WO2018080148A2 - Peg-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템 - Google Patents

Peg-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템 Download PDF

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임혜원
윤정임
김민성
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    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional cell culture system comprising a PEG-based hydrogel.
  • PEG polyethylene glycol
  • Another object of the present invention is to bind an adhesion peptide (adhesion peptide) to polyethylene glycol-vinylsulfone (PEG-VS) which is polyethylene glycol (PEG) to which vinylsulfone is bound;
  • PEG-VS polyethylene glycol-vinylsulfone
  • PEG-VS polyethylene glycol
  • PEG-VS polyethylene glycol
  • the hydrogel is to provide a three-dimensional cell culture method comprising the step of making a circular disk form through a gelation reaction.
  • the present invention provides a three-dimensional cell culture system comprising a polyethylene glycol (PEG) -based hydrogel.
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG-based hydrogel is a polyethylene glycol (PEG) bonded to a vinyl sulfone (vinylsulfone) PEG-VS (polyethylene glycol-vinylsulfone) attached peptide (adhesion peptide) and crosslinker (crosslinker) ) May be prepared by mixing.
  • the system may have a circular disk form through the gelation reaction after the cells are inserted.
  • the gelation reaction may be to react at 25 °C to 37 °C for 20 to 40 minutes, preferably it may be reacted at 37 °C for 30 minutes.
  • the attachment peptide may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the attachment peptide may be used at a concentration of 1000 to 4000 ⁇ M, preferably 1000 to 2000 ⁇ M, more preferably at a concentration of 1600 ⁇ M. .
  • the crosslinking agent may be an MMP1-specific crosslinking agent or a multi-MMP-specific crosslinking agent.
  • the MMP1-specific crosslinking agent is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the multi-MMP-specific crosslinking agent may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the system may be for culturing skin cells.
  • the skin cells may be dermal fibroblasts, melanocytes or keratinocytes.
  • the present invention comprises the steps of binding an adhesion peptide (adhesion peptide) to polyethylene glycol-vinylsulfone (PEG-VS), which is a polyethylene glycol (PEG) to which vinyl sulfone (vinylsulfone) is bound; Preparing a PEG-based hydrogel into which cells are inserted by mixing a crosslinker and cells with PEG-VS bound to the attachment peptide; It provides a three-dimensional cell culture method comprising the; hydrogel is made in the form of a circular disk through the gelation reaction.
  • adhesion peptide adhesion peptide
  • PEG-VS polyethylene glycol-vinylsulfone
  • the attachment peptide may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the attachment peptide may be used at a concentration of 1000 to 4000 ⁇ M, preferably 1000 to 2000 ⁇ M, more preferably at a concentration of 1600 ⁇ M. .
  • the crosslinking agent may be an MMP1-specific crosslinking agent or a multi-MMP-specific crosslinking agent.
  • the MMP1-specific crosslinking agent is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the multi-MMP-specific crosslinking agent may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the cells may be dermal fibroblasts, melanocytes or keratinocytes.
  • the gelation reaction may be to react at 25 °C to 37 °C for 20 to 40 minutes.
  • the three-dimensional cell culture system according to the present invention can culture dermal fibroblasts, melanocytes or keratinocytes, which can be useful for measuring the activity of skin cells in vitro .
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a non-cellular niche of a three-dimensional PEG-based hydrogel mimicking the dermal tissue microenvironment in the skin and a three-dimensional culture system of human dermal fibroblasts that can implement a three-dimensional dermal tissue using the same. It is shown.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the growth rate of the cells using an alarmar blue assay after culturing human dermal fibroblasts in PEG-based hydrogel prepared using MMP1-specific crosslinking agent or multi MMP-specific crosslinking agent ( * P ⁇ 0.05). All values represent mean ⁇ SD of the values obtained from the experiments performed three times.
  • Figure 4 shows the growth rate of the cells after culturing human dermal fibroblasts in PEG-based hydrogel prepared using 10% (w / v) 3-, 4- or 8-arm PEG using an alarmar blue assay The analysis results are shown ( * p ⁇ 0.05). All values represent mean ⁇ SD of the values obtained from the experiments performed three times.
