WO2018100628A1 - 金属高感度・高感受性の金属アレルギー動物モデルの樹立 - Google Patents

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WO2018100628A1
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dna encoding
restriction enzyme
base
dna
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康悦 小笠原
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国立大学法人東北大学
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    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for establishing a metal-sensitive allergy animal model with high sensitivity and sensitivity, and the obtained animal model, and a gene encoding a protein comprising a variable region and a constant region that can be used for the establishment of the animal model.
  • the present invention relates to a method and a cloning vector used for cloning.
  • Metal allergy research has failed to perform time-series pathological analysis and intervention research because there was no appropriate animal model.
  • Metal allergy is a delayed type allergy caused by T cells, and although metal allergy models have been created using mice so far, T cells that cause disease have not been identified, and their pathology is It was unknown.
  • Non-Patent Document 1 Previously, wild type mice were immunized with metal and measured for inflammation, but experimental animals have low metal sensitivity, and conventional animal models have low inflammation and are useful as metal allergy models. The property was not high (see Non-Patent Document 1).
  • the present inventor attempted to identify a specific T cell receptor by determining the amino acid sequence of the T cell receptor variable region of the T cell that reacts with palladium (Pb) used in dental metals.
  • the receptor was successfully cloned.
  • a transgenic mouse was prepared using this T cell receptor gene and inoculated with metal, and a highly sensitive experimental animal could be established.
  • the metal-specific T cell receptor gene-introduced mouse was confirmed to be a highly sensitive and highly sensitive experimental animal for metal.
  • the above-mentioned T cell that reacts with palladium is a T cell that has a specific reaction with palladium and has a reconstituted gene.
  • the full-length cloning of the gene encoding the T cell receptor involves the primer binding to the 5 ′ end of the DNA encoding the variable region (V region) and the 3 ′ end of the DNA encoding the constant region (C region). Can be performed using a pair of primers that bind to.
  • a gene encoding a specific T cell receptor having a specific reaction to palladium is selected from a repertoire of T cell receptors that have a large number of variations in the process of gene rearrangement. It cannot be cloned as a target.
  • the inventor previously incorporated a DNA encoding the constant region of the T cell receptor into a vector used for cloning, and used a primer that targets a part of the constant region and the variable region in the cloning vector.
  • the DNA encoding the variable region and the DNA encoding the constant region are ligated in-frame without causing a frame shift, and a specific nucleotide sequence having a specific base sequence is generated. It has been found that a gene encoding the full length of the constant region and variable region of a reactive T cell receptor can be cloned.
  • this vector it has become possible to clone a T cell receptor gene having a specific specificity as a result of gene rearrangement.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A metal allergy transgenic non-human animal model comprising a foreign DNA encoding a metal allergy-specific T cell receptor cloned from a T cell of a non-human animal that has developed metal allergy due to administration of metal.
  • [2] The metal allergy transgenic non-human animal model according to [1], wherein the non-human animal is a mouse.
  • [3] The metal allergy transgenic non-human animal model according to [1] or [2], wherein the metal is palladium.
  • the foreign DNA encoding the metal allergy-specific T cell receptor is the DNA encoding the T cell receptor ⁇ chain, which is TRAV8-1 * 01-TRAJ42 * 01 according to the IMGT nomenclature, and the amino acid of CDR3
  • a metal is administered to a non-human animal to cause metal allergy, T cells are collected from the non-human animal, DNA encoding a metal allergy-specific T cell receptor is cloned from the T cell, and the resulting metal
  • a method for producing a metal allergy transgenic non-human animal model comprising introducing DNA encoding an allergy-specific T cell receptor into a non-human animal as foreign DNA.
  • the foreign DNA encoding the metal allergy-specific T cell receptor is the DNA encoding the T cell receptor ⁇ chain, which is TRAV8-1 * 01-TRAJ42 * 01 by the IMGT nomenclature, and the amino acid of CDR3
  • a method for producing a metal allergy non-human animal model according to any one of [6] to [9], wherein the foreign DNA encoding a metal allergy-specific T cell receptor comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a full-length DNA encoding a protein comprising a variable region in which various mutations are found in the amino acid sequence and a constant region in which there are no or few mutations in the amino acid sequence in the form of a complex
  • a method for cloning full-length DNA in which DNA encoding a constant region is linked in frame to the 3 ′ end of the encoding DNA (i) preparing a cassette vector having the following characteristics (a) to (e) having a multicloning site in the DNA portion encoding the constant region, into which DNA encoding the majority of the constant region is incorporated: (a) a restriction enzyme recognition sequence having a restriction enzyme recognition sequence for inserting an insert DNA containing a DNA encoding a variable region into a multicloning site, the restriction enzyme recognition sequence forming a 3 ′ protruding end Is (b)
  • the restriction enzyme recognition sequence is composed of n bases (n is 4 to 6), the 3 ′ terminal base is X (X is A, T, G or C),
  • the 3 ′ protruding end after cleavage is a sequence consisting of n-2 bases;
  • the m-th base from the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region is the base X, and there is no base X from the 5 ′ end to the m ⁇ 1th, and the constant is incorporated into the cassette vector.
  • the DNA encoding most of the region is DNA in which the 5 'end lacking the m-1 base from the 5' end of the DNA encoding the constant region is the base X, where m is 1-10.
  • the reverse primer encodes the variable region.
  • a primer specific for the base sequence from the 3 ′ end to the 5 ′ end of DNA (iii)
  • the cassette vector is cleaved with the restriction enzyme, and the formed 3 ′ protruding end is blunted.
  • the base at the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region contained in the cassette vector becomes the base X.
  • a cloning method wherein an insert DNA containing a DNA encoding the variable region amplified in (ii) is inserted into the cassette vector in frame by ligation.
  • a protein comprising a variable region in which various mutations are found in the amino acid sequence and a constant region in which no variation is found in the amino acid sequence or a small number of constant regions form a complex, a T cell receptor, a B cell receptor, The cloning method of [13], which is an antibody.
  • a full-length DNA encoding a protein comprising a variable region in which various mutations are found in the amino acid sequence and a constant region in which there are no or few mutations in the amino acid sequence in the form of a complex
  • a cloning cassette vector for cloning a full-length DNA in which a DNA encoding a constant region is linked in frame to the 3 ′ end of the encoding DNA, wherein the DNA encoding most of the constant region is A cloning cassette vector having the following characteristics (a) to (e) having a multiple cloning site in the DNA portion encoding the constant region: (a) a restriction enzyme recognition sequence having a restriction enzyme recognition sequence for inserting an insert DNA containing a DNA encoding a variable region into a multicloning site, the restriction enzyme recognition sequence forming a 3 ′ protruding end Is (b)
  • the restriction enzyme recognition sequence is composed of n bases (n is 4 to 6), the 3 ′ terminal base is X (X is A,
  • the 3 ′ protruding end after cleavage is a sequence consisting of n-2 bases;
  • the m-th base from the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region is the base X, and there is no base X from the 5 ′ end to the m ⁇ 1th, and the constant is incorporated into the cassette vector.
  • the DNA encoding most of the region is DNA in which the 5 'end lacking the m-1 base from the 5' end of the DNA encoding the constant region is the base X, where m is 1-10.
  • a restriction enzyme recognition sequence is formed by inserting a base into the 5 ′ side of the base X at the 5 ′ end of the DNA encoding most of the constant region of (c) incorporated in the cassette vector; as well as (e) In the cassette vector, there is no restriction enzyme recognition sequence for the restriction enzyme that forms the 3 ′ protruding end other than the multiple cloning site.
  • a protein comprising a variable region in which various mutations are found in the amino acid sequence and a constant region in which no variation is found in the amino acid sequence or a small number of constant regions form a complex, a T cell receptor, a B cell receptor, The cloning cassette vector of [17], which is an antibody.
  • the metal allergy animal model of the present invention can be used as a metal highly sensitive and highly sensitive animal, and enables time-series pathological analysis of metal allergy. It can be used for safety testing of new metal materials and metal biomaterials. It can also be used for intervention experiments for metal allergy, for example, treatment experiments with new drugs.
  • DNA encoding the constant region of the T cell receptor is incorporated in advance, and DNA encoding the variable region amplified using a primer targeting a part of the constant region and the variable region is linked to the cloning vector.
  • the DNA encoding the variable region and the DNA encoding the constant region are linked in-frame without causing a frame shift, and the constant of the T cell receptor having a specific base sequence and a specific reactivity is obtained.
  • the gene encoding the full length of the region and variable region can be cloned
  • the present invention is a method for establishing a metal allergic animal model of a metal highly sensitive and highly sensitive animal.
  • the present invention includes a metal allergy animal model established by the method.
  • Metal allergy develops when a small amount of metal dissolves and ionizes when it comes into contact with the skin or when the metal is transplanted into the body and binds to proteins in the body to become allergens.
  • the allergen is recognized as a foreign substance by a living body, and immunity against a combined substance of metal and protein is established.
  • the present invention includes a cloning vector for cloning a specific repertoire such as a T cell receptor (TCR).
  • TCR T cell receptor
  • Metal allergy animal model The metal allergy animal model of the present invention can be established and produced by introducing DNA encoding a T cell receptor (TCR) of a T cell that causes metal allergy into a non-human animal.
  • TCR T cell receptor
  • Non-human animals to be used are not limited, but mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, monkeys are preferable. Among these, a mouse is preferable.
  • DNA encoding the T cell receptor of the T cell that causes metal allergy can be obtained by the following method. That is, a metal is inoculated, transplanted or administered to a non-human animal to develop allergy, T cells are collected from the lymph node of the allergic non-human animal, and total mRNA is extracted and purified. Next, cDNA is synthesized from the total mRNA by reverse transcriptase to prepare a cDNA library. The prepared cDNA library is sequenced by a next-generation sequencer, and the T cell receptor repertoire is analyzed. A T cell receptor having a high frequency of appearance in metal allergic animals is determined to be a specific T cell receptor causing metal allergy. A metal allergy-specific T cell receptor involved in metal allergy is also referred to as a metal allergy pathogenic T cell receptor.
