ES2700531T3 - Fosforilación del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr-248 y/o Thr-250 como diana terapéutica en procesos patológicos asociados a poliploidía somática - Google Patents

Fosforilación del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr-248 y/o Thr-250 como diana terapéutica en procesos patológicos asociados a poliploidía somática Download PDF

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Abstract

El objeto de la invención se basa en la inhibición de la fosforilación específica del factor de transcripción E2F4 humano en sus Thr-248 y/o Thr-250 para inhibir procesos de endoreduplicación somática en células postmitóticas que pueden estar asociados con diversas situaciones patológicas. La invención cubre cualquier método de inhibición específica de la fosforilación proteica conocido en la actualidad (incluido la expresión de formas mutantes de E2F4 carentes de los residuos Thr fosforilados por p38

Description

DESCRIPCIÓN
Fosforilación del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr-248 y/o Thr-250 como diana terapéutica en procesos patológicos asociados a poliploidía somática
Campodela técnica
La presente invención pertenece al sector farmacéutico, en concreto se refiere a la identificación de dianas moleculares para el desarrollo de herramientas terapéuticas.
Estadodela técnicaanterior
Es conocida la asociación existente entre la reactivación del ciclo celular en células postmitóticas, con la consiguiente síntesis de ADN de novo, y diversos procesos patológicos que afectan tanto a neuronas (neurodegeneración, isquemia, etc.) como a miocitos (cardiomiopatía hipertrófica, patologías vasculares asociadas a la hipertensión y envejecimiento). En muchos casos, la reactivación del ciclo celular no supone la división celular sino que forma parte de un mecanismo de endorreduplicación (Ullah et al., 2009) que se traduce en la generación de poliploidía somática (poliploidía que afecta únicamente a ciertos tipos celulares y no se transmite de generación en generación). Quizá un ejemplo de patología asociada a la poliploidía somática sea la enfermedad de Alzheimer (EA). En esta enfermedad, se sabe que las neuronas reactivan el ciclo celular antes de degenerar (Yang et al., 2003), incrementando el contenido de ADN nuclear (Arendt et al., 2010). Es previsible que estas neuronas experimenten modificaciones morfológicas y funcionales que comprometan su supervivencia (Frade y López-Sánchez, 2010). De hecho, se ha descrito que las neuronas hiperploides son las que degeneran predominantemente en el cerebro de pacientes con EA (Arendt et al., 2010). El tejido muscular cardíaco contiene también un porcentaje de miocitos poliploides, cuya proporción puede verse alterada en situaciones patológicas (Yabe y Abe, 1980; Vliegen et al., 1995). El músculo liso vascular también puede sufrir alteraciones asociadas con la poliploidía (McCrann et al. 2008). Es por ello que el conocimiento de la base molecular implicada en la endorreduplicación facilitará el diseño de herramientas terapéuticas que prevengan las patologías asociadas a la poliploidización somática. Hasta la fecha no se han desarrollado herramientas terapéuticas dirigidas a prevenir la endorreduplicación somática asociada con patologías humanas, probablemente porque se trata de un campo de investigación muy reciente en el que están empezando a surgir nuevos conceptos.
El documento US20080139517A1 propone la administración de uno o más agentes capaces de inhibir la progresión del ciclo celular neuronal ya sea en una fase temprana del ciclo celular o reduciendo la estimulación mitogénica en el deterioro de la memoria asociada a la edad (AAMI, del inglés age associated memory impairment), deterioro cognitivo leve (MCI, del inglés mild cognitive impairment), EA, demencia cerebrovascular y otras condiciones neurodegenerativas retrogenéticas. Sin embargo, en dicho documento de patente se supone que el proceso degenerativo está asociado a la progresión del ciclo celular clásico y no por endorreduplicación. Además, este documento de patente no amplía el espectro a otras enfermedades del sistema nervioso y del corazón en las que se ha descrito o pueda describirse reactivación del ciclo celular generador de poliploidía.
