WO2018084185A1 - Ｈｖｊ－ｅおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む抗がん剤 - Google Patents

Ｈｖｊ－ｅおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む抗がん剤 Download PDF

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checkpoint protein
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千萬 佐倉
智之 西川
福島　雅典
中島　俊洋
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    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18871—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer agent comprising an inhibitor of HVJ-E (hemagglutinating virus-of-Japan envelope) and immune checkpoint protein.
  • HVJ-E hemagglutinating virus-of-Japan envelope
  • Immune checkpoint protein is a factor that prevents the onset of autoimmune diseases caused by abnormal activation of the immune system.
  • PD-1 Programmed cell death protein 1, also known as CD279
  • PD-L1 Programmed cell death ligand 1, also known as B7-H1 / CD274
  • PD-L2 Programmed cell death ligand 2, aka B7-DC / CD273
  • CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4, aka CD152
  • These immune checkpoint proteins are normally expressed in cells of the immune system, and PD-1 is expressed in cells such as activated T lymphocytes, B lymphocytes, and myeloid cells.
  • PD-1 ligand PD-L1 is constitutively expressed in various cells in the body, including T lymphocytes stimulated by ⁇ -interferon, and is also a PD-1 ligand.
  • PD-L2 is expressed in antigen-presenting cells (macrophages, dendritic cells, etc.) when inducing immune responses such as inflammation.
  • expression of CTLA-4 is induced in activated T lymphocytes and NK cells, and CTLA-4 ligands B7.1 and B7.2 are specialized for antigen-presenting cells such as macrophages and dendritic cells. It is expressed in cells.
  • Non-patent Document 2 Since cancer cells are derived from autologous cells in the body, it was traditionally thought that they are difficult to be excluded by the immune system. However, in recent years, the immune system is suppressed by immune checkpoint proteins. Has been suggested to be a mechanism for avoiding attacks from the immune system in the body (Non-patent Document 2). In particular, it has become clear that PD-L1 expressed by cancer cells suppresses the function of cytotoxic T lymphocytes important for tumor immunity through binding to PD-1, and cancer cells actively It became clear that the attack of an immune system was avoided (nonpatent literature 3). In addition, it was revealed that antitumor effects were observed by releasing immunosuppression by CTLA-4 or PD-1 (Non-patent Document 4).
  • antibody drugs such as anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-1 antibody have been clinically developed as immune checkpoint protein inhibitors and approved as therapeutic agents for malignant melanoma, non-small cell lung cancer, renal cancer, Hodgkin lymphoma (Non-Patent Document 5).
  • anti-PD-L1 antibodies are being clinically developed for patients with bladder cancer, pancreatic cancer, breast cancer, colon cancer, lymphoma, etc. (Non-patent Document 6).
  • Non-patent Document 7 Non-patent Document 7
  • HVJ-E is a particulate substance obtained by completely inactivating HVJ (hemagglutinating virus-of-Japan), a paramyxovirus having specificity for rodents (Non-patent Document 8). So far, the inventor has reported that HVJ-E has multiple antitumor activities including antitumor immunity and induction of cancer cell selective apoptosis (Non-Patent Documents 9 to 13). It has not been clarified how the combined anti-tumor effect of HVJ-E changes when point protein inhibitors act simultaneously.
  • the object of the present invention was to confirm whether or not the anti-PD-1 antibody, which is an inhibitor of immune checkpoint protein, is combined with HVJ-E to remarkably enhance the effect of suppressing cancer cell growth, and as a result It is to provide a novel anticancer agent with a high growth inhibitory effect on cancer cells obtained by combining HVJ-E and an immune checkpoint protein inhibitor based on the above, and a new cancer treatment method.
  • the present inventor administered a combination of HVJ-E and an anti-PD-1 antibody that is an inhibitor of immune checkpoint protein PD-1 to malignant melanoma transplanted mice, was evaluated as an index.
  • HVJ-E and anti-PD-1 antibody were administered at the same time, two types of molecules acted cooperatively to suppress cancer cell growth.
  • HVJ-E was administered alone or when anti-PD-1 antibody was administered alone, the antitumor effect gradually declined, whereas HVJ-E and When the PD-1 antibody was administered in combination, a phenomenon in which the antitumor effect was enhanced was observed.
  • HVJ-E and anti-PD-1 antibody were administered in combination to mice transplanted with malignant pleural mesothelioma, and the antitumor effect was evaluated using the change in tumor size as an index. As a result, it was confirmed that when HVJ-E and anti-PD-1 antibody were administered at the same time, two types of molecules acted cooperatively to suppress cancer cell growth. In addition, when anti-PD-1 antibody was administered alone to mice transplanted with malignant pleural mesothelioma, there was no improvement in survival rate, and when HVJ-E and isotype control antibody were administered simultaneously.
  • an anticancer agent comprising the following (1) and (2): (1) HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope), (2) an immune checkpoint protein inhibitor; [2] The anticancer agent according to [1], wherein the anticancer agent is a combination drug; [3] The anticancer agent according to [1], wherein the anticancer agent is a kit comprising a pharmaceutical composition containing HVJ-E and a pharmaceutical composition containing an inhibitor of immune checkpoint protein; [4] The anticancer agent according to any one of [1] to [3], wherein the inhibitor of immune checkpoint protein is selected from the following: (a) a nucleic acid comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to a base sequence encoding an immune checkpoint protein, or a part thereof, (b) neutralizing antibodies against immune checkpoint proteins; [5] Cancer is melanoma, Merkel cell carcinoma, lung cancer, mesothelioma, head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer
  • the present invention can provide a new anticancer agent that can be expected to have a significantly superior antitumor effect compared to single administration by combining HVJ-E and an immune checkpoint protein inhibitor as an active ingredient.
  • mice black-grafted mice with PBS, isotype control antibody (intraperitoneal administration), anti-PD-1 antibody (intraperitoneal administration), HVJ-E (subcutaneous administration), HVJ-E (subcutaneous administration) + isotype control antibody (intraperitoneal) Administration) or HVJ-E (subcutaneous administration) + anti-PD-1 antibody (intraperitoneal administration), and shows the tumor volume when observed for 12 days after the start of administration.
  • Prostate cancer transplanted mice were treated with PBS, anti-PD-1 antibody (intratumoral administration), HVJ-E (intradermal administration), HVJ-E (intradermal administration) + isotype control antibody (intratumoral administration) or HVJ-E ( It is a figure which shows the tumor volume when administering intradermal administration) + anti-PD-1 antibody (intratumoral administration) and observing 30 days after the start of administration.
  • the present invention provides the following (1) and (2): (1) HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope), (2) To provide an anticancer agent comprising an inhibitor of immune checkpoint protein.
  • HVJ-E hemagglutinating virus of Japan envelope
  • anticancer agent comprising an inhibitor of immune checkpoint protein.
  • HVJ-E Sendai virus envelope
  • HVJ-E Sendai virus envelope
  • An envelope HVJ refers to a virus belonging to the genus Paramyxovirus belonging to the Paramyxoviridae family and having a cell fusion action.
  • HVJ particles have an envelope with hemagglutinin and neuraminidase on their surface and show polymorphism with a diameter of 150-300 nm.
  • HVJ has a minus-strand RNA of about 15,500 bases in length as a genome, has RNA polymerase, is unstable to heat, aggregates almost all kinds of red blood cells, and exhibits hemolysis.
  • examples of the HVJ used for the preparation of the HVJ-E of the present invention include VR-105, VR-907, and the like, which can be purchased from American Type Culture Collection (ATCC).
  • HVJ may be a wild type virus or a recombinant virus.
  • HVJ-E of the present invention can be prepared by inactivating HVJ.
  • HVJ inactivation method for preparing the HVJ-E of the present invention include UV treatment and alkylation treatment.
  • the genomic RNA is denatured or fragmented within the viral envelope, losing its activity, and the ability to replicate as a virus is lost.
  • the preparation method of HVJ-E of the present invention is specifically described in JP-A-2001-286282 (WO01 / 57204), JP-A-2002-065278, WO03 / 014338, etc. In particular, it can be prepared according to the method described in Example 8 of JP-A-2001-286282.
  • the HVJ-E of the present invention thus obtained has lost its replication ability, but maintains the cell fusion ability, so that it can be introduced by encapsulating a gene, polynucleotide, oligonucleotide, plasmid, etc. It can also be used as a vector.
  • the HVJ-E of the present invention may also be a fusion particle (Sendai virus-liposome) obtained by fusing a liposome encapsulating a gene or protein and HVJ in which RNA has been inactivated by ultraviolet irradiation in advance.
  • Immune checkpoint protein is a factor known as a protein that controls the immune system in the body, and its activity inhibition is suggested to be useful in cancer treatment.
  • Immune checkpoint proteins include PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, B7.1, B7.2, B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), KIR, CD137, LAG-3, TIM-3, TIGIT, OX40 and BTLA are mentioned, and PD-1 is preferred among them.
  • PD-1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • PD-L1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • PD-L2 is SEQ ID NO: 6.
  • CTLA-4 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • B7.1 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • B7. 2 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • B7-H3 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14
  • B7-H4 is an amino acid represented by SEQ ID NO: 16.
  • a protein comprising the sequence, B7-H5 (VISTA) is a protein sequence comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18
  • KIR is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20
  • CD137 is the sequence number : Table at 22
  • LAG-3 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24
  • TIM-3 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26
  • TIGIT is SEQ ID NO:
  • OX40 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30
  • BTLA is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32.
  • the “inhibitor of immune checkpoint protein” is not particularly limited as long as it is a substance that suppresses the expression or activity of immune checkpoint protein.
  • the “substance that suppresses the expression of an immune checkpoint protein” means any level of the immune checkpoint protein gene transcription level, post-transcriptional regulation level, protein translation level, post-translational modification level, etc. It may act. Therefore, as a substance that suppresses the expression of immune checkpoint protein, for example, a substance that inhibits transcription of the gene, a substance that inhibits processing of the initial transcript to mRNA, a substance that inhibits transport of mRNA to the cytoplasm, Examples include substances that promote the degradation of mRNA, substances that inhibit the translation of mRNA into protein, and substances that inhibit post-translational modification of immune checkpoint proteins. Any substance that acts at any stage can be preferably used, but a substance that inhibits translation of mRNA into protein is preferred in the sense that it directly inhibits the production of immune checkpoint protein.
  • the substance that specifically inhibits the translation of immune checkpoint protein from mRNA to protein preferably includes a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA or a part thereof.
  • a nucleic acid is mentioned.
  • base sequence complementary or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA As a base sequence complementary or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA, (a) a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to a nucleotide sequence encoding an immune checkpoint protein, or (b) A base sequence that hybridizes with a complementary strand sequence of a base sequence encoding an immune checkpoint protein under highly stringent conditions and encodes a protein having substantially the same activity as the immune checkpoint protein Examples thereof include a base sequence and a complementary or substantially complementary base sequence.
  • the “base sequence encoding an immune checkpoint protein” means a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a base sequence encoding PD-1 and SEQ ID NO: 3 as a base sequence encoding PD-L1.
  • a base sequence represented by SEQ ID NO: 15 as a base sequence encoding B7-H4 a base sequence represented by SEQ ID NO: 17 as a base sequence encoding B7-H5 (VISTA), Sequence as a base sequence encoding KIR No .: 19 nucleotide sequence, CD137 encoding nucleotide sequence SEQ ID NO: 21 nucleotide sequence, LAG-3 encoding nucleotide sequence SEQ ID NO: 23 nucleotide sequence, TIM- The nucleotide sequence encoding SEQ ID NO
  • the base sequence encoding BTLA include the base sequence represented by SEQ ID NO: 31.
  • substantially complementary means that the nucleotide sequences have complementarity of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Activity refers to the action of suppressing the antitumor activity of T cells against cancer cells.
  • Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same. Accordingly, quantitative factors such as the degree of these activities (for example, about 0.1 to about 10 medium, preferably about 0.5 to about 2 times) and the molecular weight of the protein may be different.
  • the activity of the immune checkpoint protein can be measured according to a method known per se.
  • High stringent conditions include, for example, a hybridization reaction at 45 ° C. in 6 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), followed by one or more washings at 65 ° C. in 0.2 ⁇ SSC / 0.1% SDS. Can be mentioned.
  • the base sequence complementary or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA is (a) complementary or substantially complementary to the base sequence encoding the immune checkpoint protein. Examples include base sequences.