  • the full-length sequence of the T cell receptor is cloned.
  • a full-length sequence of the T cell receptor using a primer that binds to the 5 ′ end portion of the DNA encoding the variable region of the T cell receptor and a primer that binds to the 3 ′ end portion of the constant region of the T cell receptor. And is incorporated into a cloning vector to produce a full-length gene library encoding a T cell receptor.
  • the genes in this full-length gene library are sequenced again.
  • the T cell receptor having a high appearance frequency in the above T cell receptor repertoire analysis is used as a metal allergy specific T cell receptor, and a clone having the gene sequence of this T cell receptor is metal allergy specific.
  • the clone is selected as a T cell receptor clone, and the T cell receptor gene of this clone is introduced into a non-human animal.
  • the repertoire analysis of the T cell receptor can be performed using, for example, the IMGT / V-Quest tool (http://www.imgt.org/).
  • the full length gene of the T cell receptor is cloned again to prepare a library, from which metal allergy is induced.
  • a clone is selected that has the sequence of the T cell receptor involved.
  • the specific sequence of the metal allergy specific T cell receptor obtained by the repertoire analysis of the T cell receptor is obtained. Based on this, a metal allergy specific T cell receptor gene can be cloned.
  • the DNA encoding the T cell receptor may be both the DNA encoding the ⁇ chain of the T cell receptor and the DNA encoding the ⁇ chain, or any one of them. Moreover, both the DNA encoding the T cell receptor ⁇ chain and the DNA encoding the ⁇ chain may be used, or any one of them may be used. For example, a metal allergy non-human animal model can be established by introducing DNA encoding the ⁇ chain of the T cell receptor.
  • An example of an ⁇ chain clone of a metal allergy-specific T cell receptor is TRAV8-1 * 01-TRAJ42 * 01 defined by the gene nomenclature of IMGT (registered trademark) (the International GeneTics database).
  • the amino acid sequence of CDR3 of the clone is represented by ATLYSGGSNAKLT (SEQ ID NO: 1). Further, SEQ ID NO: 2 shows the base sequence of DNA encoding the LVDJC region (L is the leader sequence) of the clone.
  • the DNA encoding the metal allergy-specific T cell receptor thus cloned is introduced into a non-human animal.
  • a non-human animal into which DNA encoding a metal allergy-specific T cell receptor has been introduced is called a transgenic non-human animal.
  • a gene encoding a cloned T cell receptor is incorporated into an expression vector and introduced into an early embryo or a fertilized egg of the non-human animal.
  • DNA that is introduced into early embryos or fertilized eggs of non-human animals is linked to a promoter that can be expressed in non-human animal cells.
  • promoters that can be expressed include promoters derived from mammalian cells such as human CD2 promoter, CAG (chicken ⁇ -actin) promoter, PGK (phosphoglycerate kinase) promoter, EF1 ⁇ (elongation factor 1 ⁇ ) promoter, and cytomegalovirus. (CMV) promoters, simian virus 40 (SV40) promoters, retrovirus promoters, polyoma virus promoters, adenovirus promoters and other viral promoters.
  • an enhancer that enhances gene expression may be incorporated.
  • the T cell receptor gene to be introduced is operably linked to a promoter and introduced into a vector.
  • Any vector can be used as long as it can induce the expression of the transgene in the body of an animal, and a vector in which a promoter has been previously incorporated may be used.
  • a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector is preferable.
  • the vector may be injected (injected) into the pronucleus of the fertilized egg or the ovum of the early embryo.
  • the early embryo or fertilized egg may be obtained by artificial fertilization or fertilized by natural mating.
  • a non-human animal born from a temporary mother can be used as a metal allergy animal model.
  • the metal may be any metal that is prone to metal allergy, and examples of such metals include palladium, nickel, mercury, cobalt, tin, chromium, and alloys thereof.
  • Pathogenic T cells involved in palladium allergy obtained by administering palladium to non-human animals may be involved in allergy of other metals. Therefore, the metal allergy animal model obtained by introducing DNA encoding the T cell receptor of pathogenic T cells obtained by administering palladium is used not only as palladium but also as other metal allergy animal models. could be possible.
  • a pathogenic T cell involved in allergy is obtained, and a DNA encoding the T cell receptor of the T cell is cloned and introduced into a non-human animal.
  • a metal allergy animal model can be prepared. For example, a palladium allergy animal model, a nickel allergy animal model, etc. can be established.
  • the non-human animal metal allergy animal model of the present invention can be used for testing the metal's allergy-inducing ability and testing the safety of the metal.
  • various alloys are used as dental metals for materials such as inlays, crowns, bridges, and stents, and gold, silver, and palladium alloys (gold-silver-palladium alloys) are often used.
  • the alloy contains nickel or cobalt.
  • metals that cause metal allergies such as palladium may easily elute.
  • the metal may be eluted in vivo from an artificial joint including a metal part, a metal stent, or the like, thereby causing metal allergy.
  • the metals can be safely transplanted in the living body. Or it can be evaluated whether it can be embedded. For example, whether or not a metal is administered to the groin of a metal allergy non-human animal model that is a mouse, T cells involved in metal allergy are induced, and the metal is further administered to the footpad to cause swelling of the foot. You just have to observe. When swelling of the foot is caused, it can be determined that the administered metal may cause metal allergy.
  • An expression vector for cloning a protein repertoire having a variable region and a constant region and specifically recognizing an antigen In the present invention, a variable region in which various mutations are observed in the amino acid sequence and a mutation in the amino acid sequence are not observed.
  • the present invention includes a method for cloning a gene encoding a protein capable of recognizing an antigen containing a small number of constant regions in a complexed state, and a cloning vector used in the method.
  • This cloning method and the cloning vector used in the method are: It can be suitably used for cloning a gene of a T cell receptor having a specific specificity and a partially known variable region sequence, such as a metal allergy-specific T cell receptor.
  • Examples of such a protein include an antibody capable of recognizing an antigen, a T cell receptor (TCR), a B cell receptor (BCR), and the like.
  • Antibodies and B cell receptors include a heavy chain and a light chain, and are composed of two heavy chains and two light chains, each of which is composed of a variable region (V region) and a constant region (C region).
  • the T cell receptor is a dimer composed of an ⁇ chain and a ⁇ chain, or a ⁇ chain and a ⁇ chain, and each chain is composed of a variable region and a constant region.
  • variable region is encoded by a plurality of gene fragments (V (variable) region (V gene fragment), D (diversity) region and J (joining) region ( ⁇ chain, ⁇ chain), or V region and J region ( ⁇ chain)). , ⁇ chain), and a large number of repertoires through gene rearrangement.
  • V variable region
  • D diversity region and J
  • CDR complementarity determining region
  • Somatic mutations result in a larger number of repertoires, especially the CDR3 region is involved in antigen specificity and is prone to sequence variation and has a large sequence diversity.
  • DNA encoding a protein of a specific repertoire having the amino acid sequence can be cloned.
  • a protein having a variable region and a constant region undergoes gene rearrangement, and a DNA in which a variable region composed of a plurality of fragments (V, D and J, or V and J) and a constant region are combined and linked is obtained. It is formed.
  • V, D and J, or V and J fragments
  • the protein When the protein is an antibody, it has a different gene configuration for each antibody-producing cell, and when the protein is a T cell receptor or B cell receptor, it has a different gene configuration for each T cell or B cell.
  • a forward primer is designed at the 5 ′ end site of the variable region and a reverse primer at the 3 ′ end site of the constant region. Design and amplify by PCR.
  • this method is intended to amplify the sequence of the 5 ′ end site of the variable region and the 3 ′ end site of the constant region as targets. Cannot target sites that are prone to mutation. For this reason, it is not possible to efficiently clone DNA that has been rearranged and has a specific sequence, in particular, DNA that has a specific mutant sequence in the CDR3 region as a target.
  • a DNA encoding a variable region amplified by designing a primer for a specific sequence at a site susceptible to mutation in a cassette vector in which a DNA encoding a constant region is previously incorporated is frame-shifted. It is a method that allows cloning of a reconstructed full-length DNA encoding a protein with a specific specificity by inserting in-frame so that it does not occur.
  • the cloning method of the present invention is a full-length DNA encoding a protein comprising a variable region in which various variations are found in the amino acid sequence and a constant region in which no variation is found in the amino acid sequence or a small number of constant regions are formed in a complex. This is a cloning method for full-length DNA in which the DNA encoding the constant region is linked in frame to the 3 ′ end of the DNA encoding the variable region.
  • the cloning method of the present invention is performed by the following steps (i) to (iv).
  • the restriction enzyme recognition sequence is composed of n bases (n is 4 to 6), the 3 ′ terminal base is X (X is A, T, G or C), and depends on the restriction enzyme.
  • the 3 ′ protruding end after cleavage is a sequence consisting of n-2 bases.
  • the m-th base from the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region is the base X, and the base X does not exist from the 5 ′ end to the (m ⁇ 1) th. That is, the first X exists from the 5 ′ end to the mth.
  • DNA encoding most of the constant region incorporated in the cassette vector is DNA in which the 5 'end lacking the m-1 base from the 5' end of the DNA encoding the constant region is base X. is there.
  • m is 1 to 10, preferably 1 to 5. That is, DNA encoding most of the constant region incorporated in the cassette vector simultaneously functions as a multicloning site.
  • a restriction enzyme recognition sequence is formed by inserting a base into the 5 ′ side of the base X at the 5 ′ end of the DNA encoding most of the constant region of (c) incorporated in the cassette vector.
  • a forward primer consisting of 20 to 50 bases, preferably 20 to 30 bases specific to the base sequence from the 5 ′ end to the 3 ′ end of the DNA encoding the variable region, and the DNA encoding the constant region
  • Primer of reverse primer consisting of 20 to 50 bases, preferably 20 to 30 bases specific for the variable region part, especially the base part containing CDR3 part from the m-1st base to the 5 'side from the 5' terminal side
  • the reverse primer is a primer specific for the base sequence from the 3 ′ end to the 5 ′ end of the DNA encoding the variable region.
