WO2018073500A1 - Utilisation de gaz comprimé pour le déplacement d'éluant appliqué à la chromatographie - Google Patents

Utilisation de gaz comprimé pour le déplacement d'éluant appliqué à la chromatographie Download PDF

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WO2018073500A1
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stationary phase
compressed gas
regeneration
phase
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Jérôme BONI
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Novasep Process
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    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • B01D15/203—Equilibration or regeneration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1814—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns recycling of the fraction to be distributed
    • B01D15/1821—Simulated moving beds

Definitions

  • the present invention relates to a chromatographic separation process including a step of moving an eluent by a compressed gas such as CO2.
  • the invention also relates to an installation adapted to the implementation of this method.
  • CN 103288571 discloses the separation of squalene by high performance liquid chromatography (HPLC) on a silica gel by first eluting with an eluent such as n-hexane, followed by a second elution with an eluent comprising a mixture such as n-hexane and cyclohexane in volume ratios such as 5-20: 1.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • US 6,072,092 discloses the separation of tocopherols and tocotrienols by HPLC on a silica gel by means of a first elution with an apolar solution followed by a second elution with a polar solution or a mixture of polar and apolar solutions.
  • WO 2014/100327 describes the separation of isomers of tocotrienol by HPLC on a silica gel; two elutions are carried out with a mixture of apolar solutions with a low polar solution content.
  • CN 101323607 discloses the separation of tocopherols by HPLC in three successive elutions.
  • CN 1013197 discloses the separation of tocopherols with simple elution with a mixture of apolar solution and a low ratio of polar solution. It is the same for the documents WO 94/08987 and EP 1424013 describing the separation of carotenes, and the document WO 2003/37884 on the extraction of tocopherols.
  • GB 8729232 and EP 1083174 disclose reverse phase separation methods, wherein the adsorption of the product or impurities on the chromatographic medium is via hydrophobic type bonds.
  • elution of the product is by means of a solution of CO2 and / or apolar solution.
  • Documents EP 1 122250, EP 1097985 and IN 2005DE00333 propose the application of this method for the separation of carotenes and / or vitamin E derivatives, derived from palm oil or palm oil derivatives.
  • the support is of ungrafted silica type or C18 type, and the separation of the product of interest and impurities is done using a temperature gradient and / or pressure during the elution step.
  • WO 2007/90545 proposes the use of gas in the supercritical state for a two-step process, in which a palm oil derivative previously concentrated in the product of interest (vitamin E or carotene) is extracted by a fluid.
  • supercritical in continuous mode step 1) then purified by chromatographic method with desorption controlled by supercritical CO2 in the case of vitamin E derivatives, and by supercritical propane in the case of carotenes.
  • a separation on a chromatography column is based on a series of steps, a typical sequence of which is detailed below: - Step 1: balancing.
  • the separation matrix also called stationary phase, is balanced by an eluent having a low affinity with the matrix.
  • the nature of the eluent can be identical to that of the eluent used during the elution step. This step makes the adsorption sites available.
  • Step 2 injection of the product.
  • the product to be separated is injected into the medium.
  • the product can remain adsorbed on the support or be driven along the column.
  • impurities can be driven or not depending on their affinity with the stationary phase.
  • Step 3 elution of low affinity impurities with the stationary phase.
  • this step also called rinsing, certain impurities with low affinity with the stationary phase are eluted with an eluent also having a low affinity with the stationary phase.
  • This rinse eluent may be identical to that used in the balancing step or the elution step of the product.
  • Step 4 elution of the product.
  • the product to be separated is desorbed by an eluent which may be identical to that used in the injection phase or in the equilibration phase or have a higher affinity with the stationary phase.
  • Step 5 (optional): cleaning or regeneration.
  • Another eluent with a higher affinity with the stationary phase is then introduced into the column in order to remove non-eluted impurities by one of the solvents of steps 2, 3 or 4 because they are strongly bound to the stationary phase.
  • Another disadvantage of this method when applied to the scale of production, is related to the difficulty of recycling the solvents used. in the mobile phase. Indeed, when a solvent in one chromatography column is displaced by another, it is a mixture of these two solvents which is first found at the column outlet, until all the solvent molecules to be replaced. completely desorbed, as shown in FIG.
  • the differences in elution strength between the solvents are more significant, and the residual contents of washing solvent that can be accepted in the recycled solvent for equilibration, injection or elution. should be even lower in order to avoid too rapid elution of the poorly retained product and also to avoid its co-elution with impurities supposed to be more restrained.
  • this method requires large volumes of eluent with a very high purity, and a distillation step is necessary to separate the various eluents before recycling and thus avoid a very high consumption of solvents.
  • the invention relates first of all to a chromatographic separation process, comprising at least one step of eluting species retained on a stationary phase by means of an eluent, followed by a step of moving the eluent in contact with the stationary phase by means of a compressed gas.
  • the compressed gas is in the liquid state.
  • the compressed gas is in the supercritical state.
  • the compressed gas is CO2.
  • the absolute pressure of the compressed gas used for the displacement step is less than or equal to 300 bar, preferably 200 bar, preferably 150 bar, preferably 100 bar, preferably 75 bar. more preferably at 50 bar.
  • the eluent is a single compound.
  • the eluent is a mixture of at least two compounds.
  • the eluent is an aqueous and / or organic solvent or a mixture of aqueous and / or organic solvents.
  • the eluent is a mixture of aqueous and / or organic solvent (s) and compressed gas, preferably CO2 in the liquid or supercritical state.
  • the method comprises, after the step of displacing the eluent, the collection of a mixture of compressed gas and aqueous and / or organic solvent (s) at the outlet of the stationary phase, and the separation of the compressed gas and the aqueous and / or organic solvent (s).
  • the (s) aqueous solvent (s) and / or organic are recycled discontinuously.
  • the (s) aqueous solvent (s) and / or organic are recycled continuously.
  • the aqueous and / or organic solvent (s) are recycled to more than 50%, preferably 60%, preferably 70%, preferably 80%, preferably 90%, preferably %, preferably 99%, by weight.
  • the compressed gas is recycled discontinuously.
  • the compressed gas is recycled continuously.
  • the compressed gas is recycled to more than
  • said step of eluting species retained on a stationary phase by means of an eluent is an elution step of product (s) of interest.
  • said step of eluting species retained on a stationary phase by means of an eluent is a stage of regeneration of the stationary phase.
  • said eluent is a first eluent
  • the process comprising, after the step of displacing the eluent by means of a compressed gas, bringing into contact a second eluent with the stationary phase, which is preferably different from the first eluent.
  • bringing a second eluent into contact with the stationary phase is a stage of regeneration of the stationary phase.
  • bringing a second eluent into contact with the stationary phase is a balancing step.
  • the method comprises cyclically:
  • a balancing step comprising contacting a balancing eluent with the stationary phase
  • an injection step comprising contacting a composition comprising a product to be separated with the stationary phase
  • an optional rinsing step comprising contacting a rinsing eluent with the stationary phase
  • a step of eluting the product comprising contacting an eluting eluent with the stationary phase and collecting the product to be separated;
  • step of moving eluent in contact with the stationary phase by means of a compressed gas being carried out between the product elution step and the equilibration step.
  • the method comprises successively or cyclically:
  • a balancing step comprising contacting a balancing eluent with the stationary phase
  • an injection step comprising contacting a composition comprising a product to be separated with the stationary phase; an optional rinsing step, comprising contacting a rinsing eluent with the stationary phase;
  • a step of eluting the product comprising contacting an eluting eluent with the stationary phase and collecting the product to be separated;
  • a regeneration step comprising contacting a regeneration eluent with the stationary phase
  • the method comprising at least one eluent displacement step in contact with the stationary phase by means of a compressed gas between the product elution step and the regeneration step; and / or between the regeneration step and the balancing step.
  • the method comprises both an eluent displacement step in contact with the stationary phase by means of a compressed gas between the product elution step and the regeneration step, and a another eluent displacement step in contact with the stationary phase by means of a compressed gas between the regeneration step and the equilibration step.
  • the equilibration, injection, optionally rinsing, elution and, if appropriate, regeneration steps are carried out with eluents comprising a compressed gas.
  • the equilibration, injection, optionally rinsing, elution and, where appropriate, regeneration steps are carried out with eluents not comprising compressed gas.
  • the stationary phase is a normal phase.
  • the stationary phase is an inverse phase.
  • the stationary phase is a phase of intermediate polarity.
  • the stationary phase is a chiral phase.
  • the stationary phase comprises at least one material selected from activated alumina, silica gel, activated charcoal, silicic acid, magnesium oxide, calcium hydroxide, hydroxide magnesium, cellulose, amylose, a polymerized adsorbent, a derivative thereof, and / or combinations thereof.
  • the method is a preparative chromatographic separation method.
  • the method is an analytical chromatographic separation method.
  • the process is for the purification of natural extracts.