En Morillo et al., 2010, se indica que el proceso de endorreduplicación en neuronas conducente a la tetraploidía neuronal ocurre de manera natural durante el desarrollo embrionario, dando lugar a poblaciones específicas de neuronas que adquieren mayor tamaño, dendritas más largas y regiones diferenciales de inervación en su tejido diana (Morillo et al., 2010). Se sabe que la endorreduplicación en estas neuronas surge en respuesta a la activación del receptor de neurotrofinas p75 (p75NTR) mediada por el factor de crecimiento nervioso NGF (del inglés nerve growth factor). Estas neuronas duplican su ADN y permanecen en un estado tipo G2 debido al efecto de la neurotrofina BDNF, la cual actúa a través de su receptor TrkB evitando la transición G2/M. Por tanto, se sabe que la tetraploidización neuronal tiene lugar durante el desarrollo del sistema nervioso mediado por NGF vía p75NTR, induciendo la actividad del factor de transcripción E2F1, para la re-entrada en el ciclo celular. Aquellas neuronas tetraploides que no reciben suficiente señal de BDNF tratan de realizar la mitosis seguida de su muerte por apoptosis. En el cerebro de enfermos de Alzheimer es conocida la presencia de p75NTR y de NGF en las regiones afectadas. Esto sugiere que la hiperploidía observada en las neuronas afectadas podría ser causada por el mismo mecanismo que genera neuronas tetraploides durante el desarrollo del sistema nervioso. La disminución de niveles de TrkB observada en estadios avanzados de la enfermedad podría facilitar la muerte neuronal (véase el desarrollo de este modelo en Frade y López-Sánchez, 2010).
Deschénes et al. 2004 hace referencia a los mecanismos de regulación de la proliferación y la diferenciación de células epiteliales intestinales humanas e indica la posible fosforilación del factor de transcripción E2F4 por p38MAPK. Sin embargo, este documento concluye que actualmente existe la necesidad de investigar qué restos del factor de transcripción E2F4 serían fosforilados por p38MAPK como parte de los mecanismos de regulación de la proliferación y la diferenciación de células epiteliales intestinales humanos.
Se ha desvelado que un inhibidor de p38MAPK, SB 239063, produce una reducción máxima del tamaño del infarto y déficits neurológicos en ictus tanto moderado como grave (Barone et al. 2001). Además se ha indicado que la ruta de señalización de p38MAPK puede mediar en efectos neurotóxicos inducidos por estreptozotocina (Sidhart et al.
2011). En relación con la enfermedad de Alzheimer Muñoz et al. 2010 indicaron que p38MAPK podría desempeñar más de un papel en la patofisiología de enfermedad de Alzheimer y Kitazawa et al. 2011 indicaron que la inhibición de la señalización IL-1 reduce la actividad de p38MAPKy también reduce los niveles de tau fosforilado.
Ninguno de estos documentos identifica moléculas candidatas como dianas terapéuticas para inhibir la poliploidización patológica. Por tanto, actualmente existe la necesidad de prevenir la endorreduplicación causante de la poliploidización patológica en células postmitóticas como método terapéutico, mediante la identificación de nuevas dianas terapéuticas.
Brevedescripcióndela invención
La presente invención hace referencia a un agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática en donde el agente inhibidor es
una forma mutante del factor de transcripción E2F4 con SEQ ID NO: 1 sustituido en restos Ther248 y/o Thr250 con un aminoácido que no puede fosforilarse por p38MAPK distinto de glutamato o aspartato o
una forma de E2F4 de especie distinta del ser humano con mutaciones en restos de Ther conservados en posiciones encontradas en una secuencia conservada correspondiente a Thr248 y/o Ther250 de la secuencia de E2F4 humano, consistiendo dichas mutaciones en una sustitución del resto de Thr conservado por un resto que no puede fosforilarse por p38MAPK distinto de glutamato o aspartato,
y en donde dicha patología asociada con poliploidía somática es una enfermedad neurodegenerativa.
Se desvela el uso de un agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, como diana terapéutica en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática.