  • the variable region is preferably amplified from a leader sequence (L) (signal sequence) portion present on the 5 ′ side of the V region (V gene fragment) of the variable region. Therefore, a forward primer that is specific for the leader sequence (L) is used.
  • the base at the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region contained in the cassette vector becomes the base X.
  • the restriction enzyme recognition sequence is not present in the cassette vector other than the multicloning site so that the restriction enzyme used does not cleave sites other than the multicloning site.
  • a restriction enzyme recognition sequence is inherently present in the cassette vector, a mutation is added to the restriction enzyme recognition sequence so that the restriction enzyme is not digested.
  • one base in the restriction enzyme recognition sequence may be replaced with another base.
  • the DNA encoding the majority of the constant region functions as a multicloning site by artificially forming the restriction enzyme recognition sequence of the above restriction enzyme in the DNA encoding the majority of the constant region. That is, a plurality of bases are present on the 5 ′ side of the base X (X is A, T, C or G) at the 3 ′ end of the restriction enzyme recognition sequence that is inherently present in the DNA encoding most of the constant region. And a restriction enzyme recognition sequence may be formed in a form including X which is inherently present.
  • restriction enzymes that form 3 ′ protruding ends include PstI, SacI, KpnI, SphI, AstII, ApaI, BaeGI, BanII, BmtI, BsiHKAI, Bsp1286I, HaeII, NsiI, NspI, HhaI and the like.
  • the restriction enzyme recognition sequence of PstI is CTGCA ⁇ G ( ⁇ indicates the cleavage site).
  • n 6
  • a restriction enzyme recognition sequence is artificially formed in the form of the m-th base from the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region and including G unique to the constant region.
  • CTGCA may be added to the 5 ′ side of the unique G.
  • the restriction enzyme recognition sequence of SacI is GAGCT ⁇ C.
  • n 6
  • a restriction enzyme recognition sequence is artificially added in the form of the m-th base from the 5 ′ end of the constant region and including C specific to the constant region.
  • restriction enzyme recognition sequence used in the method of the present invention consists of n bases, n-2 3 ′ protruding ends are formed by cleavage with the restriction enzymes. That is, only one base remains on the 5 ′ side in the cleavage site of the restriction enzyme recognition sequence.
  • R A or G
  • K G or T
  • Y C or T
  • M A ⁇ or C
  • D A or G or T (not C)
  • H A or C or T (not G )
  • W A or T.
  • ⁇ indicates a cleavage site.
  • the 3 ′ protruding ends formed by the above restriction enzyme cleavage are blunted by cutting the 3 ′ protruding ends with a DNA polymerase having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity such as T4 DNA polymerase in the presence of dNTPs. It can be carried out.
  • ligation of DNA containing DNA encoding the variable region to the blunt-ended end can be performed using DNA ligase.
  • the cassette vector most of the DNA excluding a part on the 5 ′ end side of the DNA encoding the constant region is previously incorporated. There are few variations in the sequence of the constant region.
  • the T cell receptor there is one type for the ⁇ chain and two types for the ⁇ chain.
  • the ⁇ chain there are roughly five types of H chain, C ⁇ chain, C ⁇ chain, C ⁇ chain, C ⁇ chain and C ⁇ chain, and in the case of L chain, there are two types, ⁇ chain and ⁇ chain. Therefore, all T cell receptors or antibodies can be cloned by preparing a plurality of cassette vectors by incorporating DNAs encoding these constant regions into the cassette vector.
  • the cassette vector of the present invention can be prepared by introducing a DNA containing most of the constant region into a known cloning vector and forming the restriction enzyme recognition sequence of the restriction enzyme in the DNA.
  • these restriction enzyme recognitions Mutation is added to the base of the sequence so that it is not cleaved by the restriction enzyme.
  • Known vectors used for preparing the cassette vector of the present invention are not limited, and for example, pMXs-IRES-Puro Retroviral Vector (CELL BIOLABS, INC.) And the like can be used.
  • the base length of the forward primer and reverse primer for amplifying DNA encoding the variable region by PCR is a sequence consisting of 20 to 50 bases, preferably 20 to 30 bases, and 1 to several base sequences of the target gene. There may be one, preferably one or two mismatches, as long as it has a sequence capable of hybridizing under stringent conditions to the base sequence of the target gene.
  • the PCR extension reaction may be carried out by a known method using DNA polymerase under conditions usually used. For example, heating may be performed at 98 ° C. for 10 seconds, cooling at 60 ° C. for 30 seconds, and heating at 68 ° C. for 60 seconds may be repeated for about 30 cycles.
  • FIG. 4 shows a method for cloning full-length DNA encoding a protein having a variable region and a constant region of the present invention.
  • a T cell receptor is used as a protein having a variable region and a constant region.
  • PstI that recognizes CTGCA ⁇ G ( ⁇ indicates a cleavage site) as a restriction enzyme recognition sequence is used.
  • the present invention also includes a cloning cassette vector into which DNA encoding most of the constant region used in the above-described cloning method is incorporated.
  • the cloning cassette vector is a full-length DNA encoding a protein comprising a variable region in which various mutations are found in the amino acid sequence and a constant region in which no variation is found in the amino acid sequence or a small number of constant regions form a complex.
  • a cloning cassette vector for cloning a full-length DNA in which the DNA encoding the constant region is linked in frame to the 3 ′ end of the DNA encoding the variable region, wherein most of the constant region is A cloning cassette vector having the following characteristics (a) to (e) having a multicloning site in a DNA portion encoding a constant region, into which the encoding DNA is incorporated.
  • restriction enzyme recognition sequence having a restriction enzyme recognition sequence for inserting an insert DNA containing a DNA encoding a variable region into a multicloning site, the restriction enzyme recognition sequence forming a 3 ′ protruding end It is.
  • the restriction enzyme recognition sequence is composed of n bases (n is 4 to 6), the 3 ′ terminal base is X (X is A, T, G or C), and depends on the restriction enzyme.
  • the 3 ′ protruding end after cleavage is a sequence consisting of n-2 bases.
  • the m-th base from the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region is the base X, and the base X does not exist from the 5 ′ end to the (m ⁇ 1) th.
  • DNA encoding most of the constant region incorporated in the cassette vector is DNA in which the 5 'end lacking the m-1 base from the 5' end of the DNA encoding the constant region is base X. is there.
  • m is 1 to 10, preferably 1 to 5. That is, DNA encoding most of the constant region incorporated in the cassette vector simultaneously functions as a multicloning site.
  • a restriction enzyme recognition sequence is formed by inserting a base into the 5 ′ side of the base X at the 5 ′ end of DNA encoding most of the constant region of (c) incorporated in the cassette vector.
  • TCR receptor cDNA cloning RNA was extracted from regional lymph nodes from BALB / c mice that had been immunized and induced with palladium and developed allergies, and cDNA was synthesized to create a cDNA library.
  • a part of the cDNA library was analyzed by T cell receptor repertoire using a next-generation sequencer, and found to be TRAV8-1 * 01, TRaj42 * 01 (based on IMGT (registered trademark) nomenclature), CDR3 (ATLYSGGSNAKLT as the amino acid sequence) Became clear.
  • CDR3 is a part where the V region and J region are combined, the V region overlaps the J region. Accordingly, the J region coincidence rate does not reach 100% when examined by the IMGT (the International ImmunoGene Tics Information System) (registered trademark).
  • IMGT the International ImmunoGene Tics Information System
  • the full length sequence consists of LVDJC chains.
  • PCR was performed using the following primers. Since Pfu DNA polymerase is used, the PCR product has a blunt end.
  • the primer contains the leading partial leader sequence (L chain) of TRAV8-1 * 01.
  • the primer corresponds to the terminal end of the C chain.
  • the cloned LVDJC region was incorporated into a cloning vector (using a commercially available pCR (TM) -Blunt II-TOPO (registered trademark) Vector). This sequence was sequenced again and confirmed. The sequence is shown in FIG. 1 and SEQ ID NO: 2.
  • transgenic mouse The above-mentioned subcloned full-length TCR receptor was incorporated into an expression vector (VA vector) having a human CD2 promoter. This gene was transferred to a mouse fertilized egg (BDF1: C57BL / 6xDBA / 2 fertilized egg) to produce a transgenic mouse.
  • VA vector human CD2 promoter
  • FIG. 2 shows the structure of the vector used for producing the transgenic mouse.
  • mice were treated as follows. Sensitization: subcutaneous injections of 10mM PdCl 2 / 10 ⁇ g / ml LPS in 1 ⁇ PBS mixed solution was performed twice a week every other groin. At this time, 125 ⁇ L was administered to each inguinal region. Eliciting: A solution of 10mM PdCl 2 / 10 ⁇ g / ml 1 ⁇ PBS intradermally administered by 25 ⁇ L from the second sensitization, each footpad after 1 week.
  • FIG. 3 shows the results of the foot swelling in mice that induced the development of metal allergy.
  • BALB / Ca mice not introduced with a TCR receptor were administered with palladium under the same conditions as described above, and BALB / Ca mice not introduced with a TCR receptor were administered PBS.
  • FIG. 4 encodes a T cell receptor, which is a protein having a variable region and a constant region.
  • a method for cloning full-length DNA is shown.
  • PstI which recognizes CTGCA ⁇ G ( ⁇ indicates a cleavage site) as a restriction enzyme recognition sequence is used.
  • the single underlined portion including “ ⁇ ” indicates the base of the constant region
  • the double underlined portion including “ ⁇ ” indicates the unique base in the cassette vector.
  • FIG. 4A-1 shows the structure of full-length DNA encoding the T cell receptor.
  • the variable region portion is represented by L + V + D + J (L is a leader sequence existing on the 5 ′ side of the V region), and the constant region portion is represented by C.
  • CDR3 is present at the 3 ′ end of J.
  • the second G is first present from the 5 ′ end toward the 3 ′ end.
  • FIG. 4A-2 shows the DNA structure of a portion including DNA encoding a variable region amplified by PCR and the position of a primer used for amplifying this portion.
