WO2018104536A1 - Beleuchtungseinrichtung für ein konfokales mikroskop und konfokalmikroskop - Google Patents

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WO2018104536A1
WO2018104536A1 PCT/EP2017/082100 EP2017082100W WO2018104536A1 WO 2018104536 A1 WO2018104536 A1 WO 2018104536A1 EP 2017082100 W EP2017082100 W EP 2017082100W WO 2018104536 A1 WO2018104536 A1 WO 2018104536A1
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WO
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optics
optical element
diffractive optical
beam path
lighting device
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Application number
PCT/EP2017/082100
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Inventor
Christian Schumann
Cornell Peter Gonschior
Sebastian HITZLER
Oliver SCHLICKER
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
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    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
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    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/48—Laser speckle optics

Definitions

  • the present invention relates to a confocal microscope illumination apparatus and a spinning disk type confocal microscope.
  • Pinholes illuminated at the same time.
  • the pinholes are in a predetermined geometrical arrangement on the Nipkow-type disk (also referred to in this application as a mask disk).
  • geometrical flux for illuminating a rotatable mask disk can be generated flexibly and with as little effort as possible and avoiding the mentioned interference artifacts (speckies) in the image field.
  • a lighting device for a confocal microscope which comprises: a light source for generating
  • Illumination light wherein in particular a laser or a laser coupled to a single-mode optical fiber laser is used as the light source, a collimator optics connected downstream of the light source for generating a collimated
  • Condenser optics for generating a light field in a luminous field plane. Furthermore, there is a movable, in particular rotatable in the Leuchtfeldebene
  • Masking disk with a geometric arrangement of pinholes or microfocusing optics, which are at least partially illuminated in the luminous field. Between collimator and condenser optics is in the collimated
  • Illumination beam path a diffractive optical element, also referred to as an engineered diffuser, arranged, which has a geometric flow of
  • Illuminated beam path generated with a predetermined angle spectrum.
  • the diffractive optical element is, for example, a diffuser (polymer plate) with embossed predetermined patterns, whereby the spatial distribution of the scattering or diffraction of these patterns
  • emitted light intensity can be shaped in the desired manner.
  • engineered diffusers are known from the prior art
  • Extension of the spectrum in the angular space can be determined with the structure of the diffractive optical element.
  • the angle spectrum generated by the diffractive optical element is adapted to the geometry of an object field of the microscope to be illuminated and / or of a detection element of the microscope.
  • the illumination of the masking disk takes place in particular in a Köhler illumination arrangement from the position of the diffractive optical element. That is, the angle spectrum of the diffractive optical element dictates the shape and size of the illuminated light field, whereas the diameter of the collimated illumination beam path / laser beam impinging on the diffractive optical element determines the illumination aperture.
  • a tilt of the diffractive optical element is equal to a decentering of the light field.
  • the geometry of the illuminated illuminated field also determines that of the object field illuminated in the further course in a spinning-disk microscope. Since the detection element, usually a camera, and the
  • Mask disk are in planes conjugate to each other, the sensor surface of the detection element is illuminated with the same geometry in the further course.
  • Detection element ie in particular to the geometry of the camera sensor surface, can be adjusted, whereby all light from the sample on the detection element meets and the sample must not be illuminated with higher intensity than absolutely necessary (this would be the case, for example, when a rectangular sensor surface is illuminated only in the form of a registered circular area).
  • the sensor surfaces are rectangular, it is particularly advantageous if the angular spectrum generated by the diffractive optical element has a rectangular angular distribution.
  • the diffractive optical element comprises (or consists of) at least one
  • the diffuser or diffusers are the already mentioned engineered diffusers, which may be designed in transmissive or reflective form.
  • Spatial Light Modulators SLMs
  • SLMs Spatial Light Modulators
  • such SLMs include micromirror arrays or transmissive or reflective liquid crystal displays.
  • artificial holograms are also suitable for the present application. In such holograms, the relative phase of two
  • the diffractive optical element can have one or more individual elements of one of the named types or even mixed forms of the named types. By exchanging such elements, the diffractive optical element can be made variable, whereby the advantage of power-neutral choice of the field geometry can be optimally used adapted to the respective task.
  • the luminous field as described above, can be adapted to the detection range of the camera used. This is especially advantageous when high
  • Detection speeds both due to the read speeds require a small read range of the camera, as well as due to the short Exposure times make a concentration of the illumination light on the field of view necessary.
  • a changing device is preferably provided, by means of which the diffractive optical element can be brought out of or into the illumination beam path. If the diffractive optical element consists of a plurality of said individual elements, then the changing device is preferably also configured to guide such individual elements of the diffractive optical element out of or into the illumination beam path.
  • the change can be manual or motorized, for example by means of a motorized
  • the above-mentioned interference artifacts are caused in the image field due to the spatial coherence of the laser light.
  • the spatial coherence can be reduced and thus the mentioned interference artefacts can be avoided.
  • a mechanical modulation device is provided in order to set the diffractive optical element in a mechanical movement. It makes sense here if the mechanical movement is an oscillating movement. Furthermore, it is advantageous if the direction of movement perpendicular to the optical axis of
  • Illumination beam path is.
  • the diffractive optical element can perform a fast translational vibration movement orthogonal to the optical axis.
  • This type of modulation has the advantage, in contrast to a rotational movement, of maintaining a non-cylindrically symmetrical illumination profile, such as, for example, the sensor area or a selected region of interest of a camera used in the detection of the entire system.
  • a non-cylindrically symmetrical illumination profile such as, for example, the sensor area or a selected region of interest of a camera used in the detection of the entire system.
  • Randomization of the phase of the illumination light within the corresponding Exposure time of the imaging system takes place.
  • the translational movement of the diffractive optical element proposed here is particularly well suited for the randomization of the phase on the time scales mentioned.
  • a corresponding guide in the said mechanical modulation device is necessary, which is a tilting of the diffractive optical element with respect to the optical axis of the
  • this guide may be a linear guide or a parallelogram guide.
  • this guide can be designed as a solid-body joint.
  • this drive is performed by an eccentric, which is connected either via pressure, via a driver or a lever with the guide of the diffractive optical element in the mechanical modulation device and which is driven directly on the axis of an engine via a belt.
  • this translational oscillation movement can be effected by a piezo drive.
  • the drive by means of a voice coil or a
  • Illuminating device are transmitted, it is expedient to decouple or isolate the module to be modulated with the diffractive optical element vibrationally from the rest of the illumination and imaging system. This can be done for example by a suitable suspension or by
  • phase modulator as a separate component of the diffractive optical element downstream.
  • the diffractive optical element may remain stationary.
  • a phase modulator for example, a rotating lens is, in particular with little strong
  • Lighting arrangement by the illumination device according to the invention advantageous.
  • Lighting arrangement can be represented by a single imaging element, in the rear focal plane of the diffractive optical element is arranged, whereas in the front focal plane, the light field is formed.
  • Illumination arrangement have an intermediate pupil.
  • the size of the intermediate pupil can be suitably selected by means of the corresponding additional lenses of the relay optics.
  • the light field is expanded appropriately in this way. Furthermore, to realize different beam diameters in the illumination of the diffractive optical element has the collimator optics
  • This switchable optics may be, for example, an arrangement for exchanging the collimator, which is a collimated one
  • Illuminated beam path generated with a predetermined beam diameter.
  • switchable telescope optics or afocal optics for generating a desired illumination beam diameter in the illumination device as a switchable optics for adjusting the diameter of the
  • Such optics are suitable for adapting the diameter of the illumination beam path to the geometry of the pinhole or Mikrofokussieroptiken a located in the light box
  • Mask disc Namely, in the preferred Köhler illumination arrangement, if an array of pinhole apertures or microfocusing optics is arranged in the luminous field, images of the location spectrum of the illuminating light at the location of the diffractive optical element, ie the beam profile, with which this element is illuminated are formed in its focal plane.
  • the size of the illuminated pinhole or microfocusing optics can be changed by replacing the disk or by using a radial area provided with other hole sizes on the same disk. In this case, it is expedient to adapt the beam diameter with which the diffractive optical element is illuminated accordingly. This avoids, in particular, the loss of illumination light due to the aperture effect of the diaphragm apertures or microfocusing optics.
  • the invention further relates to a confocal microscope of the spinning disk type with a lighting device according to the invention, as described above in detail.
  • a spinning disk microscope has a mask disk of the Nipkow type, which in the luminous field of the
  • Lighting device is arranged.
  • the tube optic and the lens of the confocal microscope are switched.