  • the process is for the purification of carotenes.
  • the method is for purifying squalenes.
  • the method is for the purification of vitamins.
  • the method is for the purification of peptides.
  • the method is for the purification of insulin, preferably of recombinant insulin or insulin derivative.
  • the invention also relates to an installation for implementing the above method, comprising:
  • the chamber is a chromatographic column.
  • the installation further comprises supplying the enclosure with at least one other eluent.
  • the installation comprises a device for separating compressed gas and solvent (s) at the outlet of the enclosure.
  • the present invention overcomes the disadvantages of the state of the art. More particularly, it provides a chromatographic separation process in which injections of successive eluants on the same stationary phase are facilitated and / or accelerated, the consumption of eluents is minimized and the recycling of the eluents is facilitated.
  • the invention avoids collecting at the outlet of the stationary phase mixtures of eluants of different nature: a mixture of compressed gas and eluent of a single stage is recovered at the outlet.
  • the recycling of the eluents is then possible without intermediate distillation, using for example simply filtration or flash evaporation at reduced pressure, for example in cyclonic separators.
  • the high diffusivity of the compressed gas can very appreciably improve the stage of regeneration of the stationary phase, and more specifically the desorption of the impurities. This same property of diffusivity is likely to appreciably improve the balancing step of the stationary phase, since the high affinity regeneration solvent for the stationary phase has already been desorbed by the compressed gas.
  • the volumes of eluents required for balancing are thus lower, thus reducing the time between two successive injections (or cycle time), and thus increasing productivity.
  • the invention allows an excellent stability of the operating conditions and thus a better reproducibility of the tests.
  • FIG. 1 illustrates the drawbacks of the state of the art, by showing the evolution of the concentration of different solvents at the outlet of a chromatography column of 50 mm internal diameter, filled with a non-grafted silica stationary phase. .
  • the elution time in minutes is shown on the abscissa, and the solvent content in% is on the ordinate.
  • the column filled with hexane (solvent 1).
  • solvent 1 the injection of acetone at 100% by weight
  • solvent 3 injection of dichloromethane at 100% by weight
  • t 25 minutes, the injection of hexane at 100% by weight was again started (solvent 1).
  • FIG. 2 very schematically illustrates a succession of steps in a method according to the invention.
  • FIG. 3 very schematically illustrates a succession of steps in a preferred embodiment of the invention (with a compressed gas content in the output stream of the chromatographic column on the ordinate, and a duration on the abscissa).
  • the invention relates to a chromatographic separation process, wherein a step of eluting species retained on a stationary phase by means of an eluent is followed by a step of moving the eluent. in contact with the stationary phase by means of a compressed gas.
  • eluent is meant a fluid capable of desorbing species retained on a stationary phase, whether species of interest or impurities.
  • An eluent can be a pure solvent or a mixture of solvents.
  • Each solvent may be in particular aqueous or organic, or a gas in the liquid or supercritical state or close to the supercritical state.
  • Organic compounds which can be used as solvents are, in particular, alkanes, alcohols, ethers, esters, ketones and nitriles.
  • the alkanes are preferably C1-C10, more preferably C6-C8. They can be linear or branched, and preferably linear. Hexane and heptane are preferred examples.
  • the alcohols are preferably of formula R-OH with R is a C1-C6 alkyl group. They include methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, i-butanol, s-butanol and t-butanol.
  • the ethers are preferably of the formula R-O-R ', with R and R' being C 1 -C 6 alkyl groups. They include diethyl ether, diisopropyl ether, and methyl t-butyl ether (MTBE).
  • nitriles are preferably of formula R-CN, with R a C 1 -C 6 alkyl group. They include acetonitrile.
  • compressed gas is meant a fluid which is in the gaseous state under normal conditions of temperature and pressure (ie 0 ° C and 1 bar absolute), but which is used in the process of the invention at a pressure above the pressure of 1 bar absolute.
  • the compressed gas is used at a pressure greater than or equal to 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 bar absolute.
  • the pressure of the compressed gas used for the displacement step may be less than or equal to 300 bar absolute, preferably 200 bar absolute, preferably 150 bar absolute, preferably 100 bar absolute, preferably 75 bar absolute, and more preferably 50 bar absolute.
  • the compressed gas may be in the gaseous state when used in the process of the invention for carrying out the eluent displacement step. However, preferably, it is in the liquid or supercritical state.
  • CO2 carbon dioxide
  • propane and nitrous oxide.
  • CO2 is preferred. It has the particular advantage of presenting a critical point at near-ambient temperature (31 ° C.) and at moderate pressure (73 bar). It is also already widely used as an eluent in liquid or supercritical liquid chromatography, pure or in admixture with other solvents.
  • the chromatographic separation according to the invention may be a liquid chromatographic separation, in which case the eluents used are liquid solvents as described above, preferably aqueous and / or organic.
  • it may be a liquid chromatography expanded with a gas, in which case the eluents used are mixtures of solvent or liquid solvents (preferably organic) as described above, and compressed gas, or the liquid solvents being predominant by weight.
  • the eluents used are either compressed gas (s) alone or one or more compressed gas mixtures and one or more liquid (preferably organic) solvents. compressed gas being predominant by weight.
  • the compressed gas used during the eluent displacement step is different from the eluent itself, even when this eluent is also a compressed gas.
  • the method of the invention may notably comprise, successively or cyclically:
  • One or more eluents are used at each of these stages and brought into contact with the stationary phase.
  • the balancing eluent and the eluting eluent are identical.
  • the rinsing eluent and the eluting eluent are identical.
  • the balancing eluent and the rinsing eluent are identical.
  • the optional rinsing step is intended to desorb from the stationary phase species having a affinity with the stationary phase lower than that of the product to be separated.
  • the optional step of regeneration aims at desorbing from the stationary phase species having an affinity with the stationary phase stronger than that of the product to be separated.
  • the regeneration eluent is different from the eluting eluent. It advantageously has a higher affinity with the stationary phase than the eluting eluent.
  • an eluent of constant composition can be used (elution in isocratic mode, the eluting force remaining constant over time).
  • an eluent of composition varying over time for example two or three successive different eluents, or an eluent having a composition that varies continuously (elution in gradient mode, the eluting force then generally increasing over time).
  • an eluent of composition varying over time for example two or three successive different eluents, or an eluent having a composition that varies continuously (elution in gradient mode, the eluting force then generally increasing over time).
  • the method of the invention comprises at least one step of displacement of eluent by a compressed gas.
  • This displacement step may in particular be carried out after the elution step and before the regeneration step (displacement of the eluting eluent). It can also be performed after the regeneration step and before the balancing step (displacement of the regeneration eluent).
  • the displacement step can be carried out after the elution step and before the balancing step (displacement of the eluting eluent).
  • a regeneration step is present, and two steps of displacement are provided: one after elution and before regeneration (displacement of the eluting eluent); and the other after regeneration and before equilibration (displacement of the regeneration eluent).
  • FIG. 2 shows schematically the displacement of eluants in the case where the compressed gas is CO2: two cycles (1 and 2) are represented. Each cycle successively comprises: a balancing step (Eq.), A product injection step (I), a step of eluting the impurities with little retention and the product (El.), An eluent displacement step by CO2, a regeneration step, namely desorption of highly retained impurities (R), and finally another step of displacement of the solvents by CO2.
  • Eq. balancing step
  • I product injection step
  • El. An eluent displacement step by CO2
  • R desorption of highly retained impurities
  • all the steps of the method are carried out substantially at the same pressure.
  • the pressure differs from one stage to another. In particular, it can be higher in the eluent displacement stages by means of the compressed gas.
  • each eluent displacement step preferably at least 95% by weight, more preferably at least 99% by weight, or at least 99.5% by weight, or at least 99.9% by weight, or at least 99.95% by weight, or at least 99.99% by weight of the eluent initially in contact with the stationary phase is removed.
  • an output stream is collected at the output of the stationary phase.
  • the content of eluent in the outlet stream is less than or equal to 5% by weight, more preferably less than or equal to 1% by weight, or less than or equal to at 0.5% by weight, or less than or equal to 0.1% by weight, or less than or equal to 0.05% by weight, or less than or equal to 0.01% by weight.
  • the stationary phase is generally present as a bed in an enclosure, which in general is in the form of a column.
  • the chromatographic separation according to the invention can thus be implemented either in a single-column chromatographic system or in a multi-column chromatographic system.
  • chromatographic system can be a chromatographic system with static bed or not.
  • a static bed chromatographic system the mixture of compounds to be separated percolates in a chamber or column, which is generally cylindrical.
  • the column contains a bed of porous material (the stationary phase) permeable to fluids.
  • the rate of percolation of each compound in the mixture depends on the physical properties of the compound.