Descripcióndetalladadelainvención
Según la presente invención, el agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática, en donde dicha patología asociada a poliploidía somática es una enfermedad neurodegenerativa, es una forma mutante del factor de transcripción E2F4, cuya secuencia aminoacídica se identifica como SEQ ID NO: 1 (humano). Dicha forma mutante del factor de transcripción E2F4 con SEQ ID NO: 1 presenta una sustitución en los restos Thr248 y/o Thr250 por un aminoácido no susceptible de ser fosforilado por p38MAPK, distinto de glutamato o aspartato. Más preferentemente, dicho aminoácido no susceptible de ser fosforilado es alanina.
Se desvela en el presente documento que el agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática, se caracteriza porque es un fragmento de E2F4 comprendido en SEQ ID NO: 1, con idéntica capacidad de interferir con la fosforilación por p38MAPK de E2F4 endógeno.
Además, según la presente invención, el agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática, en donde dicha patología asociada a poliploidía somática es una enfermedad neurodegenerativa, se caracteriza porque es una forma de E2F4 de una especie distinta del ser humano con mutaciones en los restos de Thr conservados en posiciones halladas en una secuencia conservada correspondiente a Thr248 y/o Thr250 de la secuencia de E2F4 humano, consistiendo dichas mutaciones en una sustitución del resto de Thr conservado por un resto no susceptible de ser fosforilado por p38MAPK, distinto de glutamato o aspartato. Dicha forma de E2F4 de una especie distinta del ser humano se selecciona entre SEQ ID NO 2 (pollo) y SEQ ID NO 3 (ratón) (véase Figura 1).
También se desvela en el presente documento el agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática, se caracteriza porque es una molécula sintética que mimetiza la forma mutante del factor de transcripción E2F4 de SEQ ID No: 1, con una sustitución por Alanina en Thr248 y/o Thr250.
Por otro lado, la presente invención hace referencia al agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática, en donde dicha patología asociada a poliploidía somática es una enfermedad neurodegenerativa, caracterizado por que dicha poliploidía somática se produce por endorreduplicación en células postmitóticas. Preferentemente, dichas células postmitóticas son neuronas y/o miocitos.
La divulgación también se refiere al agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en su Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática, caracterizado por que dicha patología asociada a la poliploidía somática se selecciona de entre el siguiente grupo: enfermedad neurodegenerativa, isquemia, cardiomiopatía hipertrófica, patología vascular asociada a la hipertensión y envejecimiento. La patología asociada a la poliploidía somática según la invención es una enfermedad neurodegenerativa. Aún más preferentemente, dicha enfermedad neurodegenerativa es Alzheimer. En otra realización preferente de la presente invención, el agente inhibidor está asociado a otro péptido permeable a la membrana celular que facilita su incorporación al interior celular, o el agente inhibidor está comprendido en forma de ADN en un vector capaz de infectar neuronas y/o miocitos, preferentemente adecuado para terapia génica, más preferentemente dicho vector es un vector vírico, y aun más preferentemente dicho vector vírico es un lentivirus. El laboratorio de los inventores ha desvelado el mecanismo empleado por NGF/p75NTR para inducir la reactivación del ciclo celular en neuronas de pollo durante el desarrollo embrionario, efecto que genera endorreduplicación y tetraploidía neuronal (Morillo et al., 2010). Dicho mecanismo se basa en la activación de la Ser/Thr kinasa p38MAPK en el núcleo de las células afectadas (Figura 2), y la posterior fosforilación del factor de transcripción E2F4 en restos treonina (Figura 3). Cualquier otra vía de señalización que activase p38MAPK en células postmitóticas podría dar como resultado la hiperploidización empleando al factor de transcripción E2F4. En el pollo, solo existen dos restos susceptibles de ser fosforilados por p38MAPK, es decir, los restos de treonina Thr261 y Thr263 (Figura 1). El uso del software NetPhosK 1.0 predice que estas treoninas están inmersas en un dominio conservado con las proteínas E2F4 humana y de ratón (Figura 1). En el caso de la proteína E2F4 humana, el resto de treonina susceptible de ser fosforilada por p38MAPK, como predice el software NetPhosk 1.0, es el resto de treonina Thr248 (el sitio consenso de fosforilación de la p38MAPK requiere de un resto Pro consecutivo, una secuencia TP, que se encuentra tras dicha treonina). Se ha considerado que también el resto Thr 250 humana está protegido pese a carecer de un resto Pro consecutivo. El motivo es su grado de conservación con el resto de treonina Thr251 del ratón y el resto de treonina Thr263 del pollo, ambas con un resto Pro consecutivo y predichas por el software NetPhosK 1.0 como restos de treonina susceptibles de ser fosforilados por p38MAPK.