  • Part of the base sequence complementary or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA is capable of specifically binding to the mRNA of the immune checkpoint protein and from the mRNA.
  • the length and position are not particularly limited as long as they can inhibit protein translation, but from the viewpoint of sequence specificity, a portion complementary to or substantially complementary to the target sequence is preferably at least 10 bases or more. Contains about 15 bases or more, more preferably about 20 bases or more.
  • nucleic acid comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA, or a part thereof, any of the following (i) to (iii): Preferably exemplified.
  • Antisense nucleic acid against immune checkpoint protein mRNA ii
  • siRNA against immune checkpoint protein mRNA iii
  • the antisense nucleic acid (antisense nucleic acid of the present invention) against mRNA of immune checkpoint protein is complementary or substantially complementary to the base sequence of the mRNA.
  • Antisense nucleic acids are polydeoxyribonucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polyribonucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, Other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages, provided that the polymer is a base such as found in DNA or RNA And a nucleotide having a configuration that allows attachment of a base). They may be double stranded DNA, single stranded DNA, double stranded RNA, single stranded RNA, DNA: RNA hybrid.
  • the antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • the antisense nucleic acid is DNA
  • the RNA DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA can be recognized by endogenous RNase H and cause selective degradation of the target RNA. Therefore, in the case of antisense DNA directed to degradation by RNase H, the target sequence may be not only the sequence in mRNA but also the sequence of the intron region in the initial translation product of the immune checkpoint protein gene.
  • the target region of the antisense nucleic acid of the present invention is not particularly limited in length as long as the antisense nucleic acid hybridizes, and as a result, the translation of an immune checkpoint protein into a protein is inhibited.
  • the entire sequence or partial sequence of mRNA encoding these proteins may be used, and the short sequence is about 10 bases, and the long sequence is the entire sequence of mRNA or initial transcript.
  • an oligonucleotide consisting of about 10 to about 40 bases, particularly about 15 to about 30 bases is preferred, but is not limited thereto.
  • An end untranslated region, a 3 ′ end palindromic region, a 3 ′ end hairpin loop, or the like may be selected as a preferred target region of an antisense nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the antisense nucleic acid of the present invention not only hybridizes with the immune checkpoint protein mRNA and initial transcription product to inhibit translation into the protein, but also binds to these genes, which are double-stranded DNA, to form a triple. It may be one that forms a strand (triplex) and can inhibit transcription to RNA (antigene).
  • the nucleotide molecule constituting the antisense nucleic acid may be natural DNA or RNA, but various chemicals may be used to improve stability (chemical and / or enzyme) and specific activity (affinity with RNA). Modifications can be included.
  • the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense nucleic acid is chemically modified, for example, phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. It can be substituted with a phosphate residue.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate etc. It can be substituted with a phosphate residue.
  • the 2′-position hydroxyl group of the sugar (ribose) of each nucleotide is represented by —OR (R is, for example, CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2 , CH 2 CONHCH 3 , CH 2 CH 2 CN and the like may be substituted).
  • R is, for example, CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2 , CH 2 CONHCH 3 , CH 2 CH 2 CN and the like may be substituted).
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • BNA LNA
  • ENA ENA
  • the antisense oligonucleotide of the present invention determines the target sequence of mRNA or initial transcript based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of immune checkpoint protein, and is a commercially available DNA / RNA automatic synthesizer (Applied Biosystems, Beckman et al.) Can be prepared by synthesizing a complementary sequence thereto.
  • any of the above-described antisense nucleic acids containing various modifications can be chemically synthesized by a method known per se.
  • RNA interference RNA interference
  • siRNA can be appropriately designed using commercially available software (eg, RNAi Designer; Invitrogen) based on the base sequence information of the target mRNA.
  • the ribonucleoside molecule constituting siRNA may also be modified in the same manner as in the above-described antisense nucleic acid in order to improve stability, specific activity and the like.
  • siRNA if all ribonucleoside molecules in natural RNA are replaced with a modified form, RNAi activity may be lost, so the introduction of the minimum modified nucleoside that allows the RISC complex to function is necessary. .
  • the siRNA is synthesized by synthesizing a sense strand and an antisense strand of a target sequence on mRNA with a DNA / RNA automatic synthesizer, denatured at about 90 to about 95 ° C. for about 1 minute in an appropriate annealing buffer, It can be prepared by annealing at about 30 to about 70 ° C. for about 1 to about 8 hours. Alternatively, it can be prepared by synthesizing a short hairpin RNA (shRNA) that is a precursor of siRNA and cleaving it with a dicer.
  • shRNA short hairpin RNA
  • nucleic acid capable of generating siRNA against mRNA of immune checkpoint protein is also referred to as immune check. It is defined as being encompassed by a nucleic acid comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the point protein mRNA or a part thereof. Examples of such a nucleic acid include the above-mentioned shRNA and an expression vector constructed so as to express it.
  • shRNA is an oligo containing a base sequence in which the sense and antisense strands of the target sequence on mRNA are linked by inserting a spacer sequence (for example, about 15 to 25 bases) long enough to form an appropriate loop structure. It can be prepared by designing RNA and synthesizing it with an automatic DNA / RNA synthesizer.
  • An expression vector containing an shRNA expression cassette can be prepared by preparing a double-stranded DNA encoding the above shRNA by a conventional method and then inserting it into an appropriate expression vector.
  • an shRNA expression vector one having a Pol III promoter such as U6 or H1 can be used. In this case, the shRNA transcribed in the animal cell into which the expression vector has been introduced forms a loop by itself, and then is processed by an endogenous enzyme dicer or the like to form a mature siRNA.
  • RNA As another preferred example of a nucleic acid containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA or a part thereof, the mRNA can be specifically cleaved within the coding region.
  • Ribozymes can be mentioned. “Ribozyme” refers to RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acids in a narrow sense, but in this specification, it is used as a concept including DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleavage activity. The most versatile ribozyme is self-splicing RNA found in infectious RNA such as viroid and virusoid, and the hammerhead type and hairpin type are known.
  • the hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and several bases at both ends (about 10 bases in total) adjacent to the part having the hammerhead structure are made complementary to the desired cleavage site of mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of ribozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • the immune checkpoint protein mRNA itself has a double-stranded structure
  • the target sequence is single-stranded by using a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase.
  • ribozymes when used in the form of expression vectors containing the DNA that encodes them, they should be hybrid ribozymes in which tRNA-modified sequences are further linked in order to promote the transfer of transcripts to the cytoplasm. [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • the nucleic acid containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA or a part thereof may be combined with a cell introduction substance.
  • the nucleic acid may be provided in a form encapsulated in HVJ-E, liposome, or microsphere.
  • the nucleic acid is a polycationic substance such as polylysine that works to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, a lipid that enhances the interaction with the cell membrane or increases the uptake of the nucleic acid (eg, phospholipid, It may be provided in a form to which a hydrophobic substance such as cholesterol is added.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and derivatives thereof (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). Such can be attached to the 3 ′ or 5 ′ end of the nucleic acid and can be attached via a base, sugar, intramolecular nucleoside bond.
  • the other group include a cap group specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the protein expression inhibitory activity of the immune checkpoint protein of these nucleic acids can be measured by transforming a gene into which the immune checkpoint protein is introduced, in vivo or in vitro immune checkpoint protein gene expression system, or in vivo or in vitro. It can be examined using a protein translation system for immune checkpoint proteins.
  • the substance that suppresses the expression of the immune checkpoint protein in the present invention is limited to a nucleic acid containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the immune checkpoint protein mRNA as described above or a part thereof.
  • other substances such as low molecular weight compounds may be used as long as they directly or indirectly inhibit the production of immune checkpoint protein.
  • the “substance that suppresses the activity of the immune checkpoint protein” may be any substance as long as it suppresses the effect of controlling the antitumor activity of T cells against cancer cells. And a substance that inhibits the binding between PD-L1 and the like.
  • examples of the substance that suppresses the activity of the immune checkpoint protein include neutralizing antibodies against the immune checkpoint protein.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These antibodies can be produced according to per se known antibody or antiserum production methods.
  • the isotype of the antibody is not particularly limited, but preferably IgG, IgM or IgA, particularly preferably IgG.
  • the antibody is not particularly limited as long as it has at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding a target antigen.
  • CDR complementarity determining region
  • Fab, Fab ′, F (ab ') 2 such as fragments, scFv, scFv-Fc, conjugation molecules prepared by genetic engineering such as minibodies and diabodies, or molecules having a protein stabilizing action such as polyethylene glycol (PEG)
  • PEG polyethylene glycol
  • Neutralizing antibodies against immune checkpoint proteins include anti-CTLA-4 antibodies, ipilimumab (Bristol-Myers Squibb) and tremelimumab (Tremelimumab, Astrazeneca), and anti-PD-1 antibodies nivolumab (Nivolumab, Bristol-Myers).
  • Pembrolizumab and Pembrolizumab include Durvalumab (Astrazeneca), Atezolizumab (Roche) and Avelumab (Avelumab, Pfizer / EMD Serono / , CureTech), as anti-KIR antibody, lirillumab (Bristol-Myers Squibb), as anti-CD137 antibody as urelumab, Bristol-Myers Squibb, as anti-LAG-3 antibody (BMS-986016, Bristol) -Myers Squibb) can be mentioned as known examples. Below, the preparation method of the antigen used in order to prepare the antibody of this invention, and the manufacturing method of this antibody are demonstrated.
  • the antigen used for preparing the antibody of the present invention has one or more of the above-described immune checkpoint proteins or partial peptides thereof, or the same antigenic determinants (synthesis). ) Any peptide or the like can be used (hereinafter, these may be simply referred to as the antigen of the present invention).
  • the immune checkpoint protein or a partial peptide thereof can be prepared, for example, by (a) preparing from a mammalian tissue or cell using a known method or a method equivalent thereto, and (b) a known peptide synthesis method using a peptide synthesizer or the like.
  • the extract is purified by a combination of chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. It can also be separated.
  • the obtained immune checkpoint protein or a partial peptide thereof can be used as an immunogen as it is, or a partial peptide can be prepared by limited degradation using peptidase or the like and used as an immunogen.
  • the synthetic peptide has, for example, the same structure as the immune checkpoint protein or its partial peptide purified from a natural material using the method (a) described above.
  • one or two amino acid sequences identical to the amino acid sequence at any position consisting of at least 3 amino acids, preferably 6 amino acids in the amino acid sequence of the immune checkpoint protein or partial peptide thereof Peptides containing more than species are used.
  • the DNA can be obtained by known cloning methods [for example, Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab The method described in Press, 1989)].
  • the cloning method includes (1) isolating DNA encoding the antigen from a human cDNA library by a hybridization method using a DNA probe designed based on a gene sequence encoding an immune checkpoint protein or a partial peptide thereof. Or (2) using a DNA primer designed based on a gene sequence encoding an immune checkpoint protein or a partial peptide thereof, preparing a DNA encoding the antigen by PCR using a mammal-derived cDNA as a template, And a method for inserting the protein into an expression vector suitable for the host.
  • a desired antigen can be obtained by culturing a transformant obtained by transforming a host with the expression vector in an appropriate medium.
  • a complete immune checkpoint protein or a peptide having a partial amino acid sequence can be used.
  • the partial amino acid sequence include those consisting of 3 or more consecutive amino acid residues, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 6 or more consecutive amino acid residues. It is done.
  • the amino acid sequence is composed of, for example, 20 or less consecutive amino acid residues, preferably 18 or less, more preferably 15 or less, and even more preferably 12 or less consecutive amino acid residues. Is mentioned. Some of these amino acid residues (eg, 1 to several) may be substituted with a substitutable group (eg, Cys, hydroxyl group, etc.).
  • a peptide used as an antigen has an amino acid sequence containing 1 to several such partial amino acid sequences.
  • mammalian cells that express immune checkpoint proteins or partial peptides thereof can also be used directly as the antigen of the present invention.
  • mammalian cells natural cells as described in the above section (a), cells transformed by the method as described in the above section (c), and the like can be used.
  • the host used for transformation may be any cell collected from humans, monkeys, rats, mice, hamsters, chickens, etc., HEK293, COS7, CHO-K1, NIH3T3, Balb3T3, FM3A, L929, SP2 / 0, P3U1, B16, or P388 is preferably used.
  • Natural mammalian cells or transformed warm-blooded animal cells that express immune checkpoint proteins or partial peptides thereof can be placed in medium (eg, RPMI1640) or buffer (eg, Hanks' Balanced Salt Solution) used for tissue culture.