  • the most retained compounds on the stationary phase percolate more slowly than the least retained compounds on the stationary phase. This principle makes it possible to perform the desired separation.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • CYCLOJET TM systems i.e., stationary recycling system
  • the CYCLOJET TM system is as described in US 6,063,284, to which reference is expressly made. It is a discontinuous column chromatographic separation system in which the (i) most retained and then (ii) least retained species are collected separately at the exit of the column, a non-separated portion of the chromatogram. being recycled by a main pump.
  • the mixture to be separated is periodically injected by means of an injection loop into the recycled portion of the chromatogram.
  • the injection loop is preferably connected between the main pump and the column. After several chromatographic cycles, the process reaches a periodic steady state in which the quantity of products injected is equal to the quantity of products collected separately at the outlet of the column.
  • the chromatographic separation in a single-column static bed system with stationary recycling is cyclic and comprises the following steps:
  • injection into said circulating chromatographic profile of a sample comprising the at least two compounds to be separated, in a discontinuous manner and at each cycle, the injection being carried out by means of a controlled injection loop in an injection position by an injection valve, in order to inject the sample present in the loop into the circulating chromatographic profile, the injection valve remaining in the position of injection from the beginning of the injection until the entire profile is eluted from the column, then switching the injection valve to a charging position, to load the injection loop when the entire profile is in the column, and
  • This separation can also include the following step:
  • This separation can also include the following steps:
  • the chromatographic separation unit may also be a non-static bed chromatographic system.
  • a non-static bed system is a multi-column system in which the relative positions of the stationary phase bed and injection and / or flow collection points move over time.
  • non-static bed chromatographic systems examples include SMB, iSMB, SSMB, AMB, VARICOL TM, MODICON TM, POWERFEED TM, DCC or MCSGP.
  • An SMB system comprises a plurality of individual adsorbent containing columns, which are connected in series.
  • An eluent stream flows through the columns in a first direction.
  • the injection points of the feed stream and the eluent, as well as the collection points of the separated compounds, are periodically and simultaneously means of a set of valves.
  • the overall effect is to simulate the operation of a single column containing a solid adsorbent moving bed, the solid adsorbent moving in a countercurrent direction of the eluent stream.
  • an SMB system is composed of columns which contain stationary beds of solid adsorbent through which the eluent passes, but the operation is such that a counter-current continuous moving bed is simulated.
  • SMB single-zone SMB
  • Other possible forms are three-zone SMB systems and two-zone SMB systems (as described in Kwangnam Lee's "Two Section Simulated Moving Bed Process", in Separation Science and Technology 35 (4): 519 -534, 2000, which is expressly referred to).
  • An iSMB system is as described in EP 0342629 and US 5,064,539, to which reference is expressly made.
  • An SSMB system cuts the introductions and collection of flows in subsequences applied in periodic ways.
  • SMB systems are: the time-varying SMB system and the POWERFEED TM system, as described in US 5,102,553 and in the article "PowerFeed operation of simulated moving bed units: changing flow-rates during the switching interval ", by Zhang et al. in Journal of Chromatography A, 1006: 87-99, 2003, which is expressly referred to; the MODICON TM system, as described in US 7,479,228, to which reference is expressly made; and the SMB system with internal recirculation, as described in US 8,282,831, to which reference is expressly made.
  • a DCC chromatography system is as described in FR 2889077, to which reference is expressly made.
  • a DCC system is a sequential method with periodic displacement of the mobile phase injection and mixing points to be separated, having the characteristic of being constantly open loop. It uses two or more columns.
  • An AMB system has a similar operation to a system
  • a VARICOL TM chromatography system is as described in US 6,136,198, US 6,375,839 US 6,413,419 and US 6,712,973, to which reference is expressly made.
  • a VARICOL TM system comprises a plurality of individual adsorbent-containing columns that are connected in series. An eluent is passed through the columns in a first direction. Unlike the SMB system, the injection points for the mixture to be separated and for the eluent and the collection points of the separated compounds in the system are moved periodically but asynchronously, by means of a set of valves. The overall effect is to create time-varying separation zones over time, thus dynamically allocating the stationary phase to areas where it is most useful, and allowing similar separation power with fewer separation units.
  • VARICOL TM does not simulate the operation of a single column containing a solid adsorbent moving bed, the solid adsorbent moving in a countercurrent direction of the eluent stream, and so the operating principle of VARICOL TM can not be implemented in an equivalent AMB system.
  • At least one eluent feed as described above preferably several eluate feeds (in particular an eluent eluent feed and a regeneration eluent feed); and
  • At least one compressed gas supply for the step (s) of eluent displacement by the compressed gas.
  • the installation of the invention also advantageously comprises a device for separating compressed gas and solvent, at the outlet of the enclosure or columns.
  • This separation device may in particular comprise a cyclonic separator, a filter and / or an evaporator.
  • the process of the invention advantageously comprises a collection of a mixture of compressed gas and one or more solvents during the step of displacement of the eluent by the compressed gas, and the separation of the compressed gas from one part and solvent (s) on the other hand.
  • the compressed gas can be recycled (especially for the implementation of the step or steps).
  • the solvent or solvents can be recycled (especially to reconstitute an eluent).
  • the stationary phase of the invention comprises at least one material chosen from activated alumina, silica gel, activated charcoal, silicic acid, magnesium oxide, calcium hydroxide and magnesium hydroxide. , cellulose, amylose, a polymerized adsorbent, a derivative thereof, and / or combinations thereof.
  • the chromatographic separation of the invention may be in the normal phase, that is to say based on polar interactions between the species to be separated and the stationary phase.
  • the stationary phase is then polar in nature, for example a silica phase, functionalized or not.
  • the chromatographic separation of the invention may be in reverse phase, that is to say based on hydrophobic interactions between the species to be separated and the stationary phase.
  • the stationary phase is then apolar in nature, for example a silica phase on which hydrocarbon chains are grafted.
  • the chromatographic separation of the invention can employ a stationary phase of intermediate polarity.
  • the chromatographic separation of the invention may be a chiral separation.
  • the stationary phase comprises chiral molecules grafted onto a support (for example silica).
  • the invention may in particular be implemented for the separation of apolar products, preferably on a normal stationary phase.
  • the product of interest and the impurities engage with the stationary phase non-covalent hydrophilic interactions, including hydrogen type bonds.
  • each eluent is therefore even stronger than the solvent or solvents which constitute it is or are polar.
  • the product of interest, hydrophobic, is weakly retained on the stationary phase.
  • an alkane, or mixture of alkanes, or a mixture of alkane (s) and compressed gas can be used for the elution step (and for equilibration).
  • a polar solvent such as ethyl acetate is preferably used to desorb the impurities strongly bound to the stationary phase.
  • FIG. 3 schematically illustrates such a method, the graph representing the evolution of the rate of compressed gas in the output stream of a chromatographic column (ordinate) as a function of time.
  • Phase 1 corresponds to the elution stage.
  • the outlet stream of the column is the eluting eluent, for example an alkane.
  • Phases 2 and 3 correspond to the displacement of the eluting eluent by the compressed gas.
  • the rate of compressed gas in the output stream increases in phase 2 until it reaches a maximum, then remains in phase 3 plateau.
  • Phases 4 and 5 correspond to the regeneration step, in which a regeneration eluent, by Example of ethyl acetate is injected.
  • the rate of compressed gas in the output stream decreases in phase 4 to zero, then remains at zero in phase 5.
  • Phases 6 and 7 correspond to the displacement of the regeneration eluent by the compressed gas.
  • phase 6 The compressed gas content in the output stream increases in phase 6 until it reaches a maximum, then remains in phase 7 plateau.
  • Phases 8 and 9 correspond to the equilibration stage, in which a balancing eluent , for example again an alkane, is injected.
  • the compressed gas content in the output stream decreases in phase 8 to zero, then remains at zero in phase 9.
  • the products of interest to be separated or purified can be, in particular, natural extracts, carotenes, squalenes, vitamins, peptides, insulin (preferably recombinant insulin) or an insulin derivative.

Abstract

L'invention concerne un procédé de séparation chromatographique, comprenant au moins une étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant, suivie d'une étape de déplacement de l'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé. De préférence, l'étape de déplacement intervient après une étape d'élution de produit(s) d'intérêt et/ou après une étape de régénération de la phase stationnaire.

Description

UTILISATION DE GAZ COMPRIME POUR LE DEPLACEMENT D'ELUANT APPLIQUE A LA CHROMATOGRAPHIE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de séparation chromatographique incluant une étape de déplacement d'un éluant par un gaz comprimé tel que du CO2. L'invention concerne également une installation adaptée à la mise en œuvre de ce procédé.
ARRIERE-PLAN TECHNIQUE
De nombreux documents de l'état de la technique décrivent des procédés de séparation chromatographique, notamment de produits hydrophobes, soit en chromatographie liquide, soit en chromatographie supercritique.