  • an object field on the sample is illuminated. From there reflected, transmitted or emitted in the context of a fluorescence excitation light passes through the lens and the tube optics through the same openings of the mask disc (s) on a located in the illumination beam path dichromatic divider. In this way, the light coming from the sample can be coupled out and fed to a detection element, usually a camera.
  • a detection element usually a camera.
  • FIG. 1 shows a first embodiment of a device according to the invention
  • FIG. 2 shows a second embodiment of a device according to the invention
  • FIG. 3 shows the embodiment according to FIG. 1 with a further optical element for phase modulation
  • FIG. 4 shows an embodiment of a changing device for diffractive optical elements in a lighting device according to the invention
  • FIG. 5 shows a schematic view of the typical elements of a confocal microscope of the spinning disk type
  • FIG. 6 shows the essential optical elements of a confocal microscope of the spinning disk type with a lighting device according to the invention in the embodiment according to FIG. 1.
  • Figure 1 shows a schematic view of an embodiment of a
  • Collimator optics 102 and condenser optics 106 is a diffractive optical element 104.
  • this diffractive optical element 104 is in particular a diffusing screen
  • the element 104 is located in the aperture plane (or at least substantially in the aperture plane) of the
  • each (illuminated) point of the diffractive optical element 104 illuminates the illuminated field 107.
  • a rotatable mask disk (not shown here) with a geometric arrangement of pinhole or Mikrofokussieroptiken which are illuminated in the luminous field 107 at least in part, that is, depending on the generated luminous field geometry.
  • the diffractive optical element 104 generates a geometric flux of the
  • Illumination beam path with a predetermined angle spectrum.
  • the location spectrum 105a on the side of the diffractive optical element 104 facing the condenser optics 106 is a Gaussian beam profile. Accordingly, the angle spectrum 105b of the illumination light is after
  • the diffractive optical element 104 Influenced by the diffractive optical element 104 of rectangular shape. Due to the condensing optics 106 as the imaging element, the spectra undergo a Fourier transformation. Thus, in the luminous field plane, the location spectrum 108a of the illumination light at the location of the luminous field 107 is produced. This location spectrum 108a has a rectangular shape. Accordingly, the angular spectrum 108b of the
  • the local spectrum 108a can be optimally adapted to the geometry of a detection element of the confocal microscope, in this case a camera with a rectangular sensor chip.
  • FIG. 2 shows a similar embodiment of a lighting device 200 as in FIG. 1, but as a Köhler illumination arrangement with an intermediate pupil. This is realized by a relay optics, which here represents a telescope optics for widening the illuminated field.
  • the illumination device 200 has a light source 201, in particular a point light source, with downstream collimator optics 202. Again, 203 may be a light source for collimated light.
  • the condenser optics is designated 206 in FIG. Between collimator optics 202 and condenser optics 206 is the diffractive optical element 204 with
  • Modulation arrangement that is, for example, the engineered diffuser of Figure 1.
  • the relay optics has additional lenses 209 and 21 1 for a telescope system. Through these additional lenses of the illumination beam path is widened.
  • 207 now denotes the intermediate image of the luminous field, which is located after beam expansion in 212.
  • 210 is the location of the intermediate pupil of the illumination assembly.
  • the rotatable mask disk (not shown here) with a geometric arrangement of pinhole or Mikrofokussieroptiken which are illuminated in the luminous field 212 at least partially.
  • the respective location and angle spectra are indicated in FIG. 2.
  • the local spectrum of the illumination light is denoted by 205a after being influenced by the diffractive optical element 204 and 205b by the corresponding angular spectrum.
  • the location spectrum 208a and the associated angular spectrum 208b are formed.
  • the telescope optics 209, 21 1 the intermediate image of the light field 207 is displayed in the light field 212.
  • the increased by beam expansion spatial spectrum at the location of the light box 212 is denoted by 213a.
  • the corresponding angle spectrum is designated 213b.
  • the Köhler illumination arrangement can have an intermediate pupil whose size can be suitably selected. This may, for example, be suitable for passing through the entrance facet of a retroreflector (cf. FIG. 12A, reference numeral 104 of US Pat. No. 7,580,171 B2).
  • FIG. 3 shows an embodiment of a lighting device 300 which is shown in FIG.
  • the (point) light source is designated here by 301, the collimator optics by 302, the diffractive optical element by 304, the condenser optics by 307 and the luminous field by 308.
  • the respective location and angle spectra are designated 305a, 305b and 309a and 309b , 303 denotes a light source for collimated light, here combination of point light source 301 and collimator optics 302.
  • Illumination device 300 has a phase modulator 306, which is connected downstream of the diffractive optical element 304.
  • This phase modulator 306 is, for example, a rotating diffuser with a less pronounced angular spectrum. In this way, the angle spectrum 305b of the diffractive optical element 304 is not changed in its geometry by the downstream phase modulator 306, but the coherence of the illumination beam path leading to interference artifacts is greatly reduced.
  • the advantage of this arrangement is that the diffractive optical element 304 may be stationary (compare below with reference to FIG. 4). That the phase modulator 306 the
  • FIG. 3 shows (location spectrum 309a or angle spectrum 309b).
  • FIG. 4 schematically shows an embodiment of a changing device 402 for a diffractive optical element 401 in a perspective view (FIG. 4A) and in a longitudinal section (FIG. 4B). Identical elements of the changing device 402 are provided with the same reference numeral.
  • the changing device 402 serves the purpose of being able to flexibly introduce a diffractive optical element 401 optimally adapted to the respective application into the illumination beam path.
  • the diffractive optical element 401 can be inserted into a guide of the changing device or pushed out again. To the position of
  • a corresponding guide 404 is advantageous, which prevents tilting of the diffractive optical element 401 relative to the optical axis of the illumination beam path.
  • it is a guide 404 with solid joints.
  • a mechanical modulation device 405 is provided, which sets the changing device 402 and thus the diffractive optical element 401 in a rapid oscillating movement perpendicular to the optical axis of the illumination beam path.
  • the drive of the modulation device 405 is performed by an eccentric 403, which is connected by a driver (fastening by screws, as shown in Figure 4B) with the guide 404 of the diffractive optical element 401 and is driven directly on the axis of a motor.
  • the translatory oscillation movement can also be effected by a piezo drive or can be realized by means of a voice coil or by means of an electromagnetic coupling.
  • FIG. 5 schematically shows an overview of the components of a
  • Laser light source which is connected via an illumination fiber 507 with the illumination device 506.
  • 504 denotes an optical adapter for the confocal microscope 505 on the microscope stand 501.
  • the object table 502 is located with a sample 503 to be examined.
  • a control unit 509 is connected to the individual components 508, 506, 505 and 501 via corresponding connecting lines.
  • a computer with control and presentation programs is with 510; he is also in communication with the control unit 509.
  • the illumination device 506 is designed according to one of the embodiments of Figures 1 to 3.
  • the principal mode of operation of the components of the illumination device 506 and of the confocal microscope 505 will now be considered in greater detail with reference to FIG.
  • FIG. 6 shows an embodiment of a lighting device 600 corresponding to that of FIG. 1.
  • 601 is again a point light source, 602 a collimator optic.
  • the light source for collimated light is represented by 603.
  • 604 denotes the diffractive optical element with modulation arrangement (engineered diffuser).
  • Downstream is again the condenser optics 606, through which a light field 607 is generated in a luminous field plane.
  • a rotatable mask disk with a geometrical arrangement of pinholes is arranged in a microscope of the spinning disk type, which are at least partially illuminated in the luminous field 607.
  • the illuminated area is a rectangular illuminated field.
  • examining sample is illuminated by a microscope optics, as well as the same microscope optics imaged in particular on the camera 613 shown.
  • An object point illuminated via a specific pinhole of the rotating mask disk is imaged onto the sensor of the camera 613 by the same pinhole. This corresponds to the basic principle of confocal microscopy.
  • the tube and C-mount optics 609 is shown.
  • the lens is labeled 610.
  • the sample (not shown) is located in the front focal plane of the objective 610. Light emanating from a sample point, in particular
  • Fluorescence light is imaged on the sensor surface of a camera 613 via the same pinhole of the rotating mask disk via a camera optics 612.
  • Decoupling of the observation beam path is located between Kodensoroptik 606 and light field 607 a dichromatic divider 61 1.
  • the dichromatic divider 61 1 also prevents reflections from the mask disc in the
  • Microfocusing optics focuses the illumination light into pinholes located behind it, which are arranged in the same geometrical arrangement on a second behind them rotating mask disk.
  • the dichroic divider 61 1 would be arranged between the two mask disks, ie between the mask disk with the microfocusing optics and the mask disk with the pinhole diaphragms.