  • Human dermal fibroblasts were purchased from Cascade Biologics TM (Portland, OR, USA), 2% (v / v) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT, USA), 3 ng / ml basic fibroblast growth factor ( bFGF; PEPROTECH, Rocky Hill, NJ, USA), 10 ng / ml human epidermal growth factor (EGF; PEPROTECH), 1 ⁇ g / ml hydrocortisone (Sigma-Aldrich, St.
  • FBS fetal bovine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF human epidermal growth factor
  • hydrocortisone Sigma-Aldrich, St.
  • PEG-VS polyethylene glycol-vinylsulfone
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • Crosslinking agents having an amino acid sequence (Ac-GCRD-GPQGIWGQ-DRCG-NH 2 ; SEQ ID NO: 1) cleaved by MMP1, 2, 3, 7, 8 and 9 (hereinafter referred to as "Multi MMP-specific crosslinking agent (multi MMP -specific crosslinker "and a crosslinker having an amino acid sequence specifically cleaved by MMP1 (Ac-GCRD-VPMSMRGG-DRCG-NH 2 ; SEQ ID NO: 2) (hereinafter referred to as" MMP1-specific crosslinker (MMP1 -specific crosslinker ”) was synthesized by Peptron (Daejeon, Korea).
  • Adhesion peptide was synthesized by Peptron (Daejeon, Korea).
  • each PEG-VS is attached with respective crosslinkers in a standard culture medium of human dermal fibroblasts.
  • Peptides were prepared in stock by dissolving in 0.3 M HEPES buffer (pH 8.0), and human dermal fibroblasts were suspended by human dermal fibroblast standard culture medium.
  • the attachment peptide stock solution was reacted with each PEG-VS stock solution for 30 minutes to bind the attachment peptide to each PEG-VS.
  • the PEG-VS solution bound to the attachment peptide was then mixed with the crosslinker and human dermal fibroblast stock solutions.
  • the cells were incubated for 14 days at 7 ° C., 5% CO 2 /95% cell incubator, and 10% (v / v) alarmar on day 1 and day 14 of culture. It was exchanged with the standard culture medium to which blue solution (Invitrogen) was added. After 2 hours, the culture was collected and the absorbance was measured at a wavelength of 570nm and 600nm. Cell proliferation was calculated by dividing the absorbance measured on day 14 of culture with the absorbance measured on day 1 of culture.
  • the three-dimensional scaffold of the present invention was implemented using a PEG-based hydrogel, and in order to prepare a human dermal fibroblast-friendly PEG-based hydrogel, first, a PEG-based made by network formation of PEG-VS and a crosslinking agent
  • the crosslinking agent was optimized to promote the proliferation of human dermal fibroblasts in hydrogels. Spatial expansion in hydrogels is an essential factor for the growth of human dermal fibroblasts in PEG-based hydrogels, the efficiency of which is determined by the amino acid sequence present in the crosslinker and degraded by MMP. Therefore, in order to confirm the type of MMP actively secreted from human dermal fibroblasts, mRNA expression of the MMP family was analyzed by using quantitative real-time PCR of the initially cultured human dermal fibroblasts.
  • MMP1, MMP2, MMP3 gene expression was detected in human dermal fibroblasts (FIG. 2), of which the expression level of MMP1 gene was found to be significantly highest.
  • MMP7, MMP8 and MMP9 gene expression was not detected.
  • a crosslinking agent having an amino acid sequence specifically cleaved by MMP1 (MMP1-specific crosslinking agent) and an amino acid sequence which can be cleaved by MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9
  • MMP1-specific crosslinking agent an amino acid sequence specifically cleaved by MMP1
  • MMP1-specific crosslinking agent multi MMP-specific cross-linking agents
  • MMP1-specific crosslinking agent can be used more effectively for the preparation of three-dimensional scaffold friendly to human dermal fibroblasts.