  • the immunized animal can be injected in a suspended state.
  • any method can be used as long as it can promote antibody production, and intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, and the like are preferably used.
  • the antigen of the present invention can be directly immunized as long as it has immunogenicity, but it has a low molecular weight (for example, a molecular weight of about 3,000 or less) having only one or several antigenic determinants in the molecule.
  • Antigens ie, partial peptides of immune checkpoint proteins
  • these antigens are usually immunized as a complex bound or adsorbed to a suitable carrier (carrier) because these antigens are usually low immunogenic hapten molecules. can do.
  • a natural or synthetic polymer can be used as the carrier.
  • Examples of natural polymers include serum albumin of mammals such as cows, rabbits and humans, and thyroglobulin of mammals such as cows and rabbits, such as chicken ovalbumin, such as mammals such as cows, rabbits, humans and sheep. Hemoglobin, keyhole limpet hemocyanin (KLH), etc. are used.
  • Examples of the synthetic polymer include various latexes such as polymers or copolymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyvinyls, and polypropylenes.
  • the mixing ratio of the carrier and the hapten is such that any antibody can be bound or adsorbed at any ratio as long as an antibody against the antigen bound or adsorbed to the carrier is efficiently produced.
  • the above-mentioned natural or synthetic polymer carrier which is commonly used in the production of the above, can be bound or adsorbed at a ratio of 0.1 to 100 with respect to hapten 1 by weight.
  • various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier.
  • diazonium compounds such as bisdiazotized benzidine that crosslinks tyrosine, histidine, and tryptophan, dialdehyde compounds such as glutaraldehyde that crosslink amino groups, diisocyanate compounds such as toluene-2,4-diisocyanate, and thiol groups
  • dimaleimide compound such as N, N′-o-phenylene dimaleimide, a maleimide active ester compound that crosslinks an amino group and a thiol group, a carbodiimide compound that crosslinks an amino group and a carboxyl group, and the like are advantageously used.
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group on one amino group for example, N-succinimidyl (SPDP) 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • SPDP N-succinimidyl
  • a maleimide group into the other amino group with a maleimide active ester reagent, and then react both.
  • the antigen of the present invention is administered to a warm-blooded animal by, for example, intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, or the like. It is administered to a site where production is possible by itself or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually once every 1 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of warm-blooded animals used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hamsters, sheep, goats, donkeys, and chickens. In order to avoid the problem of anti-Ig antibody production, it is preferable to use a mammal of the same species as the administration subject, but mice and rats are generally preferably used for the production of monoclonal antibodies.
  • human immunization to humans is ethically difficult, when the antibody of the present invention is to be administered to humans, (i) a human antibody-producing animal prepared according to the method described later (eg, mouse) ) To obtain a human antibody, (ii) preparing a chimeric antibody, humanized antibody or fully human antibody according to the method described below, or (iii) in vitro immunization and cell immortalization by virus, human-human (or It is preferable to obtain a human antibody by combining a mouse) hybridoma production technique, a phage display method and the like.
  • in vitro immunization methods can obtain antibodies with antigen amounts on the order of ng to ⁇ g, Can be preferably used also in the case of preparing an antibody derived from a non-human animal as a method for obtaining an antibody against an unstable antigen that is difficult to prepare in large quantities.
  • animal cells used for in vitro immunization include lymphocytes isolated from the peripheral blood, spleen, lymph nodes, etc. of humans and warm-blooded animals (preferably mice and rats) described above, preferably B lymphocytes and the like. .
  • the spleen is removed from an animal of about 4 to 12 weeks of age, and the spleen cells are isolated and an appropriate medium (eg Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, Ham F12 medium, etc.) ) And then suspended in a medium supplemented with fetal calf serum (FCS; about 5 to 20%) containing the antigen and cultured for about 4 to 10 days using a CO 2 incubator or the like.
  • FCS fetal calf serum
  • the antigen concentration include, but are not limited to, 0.05 to 5 ⁇ g. It is preferable to prepare a thymocyte culture supernatant of an animal of the same strain (preferably about 1 to 2 weeks of age) according to a conventional method and add it to the medium.
  • cytokines such as IL-2, IL-4, IL-5, and IL-6, and adjuvant substances (eg, mura) It is preferable to perform immunization by adding a mildipeptide or the like) together with the antigen to the medium.
  • a warm-blooded animal eg, mouse, rat
  • animal cell eg: human, mouse, rat
  • Collect spleen or lymph nodes 2-5 days after final immunization or culture for 4-10 days after in vitro immunization collect cells, isolate antibody-producing cells, and fuse this with myeloma cells to produce antibodies
  • Production hybridomas can be prepared.
  • the antibody titer in serum can be measured, for example, by reacting a labeled antigen with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the myeloma cell is not particularly limited as long as it can produce a hybridoma that secretes a large amount of antibody, but it does not itself produce or secrete an antibody, and more preferably has high cell fusion efficiency.
  • a HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • mouse myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, etc.
  • rat myeloma cells include R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3
  • human myeloma cells include SKO- 007, GM 1500-6TG-2, LICR-LON-HMy2, UC729-6 and the like.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus.
  • PEG polyethylene glycol
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited, but PEG1000 to PEG6000 having low toxicity and relatively low viscosity are preferable.
  • the PEG concentration include about 10 to 80%, preferably about 30 to 50%.
  • various buffer solutions such as serum-free medium (eg RPMI1640), complete medium containing about 5 to 20% serum, phosphate buffered saline (PBS), Tris buffer, etc. may be used. it can.
  • DMSO eg, about 10 to 20%
  • the pH of the fusion solution is, for example, about 4 to 10, preferably about 6 to 8.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells is usually about 1: 1 to 20: 1, and is usually incubated at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for usually 1 to 10 minutes. Cell fusion can be carried out efficiently.
  • Antibody-producing cell lines can also be obtained by infecting antibody-producing cells with a virus capable of transforming lymphocytes to immortalize the cells.
  • viruses include Epstein-Barr (EB) virus.
  • EB Epstein-Barr
  • Recombinant EB virus that retains the ability to immortalize B lymphocytes but lacks the ability to replicate viral particles (for example, switching from a latent infection state to a lytic infection state) as an EB system without the possibility of viral contamination It is also preferable to use a deficiency in the gene.
  • B lymphocytes can be easily transformed using the culture supernatant.
  • serum and penicillin / streptomycin (P / S) -added medium eg RPMI1640
  • serum-free medium added with cell growth factor
  • the culture supernatant is separated by filtration or centrifugation, etc.
  • Antibody production by suspending antibody-producing B lymphocytes at an appropriate concentration (eg, about 10 7 cells / mL) and incubating usually at 20 to 40 ° C., preferably at 30 to 37 ° C., usually for about 0.5 to 2 hours B cell lines can be obtained.
  • T lymphocytes When human antibody-producing cells are provided as mixed lymphocytes, most people have T lymphocytes that are toxic to EB virus-infected cells, so in order to increase the frequency of transformation, for example, it is preferable to remove T lymphocytes in advance by forming E rosette with sheep erythrocytes or the like.
  • sheep erythrocytes bound with a soluble antigen can be mixed with antibody-producing B lymphocytes, and a lymphocyte specific for the target antigen can be selected by separating rosettes using a density gradient such as Percoll.
  • antigen-specific B lymphocytes are capped and no longer present IgG on the surface, so when mixed with sheep erythrocytes bound with anti-IgG antibodies, antigen-nonspecific B lymphocytes Only form a rosette. Therefore, antigen-specific B lymphocytes can be selected by collecting a non-rosette-forming layer using a density gradient such as Percoll from this mixture.
  • Human antibody-secreting cells that have acquired infinite proliferation ability by transformation can be back-fused with mouse or human myeloma cells in order to stably maintain the antibody-secreting ability.
  • myeloma cells the same ones as described above can be used.
  • Hybridoma screening and breeding are usually carried out in animal cell culture medium (eg RPMI1640) containing 5-20% FCS or serum-free medium supplemented with cell growth factor with the addition of HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). Is called.
  • HAT hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • concentration of hypoxanthine, aminopterin, and thymidine include about 0.1 mM, about 0.4 ⁇ M, and about 0.016 mM, respectively.
  • ouabain resistance can be used. Since human cell lines are more sensitive to ouabain than mouse cell lines, unfused human cells can be eliminated by adding them to the medium at about 10 ⁇ 7 to 10 ⁇ 3 M.
  • feeder cells For selection of hybridomas, it is preferable to use feeder cells or certain cell culture supernatants.
  • Feeder cells can be irradiated with different types of cells that have a limited life span so that they can die by helping the emergence of hybridomas, or cells that can produce large amounts of growth factors useful for the appearance of hybridomas. Those having reduced proliferation ability are used.
  • mouse feeder cells include spleen cells, macrophages, blood, thymocytes, etc.
  • human feeder cells include peripheral blood mononuclear cells.
  • the cell culture supernatant include primary culture supernatants of the above-mentioned various cells and culture supernatants of various cell lines.
  • Hybridomas can also be selected by separating the cells that bind to the antigen using a fluorescence activated cell sorter (FACS) after the antigen is fluorescently labeled and reacted with the fused cells.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • aminopterin inhibits many cell functions, it is preferably removed from the medium as soon as possible. In mice and rats, most myeloma cells die within 10-14 days, so aminopterin can be removed after 2 weeks of fusion. However, human hybridomas are usually maintained in a medium containing aminopterin for about 4 to 6 weeks after fusion. It is desirable to remove hypoxanthine and thymidine at least 1 week after removal of aminopterin.
  • a complete medium supplemented with hypoxanthine and thymidine eg, RPMI1640 supplemented with 10% FCS
  • HT hypoxanthine and thymidine
  • FCS thymidine
  • the amount of antibody can be measured, for example, by hybridoma culture supernatant on a solid phase (eg, microplate) on which a target antigen or derivative thereof or a partial peptide thereof (including a partial amino acid sequence used as an antigenic determinant) is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, microplate
  • a target antigen or derivative thereof or a partial peptide thereof including a partial amino acid sequence used as an antigenic determinant
  • radioactive materials eg 125 I, 131 I, 3 H, 14 C
  • enzymes eg ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase
  • fluorescence Anti-immunoglobulin (IgG) antibodies labeled with substances eg fluorescamine, fluorescein isothiocyanate
  • luminescent substances eg luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin
  • the limiting dilution method is usually used as a cloning method, but cloning using soft agar or cloning using FACS is also possible. Cloning by the limiting dilution method can be performed, for example, by the following procedure, but is not limited thereto.
  • the positive well is selected by measuring the amount of antibody as described above. Appropriate feeder cells are selected and added to a 96-well plate.
  • Cells are aspirated from antibody-positive wells, suspended in complete medium (eg RMPI1640 supplemented with 10% FCS and P / S) to a density of 30 cells / mL, and 0.1 mL (3 Cells / well), dilute the remaining cell suspension to 10 cells / mL and sprinkle into another well (1 cell / well), and dilute the remaining cell suspension to 3 cells / mL. Seed into another well (0.3 cells / well). Incubate for 2 to 3 weeks until a visible clone appears, measure the amount of antibody, select a positive well, and clone again. Because human cells are relatively difficult to clone, prepare a 10-cell / well plate. Usually, monoclonal antibody-producing hybridomas can be obtained by subcloning twice, but it is desirable to re-clone regularly for several months to confirm their stability.
  • complete medium eg RMPI1640 supplemented with 10% FCS and P / S
  • Hybridomas can be cultured in vitro or in vivo.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained as described above is used in a well plate while maintaining the cell density at, for example, about 10 5 to 10 6 cells / mL and gradually decreasing the FCS concentration. There is a method of gradually increasing the scale.
  • a mouse in which plasma cell tumor (MOPC) is induced by injecting mineral oil into the peritoneal cavity is used after 10 to 10 6
  • Examples include a method in which a hybridoma of about 10 7 cells is injected intraperitoneally, and ascites is collected under anesthesia 2 to 5 weeks later.
  • a monoclonal antibody can be produced by culturing a hybridoma in a warm-blooded animal in vivo or in vitro and collecting the antibody from the body fluid or culture.
  • the antibody against the immune checkpoint protein In order to inhibit the activity of the immune checkpoint protein, the antibody against the immune checkpoint protein must neutralize the function of the immune checkpoint protein, so it is necessary to examine the neutralizing activity of the obtained monoclonal antibody. is there.