  • the sensor surface of the camera 613 and the mask disk located in the illuminated field 607 are in mutually conjugate plane.
  • the sensor surface of the camera 613 is illuminated with the same geometry as the geometric arrangement of pinhole diaphragms of the mask disk in the light field 607.
  • the geometry of the illuminated object field can be optimally adapted to the geometry of the sensor surface of a camera. This results in the advantages already described above.
  • illumination device 201 light source, point light source

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Beleuchtungseinrichtung (100, 200, 300, 600) für ein konfokales Mikroskop aufweisend eine Lichtquelle (101, 201, 301, 601) zur Erzeugung von Beleuchtungslicht, eine nachgeschaltete Kollimatoroptik (102, 202, 302, 602) zur Erzeugung eines kollimierten Beleuchtungsstrahlengangs sowie eine nachgeschaltete Kondensoroptik (106, 206, 209, 211, 307, 606) zur Erzeugung eines Leuchtfeldes (107, 212, 308, 607) in einer Leuchtfeldebene, eine in der Leuchtfeldebene befindliche drehbare Maskenscheibe mit einer geo-metrischen Anordnung von Lochblenden oder Mikrofokussieroptiken, die in dem Leuchtfeld (107, 212, 308, 607) zumindest zum Teil beleuchtet werden, wobei in dem kollimierten Beleuchtungsstrahlengang zwi- schen Kollimatoroptik (102, 202, 302, 602) und Kondensoroptik (106, 206, 209, 211, 307, 606) ein diffraktives optisches Element (104, 204, 304, 401, 604) angeordnet ist, das einen geometrischen Fluss des Beleuchtungsstrahlengangs mit vorgegebenem Winkelspektrum erzeugt, und wobei eine mechanische Modulationseinrichtung (405) vorhanden ist, um das diffraktive optische Element (401) in eine mechanische Bewegung zu versetzen und/oder wobei dem diffraktiven optischen Element (304) ein Phasenmodulator (306) nachgeschaltet ist und/oder wobei eine elektrische Modulationseinrichtung zur Modulation der Energieversorgung der Lichtquelle (101, 201, 301, 601) vorhanden ist.

Description

Beleuchtungseinrichtung für ein konfokales Mikroskop und Konfokalmikroskop
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Beleuchtungseinrichtung für ein konfokales Mikroskop sowie ein konfokales Mikroskop vom Spinning-Disk-Typ.
Stand der Technik
Aus dem Stand der Technik sind Konfokalmikroskope seit langem bekannt.
US 3013467 A (M. Minsky) beschreibt ein Konfokalmikroskop mit Tischscanner. Nach Erfindung der Nipkow-Scheibe ursprünglich zur Übertragung zweidimensionaler Bilddaten in Form eines elektrischen Signals wurden solche Nipkow-Scheiben in sogenannten konfokalen Mikroskopen vom Spinning-Disk-Typ eingesetzt. Dabei wird das Objektfeld mittels eines Rasters aus kleinen Lochblenden beleuchtet und das reflektierte oder im Rahmen eines Fluoreszenzprozesses emittierte Licht durch eben diese kleinen Lochblenden, auch Pinholes genannt, räumlich gefiltert. Das komplette Objektfeld wird mittels einer passenden Anordnung solcher Pinholes auf einer rotierenden Nipkow-Scheibe abgerastert. Die Nipkow-Scheibe befindet sich zwischen Kollektorlinse der Beleuchtungsquelle und dem Objektiv des Mikroskops. Diese Konfokalmikroskope erzielen im Gegensatz zu konventionellen Auflicht- Weitfeldmikroskopen eine Tiefenauflösung. Um diesen Effekt zu gewährleisten, darf die Dichte der Pinholes auf der rotierenden Scheibe nicht zu dicht gewählt werden, um ein Übersprechen zu verhindern. Dies hat im Gegenzug zur Folge, dass bei der
Ausleuchtung des Bildfeldes die Scheibe mit den Pinholes als Blende wirkt, wodurch ein großer Teil des Beleuchtungslichts nicht zur Probe transportiert wird. Großer Vorteil, insbesondere für biologische Anwendungen, ist jedoch, dass die Probe während der Untersuchung stationär bleibt. Zur Abhilfe des genannten Lichtverlustes schlägt US 5717519 A (Yokogawa Electric Corporation) ein Spinning-Disk-Mikroskop mit Mikrofokussieroptiken vor, welche das Beleuchtungslicht auf die einzelnen Pinholes fokussieren. Mittels solcher Mikroskope lässt sich eine Echtzeit-Vollbild- Videobeobachtung von Proben realisieren. Zur Beleuchtung von Spinning-Disk-Mikroskopen wird im Allgemeinen Laserlicht verwendet, um eine genügend hohe Intensität des Beleuchtungslichts im Objektfeld zu erreichen. Bei einem Spinning-Disk-Mikroskop gemäß Yokogawa werden zwei drehbare Maskenscheiben vom Nipkow-Typ übereinander und mit ihren Öffnungen exakt zueinander ausgerichtet verwendet. Die obere Scheibe enthält statt der Pinholes mehrere Zehntausend Mikrolinsen bzw. Mikrofokussieroptiken, von denen jede den kollimierten Laserstrahl auf das entsprechende Pinhole der zweiten, unteren Scheibe fokussiert. Die Mikrolinsen erhöhen den Durchsatz von Beleuchtungslicht von bisher einigen Prozent auf fast 50%. Zwischen den beiden Scheiben befindet sich ein dichromatischer Strahlteiler, sodass von der unteren Scheibe reflektiertes oder gestreutes Licht nicht als unerwünschte Hintergrundstrahlung den Detektor erreicht. Beim Beleuchten des Objektfeldes werden typischerweise etwa tausend solche
Pinholes gleichzeitig beleuchtet. Die Pinholes befinden sich in einer vorbestimmten geometrischen Anordnung auf der Scheibe vom Nipkow-Typ (in dieser Anmeldung auch als Maskenscheibe bezeichnet). Durch die vorbestimmte geometrische
Anordnung der Pinholes kann eine Bildverschmierung vermindert und eine
gleichförmige Objektfeldbeleuchtung gesichert werden.
Gemäß US 7580171 B2 wird bei einem solchen Spinning-Disk-Mikroskop gemäß Yokogawa in den Strahlengang zwischen der Maskenscheibe mit den Pinholes und der Maskenscheibe mit den Mikrofokussieroptiken eine optische Anordnung eingebracht, die einen Unendlichraum erzeugt, in dem der dichromatische Strahlteiler angeordnet wird. Schließlich ist aus US 8275226 B2 eine Beleuchtung mittels einer Multimode-Glasfaser bekannt, um die Mikrofokussieroptiken bei den genannten Spinning-Disk-Mikroskopen vom Yokogawa-Typ mit einem angepassten geometrischen Fluss (auch Lichtleitwert, engl.: "etendue") auszuleuchten. Hierzu wird beispielsweise Licht mehrerer
Laserstrahlquellen über eine Kondensoroptik in eine Multimode-Glasfaser
eingekoppelt. Mittels eines Diffusors oder einer zeitabhängigen Manipulation der Faser, z. B. mittels Piezo-Elementen zur Dehnung, wird die Phase des kohärenten Laserlichts moduliert, um störende Interferenzen im Bild zu vermeiden. Das aus der Glasfaser austretende Licht wird mittels einer Kondensoroptik auf die Mikrofokussieroptiken der oberen Maskenscheibe gerichtet. Dieser Aufbau hat jedoch den Nachteil, dass der Austausch einer Glasfaser mit sehr viel Aufwand verbunden ist. Insofern ist der durch die Einkopplung in die Multimode-Glasfaser generierte geometrische Fluss durch die beiden Parameter, Kerndurchmesser und numerische Apertur der Glasfaser festgelegt. In US 2016/0231550 A1 ist eine Beleuchtungsanordnung für mikrofokussierende multifokale Konfokalmikroskope genannt, bei denen eine nicht-Gauß'sche
Ausleuchtung des Sehfelds erreicht wird. Dabei ist jedoch bei der Verwendung diffraktiv optischer Elemente keine Lösung für das Problem der entstehenden sogenannten Speckies genannt, die im Bildfeld bei Verwendung räumlich kohärenten Beleuchtungslichts als Interferenzartefakte auftreten
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Beleuchtungseinrichtung für ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop anzugeben, mit der ein gewünschter
geometrischer Fluss zur Beleuchtung einer drehbaren Maskenscheibe flexibel und mit möglichst wenig Aufwand und bei Vermeidung der genannten Interferenzartefakte (Speckies) im Bildfeld generiert werden kann.