  • human dermal fibroblasts cultured in 10% (w / v) 3-arm PEG-based hydrogels were treated with 10% (w / v) 4-arm PEG-based hydrogels and 10% (w / v) 8 significantly higher proliferation than human dermal fibroblasts cultured on -arm PEG-based hydrogels, and 10% (w / v) human dermal fibroblasts cultured on 4-arm PEG-based hydrogels.
  • w / v) showed significantly higher proliferation than human dermal fibroblasts cultured on 8-arm PEG-based hydrogels (FIG. 4).
  • no increase in proliferation was observed in human dermal fibroblasts cultured on 10% (w / v) 8-arm PEG-based hydrogels.
  • the physical strength derived from 10% (w / v) 3-arm PEG-based hydrogels prepared using MMP1-specific crosslinkers and 1600 ⁇ M of RGD peptides may more effectively stimulate the proliferation of human dermal fibroblasts. Yes, it was possible to establish PEG-based hydrogel conditions with human dermal fibroblast-friendly physical strength.
  • human dermal fibroblasts cultured on 10% (w / v) 3-arm PEG-based hydrogels bound with 1600 ⁇ M of attachment peptides showed radially elongated cell shapes, typical fibroblast shapes (FIG. 4B). .
  • the friendly three-dimensional noncellular niche that can effectively promote the proliferation and proliferation of human dermal fibroblasts is a 10% (w / v) 3-arm PEG-based hydrogel to which 1600 ⁇ M RGD peptide is bound.
  • a three-dimensional culture system of human dermal fibroblasts capable of realizing three-dimensional dermal tissue.

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Abstract

본 발명은 PEG(polyethylene glycol)-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템에 관한 것으로서, 상기 PEG-기반 하이드로젤은 비닐술폰(vinylsulfone)이 결합된 PEG(polyethylene glycol)인 PEG-VS(polyethylene glycol-vinylsulfone)에 부착 펩타이드(adhesion peptide) 및 가교제(crosslinker)를 혼합하여 제조되며, 상기 시스템은 피부세포인 진피섬유아세포, 멜라노세포 또는 케라틴세포를 배양할 수 있어 피부세포의 활성을 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PEG-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템
본 발명은 PEG-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템에 관한 것이다.
현대 사회에서 경제 성장과 더불어 모든 연령층에서 미에 대한 요구가 증가하면서 화장품산업은 시장 규모가 점차적으로 거대화되고, 이후에 기능성 및 다양성, 안정성을 추구하면서 생명공학, 화학, 의학, 약학 등의 여러 과학기술들이 융합 및 적용됨에 따라 고부가가치산업의 창출을 도모할 수 있는 사업으로 성장하였다. 또한, 현재 글로벌 경제위기에도 불구하고 여성경제활동 인구의 증가, 미용에 대한 관심 증가로 인한 남성유아 소비계층이 확대됨에 따라, 생리활성단백질과 바이오 신약 생산과 개발 산업에 비등할 만큼 피부 미용 관련 의약품 및 화장품 개발 산업에도 투자가 증가하는 추세이다. 특히 고령화 사회의 도래와 함께 보다 더 젊고 건강하게 살아가려는 사회적 트렌드로부터 기인된 안티에이징(항노화)에 대한 관심은 화장품 및 미용분야에서 크게 증가되고 있는 실정이며, 따라서, 안티에이징 화장품 시장은 현재 성장하는 화장품 시장 가운데에 더욱 괄목할 만한 성장을 보여주고 있다.
식품의약품안전처의 2014년 "화장품 표시 광고 관리 가이드라인"에 의하면 화장품 관련 표시 및 광고를 실증하기 위하여 인체적용시험(in vivo) 또는 생체 외 시험(in vitro)을 수행해야 한다. 과거 화장품에 자유롭게 표기되던 피부노화 완화 또는 안티에이징이란 표현이 화장품 표시 광고 주요 실증대상이 되어 인체적용시험 자료 또는 인체 외 시험자료로 입증해야만 하는 상황이다. 현재 안티에이징 효과를 입증하는 연구는 주름개선, 피부탄력, 광노화완화를 중심으로 이루어지고 있으며, 이와 관련하여 진피 내 주요 구성세포인 진피섬유아세포를 활용한 MMP 억제 효능 시험, 라디칼 소거 효능, 염증반응 억제 효능 등의 특정 효소 활성 조절에 관한 실험들이 수행되고 있다.