  • the neutralizing activity can be measured, for example, by comparing the degree of binding between PD-1 and PD-L1 in the presence and absence of an antibody.
  • the antibody of the present invention since the antibody of the present invention is used as a pharmaceutical for human administration, the antibody of the present invention (preferably a monoclonal antibody) has a reduced risk of showing antigenicity when administered to a human.
  • Antibodies specifically, fully human antibodies, humanized antibodies, mouse-human chimeric antibodies and the like, particularly preferably fully human antibodies.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immune antigen (protein or peptide antigen) itself or a complex of it and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. It can be produced by collecting the antibody-containing material and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier protein and hapten are determined based on the antibody against the hapten immunized by cross-linking to carrier protein. Any one can be cross-linked at any ratio as long as it is efficient.
  • bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin, etc. are about 0.1 to about 20, preferably about A method of coupling at a rate of 1 to about 5 is used.
  • Various coupling agents can be used for coupling of the hapten and the carrier protein, but an active ester reagent containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithiobilidyl group or the like is used.
  • the condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, or with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every about 1 to about 6 weeks, about 2 to about 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.
  • HVJ-E and immune checkpoint protein inhibitors obtained as described above can be provided as anticancer agents.
  • combined administration of HVJ-E and anti-PD-1 antibody is more effective in suppressing tumor growth in tumor-bearing mice than HVJ-E alone or anti-PD-1 antibody alone And showed the effect of improving the survival rate.
  • this invention can provide the anticancer agent (anticancer agent of this invention) containing the inhibitor of HVJ-E and immune checkpoint protein.
  • the administration target of the anticancer agent of the present invention includes humans or other warm-blooded animals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, birds, etc.), preferably humans. It is.
  • the cancer to which the anticancer agent of the present invention is applied is not particularly limited, for example, melanoma (malignant melanoma), Merkel cell cancer, lung cancer, mesothelioma, head and neck cancer, esophageal cancer , Stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, colon cancer, prostate cancer, kidney cancer, bladder cancer, urothelial cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, brain tumor, thyroid cancer, blood vessel Sarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, fibrosarcoma, synovial sarcoma, liposarcoma, neuroendocrine tumor, lymphoma, leukemia, etc., among which melanoma, mesothelioma or prostate cancer are more appropriate is there. Malignant pleural mesothelioma is more appropriate for mesothelioma.
  • the anticancer agent of the present invention is a combination drug containing the inhibitor of HVJ-E and immune checkpoint protein (the combination drug of the present invention)
  • the pharmaceutical composition containing HVJ-E and inhibition of immune checkpoint protein The kit (kit of this invention) containing the pharmaceutical composition containing a substance may be sufficient.
  • the HVJ-E and immune checkpoint protein inhibitor of the present invention has low toxicity and is used as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as a human or It can be administered to other warm-blooded animals orally or parenterally (eg, intratumoral, intravascular, subcutaneous, intradermal etc.), parenteral administration is preferred, intratumoral administration is preferred More preferred.
  • injections for example, injections, suppositories and the like are used. Injections are intratumoral injections, intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. A dosage form such as an injection may be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • the HVJ-E of the present invention and the immune checkpoint protein inhibitor are dissolved, suspended or emulsified in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injections. Can be prepared.
  • an aqueous solution for injection for example, an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct-of-hydrogenated-castor-oil)), etc. may be used in combination.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct-of-hydrogenated-castor-oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubil
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), Syrups, emulsions, suspensions and the like can be mentioned.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier and excipient for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the compounding agent of the present invention When the compounding agent of the present invention is administered to an adult cancer patient, it can be administered by direct injection, for example, at a tumor site or its peripheral part, intradermally, or subcutaneously.
  • the dose can be appropriately determined by a doctor or medical staff in consideration of the size of the tumor, the age, weight, condition, etc. of the patient.
  • the tumor volume is 1000 mm 3 or less (for example, about 200 mm 3 )
  • the dose of HVJ-E per tumor site is 3 HAU to 750,000 HAU, preferably 30 HAU to 300,000 HAU, more preferably 300 HAU Up to 200,000 HAU (eg, 9,000 HAU to 100,000 HAU). Alternatively, it is preferably 100,000 HAU or less per kg of body weight.
  • the dosage of the inhibitor of PD-1 is the anti-dose per kg body weight when the tumor volume is 1000 mm 3 or less (for example, about 200 mm 3 ).
  • the dose of PD-1 antibody can be 0.1 mg to 10 mg, preferably 0.3 mg to 5 mg, more preferably 1 mg to 3 mg (for example, 2 mg to 3 mg).
  • the dosage of the nucleic acid containing a part can be 10 mg to 2000 mg, preferably 20 mg to 1000 mg, more preferably 50 mg to 300 mg.
  • the dosage of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence encoding PD-1 or a part thereof is preferably 1 mg to 20 mg per kg body weight. Further, it is preferably 10 mg to 500 mg per 1 m 2 of the body surface area.
  • HVJ-E and an immune checkpoint protein inhibitor are respectively used as pharmaceutical compositions of appropriate dosage forms as human or other warm agents. It can be administered orally or parenterally to blood animals.
  • a pharmaceutical composition for parenteral administration and a pharmaceutical composition for oral administration can be prepared in the same manner as the combination preparation of the present invention.
  • the pharmaceutical composition containing HVJ-E and the pharmaceutical composition containing an inhibitor of immune checkpoint protein contained in the kit of the present invention may be administered by the same administration route or by different administration routes.
  • the pharmaceutical composition containing HVJ-E and the pharmaceutical composition containing an inhibitor of immune checkpoint protein may have the same dosage and route of administration as the combination preparation of the present invention.
  • the pharmaceutical composition containing HVJ-E is preferably administered at or around the tumor site, intradermally or subcutaneously, and the anti-PD-1 antibody is administered intravenously, subcutaneously, or subcutaneously.
  • the nucleic acid containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence encoding PD-1 or a part thereof is preferably a tumor site, its periphery, intradermal, Intravenous, subcutaneous or intramuscular administration is preferred. Moreover, the dosage may be the same as when administered by the same route.
  • the pharmaceutical composition containing HVJ-E and the pharmaceutical composition containing an inhibitor of immune checkpoint protein may be administered simultaneously or at different times. Moreover, when both are administered at different time points, either may be administered first. HVJ-E itself can be combined with the anti-cancer effect of the immune checkpoint protein inhibitor to achieve anti-cancer activity that cannot be achieved when used alone.
  • the dose of HVJ-E and immune checkpoint protein inhibitors can be reduced. Is advantageous.
  • the number of administrations can be appropriately determined by a doctor or medical staff in consideration of the size of the tumor, the age, weight, condition, etc. of the patient.
  • Each of the aforementioned pharmaceutical compositions may contain other active ingredients as long as no undesirable interaction is caused by the combination of the HVJ-E of the present invention and the immune checkpoint protein inhibitor.
  • AB22 mouse mesothelioma cell line was maintained in DMEM medium (Nacalai Tesque Inc.) containing 5% FBS (HyClone, South Logan Utah, USA).
  • Eight-week-old female BALB / c mice purchased from Clea Japan were maintained in a sterile room under room temperature control, and were handled according to the approved protocol and guidelines of the animal experiment regulations of Osaka University (Suita, Japan).
  • TRAMP-C1 mouse prostate cancer cell line maintained in DMEM medium (Nacalai Tesque Inc.) containing 10% FBS (BioWest, Nuaille, France) and 0.1 mg / ml penicillin-streptomycin mixed solution (Nacalai Tesque Inc.) Cultured.
  • Seven-week-old female C57BL / 6N mice purchased from Clea Japan were maintained in a sterile room under room temperature control, and were handled according to the approved protocol and guidelines of the animal experiment regulations of Osaka University (Suita, Japan).
  • Virus HVJ VR-105 parainfluenza Sendai / 52 Z strain
  • ATCC Manassas, VA
  • HVJ seed solution was injected into 10-day-old embryonated chicken eggs and cultured in an incubator at 37 ° C. for 3 days. Three days later, allantoic fluid was collected from chicken eggs injected with HVJ. The recovered virus (live HVJ) was inactivated by UV irradiation (198 mJ / cm 2 ) to prepare HVJ-E.
  • Anti-PD-1 antibody Anti-PD-1 antibody
  • Anti-PD-1 antibody (LEAF TM Purified anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody, Catalog #: 114108, Clone: RMP1-14) and control antibody (LEAF TM Purified Rat with isotype IgG2a) IgG2a, ⁇ Isotype Ctrl Antibody, Catalog #: 400516, Clone: RTK2758) were purchased from BioLegend (San Diego, CA, USA).
  • the HVJ-E administration group and the antiPD-1 ab administration group showed an antitumor effect using the tumor size as an index with respect to the PBS administration group as a negative control group.
  • the antiPD-1 ab + HVJ-E administration group the anti-tumor effect was enhanced with the tumor size as an index compared to the HVJ-E administration group and the antiPD-1 ab administration group.
  • the isotype IgG2b + HVJ-E administration group no enhancement of the antitumor effect was observed compared to the HVJ-E administration group and the isotype IgG2b administration group.
  • Example 2 Tumor inoculation test (2) 50 [mu] l 10 6 cells B16-F10 murine melanoma cells suspended in PBS to intradermal injections on the back of C57BL / 6N mice were divided into 4 groups. Six days after the diameter of the tumor became 3-5 mm (Day 0), two of the four groups had 2 HVJ-E (particle number 1.0 ⁇ 10 10 (1000 HAU)) dissolved in a total volume of 50 ⁇ l of PBS. Injected into the tumor of mice 3 times a day, changed the dosage after Day 18 and injected HVJ-E (particle number 5.0 ⁇ 10 10 (5000 HAU)) into the tumor 6 times every 2 days did.
  • HVJ-E particle number 1.0 ⁇ 10 10 (1000 HAU)
  • the HVJ-E administration group showed an antitumor effect using the tumor size as an index compared to the PBS administration group, which was a negative control group, on the 14th day after the start of administration. However, administration after the 18th day did not show an antitumor effect even though the dose of HVJ-E was increased 5 times.
  • the antiPD-1 ab administration group on the 14th day after the start of administration, the anti-tumor effect was shown by using the tumor size as an index for the negative control group PBS administration group. At the 30th day, no antitumor effect was shown.
  • the tumor size index was compared to the HVJ-E administration group and the antiPD-1 ab administration group at any time point on the 14th and 30th day after the start of administration. The antitumor effect was enhanced.
  • Example 3 Tumor inoculation test (3) 10 6 AB22 mouse mesothelioma cells suspended in 50 ⁇ l of PBS were injected intradermally into BALB / c mice and divided into 3 groups. 4, 7, 8, 10, 12, 14, 17, 18, 20, 22, 24 days later, one of the three groups was dissolved in HVJ-E (particle number 1.0 ⁇ 10 10 in one total of 50 ⁇ l of PBS). (1000 HAU)) was administered intratumor a total of 11 times, and the remaining two groups were injected with 50 ⁇ l of PBS into the tumor.
  • HVJ-E particle number 1.0 ⁇ 10 10 in one total of 50 ⁇ l of PBS
  • 1000 HAU 1000 HAU
  • the anti-PD-1 antibody (100 ⁇ g) dissolved in 100 ⁇ l of PBS into the abdominal cavity of the mice administered with the above HVJ-E was administered on the 4th and 18th days. The eye was injected twice.
  • the antiPD-1 ab administration group did not show an antitumor effect using the tumor size as an index compared with the PBS administration group, which is a negative control group, on the 27th day after the start of the test.
  • the antitumor effect was enhanced with the tumor size as an index compared to the antiPD-1 ab administration group at the 27th day after the start of the study.
  • Example 4 Tumor inoculation test (4) 50 [mu] l 10 6 cells AB22 mouse mesothelioma cells suspended in PBS of injected into the thoracic cavity of BALB / c mice were divided into 4 groups. Four days later, HVJ-E (particle count 1.0 ⁇ 10 10 (1000HAU) dissolved in 50 ⁇ l of PBS in total of 50 ⁇ l in 2 groups out of 4 groups was administered 4 times in total for 2 weeks (initially intrathoracic, then The administration was carried out subcutaneously 3 times, and this administration was taken as one cycle and repeated 3 cycles, giving a total of 12 administrations over 6 weeks.