Beschreibung der Erfindung Erfindungsgemäß wird eine Beleuchtungseinrichtung für ein konfokales Mikroskop und ein entsprechendes konfokales Mikroskop gemäß der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Erfindungsgemäß wird eine Beleuchtungseinrichtung für ein konfokales Mikroskop vorgeschlagen, welches aufweist: Eine Lichtquelle zur Erzeugung von
Beleuchtungslicht, wobei insbesondere ein Laser- oder ein an eine Singlemode- Glasfaser gekoppelter Laser als Lichtquelle verwendet wird, eine der Lichtquelle nachgeschaltete Kollimatoroptik zur Erzeugung eines kollimierten
Beleuchtungsstrahlengangs sowie eine der Kollimatoroptik nachgeschaltete
Kondensoroptik zur Erzeugung eines Leuchtfeldes in einer Leuchtfeldebene. Weiterhin befindet sich in der Leuchtfeldebene eine bewegliche, insbesondere drehbare
Maskenscheibe mit einer geometrischen Anordnung von Lochblenden (Pinholes) oder Mikrofokussieroptiken, die in dem Leuchtfeld zumindest zum Teil beleuchtet werden. Zwischen Kollimator- und Kondensoroptik ist in dem kollimierten
Beleuchtungsstrahlengang ein diffraktives optisches Element, auch als Engineered Diffuser bezeichnet, angeordnet, das einen geometrischen Fluss des
Beleuchtungsstrahlengangs mit vorgegebenem Winkelspektrum erzeugt.
Bei dem diffraktiven optischen Element handelt es sich beispielsweise um eine Streuscheibe (Polymerplatte) mit eingeprägten vorgegebenen Mustern, wodurch die räumliche Verteilung der durch Streuung bzw. Beugung an diesen Mustern
abgegebenen Lichtintensität in der gewünschten Art und Weise geformt werden kann. Aus dem Stand der Technik sind beispielsweise Engineered Diffusers zur
Homogenisierung eines Beleuchtungsstrahlengangs oder zur Erzeugung
schmalwinkliger oder weitwinkliger rechteckiger Beleuchtungsfelder oder zur
Erzeugung gaußförmiger oder sogenannter "flat-top" Beleuchtungsfelder bzw.
Intensitätsprofilen bekannt. Es hat sich gezeigt, dass der Einsatz solcher diffraktiver optischer Elemente allein es erlaubt, den geometrischen Fluss, also den Lichtleitwert (engl, "etendue"), des Beleuchtungsstrahlengangs auf die Maskenscheibe von konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopen flexibel und in technisch einfacher Weise an die jeweilige Aufgabenstellung angepasst zu generieren. Beispielsweise ist es insbesondere möglich, wie bereits erwähnt, von Kegeln abweichende Spektren, insbesondere eine im Fernfeld rechteckige Winkelverteilung mit relative scharfen Kanten zu generieren. Die Schärfe der Kanten sowie die
Ausdehnung des Spektrums im Winkelraum sind mit der Struktur des diffraktiv optischen Elements bestimmbar.
Da der Austausch von diffraktiven optischen Elementen im Beleuchtungs-strahlengang unkompliziert möglich ist, ist es erfindungsgemäß möglich, je nach Anwendungsfall einen geeigneten geometrischen Fluss zu erzeugen. Vorzugsweise ist hierbei das von dem diffraktiven optischen Element erzeugte Winkelspektrum an die Geometrie eines auszuleuchtenden Objektfeldes des Mikroskops und/oder eines Detektionselements des Mikroskops angepasst. Die Beleuchtung der Maskenscheibe erfolgt insbesondere in einer Köhlerschen Beleuchtungsanordnung von der Position des diffraktiv optischen Elements aus. Das heißt, dass das Winkelspektrum des diffraktiv optischen Elements die Form und Größe des ausgeleuchteten Leuchtfeldes vorgibt, wohingegen der Durchmesser des auf das diffraktiv optische Element auftreffenden kollimierten Beleuchtungsstrahlengangs/Laserstrahls die Beleuchtungsapertur bestimmt. Dadurch ist es möglich, durch die passende Wahl des diffraktiv optischen Elements bzw. seines Winkelspektrums das beleuchtete Leuchtfeld vorzugeben, ohne signifikante Einbußen an Beleuchtungslichtstärke, wie z.B. bei der Verwendung einer Leuchtfeldblende in Kauf nehmen zu müssen. Eine Kippung des diffraktiv optischen Elements kommt einer Dezentrierung des Leuchtfelds gleich.
Insbesondere bestimmt die Geometrie des ausgeleuchteten Leuchtfeldes auch diejenige des im weiteren Verlauf bei einem Spinning-Disk-Mikroskop beleuchteten Objektfeldes. Da sich das Detektionselement, zumeist eine Kamera, und die
Maskenscheibe in zueinander konjugierten Ebenen befinden, wird im weiteren Verlauf auch die Sensorfläche des Detektionselements mit derselben Geometrie beleuchtet. Hierdurch ergibt sich als weiterer Vorteil der Erfindung, dass das von dem diffraktiven optischen Element erzeugte Winkelspektrum an die Geometrie des
Detektionselements, also insbesondere an die Geometrie der Kamera-Sensorfläche, angepasst werden kann, wodurch alles Licht von der Probe auf das Detektionselement trifft und die Probe nicht mit höherer Intensität beleuchtet werden muss als unbedingt notwendig (dies wäre etwa der Fall, wenn eine rechteckige Sensorfläche nur in Form einer eingeschriebenen Kreisfläche beleuchtet wird).
Da bei den marktüblichen Spinning-Disk-Mikroskopen meist (auch) Kameras zur Beobachtung und Dokumentation eingesetzt werden, deren Sensorflächen rechteckig sind, ist es besonders vorteilhaft, wenn das von dem diffraktiven optischen Element erzeugte Winkelspektrum eine rechteckige Winkelverteilung aufweist.
Das diffraktive optische Element umfasst (oder besteht aus) mindestens einer
Streuscheibe und/oder mindestens einem räumlichen Lichtmodulator und/oder mindestens einem künstlichen Hologramm. Bei der oder den Streuscheiben handelt es sich um die bereits erwähnten Engineered Diffusers, die in transmissiver oder reflektiver Form ausgestaltet sein können. Bei den räumlichen Lichtmodulatoren (engl.: "Spatial Light Modulator, SLM") handelt es sich um aus dem Stand der Technik bekannte Einrichtungen zur räumlichen Modulation von Licht. Beispielsweise umfassen solche SLMs Mikrospiegelarrays oder transmissive oder reflektive Flüssigkristall- Displays. Schließlich sind auch künstliche Hologramme für die vorliegende Anwendung geeignet. Bei derartigen Hologrammen ist die relative Phasenlage zweier
transmittierter bzw. reflektierter Teilbündel zueinander vorgegeben. Das diffraktive optische Element kann hierbei ein oder mehrere Einzelelemente einer der genannten Arten oder aber auch Mischformen der genannten Arten aufweisen. Durch Austausch solcher Elemente kann das diffraktive optische Element variabel gestaltet werden, womit der Vorteil der leistungsneutralen Wahl der Leuchtfeldgeometrie angepasst an die jeweilige Aufgabenstellung optimal genutzt werden kann. Insbesondere kann das Leuchtfeld, wie oben beschrieben, an den Detektionsbereich der verwendeten Kamera angepasst werden. Dies ist besonders dann vorteilhaft, wenn hohe
Detektionsgeschwindigkeiten sowohl aufgrund der Auslesegeschwindigkeiten einen kleinen Auslesebereich der Kamera erfordern, als auch aufgrund der kurzen Belichtungszeiten eine Konzentration des Beleuchtungslichts auf das Sehfeld notwendig machen.
Hierzu ist vorzugsweise eine Wechselvorrichtung vorhanden, mittels derer das diffraktive optische Element aus dem Beleuchtungsstrahlengang heraus oder in diesen hinein gebracht werden kann. Besteht das diffraktive optische Element aus mehreren der genannten Einzelelemente, so ist die Wechselvorrichtung vorzugsweise auch dazu eingerichtet, solche Einzelelemente des diffraktiven optischen Elements aus den Beleuchtungsstrahlengang heraus oder in diesen hinein zu führen. Die Wechselung kann dabei manuell oder motorisch, beispielsweise mittels eines motorisierten
Schlittens erfolgen.
