WO2018052142A1 - 遺伝子改変細胞及びその作製方法 - Google Patents

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csf
human
cell
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洋三 中沢
松田　和之
中野　茂
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キッセイ薬品工業株式会社
国立大学法人信州大学
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Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified cell that expresses a chimeric antigen receptor and a method for producing the same that are useful in the field of adoptive immunotherapy.
  • the present invention relates to a genetic modification in which a polynucleotide encoding a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor-specific chimeric antigen receptor having excellent target cytotoxicity is introduced.
  • the present invention relates to a cell, a genetically modified cell into which a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF is introduced together with the polynucleotide, and a production method and pharmaceutical use thereof.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • CAR-T chimeric antigen receptors
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CD19 chimeric antigen receptor
  • scFv single-chain antibody
  • ⁇ CAR-T therapy is highly effective, but side effects often occur in clinical trials.
  • a single-chain antibody (scFv) derived from a mouse is often used as an antigen-binding domain, there is a risk of causing serious anaphylactic shock associated with an undesired immune response. For this reason, provision of a CAR having both excellent effects and safety is demanded.
  • the use of a ligand-type CAR has been proposed as a method to replace the conventional antibody-type CAR (Non-patent Document 2).
  • a liganded CAR is a ligand that specifically binds to a receptor protein whose target binding domain is expressed on the target cell, eg, a cytokine, affibody, a ligand binding domain derived from a natural receptor (eg, on a tumor cell) Receptor soluble protein / peptide ligands, peptides, and vaccines to stimulate immune responses. Therefore, if a receptor is expressed on the surface of the target cell, it is expected to show the target cytotoxic activity similar to that of the conventional CAR. Furthermore, the use of endogenous proteins as ligands can be expected to reduce the aforementioned unwanted immune responses.
  • GMR.CAR juvenile myelomonocytic leukemia
  • the present inventors further found that GMR.CAR-T cells autocrine GM-CSF over time when tumor cells were killed, and that the increased secretion of GM-CSF is the cytotoxic activity of GMR.CAR-T cells. It has also been found that it is necessary to overcome this issue for the development of GMR.CAR in the treatment because it may be a factor that hinders the improvement of GMR. Therefore, it was further investigated to provide GMR.CAR with suppressed GM-CSF gene expression in GMR.CAR-T cells and improved cytotoxic activity.
  • the present inventors expressed GMR.CAR-T in a host cell by simultaneously expressing in the host cell a polynucleotide encoding GMR.CAR and a polynucleotide capable of inducing an RNAi effect on GM-CSF. It was found that the secretion of GM-CSF from cells can be suppressed and the target cytotoxic activity of GMR.CAR-T cells can be improved, and the present invention has been completed.
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain A genetically modified cell into which a polynucleotide encoding is introduced.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a chimeric antigen receptor having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain ( CAR) a genetically modified cell into which a polynucleotide encoding a protein and (ii) a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF are introduced.
  • CAR intracellular signaling domain
  • the CAR protein further comprises a costimulatory domain and / or an extracellular spacer domain.
  • the intracellular signaling domain is human CD3 ⁇ .
  • the costimulatory domain is human CD28 or human 4-1BB.
  • the extracellular spacer domain comprises a human IgG1 hinge, CH2, and / or CH3 region or a part thereof, and / or an artificial spacer sequence.
  • the target binding domain is a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the cell in any one of. [9] The cell according to any one of [2] to [8] above, wherein the polynucleotide that induces RNAi is siRNA or shRNA. [10] A method for producing a CAR protein-expressing cell, comprising introducing a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to a human GM-CSF receptor into a cell using a vector.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a method for producing a CAR protein-expressing cell comprising introducing the cell into a cell.
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to a human GM-CSF receptor.
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to a human GM-CSF receptor, and a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF.
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to the human GM-CSF receptor, and a vector comprising a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF
  • a kit for the production of CAR protein-expressing cells for the production of CAR protein-expressing cells.
  • a therapeutic agent for a disease involving GM-CSF receptor-expressing cells comprising the cell according to any one of [1] to [9] above.
  • a pharmaceutical composition comprising the therapeutic agent according to the above [15] and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the GMR.CAR-T cell of the present invention comprises various cells expressing GM-CSF receptor on the cell surface, including juvenile myelomonocytic leukemia (JMML) and acute myeloid leukemia (AML). Expected to be effective for targeted adoptive immunotherapy.
  • the genetically modified cell in which the polynucleotide encoding GMR.CAR of the present invention and the polynucleotide that induces RNAi against GM-CSF are simultaneously expressed suppresses GM-CSF secretion from the genetically modified cell over time. In addition, it exhibits excellent cytotoxic activity against target cells.
  • An example of a vector map of CD19.CAR is shown.
  • the example of the vector map of GMR.CAR of this invention is shown.
  • the structural example of the synthetic sequence (sequence number 19) containing the polynucleotide which induces RNAi is shown.
  • sequence (sequence number 29) containing the polynucleotide (sequence number 22) which induces RNAi is shown.
  • sequence (sequence number 30) containing the polynucleotide (sequence number 25) which induces RNAi is shown.
  • sequence number 31 The structural example of the synthetic
  • sequence number 32 The structural example of the synthetic sequence (sequence number 32) containing the polynucleotide (SNC1-C (Takara Bio Inc.)) which induces RNAi is shown.
  • SNC1-C The example of the vector map of GMR.CAR + shRNA of this invention is shown.
  • the GMR.CAR expression rate% in HEK293T cells into which a polynucleotide encoding GMR.CAR and a polynucleotide inducing RNAi were introduced is shown.
  • the GMR.CAR expression rate% in day 14 of GMR.CAR-T cells (CAR-T 001) introduced with a polynucleotide encoding GMR.CAR is shown.
  • the antitumor cell activity% with respect to THP-1, Kasumi-1, or K562 cell of GMR.CAR-T cell (CAR-T 001) is shown.
  • the time-dependent change of the GM-CSF secretion amount in the co-culture supernatant of GMR.CAR-T cell (CAR-T 001) and THP-1 or Kasumi-1 is shown.
  • GMR.CAR-T 001 Anti-tumor cell activity% against THP-1 (A) or Kasumi-1 cells (B) of GMR.CAR-T cells (CAR-T 001) in the presence of GM-CSF (0, 5, or 10 ng / ml) Indicates.