  • Amplification is performed using a reverse primer specific for the sequence including the variable region from the first (m-1) base from the 5 'end to the 5' end.
  • FIG. 4B shows the structure of a cassette vector in which a restriction enzyme recognition sequence is formed.
  • the cassette vector contains DNA consisting of bases other than the base at the 5 ′ end (sequence from the 5 ′ end to the m th (second) sequence), which is the majority of DNA encoding the constant region.
  • the base CTGCA is inserted into the 5 ′ side of the second base G from the 5 ′ end of the DNA encoding the constant region to form CTGCAG, which is a PstI restriction enzyme recognition sequence.
  • FIG. 4C shows the cassette vector shown in FIG. 4B cut with PstI.
  • the 3 ′ protruding end consists of 4 bases TGCA.
  • the sequence at the 3 ′ protruding end ACGT is removed.
  • FIG. 4D shows a state in which the DNA shown in FIG. 4A-2, which includes DNA encoding a variable region amplified by PCR and DNA containing a portion of DNA encoding a constant region, is linked to a cassette vector.
  • the DNA that contains the DNA encoding the variable region and a part of the DNA encoding the constant region is a DNA that encodes the constant region 5 'from the 5' end of the constant region 5 'to the 3' end. including.
  • DNA encoding the T cell receptor can be cloned.
  • a primer complementary to the DNA encoding the variable region is used as a reverse primer. If the amino acid sequence of the variable region of the T cell receptor to be cloned is known in advance, a reverse primer can be designed based on the sequence, so that the gene encoding the desired T cell receptor can be reliably identified. Can be cloned into.
  • the highly sensitive and highly sensitive animal of the present invention can be used for safety tests of new metal materials and metal biomaterials. It can also be used for intervention experiments for metal allergy, for example, treatment experiments with new drugs.

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Abstract

金属高感度・高感受性の金属アレルギー動物モデルの樹立法及び該樹立法により得られた動物モデルの提供、並びに可変領域と定常領域からなるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする方法及びクローニングに用いるクローニングベクターの提供。　金属の投与により金属アレルギーを発症した非ヒト動物のＴ細胞からクローニングした金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAを含む、金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。

Description

金属高感度・高感受性の金属アレルギー動物モデルの樹立
　本発明は、金属高感度・高感受性の金属アレルギー動物モデルの樹立法及び得られた動物モデル、並びに該動物モデルの樹立に利用し得る可変領域と定常領域からなるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする方法及びクローニングに用いるクローニングベクターに関する。
　従来、金属アレルギー研究は、適切な動物モデルが存在しなかったため、時系列的な病態解析や介入研究ができなかった。金属アレルギーは、Ｔ細胞が原因で起こる遅延型アレルギーであり、これまでマウスを用いて金属アレルギーモデルが作製されてはいたものの、疾患の原因となるＴ細胞が特定されておらず、その病態は不明であった。
　従来は、野生型マウスに金属を免疫して、その炎症の測定を行っていたが、実験動物は金属の感受性が低く、従来の動物モデルは・炎症の程度が低く、金属アレルギーモデルとしての有用性は高くなかった（非特許文献１を参照）。
Sato N et al., Clin Exp Allergy,2007;37(5):743-51
　本発明は、金属高感度・高感受性の金属アレルギー動物モデルの樹立法及び該樹立法により得られた動物モデルの提供を目的とする。さらに、本発明は該動物モデルの樹立に利用し得る可変領域（Ｖ領域）と定常領域（Ｃ領域）からなるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする方法及びクローニングに用いるクローニングベクターの提供を目的とする。
　金属アレルギーや、金属炎症は、年々増加傾向にありその対策が求められていた。これまで、金属アレルギーの研究は、適切な動物モデルが存在しなかったため、ヒト末梢血を用いた解析が行われていたが、時系列的な病態解析や介入実験の必要性から、金属に対して、高感度、高感受性実験動物の樹立が求められていた。しかし、疾患の原因となるＴ細胞が特定できていなかったため、高感度、高感受性実験動物は作製できていなかった。
　本発明者は、歯科金属で用いられているパラジウム（Pb)に反応するＴ細胞のＴ細胞受容体の可変領域のアミノ酸配列を決定することにより特異的Ｔ細胞受容体の特定を試み、Ｔ細胞受容体をクローニングすることに成功した。このＴ細胞受容体の遺伝子を用いて遺伝子導入マウスを作製し、金属を接種したところ、高感受性の実験動物を樹立することができた。該金属特異的Ｔ細胞受容体遺伝子導入マウスは、金属に対し、高感度、高感受性の実験動物であることを確認した。
　上記のパラジウムに反応するＴ細胞は、パラジウムに特異的反応を有する、遺伝子が再構成されたＴ細胞である。理論上、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子の全長のクローニングは、可変領域（Ｖ領域）をコードするDNAの5'末端に結合するプライマーと定常領域（Ｃ領域）をコードするDNAの3'末端に結合するプライマーのペアを用いて行うことができる。しかしながら、この方法では遺伝子の再構成の過程で多数のバリエーションを有するようになった多数のＴ細胞受容体のレパートリーの中からパラジウムに特異的反応を有する特定のＴ細胞受容体をコードする遺伝子を標的としてクローニングすることはできない。そこで、本発明者は、クローニングに用いるベクターにあらかじめＴ細胞受容体の定常領域をコードするDNAを組込んでおき、該クローニングベクターに定常領域の一部及び可変領域を標的とするプライマーを用いて増幅した可変領域をコードするDNAを連結することにより、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNAをフレームシフトを生じさせることなくインフレームで連結させ、特定の塩基配列を有し特定の反応性を有するＴ細胞受容体の定常領域と可変領域の全長をコードする遺伝子をクローニングすることができることを見出した。このベクターを用いることにより、遺伝子が再構成され特定の特異性を有するＴ細胞受容体遺伝子をクローニングすることが可能になった。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　金属の投与により金属アレルギーを発症した非ヒト動物のＴ細胞からクローニングした金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAを含む、金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
[２]　非ヒト動物がマウスである、[１]の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
[３]　金属がパラジウムである、[１]又は[２]の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
[４]　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、Ｔ細胞受容体α鎖をコードするDNAであり、IMGT命名法によるTRAV8-1*01-TRAJ42*01であり、CDR3のアミノ酸配列がATLYSGGSNAKLT（配列番号１）で表される、[１]～[３]のいずれかの金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
[５]　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、配列番号２に示す塩基配列からなる[１]～[４]のいずれかの金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
[６]　非ヒト動物に金属を投与し金属アレルギーを発症させ、該非ヒト動物からＴ細胞を採取し、Ｔ細胞から金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、得られた金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAを外来DNAとして、非ヒト動物に導入することを含む、金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
[７]　非ヒト動物がマウスである、[６]の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
[８]　金属がパラジウムである、[６]又は[７]の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
[９]　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、Ｔ細胞受容体α鎖をコードするDNAであり、IMGT命名法によるTRAV8-1*01-TRAJ42*01であり、CDR3のアミノ酸配列がATLYSGGSNAKLT（配列番号１）で表される、[６]～[８]のいずれかの金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
[１０]　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、配列番号２に示す塩基配列からなる[６]～[９]のいずれかの金属アレルギー非ヒト動物モデルを作製する方法。
[１１]　[１]～[５]のいずれかの金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルに、金属又は金属合金を移植し、該金属又は金属合金に対する金属アレルギー反応が誘導されるか否かを確認することを含む、金属又は金属合金のアレルギー誘導能を評価する方法。
[１２]　金属又は金属合金がパラジウムを含む歯科用金属である、[１１]の金属又は金属合金のアレルギー誘導能を評価する方法。