Bei der bevorzugten Verwendung von Laserlicht als Beleuchtungslicht bei der erfindungsgemäßen Beleuchtungseinrichtung werden im Bildfeld aufgrund der räumlichen Kohärenz des Laserlichts die oben genannten Interferenzartefakte, sogenannte Speckies, hervorgerufen. Durch schnelle Modulation des diffraktiven optischen Elements können die räumliche Kohärenz verringert und damit die genannten Interferenzartefakte vermieden werden. Hierzu ist in einer ersten Alternative eine mechanische Modulationseinrichtung vorhanden, um das diffraktive optische Element in eine mechanische Bewegung zu versetzen. Hierbei ist es sinnvoll, wenn die mechanische Bewegung eine oszillierende Bewegung ist. Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Bewegungsrichtung senkrecht zur optischen Achse des
Beleuchtungsstrahlengangs steht. Beispielsweise kann also das diffraktive optische Element eine schnelle translatorische Vibrationsbewegung orthogonal zur optischen Achse ausführen. Diese Art der Modulation hat im Gegensatz zu einer rotatorischen Bewegung den Vorteil, dass ein nicht-zylindersymmetrisches Beleuchtungsprofil, wie beispielsweise der Sensorfläche oder einer gewählten Region of Interest einer in der Detektion des gesamten Systems verwendeten Kamera angepasst, erhalten bleibt. Insbesondere ist bei den im Rahmen vorliegender Erfindung behandelten Spinning- Disk-Mikroskopen, die Bildraten von 2 kHz erreichen, zu beachten, dass die
Randomisierung der Phase des Beleuchtungslichts innerhalb der entsprechenden Belichtungszeit des Abbildungssystems erfolgt. Die hier vorgeschlagene translatorische Bewegung des diffraktiven optischen Elements ist zur Randomisierung der Phase auf den genannten Zeitskalen besonders gut geeignet. Um die Position des Leuchtfeldes konstant zu halten, ist eine entsprechende Führung bei der genannten mechanischen Modulationseinrichtung notwendig, die ein Verkippen des diffraktiven optischen Elements gegenüber der optischen Achse der
Beleuchtungsanordnung verhindert. In einer Ausführungsform kann diese Führung eine Linearführung oder eine Parallelogrammführung sein. In einer weiteren
Ausführungsform kann diese Führung als Festkörpergelenk ausgeführt sein.
Zur schnellen translatorischen Bewegung, die zweckmäßigerweise den schon erwähnten oszillatorischen Charakter hat, stehen unterschiedlich Antriebsarten zur Verfügung, um die oben genannten Zeitkonstanten zu gewährleisten. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist dieser Antrieb durch einen Exzenter ausgeführt, der entweder über Druck, über einen Mitnehmer oder einen Hebel mit der Führung des diffraktiven optischen Elements in der mechanischen Modulationseinrichtung verbunden ist und der direkt auf der Achse eines Motors über einen Riemen angetrieben wird. In einer weiteren Ausführungsform kann diese translatorische Oszillationsbewegung durch einen Piezo-Antrieb erfolgen. In einer wiederum weiteren Ausführungsform kann der Antrieb mittels einer Schwingspule oder einer
elektromagnetischen Ankopplung realisiert sein.
Um zu vermeiden, dass die von der mechanischen Modulationseinrichtung erzeugten Bewegungen bzw. Schwingungen auf die übrigen Komponenten der
Beleuchtungseinrichtung übertragen werden, ist es zweckmäßig, die zu modulierende Baugruppe mit dem diffraktiven optischen Element schwingungsmäßig vom übrigen Beleuchtungs- und Abbildungssystem zu entkoppeln oder zu isolieren. Dies kann beispielsweise durch eine passende Aufhängung oder durch
schwingungsabsorbierende Elemente im jeweiligen Verbindungsbereich erfolgen. In einer zweiten Alternative kann alternativ oder zusätzlich zur genannten
mechanischen Modulationseinrichtung ein Phasenmodulator als separates Bauteil dem diffraktiven optischen Element nachgeschaltet sein. Insbesondere kann in diesem Fall das diffraktiv optische Element stationär verbleiben. Als Phasenmodulator eignet sich beispielsweise eine rotierende Streuscheibe, insbesondere mit wenig stark
ausgeprägtem Winkelspektrum.
Eine weitere zusätzliche oder alternative Möglichkeit der Vermeidung von kohärenten Interferenzartefakten ist die Modulation des Stroms bzw. allgemeiner der
Energieversorgung an einer Lichtquelle, insbesondere Diodenlaserquelle, welche eine Verschiebung der Lichtfrequenz und damit eine Reduktion der Kohärenz zur Folge hat.
Wie bereits oben erwähnt, ist die Realisierung einer Köhlerschen
Beleuchtungsanordnung durch die erfindungsgemäße Beleuchtungseinrichtung von Vorteil. In der einfachsten Ausführungsform kann die Köhlersche
Beleuchtungsanordnung mittels eines einzigen abbildenden Elements dargestellt werden, in dessen hinteren Brennebene das diffraktive optische Element angeordnet ist, wohingegen in der vorderen Brennebene das Leuchtfeld entsteht. Durch Einführung einer Relay-Optik in die erfindungsgemäße Beleuchtungseinrichtung, insbesondere in deren Kondensoroptik, in Form eines Galilei-Fernrohres, kann die Köhlersche
Beleuchtungsanordnung über eine Zwischenpupille verfügen. Hierbei kann die Größe der Zwischenpupille mittels der entsprechenden Zusatzlinsen der Relay-Optik passend gewählt werden. Weiterhin wird auf diese Weise das Leuchtfeld passend aufgeweitet. Desweiteren verfügt zur Realisierung unterschiedlicher Strahldurchmesser bei der Beleuchtung des diffraktiven optischen Elements die Kollimatoroptik
zweckmäßigerweise über eine schaltbare Optik zur Anpassung des Durchmessers des Beleuchtungsstrahlengangs. Bei dieser schaltbaren Optik kann es sich bspw. um eine Anordung zum Austausch des Kollimators handeln, der einen kollimierten
Beleuchtungsstrahlengang mit vorgegebenem Strahlendurchmesser erzeugt. Alternativ können schaltbare Fernrohr-Optiken oder Afokal-Optiken zur Erzeugung eines gewünschten Beleuchtungsstrahlengangdurchmessers in der Beleuchtungseinrichtung als schaltbare Optik zur Anpassung des Durchmessers des
Beleuchtungsstrahlengangs vorgesehen sein. Derartige Optiken eignen sich zur Anpassung des Durchmessers des Beleuchtungsstrahlengangs an die Geometrie der Lochblenden oder Mikrofokussieroptiken einer im Leuchtfeld befindlichen
Maskenscheibe. In der bevorzugten Köhlerschen Beleuchtungsanordnung entstehen nämlich, falls im Leuchtfeld ein Array von Lochblenden oder Mikrofokussieroptiken angeordnet ist, in deren Brennebene Bilder des Ortsspektrums des Beleuchtungslichts am Ort des diffraktiven optischen Elements, also des Strahlprofils, mit dem dieses Element beleuchtet wird. Durch Austausch der Scheibe oder durch Nutzung eines mit anderen Lochgrößen versehenen radialen Bereichs auf derselben Scheibe kann die Größe der beleuchteten Lochblenden- bzw. Mikrofokussieroptiken geändert werden. In diesem Fall ist es zweckmäßig, den Strahldurchmesser, mit welchem das diffraktive optische Element beleuchtet wird, entsprechend anzupassen. Dies vermeidet insbesondere den Verlust von Beleuchtungslicht durch die Blendenwirkung der Lochblenden bzw. Mikrofokussieroptiken der Maskenscheibe.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein konfokales Mikroskop vom Spinning-Disk-Typ mit einer erfindungsgemäßen Beleuchtungseinrichtung, wie sie oben ausführlich geschildert ist. Wie bereits eingangs erwähnt, verfügt ein Spinning-Disk-Mikroskop über eine Maskenscheibe vom Nipkow-Typ, die im Leuchtfeld der
Beleuchtungseinrichtung angeordnet ist. In der Weiterentwicklung nach Yokogawa befindet sich im Leuchtfeld eine Maskenscheibe mit identischer geometrischer Anordnung von Öffnungen, in denen Mikrofokussieroptiken angeordnet sind, die das Beleuchtungslicht in die Pinholes einer dahinter angeordneten Maskenscheibe fokussieren. In beiden Fällen ist hinter der Maskenscheibe vom Nipkow-Typ die Tubusoptik und das Objektiv des konfokalen Mikroskops geschaltet. Entsprechend der Geometrie des Leuchtfeldes wird ein Objektfeld auf der Probe beleuchtet. Von dort reflektiertes, transmittiertes oder im Rahmen einer Floureszenzanregung emittiertes Licht gelangt über das Objektiv und die Tubusoptik durch dieselben Öffnungen der Maskenscheibe(n) auf einen im Beleuchtungsstrahlengang befindlichen dichromatischen Teiler. Auf diese Weise kann das von der Probe kommende Licht ausgekoppelt und einem Detektionselement, in der Regel einer Kamera, zugeführt werden. Durch Bewegung, insbesondere Drehung der Maskenscheibe(n) kann der beleuchtete Bereich auf der Probe abgescannt werden.