  • GMR.CAR-T cells (CAR-T 001) introduced with a polynucleotide encoding GMR.CAR
  • GMR.CAR-T cells introduced with a polynucleotide encoding GMR.CAR and a polynucleotide that induces RNAi
  • the result of GM-CSF expression analysis on day 14 of (CAR-T 004-007) is shown.
  • CAR-T ⁇ 001 and CAR-T 004 to CAR-T 007 and anti-tumor cell activity% (A) and tumor cell killing ability (B) of Tock-1 cells of Mock-T cells into which no polynucleotide has been introduced Show.
  • the anti-tumor cell activity% (A) and tumor cell killing ability (B) of CAR-T 001 and CAR-T 004 to CAR-T 007 and Mock-T cells against Kasumi-1 cells are shown, respectively.
  • the anti-tumor cell activity% (A) and tumor cell killing ability (B) of CAR-T 001 and CAR-T 004 to CAR-T 007 and Mock-T cells against shinAML-1 cells are shown, respectively.
  • the anti-tumor cell activity% (A) and tumor cell killing ability (B) of CAR-T 001 and CAR-T 004 to CAR-T 007 and Mock-T cells against MV4-11 cells are shown, respectively.
  • the example of the vector map of GMR.CAR (CH2CH3 deletion body, GMR.CARdCH2CH3) of this invention which modified the spacer domain is shown.
  • the example of the vector map of GMR.CAR (CH2 deletion body, GMR.CARdCH2) of this invention which modified the spacer domain is shown.
  • the example of the vector map of GMR.CAR (CH2CH3 deletion- (G4S) 3 insert, GMR.CARdCH2CH3 + (G4S) 3) of the present invention with a modified spacer domain is shown.
  • the example of the vector map of GMR.CAR (hinge CH2 deletion body, GMR.CARdhingeCH2) of this invention which modified the spacer domain is shown.
  • the result of the GM-CSF expression analysis in day 14 of GMR.CAR-T cells CAR-T 001, CAR-T 008 to 011) introduced with a polynucleotide encoding GMR.CAR is shown.
  • Results of GM-CSF expression analysis on day 14 of GMR.CAR-T cells (CAR-T 008, CAR-T 010, CAR-T 012, and CAR-T 014) introduced with a polynucleotide encoding GMR.CAR Show.
  • the anti-tumor cell activity% with respect to MV4-11 cells of CAR-T001 and CAR-T 008 to CAR-T 011 and Mock-T cells is shown.
  • the anti-tumor cell activity% with respect to the MV4-11 cell of CAR-T012, CAR-T014, and Mock-T cell is shown.
  • Fig. 3 shows tumor cell killing ability of CAR-T 012, CAR-T 014 and Mock-T cells against MV4-11 cells.
  • T ratio in the evaluation of the persistence of the anti-tumor cell activity of CAR-T 001 and CAR-T 008 to CAR-T 011 and Mock-T cells against THP-1 cells.
  • the combination of the number of tumor cells in the well and the E: T ratio in the evaluation of the persistence of the antitumor cell activity of CAR-T 001 and CAR-T 008 to CAR-T 011 and Mock-T cells against MV4-11 cells is shown.
  • FIG. 6 shows sustained tumor cell killing ability at an E: T ratio of 1: 5 for CAR-T014008, 010, 012, 014 and Mock-T cells to THP-1 cells.
  • chimeric antigen receptor refers to a target specificity such as T cells (eg, T cells such as naive T cells, central memory T cells, effector memory T cells, or combinations thereof), etc. Refers to a modified receptor that can be transplanted into a cell. CAR is also known as an artificial T cell receptor, a chimeric T cell receptor, or a chimeric immune receptor.
  • domain refers to a region in a polypeptide that is folded into a specific structure independently of other regions.
  • RNAi RNA interference
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RNAi is a sequence-specific process of post-transcriptional gene repression.
  • siRNA short double-stranded RNA
  • the “polynucleotide that induces RNAi” refers to a polynucleotide that, when introduced into a cell, produces a desired siRNA (siRNA that causes RNAi against a target gene) by intracellular processing.
  • siRNA siRNA that causes RNAi against a target gene
  • shRNA short hairpin RNA
  • shRNA has a structure (hairpin structure) in which a sense RNA and an antisense RNA are linked via a loop structure part, and the loop structure part is cleaved in a cell to form a double-stranded siRNA, resulting in an RNAi effect.
  • RNAi-inducing polynucleotide may include antisense RNA and ribozyme.
  • polynucleotide includes natural or synthetic DNA and RNA, such as genomic DNA, cDNA (complementary DNA), mRNA (messenger RNA), rRNA (ribosomal RNA), shRNA (small hairpin). RNA), snRNA (nuclear small RNA), snoRNA (nuclear small RNA), miRNA (microRNA), and / or tRNA, but are not limited thereto.
  • the “translation region” refers to a region (coding region) that is translated into a protein among mRNA regions, and the “non-translation region” is located on both sides of the coding region, It means an area that is not translated.
  • the untranslated region there are a 5′-untranslated region (5′-UTR) on the 5 ′ end side and a 3′-untranslated region (3′-UTR) on the 3 ′ end side.
  • SEQ ID NO: 1 discloses a sequence containing the nucleotide sequences of human GM-CSF 5 ′ and 3′-untranslated regions and translated regions, in which the 1st to 32nd polynucleotides are The 5′-UTR, the 33rd to 467th polynucleotide corresponds to the translation region, and the 468th to 800th polynucleotide corresponds to the 3′-UTR.
  • encoding means that a predetermined nucleotide sequence encodes amino acid sequence information of a predetermined protein or (poly) peptide, as commonly used in the art. In the text, both sense and antisense strands are used in the context of “encoding”.
  • the present invention provides a chimeric antigen receptor having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • the CAR protein of the present invention contains a “target binding domain” that specifically binds to the human GM-CSF receptor.
  • Target (GM-CSF receptor) binding domain shows specific binding to GM-CSF receptor and specific immune response against target cells expressing GM-CSF receptor on the cell surface Enable.
  • a polypeptide having the amino acid sequence of GM-CSF which is a cytokine that binds to the GM-CSF receptor, can be used as the GM-CSF receptor binding domain.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the open reading frame of human GM-CSF can be used as the GM-CSF receptor binding domain.
  • GM-CSF protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be used.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and capable of binding to the human GM-CSF receptor can be used.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 can be used similarly.
  • a fragment of these polypeptides, that is, a binding fragment may be used as long as it retains the binding ability to the GM-CSF receptor.