[１３]　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質をコードする全長DNAであって、可変領域をコードするDNAの3'末端側に定常領域をコードするDNAがインフレームで連結している全長DNAのクローニング方法であって、
(i)　前記定常領域の大部分をコードするDNAが組込まれた、定常領域をコードするDNA部分にマルチクローニングサイトを有する以下の(a)～(e)の特徴を有するカセットベクターを調製し、
(a)　マルチクローニングサイトに可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを挿入するための制限酵素認識配列を有し、該制限酵素認識配列は3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列である；
(b)　前記制限酵素認識配列は、n個の塩基からなる(nは４～６）、3'末端側の塩基がＸ（Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）であり、制限酵素による切断後3'突出末端はn-2個の塩基からなる配列である；
(c)　前記定常領域をコードするDNAの5'末端からm番目の塩基は塩基Ｘであり、5'末端からm-1番目までには塩基Ｘは存在せず、カセットベクターに組込まれた定常領域の大部分をコードするDNAは、定常領域をコードするDNAの5'末端からm-1番目の塩基を欠いている5'末端が塩基ＸであるDNAであり、ここでmは１～10である；
(d)　カセットベクターに組込まれた(c)の定常領域の大部分をコードするDNAの5'末端の塩基Ｘの5'側に塩基を挿入することにより制限酵素認識配列を形成させる；及び
(e)　前記カセットベクター中にはマルチクローニングサイト以外に前記3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列は存在しない、
(ii)　可変領域をコードするDNAの5'末端から3'末端に向かった塩基配列に特異的な20～50塩基からなるフォワードプライマー、及び定常領域をコードするDNAの5'末端側からm-1番目の塩基から5'側に向かって可変領域部分を含む塩基配列に特異的な20～50塩基からなるリバースプライマーのプライマー対で可変領域及び定常領域の5'末端からm-1番目までの塩基を含む領域をPCRにより増幅し、前記カセットベクターに挿入するための可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを調製し、但し、mが１である場合は、リバースプライマーは可変領域をコードするDNAの3'末端から5’末端に向かった塩基配列に特異的なプライマーであり、
(iii)　前記カセットベクターを前記制限酵素で切断し、形成された3'突出末端を平滑化し、その結果、カセットベクター中に含まれる定常領域をコードするDNAの5'末端の塩基は塩基Ｘとなり、
(iv)　前記カセットベクターに(ii)で増幅した可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAをライゲーションによりインフレームで挿入するクローニング方法。
[１４]　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質が、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体又は抗体である、[１３]のクローニング方法。
[１５]　3'突出末端を形成する制限酵素がPstIである、[１３]又は[１４]のクローニング方法。
[１６]　カセットベクター中に、マルチクローニングサイト以外に3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列が存在するときに、該配列を変異させる、[１３]～[１５]のいずれかのクローニング法。
[１７]　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質をコードする全長DNAであって、可変領域をコードするDNAの3'末端側に定常領域をコードするDNAがインフレームで連結している全長DNAのクローニングを行うためのクローニング用カセットベクターであって、前記定常領域の大部分をコードするDNAが組込まれた、定常領域をコードするDNA部分にマルチクローニングサイトを有する以下の(a)～(e)の特徴を有するクローニング用カセットベクター：
(a)　マルチクローニングサイトに可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを挿入するための制限酵素認識配列を有し、該制限酵素認識配列は3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列である；
(b)　前記制限酵素認識配列は、n個の塩基からなる(nは４～６）、3'末端側の塩基がＸ（Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）であり、制限酵素による切断後3'突出末端はn-2個の塩基からなる配列である；
(c)　前記定常領域をコードするDNAの5'末端からm番目の塩基は塩基Ｘであり、5'末端からm-1番目までには塩基Ｘは存在せず、カセットベクターに組込まれた定常領域の大部分をコードするDNAは、定常領域をコードするDNAの5'末端からm-1番目の塩基を欠いている5'末端が塩基ＸであるDNAであり、ここでmは１～10である；
(d)　カセットベクターに組込まれた(c)の定常領域の大部分をコードするDNAの5'末端の塩基Ｘの5'側に塩基を挿入することにより制限酵素認識配列が形成されている；及び
(e)　前記カセットベクター中にはマルチクローニングサイト以外に前記3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列は存在しない。
[１８]　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質が、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体又は抗体である、[１７]のクローニング用カセットベクター。
[１９]　3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列が、PstIの制限酵素認識配列である、[１７]又は[１８]のクローニング用カセットベクター。
[２０]　カセットベクター中にマルチクローニングサイト以外に3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列が存在するときに、該配列が変異させられている、[１７]～[１９]のいずれかのクローニング用カセットベクター。
　本発明の金属アレルギー動物モデルは、金属高感度、高感受性動物として利用でき、金属アレルギーの時系列的な病態解析が可能となる。新規金属材料の安全性試験、金属生体材料の安全性試験に利用できる。また、金属アレルギーに対する介入実験、例えば、新規薬剤による治療実験に利用できる。
　さらに、あらかじめＴ細胞受容体の定常領域をコードするDNAを組込んでおき、該クローニングベクターに定常領域の一部及び可変領域を標的とするプライマーを用いて増幅した可変領域をコードするDNAを連結することにより、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNAをフレームシフトを生じさせることなくインフレームで連結させ、特定の塩基配列を有し特定の反応性を有するＴ細胞受容体の定常領域と可変領域の全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる
金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体α鎖をコードするDNAの配列を示す図である。 金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNA導入マウスに用いたベクターの構造を示す図である。 Ｔ細胞受容体をコードするDNAを導入したマウスにおける、パラジウムによる金属アレルギーの誘導を示す図である。 可変領域と定常領域を有するタンパク質であるＴ細胞受容体をコードする全長DNAをクローニングする方法及び用いるカセットベクターの構造を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、金属高感度、高感受性動物の金属アレルギー動物モデルを樹立する方法である。本発明は、該方法により樹立した金属アレルギー動物モデルを包含する。
　金属アレルギーは、金属が皮膚と接触したとき、あるいは金属が生体内に移植されたときに微量の金属が溶解しイオン化し生体内のタンパク質と結合しアレルゲンとなるために発症する。該アレルゲンは生体により異物と認識され、金属とタンパク質の結合物に対する免疫が成立する。
　さらに、本発明はＴ細胞受容体(TCR）等の特異的レパートリーをクローニングするためのクローニングベクターを包含する。
１．金属アレルギー動物モデル
　本発明の金属アレルギー動物モデルは、非ヒト動物に金属アレルギーの原因となるＴ細胞のＴ細胞受容体（TCR)をコードするDNAを導入して樹立し作製することができる。
　用いる非ヒト動物は限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物が好ましい。この中でも、マウスが好ましい。
　金属アレルギーの原因となるＴ細胞のＴ細胞受容体をコードするDNAは、以下の方法で取得することができる。すなわち、非ヒト動物に金属を接種、移植又は投与し、アレルギーを発症させ、該アレルギー非ヒト動物のリンパ節より、Ｔ細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、Ｔ細胞受容体のレパートリーを解析する。金属アレルギー動物において出現頻度が高いＴ細胞受容体を金属アレルギーの原因となる特異的Ｔ細胞受容体であると判断する。金属アレルギーに関与する金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体を金属アレルギー病原性Ｔ細胞受容体とも呼ぶ。
　次いで、Ｔ細胞受容体の全長配列をクローニングする。この際、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードするDNAの5'末端部分に結合するプライマーとＴ細胞受容体の定常領域の3'末端部分に結合するプライマーを用いてＴ細胞受容体の全長配列を増幅し、クローニングベクターに組込み、Ｔ細胞受容体をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この全長遺伝子ライブラリーの遺伝子について、再度シークエンスする。前記のＴ細胞受容体のレパートリー解析で、出現頻度が高かったＴ細胞受容体を金属アレルギーに特異的なＴ細胞受容体とし、このＴ細胞受容体の遺伝子の配列を有するクローンを金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体のクローンとして選択し、このクローンのＴ細胞受容体遺伝子を非ヒト動物に導入する。
　Ｔ細胞受容体のレパートリー解析は、例えば、IMGT/V-Questツール（http://www.imgt.org/）を利用して行うことができる。
　上記の方法では、Ｔ細胞レパートリー解析により、金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体の配列を決定した後に、再度Ｔ細胞受容体の全長遺伝子をクローニングし、ライブラリーを作製し、その中から金属アレルギーに関与するＴ細胞受容体の配列を有するクローンを選択する。一方、このときに後述の特異的Ｔ細胞受容体レパートリーをクローニングするためのクローニングベクターを用いることにより、Ｔ細胞受容体のレパートリー解析で得られた金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体の特異的配列に基づいて、金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体遺伝子をクローニングすることができる。
　Ｔ細胞受容体をコードするDNAはＴ細胞受容体のα鎖をコードするDNA及びβ鎖をコードするDNAの両方でもよいし、いずれか１つでもよい。また、Ｔ細胞受容体のγ鎖をコードするDNA及びδ鎖をコードするDNAの両方でもよいし、いずれか１つでもよい。例えば、Ｔ細胞受容体のα鎖をコードするDNAを導入することにより金属アレルギー非ヒト動物モデルを樹立することができる。
　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体のα鎖のクローンの例として、IMGT(登録商標）（the international ImmunoGeneTics database)の遺伝子命名法により規定されるTRAV8-1*01-TRAJ42*01が挙げられる。該クローンのCDR3のアミノ酸配列は、ATLYSGGSNAKLT（配列番号１）で表される。また、該クローンのLVDJC領域（Lはリーダー配列）をコードするDNAの塩基配列を配列番号２に示す。