La fosforilación de los restos Thr261/Thr263 de E2F4 es crucial para la reactivación del ciclo celular inducida por NGF vía p75NTR en las células de retina de embrión de pollo en proceso de diferenciación neuronal (Figura 4). Tal reactivación del ciclo celular conduce a la tetraploidía neuronal (Morillo et al., 2010). Los inventores han observado que el empleo de una forma constitutivamente activa de E2F4 de pollo, en la cual las Thr261 y Thr263 han sido substituidas por Glu (un aminoácido cargado positivamente que mimetiza el estado fosforilado de la Thr) es capaz de mimetizar el efecto de NGF sobre las neuronas de la retina (Figura 4AB). También se ha demostrado que el uso de una forma dominante negativa de E2F4 de pollo (Thr261Ala/Thr263Ala) que impide su fosforilación por p38MAPK es capaz de inhibir el efecto de NGF sobre el ciclo celular en cultivos neurogénicos de retina (Figura 4C, Figura 4D). Por ello, es previsible que la expresión de esta forma mutante Thr261Ala/Thr263Ala (o bien la forma humana Thr248Ala/Thr250Ala) en las neuronas o miocitos afectados asociados a las patologías descritas anteriormente podría inhibir el proceso de endorreduplicación y la hiperploidización consiguiente, lo cual podría prevenir, o al menos ralentizar, la progresión de la enfermedad. Se desvela en el presente documento el uso de dichas formas mutantes de E2F4 para prevenir la hiperploidización y los efectos patológicos asociados en diversas enfermedades que afectan a células postmitóticas (neuronas y células musculares).
Por tanto, la presente divulgación demuestra que la fosforilación en restos Thr conservados homólogos de Thr248 y Thr250 en el E2F4 humano es crucial para la inducción de endorreduplicación en neuronas de retina.
También se desvela cualquier método para inhibir de manera específica la fosforilación del factor de transcripción E2F4 humano (en adelante fosfoE2F4) en los restos Thr248 y/o Thr250. La inhibición de dicha fosforilación impediría la capacidad de E2F4 para inducir la síntesis de ADN en células postmitóticas, lo cual tiene claros beneficios terapéuticos.
La presente divulgación también hace referencia a cualquier método para inhibir la señalización de p38MAPK/fosfoE2F4, preferentemente mediante una forma mutante de E2F4 en la que el resto Thr 248 y/o resto Thr250, ha(n) sido sustituido(s) por un resto Ala, tal como se ha realizado en el laboratorio de los inventores con E2F4 de pollo.
De forma alternativa, la presente divulgación también hace referencia a cualquier otro método de inhibición de la señalización de p38MAPK/fosfoE2F4, tal como por ejemplo:
- sustitución de restos Thr248 y/o Thr250 por otros aminoácidos no susceptibles de ser fosforilados,
- uso de un fragmento de E2F4 con idéntica capacidad de interferir en la fosforilación de E2F4 endógeno,
- uso de formas de E2F4 de otras especies con mutaciones en los restos de Thr conservados,
- uso de moléculas sintéticas que mimeticen la forma mutada de E2F4, etc.
La presente divulgación también hace referencia a cualquier medio de transferencia específica de las formas mutadas de E2F4 mencionadas anteriormente al interior de las células afectadas, tal como por ejemplo mediante vectores apropiados, péptidos susceptibles de atravesar la membrana celular, etc.