Bei einem derartigen konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop können durch Einsatz der erfindungsgemäßen Beleuchtungseinrichtungen die oben genannten Vorteile erzielt werden. Die in Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Beleuchtungseinrichtung geschilderten Vorteile und Ausführungsformen gelten in analoger Weise für das erfindungsgemäße konfokale Mikroskop.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben. Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen
Beleuchtungseinrichtung in schematischer Ansicht; Figur 2zeigt eine zweite Ausführungsform einer erfindungsgemäßen
Beleuchtungseinrichtung mit einer Relay-Optik in schematischer Ansicht;
Figur 3zeigt die Ausführungsform gemäß Figur 1 mit einem weiteren optischen Element zur Phasenmodulierung; Figur 4zeigt eine Ausführungsform einer Wechselvorrichtung für diffraktive optische Elemente in einer erfindungsgemäßen Beleuchtungseinrichtung;
Figur 5zeigt eine Übersicht über die typischen Elemente eines konfokalen Mikroskops vom Spinning-Disk-Typ in schematischer Ansicht und
Figur 6zeigt die wesentlichen optischen Elemente eines konfokalen Mikroskops vom Spinning-Disk-Typ mit einer erfindungsgemäßen Beleuchtungseinrichtung in der Ausführungsform gemäß Figur 1 .
Figur 1 zeigt in schematischer Ansicht eine Ausführungsform einer
Beleuchtungseinrichtung 100 für ein konfokales Mikroskop mit einer Lichtquelle 101 , insbesondere einer Punktlichtquelle, insbesondere einem Laser- oder dem Ausgang einer Singlemode-Faser, die an einen Laser gekoppelt ist, zur Erzeugung von Beleuchtungslicht. Weiterhin mit einer nachgeschalteten Kollimatoroptik 102 zur Erzeugung eines kollimierten Beleuchtungsstrahlengangs. Die Anordnung aus Punktlichtquelle 101 und Kollimator 102 kann auch als Lichtquelle 103 für kollimiertes Licht betrachtet werden. Im weiteren Verlauf des Beleuchtungsstrahlengangs befindet sich eine der Kollimatoroptik 102 nachgeschaltete Kondensoroptik 106 zur Erzeugung eines Leuchtfeldes 107 in einer entsprechenden Leuchtfeldebene. Zwischen
Kollimatoroptik 102 und Kondensoroptik 106 befindet sich ein diffraktives optisches Element 104. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel handelt es sich bei diesem diffraktiven optischen Element 104 insbesondere um eine Streuscheibe mit
Modulationsanordnung ("Engineered Diffuser"). Das Element 104 befindet sich in der Aperturebene (oder zumindest im Wesentlichen in der Aperturebene) der
Beleuchtungsanordnung. Insgesamt handelt es sich um eine Köhlersche
Beleuchtungsanordnung ohne Zwischenpupille. Wie aus Figur 1 ersichtlich, leuchtet jeder (beleuchtete) Punkt des diffraktiven optischen Elements 104 das Leuchtfeld 107 aus. In der Leuchtfeldebene befindet sich eine drehbare Maskenscheibe (hier nicht dargestellt) mit einer geometrischen Anordnung von Lochblenden oder Mikrofokussieroptiken, die in dem Leuchtfeld 107 zumindest zum Teil, also abhängig von der erzeugten Leuchtfeldgeometrie, beleuchtet werden.
Das diffraktive optische Element 104 erzeugt einen geometrischen Fluss des
Beleuchtungsstrahlengangs mit einem vorgegebenen Winkelspektrum. Die
entsprechenden Orts- und Winkelspektren sind in Figur 1 ebenfalls dargestellt. Bei dem Ortsspektrum 105a auf der der Kondensoroptik 106 zugewandten Seite des diffraktiven optischen Elements 104 handelt es sich um ein Gaußsches Strahlprofil. Dementsprechend ist das Winkelspektrum 105b des Beleuchtungslichts nach
Beeinflussung durch das diffraktive optische Element 104 von rechteckiger Form. Durch die Kondensoroptik 106 als abbildendes Element erfahren die Spektren eine Fourier-Transformation. Somit entsteht in der Leuchtfeldebene das Ortsspektrum 108a des Beleuchtungslichts am Ort des Leuchtfeldes 107. Dieses Ortsspektrum 108a ist von rechteckiger Gestalt. Dementsprechend ist das Winkelspektrum 108b des
Beleuchtungslichts am Ort des Leuchtfelds 107 nunmehr von kreisförmiger Gestalt entsprechend einem Gauß-Profil. Durch entsprechende Wahl des diffraktiven optischen Elements 104 kann man das Ortsspektrum 108a optimal an die Geometrie eines Detektionselements des konfokalen Mikroskops, hier eine Kamera mit rechteckigem Sensorchip, angepasst werden.
In der gezeigten Anordnung als Köhler'sche Beleuchtung entstehen, falls im Leuchtfeld 107 ein Array aus Mikrofokussieroptiken angeordnet ist, in deren Brennebene Bilder des Ortsspektrums des Beleuchtungslichts am Ort des diffraktiv optischen Elements, also des Strahlprofils, mit dem dieses Element beleuchtet wird. Falls nun die Größe der Anregungs- und Detektionspinholes der Nipkow-Scheibe geändert wird, z. B. durch Nutzung eines mit anderen Lochgrößen versehenen radialen Bereichs auf der selben Scheibe oder durch Austauch der Scheibe, und die Apertur der Mikrofokussieroptiken beibehalten wird, ist es zweckmäßig, den Strahldurchmesser, mit welchem das diffrativ optische Element beleuchtet wird, entsprechend anzupassen. Dies kann
beispielsweise durch den Austausch des Faserkollimators 102 oder aber auch durch schaltbare Fernrohr-/ Afokal-Optiken geschehen. Dadurch kann eine effiziente Beleuchtung der Nipkow-Scheibe sichergestellt werden, ohne dass zu viel Licht am Anregungspinhole blockiert wird.
Figur 2 zeigt eine ähnliche Ausführungsform einer Beleuchtungseinrichtung 200 wie aus Figur 1 , jedoch als Köhlersche Beleuchtungsanordnung mit Zwischenpupille. Diese wird durch eine Relay-Optik realisiert, die hier eine Fernrohroptik zur Aufweitung des Leuchtfeldes darstellt.
Im Einzelnen weist die Beleuchtungseinrichtung 200 gemäß Figur 2 eine Lichtquelle 201 , insbesondere Punktlichtquelle, mit nachgeschalteter Kollimatoroptik 202 auf. Wiederum kann mit 203 eine Lichtquelle für kollimiertes Licht bezeichnet werden. Die Kondensoroptik ist in Figur 2 mit 206 bezeichnet. Zwischen Kollimatoroptik 202 und Kondensoroptik 206 befindet sich das diffraktive optische Element 204 mit
Modulationsanordnung, also beispielsweise der Engineered Diffuser aus Figur 1 . Die Relay-Optik weist Zusatzlinsen 209 und 21 1 für ein Fernrohrsystem auf. Durch diese Zusatzlinsen wird der Beleuchtungsstrahlengang aufgeweitet. 207 bezeichnet nunmehr das Zwischenbild des Leuchtfeldes, welches sich nach Strahlaufweitung in 212 befindet. 210 ist der Ort der Zwischenpupille der Beleuchtungsanordnung. Am Ort des Leuchtfelds 212 befindet sich die drehbare Maskenscheibe (hier nicht dargestellt) mit einer geometrischen Anordnung von Lochblenden oder Mikrofokussieroptiken, die in dem Leuchtfeld 212 zumindest zum Teil beleuchtet werden.