En chromatographie liquide, les produits tels que squalènes, caroténoïdes et vitamine E, et de nombreux autres produits sont séparés par une succession d'étapes d'élution. L'exigence de haut rendement et de haute pureté conduit à utiliser plusieurs éluants. De ce fait, des solutions en sortie de chromatographie comprennent des mélanges d'éluants qu'il est nécessaire de récupérer et dissocier par distillation.
Ainsi, le document CN 103288571 décrit la séparation de squalène par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC) sur un gel de silice au moyen d'une première élution avec un éluant tel que le n- hexane, suivie d'une seconde élution avec un éluant comprenant un mélange tel que n-hexane et cyclohexane dans des ratios volumiques tels que 5-20:1 .
Le document US 6,072,092 décrit la séparation de tocophérols et tocotriénols en HPLC sur un gel de silice au moyen d'une première élution avec une solution apolaire suivie d'une seconde élution par une solution polaire ou un mélange de solutions polaires et apolaires.
Le document WO 2014/100327 décrit la séparation d'isomères de tocotriénol en HPLC sur un gel de silice ; il est procédé à deux élutions par un mélange de solutions apolaires avec une faible teneur en solution polaire. Le document CN 101323607 décrit la séparation de tocophérols par HPLC en trois élutions successives.
Une méthode d'élution comprenant des mélanges de solutions est aussi décrite dans le document EP 242148 présentant l'extraction de carotènes avec une solution d'élution comprenant une majorité de solution polaire et une minorité de solution apolaire.
Le document CN 1013197 décrit la séparation de tocophérols avec une élution simple avec un mélange de solution apolaire et un faible ratio de solution polaire. Il en est de même pour les documents WO 94/08987 et EP 1424013 décrivant la séparation de carotènes, et le document WO 2003/37884 sur l'extraction de tocophérols.
Une élution simple du produit au moyen d'une solution unique apolaire est décrite dans les documents JP 2547595 et US 4,122,094 pour la séparation de carotènes et tocophérols.
L'art antérieur décrit ci-dessus concerne la voie HPLC en phase normale. Les documents GB 8729232 et EP 1083174 décrivent des modes de séparation en phase inverse, où l'adsorption du produit ou des impuretés sur le support chromatographique se fait par l'intermédiaire de liaisons de type hydrophobes.
Pour la séparation en chromatographie supercritique, l'élution du produit se fait au moyen d'une solution de CO2 et/ou solution apolaire. Les documents EP 1 122250, EP 1097985 et IN 2005DE00333 proposent l'application de cette méthode pour la séparation de carotènes et/ou de dérivés de vitamine E, issus d'huile de palme ou de dérivés d'huile de palme. Le support est de type silice non greffée ou de type C18, et la séparation du produit d'intérêt et des impuretés se fait à l'aide d'un gradient de température et/ou de pression lors de l'étape d'élution. Le document WO 2007/90545 propose l'utilisation de gaz à l'état supercritique pour un procédé en deux étapes, où un dérivé d'huile de palme préalablement concentré en produit d'intérêt (vitamines E ou carotènes) est extrait par un fluide supercritique en mode continu (étape 1 ) puis purifié par méthode chromatographique avec désorption contrôlée par du CO2 supercritique dans le cas des dérivés vitamines E, et par du propane supercritique dans le cas des carotènes.
De manière générale, une séparation sur une colonne de chromatographie, notamment pour l'obtention des composés apolaires ci- dessus, repose sur une suite d'étapes dont une séquence typique est détaillée ci-après : - Etape 1 : équilibrage. La matrice de séparation, appelée aussi phase stationnaire, est équilibrée par un éluant ayant une faible affinité avec la matrice. La nature de l'éluant peut être identique à celle de l'éluant utilisé pendant l'étape d'élution. Cette étape rend les sites d'adsorption de la phase disponibles.
- Etape 2 : injection du produit. Le produit à séparer est injecté dans le milieu. Au cours de l'injection, en fonction du solvant utilisé dans la solution d'injection, le produit peut rester adsorbé sur le support ou bien être entraîné le long de la colonne. De même les impuretés peuvent être entraînées ou non en fonction de leur affinité avec la phase stationnaire.
- Etape 3 (optionnelle) : élution des impuretés à faible affinité avec la phase stationnaire. Dans cette étape, appelée aussi rinçage, certaines impuretés à faible affinité avec la phase stationnaire sont éluées avec un éluant ayant lui aussi une faible affinité avec la phase stationnaire. Cet éluant de rinçage peut être identique à celui utilisé dans l'étape d'équilibrage ou l'étape d'élution du produit.
- Etape 4 : élution du produit. Le produit à séparer est désorbé par un éluant qui peut être identique à celui utilisé en phase d'injection ou en phase d'équilibrage ou bien avoir une plus forte affinité avec la phase stationnaire.
- Etape 5 (optionnelle) : nettoyage ou régénération. Un autre éluant à plus forte affinité avec la phase stationnaire est alors introduit dans la colonne afin d'éliminer les impuretés non éluées par un des solvants des étapes 2, 3 ou 4 car fortement liées à la phase stationnaire.
Une des limites de cette méthode de séparation séquentielle, utilisée à des fins analytiques ou préparatives, apparaît lorsqu'on applique au moins deux cycles de façon consécutive, et que l'on passe de l'étape 4 ou optionnellement 5 à l'étape 1 . En effet lors de cette transition, on utilise un éluant dont l'affinité pour la phase stationnaire est faible, pour déplacer un éluant dont l'affinité avec la phase stationnaire est forte. Des volumes importants d'éluant d'équilibrage sont nécessaires pour déplacer totalement l'éluant de lavage, les temps d'équilibrage de la colonne sont donc longs, et la consommation en solvant est significative.
Un autre inconvénient de cette méthode, lorsqu'elle est appliquée à l'échelle de production, est lié à la difficulté de recycler les solvants utilisés dans la phase mobile. En effet lorsqu'un solvant dans une colonne de chromatographie est déplacé par un autre, c'est un mélange de ces deux solvants qui est en premier lieu retrouvé en sortie de colonne, jusqu'à ce que la totalité des molécules de solvant à remplacer soit totalement désorbée, comme illustré sur la figure 1.
La durée de cette phase de rééquilibrage impacte négativement la productivité, et le volume de cette interface entre solvant de régénération et d'équilibrage impacte le coût de la séparation : soit cette interface est éliminée, soit les solvants de ce mélange de solvants doivent être purifiés par distillation avant d'être utilisés à nouveau car les teneurs résiduelles en solvant de régénération dans le solvant d'élution doivent être très faibles pour ne pas faire évoluer l'élution des différents produits dans les cycles successifs. Ces difficultés de recyclage de solvant sont d'autant plus significatives que l'affinité du produit à séparer pour la phase stationnaire est faible (étape d'élution) et l'affinité des impuretés très adsorbées est forte (étape de régénération). En effet dans ce cas, les différences de force d'élution entre les solvants sont plus significatives, et les teneurs résiduelles en solvant de lavage que l'on peut accepter dans le solvant recyclé pour l'équilibrage, l'injection ou l'élution doivent être d'autant plus faibles afin d'éviter une élution trop rapide du produit peu retenu et aussi afin d'éviter sa co-élution avec des impuretés censées être plus retenues.
En conclusion, cette méthode requiert des volumes importants d'éluant avec une très haute pureté, et une étape de distillation est nécessaire pour séparer les différents éluants avant leur recyclage et ainsi éviter une consommation très importante de solvants.
Il y a donc véritablement un besoin de développer une méthode de séparation chromatographique dans laquelle le déplacement d'un solvant par un autre dans une colonne de chromatographie est facilité, notamment lorsque le solvant à déplacer est de plus grande affinité pour le support que le solvant utilisé pour son déplacement.
Il y a aussi intérêt à développer une méthode permettant d'éviter aux solvants utilisés de se mélanger dans la colonne, afin de faciliter leur recyclage. RESUME DE L'INVENTION
L'invention concerne en premier lieu un procédé de séparation chromatographique, comprenant au moins une étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant, suivie d'une étape de déplacement de l'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé.
Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est à l'état liquide.
Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est à l'état supercritique.
Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est du CO2.
Selon un mode de réalisation, la pression absolue du gaz comprimé utilisé pour l'étape de déplacement est inférieure ou égale à 300 bar, de préférence à 200 bar, de préférence à 150 bar, de préférence à 100 bar, de préférence à 75 bar, de préférence encore à 50 bar.
Selon un mode de réalisation, l'éluant est un composé unique.
Selon un mode de réalisation, l'éluant est un mélange d'au moins deux composés.
Selon un mode de réalisation, l'éluant est un solvant aqueux et/ou organique ou un mélange de solvants aqueux et/ou organiques.
Selon un mode de réalisation, l'éluant est un mélange de solvant(s) aqueux et/ou organique(s) et de gaz comprimé, préférentiellement du CO2 à l'état liquide ou supercritique.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend, après l'étape de déplacement de l'éluant, la collecte d'un mélange de gaz comprimé et de solvant(s) aqueux et/ou organiques en sortie de la phase stationnaire, et la séparation du gaz comprimé et du ou des solvants aqueux et/ou organiques.