하지만, 2차원적인 세포 배양 시 세포 본연의 기능 및 표현형을 잃게 되고, 세포와 세포 간 또는 세포 외 기질 간의 상호작용이 결여되어 기능적인 분화특성을 유지할 수 없기 때문에, 이를 이용한 결과를 바탕으로 화장품 유효성분들의 효능에 대해 논하기에는 다소 어려운 실정이다. 이러한 문제점들을 극복할 수 있는 근본적인 하나의 대안으로써 각종 피부세포들의 증식 및 세포활성을 증진시켜 피부조직을 재생시킬 수 있는 생체적합물질을 이용하여 3차원적인 피부조직을 구현하는 것이다. 이를 위해 세계 각국에서 다양한 연구가 진행 중에 있는 상황이며, 최근에는 국내외 여러 회사들에 의해 Apligraf(Organogenesis Inc.), Dermagraft(Advanced Tissue Sciences), Epicel(Genzyme Tissue repair), Integra(Integra Life Sciences), Kaloderm(Tego Science) 등의 이름으로 상품화 되어있다. 하지만 이러한 3D 피부조직 재생 제품들은 체내에 이식되어 내인성 피부세포들의 증식을 유도하도록 설계되어 있기 때문에, 체외에서 피부조직을 구성하고 있는 각각의 피부세포들을 3차원으로 조직화하는 것이 매우 어려운 실정이다. 또한, 이들 시스템들을 통해 구현된 피부조직들은 체내 피부조직 미세환경에 대한 정보들에 기반한 시스템이 아니기 때문에, 실제 체내 피부조직 특성과는 정확히 일치하지 않으며, 다양한 응용을 위해 요구되는 자유로운 피부조직 형태 변화가 어렵다는 점과 함께 생산이 까다로워 효능 검증에 이용하는데 있어서 발생되는 고비용이 아직까지 문제가 되고 있다. 따라서, 국내에서 화장품 내 유효인자들에 대한 정확하고 편리하며, 저비용의 효능 평가를 위한 대안책이 절실히 요구되고 있는 상황이며, 이를 위해 피부조직내 미세환경을 정밀하게 모방한 피부구성세포들의 3차원적 체외 배양시스템 개발이 적극 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
1. 한국공개특허 제10-2016-0038120호
2. 한국공개특허 제10-2016-0111563호
본 발명의 목적은 PEG(polyethylene glycol)-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비닐술폰(vinylsulfone)이 결합된 PEG(polyethylene glycol)인 PEG-VS(polyethylene glycol-vinylsulfone)에 부착 펩타이드(adhesion peptide)를 결합시키는 단계; 상기 부착 펩타이드가 결합된 PEG-VS에 가교제(crosslinker) 및 세포를 혼합하여 세포가 삽입된 PEG-기반 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤은 젤화반응을 통해 원형 디스크 형태로 만드는 단계;를 포함하는 3차원 세포배양 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PEG(polyethylene glycol)-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PEG-기반 하이드로젤은 비닐술폰(vinylsulfone)이 결합된 PEG(polyethylene glycol)인 PEG-VS(polyethylene glycol-vinylsulfone)에 부착 펩타이드(adhesion peptide) 및 가교제(crosslinker)를 혼합하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시스템은 세포가 삽입된 후 젤화반응을 통해 원형 디스크 형태를 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 젤화반응은 20분 내지 40분 동안 25℃ 내지 37℃에서 반응시키는 것일 수 있고, 바람직하게는 30분 동안 37℃에서 반응시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 부착 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 부착 펩타이드는 1000 내지 4000 μM의 농도, 바람직하게는 1000 내지 2000 μM의 농도로 사용되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1600 μM의 농도로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가교제는 MMP1-특이적인 가교제 또는 multi-MMP-특이적인 가교제인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 MMP1-특이적인 가교제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 multi-MMP-특이적인 가교제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시스템은 피부세포의 배양을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피부세포는 진피섬유아세포, 멜라노세포 또는 케라틴세포인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 비닐술폰(vinylsulfone)이 결합된 PEG(polyethylene glycol)인 PEG-VS(polyethylene glycol-vinylsulfone)에 부착 펩타이드(adhesion