In Figur 2 sind die jeweiligen Orts- und Winkelspektren angegeben: Wiederum ist das Ortsspektrum des Beleuchtungslichts nach Beeinflussung durch das diffraktiv optische Element 204 mit 205a sowie das entsprechende Winkelspektrum mit 205b bezeichnet. Am Ort des Zwischenbildes 207 des Leuchtfelds entsteht das Ortsspektrum 208a sowie das dazugehörige Winkelspektrum 208b. Durch die Fernrohroptik 209, 21 1 wird das Zwischenbild des Leuchtfelds 207 in das Leuchtfeld 212 abgebildet. Das durch Strahlaufweitung vergrößerte Ortsspektrum am Ort des Leuchtfelds 212 ist mit 213a bezeichnet. Das entsprechende Winkelspektrum ist mit 213b bezeichnet. Durch die in Figur 2 gezeigte Einführung einer Relay-Optik kann die Köhlersche Beleuchtungsanordnung über eine Zwischenpupille verfügen, deren Größe passend gewählt werden kann. Dies kann beispielsweise dazu geeignet sein, um durch die Eintrittsfacette eines Retroreflektors zu treten (vergleiche Figur 12A, Bezugszeichen 104 der US 7580171 B2).
Figur 3 zeigt eine Ausführungsform einer Beleuchtungseinrichtung 300, die im
Wesentlichen der Beleuchtungseinrichtung 100 aus Figur 1 entspricht. Die (Punkt-) Lichtquelle ist hier mit 301 bezeichnet, die Kollimatoroptik mit 302, das diffraktive optische Element mit 304, die Kondensoroptik mit 307 und das Leuchtfeld mit 308. Die jeweiligen Orts- und Winkelspektren sind mit 305a, 305b sowie 309a und 309b bezeichnet. 303 bezeichnet eine Lichtquelle für kollimiertes Licht, hier Kombination aus Punktlichtquelle 301 und Kollimatoroptik 302. Im Vergleich zu Figur 1 weist die
Beleuchtungseinrichtung 300 einen Phasenmodulator 306 auf, der dem diffraktiven optischen Element 304 nachgeschaltet ist. Bei diesem Phasenmodulator 306 handelt es sich beispielsweise um eine rotierende Streuscheibe mit wenig ausgeprägtem Winkelspektrum. Auf diese Weise wird das Winkelspektrum 305b des diffraktiven optischen Elements 304 durch den nachgeschalteten Phasenmodulator 306 in seiner Geometrie nicht verändert, allerdings wird die zu Interferenzartefakten führende Kohärenz des Beleuchtungsstrahlengangs stark vermindert. Vorteil dieser Anordnung ist, dass das diffraktive optische Element 304 stationär sein kann (vergleiche nachfolgende Ausführungen zu Figur 4). Dass der Phasenmodulator 306 das
Winkelspektrum 309b am Ort des Leuchtfelds 308 nicht wesentlich verändert, zeigt Figur 3 (Ortsspektrum 309a bzw. Winkelspektrum 309b).
Figur 4 zeigt schematisch eine Ausführungsform einer Wechselvorrichtung 402 für ein diffraktives optisches Element 401 in einer perspektivischen Ansicht (Figur 4A) sowie im Längsschnitt (Figur 4B). Gleiche Elemente der Wechselvorrichtung 402 sind mit dem gleichen Bezugszeichen versehen. Die Wechselvorrichtung 402 dient dem Zweck, ein an den jeweiligen Anwendungsfall optimal angepasstes diffraktives optisches Element 401 flexibel in den Beleuchtungsstrahlengang einbringen zu können. Das diffraktive optische Element 401 kann dazu in eine Führung der Wechselvorrichtung eingeschoben bzw. wieder herausgeschoben werden. Um die Position des
Leuchtfeldes konstant zu halten, ist eine entsprechende Führung 404 vorteilhaft, die ein Verkippen des diffraktiven optischen Elements 401 gegenüber der optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs verhindert. In der gezeigten Ausführungsform handelt es sich um eine Führung 404 mit Festkörpergelenken.
Wie bereits oben erläutert, ist es zur Verminderung von Interferenzartefakten aufgrund der Kohärenz der Punktlichtquelle zweckmäßig, das diffraktive optische Element 401 in eine schnelle oszillatorische Bewegung zu versetzen. Hierfür ist eine mechanische Modulationseinrichtung 405 vorhanden, die die Wechselvorrichtung 402 und somit das diffraktive optische Element 401 in eine schnelle oszillierende Bewegung senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs versetzt. In der dargestellten
Ausführungsform ist der Antrieb der Modulationseinrichtung 405 durch einen Exzenter 403 ausgeführt, der durch einen Mitnehmer (Befestigung durch Schrauben, wie in Figur 4B dargestellt) mit der Führung 404 des diffraktiven optischen Elements 401 verbunden ist und direkt auf der Achse eines Motors angetrieben wird. In alternativen Ausführungsformen kann die translatorische Oszillationsbewegung auch durch einen Piezo-Antrieb erfolgen oder kann mittels einer Schwingspule oder mittels einer elektromagnetischen Ankopplung realisiert sein.
Figur 5 zeigt schematisch eine Übersicht über die Komponenten eines
Konfokalmikroskops mit all seinen typischen Komponenten. 500 bezeichnet das Gesamtsystem. Das eigentliche Mikroskop ist mit 505 bezeichnet. Die dazugehörige Beleuchtungseinrichtung ist mit 506 bezeichnet. Bei 508 handelt es sich um eine
Laserlichtquelle, die über eine Beleuchtungsfaser 507 mit der Beleuchtungseinrichtung 506 verbunden ist. 504 bezeichnet einen optischen Adapter für das Konfokalmikroskop 505 am Mikroskopstativ 501 . Innerhalb des Stativs 501 befindet sich der Objekttisch 502 mit einer zu untersuchenden Probe 503. Eine Steuereinheit 509 steht über entsprechende Verbindungsleitungen mit den einzelnen Komponenten 508, 506, 505 und 501 in Verbindung. Ein Rechner mit Steuer- und Darstellungsprogrammen ist mit 510 bezeichnet; auch er steht mit der Steuereinheit 509 in Verbindung. Die
Funktionsweise eines in Figur 5 dargestellten Systems 500 ist an sich hinlänglich bekannt und soll daher vorliegend nicht erläutert werden. Zur optimalen Generierung eines geometrischen Flusses des Beleuchtungsstrahlengangs mit einem
vorgegebenen Winkelspektrum, das insbesondere an die Geometrie der Sensorfläche der Mikroskopkamera angepasst ist, ist die Beleuchtungseinrichtung 506 entsprechend einer der Ausführungsformen gemäß den Figuren 1 bis 3 gestaltet. Anhand von Figur 6 soll nun die prinzipielle Funktionsweise der Komponenten der Beleuchtungseinrichtung 506 und des Konfokalmikroskops 505 näher betrachtet werden.
Figur 6 zeigt eine Ausführungsform einer Beleuchtungseinrichtung 600 entsprechend derjenigen aus Figur 1 . Mit 601 ist wiederum eine Punktlichtquelle, mit 602 eine Kollimatoroptik bezeichnet. Die Lichtquelle für kollimiertes Licht ist durch 603 dargestellt. 604 bezeichnet das diffraktive optische Element mit Modulationsanordnung (Engineered Diffuser). Nachgeschaltet ist wiederum die Kondensoroptik 606, durch die in einer Leuchtfeldebene ein Leuchtfeld 607 erzeugt wird. In diesem Leuchtfeld 607 ist bei einem Mikroskop vom Spinning-Disk-Typ eine drehbare Maskenscheibe mit einer geometrischen Anordnung von Lochblenden (Pinholes) angeordnet, die in dem Leuchtfeld 607 zumindest zum Teil beleuchtet werden. Beispielsweise handelt es sich bei dem ausgeleuchteten Bereich um ein rechteckiges Leuchtfeld. Eine zu
untersuchende Probe wird über eine Mikroskopoptik beleuchtet, sowie über dieselbe Mikroskopoptik insbesondere auf die gezeigte Kamera 613 abgebildet. Ein über ein bestimmtes Pinhole der sich drehenden Maskenscheibe beleuchteter Objektpunkt wird durch dasselbe Pinhole auf den Sensor der Kamera 613 abgebildet. Dies entspricht dem Grundprinzip der konfokalen Mikroskopie. Als wesentliche Komponenten der Mikroskopoptik ist die Tubus- und C-Mount-Optik 609 dargestellt. Das Objektiv ist mit 610 bezeichnet. Die Probe (nicht dargestellt) befindet sich in der vorderen Brennebene des Objektivs 610. Von einem Probenpunkt ausgehendes Licht, insbesondere
Fluoreszenzlicht, wird über dasselbe Pinhole der sich drehenden Maskenscheibe über eine Kameraoptik 612 auf die Sensorfläche einer Kamera 613 abgebildet. Zur
Auskopplung des Beobachtungsstrahlengangs befindet sich zwischen Kodensoroptik 606 und Leuchtfeld 607 ein dichromatischer Teiler 61 1 . Der dichromatische Teiler 61 1 verhindert zudem, dass Reflexe von der Maskenscheibe in den
Beobachtungsstrahlengang gelangen. In einer anderen Ausführungsform eines Konfokalmikroskops gemäß Yokogawa befindet sich im Leuchtfeld 607 eine sich drehende Maskenscheibe mit einer geometrischen Anordnung von Mikrofokussieroptiken. Jede dieser
Mikrofokussieroptiken fokussiert das Beleuchtungslicht in dahinter liegende Pinholes, die in derselben geometrischen Anordnung auf einer zweiten dahinter liegenden sich drehenden Maskenscheibe angeordnet sind. In diesem Anwendungsfall wäre der dichromatische Teiler 61 1 zwischen den beiden Maskenscheiben, also zwischen der Maskenscheibe mit den Mikrofokussieroptiken und der Maskenscheibe mit den Lochblenden, angeordnet. Aus Figur 6 ist ersichtlich, dass sich die Sensorfläche der Kamera 613 und die sich im Leuchtfeld 607 befindliche Maskenscheibe in zueinander konjungierten Ebene befinden. Somit wird die Sensorfläche der Kamera 613 mit derselben Geometrie beleuchtet wie die geometrische Anordnung von Lochblenden der Maskenscheibe im Leuchtfeld 607. Auf diese Weise kann die Geometrie des beleuchteten Objektfeldes optimal an die Geometrie der Sensorfläche einer Kamera angepasst werden. Hieraus ergeben sich die bereits oben geschilderten Vorteile.