La divulgación supone las siguientes fases:
1) Generación de la molécula bloqueante que bloquea la fosforilación del factor de transcripción E2F4 humano en las células diana
La molécula elegida para bloquear la fosforilación de E2F4 humano en los restos Thr248 y/o Thr250 (ya sea la secuencia del gen codificante para E2F4 humano o E2F4 de otra especie, la secuencia peptídica de E2F4 humano o E2F4 de otra especie, la secuencia parcial de del gen codificante para E2F4 humano o E2F4 de otra especie, la secuencia peptídica parcial de E2F4 humano o E2F4 de otra especie, u otra molécula que mimetice la región o regiones de interacción entre E2F4 y p38MAPK capaz de bloquear la fosforilación de E2F4 humano en los restos Thr248 y/o Thr250) será generada por síntesis química o mediante clonación de la secuencia de ADNc en un plásmido que pueda generar vectores adecuados para terapia génica.
En este último caso, la secuencia codificante debe amplificarse previamente con una enzima termoestable y con capacidad de corrección de errores a partir de ADNc derivado del ARNm obtenido previamente de una línea celular o de un tejido de origen humano. Para clonar la secuencia, se usan cebadores en los que se han incluido sitios de restricción compatibles con el polilinker del vector elegido para su clonación. Dicho vector se elige basándose en el procedimiento usado en el Ejemplo 4 para introducir la secuencia elegida en las células diana. Una vez clonada la secuencia, se realiza un proceso convencional de mutagénesis dirigida conducente a modificar específicamente el codón ACT codificante de los restos Thr248 y/o Thr250 para transformar dicho codón en un codón específico de cualquier aminoácido excepto Glu o Asp. El plásmido así generado se co-transfecta en una línea celular apropiada capaz de empaquetar el vector de interés.
2) Expresión de la molécula bloqueante que bloquea la fosforilación del factor de transcripción E2F4 humano en las células diana
En aquellas células en las que está activa la vía de señalización p38MAPK-E2F4, se espera que p38MAPK resulte inhibido al unirse al exceso de moléculas de que mimetizan la forma mutada de E2F4, capaz de interaccionar con p38MAPK pero incapaz de ser fosforilada. De este modo se bloquea el proceso de endorreduplicación en dichas células. Las moléculas bloqueantes pueden ser expresadas por las mismas células diana si se transfieren en forma de ADN (usando vectores apropiados tales como los lentivirus, por ejemplo). Como alternativa, las moléculas bloqueantes pueden ser transferidas mediante péptidos capaces de atravesar la membrana celular con mayor o menor especificidad de tipo celular diana.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes dibujos y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripcióndelosdibujos
La Figura 1 muestra la estructura, dominios funcionales y conservación de secuencias del factor de transcripción E2F4. En el dibujo se ilustra la comparación entre las secuencias de aminoácidos del factor de transcripción E2F4 humano (H. sapiens), factor de transcripción E2F4 del ratón (M. musculus), factor de transcripción E2F4 del pollo (G. gallus), factor de transcripción E2F4 de la rana Xenopus laevis (X. laevis) y factor de transcripción E2F4 del pez cebra (D. rerio). Se indican también los distintos dominios funcionales conocidos, que incluyen la región de unión al ADN (DB), el dominio de dimerización (DIM), la caja marcada (MB) y el dominio de transactivación (TA). Se indica también la región que incluye los restos Thr248 y Thr250 de la secuencia humana conservada en otras especies (indicado por pequeños rectángulos): restos Thr249 y Thr251 en la secuencia del ratón, restos Thr 261 y Thr263 en la secuencia del pollo, restos Thr228 en la rana y restos Thr217 en el pez cebra. Esta región se denomina dominio regulador (RD). Los aminoácidos conservados completamente en el dominio regulador se indican con un punto.