Selon un mode de réalisation, le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés de manière discontinue.
Selon un mode de réalisation, le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés de manière continue.
Selon un mode de réalisation, le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés à plus de 50 %, de préférence 60 %, de préférence 70 %, de préférence 80 %, de préférence 90 %, de préférence 95 %, de préférence 99 %, en poids.
Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est recyclé de manière discontinue.
Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est recyclé de manière continue.
Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est recyclé à plus de
50 %, de préférence 60 %, de préférence 70 %, de préférence 80 %, de préférence 90 %, de préférence 95 %, de préférence 99 %, en poids. Selon un mode de réalisation, ladite étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est une étape d'élution de produit(s) d'intérêt.
Selon un mode de réalisation, ladite étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est une étape de régénération de la phase stationnaire.
Selon un mode de réalisation, ledit éluant est un premier éluant, le procédé comprenant, après l'étape de déplacement de l'éluant au moyen d'un gaz comprimé, la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire, qui est de préférence différent du premier éluant.
Selon un mode de réalisation, la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire est une étape de régénération de la phase stationnaire.
Selon un mode de réalisation, la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire est une étape d'équilibrage.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend de manière cyclique :
- une étape d'équilibrage, comprenant la mise en contact d'un éluant d'équilibrage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'injection, comprenant la mise en contact d'une composition comprenant un produit à séparer avec la phase stationnaire ;
- une étape optionnelle de rinçage, comprenant la mise en contact d'un éluant de rinçage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'élution du produit, comprenant la mise en contact d'un éluant d'élution avec la phase stationnaire et la collecte du produit à séparer ;
- à nouveau l'étape d'équilibrage ;
l'étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé étant effectuée entre l'étape d'élution du produit et l'étape d'équilibrage.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend de manière successive ou cyclique :
- une étape d'équilibrage, comprenant la mise en contact d'un éluant d'équilibrage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'injection, comprenant la mise en contact d'une composition comprenant un produit à séparer avec la phase stationnaire ; - une étape optionnelle de rinçage, comprenant la mise en contact d'un éluant de rinçage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'élution du produit, comprenant la mise en contact d'un éluant d'élution avec la phase stationnaire et la collecte du produit à séparer ;
- une étape de régénération, comprenant la mise en contact d'un éluant de régénération avec la phase stationnaire ;
- le cas échéant, l'étape d'équilibrage à nouveau ;
le procédé comprenant au moins une étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape d'élution du produit et l'étape de régénération ; et/ou entre l'étape de régénération et l'étape d'équilibrage.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend à la fois une étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape d'élution du produit et l'étape de régénération, et une autre étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape de régénération et l'étape d'équilibrage.
Selon un mode de réalisation, les étapes d'équilibrage, d'injection, le cas échéant de rinçage, d'élution, et le cas échéant de régénération, sont mises en œuvre avec des éluants comprenant un gaz comprimé.
Selon un mode de réalisation, les étapes d'équilibrage, d'injection, le cas échéant de rinçage, d'élution, et le cas échéant de régénération, sont mises en œuvre avec des éluants ne comprenant pas de gaz comprimé.
Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase normale.
Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase inverse.
Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase de polarité intermédiaire.
Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase chirale.
Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire comprend au moins un matériau choisi parmi l'alumine activée, le gel de silice, le charbon actif, l'acide silicique, l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, la cellulose, l'amylose, un adsorbant polymérisé, un de leurs dérivés, et/ou les combinaisons de ceux-ci. Selon un mode de réalisation, le procédé est un procédé de séparation chromatographique préparative.
Selon un mode de réalisation, le procédé est un procédé de séparation chromatographique analytique.
Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification d'extraits naturels.
Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de carotènes.
Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de squalènes.
Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de vitamines.
Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de peptides.
Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification d'insuline, de préférence d'insuline recombinante ou de dérivé d'insuline.
L'invention a également pour objet une installation pour la mise en œuvre du procédé ci-dessus, comprenant :
- au moins une enceinte contenant une phase stationnaire ;
- une alimentation de l'enceinte en au moins un éluant ; et
- une alimentation de l'enceinte en gaz comprimé.
Selon un mode de réalisation, l'enceinte est une colonne chromatographique.
Selon un mode de réalisation, l'installation comprend en outre une alimentation de l'enceinte en au moins un autre éluant.
Selon un mode de réalisation, l'installation comprend un dispositif de séparation de gaz comprimé et de solvant(s) en sortie de l'enceinte.
La présente invention permet de surmonter les inconvénients de l'état de la technique. Elle fournit plus particulièrement un procédé de séparation chromatographique dans lequel des injections d'éluants successifs sur une même phase stationnaire sont facilitées et/ou accélérées, la consommation d'éluants est minimisée et le recyclage des éluants est facilité.
Cela est accompli grâce à l'utilisation d'un gaz comprimé, tel que du CO2 comprimé, pour déplacer un éluant en contact avec la phase stationnaire, avant l'injection de l'éluant successif.
Ainsi, l'invention évite de collecter en sortie de phase stationnaire des mélange d'éluants de nature différente : on récupère en sortie un mélange de gaz comprimé et d'éluant d'une seule étape. Le recyclage des éluants est alors possible sans distillation intermédiaire, en utilisant par exemple simplement une filtration ou une évaporation flash à pression réduite, par exemple dans des séparateurs cycloniques.
La forte diffusivité du gaz comprimé (tel que le CO2 comprimé) peut améliorer très sensiblement l'étape de régénération de la phase stationnaire, et plus précisément la désorption des impuretés. Cette même propriété de diffusivité est susceptible d'améliorer sensiblement l'étape d'équilibrage de la phase stationnaire, puisque le solvant de régénération à forte affinité pour la phase stationnaire aura déjà été désorbé par le gaz comprimé. Les volumes d'éluants nécessaires à l'équilibrage sont ainsi plus faibles, réduisant ainsi le temps entre deux injections successives (ou temps de cycle), et augmentant ainsi la productivité.
L'invention permet une excellente stabilité des conditions opératoires et ainsi une meilleure reproductibilité des essais.
Ces avantages en termes de réduction de temps opératoires et de baisse de la consommation d'éluants ont une portée très intéressante pour la chromatographie préparative tout comme pour la chromatographie analytique. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 illustre les inconvénients de l'état de la technique, en montrant l'évolution de la concentration en différents solvants en sortie d'une colonne de chromatographie de 50 mm de diamètre interne, remplie d'une phase stationnaire de silice non greffée. Le temps d'élution en minutes figure en abscisse, et la teneur de solvants en % figure en ordonnée. Initialement, la colonne remplie d'hexane (solvant 1 ). A t=10 minutes, on commence l'injection d'acétone à 100 % en poids (solvant 2). A t=15 minutes, on commence l'injection de dichlorométhane à 100 % en poids (solvant 3). A t=25 minutes, on commence l'injection d'hexane à 100 % en poids à nouveau (solvant 1 ).
La figure 2 illustre de manière très schématique une succession d'étapes dans un procédé selon l'invention.
La figure 3 illustre de manière très schématique une succession d'étapes dans un mode de réalisation préféré de l'invention (avec un taux de gaz comprimé dans le flux de sortie de la colonne chromatographique en ordonnée, et une durée en abscisse). DESCRIPTION DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION
L'invention est maintenant décrite plus en détail et de façon non limitative dans la description qui suit.
Dans sa forme la plus générale, l'invention concerne un procédé de séparation chromatographique, dans lequel une étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est suivie d'une étape de déplacement de l'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé.
Par « éluant » on entend un fluide susceptible de désorber des espèces retenues sur une phase stationnaire, qu'il s'agisse d'espèces d'intérêt ou d'impuretés.
Un éluant peut être un solvant pur ou un mélange de solvants. Chaque solvant peut-être notamment aqueux ou organique, ou encore un gaz à l'état liquide ou supercritique ou proche de l'état supercritique.
Des composés organiques utilisables en tant que solvants sont en particulier les alcanes, les alcools, les éthers, les esters, les cétones et les nitriles.
Les alcanes sont de préférence en C1 -C10, de préférence encore en C6-C8. Ils peuvent être linéaires ou ramifiés, et de préférence sont linéaires. L'hexane et l'heptane sont des exemples préférés.
Les alcools sont de préférence de formule R-OH avec R un groupe alkyle en C1 -C6. Ils incluent le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, l'i-propanol, le n-butanol, l'i-butanol, le s-butanol et le t-butanol.
Les éthers sont de préférence de formule R-O-R', avec R et R' des groupements alkyles en C1 -C6. Ils incluent le diéthyléther, le diisopropyléther, et le méthyl t-butyléther (MTBE).
Les éthers sont de préférence de formule R-(C=O)O-R', avec R et R' des groupements alkyles en C1 -C6. Ils incluent l'acétate de méthyle et l'acétate d'éthyle.