Bezugszeichenliste:
100 Beleuchtungseinrichtung
101 Lichtquelle, Punktlichtquelle
102 Kollimatoroptik
103 Lichtquelle für kollimiertes Licht
104 diffraktives optisches Element
105a Ortsspektrum
105b Winkelspektrum
106 Kondensoroptik
107 Leuchtfeld
108a Ortsspektrum
108b Winkelspektrum
200 Beleuchtungseinrichtung 201 Lichtquelle, Punktlichtquelle
202 Kollimatoroptik
203 Lichtquelle für kollimiertes Licht
204 diffraktives optisches Element 205a Ortsspektrum
205b Winkelspektrum
206 Kondensoroptik
207 Zwischenbild des Leuchtfelds 208a Ortsspektrum
208b Winkelspektrum
209 Zusatzlinse
210 Zwischenpupille
21 1 Zusatzlinse
212 Leuchtfeld
213a Ortsspektrum
213b Winkelspektrum 300 Beleuchtungseinrichtung
301 Lichtquelle, Punktlichtquelle
302 Kollimatoroptik
303 Lichtquelle für kollimiertes Licht 304 diffraktives optisches Element
305a Ortsspektrum
305b Winkelspektrum
306 Phasenmodulator
307 Kondensoroptik
308 Leuchtfeld
309a Ortsspektrum
309b Winkelspektrum
401 diffraktives optisches Element 402 Wechselvorrichtung
403 Exzenterantrieb
404 Führung
405 Modulationseinrichtung 500 Gesamtsystem
501 Stativ
502 Objekttisch
503 Probe
504 optischer Adapter
505 konfokales Mikroskop
506 Beleuchtungseinrichtung
507 Beleuchtungsfaser
508 Laserlichtquelle
509 Steuereinheit
510 Rechner 600 Beleuchtungseinrichtung
601 Punktlichtquelle
602 Kollimatoroptik
603 Lichtquelle für kollimiertes Licht
604 diffraktives optisches Element
606 Kondensoroptik
607 Leuchtfeld
609 Tubus- und C-Mount-Optik
610 Objektiv
61 1 dichromatischer Teiler
612 Kameraoptik
613 Kamera
615 konfokales Mikroskop

Claims

Patentansprüche
1 . Beleuchtungseinrichtung (100, 200, 300, 600) für ein konfokales Mikroskop aufweisend
eine Lichtquelle (101 , 201 , 301 , 601 ) zur Erzeugung von Beleuchtungslicht, eine nachgeschaltete Kollimatoroptik (102, 202, 302, 602) zur Erzeugung eines kolli- mierten Beleuchtungsstrahlengangs sowie
eine nachgeschaltete Kondensoroptik (106, 206, 209, 21 1 , 307, 606) zur Erzeugung eines Leuchtfeldes (107, 212, 308, 607) in einer Leuchtfeldebene,
eine in der Leuchtfeldebene befindliche bewegliche Maskenscheibe mit einer geometrischen Anordnung von Lochblenden oder Mikrofokussieroptiken, die in dem Leuchtfeld (107, 212, 308, 607) zumindest zum Teil beleuchtet werden, wobei
in dem kollimierten Beleuchtungsstrahlengang zwischen Kollimatoroptik (102, 202, 302, 602) und Kondensoroptik (106, 206, 209, 21 1 , 307, 606) ein diffraktives optisches Element (104, 204, 304, 401 , 604) angeordnet ist, das einen geometrischen Fluss des Beleuchtungsstrahlengangs mit vorgegebenem Winkelspektrum erzeugt, und wobei eine mechanische Modulationseinrichtung (405) vorhanden ist, um das diffraktive optische Element (401 ) in eine mechanische Bewegung zu versetzen und/oder wobei dem diffraktiven optischen Element (304) ein Phasenmodulator (306) nachgeschaltet ist und/oder wobei eine elektrische Modulationseinrichtung zur Modulation der Energieversorgung der Lichtquelle (101 , 201 , 301 , 601 ) vorhanden ist.
2. Beleuchtungseinrichtung nach Anspruch 1 , wobei das von dem diffraktiven opti- sehen Element (104, 204, 304, 401 , 604) erzeugte Winkelspektrum an die Geometrie eines auszuleuchtenden Objektfeldes des Mikroskops und/oder eines Detektionsele- ments (613) des Mikroskops angepasst ist.
3. Beleuchtungseinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das von dem diffrakti- ven optischen Element (104, 204, 304, 401 , 604) erzeugte Winkelspektrum eine rechteckige Winkelverteilung aufweist.
4. Beleuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das diffrakti- ve optische Element (104, 204, 304, 401 , 604) mindestens eine Streuscheibe und/oder mindestens einen räumlichen Lichtmodulator und/oder mindestens ein künstliches Hologramm umfasst.
5. Beleuchtungseinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Wechselvorrichtung (402) vorhanden ist, mittels derer das diffraktive optische Element (401 ) aus dem Beleuchtungsstrahlengang heraus oder in diesen hinein gebracht werden kann.
6. Beleuchtungseinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mechanische Bewegung eine oszillierende Bewegung ist.
7. Beleuchtungseinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bewegungsrichtung der mechanischen Bewegung senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs steht.
8. Beleuchtungseinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mechanische Modulationseinrichtung (405) einen Exzenterantrieb (403) aufweist.
9. Beleuchtungseinrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Kollimatoroptik (102, 202, 302, 602) eine schaltbare Optik zur Änderung des Durchmessers des Beleuchtungsstrahlengangs aufweist.
10. Beleuchtungseinrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Kondensoroptik (206, 209, 21 1 ) eine Relay-Optik (209, 21 1 ) aufweist.
1 1 . Beleuchtungseinrichtung nach Anspruch 10, wobei die Relay-Optik (209, 21 1 ) eine Fernrohroptik (209, 21 1 ) zur Aufweitung des Leuchtfeldes aufweist oder darstellt.
12. Konfokales Mikroskop (615) vom Spinning-Disk-Typ mit einer Beleuchtungseinrichtung (600) gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
13. Konfokales Mikroskop (615) vom Spinning-Disk-Typ nach Anspruch 12 mit ei- ner im Beleuchtungsstrahlengang der beweglichen Maskenscheibe nachgeschalteten
Mikroskopoptik (609, 610) umfassend ein Mikroskopobjektiv (610) zur Ausleuchtung eines Objektfeldes sowie zur Abbildung einer dort anzuordnenden Probe, wobei durch das Objektiv (610) ein Beobachtungsstrahlengang erzeugt wird, sowie mit einem dem Objektiv im Beobachtungsstrahlengang nachgeschalteten dichromatischen Teiler (61 1 ) zur Auskopplung des Beobachtungsstrahlengangs und zur Zuleitung zu einem Detekti- onselement (613).
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