　このようにしてクローニングした金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAを非ヒト動物に導入する。金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAを導入した非ヒト動物をトランスジェニック非ヒト動物と呼ぶ。非ヒト動物への遺伝子の導入は、例えば、クローニングしたＴ細胞受容体をコードするDNAを発現ベクターに組込み、非ヒト動物の初期胚又は受精卵に導入する。
　非ヒト動物の初期胚又は受精卵に導入するDNAは、非ヒト動物細胞中で発現可能なプロモータと連結する。発現可能なプロモータとして、例えば、ヒトCD2プロモータ、CAG（ニワトリβアクチン）プロモータ、PGK（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモータ、EF1α（エロンゲーションファクター１α）プロモータなどの哺乳動物細胞由来のプロモータや、サイトメガロウイルス（CMV）プロモータ、シミアンウイルス40（SV40）プロモータ、レトロウイルスプロモータ、ポリオーマウイルスプロモータ、アデノウイルスプロモータなどのウイルスプロモータが挙げられる。また、遺伝子の発現を増強するエンハンサーを組込んでもよい。導入しようとするＴ細胞受容体遺伝子をプロモータと作動可能に連結し、ベクターに導入する。ベクターとしては、導入遺伝子を動物の生体内で発現誘導させることができるものであればよく、あらかじめプロモータが組込まれたベクターを用いてもよい。ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターが好ましい。ベクターは、受精卵の前核や初期胚の囲卵腔へ注入（インジェクション）すればよい。初期胚や受精卵は、人工受精により得られたものでもよいし、自然交配により受精したものでもよい。
　金属アレルギー特異的Ｔ細胞遺伝子を導入した非ヒト動物初期胚又は受精卵を非ヒト動物の仮母の子宮に移植する。仮母から産まれた非ヒト動物を金属アレルギー動物モデルとして用いることができる。
　金属は、金属アレルギーを起こしやすい金属を用いればよく、そのような金属として、パラジウム、ニッケル、水銀、コバルト、スズ、クロムやそれらの合金が挙げられる。
　パラジウムを非ヒト動物に投与して得られたパラジウムのアレルギーに関与する病原性Ｔ細胞は他の金属のアレルギーにも関与する可能性がある。従って、パラジウムを投与して得られた病原性Ｔ細胞のＴ細胞受容体をコードするDNAを導入して得られた金属アレルギー動物モデルは、パラジウムのみならず、他の金属アレルギー動物モデルとしても用いることができる可能性がある。
　また、金属の種類ごとに、アレルギーに関与する病原性Ｔ細胞を得て、該Ｔ細胞のＴ細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、非ヒト動物に導入することにより、アレルギーを引き起こす金属ごとに金属アレルギー動物モデルを作製することができる。例えば、パラジウムアレルギー動物モデル、ニッケルアレルギー動物モデル等を樹立することができる。
　本発明の非ヒト動物金属アレルギー動物モデルは、金属のアレルギー誘導能を試験し、該金属の安全性試験に用いることができる。例えば、歯科領域では、インレー、クラウン、ブリッジ、ステント等の材料となる歯科用金属として、種々の合金が用いられ、特に金、銀及びパラジウムの合金（金銀パラジウム合金）が良く用いられている。また、合金にニッケルやコバルトが含まれる場合もある。このような歯科用金属において、パラジウム等の金属アレルギーを引き起こす金属が溶出し易い場合がある。また、同様のことが体内に埋め込む人工関節やステント等についても言える。すなわち、金属部品を含む人工関節や金属製のステント等から生体内で金属が溶出し、金属アレルギーを引き起こすことがある。
　これらの生体内に移植又は埋め込む金属を本発明の金属アレルギー非ヒト動物モデルに移植し、該動物にアレルギー反応が誘導されるか否かを確認することにより、該金属を安全に生体内に移植又は埋め込むことができるかを評価することができる。例えば、マウスである金属アレルギー非ヒト動物モデルの鼠径部に金属を投与し、金属アレルギーに関与するＴ細胞を誘導し、さらに足蹠に前記金属を投与し、足の腫れが惹起されるか否かを観察すればよい。足の腫れが惹起された場合は、投与した金属は金属アレルギーを引き起こす可能性があると判断することができる。
２．可変領域と定常領域を有し、抗原を特異的に認識するタンパク質のレパートリーをクローニングするための発現ベクター
　本発明は、アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含む抗原を認識し得るタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする方法及び該方法に用いるクローニングベクターを包含する。
　このクローニング法及び該方法に用いるクローニングベクターは、１．の金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体等、特定の特異性を有し、可変領域の配列が部分的にわかっているＴ細胞受容体の遺伝子のクローニングに好適に用いることができる。
　このようなタンパク質として、抗原を認識し得る抗体、Ｔ細胞受容体（TCR)及びＢ細胞受容体（BCR)等が挙げられる。抗体及びＢ細胞受容体は重鎖と軽鎖を含み、２本の重鎖と２本の軽鎖からなり、それぞれの鎖が可変領域（Ｖ領域）と定常領域（Ｃ領域）から構成される。また、Ｔ細胞受容体はα鎖とβ鎖、又はγ鎖とδ鎖から構成される二量体であり、それぞれの鎖が可変領域と定常領域から構成される。可変領域は複数の遺伝子断片（Ｖ(variable)領域（Ｖ遺伝子断片）、Ｄ(diversity)領域及びＪ（joining)領域（β鎖、δ鎖）、あるいはＶ領域及びＪ領域によりコードされ（α鎖、γ鎖）、遺伝子再構成を通して多数のレパートリーを有するようになる。さらに、可変領域にはCDR（complementarity determining region：相補性決定領域）と呼ばれる超可変領域が３つ存在し、これらの領域の体細胞突然変異によりさらに多数のレパートリーを有するようになる。特にCDR3領域は抗原特異性に関与しており、配列の変異が生じやすく配列の多様性が大きい。本発明の方法によれば、特定のアミノ酸配列を有する特定のレパートリーのタンパク質をコードするDNAをクローニングすることができる。
　上記のように可変領域と定常領域を有するタンパク質は、遺伝子再構成が生じ、複数の断片(Ｖ、Ｄ及びＪ、あるいはＶ及びＪ)からなる可変領域と定常領域が組み合わさって連結したDNAが形成される。抗体重鎖の場合、Ｖ領域、Ｄ領域及びＪ領域の再構成が、抗体軽鎖の場合Ｖ領域及びＪ領域の再構成が、Ｔ細胞受容体β鎖の場合、Ｖ領域、Ｄ領域及びＪ領域の再構成が、Ｔ細胞受容体α鎖の場合、Ｖ領域及びＪ領域の再構成が生じる。
　タンパク質が抗体の場合は、抗体産生細胞ごとに異なる遺伝子構成を有し、タンパク質がＴ細胞受容体又はＢ細胞受容体の場合は、Ｔ細胞又はＢ細胞ごとに異なる遺伝子構成を有する。
　可変領域と定常領域を有するタンパク質をコードする全長DNAをクローニングするためには、理論的には、可変領域の5'末端部位にフォワードプライマーを設計し、定常領域の3'末端部位にリバースプライマーを設計し、PCRで増幅すればよい。しかしながら、特定の特異性を有するタンパク質をコードするDNAのクローニングを目的とした場合、この方法では、可変領域の5'末端部位の配列と定常領域の3'末端部位の配列を標的として増幅するため、変異が起こりやすい部位を標的とすることができない。このため、再構成され特定の配列を有するDNA、特にCDR3領域に特定の変異配列を有するDNAを標的として効率的にクローニングすることはできない。
　本発明の方法は、定常領域をコードするDNAを予め組み込んだカセットベクターに、変異の起こりやすい部位の特定の配列に対してプライマーを設計して増幅させた可変領域をコードするDNAをフレームシフトが生じないようにインフレームでインサートすることにより、特定の特異性を有するタンパク質をコードする再構成された全長DNAのクローニングを可能にする方法である。
　本発明のクローニング方法は、アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質をコードする全長DNAであって、可変領域をコードするDNAの3'末端側に定常領域をコードするDNAがインフレームで連結している全長DNAのクローニング方法である。
　本発明のクローニング方法は、以下の(i)～(iv)の工程で行う。
(i)　前記定常領域の大部分をコードするDNAが組込まれた、定常領域をコードするDNA部分にマルチクローニングサイトを有する以下の(a)～(e)の特徴を有するカセットベクターを調製する工程。
(a)　マルチクローニングサイトに可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを挿入するための制限酵素認識配列を有し、該制限酵素認識配列は3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列である。
(b)　前記制限酵素認識配列は、n個の塩基からなる(nは４～６）、3'末端側の塩基がＸ（Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）であり、制限酵素による切断後3'突出末端はn-2個の塩基からなる配列である。
(c)　前記定常領域をコードするDNAの5'末端からm番目の塩基は塩基Ｘであり、5'末端からm-1番目までには塩基Ｘは存在しない。すなわち、5'末端からm番目に最初のＸが存在する。また、カセットベクターに組込まれた定常領域の大部分をコードするDNAは、定常領域をコードするDNAの5'末端からm-1番目の塩基を欠いている5'末端が塩基ＸであるDNAである。ここで、mは１～10、好ましくは１～５である。すなわち、カセットベクター中に組込んだ定常領域の大部分をコードするDNAが同時にマルチクローニングサイトとして機能する。
(d)　カセットベクターに組込まれた(c)の定常領域の大部分をコードするDNAの5'末端の塩基Ｘの5'側に塩基を挿入することにより制限酵素認識配列を形成させる。
(e)　前記カセットベクター中にはマルチクローニングサイト以外に前記3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列は存在しない。
(ii)　可変領域をコードするDNAの5'末端から3'末端に向かった塩基配列に特異的な20～50塩基、好ましくは20～30塩基からなるフォワードプライマー、及び定常領域をコードするDNAの5'末端側からm-1番目の塩基から5'側に向かって可変領域部分、特にCDR3部分を含む塩基配列に特異的な20～50塩基、好ましくは20～30塩基からなるリバースプライマーのプライマー対で可変領域及び定常領域の5'末端からm-1番目までの塩基を含む領域をPCRにより増幅し、前記カセットベクターに挿入するための可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを調製する工程。
　但し、mが１である場合は、リバースプライマーは可変領域をコードするDNAの3'末端から5’末端に向かった塩基配列に特異的なプライマーである。この際、可変領域の増幅は、可変領域のＶ領域（Ｖ遺伝子断片）の5'側に存在するリーダー配列（Ｌ）(シグナル配列）部分から増幅するのが好ましい。このため、フォワードプライマーはリーダー配列（Ｌ）部分に特異的なものを用いる。
(iii)　前記カセットベクターを前記制限酵素で切断し、形成された3'突出末端を平滑化する工程。
　この工程を行う結果、カセットベクター中に含まれる定常領域をコードするDNAの5'末端の塩基は塩基Ｘとなる。
(iv)　前記カセットベクターに(ii)で増幅した可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAをライゲーションによりインフレームで挿入する工程。
　この方法において、用いる制限酵素でマルチクローニングサイト以外の部位が切断されないように、カセットベクター中にはマルチクローニングサイト以外に前記制限酵素認識配列は存在しない。カセットベクター中に固有に制限酵素認識配列が存在する場合は、該制限酵素認識配列中に変異を加え、用いる制限酵素で消化されないようにする。例えば、制限酵素認識配列の１塩基を他の塩基に置換すればよい。
　定常領域の大部分をコードするDNA中に前記の制限酵素の制限酵素認識配列を人工的に形成させることにより定常領域の大部分をコードするDNAがマルチクローニングサイトとして機能する。すなわち、定常領域の大部分をコードするDNA中に固有に存在する、制限酵素認識配列の3'末端の塩基Ｘ（Ｘは、Ａ，Ｔ、Ｃ又はＧ）の5'側に、複数の塩基を挿入し、固有に存在するＸを含む形で、制限酵素認識配列を形成させればよい。