Les cétones sont de préférence de formule R-(C=O)-R', avec R et R' des groupements alkyles en C1 -C6. Elles incluent l'acétone, la méthyléthylcétone et la méthylisobutylcétone (MIBK).
Les nitriles sont de préférence de formule R-CN, avec R un groupement alkyle en C1 -C6. Ils incluent l'acétonitrile.
Par « gaz comprimé » on entend un fluide qui est à l'état gazeux dans des conditions normales de température et de pression (à savoir 0°C et 1 bar absolu), mais qui est utilisé dans le procédé de l'invention à une pression supérieure à la pression de 1 bar absolu. Selon des modes de réalisation particuliers, le gaz comprimé est utilisé à une pression supérieure ou égale à 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 bar absolu.
Afin de simplifier la mise en œuvre du procédé, il peut être avantageux que la pression du gaz comprimé utilisé pour l'étape de déplacement soit toutefois inférieure ou égale à 300 bar absolu, de préférence 200 bar absolu, de préférence 150 bar absolu, de préférence 100 bar absolu, de préférence 75 bar absolu, et de préférence encore 50 bar absolu.
Le gaz comprimé peut être à l'état gazeux lorsqu'il est utilisé dans le procédé de l'invention pour la mise en œuvre de l'étape de déplacement d'éluant. Toutefois, de préférence, il est à l'état liquide ou supercritique.
A titre d'exemples de gaz comprimés, on peut citer le dioxyde de carbone (CO2), le propane et le protoxyde d'azote. Le CO2 est préféré. Il a notamment l'avantage de présenter un point critique à température quasi- ambiante (31 °C) et à pression modérée (73 bar). Il est par ailleurs d'ores et déjà largement utilisé en tant qu'éluant en chromatographie en phase liquide ou supercritique, pur ou en mélange avec d'autres solvants.
La séparation chromatographique selon l'invention peut être une séparation de chromatographie liquide, auquel cas les éluants utilisés sont des solvants liquides tels que décrits ci-dessus, de préférence aqueux et/ou organiques.
Alternativement, il peut s'agir d'une chromatographie avec liquide expansé par un gaz, auquel cas les éluants utilisés sont des mélanges de solvant ou solvants liquides (de préférence organiques) tels que décrits ci- dessus, et de gaz comprimé, le ou les solvants liquides étant majoritaires en poids.
Alternativement, il peut s'agir d'une chromatographie supercritique, auquel cas les éluants utilisés sont soit un ou des gaz comprimés seuls, soit un ou des mélanges de gaz comprimé et d'un ou plusieurs solvants liquides (de préférence organiques), le gaz comprimé étant majoritaire en poids.
Il est toutefois entendu que le gaz comprimé utilisé lors de l'étape de déplacement de l'éluant est différent de l'éluant lui-même, même lorsque cet éluant est également un gaz comprimé.
Le procédé de l'invention peut notamment comprendre, de manière successive ou de manière cyclique :
- une étape d'équilibrage ;
- une étape d'injection d'une composition contenant au moins un produit devant être séparé (ou purifié) ; - une étape optionnelle de rinçage ;
- une étape d'élution du produit ;
- une étape optionnelle de régénération ;
- à nouveau l'étape d'équilibrage si le procédé est mis en œuvre de manière cyclique.
Un ou plusieurs éluants, tels que définis ci-dessus, sont utilisés à chacune de ces étapes et mis en contact avec la phase stationnaire.
Selon un mode de réalisation, l'éluant d'équilibrage et l'éluant d'élution sont identiques.
Selon un mode de réalisation, l'éluant de rinçage et l'éluant d'élution sont identiques.
Selon un mode de réalisation, l'éluant d'équilibrage et l'éluant de rinçage sont identiques.
L'étape optionnelle de rinçage vise à désorber de la phase stationnaire des espèces ayant une affinité avec la phase stationnaire plus faible que celle du produit à séparer.
L'étape optionnelle de régénération vise à désorber de la phase stationnaire des espèces ayant une affinité avec la phase stationnaire plus forte que celle du produit à séparer.
De préférence, l'éluant de régénération est différent de l'éluant d'élution. Il comporte avantageusement une plus forte affinité avec la phase stationnaire que l'éluant d'élution.
A chaque étape où un éluant est utilisé, on peut utiliser un éluant de composition constante (élution en mode isocratique, la force éluante restant constante au cours du temps).
Alternativement, on peut utiliser un éluant de composition variant au cours du temps, par exemple deux ou trois éluants différents successifs, ou bien un éluant ayant une composition variant continûment (élution en mode gradient, la force éluante augmentant alors généralement au cours du temps). Pour ce faire, il est par exemple possible d'augmenter progressivement la proportion du solvant le plus éluant dans un mélange contenant au moins deux solvants.
Dans le contexte de la succession d'étapes décrite ci-dessus, le procédé de l'invention comporte au moins une étape de déplacement d'éluant par un gaz comprimé.
Cette étape de déplacement peut notamment être effectuée après l'étape d'élution et avant l'étape de régénération (déplacement de l'éluant d'élution). Elle peut également être effectuée après l'étape de régénération et avant l'étape d'équilibrage (déplacement de l'éluant de régénération).
Lorsque le procédé ne comporte pas d'étape de régénération, l'étape de déplacement peut être effectuée après l'étape d'élution et avant l'étape d'équilibrage (déplacement de l'éluant d'élution).
Dans un mode de réalisation préféré, une étape de régénération est présente, et deux étapes de déplacement sont prévues : l'une après l'élution et avant la régénération (déplacement de l'éluant d'élution) ; et l'autre après la régénération et avant l'équilibrage (déplacement de l'éluant de régénération).
Ce mode de réalisation est illustré à la figure 2, qui montre de manière schématique le déplacement d'éluants dans le cas où le gaz comprimé est du CO2 : deux cycles (1 et 2) sont représentés. Chaque cycle comprend successivement : une étape d'équilibrage (Eq.), une étape d'injection de produit (I), une étape d'élution des impuretés peu retenues et du produit (El.), une étape de déplacement d'éluant par le CO2, une étape de régénération, à savoir désorption des impuretés très retenues (R), et enfin une autre étape de déplacement des solvants par le CO2.
Selon un mode de réalisation, l'ensemble des étapes du procédé sont effectuées sensiblement à une même pression. Selon un mode de réalisation alternatif, la pression diffère d'une étape à l'autre. Elle peut notamment être plus élevée dans les étapes de déplacement d'éluant au moyen du gaz comprimé.
A l'issue de chaque étape de déplacement d'éluant, de préférence, au moins 95 % en poids, de préférence encore au moins 99 % en poids, ou au moins 99,5 % en poids, ou au moins 99,9 % en poids, ou au moins 99,95 % en poids, ou au moins 99,99 % en poids de l'éluant initialement en contact avec la phase stationnaire est éliminé.
Au cours de l'étape de déplacement d'éluant, on collecte en sortie de la phase stationnaire un flux de sortie. De préférence, à l'issue de l'étape de déplacement, la teneur d'éluant dans le flux de sortie est inférieure ou égale à 5 % en poids, de préférence encore inférieure ou égale à 1 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,5 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,1 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,05 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,01 % en poids.
La phase stationnaire est généralement présente sous forme de lit dans une enceinte, qui en général est sous forme de colonne. La séparation chromatographique selon l'invention peut ainsi être mise en œuvre soit dans un système chromatographique à colonne unique, soit dans un système chromatographique à plusieurs colonnes.
Il peut s'agir d'un système chromatographique à lit statique ou non. Dans un système chromatographique à lit statique, le mélange de composés à séparer percole dans une enceinte ou colonne, généralement cylindrique. La colonne contient un lit de matériau poreux (la phase stationnaire) perméable aux fluides. La vitesse de percolation de chaque composé dans le mélange dépend des propriétés physiques du composé. Les composés les plus retenus sur la phase stationnaire percolent plus lentement que les composés les moins retenus sur la phase stationnaire. Ce principe permet d'effectuer la séparation souhaitée.
Il est possible d'effectuer un tel traitement dans plusieurs colonnes en série ou en parallèle, mais généralement une séparation chromatographique dans un système à lit statique est mise en œuvre avec une colonne unique.
Des exemples de tels systèmes chromatographiques à lit statique sont les systèmes HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) ou CYCLOJET™ (c'est-à-dire système avec recyclage à l'état stationnaire).
Le système CYCLOJET™ est tel que décrit dans le document US 6,063,284, auquel il est fait expressément référence. Il s'agit d'un système de séparation chromatographique discontinue à colonne unique, dans lequel les espèces (i) les plus retenues puis (ii) les moins retenues sont collectées séparément à la sortie de la colonne, une portion non-séparée du chromatogramme étant recyclée par une pompe principale. Le mélange à séparer est périodiquement injecté au moyen d'une boucle d'injection dans la portion recyclée du chromatogramme. La boucle d'injection est de préférence connectée entre la pompe principale et la colonne. Après plusieurs cycles chromatographiques, le procédé atteint un état stationnaire périodique dans lequel la quantité de produits injectés est égale à la quantité de produits collectés séparément à la sortie de la colonne.