  • “having the ability to bind to human GM-CSF receptor” means that the binding constant to human GM-CSF receptor is, for example, 1 to 1000 ⁇ m or less. This binding ability may be a relatively weak binding compared to the binding ability between the antigen and the antibody.
  • the CAR protein herein can optionally include an “extracellular spacer domain”.
  • the extracellular spacer domain is preferably a sequence that promotes the binding of CAR to an antigen and enhances signal transduction into the cell.
  • antibody Fc fragments, or fragments or derivatives thereof, antibody hinge regions, or fragments or derivatives thereof, antibody CH2 regions, antibody CH3 regions, artificial spacer sequences, or combinations thereof can be used.
  • IgG4 hinge As an extracellular spacer domain, (i) IgG4 hinge, CH2 and CH3 regions, (ii) IgG4 hinge region, (iii) IgG4 hinge and CH2, (iv) CD8a hinge region , (V) IgG1 hinge, CH2 and CH3 regions, (vi) IgG1 hinge region, or (vii) IgG1 hinge and CH2, or combinations thereof.
  • an IgG1 hinge region having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be preferably used, but is not limited thereto.
  • the IgG1 CH2 region has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the CH3 region has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 8 encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7
  • CH3 region has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • Each of those having 10) can be preferably used, but is not limited thereto.
  • the extracellular spacer domain can be the hinge, CH2, and CH3 regions of human IgG1 or a part thereof.
  • the extracellular spacer domain comprises (i) a human IgG1 hinge region alone (SEQ ID NO: 6), (ii) a human IgG1 hinge region (SEQ ID NO: 6) and CH3 region (SEQ ID NO: 10). , (Iii) CH3 region alone (SEQ ID NO: 10).
  • a spacer sequence represented by the formula (G4S) n can be used as an artificial spacer sequence used for an extracellular spacer domain.
  • those having SEQ ID NO: 42 can be preferably used.
  • a spacer having such a spacer sequence is sometimes called a peptide linker.
  • Peptide linkers preferably used in the art can be used as appropriate in the present invention. In this case, an appropriate peptide linker configuration and chain length can be selected as long as the function of the obtained CAR protein is not impaired.
  • the extracellular spacer domain can be a combination of the hinge region (SEQ ID NO: 6) of human IgG1 and the spacer sequence (SEQ ID NO: 42) of (G4S) 3.
  • the extracellular spacer domain can be appropriately selected from those exemplified above or further modified based on the common general technical knowledge in the art and used for the present invention.
  • the extracellular spacer domain is inserted into the vector by linking the base sequence encoding the amino acid sequence of each domain so that it can exist between the target binding domain and the transmembrane domain, and expressed in the host cell. Can do.
  • the extracellular spacer domain can be modified using a polynucleotide encoding a previously prepared plasmid CAR protein as a template.
  • the modification of the extracellular spacer domain can be achieved by, for example, improving the CAR gene expression rate in a host cell of a CAR-T cell into which a polynucleotide encoding CAR is introduced, signal transduction, cell aging, tumor distribution, antigen recognition or in This is useful when considering the effect on in vivo activity.
  • the CAR protein of the present invention is present on the cell membrane and comprises an extracellular domain comprising a target binding domain and optionally an extracellular spacer domain, a transmembrane domain, an intracellular signaling domain and optionally a costimulatory domain. Including domains.
  • a “transmembrane domain” is a domain having an affinity for the lipid bilayer constituting the cell membrane, whereas both the extracellular domain and the intracellular domain are hydrophilic domains. is there.
  • the transmembrane domain in GMR.CAR of the present invention is not particularly limited as long as the CAR protein can be present on the cell membrane and does not impair the functions of the target binding domain and the intracellular signal transduction domain. In some cases, a polypeptide derived from the same protein may serve as a transmembrane domain.
  • transmembrane domain for example, a transmembrane domain such as CD28, CD3 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3, CD4, or 4-1BB can be used.
  • human CD28 (Uniprot No. IV: P10747 (153-179)) can be used as the transmembrane domain.
  • the one having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 is preferably used as the transmembrane domain. be able to.
  • the CAR protein of the present invention can optionally contain a “costimulatory domain”.
  • Costimulatory domains specifically bind to costimulatory ligands, thereby causing costimulatory responses by cells such as, but not limited to, CAR-T cell proliferation, cytokine production, functional differentiation, and target cell death Is mediated.
  • the costimulatory domain is, for example, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), CD134 (OX40), Dap10, CD2, CD5, CD30, CD40, PD-1, ICAM-1, LFA- 1 (CD11a / CD18), TNFR-1, TNFR-II, Fas, Lck can be used.
  • human CD28 (Uniprot No .: P10747 (180-220)) or 4-1BB (GenBank: U03397.1) can be used as the costimulatory domain.
  • 4-1BB GenBank: U03397.1
  • the one having the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 is preferably used as the costimulatory domain. be able to.
  • the CAR protein of the present invention contains an “intracellular signaling domain”.
  • the intracellular signal transduction domain transmits signals necessary for exerting effector functions of immune cells.
  • intracellular signaling domains include, for example, human CD3 ⁇ chain, Fc ⁇ RIII, Fc ⁇ RI, cytoplasmic terminal of Fc receptor, cytoplasmic receptor having immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM) or their Combinations can be used.
  • ITAM immunoreceptor tyrosine activation motif
  • human CD3 ⁇ chain for example, nucleotides 299-637 of NCBI Accession No. NM_000734.3
  • intracellular signaling domain a substance having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 can be suitably used as the intracellular signal transduction domain.
  • the target polynucleotide can be easily prepared according to a conventional method. It is possible to obtain a base sequence encoding an amino acid sequence from NCBI RefSeq ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ID indicating the amino acid sequence of each domain or GenBank Accession number, and the present invention using standard molecular biological and / or chemical procedures. Of polynucleotides can be made. For example, nucleic acids can be synthesized based on these base sequences, and the polynucleotide of the present invention can be prepared by combining DNA fragments obtained from a cDNA library using the polymerase chain reaction (PCR). be able to.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the polynucleotide encoding GMR.CAR of the present invention can be prepared by ligating polynucleotides encoding the respective domains described above, and GMR.CAR is introduced by introducing this polynucleotide into an appropriate cell. -T cells can be generated. GMR.CAR can also be produced by recombining the target binding domain in accordance with a conventional method using a polynucleotide encoding an existing CAR protein having the same component other than the target binding domain as a template.