　3'突出末端を形成する制限酵素として、PstI、SacI、KpnI、SphI、AstII、ApaI、BaeGI、BanII、BmtI、BsiHKAI、Bsp1286I、HaeII、NsiI、NspI、HhaI等が挙げられる。
　PstIの制限酵素認識配列は、CTGCA↓G（↓は切断部位を示す）である。この場合、nは６であり、定常領域をコードするDNAの5'末端からm番目の塩基であって定常領域に固有のGを含んだ形で制限酵素認識配列を人工的に形成させる。この際、CTGCAを固有のGの5'側に付加すればよい。
　また、SacIの制限酵素認識配列は、GAGCT↓Cである。この場合、nは６であり、定常領域の5'末端からm番目の塩基であって定常領域に固有のCを含んだ形で制限酵素認識配列を人工的に付加する。
　他の3'突出末端を形成する制限酵素の認識配列を以下に示す。本発明の方法で用いる制限酵素の認識配列がn個の塩基からなる場合、制限酵素による切断によって、n-2個の3'突出末端が形成される。すなわち、制限酵素認識配列の切断部において5'側に残る塩基は１個である。
　KpnI　GGTAC↓C
　SphI　GCATG↓C
　AstII　GACGT↓C
　ApaI　GGGCC↓C
　BaeGI　GKGCM↓C
　BanII　GRGCY↓C
　BmtI　GCTAG↓C
　BsiHKAI　GWGCW↓C
　Bsp1286I　GDGCH↓C
　HaeII　RGCGC↓Y
　NsiI　ATGCA↓T
　NspI　RCATG↓Y
　HhaI　GCG↓C
　上記配列中、R= A or G、K= G or T、Y= C or T、M= A or C、D= A or G or T (not C)、H= A or C or T (not G)及びW= A or Tである。また、↓は切断部位を示す。
　上記の制限酵素による切断により形成された3'突出末端の平滑化は、dNTPsの存在下でT4 DNAポリメラーゼ等の3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼにより3'突出末端を削ることにより行うことができる。
　また、平滑末端化した末端への可変領域をコードするDNAを含むDNAのライゲーションはDNAリガーゼを用いて行うことができる。
　カセットベクターには、あらかじめ定常領域をコードするDNAの5'末端側の一部を除く大部分のDNAを組込んでおく。定常領域の配列はバリエーションが少なく、Ｔ細胞受容体では、α鎖の場合１種類あり、β鎖の場合２種類ある。抗体では、Ｈ鎖の場合大きく分けてＣα鎖、Ｃδ鎖、Ｃε鎖、Ｃγ鎖及びＣμ鎖の５種類があり、Ｌ鎖の場合λ鎖とκ鎖の２種類がある。従って、これらの定常領域をコードするDNAをカセットベクターに組込んで複数のカセットベクターを作製しておくことにより、すべてのＴ細胞受容体又は抗体をクローニングすることができる。
　本発明のカセットベクターは公知のクローニングベクターに定常領域の大部分を含むDNAを導入し、該DNA中に前記の制限酵素の制限酵素認識配列を形成させることにより作製することができる。また、公知のクローニングベクター配列中に、定常領域の大部分をコードするDNA中に形成させた制限酵素認識配列以外に、前記の制限酵素の制限酵素認識配列を有するときは、これらの制限酵素認識配列の塩基に変異を加え、前記の制限酵素により切断されないようにする。本発明のカセットベクターを作製するために用いる公知のベクターは限定されないが、例えば、pMXs-IRES-Puro Retroviral Vector（CELL BIOLABS, INC.）等を用いることができる。
　可変領域をコードするDNAをPCRにより増幅するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基長は、20～50塩基、好ましくは20～30塩基からなる配列であり、標的遺伝子の塩基配列に対して、１～数個、好ましくは１個若しくは２個のミスマッチがあってもよく、該標的遺伝子の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列を有していればよい。PCR伸長反応は、DNAポリメラーゼを用いて通常用いる条件で公知の方法で行えばよい。例えば、98℃で10秒間加熱、60℃で30秒間冷却、68℃で60秒間加熱を１サイクルとして30サイクル程度繰り返せばよい。
　本発明の方法よれば、可変領域と定常領域の連結部でフレームシフトが起こることなく確実にインフレームで連結することができる。
　図４に、本発明の可変領域と定常領域を有するタンパク質をコードする全長DNAをクローニングする方法を示す。図４においては、可変領域と定常領域を有するタンパク質としてＴ細胞受容体を用いている。また、制限酵素としては、CTGCA↓G（↓は切断部位を示す）を制限酵素認識配列として認識するPstIを用いる。該制限酵素認識配列は、６個（n=6)の塩基からなる、3'末端側の塩基がG（X=G)であり、制限酵素による切断後3'突出末端は４個(n-2=4)の塩基からなる配列（TGCA）である。
　方法の詳細は実施例２に示す。
　本発明は、上記のクローニング方法に用いる定常領域の大部分をコードするDNAを組込んだクローニング用カセットベクターも包含する。
　該クローニング用カセットベクターは、アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質をコードする全長DNAであって、可変領域をコードするDNAの3'末端側に定常領域をコードするDNAがインフレームで連結している全長DNAのクローニングを行うためのクローニング用カセットベクターであって、前記定常領域の大部分をコードするDNAが組込まれた、定常領域をコードするDNA部分にマルチクローニングサイトを有する以下の(a)～(e)の特徴を有するクローニング用カセットベクターである。
(a)　マルチクローニングサイトに可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを挿入するための制限酵素認識配列を有し、該制限酵素認識配列は3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列である。
(b)　前記制限酵素認識配列は、n個の塩基からなる(nは４～６）、3'末端側の塩基がＸ（Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）であり、制限酵素による切断後3'突出末端はn-2個の塩基からなる配列である。
(c)　前記定常領域をコードするDNAの5'末端からm番目の塩基は塩基Ｘであり、5'末端からm-1番目までには塩基Ｘは存在しない。すなわち、5'末端からm番目に最初のＸが存在する。また、カセットベクターに組込まれた定常領域の大部分をコードするDNAは、定常領域をコードするDNAの5'末端からm-1番目の塩基を欠いている5'末端が塩基ＸであるDNAである。ここで、mは１～10、好ましくは１～５である。すなわち、カセットベクター中に組込んだ定常領域の大部分をコードするDNAが同時にマルチクローニングサイトとして機能する。
(d)　カセットベクターに組込まれた(c)の定常領域の大部分をコードするDNAの5'末端の塩基Ｘの5'側に塩基を挿入することにより制限酵素認識配列を形成されている。
(e)　前記カセットベクター中にはマルチクローニングサイト以外に前記3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列は存在しない。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１　金属高感度・高感受性の金属アレルギートランスジェニックマウスの樹立
１．　TCR受容体cDNAクローニング
　パラジウムにより免疫、惹起させ、アレルギーを発症したBALB/cマウスから、所属リンパ節より、RNAを抽出、cDNA合成してcDNAライブラリーを作成した。
　cDNAライブラリーの一部を次世代シークエンサーによりT細胞受容体レパートリー解析したところ、TRAV8-1*01、TRAJ42*01（IMGT（登録商標）命名法による）、CDR3（アミノ酸配列としてATLYSGGSNAKLT）であることが明らかとなった。
　解析の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　CDR3は、V領域とJ領域が結合した部分であるので、J領域にV領域が重なっている。従って、IMGT（the international ImMunoGene Tics information system)（登録商標）で調べた場合J領域の一致率は100％にはならない。
　レパートリー解析をもとに、全長の配列をクローニングするため、cDNAライブラリーの一部を用いてPCR法によりクローニングすることとした。
　全長の配列は、LVDJC鎖から成る。
　以下のプライマーを用いてPCRを行った。Pfu DNAポリメラーゼを用いたので、PCR産物は平滑末端（Blunt end）となる。
センスプライマー（Sense primer）: TO761 5’atgcacagcctcctggggttgttgatg 3’（配列番号４）
　該プライマーは、TRAV8-1*01の先頭部分リーダー配列（L鎖）を含む。
アンチセンスプライマー（Anti sense primer）: TO11 5’ctcatgacgctgaggctgtggtccagttga 3’（配列番号５）
　該プライマーはC鎖の終末端の部分に対応する。
　クローニングしたLVDJC領域をクローニングベクター（市販のpCR（商標）-Blunt II-TOPO（登録商標） Vectorを用いた）に組み込んだ。この配列について再度シークエンスし確認した。配列を図１及び配列番号２に示す。
２．　遺伝子導入マウスの作製
　上記のサブクローニングした全長TCR受容体を、ヒトCD2プロモーターをもつ発現ベクター（VA vector）に組み込んだ。この遺伝子を、マウス受精卵（BDF1:C57BL/6xDBA/2の受精卵）に移入し、遺伝子導入マウスを作製した。
　遺伝子導入マウス作製に用いたベクターの構造を図２に示す。
３．　マウスを用いたアレルギー試験方法
　パラジウムを用いた金属アレルギーの発症を誘導するために、マウスに以下の処置を施した。
感作：鼠径部に10mM PdCl2/10μg/ml LPS in 1×PBS混合溶液の皮下注射を１週おきに２回行なった。この際、それぞれの鼠径部に125μL投与した。
惹起：２回目の感作から１週後にそれぞれの足蹠に10mM PdCl2/10μg/ml 1×PBSの溶液を25μLずつ皮内投与した。
　金属アレルギーの発症を誘導したマウスにおける足の腫れの惹起の結果を図３に示す。　　　
　コントロールとして、TCR受容体を導入していないBALB/Caマウスに上と同じ条件でパラジウムを投与したもの、TCR受容体を導入していないBALB/CaマウスにPBSを投与したものを用いた。
　図３に示すように、TCR受容体を導入したトランスジェニックマウスにパラジウムを投与した場合に、TCR受容体を導入していないトランスジェニックマウスにパラジウムを投与した場合に比べ、足の腫れが強く惹起された。この結果は、TCR受容体を導入したトランスジェニックマウスがパラジウムの金属アレルギーモデルとして用い得ることを示す。
 実施例２　Ｔ細胞受容体のレパートリーをクローニングするための発現ベクターを用いたＴ細胞受容体をコードする遺伝子のクローニング
　図４に、可変領域と定常領域を有するタンパク質であるＴ細胞受容体をコードする全長DNAをクローニングする方法を示す。制限酵素としては、CTGCA↓G（↓は切断部位を示す）を制限酵素認識配列として認識するPstIを用いる。該制限酵素認識配列は、６個（n=6)の塩基からなる、3'末端側の塩基がG（X=G)であり、制限酵素による切断後3'突出末端は４個(n-2=4)の塩基からなる配列（TGCA）である。
　図４において、「○」を含む一重下線部は定常領域の塩基を示し、「□」を含む二重下線部はカセットベクター中の固有の塩基を示す。
　図４A-1は、Ｔ細胞受容体をコードする全長DNAの構造を示す。可変領域部分はＬ+Ｖ+Ｄ+Ｊで表され（Ｌは、Ｖ領域の5'側に存在するリーダー配列）、定常領域部分はＣで表される。Ｊの3'末端部分にCDR3が存在する。図の例では、定常領域をコードするDNAの5'末端から２番目（m=2)の塩基が制限酵素認識配列の3'末端側の塩基である塩基Ｇである。定常領域をコードするDNAにおいて２番目のＧが5'末端から3'末端方向に向かって最初に存在するＧである。
　図４A-2は、PCRにより増幅する可変領域をコードするDNAを含む部分のDNAの構造及びこの部分を増幅するために用いるプライマーの位置を示す。図４A-2に示すように、可変領域をコードするDNAの5'末端（Ｌの先頭（5'末端））から3'末端に向かった配列に特異的なフォワードプライマー及び定常領域をコードするDNAの5'末端側から１番目(m-1番目）の塩基から5'側に向かって可変領域部分を含む配列に特異的なリバースプライマーを用いて増幅する。