  • HVJ-E particle count 1.0 ⁇ 10 10 (1000HAU) dissolved in 50 ⁇ l of PBS in total of 50 ⁇ l in 2 groups out of 4 groups was administered 4 times in total for 2 weeks (initially intrathoracic, then The administration was carried out subcutaneously 3 times, and this administration was taken as one cycle and repeated 3 cycles, giving
  • the administration was changed to administration, and a total of 4 administrations were performed in 2 weeks. The administration was made into 1 cycle, repeated 3 cycles, and a total of 9 administrations were carried out in 6 weeks (only the first subcutaneous administration was conducted in the 3rd cycle)
  • only 50 ⁇ l of PBS was administered to the remaining two groups, and finally, the number of HVJ-E or PBS administered up to day 73 was 3 times for intrathoracic administration and 3 times for subcutaneous administration.
  • anti-PD-1 antibody 100 ⁇ g
  • antiPD-1 ab + HVJ-E was injected into the abdominal cavity of mice administered HVJ-E as described above.
  • the antiPD-1 ab-administered group did not show an anti-tumor effect with the survival rate as an index compared to the negative control group PBS-administered group, and the survival rate was 0% (all patients died) on the 25th day.
  • the antitype PBS2b + HVJ-E administration group showed enhanced antitumor effects (survival extension) using survival as an index compared to the PBS administration group, which was a negative control group, but survived 73 days after the start of the study. The rate was 0% (all deaths).
  • the survival rate of the antiPD-1 ab + HVJ-E administration group was 40%, which was higher than the antiPD-1 ab administration group and the isotype IgG2b + HVJ-E administration group. It was.
  • HVJ-E particle count 1.0 ⁇ 10 10 (1000 HAU)
  • the HVJ-E group showed an antitumor effect with the tumor size as an index compared to the PBS group as a negative control group.
  • the tumor size was almost the same as that of the PBS group as a negative control group at the 20th day from the start of administration.
  • the anti-tumor effect was enhanced with the tumor size as an index compared to the HVJ-E group and the PD-1ab group.
  • the Ctrl IgG + HVJ-E group had a lower antitumor effect than the HVJ-E group.
  • HVJ-E hemagglutinating virus of Japan envelope
  • anti-cancer drugs containing inhibitors of immune checkpoint protein as active ingredients exhibit significantly more anti-tumor effects than when used alone and are novel cancer treatments Useful as an agent.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2016-214198 (filing date: November 1, 2016) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

本発明は、以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤を提供する。 （１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、 （２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質

Description

ＨＶＪ－Ｅおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む抗がん剤
　本発明は、HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む、抗がん剤に関する。
　免疫チェックポイントタンパク質は、免疫システムの異常賦活化による自己免疫疾患の発症などを防止する因子でありPD-1(Programmed cell death protein 1、別名CD279)、PD-L1（Programmed cell death ligand 1、別名B7-H1/CD274）、PD-L2（Programmed cell death ligand 2、別名：B7-DC/CD273）およびCTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4、別名CD152)などが主要な分子である事が知られている(非特許文献１）。
　これらの免疫チェックポイントタンパク質は、通常免疫系の細胞に発現しており、PD-1は活性化Tリンパ細胞、Bリンパ細胞および骨髄系細胞などの細胞に発現している。PD-1のリガンドであるPD-L1は、γ-インターフェロンの刺激を受けたTリンパ細胞を初めとする体内の種々の細胞に恒常的に発現しており、同様にPD-1のリガンドであるPD-L2は炎症など免疫反応の誘導時に抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞など）に発現誘導される。一方、CTLA-4は活性化Tリンパ細胞やNK細胞に発現誘導され、CTLA-4のリガンドであるB7.1とB7.2は、いずれもマクロファージ、樹状細胞など抗原提示細胞に特化した細胞に発現している。
　がん細胞は、体内の自己細胞に由来するため、従来は免疫システムによる排除を受けにくいものと考えられていたが、近年、免疫チェックポイントタンパク質により免疫システムが抑制されることが、がん細胞が体内で免疫システムからの攻撃を回避するメカニズムである事が示唆されていた(非特許文献２）。特に、がん細胞が発現するPD-L1が、PD-1との結合を介して腫瘍免疫に重要な細胞傷害性Tリンパ細胞の機能を抑制することが明らかとなり、がん細胞が積極的に免疫システムの攻撃を回避している事が明らかとなった(非特許文献３）。また、CTLA-4やPD-1による免疫抑制を解除する事で抗腫瘍効果が認められる事が明らかとなった(非特許文献４）。そのため、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体などの抗体医薬が、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質として臨床開発され、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎癌、ホジキンリンパ腫に対する治療薬として承認されている(非特許文献５）。また、抗PD-L1抗体についても膀胱がん、膵臓がん、乳がん、大腸がん、リンパ腫などの患者を対象とした臨床開発が進められている(非特許文献６）。
　以上の通り、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質による治療が、一部のがんにおいて治療効果を認めたことで、免疫システムを抑制する免疫チェックポイントタンパク質の機能を解除するという新たながん治療の方向性が示された。一方、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質による治療効果が認められない症例や、がん種も報告されており、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質による治療効果を如何にして向上するかが課題となっている(非特許文献７）。
　ところで、HVJ-Eは、げっ歯類に特異性を持つパラミクソウイルスであるHVJ(hemagglutinating virus of Japan)を完全に不活性化した粒子状の物質である(非特許文献８）。これまでに発明者は、HVJ-Eが、抗腫瘍免疫とがん細胞選択的アポトーシスの誘導を含む複数の抗腫瘍活性を有することを報告してきたが(非特許文献９～１３）、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を同時に作用させた場合に、HVJ-Eが有する複合的な抗腫瘍効果がどのように変化をするのかについては明らかにされていない状況である。
Korman AJ, et al. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Adv Immunol. 2006;90:297-339. Dong H, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med. 2002 Aug;8(8):793-800. Kleffel S, et al. Melanoma Cell-Intrinsic PD-1 Receptor Functions Promote Tumor Growth. Cell. 2015 Sep 10;162(6):1242-56. Littman DR. Releasing the Brakes on Cancer Immunotherapy. Cell. 2015 Sep 10;162(6):1186-90. Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science. 2015 Apr 3;348(6230):56-61. Wolchok JD. PD-1 Blockers. Cell. 2015 Aug 27;162(5):937 Tumeh PC, et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):568-71. Kaneda Y, et al. Hemagglutinating virus of Japan (HVJ) envelope vector as a versatile gene delivery system. Mol. Ther. 2002 Aug;6(2):219-26. Kurooka M, Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells. Cancer Research, 67, 227-236, 2007. Kawaguchi Y, et al. Efficient eradication of hormone-resistant human prostate cancers by inactivated Sendai virus particle. Int. J. Cancer 2009. 124: 2478-87. Matsushima-Miyagi T., et al. TRAIL and Noxa are selectively up-regulated in prostate cancer cells downstream of the RIG-I/MAVS signaling pathway by non-replicating Sendai virus particles. Clinical Cancer Research, 18, 6271-83, 2012. Suzuki H, et al. Sendai virus F glycoprotein induces IL-6 production in dendritic cells in a fusion-independent manner. FEBS Letter, 2008. 582: 1325-29. Nomura M, et al. Accumulation of cytosolic calcium induces necroptotic cell death in human neuroblastoma. Cancer Res. 74, 1056-1066, 2014.
　本発明の目的は、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質である抗PD-1抗体をHVJ-Eと組み合わせて、がん細胞を増殖抑制する効果が顕著に増強するのか否かを確認し、その結果を基にHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を組み合わせることによって得られる、がん細胞に対する増殖抑制効果が高い新規抗がん剤、および新たながん治療法を提供することである。
　本発明者は上記課題を解決すべく、悪性黒色腫移植マウスにHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質PD-1の阻害物質である抗PD-1抗体を組み合わせて投与し、抗腫瘍効果について腫瘍サイズの変化を指標として評価した。その結果、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には2種類の分子が協調的に作用してがん細胞の増殖を抑制できることが確認された。さらに、HVJ-Eを単独で投与した場合や、抗PD-1抗体を単独で投与した場合には、抗腫瘍効果が徐々に減弱する現象が認められたのに対して、HVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与した場合には、抗腫瘍効果が増強される現象が認められた。
　また、悪性胸膜中皮腫移植マウスにHVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与し、抗腫瘍効果について腫瘍サイズの変化を指標として評価した。その結果、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には2種類の分子が協調的に作用してがん細胞の増殖を抑制できることが確認された。さらに、悪性胸膜中皮腫移植マウスに対して抗PD-1抗体を単独で投与した場合には、生存率の向上は認められないこと、HVJ-Eとアイソタイプ対照抗体を同時に投与した場合には、生存率が経日的に低下し、評価最終日の生存率が0%となるのに対して、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には評価最終日においても40%のマウスが生存していた。
　さらに、SV40のLargeT遺伝子を発現するトランスジェニックマウスで自然発症した前立腺がん細胞であるTRAMP-C1細胞を移植したマウスにHVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与し、抗腫瘍効果について腫瘍サイズの変化を指標として評価した。その結果、悪性黒色腫移植マウスの場合と同様に、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には2種類の分子が協調的に作用してがん細胞の増殖を抑制できることが確認された。さらに、悪性黒色腫移植マウスの場合と同様に、抗PD-1抗体を単独で投与した場合には、抗腫瘍効果が徐々に減弱し、陰性対照と同様の腫瘍サイズとなってしまう現象が認められたのに対して、HVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与した場合には、それぞれの単剤投与よりも抗腫瘍効果が増強される現象が認められた。
　以上の結果から、HVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与した場合には、それぞれを単独で投与した場合と比較して、がん増殖の抑制効果と生存率の改善効果が当業者の予測を超えて高まることが明らかとなった。以上の発見から、本発明が完成されるに至った。即ち、本発明は、
［１］以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質；
［２］抗がん剤が配合剤である、［１］に記載の抗がん剤；
［３］抗がん剤がHVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物を含むキットである、［１］に記載の抗がん剤；
［４］免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質が、下記から選択される、［１］～［３］のいずれか１つに記載の抗がん剤、
(a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸、
(b) 免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体；
［５］がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、肺がん、中皮腫、頭頚部がん、食道がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、および白血病からなる群から選択される、［１］～［４］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［６］がんが、メラノーマ、中皮腫または前立腺がんである、［１］～［４］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［７］免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7.1、B7.2、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）、KIR、CD137、LAG-3、TIM-3、TIGIT、OX40およびBTLAからなる群から選択される、［１］～［６］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［８］免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［９］以下の（１）および（２）の有効量を対象に投与することを含む、がんの予防または治療方法；
（１）HVJ-E、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質；
を提供する。
　本発明は、有効成分としてHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を組み合わせることによって、単独投与よりも顕著に優れた抗腫瘍効果が期待できる新たな抗がん剤を提供することができる。
悪性黒色種移植マウスにPBS、アイソタイプ対照抗体（腹腔内投与）、抗PD-1抗体（腹腔内投与）、HVJ-E（皮下投与）、HVJ-E（皮下投与）+アイソタイプ対照抗体（腹腔内投与）またはHVJ-E（皮下投与）+抗PD-1抗体（腹腔内投与）を投与し、投与開始後12日観察した場合における、腫瘍体積を示す図である。 悪性黒色種移植マウスにPBS、抗PD-1抗体（腹腔内投与）、HVJ-E（腫瘍内投与）またはHVJ-E（腫瘍内投与）+抗PD-1抗体（腹腔内投与）を投与し、投与開始後30日観察した場合における、腫瘍体積を示す図である。 悪性胸膜中皮腫移植マウスにPBS、抗PD-1抗体（腹腔内投与）またはHVJ-E（腫瘍内投与）+抗PD-1抗体（腹腔内投与）を投与した場合における、腫瘍体積を示す図である。 悪性胸膜中皮腫移植マウスに投与したPBS、抗PD-1抗体、HVJ-E+アイソタイプ対照抗体（IgG2b）またはHVJ-E+抗PD-1抗体の投与スケジュールを示す図である。 悪性胸膜中皮腫移植マウスにPBS、抗PD-1抗体、HVJ-E+アイソタイプ対照抗体（IgG2b）またはHVJ-E+抗PD-1抗体を投与した場合における、マウスの生存率を示す図である。 前立腺がん移植マウスにPBS、抗PD-1抗体（腫瘍内投与）、HVJ-E（皮内投与）、HVJ-E（皮内投与）+アイソタイプ対照抗体（腫瘍内投与）またはHVJ-E（皮内投与）+抗PD-1抗体（腫瘍内投与）を投与し、投与開始後30日観察した場合における、腫瘍体積を示す図である。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、以下の（１）および（２）:
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質
を含む、抗がん剤を提供する。
　本発明において、「センダイウイルスエンベロープ (hemagglutinating virus of Japan envelope、以下、本発明のHVJ-E)」とは、センダイウイルス（hemagglutinating virus of Japan、以下、HVJ）由来のHVJの粒子構造を維持したウイルスエンベロープをいう。HVJとは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属し、細胞融合作用をもつウイルスをいう。HVJ粒子は、その表面にヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを有するエンベロープをもち、直径150～300 nmの多形性を示す。また、HVJは、約15,500塩基長のマイナス鎖RNAをゲノムとして有し、RNAポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶血性を示す。本発明のHVJ-Eの調製のために用いられるHVJとしては、例えばVR-105、VR-907等が挙げられ、American Type Culture Collection（ATCC）から購入することができる。また、HVJは、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであっても良い。
　本発明のHVJ-Eは、HVJを不活性化することによって調製することができる。本発明のHVJ-Eを調製するためのHVJの不活性化方法としては、例えばUV処理やアルキル化処理が挙げられる。不活性化処理により、ゲノムRNAがウイルスエンベロープ内で変性または断片化されてその活性を喪失し、ウイルスとしての複製能が失われる。本発明のHVJ-Eの調製方法は、具体的には、特開2001-286282号公報（WO01/57204号公報）、特開2002-065278号公報、WO03/014338号公報等に記載されており、特に特開2001-286282号公報の実施例８などに記載の方法に従って調製することができる。このようにして得られる本発明のHVJ-Eは複製能が消失しているが、細胞融合能を維持しているため、遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド等を封入することによって、遺伝子導入用ベクターとしても利用することができる。本発明のHVJ-Eはまた、遺伝子やタンパク質を封入したリポソームと予め紫外線照射によりRNAを不活性化したHVJとを融合することで得られる融合粒子（センダイウイルス－リポソーム）であってもよい。