La Figura 2 muestra que la activación de p38MAPK nuclear en respuesta a NGF es necesaria para la reactivación del ciclo en cultivos neurogénicos de células de retina de embrión de pollo en E6. Estas células responden a NGF induciendo la reactivación del ciclo celular que conduce a la tetraploidía somática (endorreduplicación) (Morillo et al., 2010). A. Transferencia de western con anti-p38MAPK activo (P-p38MAPK) y anti-p38MAPK en extractos nucleares de los cultivos neurogénicos mencionados tratados durante el tiempo indicado con 100 ng/ml de NGF. Las relaciones normalizadas entre los niveles de P-p38MAPK y p38MAPK se indican en la base. B. Tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-p38MAPK activo (P-p38MAPK) en los cultivos neurogénicos mencionados tratados con 100 ng/ml de NGF durante 20 min. Los núcleos se marcaron con bisbenzimida (Bisb.). Obsérvese el aumento de señal en el núcleo de las células tratadas con NGF. C. Ensayo de luciferasa en extractos de cultivos neurogénicos de células de retina de embrión de pollo E6 transfectados con un plásmido que expresa luciferasa bajo el control del promotor del gen cMyc, conocido por su respuesta a E2F durante la transición G1/S, y otro plásmido con expresión constitutiva de p-galactosidasa. Los valores de la relación luciferasa/p-galactosidasa se representan como “actividad luciferasa”. El tratamiento con 100 ng/ml de NGF supone la activación del promotor cMyc, que indica reactivación del ciclo celular. Este efecto se bloquea con el inhibidor selectivo de p38MAPK SB203580 (usado a 5 pM). D. Incorporación de BrdU, como indicativo de entrada en fase S, en cultivos neurogénicos de células de retina de embrión de pollo E6. El tratamiento con 100 ng/ml de NGF supone el incremento en la proporción de células en fase S, efecto bloqueado por el inhibidor selectivo de p38MAPK SB203580 (usado a 5 j M), pero no por el inhibidor selectivo de JNK, SP600125 (usado a 7 j M). *p<0,05; ***p<0,005 (ensayo de t de Student)
La Figura 3 muestra fosforilación de E2F4 en restos de treonina promovida por NGF en cultivos neurogénicos de células de retina de embrión de pollo en E6. En la parte superior se muestra una transferencia de western realizada con anticuerpos anti-fosfoThr (ap-Thr) en extractos inmunoprecipitados con anticuerpos anti-E2F4, procedentes de los cultivos indicados tratados con diferentes combinaciones de 100 ng/ml de NGF y el inhibidor selectivo SB203580 (usado a 5 j M). En la parte inferior se muestra una transferencia de western realizada con anticuerpos anti-E2F4 en los mismos extractos sin inmunoprecipitar (ENTRADA). Puede observarse cómo la presencia de NGF supone el incremento en la fosforilación en restos de treonina, mientras que la presencia del inhibidor de p38MAPK inhibe tal fosforilación.
La Figura 4 muestra que la fosforilación de E2F4 en los restos Thr261/Thr263 es capaz de inducir reactivación del ciclo en cultivos neurogénicos de células de retina de embrión de pollo en E6. A. Actividad luciferasa analizada como se describe en la Figura 2C. La expresión de la forma constitutivamente activa de E2F4 (E2F4-CA), caracterizada por las sustituciones Thr261Glu/Thr263Glu, induce la actividad del promotor cMyc, efecto observable incluso en presencia del inhibidor selectivo de p38MAPK SB203580 (usado a 5 j M). B. La incorporación de BrdU se incrementa significativamente en células transfectadas con la forma constitutivamente activa de E2F4 (E2F4-CA), efecto observable incluso en presencia del inhibidor selectivo de p38MAPK SB203580 (usado a 5 j M). De los resultados mostrados en los paneles A y B se deduce que p38MAPK actúa exclusivamente a través de los restos Thr261/Thr263. C. Actividad luciferasa analizada como se describe en la Figura 2C. La expresión de la forma dominante negativa de E2F4 (E2F4-DN), caracterizada por las sustituciones Thr261Ala/Thr263Ala, previene el efecto de 100 ng/ml de NGF sobre la actividad del promotor cMyc. D. La expresión de la forma dominante negativa de E2F4 (E2F4-DN), previene el efecto de 100 ng/ml de NGF sobre la incorporación de BrdU en los cultivos neurogénicos de retina.