  • one or more domains such as an extracellular spacer domain can be modified using an inverse-PCR (iPCR) method, etc., using a polynucleotide encoding an existing CAR protein as a template.
  • iPCR inverse-PCR
  • Techniques for modifying the extracellular spacer domain are described, for example, in Oncoimmunology, 2016, Vol.5, No.12, e1253656, and the like.
  • the present invention also provides (i) A chimeric antigen receptor (CAR) protein having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain And (ii) a genetically modified cell into which a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF is introduced.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF in the present invention is a nucleic acid molecule that suppresses the expression process (including transcription, post-transcriptional regulation, translation, and post-translational regulation) of the GM-CSF gene. “Suppression of expression” in the present invention may be either transient suppression or constant suppression.
  • siRNA consisting of a sense strand complementary to a part of the mRNA sequence of the target gene and an antisense strand complementary thereto is introduced into the cell, or intracellularly. It can be expressed in As one embodiment of the present invention, siRNA or shRNA can be used as a polynucleotide for inducing RNAi.
  • siRNAs are short double stranded RNA molecules, usually 15-30 base pairs.
  • shRNA is a hairpin RNA that can be processed in vivo by Dicer to produce siRNA.
  • siRNA and shRNA can be introduced into cells together with transfection reagents such as Lipofectamine in vitro or in vivo.
  • siRNA and shRNA can be incorporated into a vector in the form of DNA and introduced into the cell so that they can be generated within the cell.
  • the siRNA targeting the GM-CSF gene is usually a double-stranded RNA in which a sense strand consisting of a sequence homologous to a continuous region in the mRNA sequence of the gene and an antisense strand consisting of its complementary sequence are hybridized. .
  • the length of the “continuous region” here is usually 15 to 30 bases.
  • the “continuous region” may include a translation region of the GM-CSF gene, a non-translation region, and a boundary between the translation region and the non-translation region.
  • siRNA and shRNA that can be preferably used in the present invention are for the untranslated region of mRNA of the human GM-CSF gene.
  • siRNA and shRNA based on the information of the target sequence and the like.
  • a sequence unique to a target sequence continuous sequence
  • Programs and algorithms have been developed for selecting appropriate target sequences.
  • siRNA and shRNA that suppress or inhibit the expression of a specific target protein can be obtained commercially from suppliers such as Takara Bio Inc., Thermo Fisher Scientific, Qiagen, and the like.
  • a further embodiment of the polynucleotide for inducing RNAi is a vector capable of expressing a desired siRNA.
  • Such vectors include vectors that express shRNA that is converted to siRNA by a later process (referred to as stem loop type or short hairpin type), vectors that separately express sense RNA and antisense RNA (referred to as tandem type) ).
  • stem loop type or short hairpin type vectors that separately express sense RNA and antisense RNA
  • tandem type vectors that separately express sense RNA and antisense RNA
  • RNAi RNAi
  • the polynucleotide for inducing RNAi of the present invention is also expressed simultaneously with GMR.CAR having human GM-CSF as a target binding domain in a host cell. Therefore, it is desirable that the polynucleotide for inducing RNAi of the present invention does not affect the expression of GMR.CAR in the host cell and suppresses the expression of GM-CSF in the host cell.
  • one embodiment of the present invention is 15 to 30 complementary to any continuous 15 to 30 regions in the mRNA sequence of the untranslated region of GM-CSF.
  • 15 to 30 nucleotide sequences including a nucleotide sequence complementary to the sense strand as an antisense strand can be used as siRNA.
  • As untranslated regions of GM-CSF there are an untranslated region on the 5′-terminal side and an untranslated region on the 3′-terminal side, and any region may be used.
  • the untranslated region on the 5′-terminal side is any continuous 15 to 30 of the 1st to 32nd sequences of the full-length nucleotide sequence of human GM-CSF represented by SEQ ID NO: 1.
  • any continuous 15 to 30 regions are selected from the 468th to 800th sequences of the full-length nucleotide sequence of human GM-CSF represented by SEQ ID NO: 1. be able to. More preferably, a 5′-terminal untranslated region can be used.
  • siRNA having sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 21 can be used as a polynucleotide for inducing RNAi.
  • an shRNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 22 can be used.
  • the polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor protein that specifically binds to human GM-CSF receptor and the polynucleotide that induces RNAi for human GM-CSF are promoters suitable for expression in human cells. It can be in the same vector under control, but it can also be in a separate vector. Suitable promoters can be both constitutive promoters and inducible promoters. Preferred promoters are derived from CMV and SV-40. If the polynucleotides are introduced by separate vectors, these vectors can be transfected into the host cell simultaneously or sequentially.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO:
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having an extracellular spacer domain comprising 42 amino acid sequences, a transmembrane domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • Genetically modified cells into which the encoding polynucleotide has been introduced can be used.
  • the above-mentioned “including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 42” means the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 42. Among them, it is meant to include any one or a combination of two or more. The same applies hereinafter.
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain SiRNA or shRNA complementary to the sequence of the untranslated region of human GM-CSF as a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF Genetically modified cells into which can be introduced can be used.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • a genetically modified cell into which a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 28 has been introduced.
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain SiRNA or shRNA complementary to the sequence of the 5'-untranslated region of human GM-CSF as a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF Genetically modified cells into which can be introduced can be used.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • a genetically modified cell into which a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF of SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 25 has been introduced.
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 42
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, a costimulatory domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • siRNA or shRNA complementary to the sequence of the untranslated region of human GM-CSF as a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF Genetically modified cells into which can be introduced can be used.
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO:
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having a costimulatory domain comprising 14 amino acid sequences and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • GM-CSF SiRNA or shRNA complementary to the sequence of the untranslated region of human GM-CSF as a polynucleotide that induces RNAi Genetically modified cells into which can
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 42
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, a costimulatory domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO:
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • SEQ ID NO: 22 sequence Genetically modified cells into which a polynucleotide that induces RNAi for human GM-CSF of SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 28 has been introduced can be used.
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 42
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, a costimulatory domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • siRNA or shRNA having complementarity to the sequence of the 5'-untranslated region of human GM-CSF as a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF Genetically modified cells into which can be introduced can be used.