peptide)를 결합시키는 단계; 상기 부착 펩타이드가 결합된 PEG-VS에 가교제(crosslinker) 및 세포를 혼합하여 세포가 삽입된 PEG-기반 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤은 젤화반응을 통해 원형 디스크 형태로 만드는 단계;를 포함하는 3차원 세포배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 부착 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 부착 펩타이드는 1000 내지 4000 μM의 농도, 바람직하게는 1000 내지 2000 μM의 농도로 사용되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1600 μM의 농도로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가교제는 MMP1-특이적인 가교제 또는 multi-MMP-특이적인 가교제인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 MMP1-특이적인 가교제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 multi-MMP-특이적인 가교제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 진피섬유아세포, 멜라노세포 또는 케라틴세포인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 젤화반응은 20분 내지 40분 동안 25℃ 내지 37℃에서 반응시키는 것일 수 있다.
또한, 3차원 세포배양 시스템을 이용하여 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포의 증식, 분화 도는 사멸을 분석하는 단계;를 포함하는 세포활성 측정방법을 제공한다.
본 발명에 따른 3차원 세포배양 시스템은 피부세포인 진피섬유아세포, 멜라노세포 또는 케라틴세포를 배양할 수 있어 in vitro에서 피부세포의 활성을 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 피부 내 진피조직 미세환경을 모방한 3차원 PEG-기반 하이드로젤의 비세포성니쉬 및 이를 활용한 3차원 형태의 진피조직을 구현할 수 있는 인간진피섬유아세포의 3차원 배양시스템에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 인간진피섬유아세포에서 발현되는 MMP 종류를 quantitative real-time PCR를 이용하여 분석한 결과이다(ND=not detected, * p<0.05). 모든 값은 3번 수행된 실험들로부터 얻은 값들의 mean±SD를 의미한다.
도 3은 MMP1-특이적인 가교제 또는 multi MMP-특이적인 가교제를 사용하여 제조된 PEG-기반 하이드로젤 내에 인간진피섬유아세포를 배양한 후, 세포의 증식률을 alarmar blue assay를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다( * p<0.05). 모든 값은 3번 수행된 실험들로부터 얻은 값들의 mean±SD를 의미한다.
도 4는 10% (w/v) 3-, 4- 또는 8-arm PEG 를 이용하여 제조된 PEG-기반 하이드로젤 내에 인간진피섬유아세포를 배양한 후, 세포의 증식률을 alarmar blue assay를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다( * p<0.05). 모든 값은 3번 수행된 실험들로부터 얻은 값들의 mean±SD를 의미한다.
도 5는 0, 1600, 2400 또는 3000μM 의 RGD 펩타이드(부착 펩타이드)를 이용하여 제조된 PEG-기반 하이드로젤 내에 인간진피섬유아세포를 배양한 후, 세포의 증식률을 alarmar blue assay를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다(*,** p<0.05). 모든 값은 3번 수행된 실험들로부터 얻은 값들의 mean±SD를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험재료 및 방법
1.1. 세포주 및 세포배양 방법
인간진피섬유아세포는 Cascade BiologicsTM (Portland, OR, USA)에서 구입하였고, 2%(v/v) 소태아혈청 (FBS; Hyclone, Logan, UT, USA), 3ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF; PEPROTECH, Rocky Hill, NJ, USA), 10ng/㎖ 인간 상피세포 성장인자(EGF; PEPROTECH), 1㎍/㎖ 하이드로코티손(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10㎍/㎖ 겐타마이신(Cascade BiologicsTM) 및 0.25㎍/㎖ 암포테리신 B (Cascade BiologicsTM)가 첨가된 M106 배지(Cascade BiologicsTM; 이하, "표준배양배지"라고 함)에서 37℃, 5% CO2/95% 공기의 습식 세포 배양기 (MCO-20AIC; SANYO, Gunma, Japan)를 사용하여 인간진피섬유아세포를 배양하였다. 계대 배양은 7일 간격으로 수행되었고, 배지는 2일에 한 번 교환되었다. 각각의 실험에는 3회 내지 5회 계대의 인간진피섬유아세포가 사용되었다.