　図４Bは、制限酵素認識配列を形成させたカセットベクターの構造を示す。カセットベクターは定常領域をコードするDNAの大部分である、5'末端の塩基以外の塩基からなるDNA(5'末端からm番目（２番目）以降の配列）を含む。また、定常領域をコードするDNAの5'末端から２番目の塩基Ｇの5'側に塩基CTGCAが挿入され、PstIの制限酵素認識配列であるCTGCAGが形成されている。
　図４Cは、図４Bに示すカセットベクターをPstIにより切断した状態を示す。切断後の制限酵素認識配列CTGCAG部分において、3'突出末端は４個の塩基TGCAからなる。平滑末端処理を行うことにより、3'突出末端の配列（ACGT)が除去される。
　図４Dは、図４A-2に示す、PCRにより増幅する可変領域をコードするDNAと定常領域をコードする一部のDNAを含むDNAをカセットベクターに連結した状態を示す。可変領域をコードするDNAと定常領域をコードする一部のDNAを含むDNAは、3'末端側に定常領域の5'末端からm-1番目の塩基より5'側の定常領域をコードするDNAを含む。その結果、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNAの一部を含むDNAをカセットベクターに連結したときに、カセットベクターに含まれる定常領域をコードするDNAの大部分と、カセットベクターに連結した可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNAの一部を含むDNAに含まれる定常領域をコードするDNAの一部がインフレームで連結される。
　このようにして、Ｔ細胞受容体をコードするDNAをクローニングすることができる。該方法においては、可変領域をコードするDNAを含むDNAをPCRにより増幅するときに、リバースプライマーとして、可変領域をコードするDNAに相補的なプライマーを用いる。あらかじめ、クローニングをしようとするＴ細胞受容体の可変領域のアミノ酸配列がわかっている場合、該配列に基づいてリバースプライマーを設計することができるので、所望のＴ細胞受容体をコードする遺伝子を確実にクローニングすることができる。
　本発明の、金属高感度・高感受性動物は、新規金属材料の安全性試験、金属生体材料の安全性試験に利用できる。また、金属アレルギーに対する介入実験、例えば、新規薬剤による治療実験に利用できる。
配列番号４、５　プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (20)

  1. 　金属の投与により金属アレルギーを発症した非ヒト動物のＴ細胞からクローニングした金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAを含む、金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
  2. 　非ヒト動物がマウスである、請求項１記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
  3. 　金属がパラジウムである、請求項１又は２に記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
  4. 　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、Ｔ細胞受容体α鎖をコードするDNAであり、IMGT命名法によるTRAV8-1*01-TRAJ42*01であり、CDR3のアミノ酸配列がATLYSGGSNAKLT（配列番号１）で表される、請求項１～３のいずれか１項に記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
  5. 　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、配列番号２に示す塩基配列からなる請求項１～４のいずれか１項に記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデル。
  6. 　非ヒト動物に金属を投与し金属アレルギーを発症させ、該非ヒト動物からＴ細胞を採取し、Ｔ細胞から金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、得られた金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAを外来DNAとして、非ヒト動物に導入することを含む、金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
  7. 　非ヒト動物がマウスである、請求項６記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
  8. 　金属がパラジウムである、請求項６又は７に記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
  9. 　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、Ｔ細胞受容体α鎖をコードするDNAであり、IMGT命名法によるTRAV8-1*01-TRAJ42*01であり、CDR3のアミノ酸配列がATLYSGGSNAKLT（配列番号１）で表される、請求項６～８のいずれか１項に記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルを作製する方法。
  10. 　金属アレルギー特異的Ｔ細胞受容体をコードする外来DNAが、配列番号２に示す塩基配列からなる請求項６～９のいずれか１項に記載の金属アレルギー非ヒト動物モデルを作製する方法。
  11. 　請求項１～５のいずれか1項に記載の金属アレルギートランスジェニック非ヒト動物モデルに、金属又は金属合金を移植し、該金属又は金属合金に対する金属アレルギー反応が誘導されるか否かを確認することを含む、金属又は金属合金のアレルギー誘導能を評価する方法。
  12. 　金属又は金属合金がパラジウムを含む歯科用金属である、請求項１１記載の金属又は金属合金のアレルギー誘導能を評価する方法。
  13. 　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質をコードする全長DNAであって、可変領域をコードするDNAの3'末端側に定常領域をコードするDNAがインフレームで連結している全長DNAのクローニング方法であって、
    (i)　前記定常領域の大部分をコードするDNAが組込まれた、定常領域をコードするDNA部分にマルチクローニングサイトを有する以下の(a)～(e)の特徴を有するカセットベクターを調製し、
    (a)　マルチクローニングサイトに可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを挿入するための制限酵素認識配列を有し、該制限酵素認識配列は3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列である；
    (b)　前記制限酵素認識配列は、n個の塩基からなる(nは４～６）、3'末端側の塩基がＸ（Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）であり、制限酵素による切断後3'突出末端はn-2個の塩基からなる配列である；
    (c)　前記定常領域をコードするDNAの5'末端からm番目の塩基は塩基Ｘであり、5'末端からm-1番目までには塩基Ｘは存在せず、カセットベクターに組込まれた定常領域の大部分をコードするDNAは、定常領域をコードするDNAの5'末端からm-1番目の塩基を欠いている5'末端が塩基ＸであるDNAであり、ここでmは１～10である；
    (d)　カセットベクターに組込まれた(c)の定常領域の大部分をコードするDNAの5'末端の塩基Ｘの5'側に塩基を挿入することにより制限酵素認識配列を形成させる；及び
    (e)　前記カセットベクター中にはマルチクローニングサイト以外に前記3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列は存在しない、
    (ii)　可変領域をコードするDNAの5'末端から3'末端に向かった塩基配列に特異的な20～50塩基からなるフォワードプライマー、及び定常領域をコードするDNAの5'末端側からm-1番目の塩基から5'側に向かって可変領域部分を含む塩基配列に特異的な20～50塩基からなるリバースプライマーのプライマー対で可変領域及び定常領域の5'末端からm-1番目までの塩基を含む領域をPCRにより増幅し、前記カセットベクターに挿入するための可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを調製し、但し、mが１である場合は、リバースプライマーは可変領域をコードするDNAの3'末端から5’末端に向かった塩基配列に特異的なプライマーであり、
    (iii)　前記カセットベクターを前記制限酵素で切断し、形成された3'突出末端を平滑化し、その結果、カセットベクター中に含まれる定常領域をコードするDNAの5'末端の塩基は塩基Ｘとなり、
    (iv)　前記カセットベクターに(ii)で増幅した可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAをライゲーションによりインフレームで挿入するクローニング方法。
  14. 　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質が、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体又は抗体である、請求項１３記載のクローニング方法。
  15. 　3'突出末端を形成する制限酵素がPstIである、請求項１３又は１４に記載のクローニング方法。
  16. 　カセットベクター中にマルチクローニングサイト以外に3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列が存在するときに、該配列を変異させる、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のクローニング法。
  17. 　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質をコードする全長DNAであって、可変領域をコードするDNAの3'末端側に定常領域をコードするDNAがインフレームで連結している全長DNAのクローニングを行うためのクローニング用カセットベクターであって、前記定常領域の大部分をコードするDNAが組込まれた、定常領域をコードするDNA部分にマルチクローニングサイトを有する以下の(a)～(e)の特徴を有するクローニング用カセットベクター：
    (a)　マルチクローニングサイトに可変領域をコードするDNAを含むインサートDNAを挿入するための制限酵素認識配列を有し、該制限酵素認識配列は3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列である；
    (b)　前記制限酵素認識配列は、n個の塩基からなる(nは４～６）、3'末端側の塩基がＸ（Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）であり、制限酵素による切断後3'突出末端はn-2個の塩基からなる配列である；
    (c)　前記定常領域をコードするDNAの5'末端からm番目の塩基は塩基Ｘであり、5'末端からm-1番目までには塩基Ｘは存在せず、カセットベクターに組込まれた定常領域の大部分をコードするDNAは、定常領域をコードするDNAの5'末端からm-1番目の塩基を欠いている5'末端が塩基ＸであるDNAであり、ここでmは１～10である；
    (d)　カセットベクターに組込まれた(c)の定常領域の大部分をコードするDNAの5'末端の塩基Ｘの5'側に塩基を挿入することにより制限酵素認識配列が形成されている；及び
    (e)　前記カセットベクター中にはマルチクローニングサイト以外に前記3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列は存在しない。
  18. 　アミノ酸配列に多様な変異が認められる可変領域とアミノ酸配列に変異が認められないか又は少ない定常領域が複合体を形成した状態で含むタンパク質が、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体又は抗体である、請求項１７記載のクローニング用カセットベクター。
  19. 　3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列が、PstIの制限酵素認識配列である、請求項１７又は１８に記載のクローニング用カセットベクター。
  20. 　カセットベクター中にマルチクローニングサイト以外に3'突出末端を形成する制限酵素の制限酵素認識配列が存在するときに、該配列が変異させられている、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のクローニング用カセットベクター。
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