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO:
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having a costimulatory domain comprising 14 amino acid sequences and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • GM-CSF SiRNA or shRNA complementary to the sequence of the 5 'untranslated region of human GM-CSF as a polynucleotide that induces RNAi Genetically modified cells
  • a target binding domain that specifically binds to a human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor, a transmembrane domain, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 42
  • a chimeric antigen receptor (CAR) protein having an extracellular spacer domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, a costimulatory domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and an intracellular signaling domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • SEQ ID NO: 22 or the sequence Genetically modified cells into which a polynucleotide that induces RNAi for human GM-CSF of No. 25 has been introduced can be used.
  • Examples of the cells into which the polynucleotide is introduced include cells derived from mammals such as human-derived cells or T cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs. Can be used. For example, cells collected, isolated, purified and induced by blood (peripheral blood, umbilical cord blood, etc.), body fluid such as bone marrow, tissue or organ can be used.
  • mammals such as human-derived cells or T cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs.
  • blood peripheral blood, umbilical cord blood, etc.
  • body fluid such as bone marrow, tissue or organ can be used.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • immune cells dendritic cells, B cells, hematopoietic stem cells, macrophages, monocytes, NK cells or blood cells (neutrophils, basophils)
  • cord blood mononuclear cells Fibroblasts, preadipocytes, stem cells, skin keratinocytes, mesenchymal cells, fatty liver cells, various cancer cell lines or neural stem cells can be used.
  • cells that release cytotoxic proteins can be used.
  • T cells T cell progenitor cells (hematopoietic stem cells, lymphocyte progenitor cells, etc.), NK cells, NK-T cells, or cell populations containing these can be used.
  • various stem cells such as ES cells and iPS cells are included as cells that can differentiate into these cells.
  • T cells include CD8 positive T cells, CD4 positive T cells, regulatory T cells, cytotoxic T cells, or tumor infiltrating lymphocytes.
  • Cell populations containing T cells and T cell progenitor cells include PBMC.
  • the cells may be collected from a living body, expanded and cultured, or established as a cell line.
  • a cell expressing the produced CAR or a cell differentiated from the cell into a living body it is desirable to introduce a nucleic acid into the living body itself or a cell collected from the same kind of living body.
  • the method for introducing a polynucleotide for producing a genetically modified cell is not particularly limited as long as it is a commonly used method.
  • the vector that can be used is not particularly limited, and examples thereof include a lentivirus vector, a retrovirus vector, a foamy virus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • a plasmid transposon can be used, such as sleeping beauty transposon system (for example, Huang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9; Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71; Deniger DC, Yu J, et al.
  • a non-viral embodiment particularly a piggybac transposon system can be used. Specific examples are shown in the Examples.
  • the present invention also includes CAR protein expression comprising introducing into a cell using a vector a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to a human GM-CSF receptor, as described above.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to a human GM-CSF receptor, and a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF.
  • a method for producing a CAR protein-expressing cell which comprises introducing each into a cell using a different vector.
  • a polynucleotide encoding GMR.CAR and a polynucleotide that induces RNAi in a host cell are used to increase the rate at which the two polynucleotides are simultaneously expressed in the host cell. It is desirable that they are incorporated into the same vector. That is, it is desirable that GMR.CAR is expressed in a cell in which the expression of GM-CSF is suppressed in the host cell by the polynucleotide that induces RNAi.
  • a genetically modified cell can be prepared using the 33rd to 467th polynucleotides of SEQ ID NO: 1 and the polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 29 to 31.
  • a vector containing the polynucleotide encoding GMR.CAR of the present invention and optionally a polynucleotide that induces RNAi is not particularly limited, but can be produced and maintained in an appropriate host cell such as Escherichia coli, for example. .
  • the production and culture of the genetically modified cells of the present invention is a medium suitable for culturing T cells or a cell population containing T cells or T cell progenitor cells based on the description in the present specification and common technical knowledge in the art. And according to culture conditions. In culturing, appropriate cytokines such as IL-15 and IL-7 can be added.
  • activated T cells stimulated with an antibody for example, as disclosed in International Publication WO 2017/061615, or virus after antibody stimulation
  • Viral peptide-added activated T cells treated with peptide antigens can also be added as feeder cells.
  • the method for culturing genetically modified cells of the present invention is not particularly limited.
  • a signal is transmitted into the cell and activated by inducing a receptor-specific immune response to the target cell expressing the GM-CSF receptor on the surface.
  • the activation of CAR-expressing cells varies depending on the type of host cell and the intracellular domain of the CAR, but can be confirmed using, for example, cytokine release, improved cell proliferation rate, changes in cell surface molecules, etc. as indicators . Release of cytotoxic proteins (perforin, granzyme, etc.) results in the destruction of cells expressing the receptor.
  • the present invention further provides a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to human GM-CSF receptor.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention further provides a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to human GM-CSF receptor, and a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF.
  • the present invention further includes a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein that specifically binds to a human GM-CSF receptor, and a vector comprising a polynucleotide that induces RNAi against human GM-CSF.
  • a kit for producing a CAR protein-expressing cell is provided.
  • the vector and kit of the present invention can be suitably used for preparing the above-described genetically modified cells of the present invention.
  • the cell expressing GMR.CAR of the present invention can be used as a therapeutic agent for diseases. Therefore, the present invention provides a therapeutic agent for a disease involving GM-CSF receptor-expressing cells, comprising the above-described cells of the present invention.
  • the therapeutic agent contains cells expressing CAR protein as an active ingredient, and may further contain a suitable excipient.
  • the disease that is expected to be treated with the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a disease that is sensitive to the cell. For example, a cell that expresses a GM-CSF receptor, particularly, a highly-expressed cell is related.
  • glioma glioma
  • neuroblastoma glioblastoma
  • brain tumor colorectal adenocarcinoma
  • kidney cancer melanoma
  • small cell lung cancer glioma
  • JMML juvenile myelomonocytic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • solid cancer is mentioned, for example, glioma (glioma), neuroblastoma, glioblastoma, brain tumor, colorectal adenocarcinoma, prostate cancer, kidney cancer, melanoma And small cell lung cancer.
  • the above-mentioned therapeutic agent when applied to solid cancer, it includes diseases in which GM-CSF receptor is expressed in cells forming the microenvironment of target cells, such as bone marrow-derived immunosuppressive cells (MDSCs) .
  • MDSCs bone marrow-derived immunosuppressive cells
  • the GM-CSF receptor is not expressed in the target cell, it can be used in combination with other therapeutic agents, for example, for the purpose of enhancing tumor cytotoxic activity.
