A4 (en) | 2020-07-15 |
| CA3045790A1 (en) | 2018-06-14 |
| KR20190090849A (ko) | 2019-08-02 |
| AU2017371488B2 (en) | 2020-10-29 |
| US20200207815A1 (en) | 2020-07-02 |
| RU2650780C1 (ru) | 2018-04-17 |
| KR102237590B1 (ko) | 2021-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6426217B2 (ja) | 核タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド | |
| JP6203215B2 (ja) | プロミニン−１ペプチド断片およびその使用 | |
| US20150050354A1 (en) | Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions | |
| JP2015518705A (ja) | ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド | |
| JP2015516143A6 (ja) | ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド | |
| RU2650780C1 (ru) | Пептидный модулятор пуринергических рецепторов | |
| RU2422459C1 (ru) | Пептидный модулятор пуринергических рецепторов | |
| JP2023544141A (ja) | ＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列ならびにその組成物を使用した神経系疾患を処置する方法 | |
| Zhang et al. | Purification, characterization and cDNA cloning of an analgesic peptide from the Chinese scorpion Buthus martensii Karsch (BmK AGP-SYPU2) | |
| ES2700531T3 (es) | Fosforilación del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr-248 y/o Thr-250 como diana terapéutica en procesos patológicos asociados a poliploidía somática | |
| RU2521657C1 (ru) | Анальгетический пептид из морской анемоны urticina grebelnyi | |
| US7662620B2 (en) | Human and mammalian stem cell-derived neuron survival factors | |
| AU2002245934B2 (en) | Alpha conotoxin peptides with analgesic properties | |
| EP1503758A1 (en) | Methods of modulating smooth muscle contractility | |
| JP2000166572A (ja) | 神経伝導抑制作用を有するペプチド | |
| WO2015035364A1 (en) | Proteins for targeting neuronal nitric oxide synthase to muscle sarcolemma and related methods of use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 17877931 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 3045790 Country of ref document: CA |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2019531251 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 20197019434 Country of ref document: KR Kind code of ref document: A |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2017371488 Country of ref document: AU Date of ref document: 20170531 Kind code of ref document: A |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2017877931 Country of ref document: EP Effective date: 20190708 |