1.2. PEG-기반 하이드로젤 (PEG-based hydrogel )의 제작, 인간진피섬유아세포에의 도입 및 배양
비닐술폰(Vinylsulfone)이 결합된 3-, 4-, 8-arm PEG (PEG-VS; polyethylene glycol-vinylsulfone)는 JenKem Technology(Plano, TX, USA)에서 구입되었다. PEG-기반 하이드로젤(PEG-based hydrogel)은 각각의 PEG-VS과 MMP(matrix metalloproteinase)에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열을 내부에 보유하고 양쪽 끝에 시스테인(cystein)을 가지고 있는 펩타이드(이하, "가교제(crosslinker)"라고 함)를 미카엘 유형 첨가(Michael-type addition) 반응을 통해 결합시킴으로써 형성되었다. MMP1, 2, 3, 7, 8 및 9에 의해 절단되는 아미노산 서열(Ac-GCRD-GPQGIWGQ-DRCG-NH2; 서열번호 1)을 가지고 있는 가교제(이하, "Multi MMP-특이적인 가교제(multi MMP-specific crosslinker)"라고 함)와 MMP1에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열(Ac-GCRD-VPMSMRGG-DRCG-NH2; 서열번호 2)을 가지고 있는 가교제(이하, "MMP1-특이적인 가교제(MMP1-specific crosslinker)"라고 함)를 Peptron(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 또한, 부착세포들의 일종인 인간진피섬유아세포가 PEG-기반 하이드로젤(PEG-based hydrogel)내에서 부착할 수 있는 모티프를 제공하기 위해 Ac-RGDSP(서열번호 3)와 같은 아미노산 서열을 가진 부착 펩타이드(adhesion peptide)를 Peptron(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였다.
인간진피섬유아세포가 삽입될 부착 펩타이드가 결합된 10% (w/v) PEG-기반 하이드로젤을 제작하기 위하여, 각각의 PEG-VS는 인간진피섬유아세포의 표준배양배지에서 각각의 가교제들과 부착 펩타이드를 0.3M HEPES buffer(pH 8.0)에 녹여 스톡(stock)으로 준비하였고, 인간진피섬유아세포들은 인간진피섬유아세포 표준배양배지에 의해 현탁되었다. 각각의 PEG-VS에 부착 펩타이드를 결합시키기 위해 부착 펩타이드 스톡 용액은 각각의 PEG-VS 스톡 용액과 30분 동안 반응시켰다. 이후, 부착 펩타이드가 결합된 PEG-VS 용액은 가교제와 인간진피섬유아세포 스톡 용액들과 혼합되었다. 6μl의 혼합 용액은 원형 디스크 형태로 만들어서 30분 동안 37℃에서 겔화반응을 시켰다. 이후, PEG-기반 하이드로젤에 삽입된 인간진피섬유아세포는 37℃, 5% CO2/95%의 세포 배양기에서 표준배양배지를 사용하여 7일 동안 배양되었으며, 배지는 매일 교환하였다.
1.3. 인간진피섬유아세포의 세포증식률 분석 방법
인간진피섬유아세포의 세포 증식률을 분석하기 위하여, 상기 세포는 7℃, 5% CO2/95%의 세포배양기에서 14일 동안 배양되었고, 배양 1일째와 14일째에는 10% (v/v) alarmar blue solution(Invitrogen)가 첨가된 표준배양배지로 교환되었다. 2시간 후, 배양액을 수집하여 570nm와 600nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 배양 14일째 측정된 흡광도를 배양 1일째에 측정된 흡광도로 나누어 계산되었다.