  • expressing GM-CSF receptor, especially highly expressed means that the expression intensity is high (for example, the mean fluorescence intensity (MFI) in flow cytometry is high) and the expression rate It may be intended that the (positive rate) is high.
  • a cell having a high expression rate for example, it means a cell having a CD33 / CD116 expression rate (positive rate) of at least 40% or more.
  • it means a cell having an expression rate of 80% or more.
  • One embodiment of the therapeutic agent of the present invention is an anticancer agent against tumor cells that express the GM-CSF receptor.
  • the therapeutic agent or anticancer agent of the present invention can be used alone or in combination with drugs and / or treatments of different mechanisms.
  • the therapeutic agent of the present invention can be used in the form of a pharmaceutical composition alone or in combination with other active ingredients.
  • the therapeutic agent or pharmaceutical composition of the present invention can be administered locally or systemically, and the dosage form is not limited.
  • the dosage form is not limited.
  • the pharmaceutical composition may contain carriers, excipients, buffers, stabilizers and the like that are commonly used in the art depending on the dosage form. it can.
  • the dose of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the patient's weight, age, severity of disease, etc., and is not particularly limited.
  • the number of 10 4 to 10 10 CAR positive cells In the range of 1 kg / kg body weight, it can be administered once to several times a day, every 2 days, every 3 days, every week, every 2 weeks, every month, every 2 months, every 3 months.
  • the human GM-CSF sequence was ligated to the pSL1190 vector using a compatible site (pSL1190-GMR.CAR), pSL1190-GMR.CAR was double digested with NotI and EcoRI, and the GMR.CAR sequence portion was excised.
  • pIRES2-eGFP (Clontech) as a transposon plasmid
  • a 5 ′ inverted repeat sequence and a 3 ′ inverted repeat sequence were inserted to obtain a pIR-eGFP vector as a transposon plasmid.
  • the puromycin resistance gene was removed from the pIR-eGFP vector to obtain a pIRII-eGFP vector.
  • SFG-CD19 CAR retroviral vector prepared at Baylor College of Medicine was double digested with EcoRI and NotI, and anti-CD19 scFv (FMC63; Zola H. et al. Immunol Cell Biol.
  • FIG. 1 shows a vector map of pIRII-CD19.CAR, which was the basis of CAR 001 production
  • FIG. 2 shows a vector map of CAR 001 produced.
  • siRNA design and shRNA synthesis Based on the sequence of human GM-CSF (NCBI Accession No .: NM_000758.3, SEQ ID NO: 1), we commissioned Takara Bio Inc. to design siRNA specific to mRNA within a pair of translation regions ( SEQ ID NOs: 17 and 18).
  • siRNA specific for the mRNA sequence of 5'-untranslated region (5'-UTR) or 3'-untranslated region (3'-UTR) of human GM-CSF is expressed as BLOCK-iT (registered trademark) RNAi Designer Designed using (Thermo Fisher Scientific), any three pairs of siRNAs were selected (SEQ ID NO: 20 and 21, 23 and 24, 26 and 27).
  • Example 3 Construction of GMR.CAR + siRNA construct The artificially synthesized DNA (SEQ ID NOs: 29 to 31) in Example 2 and SNC1-C (Takara Bio Inc., SEQ ID NO: 32) to which MunI (MfeI) and ClaI cleavage sequences were added were used as pTAKN-2 vector (Bio Inc.) Dynamics Research Laboratories) or pBAsi vector (Takara Bio Inc.), the resulting vector is dissolved to 100 ng / ⁇ L, and 1 ⁇ L (corresponding to 100 ng) is used for E.
  • the cells were cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin for about 16 hours.
  • the HST04 strain was similarly transformed with the GMR.CAR expression plasmid (CAR 001) prepared in Example 1, and cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • the emerged colonies were further cultured in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin or ampicillin for about 16 hours.
  • Each plasmid was purified from the E. coli culture using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the purified plasmid (corresponding to 0.5-1 ⁇ g) was digested with the restriction enzymes MfeI and ClaI (New England Biolabs) for about 3 hours.
  • the enzyme-treated reaction solution is separated by 1% agarose gel electrophoresis, and the insert fragment excised from the pTAKN-2 vector and the CAR 001 enzyme-treated fragment are excised from the gel, and NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (registered trademark) , Machalai Nagel, Takara Bio Inc.).
  • the purified insert fragment and vector fragment were ligated using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix (Takara Bio Inc.).
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (Toyobo Co., Ltd.), TOP10 (Thermo Fisher Scientific) or HST04 strain was transformed with the ligated circular vector and cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • the emerged colonies were further cultured in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • Each plasmid was purified from the cultured E. coli culture solution using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the purified plasmid (equivalent to 0.5-1 ⁇ g) is digested with the restriction enzyme BamHI (New England Biolabs) for about 3 hours, and the insert fragment is confirmed by 1% agarose gel electrophoresis.
  • GMR.CAR + shRNA insert expression plasmids [car CAR 004 (GMR.CAR + 5'-UTR_1, respectively) CAR 005 (GMR.CAR + 5 ' -UTR_6), CAR-006 (GMR.CAR + 3'-UTR_500) or CAR-007 (GMR.CAR + SNC1-C)] (FIG. 8).
  • E. coli containing a GMR.CAR + shRNA insert expression plasmid or a mutant GMR.CAR + shRNA insert expression plasmid was cultured, and a plasmid solution purified using Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) was used. .
  • GM-CSF mutant GMR.CAR expression plasmid Since siRNA of the translation region may affect the expression of GM-CSF, which is the target binding domain of GMR.CAR, 159 of GM-CSF mRNA sequence (NCBI Accession No .: NM_000758.3 (SEQ ID NO: 1)) Mutation that does not cause amino acid substitution was introduced into the portion corresponding to -179 bases (SEQ ID NOs: 3 and 4). Specifically, the 159th to 179th base sequences in the base sequence of SEQ ID NO: 1 were mutated to the 127th to 147th base sequences in the base sequence of SEQ ID NO: 3.
  • This mutant was prepared by replacing the artificially synthesized gene in which mutation was introduced into the base of the mRNA sequence part to which siRNA binds with the wild type GM-CSF sequence of CAR001. That is, XhoI-secretion signal sequence-GM-CSF variant-hinge sequence-DraIII fragment artificially added with a sequence cleaved by restriction enzyme XhoI on the 5 'side and a sequence cleaved by restriction enzyme DraIII on the 3' side Synthesized (consigned to Eurofin Genomics Co., Ltd.). This fragment was combined with a fragment obtained by treating CAR 001 with XhoI and DraIII to prepare a GM-CSF mutant GMR.CAR expression plasmid.