La Figura 5 muestra el diagrama del método de clonación de la secuencia codificante de E2F4 en un plásmido que permita la generación de un vector apropiado para terapia génica (lentivirus, etc.), por ejemplo. El ARNm obtenido a partir de células o tejido humano se convierte en ADNc utilizando una transcriptasa reversa. La secuencia codificante de E2F4 humano se representa como un rectángulo gris en el que se indica la posición del codón codificante del resto Thr 248. Este codón está flanqueado por dos dianas de restricción específicas (C y D). Se diseñan dos cebadores a partir de la secuencia de los extremos de la región codificante con un sitio de restricción específico en sus extremos 5' (A y B). Estas dianas aparecen también en el polilinker del vector de expresión y se usan para la clonación de la secuencia codificante de E2F4 en dicho vector. P: promotor encargado de la transcripción de la proteína E2F4. pol: secuencia de poliadenilación usada para introducir una cola de poli(A) en el ARNm generado por el vector.
La Figura 6 muestra el diagrama del procedimiento de mutagénesis de la secuencia codificante de E2F4. Se diseñan una pareja de cebadores externos que flanquean los sitios de restricción C y D (flechas externas) y otra pareja solapante de cebadores internos que incluyen en su secuencia el codón de Thr248 mutagenizado (flechas internas). Se realizan dos reacciones de amplificación por PCR con ADN polimerasa Pfu y los productos de la reacción se desnaturalizan conjuntamente. Después de renaturalizar el ADN, se obtienen entre otras posibilidades, la situación indicada en el diagrama. La extensión con ADN polimerasa Pfu crea dobles hélices de ADN con las secuencias de los cebadores externos en sus extremos. Estas secuencias se amplifican exponencialmente con dichos cebadores dando como resultado fragmentos de ADN con el resto de Thr248 mutagenizado en Ala, flanqueado por las dianas de restricción C y D. La secuencia que contiene la mutación se puede subclonar en el vector de expresión usando para ello las dianas de restricción C y D.
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo1- ClonacióndelasecuenciacodificantedeE2F4humano
La secuencia codificante de E2F4 humano (posiciones 64-1305 de la secuencia con número de referencia del NCBI: NM_001950) (SEQ ID NO 4) se clona en un plásmido que pueda generar vectores adecuados para terapia génica (vectores lentivíricos, por ejemplo). La secuencia codificante debe amplificarse previamente con la enzima ADN polimerasa Pfu a partir de ADNc procedente del ARNm obtenido previamente de una línea celular o de un tejido de origen humano. Para clonar la secuencia, se usan cebadores en los que se han incluido las dianas de restricción EcoRV y PacI (subrayadas en las secuencias indicadas al pie de este párrafo) compatibles con el polilinker del vector de expresión lentivírico (véase diagrama simple de dicho vector en la Figura 5, el sitio EcoRV se correspondería con A y el sitio PacI se correspondería con B en dicho diagrama). Son ejemplos de estos oligonucleótidos los siguientes:
SEQ ID NO 5: Oligo 5': 5’-CAACAGATATCATGGCGGAGGCCGGGCCACA-3’
SEQ ID NO 6: Oligo 3’: 5’-CCATTAATTAAGGGTCCCAGCCACACAGGGC-3’
El primero corresponde a los nucleótidos en las posiciones 64-83 y el segundo es complementario de los nucleótidos en las posiciones 1319-1338 de la secuencia de E2F4 humano.
El amplificón así obtenido se clona en el vector pGEM-Teasy (Promega), que no posee sitios de restricción EcoRV o PacI, en el que se realizará la mutagénesis dirigida descrita en la Sección 2.
Ejemplo2 - Mutacióndel restoThr248(elresto Thr250puedemutarsemedianteunprocedimientosimilar unavezgeneradalamutaciónThr248Ala)
Una vez clonada la secuencia de E2F4 humano en el vector pGEM-Teasy, se diseñan oligonucleótidos en la región comprendida entre las posiciones 731-754 de la secuencia codificante de E2F4 humano, correspondiente a la SEQ ID NO 4.