　本発明において、「免疫チェックポイントタンパク質」とは、体内の免疫システムを制御するタンパク質として公知となっている因子であり、癌治療においてその活性阻害が有用であることが示唆されている。免疫チェックポイントタンパク質としては、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7.1、B7.2、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）、KIR、CD137、LAG-3、TIM-3、TIGIT、OX40およびBTLAが挙げられ、その中でもPD-1が好ましく挙げられる。ここで、PD-1は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、PD-L1は、配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、PD-L2は、配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、CTLA-4は、配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7.1は、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7.2は、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7-H3は、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7-H4は、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7-H5（VISTA）は、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質列、KIRは、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、CD137は、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、LAG-3は、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、TIM-3は、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、TIGITは、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、OX40は、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質およびBTLAは、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　本発明において、「免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質」とは、免疫チェックポイントタンパク質の発現または活性を抑制する物質であれば特に制限されない。
　本発明において「免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制する物質」とは、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制する物質としては、例えば、該遺伝子の転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質、免疫チェックポイントタンパク質の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、免疫チェックポイントタンパク質の産生を直接的に阻害するという意味では、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質が好ましい。
　免疫チェックポイントタンパク質のmRNAからタンパク質への翻訳を特異的に阻害する物質として、好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
　免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、
(a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、または
(b) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、免疫チェックポイントタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列
が挙げられる。
　ここで、「免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列」とは、PD-1をコードする塩基配列として配列番号：１で表される塩基配列、PD-L1をコードする塩基配列として配列番号：３で表される塩基配列、PD-L2をコードする塩基配列として配列番号：５で表される塩基配列、CTLA-4をコードする塩基配列として配列番号：７で表される塩基配列、B7.1をコードする塩基配列として配列番号：９で表される塩基配列、B7.2をコードする塩基配列として配列番号：１１で表される塩基配列、B7-H3をコードする塩基配列として配列番号：１３で表される塩基配列、B7-H4をコードする塩基配列として配列番号：１５で表される塩基配列、B7-H5（VISTA）をコードする塩基配列として配列番号：１７で表される塩基配列、KIRをコードする塩基配列として配列番号：１９で表される塩基配列、CD137をコードする塩基配列として配列番号：２１で表される塩基配列、LAG-3をコードする塩基配列として配列番号：２３で表される塩基配列、TIM-3をコードする塩基配列として配列番号：２５で表される塩基配列、TIGITをコードする塩基配列として配列番号：２７で表される塩基配列、OX40をコードする塩基配列として配列番号：２９で表される塩基配列およびBTLAをコードする塩基配列として配列番号：３１で表される塩基配列が挙げられる。
　また、「実質的に相補的」とは、塩基配列間で約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相補性を有することをいう。また、「活性」とは、T細胞のがん細胞に対する抗腫瘍活性を抑制する作用などをいう。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、これらの活性の程度（例えば、約0.1～約10培、好ましくは約0.5～約2倍）やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。免疫チェックポイントタンパク質の活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
　ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。
　より好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。
　「免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。
　具体的には、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の(i)～(iii)のいずれかのものが好ましく例示される。
(i) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するアンチセンス核酸
(ii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNA
(iii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
(i) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するアンチセンス核酸
　本発明における、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するアンチセンス核酸（本発明のアンチセンス核酸）とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
　アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよい。
　上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。
　本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、これらタンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子の5'端ヘアピンループ、5'端６－ベースペア・リピート、5'端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム領域または3'端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
　さらに、本発明のアンチセンス核酸は、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
　アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2'位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2'-O-Me）、CH2CH2OCH3（2'-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
　RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、免疫チェックポイントタンパク質のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
(ii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNA
　本明細書においては、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。
　siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
　siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
(iii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
　本明細書においては、生体内で上記の免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAやそれを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば15から25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAの発現カセットを含む発現ベクターは、上記shRNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製した後、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。
　免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイムが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。免疫チェックポイントタンパク質のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
　免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、細胞導入用物質と組み合されていてもよい。例えば、前記核酸は、HVJ-E、リポソーム、ミクロスフェアに封入された形態で供与されてよい。また、前記核酸は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性物質が付加された形態で供与されてもよい。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3'端または5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3'端または5'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
　これらの核酸の免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質発現阻害活性は、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外の免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子発現系、または生体内や生体外の免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質翻訳系を用いて調べることができる。
　本発明における免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制する物質は、上記のような免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質の産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。
　本発明において「免疫チェックポイントタンパク質の活性を抑制する物質」とは、T細胞のがん細胞に対する抗腫瘍活性を制御する作用を抑制する限り、いかなるものであってもよく、例えば、PD-1とPD-L1との結合を阻害する物質等が挙げられる。
　具体的には、免疫チェックポイントタンパク質の活性を抑制する物質として、例えば、免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
　免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体としては、抗 CTLA-4抗体としてはイピリムマブ（Ipilimumab、Bristol-Myers Squibb）とトレメリムマブ（Tremelimumab、Astrazeneca）を、抗 PD-1抗体としてはニボルマブ（Nivolumab、Bristol-Myers Squibb）とペンブロリズマブ（Pembrolizumab、Merck/MSD）を、抗 PD-L1 抗体としてはデュルルマブ（Durvalumab、Astrazeneca）とアテゾリズマブ（Atezolizumab、Roche）とアベルマブ（Avelumab、Pfizer/ EMD Serono/ Merck KGaA）とピディリツマブ（Pidilizumab、CureTech）を、抗KIR抗体としてはリリルマブ（lirilumab、Bristol-Myers Squibb）を、抗CD137抗体としてはウレルマブ（urelumab、Bristol-Myers Squibb）を、抗LAG-3抗体としては（BMS-986016、Bristol-Myers Squibb）を、それぞれ公知の例として挙げることができる。
　以下に、本発明の抗体を調製するために使用される抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
　本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
　免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドは、例えば、（a）哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c）免疫チェックポイントタンパク質の抗原タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養、あるいは（d）免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
（a）哺乳動物の組織または細胞から免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドを調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
（b）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（a）の方法を用いて天然材料より精製した免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドと同一の構造を有するもの、具体的には、免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドのアミノ酸配列において少なくとも3個以上、好ましくは6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（c）DNAを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該DNAは、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（1）免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプローブを用い、ヒトcDNAライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするDNAを単離するか、（2）免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプライマーを用い、哺乳動物由来のcDNAを鋳型としてPCR法により該抗原をコードするDNAを調製し、該DNAを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
（d）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（c）と同様の方法により調製した抗原をコードするDNAを挿入した発現ベクター（例えば、該DNAがT7、SP6プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するRNAポリメラーゼおよび基質（NTPs）を含む転写反応液を用いてmRNAを合成した後、該mRNAを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
　抗原としては完全な免疫チェックポイントタンパク質やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば3個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは4個以上、より好ましくは5個以上、いっそう好ましくは6個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば20個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは18個以下、より好ましくは15個以下、いっそう好ましくは12個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：1ないし数個）は置換可能な基（例：Cys、水酸基等）によって置換されていてもよい。抗原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を1ないし数個含むアミノ酸配列を有する。
　あるいは、免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（a）項で述べたような天然の細胞、上記（c）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、HEK293、COS7、CHO-K1、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、またはP388などが好ましく用いられる。免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、RPMI1640）または緩衝液（例、Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
　本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約3,000以下）の抗原（即ち、免疫チェックポイントタンパク質の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
　該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン1に対し0.1～100の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
　また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン-2,4-ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するN,N’-o-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
　本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常1～6週毎に1回ずつ、計2～10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
　ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、(i)後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、(ii)後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは(iii)体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト－ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、ng～μgオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
　体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、4～12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、ハムF12培地等））で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（FCS；5～20%程度）添加培地に浮遊させて4～10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05～5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（1～2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
　ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
　モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の2～5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後4～10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
　骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が、ラット骨髄腫細胞としてはR210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3等が、ヒト骨髄腫細胞としてはSKO-007、GM 1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。
　融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Nature）、256巻、495頁(1975年)］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGなどが用いられる。PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いPEG1000～PEG6000が好ましい。PEG濃度としては例えば10～80%程度、好ましくは30～50%程度が例示される。PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例：RPMI1640）、5～20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりDMSO（例：10～20％程度）を添加することもできる。融合液のpHとしては、例えば4～10程度、好ましくは6～8程度が挙げられる。
　抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常1:1～20:1程度であり、通常20～40℃、好ましくは30～37℃で通常1～10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
　抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン－バー（EB）ウイルス等が挙げられる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないEBシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えEBウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
　マーモセット由来のB95-8細胞はEBウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）添加培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約107細胞/mL）で浮遊させて、通常20～40℃、好ましくは30～37℃で通常0.5～2時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はEBウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にIgGを提示しなくなるので、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
　トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
　ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、5～20% FCSを含む動物細胞用培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約0.1mM、約0.4μMおよび約0.016mM等が挙げられる。ヒト－マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、10-7～10-3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
　ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
　また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（FACS）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
　標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
　アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は10～14日以内に死滅するので、融合2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後4～6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後1週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合7～10日後にヒポキサンチンおよびチミジン（HT）添加完全培地（例：10% FCS添加RPMI1640）の添加または交換を行う。融合後8～14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
　抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：125I, 131I, 3H, 14C）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（IgG）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のIgGに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗IgG抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
　クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやFACSを用いたクローニングも可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
　上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して96ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：10% FCSおよびP/S添加RMPI1640）中に30細胞/mLの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに0.1mL（3細胞/ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈して別のウェルに同様にまき（1細胞/ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を3細胞/mLに希釈して別のウェルにまく（0.3細胞/ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで2～3週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、10細胞/ウェルのプレートも調製しておく。通常2回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
　ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
　インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば105～106細胞/mL程度に保ちながら、また、FCS濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
　インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（MOPC）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、5～10日後に106～107細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、2～5週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙げられる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
　モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：DEAE、QEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。
　以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
　免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害するためには、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体は免疫チェックポイントタンパク質の機能を中和するものでなければならないので、得られたモノクローナル抗体の中和活性について調べる必要がある。中和活性は、例えば、抗体の存在下および非存在下におけるPD-1とPD-L1の結合等の程度を比較することにより測定することができる。
　好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス－ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。
（３）ポリクローナル抗体の作製
　本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
　温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1～約20、好ましくは約1～約5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
　また、ハプテンとキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
　縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約1～約6週毎に1回ずつ、計約2～約10回程度行われる。
　ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
　抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
　以上の通りにして得られるHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質は、抗がん剤として提供することができる。
　本明細書の後述する実施例においては、HVJ-Eと抗PD-1抗体の併用投与は、HVJ-E単独投与、抗PD-1抗体単独投与よりも担癌マウスの腫瘍増殖を抑制する効果と生存率を改善する効果を示した。以上のことから、HVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質の併用投与は、がんの発症、進行を治療できることが示唆される。従って、本発明は、HVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む、抗がん剤（本発明の抗がん剤）を提供することができる。
　本発明の抗がん剤の投与対象は、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）があげられ、好ましくはヒトである。
　本発明の抗がん剤の適用対象となるがんは、例えば、特に制限はないが、メラノーマ（悪性黒色腫）、メルケル細胞がん、肺がん、中皮腫、頭頚部がん、食道がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、白血病等があげられるが、その中でも、メラノーマ、中皮腫または前立腺がんがより適切である。また、中皮腫は悪性胸膜中皮腫がより適切である。
　本発明の抗がん剤は、HVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む配合剤（本発明の配合剤）であっても、HVJ-E含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物を含むキット（本発明のキット）であってもよい。
　本発明の抗がん剤が配合剤の場合、本発明のHVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物に対して経口的または非経口的（例、腫瘍内投与、血管内投与、皮下投与、皮内投与など）に投与することができ、非経口投与が好ましく、腫瘍内投与がより好ましい。
　非経口投与のための医薬組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は腫瘍内注射剤、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のHVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO－50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記HVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
　経口投与のための医薬組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
　本発明の配合剤は、成人のがん患者に投与する場合、例えば、腫瘍部位、またはその周辺部、皮内、あるいは皮下に、直接注射により投与することができる。その投与量は、腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたり１回当たりのHVJ-Eの投与量を3HAU～75万HAU、好ましくは30HAU～30万HAU、さらに好ましくは300HAU～20万HAU、(例えば9,000HAU～10万HAU)とすることができる。あるいはまた、体重1kgあたり、10万HAU以下であることが好ましい。また、免疫チェックポイントタンパク質がPD-1の場合、PD-1の阻害物質の投与量は、腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、体重kgあたりの１回あたりの抗PD-1抗体の投与量を0.1mg～10mg、好ましくは0.3mg～5mg、更に好ましくは1mg～3mg（例えば2mg～3mg）とすることができる。あるいは、腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたりの１回あたりのPD-1をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の投与量を10mg～2000mg、好ましくは20mg～1000mg、更に好ましくは50mg～300mgとすることができる。また、PD-1をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の投与量は、体重1kgあたり、1mg～20mgであることが好ましい。更に体表面積1m2あたり、10mg～500mgであることが好ましい。
　本発明の抗がん剤がキットの場合、本発明の配合剤と同様に、HVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質をそれぞれ、適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物に対して経口的または非経口的に投与することができる。非経口投与のための医薬組成物、経口投与のための医薬組成物は、本発明の配合剤と同様の手法で調製することができる。
　本発明のキットに含まれるHVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物は、同一の投与経路で投与されても、異なる投与経路で投与されてもよい。
　同一の経路で投与する場合、HVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物は、本発明の配合剤と同様の投与量および投与経路であってよい。
　また、異なる経路で投与する場合、HVJ-Eを含む医薬組成物は腫瘍部位、またはその周辺部、皮内、あるいは皮下に投与することが好ましく、抗PD-1抗体は静脈内、皮下、皮内、腹腔内等への投与が好ましく、PD-1をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は腫瘍部位、またはその周辺部、皮内、静脈内、皮下あるいは筋肉内等への投与が好ましい。また、その投与量は同一の経路で投与する場合と同様であってよい。
　また、HVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物は、同時に投与されても、互いに異なる時点で投与されてもよい。また、両者が互いに異なる時点で投与される場合は、どちらを先に投与してもよい。
　HVJ-E自体の抗がん効果と免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質の抗がん効果とが相まって、それぞれ単独に用いた場合では実現できない抗がん活性を達成することが可能であるため、HVJ-Eや免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を、それぞれ単独で投与する場合と比較して、HVJ-E及び免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質それぞれの投与量を減らすことが可能であり、安全性の観点から有利である。また、投与回数も腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。
　なお、前記した各医薬組成物は、本発明のHVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
細胞株とマウス
　B16-F10マウスメラノーマ細胞株を10%FBS (BioWest, Nuaille, France)および0.1 mg/mlペニシリン‐ストレプトマイシン混合溶液 (Nacalai Tesque Inc.)を含有するDMEM培地 (Nacalai Tesque Inc.)中で維持培養した。Clea Japanより購入した6週齢の雌C57BL/6Nマウスを室温調節下、無菌室で維持し、大阪大学(Suita, Japan)の動物実験規定の承認プロトコールおよびガイドラインに従って、取り扱った。AB22マウス中皮腫細胞株を5％FBS (HyClone, South Logan Utah, USA)を含むDMEM培地 (Nacalai Tesque Inc.)中で維持培養した。Clea Japanより購入した8週齢の雌BALB/cマウスを室温調節下、無菌室で維持し、大阪大学(Suita, Japan)の動物実験規定の承認プロトコールおよびガイドラインに従って、取り扱った。TRAMP-C1マウス前立腺がん細胞株を10%FBS (BioWest, Nuaille, France)および0.1 mg/mlペニシリン‐ストレプトマイシン混合溶液 (Nacalai Tesque Inc.)を含有するDMEM培地 (Nacalai Tesque Inc.)中で維持培養した。Clea Japanより購入した7週齢の雌C57BL/6Nマウスを室温調節下、無菌室で維持し、大阪大学(Suita, Japan)の動物実験規定の承認プロトコールおよびガイドラインに従って、取り扱った。
ウイルス
　HVJ (VR-105 parainfluenza　Sendai/52 Z strain)をATCC (Manassas, VA)から購入し、Cancer Res. 67, 227-236, 2007に記載の方法に従い調製した。簡潔に述べると、HVJの種溶液を10日齢の孵化鶏卵に注射し、3日間、37℃で培養器中で培養した。3日後に、HVJを注射した鶏卵から尿膜腔液を採取した。回収したウイルス(生HVJ)をUV照射(198 mJ/cm2)によって不活性化し、HVJ-Eを調製した。
抗PD-1抗体
　抗PD-1抗体（LEAFTMPurified anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody、Catalog#: 114108, Clone: RMP1-14）およびアイソタイプが同じIgG2aである対照抗体（LEAFTM Purified Rat IgG2a, κIsotype Ctrl Antibody、Catalog#: 400516, Clone: RTK2758）を BioLegend (San Diego, CA, USA)より購入した。
実施例１　腫瘍接種試験（１）
　50μlのPBS中に懸濁したB16-F10マウスメラノーマ細胞106個をC57BL/6Nマウスの背部に皮内注射し、６群（n=４/群）に分けた。腫瘍の直径が3-5mmになった6日後（Day0）、前記６群のうち３群には、総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を2日ごとに計6回マウスの皮下へ注射し、残りの３群には50μlのPBSのみ2日ごとに計6回マウスの皮下へ注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（HVJ-E投与群）、100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体(100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）または100μlのPBS中に溶解したアイソタイプ対照抗体(100 μg)（isotype IgG2b+HVJ-E投与群）をDay0に単回注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）、100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab投与群）または100μlのPBS中に溶解したアイソタイプ対照抗体(100 μg)（isotype IgG2b投与群）をDay0に単回注射した。腫瘍サイズを12日目まで観察した。腫瘍体積は、ノギスを用いて盲検下で計測し、以下の式を用いて計算した:
腫瘍体積(mm3) =長さ×(幅)2/2
　結果を図１に示す。HVJ-E投与群およびantiPD-1 ab投与群は、それぞれ陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示した。antiPD-1 ab+HVJ-E投与群では、HVJ-E投与群およびantiPD-1 ab投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。一方、isotype IgG2b+HVJ-E投与群では、HVJ-E投与群およびisotype IgG2b投与群に対して抗腫瘍効果の増強は認められなかった。
実施例２　腫瘍接種試験（２）
　50μlのPBS中に懸濁したB16-F10マウスメラノーマ細胞106個をC57BL/6Nマウスの背部に皮内注射し、４群に分けた。腫瘍の直径が3-5mmになった6日後（Day0）、前記４群のうち２群には、総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を2日ごとに計3回マウスの腫瘍内へ注射し、Day18以降は用法用量を変更し、HVJ-E (粒子数5.0 × 1010(5000HAU))を2日ごとに計6回マウスに腫瘍内注射した。残りの２群には50μlのPBSのみ2日ごとに計3回マウスの腫瘍内へ注射し、Day18以降は50μlのPBSのみを2日ごとに計6回マウスに腫瘍内注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（HVJ-E投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）をDay0、Day14およびDay18に計３回注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab投与群）をDay0、Day14およびDay18に計３回注射した。実施例１と同じ計算式に従い、腫瘍サイズを30日目まで観察した。
　結果を図２に示す。HVJ-E投与群は、投与開始後14日目の時点では、陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示したが、投与開始後30日目の時点では、18日目以降の投与ではHVJ-Eの用量を5倍にしたにも係わらず抗腫瘍効果を示さなかった。同様に、antiPD-1 ab投与群においても、投与開始後14日目の時点では、陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示したが、投与開始後30日目の時点では、抗腫瘍効果を示さなかった。一方、antiPD-1 ab+HVJ-E投与群では、投与開始後14日目と30日目のいずれの評価時点でも、HVJ-E投与群およびantiPD-1 ab投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。
実施例３　腫瘍接種試験（３）
　50μlのPBS中に懸濁したAB22マウス中皮腫細胞106個をBALB/cマウスの皮内へ注射し、３群に分けた。4, 7，8，10，12，14，17，18，20，22, 24日後に、前記３群のうち１群に総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を計１１回腫瘍内投与し、残りの２群には50μlのPBSのみ腫瘍内へ注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）を4日目と18日目に計２回注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab投与群）を4日目と18日目に計２回注射した。実施例１と同じ計算式に従い、腫瘍サイズを27日目まで観察した。
　結果を図３に示す。antiPD-1 ab投与群は、試験開始後27日目の時点で、陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示さなかった。一方、antiPD-1 ab+HVJ-E投与群では、試験開始後27日目の時点で、antiPD-1 ab投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。