  • the HST04 strain was similarly transformed with the GM-CSF mutant GMR.CAR expression plasmid (CAR 002) prepared in Comparative Example 1 and cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • the emerged colony was further cultured in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin or ampicillin for about 16 hours, and a sample having the base sequence completely matched with SEQ ID NOs: 19 and 32 was obtained by the same procedure as in Example 3.
  • GMR.CAR + shRNA insert expression plasmids [car CAR 002 (mutant GMR.CAR + shRNA) and CAR 003 (mutant GMR.CAR + SNC1-C), respectively].
  • Overnight cultured cells are mixed with plasmid dilutions containing 0.8 ⁇ g CAR 001-007 in 50 ⁇ L Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) and 2 ⁇ L Lipofectamine 2000 reagent (Thermo Fisher Scientific in 50 ⁇ L Opti-MEM). Fick) was mixed in equal amounts and left at room temperature for 20 minutes, and 100 ⁇ L / well was added to the seeded cells. The culture was continued for about 48 hours in a CO 2 incubator. As a control, a group to which 100 ⁇ L of Opti-MEM was added and a group to which only a lipofectamine reagent not containing a plasmid was added were set.
  • each cell was collected and centrifuged, and then suspended by adding 2.5 ⁇ L of PE Rat Anti-Human GM-CSF antibody (BD Pharmingen) and APC Anti-Human CD116 antibody (Miltenyi Biotech) 4 ⁇ C, The antibody labeling reaction was performed for 20 minutes in the dark. After 20 minutes, the cells were washed with an appropriate amount of D-PBS, the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and the sample resuspended in an appropriate amount of D-PBS was analyzed using FACSCalibur (BD), and GM -The expression rate of CSF / CD3-positive GMR.CAR was measured.
  • PE Rat Anti-Human GM-CSF antibody BD Pharmingen
  • APC Anti-Human CD116 antibody Miltenyi Biotech 4 ⁇ C
  • FIG. 9 shows the results of GM-CSF positive GMR.CAR expression rate% 48 hours after the introduction of CAR 001-007 into HEK293T cells.
  • the expression rate of GMR.CAR was lowest when CAR ⁇ 002, which can induce RNAi for the translation region of the GM-CSF gene, was introduced compared to the others.
  • the expression rate of GMR.CAR by introduction of the negative control shRNA insert (CAR 003 and CAR 007) and the untranslated region shRNA insert (CAR 004 to 006) hardly decreased.
  • CAR 002 is a mutant in which a specific shRNA is inserted in the translation region of GM-CSF mRNA and a base mutation is introduced into the siRNA recognition part in the GM-CSF gene sequence. It was considered that siRNA showed a certain knockdown effect and suppressed the expression of GMR.CAR itself.
  • Example 5 CMR-CAR-T cell culture and amplification 1 ⁇ Day 0: Isolation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and electrical introduction of GMR.CAR expression vector> Peripheral blood was collected from healthy adult donors, diluted twice with D-PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then diluted with Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare), 400 xg, 30 Centrifugation was performed for 1 minute, and PBMCs were collected. The sorted PBMCs were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation. For introduction of the GMR.CAR expression plasmid (CAR 001) into PBMC, 10 ⁇ 10 6 cells were used.
  • TexMACS medium (Miltenyi Biotech) 2 containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15, in which cells subjected to electrical gene transfer were allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and the entire amount was pre-warmed Culturing was started on a 24-well treatment culture plate at mL / well.
  • Mock-T cells not subjected to gene transfer operation 1 ⁇ 10 6 cells were cultured in the same manner.
  • Half of the medium during culture was discarded, and medium replacement was performed as appropriate by adding half the amount of TexMACS medium containing twice the amount, that is, 20 ng / mL IL-7 and 10 ng / mL IL-15.
  • Nonspecific antibody stimulation of transgenic cells Prepare a 24-well non-treatment culture plate with D-PBS containing anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody (Miltenyi Biotech) at 37 ° C for 2 hours. Transfer to plate and non-specific antibody stimulation of T cells until day 4.
  • CAR-T cell amplification Transfer the entire cell suspension to G-Rex 10 (Wilson Wolf) packed with 30 mL of TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15 and amplify CAR-T cells until Day 14 Went.
  • the expression rate of GMR.CAR cells amplified until Day 14 was measured by the following method. Mock-T cells were continuously cultured on a 24-well treatment culture plate, and medium exchange and amplification were performed depending on the degree of cell proliferation.
  • the expression rate of / MR3-positive or GM-CSF / CD3-positive GMR.CAR was measured.
  • the GMR.CAR-T cell obtained by the electrical introduction operation into PBMC and the T cell culture / amplification operation using the GMR.CAR expression plasmid (CAR 001) was defined as CAR-T 001.
  • Fig. 10 shows the expression analysis results of CAR-T 001 produced from 3 healthy adult donors on day 14.
  • CAR-T 001 GMR.CAR expression rates are donor 1: 10.12% (IgG / CD3 positive rate), donor 2: 15.38% and donor 3: 10.98% (respectively GM-CSF / CD3 positive rate) ⁇
  • donor 1 10.12%
  • donor 2 15.38%
  • donor 3 10.98%
  • the expression rate in Mock-T cells corresponding to each donor was high, and GMR.CAR expressing T cells (CAR-T 001) was successfully produced.
  • the co-culture test was conducted for 5 days. A similar co-culture test was performed for Mock-T cells, and a group in which only tumor cells were cultured at the same number of cells was also set as a control group (CAR-T non-added group). On the fifth day of the co-culture test, the cells in each well were collected, and the number of viable cells was counted under staining with trypan blue. To the centrifuged cells, 5 ⁇ L of APC Anti-Human CD3 antibody (Milteny Biotech) and 5 ⁇ L of PE Anti-Human CD33 antibody were added and suspended, and an antibody labeling reaction was performed at 4 ° C. for 20 minutes in the dark.
  • APC Anti-Human CD3 antibody Milteny Biotech
  • PE Anti-Human CD33 antibody were added and suspended, and an antibody labeling reaction was performed at 4 ° C. for 20 minutes in the dark.
  • the anti-tumor cell activity% of CAR-T ⁇ 001 or Mock-T cells was calculated by the following formula.