Selon un mode de réalisation, la séparation chromatographique dans un système à lit statique mono-colonne avec recyclage à l'état stationnaire est cyclique et comprend les étapes suivantes :
- établissement et maintien d'un profil chromatographique circulant dans la colonne au moyen d'une pompe à éluant ;
- injection dans ledit profil chromatographique circulant d'un échantillon comprenant les au moins deux composés à séparer, de manière discontinue et à chaque cycle, l'injection étant effectuée au moyen d'une boucle d'injection contrôlée dans une position d'injection par une vanne d'injection, afin d'injecter l'échantillon présent dans la boucle dans le profil chromatographique circulant, la vanne d'injection restant en position d'injection du début de l'injection jusqu'au moment où la totalité du profil est élué de la colonne, puis basculement de la vanne d'injection dans une position de charge, pour charger la boucle d'injection lorsque tout le profil est dans la colonne, et
- collecte d'au moins deux fractions enrichies à partir du profil circulant, de manière discontinue et périodique.
Cette séparation peut également comprendre l'étape suivante :
- passage d'éluant dans la colonne en tant que phase mobile, de manière essentiellement continue au cours du cycle, au moyen de la pompe à éluant.
Cette séparation peut également comprendre les étapes suivantes :
- enregistrement des événements se produisant à partir du début de la collecte d'une première fraction jusqu'au début suivant de collecte de première fraction ;
- interruption de la pompe à éluant lors de la collecte d'une troisième fraction, cette interruption se poursuivant jusqu'à la fin du cycle, de sorte que les cycles soient reproductibles temporellement. Selon un mode de réalisation, il n'y a aucune perte de profil circulant lors de l'injection dans le profil circulant maintenu.
Un mode de réalisation détaillé de ce système figure en col.5 1.36- col.10 1.41 du document US 6,063,284 précité.
L'unité de séparation chromatographique peut également être un système chromatographique à lit non-statique. Un système à lit non-statique est un système multi-colonnes, dans lequel les positions relatives du lit de phase stationnaire et des points d'injection et/ou de collecte des flux se déplacent au cours du temps.
Des exemples de tels systèmes chromatographiques à lit non-statique sont les systèmes SMB, iSMB, SSMB, AMB, VARICOL™, MODICON™, POWERFEED™, DCC ou MCSGP.
Un système SMB comprend une pluralité de colonnes individuelles contenant un adsorbant, qui sont connectées en série. Un flux d'éluant traverse les colonnes selon une première direction. Les points d'injection du flux d'alimentation et de l'éluant, ainsi que les points de collecte des composés séparés, sont décalés périodiquement et simultanément au moyen d'un ensemble de vannes. L'effet global est de simuler le fonctionnement d'une colonne unique contenant un lit mobile d'adsorbant solide, l'adsorbant solide se déplaçant dans une direction à contre-courant du flux d'éluant. Ainsi, un système SMB est composé de colonnes qui contiennent des lits stationnaires d'adsorbant solide à travers lesquels passe l'éluant, mais le fonctionnement est tel qu'un lit mobile continu à contre- courant est simulé.
La forme la plus conventionnelle d'un système SMB est le système SMB à quatre zones. D'autres formes possibles sont les systèmes SMB à trois zones et les systèmes SMB à deux zones (tels que décrits dans l'article « Two Section Simulated Moving Bed Process » de Kwangnam Lee, dans Séparation Science and Technology 35(4):519-534, 2000, auquel il est fait expressément référence).
Un système iSMB est tel que décrit dans les documents EP 0342629 et US 5,064,539, auxquels il est fait expressément référence. Un système SSMB découpe les introductions et collectes des flux en sous séquences appliquées de façons périodiques. Dans les systèmes iSMB et SSMB, il y a au moins une étape dans laquelle le système fonctionne en boucle fermée, sans entrée ou sortie de produit.
D'autres variantes des systèmes SMB sont : le système SMB variant dans le temps et le système POWERFEED™, tels que décrits dans le document US 5,102,553 et dans l'article « PowerFeed opération of simulated moving bed units: changing flow-rates during the switching interval », de Zhang et al. dans Journal of Chromatography A, 1006:87-99, 2003, auxquels il est fait expressément référence; le système MODICON™, tel que décrit dans le document US 7,479,228, auquel il est fait expressément référence ; et le système SMB avec recirculation interne, tel que décrit dans le document US 8,282,831 , auquel il est fait expressément référence.
Un système de chromatographie DCC est tel que décrit dans le document FR 2889077, auquel il est fait expressément référence. Un système DCC est un procédé séquentiel à déplacement périodique des points d'injection de phase mobile et de mélange à séparer, ayant la caractéristique d'être constamment en boucle ouverte. Il utilise deux colonnes ou plus.
Un système AMB présente un fonctionnement similaire à un système
SMB. Toutefois, au lieu de déplacer les points d'injection du flux d'alimentation et de l'éluant, ainsi que des points de collecte, au moyen d'un système de vannes, un ensemble d'unités d'adsorption (colonnes) sont déplacées physiquement par rapport aux points d'alimentation et de collecte. A nouveau, le fonctionnement permet de simuler un lit mobile continu à contre-courant.
Un système de chromatographie VARICOL™ est tel que décrit dans les documents US 6,136,198, US 6,375,839 US 6,413,419 et US 6,712,973, auxquels il est fait expressément référence. Un système VARICOL™ comprend une pluralité de colonnes individuelles contenant un adsorbant qui sont reliées en série. On fait passer un éluant dans les colonnes selon une première direction. Contrairement au système SMB, les points d'injection pour le mélange à séparer et pour l'éluant et les points de collecte des composés séparés dans le système sont déplacés périodiquement mais de manière asynchrone, au moyen d'un ensemble de vannes. L'effet global est de créer des zones de séparation de longueur variable dans le temps, allouant ainsi la phase stationnaire de manière dynamique dans les zones où elle est la plus utile, et permettant une puissance de séparation similaire avec moins d'unités de séparation chromatographique et une productivité accrue. Contrairement à un système SMB, un système VARICOL™ ne simule pas le fonctionnement d'une colonne unique contenant un lit mobile d'adsorbant solide, l'adsorbant solide se déplaçant dans une direction à contre-courant du flux d'éluant, et ainsi le principe de fonctionnement du VARICOL™ ne peut pas être mis en œuvre dans un système AMB équivalent.
L'ensemble des installations connues ci-dessus peuvent être adaptées pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, en prévoyant des alimentations adéquates pour l'enceinte ou les enceinte(s) contenant le lit de phase stationnaire, à savoir :
- au moins une alimentation en éluant tel que décrit ci-dessus, de préférence plusieurs alimentations en éluants (notamment une alimentation en éluant d'élution et une alimentation en éluant de régénération) ; et
- au moins une alimentation en gaz comprimé, pour la ou les étapes de déplacement d'éluant par le gaz comprimé.
L'installation de l'invention comprend également avantageusement un dispositif de séparation de gaz comprimé et de solvant, en sortie de la ou des enceintes ou colonnes.
Ce dispositif de séparation peut notamment comporter un séparateur cyclonique, un filtre et/ou un évaporateur. Ainsi, le procédé de l'invention comprend avantageusement une collecte d'un mélange de gaz comprimé et d'un ou plusieurs solvants lors de l'étape de déplacement de l'éluant par le gaz comprimé, et la séparation du gaz comprimé d'une part et du ou des solvants d'autre part. Ainsi, le gaz comprimé peut être recyclé (notamment pour la mise en œuvre de la ou les étapes de déplacement). De même le ou les solvants peuvent être recyclés (notamment pour reconstituer un éluant).
La phase stationnaire de l'invention comprend au moins un matériau choisi parmi l'alumine activée, le gel de silice, le charbon actif, l'acide silicique, l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, la cellulose, l'amylose, un adsorbant polymérisé, un de leurs dérivés, et/ou les combinaisons de ceux-ci.
La séparation chromatographique de l'invention peut être en phase normale, c'est-à-dire reposer sur des interactions polaires entre les espèces à séparer et la phase stationnaire. La phase stationnaire est alors de nature polaire, par exemple une phase de silice, fonctionnalisée ou non.
Alternativement, la séparation chromatographique de l'invention peut être en phase inverse, c'est-à-dire reposer sur des interactions hydrophobes entre les espèces à séparer et la phase stationnaire. La phase stationnaire est alors de nature apolaire, par exemple une phase de silice sur laquelle sont greffées des chaînes hydrocarbonées.
Alternativement, la séparation chromatographique de l'invention peut employer une phase stationnaire de polarité intermédiaire.