実施例４　腫瘍接種試験（４）
　50μlのPBS中に懸濁したAB22マウス中皮腫細胞106個をBALB/cマウスの胸腔内へ注射し、４群に分けた。4日後から、前記４群のうち２群に総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU) を2週間で計4回の投与（初回は胸腔内投与、その後3回は皮下投与）を行った。該投与を1サイクルとして、3サイクル繰り返し、6週間で計12回の投与を実施した。7週目以降は各サイクルで行われる4回の投与を全て皮下投与に変更し、2週間で計4回の投与を行った。該投与を1サイクルとして、3サイクル繰り返し、6週間で計9回の投与を実施した（3サイクル目については初回の皮下投与のみを実施）。また、残りの２群には50μlのPBSのみ投与した。最終的に、73日目までのHVJ-E またはPBSの投与回数は、胸腔内投与は計3回、皮下投与は計18回となった。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ総量100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）またはアイソタイプ対照抗体(100 μg)（isotype IgG2b+HVJ-E投与群）を4日目以降の上記の各HVJ-E投与サイクルの初回投与時に注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体(100 μg)（antiPD-1 ab投与群）を4日目以降の上記の各HVJ-E投与サイクルの初回投与時に注射した。最終的に、PBS、抗PD-1抗体またはアイソタイプ対照抗体の投与回数は、計6回となった。生存率を73日目まで観察した。
　結果を図５に示す。antiPD-1 ab投与群は、陰性対照群であるPBS投与群に対して生存率を指標とした抗腫瘍効果を示さず25日目に生存率が0%（全例死亡）となった。陰性対照群であるPBS投与群に対してisotype IgG2b+HVJ-E投与群は生存率を指標とした抗腫瘍効果の増強（生存期間の延長）を示したが、試験開始後73日目に生存率が0%（全例死亡）となった。一方、試験開始後73日目におけるantiPD-1 ab+HVJ-E投与群の生存率は40%であり、antiPD-1 ab投与群やisotype IgG2b+HVJ-E投与群よりも高い生存率を示した。
実施例５　腫瘍接種試験（５）
　50μlのPBS中に懸濁したTRAMP-C1マウス前立腺がん細胞106個を50μlのマトリゲル（Corning　Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration, Phenol Red Free、Catalog#:354262）と混合して計100μlの溶液とした後、 C57BL/6Nマウスの背部に皮内注射し、5群（n=４/群）に分けた。腫瘍の直径が5mm以上になった日をDay0とし、前記５群のうち３群には、総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を2日ごとに計6回（Day0、Day2、Day4、Day6、Day8、Day10）マウスの皮内へ注射し、その後6回（Day20、Day22、Day24、Day26、Day28、Day30）マウスの皮内へ追加注射した。残りの２群には50μlのPBSのみを、上記のHVJ-Eの投与日と同一の日に計12回（Day0、Day2、Day4、Day6、Day8、Day10、Day20、Day22、Day24、Day26、Day28、Day30）マウスの皮内へ注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腫瘍内へ100μlのPBSのみ（HVJ-E群）、100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体(100 μg)（PD-1 ab+HVJ-E群）または100μlのPBS中に溶解したアイソタイプ対照抗体(100 μg)（Ctrl IgG+HVJ-E群）を、Day0とDay20 の計2回注射した。同様に、上記のPBSのみを投与したマウスの腫瘍内へ100μlのPBSのみ（PBS群）、または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（PD-1 ab群）を、Day0とDay20 の計2回注射した。腫瘍サイズを30日目まで観察した。腫瘍体積は、ノギスを用いて盲検下で計測し、以下の式を用いて計算した:
腫瘍体積(mm3) =長さ×(幅)2/2
　結果を図６に示す。HVJ-E群は、陰性対照群であるPBS群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示した。一方PD-1 ab群は、投与開始から20日の時点で陰性対照群であるPBS群とほぼ同様の腫瘍サイズとなった。PD-1 ab+HVJ-E群では、HVJ-E群およびPD-1 ab群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。一方、Ctrl IgG+HVJ-E群は、HVJ-E群よりも抗腫瘍効果が低かった。
　HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を有効成分とする抗がん剤は、それぞれ単独で使用した場合よりも著しい抗腫瘍効果を発揮し、新規ながん治療剤として有用である。本出願は、日本で出願された特願２０１６－２１４１９８（出願日：平成２８年１１月１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (9)

  1. 　以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤：
    （１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
    （２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質。
  2. 　抗がん剤が配合剤である、請求項１に記載の抗がん剤。
  3. 　抗がん剤がHVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物を含むキットである、請求項１に記載の抗がん剤。
  4. 　免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質が、下記から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗がん剤、
    (a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸、
    (b) 免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体。
  5. 　がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、肺がん、中皮腫、頭頚部がん、食道がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、および白血病からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗がん剤。
  6. 　がんが、メラノーマ、中皮腫または前立腺がんである、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗がん剤。
  7. 　免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7.1、B7.2、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）、KIR、CD137、LAG-3、TIM-3、TIGIT、OX40およびBTLAからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗がん剤。
  8. 　免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗がん剤。
  9. 　以下の（１）および（２）の有効量を対象に投与することを含む、がんの予防または治療方法：
    （１）HVJ-E、
    （２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018084185A1 (ja) 2016-11-01 2018-05-11 国立大学法人大阪大学 Ｈｖｊ－ｅおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む抗がん剤
JP6799296B2 (ja) * 2016-12-06 2020-12-16 国立大学法人大阪大学 新規プリオノイド病用治療薬

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001057204A1 (fr) 2000-02-02 2001-08-09 Yasufumi Kaneda Vecteur d'enveloppe virale pour transfert de gene
JP2001286282A (ja) 2000-02-02 2001-10-16 Japan Science & Technology Corp 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター
JP2002065278A (ja) 2000-08-31 2002-03-05 Anges Mg Inc Ｈｖｊの融合タンパク質を含有する遺伝子移入ビヒクル
WO2003014338A1 (fr) 2001-08-02 2003-02-20 Anges Mg, Inc. Procede de production d'enveloppes virales inactivees
WO2010032764A1 (ja) * 2008-09-16 2010-03-25 ジェノミディア株式会社 前立腺癌の治療・予防剤
JP2016214198A (ja) 2015-05-26 2016-12-22 株式会社ファイン ハトムギを用いた健康食品及びその製造方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5631237A (en) 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
EP1449542B1 (en) 2001-11-28 2012-06-13 AnGes MG, Inc. Hgf as genetic remedy for parkinson's disease
CA2497313A1 (en) 2002-08-27 2004-04-29 Anges Mg, Inc. Biomolecule transfer method using virus envelope and composition and system therefor
JP4746877B2 (ja) 2002-11-01 2011-08-10 ジェノミディア株式会社 不活性化されたセンダイウイルスエンベロープを有効成分とする抗癌剤
EP1731609A4 (en) 2004-03-30 2010-04-07 Genomidea Inc INHIBITOR OF THE EXPRESSION OF RAD51, MEDICAMENT CONTAINING THE INHIBITOR AS ACTIVE INGREDIENT AND USE THEREOF
WO2005094878A1 (ja) 2004-03-31 2005-10-13 Genomidea Inc. 抗腫瘍作用を有する組成物
EP1782821A4 (en) 2004-07-29 2009-11-11 Anges Mg Inc MEDICAMENT AND METHOD FOR IMPROVING BRAIN FUNCTION
US10144778B2 (en) 2014-03-12 2018-12-04 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
WO2018084185A1 (ja) 2016-11-01 2018-05-11 国立大学法人大阪大学 Ｈｖｊ－ｅおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む抗がん剤
JP6799296B2 (ja) * 2016-12-06 2020-12-16 国立大学法人大阪大学 新規プリオノイド病用治療薬

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001057204A1 (fr) 2000-02-02 2001-08-09 Yasufumi Kaneda Vecteur d'enveloppe virale pour transfert de gene
JP2001286282A (ja) 2000-02-02 2001-10-16 Japan Science & Technology Corp 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター
JP2002065278A (ja) 2000-08-31 2002-03-05 Anges Mg Inc Ｈｖｊの融合タンパク質を含有する遺伝子移入ビヒクル
WO2003014338A1 (fr) 2001-08-02 2003-02-20 Anges Mg, Inc. Procede de production d'enveloppes virales inactivees
WO2010032764A1 (ja) * 2008-09-16 2010-03-25 ジェノミディア株式会社 前立腺癌の治療・予防剤
JP2016214198A (ja) 2015-05-26 2016-12-22 株式会社ファイン ハトムギを用いた健康食品及びその製造方法

Non-Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANCER RES., vol. 67, 2007, pages 227 - 236
DONG H ET AL.: "Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion", NAT MED., vol. 8, no. 8, August 2002 (2002-08-01), pages 793 - 800, XP002397368, DOI: doi:10.1038/nm730
IMANISHI, T. ET AL., CHEM. COMMUN., vol. 1653-9, 2002
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
JEPSEN, J.S. ET AL., OLIGONUCLEOTIDES, vol. 14, 2004, pages 130 - 46
JINUSHI, MASAHISA ET AL.: "Basis and clinical applications of base TIM-3 molecule", MODERN MEDICINE, vol. 70, no. 3, 10 March 2015 (2015-03-10), pages 42 (366) - 47 (371), XP009514425, ISSN: 0370-8241 *
KANEDA Y ET AL.: "Hemagglutinating virus of Japan (HVJ) envelope vector as a versatile gene delivery system", MOL. THER., vol. 6, no. 2, August 2002 (2002-08-01), pages 219 - 26, XP002957356, DOI: doi:10.1006/mthe.2002.0647
KANEDA, Y. ET AL.: "Development of anti-cancer strategies using HVJ envelope", J. GENE MED., vol. 14, no. 11, 1 November 2012 (2012-11-01), pages 652, XP055503759, ISSN: 1099-498X *
KAWAGUCHI Y ET AL.: "Efficient eradication of hormone-resistant human prostate cancers by inactivated Sendai virus particle", INT. J. CANCER, vol. 124, 2009, pages 2478 - 87, XP055515585, DOI: doi:10.1002/ijc.24234
KLEFFEL S ET AL.: "Melanoma Cell - Intrinsic PD-1 Receptor Functions Promote Tumor Growth", CELL, vol. 162, no. 6, 10 September 2015 (2015-09-10), pages 1242 - 56, XP055594329, DOI: doi:10.1016/j.cell.2015.08.052
KOEHLERMILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
KORMAN AJ ET AL.: "Checkpoint blockade in cancer immunotherapy", ADV IMMUNOL., vol. 90, 2006, pages 297 - 339, XP009101810, DOI: doi:10.1016/S0065-2776(06)90008-X
KUROOKA MKANEDA Y: "Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells", CANCER RESEARCH, vol. 67, 2007, pages 227 - 236, XP055121699, DOI: doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-1615
KUROOKA, M. ET AL.: "Inactivated Sendai Virus Particles Eradicate Tumors by Immune Responses through Blocking Regulatory T Cells", CANCER RES., vol. 67, no. 1, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 227 - 236, XP055121699, ISSN: 0008-5472 *
KUROOKA, MASAYUKI ET. AL. ET AL.: "Anticancer Immunotherapy using Inactivated Sendai Virus Particles", WIRUSU = VIRUS : JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 57, no. 1, 26 June 2007 (2007-06-26), pages 19 - 27, XP009515253, ISSN: 0042-6857, DOI: 10.2222/jsv.57.19 *
LITTMAN DR: "Releasing the Brakes on Cancer Immunotherapy", CELL, vol. 162, no. 6, 10 September 2015 (2015-09-10), pages 1186 - 90
MAEDA, YUKA: "Potential of the Co-stimulatory Molecule OX40 as a Target of Cancer Immunotherapy", MODERN MEDICINE, vol. 70, no. 3, 10 March 2015 (2015-03-10), pages 48 (372) - 53 (377), XP009514426, ISSN: 0370-8241 *
MATSUSHIMA-MIYAGI T. ET AL.: "TRAIL and Noxa are selectively up-regulated in prostate cancer cells ) downstream of the RIG-I/MAVS signaling pathway by non-replicating Sendai virus particles", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 18, 2012, pages 6271 - 83
MORITA, K. ET AL., NUCLEOSIDES NUCLEOTIDES NUCLEIC ACIDS, vol. 22, 2003, pages 1619 - 21
NATURE, vol. 411, no. 6836, 2001, pages 494 - 498
NOMURA M ET AL.: "Accumulation of cytosolic calcium induces necroptotic cell death in human neuroblastoma", CANCER RES., vol. 74, 2014, pages 1056 - 1066
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 29, no. 13, 2001, pages 2780 - 2788
OTT, P. A. ET AL.: "CTLA-4 and PD-1/PD-L1 Blockade:New Immunotherapeutic Modalities with Durable Clinical Benefit in Melanoma Patients", CLIN. CANCER RES., vol. 19, no. 19, 1 October 2013 (2013-10-01), pages 5300 - 5309, XP055458362, ISSN: 1078-0432 *
PHARMA MED., vol. 33, no. 6, 10 June 2015 (2015-06-10), pages 15 - 19, ISSN: 0289-5803 *
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 10, 2001, pages 5572 - 5577
See also references of EP3536329A4
SHARMA PALLISON JP: "The future of immune checkpoint therapy", SCIENCE, vol. 348, no. 6230, 3 April 2015 (2015-04-03), pages 56 - 61, XP055402824, DOI: doi:10.1126/science.aaa8172
SUZUKI H ET AL.: "Sendai virus F glycoprotein induces IL-6 production in dendritic cells in a ) fusion-independent manner", FEBS LETTER, vol. 582, 2008, pages 1325 - 29, XP022587125, DOI: doi:10.1016/j.febslet.2008.03.011
TOPALIAN, S. L. ET AL.: "Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer", N. ENGL. J. MED., vol. 366, no. 26, 28 June 2012 (2012-06-28), pages 2443 - 2454, XP055098235, ISSN: 1078-0432 *
TUMEH PC ET AL.: "PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance", NATURE, vol. 515, no. 7528, 27 November 2014 (2014-11-27), pages 568 - 71, XP055247294, DOI: doi:10.1038/nature13954
WOLCHOK JD: "PD-1 Blockers", CELL, vol. 162, no. 5, 27 August 2015 (2015-08-27), pages 937
YAMAZAKI, NAOYA: "Development of melanoma therapy for clinical antibody CTLA4 and PD-1 antagonist", MODERN MEDICINE, vol. 70, no. 3, 10 March 2015 (2015-03-10), pages 75 (399) - 83 (407), XP009514428, ISSN: 0370-8241 *

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