1.4. 통계분석
모든 데이터는 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하여 통계분석을 하였고, SAS 패키지에 포함된 ANOVA(analysis of variance)를 이용하여 각 실험에 대한 유의성 검정을 수행하였다. 유의적 차이는 least-square 또는 DUNCAN 방법을 이용하여 측정하였고, p value가 0.05 미만일 때, 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실시예 2. 3차원 스캐폴드 제작에 필요한 인간진피섬유아세포 친화적인 가교제에 대한 분석 결과
본 발명의 3차원 스캐폴드는 PEG-기반 하이드로젤을 이용하여 구현되었으며, 인간진피섬유아세포 친화적 PEG-기반 하이드로젤을 제작하기 위해, 우선, PEG-VS과 가교제의 네트워크 형성에 의해 만들어진 PEG-기반 하이드로젤 내에서 인간진피섬유아세포의 증식을 촉진시키기 위해 가교제를 최적화하고자 하였다. PEG-기반 하이드로젤 내에서 인간진피섬유아세포가 증식하기 위해서는 하이드로젤 내에서의 공간 확장은 필수적인 요소이며, 이러한 공간 확장 효율은 가교제 내에 존재하면서 MMP에 의해 분해되는 아미노산 서열에 의해 결정된다. 따라서, 인간진피섬유아세포에서 활발히 분비되어지는 MMP의 유형을 확인하기 위해, 초기 배양된 인간진피섬유아세포를 quantitative real-time PCR를 이용하여 MMP family의 mRNA 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, 인간진피섬유아세포에서 MMP1, MMP2, MMP3 유전자 발현이 탐지되었으며(도 2), 이 중 MMP1 유전자의 발현수준이 유의적으로 가장 높았음을 확인하였다. 반면, MMP7, MMP8 및 MMP9 유전자 발현은 탐지되지 않았다.
상기 결과를 바탕으로, MMP1에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열을 가지고 있는 가교제(MMP1-특이적인 가교제)와 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9에 의해 모두 절단될 수 있는 아미노산 서열을 가지고 있는 가교제(multi MMP-특이적인 가교제)를 제작하였으며, 이들과 1600μM의 부착 펩타이드를 이용하여 제작된 3차원 PEG-기반 하이드로젤 내에서 배양된 인간진피섬유아세포의 증식률을 분석하였다.
그 결과, MMP1-특이적인 가교제를 이용하여 제작된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포의 증식률이 multi MMP-특이적인 가교제를 이용하여 제작된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포의 증식률보다 유의적으로 높았음을 확인하였다(도 3).
따라서, MMP1-특이적인 가교제는 인간진피섬유아세포에 친화적인 3차원 스캐폴드 제작에 더욱 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 3차원 스캐폴드 제작에 필요한 PEG-기반 하이드로젤 (PEG-based hydrogel)의 조건에 대한 분석 결과
이후, 인간진피섬유아세포의 증식을 자극할 수 있는 물리적 강도를 가지는 3차원 PEG-기반 하이드로젤 조건을 탐색하기 위해, 초기 배양된 인간진피섬유아세포는 MMP1-특이적인 가교제와 1600μM의 부착 펩타이드를 이용하여 제작된 10% (w/v) 3-, 4-, 8-arm PEG-기반 하이드로젤 내에서 각각 배양되었고, 2주 후 각 PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포의 증식률을 분석하였다.
그 결과, 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포는 10% (w/v) 4-arm PEG-기반 하이드로젤과 10% (w/v) 8-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포보다 유의적으로 높은 증식률을 보여주었고, 10% (w/v) 4-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포는 10% (w/v) 8-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포보다 유의적으로 높은 증식률을 보여주었다(도 4). 반면, 10% (w/v) 8-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포에서는 증식률의 증가가 전혀 나타나지 않았다.
따라서, MMP1-특이적인 가교제와 1600μM의 RGD 펩타이드를 이용하여 제작된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤로부터 유래한 물리적 강도는 인간진피섬유아세포의 증식을 보다 더 효과적으로 자극할 수 있음 확인할 수 있었으며, 인간진피섬유아세포 친화적 물리적 강도를 가지고 있는 PEG-기반 하이드로젤 조건을 확립할 수 있었다.