Estos oligonucleótidos incluyen el codón ACT codificante de la Thr248 (en las posiciones 742-744 de la secuencia codificante de E2F4 humano) mutado como codón específico de Ala (secuencia GCT). Son ejemplos de estos oligonucleótidos:
SEQ ID NO 7: Oligo 5’ mutado: 5’-TCAGCTCGCTCCCACTGCTG-3’ (posiciones 735-754).
SEQ ID NO 8: Oligo 3’ mutado: 5’-CAGTGGGAGCGAGCTGAGGA-3’ (posiciones 732-751).
Estos oligonucleótidos (que contienen la mutación subrayada) serán usados como cebadores de dos reacciones independientes indicadas en la Figura 6. Para estas reacciones se diseña otra pareja de cebadores que flanquean los sitios de restricción de la enzima BspEI (indicados como C y D en la Figura 6). La secuencia del ADNc codificante para E2F4 humano incluye dos sitios BspEI en las posiciones 374-379 y 979-984, con secuencia TCCGGA. Son ejemplos de estos cebadores:
SEQ ID NO 9: Oligo 5’ no mutado: 5’-AAGGTGTGGGTGCAGCAGAG-3’ (posición 352-371)
SEQ ID NO 10: Oligo 3’ no mutado: 5’-GGTCTGCCTTGATGGGCTCA-3’ (posición 1005-1025)
Posteriormente se realizan dos reacciones de amplificación por PCR con ADN polimerasa Pfu como se indica en el esquema de la Figura 6 (Oligo 5’ no mutado con Oligo 3’ mutado y Oligo 5’ mutado con Oligo 3’ no mutado), y los productos de la reacción se desnaturalizan conjuntamente. Después de renaturalizar el ADN, se obtienen, entre otras posibilidades, la situación indicada en el diagrama de la Figura 6. La extensión con ADN polimerasa Pfu de

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un agente inhibidor de la fosforilación por p38MAPK del factor de transcripción E2F4 en los restos Thr248 y/o Thr250, para su uso en la prevención y/o tratamiento de una patología asociada a la poliploidía somática en donde el agente inhibidor es
una forma mutante del factor de transcripción E2F4 con SEQ ID NO: 1 sustituido en los restos Thr248 y/o Thr250 por un aminoácido no susceptible de ser fosforilado por p38MAPK distinto de glutamato o aspartato o
una forma de E2F4 de una especie distinta del ser humano con mutaciones en los restos de Thr conservados en posiciones halladas dentro de una secuencia conservada correspondiente a Thr248 y/o Thr250 de la secuencia de E2F4 humano, consistiendo dichas mutaciones en una sustitución del resto de Thr conservado por un resto no susceptible de ser fosforilado por p38MAPK distinto de glutamato o aspartato,
y en donde dicha patología asociada a poliploidía somática es una enfermedad neurodegenerativa.
2. El agente inhibidor para su uso según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho aminoácido no susceptible de ser fosforilado es alanina.
3. El agente inhibidor para su uso según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha forma de E2F4 de otra especie se selecciona entre SEQ ID NO 2 y/o SEQ ID NO 3.
4. El agente inhibidor para su uso según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha poliploidía somática se produce como resultado de endorreduplicación en células postmitóticas.
5. El agente inhibidor para su uso según la reivindicación 4, caracterizado por que dichas células postmitóticas son neuronas.
6. El agente inhibidor para su uso según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Alzheimer.
7. El agente inhibidor para su uso según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho agente inhibidor se asocia a un péptido permeable a la membrana celular que facilita su incorporación en la célula.
8. El agente inhibidor para su uso según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho agente inhibidor está comprendido en forma de ADN y está comprendido en un vector capaz de infectar neuronas y/o miocitos.
9. El agente inhibidor para su uso según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho agente inhibidor es expresado por una célula diana después de que dicho agente inhibidor se transfiera a la célula en forma de ADN usando un vector adecuado.
10. El agente inhibidor para su uso según la reivindicación 8, en donde el vector es un vector vírico.
11. El agente inhibidor para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en donde el vector es un lentivirus.
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