Alternativement, la séparation chromatographique de l'invention peut être une séparation chirale. Dans cas, la phase stationnaire comporte des molécules chirales greffées sur un support (par exemple de la silice).
L'invention peut en particulier être mise en œuvre pour la séparation de produits apolaires, de préférence sur une phase stationnaire normale. Dans ce cas, le produit d'intérêt et les impuretés engagent avec la phase stationnaire des interactions non covalentes hydrophiles, notamment des liaisons de type hydrogène.
Le pouvoir éluant de chaque éluant est donc d'autant plus fort que le ou les solvants qui le constituent est ou sont polaires. Le produit d'intérêt, hydrophobe, est faiblement retenu sur la phase stationnaire.
Ainsi, on peut utiliser un alcane, ou mélange d'alcanes, ou un mélange d'alcane(s) et de gaz comprimé, pour l'étape d'élution (et pour l'équilibrage). Pour la régénération, on utilise de préférence un solvant polaire tel que l'acétate d'éthyle, afin de désorber les impuretés fortement liées à la phase stationnaire.
La figure 3 illustre de manière schématique un tel procédé, le graphe représentant l'évolution du taux de gaz comprimé dans le flux de sortie d'une colonne chromatographique (en ordonnée) en fonction du temps.
La phase 1 correspond à l'étape d'élution. Le flux de sortie de la colonne est l'éluant d'élution, par exemple un alcane. Les phases 2 et 3 correspondent au déplacement de l'éluant d'élution par le gaz comprimé. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie augmente en phase 2 jusqu'à atteindre un maximum, puis reste en plateau en phase 3. Les phases 4 et 5 correspondent à l'étape de régénération, dans laquelle un éluant de régénération, par exemple de l'acétate d'éthyle, est injecté. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie diminue en phase 4 jusqu'à zéro, puis il reste à zéro en phase 5. Les phases 6 et 7 correspondent au déplacement de l'éluant de régénération par le gaz comprimé. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie augmente en phase 6 jusqu'à atteindre un maximum, puis reste en plateau en phase 7. Les phases 8 et 9 correspondent à l'étape d'équilibrage, dans laquelle un éluant d'équilibrage, par exemple à nouveau un alcane, est injecté. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie diminue en phase 8 jusqu'à zéro, puis il reste à zéro en phase 9.
Les produits d'intérêt à séparer ou purifier peuvent être en particulier des extraits naturels, des carotènes, des squalènes, des vitamines, des peptides, de l'insuline (de préférence de l'insuline recombinante) ou un dérivé d'insuline.

Claims

REVENDICATIONS
Procédé de séparation chromatographique, comprenant au moins une étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant, suivie d'une étape de déplacement de l'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé.
Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le gaz comprimé est à l'état liquide.
Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le gaz comprimé est à l'état supercritique.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le gaz comprimé est du CO2.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la pression absolue du gaz comprimé utilisé pour l'étape de déplacement est inférieure ou égale à 300 bar, de préférence à 200 bar, de préférence à 150 bar, de préférence à 100 bar, de préférence à 75 bar, de préférence encore à 50 bar.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'éluant est un composé unique.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'éluant est un mélange d'au moins deux composés.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel l'éluant est un solvant aqueux et/ou organique ou un mélange de solvants aqueux et/ou organiques.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel l'éluant est un mélange de solvant(s) aqueux et/ou organique(s) et de gaz comprimé, préférentiellement du CO2 à l'état liquide ou supercritique.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant, après l'étape de déplacement de l'éluant, la collecte d'un mélange de gaz comprimé et de solvant(s) aqueux et/ou organiques en sortie de la phase stationnaire, et la séparation du gaz comprimé et du ou des solvants aqueux et/ou organiques.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés de manière discontinue.
12. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés de manière continue.
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés à plus de
50 %, de préférence 60 %, de préférence 70 %, de préférence 80 %, de préférence 90 %, de préférence 95 %, de préférence 99 %, en poids. 14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel le gaz comprimé est recyclé de manière discontinue.
15. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel le gaz comprimé est recyclé de manière continue.
16. Procédé selon l'une des revendications 10 à 15, dans lequel le gaz comprimé est recyclé à plus de 50 %, de préférence 60 %, de préférence 70 %, de préférence 80 %, de préférence 90 %, de préférence 95 %, de préférence 99 %, en poids.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel ladite étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est une étape d'élution de produit(s) d'intérêt.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel ladite étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est une étape de régénération de la phase stationnaire.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, dans lequel ledit éluant est un premier éluant, le procédé comprenant, après l'étape de déplacement de l'éluant au moyen d'un gaz comprimé, la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire, qui est de préférence différent du premier éluant.
Procédé selon la revendication 19, dans lequel la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire est une étape de régénération de la phase stationnaire.
Procédé selon la revendication 19, dans lequel la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire est une étape d'équilibrage.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 , qui comprend de manière cyclique :
- une étape d'équilibrage, comprenant la mise en contact d'un éluant d'équilibrage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'injection, comprenant la mise en contact d'une composition comprenant un produit à séparer avec la phase stationnaire ;
- une étape optionnelle de rinçage, comprenant la mise en contact d'un éluant de rinçage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'élution du produit, comprenant la mise en contact d'un éluant d'élution avec la phase stationnaire et la collecte du produit à séparer ;
- à nouveau l'étape d'équilibrage ;
et dans lequel l'étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé est effectuée entre l'étape d'élution du produit et l'étape d'équilibrage.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 , qui comprend de manière successive ou cyclique : - une étape d'équilibrage, comprenant la mise en contact d'un éluant d'équilibrage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'injection, comprenant la mise en contact d'une composition comprenant un produit à séparer avec la phase stationnaire ;
- une étape optionnelle de rinçage, comprenant la mise en contact d'un éluant de rinçage avec la phase stationnaire ;
- une étape d'élution du produit, comprenant la mise en contact d'un éluant d'élution avec la phase stationnaire et la collecte du produit à séparer ;
- une étape de régénération, comprenant la mise en contact d'un éluant de régénération avec la phase stationnaire ;
- le cas échéant, l'étape d'équilibrage à nouveau ;
le procédé comprenant au moins une étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape d'élution du produit et l'étape de régénération ; et/ou entre l'étape de régénération et l'étape d'équilibrage. 24. Procédé selon la revendication 23, qui comprend à la fois une étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape d'élution du produit et l'étape de régénération, et une autre étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape de régénération et l'étape d'équilibrage.
25. Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, dans lequel les étapes d'équilibrage, d'injection, le cas échéant de rinçage, d'élution, et le cas échéant de régénération, sont mises en œuvre avec des éluants comprenant un gaz comprimé.
26. Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, dans lequel les étapes d'équilibrage, d'injection, le cas échéant de rinçage, d'élution, et le cas échéant de régénération, sont mises en œuvre avec des éluants ne comprenant pas de gaz comprimé.
27. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, dans lequel la phase stationnaire est une phase normale.
28. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, dans lequel la phase stationnaire est une phase inverse.
29. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, dans lequel la phase stationnaire est une phase de polarité intermédiaire. 30. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, dans lequel la phase stationnaire est une phase chirale.
31. Procédé selon l'une des revendications 1 à 30, dans lequel la phase stationnaire comprend au moins un matériau choisi parmi l'alumine activée, le gel de silice, le charbon actif, l'acide silicique, l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, la cellulose, l'amylose, un adsorbant polymérisé, un de leurs dérivés, et/ou les combinaisons de ceux-ci.
32. Procédé selon l'une des revendications 1 à 31 , qui est un procédé de séparation chromatographique préparative.
33. Procédé selon l'une des revendications 1 à 31 , qui est un procédé de séparation chromatographique analytique.
34. Procédé selon l'une des revendications 1 à 33, pour la purification d'extraits naturels. 35. Procédé selon l'une des revendications 1 à 33, pour la purification de carotènes.
36. Procédé selon l'une des revendications 1 à 33, pour la purification de squalènes.
37. Procédé selon l'une des revendications 1 à 33, pour la purification de vitamines.
38. Procédé selon l'une des revendications 1 à 33, pour la purification de peptides.
39. Procédé selon l'une des revendications 1 à 33, pour la purification d'insuline, de préférence d'insuline recombinante ou de dérivé d'insuline.
40. Installation pour la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 39, comprenant :
- au moins une enceinte contenant une phase stationnaire ;
- une alimentation de l'enceinte en au moins un éluant ; et
- une alimentation de l'enceinte en gaz comprimé.
41. Installation selon la revendication 40, dans laquelle l'enceinte est une colonne chromatographique.
42. Installation selon la revendication 40 ou 41 , comprenant en outre une alimentation de l'enceinte en au moins un autre éluant.
43. Installation selon l'une des revendications 40 à 42, comprenant un dispositif de séparation de gaz comprimé et de solvant(s) en sortie de l'enceinte.
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