실시예 4. 3차원 스캐폴드 제작에 필요한 부착 펩타이드(adhesion peptide)의 조건에 대한 분석 결과
마지막으로, 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤내에서 인간진피섬유아세포 증식을 자극할 수 있는 부착 펩타이드의 농도를 최적화하고자 하였다. 이를 위해, 인간진피섬유아세포는 MMP1-특이적인 가교제와 0, 1600, 2400 및 3000μM의 부착 펩타이드가 각각 결합되어 있는 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤 내에서 14일 동안 배양되었고, 이후 각각의 PEG-기반 하이드로젤 내에 배양된 인간진피섬유아세포의 증식률을 분석하였다.
그 결과, 1600μM 부착 펩타이드가 결합된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포는 0μM과 2400μM의 부착 펩타이드가 결합된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포보다 유의적으로 더 높은 증식률을 보여주었다(도 4A). 반면, 3000μM의 부착 펩타이드가 결합된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤은 2주 동안 3차원적 미세환경을 유지하지 못하고 분해되었다(도 4A). 또한, 1600μM의 부착 펩타이드가 결합된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤에서 배양된 인간진피섬유아세포는 전형적인 섬유아세포 모양인 방사형으로 길게 늘어진 세포 모양을 보여주었다 (도 4B).
따라서, 인간진피섬유아세포의 증식과 확산을 효과적으로 촉진시킬 수 있는 친화적인 3차원 비세포성니쉬는 1600μM RGD 펩타이드가 결합된 10% (w/v) 3-arm PEG-기반 하이드로젤임을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 3차원 형태의 진피조직을 구현할 수 있는 인간진피섬유아세포의 3차원 배양시스템을 개발할 수 있었다.

Claims (18)

  1. PEG(polyethylene glycol)-기반 하이드로젤을 포함하는 3차원 세포배양 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 PEG-기반 하이드로젤은 비닐술폰(vinylsulfone)이 결합된 PEG(polyethylene glycol)인 PEG-VS(polyethylene glycol-vinylsulfone)에 부착 펩타이드(adhesion peptide) 및 가교제(crosslinker)를 혼합하여 제조된 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 시스템은 세포가 삽입된 후 젤화반응을 통해 원형 디스크 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 젤화반응은 20분 내지 40분 동안 25℃ 내지 37℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 부착 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 부착 펩타이드는 1000 내지 4000 μM의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 가교제는 MMP1-특이적인 가교제 또는 multi-MMP-특이적인 가교제인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 MMP1-특이적인 가교제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 multi-MMP-특이적인 가교제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 시스템은 피부세포의 배양을 위한 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 피부세포는 진피섬유아세포, 멜라노세포 또는 케라틴세포인 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 비닐술폰(vinylsulfone)이 결합된 PEG(polyethylene glycol)인 PEG-VS(polyethylene glycol-vinylsulfone)에 부착 펩타이드(adhesion peptide)를 결합시키는 단계;
    상기 부착 펩타이드가 결합된 PEG-VS에 가교제(crosslinker) 및 세포를 혼합하여 세포가 삽입된 PEG-기반 하이드로젤을 제조하는 단계; 및
    상기 하이드로젤은 젤화반응을 통해 원형 디스크 형태로 만드는 단계;를 포함하는 3차원 세포배양 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 부착 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 부착 펩타이드는 1000 내지 4000 μM의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 가교제는 MMP1-특이적인 가교제 또는 multi-MMP-특이적인 가교제인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 MMP1-특이적인 가교제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 multi-MMP-특이적인 가교제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서,
    상기 세포는 진피섬유아세포, 멜라노세포 또는 케라틴세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 젤화반응은 20분 내지 40분 동안 25℃ 내지 37℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항의 세포배양 시스템을 이용하여 세포를 배양하는 단계 및
    상기 세포의 증식, 분화 도는 사멸을 분석하는 단계;를 포함하는 세포활성 측정방법.
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