  • FIG. 11 shows the results of% anti-tumor cell activity of TAR-1, Kasumi-1 or K562 cells of CAR-T 001 prepared using cells derived from 3 healthy adult donors. The data showed the average value of% anti-tumor cell activity of 3 donors CAR-T 001. CAR-T 001 completely killed THP-1 and Kasumi-1 cells at E: T ratio 1: 5, and strong antitumor cell activity was also observed at E: T ratio 1: 50. On the other hand, CAR-T 001 did not kill K562 cells that do not express CD116, which is a GM-CSF receptor ⁇ chain.
  • FIG. 12 shows the results of GM-CSF secretion in the co-culture supernatant of CAR-T 001 and THP-1 or Kasumi-1.
  • CAR-T 001 showed GM-CSF secretion from day 1 of co-culture with THP-1 or Kasumi-1, and peaked on day 3 in co-culture with THP-1 cells. In culture, a significant increase in GM-CSF was confirmed up to day 5. On the other hand, no increase in GM-CSF in the culture supernatant was observed in any of the co-cultures with Mock-T without the gene transfer operation.
  • Example 7 Effect of GM-CSF coexistence on anti-tumor cell activity of CAR-T 001.
  • GM-CSF 0-10 ng / mL was artificially added, and anti-tumor of CAR-T 001 coexisting with GM-CSF The effect on cell activity was evaluated.
  • FIG. 13 is a graph showing the antitumor cell activity of CAR-T 001 against THP-1 or Kasumi-1 in the presence of GM-CSF.
  • Example 8 CMR-CAR-T cell culture / amplification 2
  • Day-3 Isolation of PBMC and non-specific stimulation of T cells OKT 3 blast (blasts stimulated non-specifically with anti-CD3 antibody)>
  • D-PBS Wicoll-Paque PLUS, 400 xg
  • Centrifugation was performed for 30 minutes to separate PBMC.
  • the sorted PBMCs were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation.
  • the suspension was suspended in TexMACS medium containing 5 ng / mL IL-15 so that the isolated PBMC was 2 to 4 ⁇ 10 6 cells / well / 2 mL.
  • the OKT3 blast was prepared by stimulating the target.
  • ⁇ Day 0 Viral peptide pulse of OKT3 blast>
  • OKT3 blasts subjected to nonspecific antibody stimulation were collected, and virus peptide stimulation was performed with Peptivator peptide pool (registered trademark, Miltenyi Biotech).
  • Peptivator peptide pool registered trademark, Miltenyi Biotech.
  • OKT3 blast was suspended in a peptide pool supplemented with 0.05 ⁇ g / ⁇ L of AdV5 Hexon, CMV pp65, EBV BZLF1 and EBV EBNA-1 in 50 ⁇ L of D-PBS, and stimulated with viral peptide at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the acronym for these viral peptides was taken and defined as the ACE method.
  • TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15 to 0.5-2 x 10 6 cells / well / 2 mL It was suspended in and transferred to a 24-well treatment culture plate as feeder cells. The rest of the OKT3 blast not subjected to the viral peptide pulse and UV irradiation was continuously cultured in a 24-well treatment culture plate in TexMACS medium containing 5 ng / mL IL-15.
  • PBMC isolation and gene transfer Peripheral blood was collected from healthy adult donors, diluted twice with D-PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then diluted with Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare), 400 xg, 30 Centrifugation was performed for 1 minute, and PBMCs were collected. The sorted PBMCs were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation. For introduction of the GMR.CAR expression plasmid into PBMC, 10 ⁇ 10 6 cells were used.
  • Mock-T cells As Mock-T cells not subjected to gene transfer operation, 1 ⁇ 10 6 cells from each donor were cultured in the same manner. Half of the medium during culture was discarded, and medium replacement was performed as appropriate by adding half the amount of TexMACS medium containing twice the amount, that is, 20 ng / mL IL-7 and 10 ng / mL IL-15. Mock-T cells were continuously cultured on a 24-well treatment culture plate, and medium exchange and amplification were performed depending on the degree of cell proliferation.
  • CAR-T cell amplification > G-Rex filled with 2 x 10 6 feeder cells prepared as in Day 0 in 30 mL of TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15 Then, GMR.CAR-T cells were amplified until Day 14. The expression rate of GMR.CAR-T cells amplified until Day 14 was measured by the following method.
  • the cells were washed with an appropriate amount of D-PBS, the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and the sample resuspended in an appropriate amount of D-PBS was analyzed using FACSCalibur, and GM-CSF / The expression rate of CD3-positive GMR.CAR was measured.
  • GMR.CAR expression plasmid CAR 001
  • GMR.CAR + shRNA insert expression plasmid CAR 004, CAR 005, CAR 006 or CAR 007, respectively
  • the GMR.CAR-T cells obtained by manipulation were defined as CAR-T 001, CAR-T 004, CAR-T 005, CAR-T 006 and CAR-T 007, respectively.
  • FIG. 14 shows the expression analysis results on day 14 of CAR-T 001 and 004 to 007 prepared from PBMC of a healthy adult 1 donor by the ACE method.
  • CAR-T 001 and CAR-T 001: 004-007 produced by the ACE method have CAR-T 001: 24.41%, CAR-T 004: 13.17%, CAR-T 005: 16.47%, CAR-T, respectively.
  • Example 9 Expression analysis of GMR ⁇ (CD116) on tumor cell surface
  • AML Acute myeloid leukemia (AML) cell lines THP-1, Kasumi-1, MV4-11 (American Type Culture Collection (ATCC)), shinAML-1 (cells established from AML patients at Shinshu University Hospital) Strain) or K562 cells, which are cell lines of chronic myelogenous leukemia (CML).
  • Table 1 shows the expression rate of CD33 / CD116 on the surface of each tumor cell.
  • the CD33 / CD116 positive rate was 90% or more in all of THP-1, Kasumi-1, shinAML-1, and MV4-11.
  • the CD33 / CD116 positive rate in K562 was as low as 4.29%, confirming the low expression of GM-CSF receptor ⁇ chain on the K562 cell surface.
  • Example 10 Antitumor cell activity of ACE CAR-T 001 and 004 to 007
  • THP-1, Kasumi-1, shinAML-1, or MV4-11 is used, and each tumor cell [target (T)] contains 5 % 10 5 cells / mL and contains 10% FBS. It was prepared with RPMI 1640 medium (Thermo Fisher Scientific) and seeded on a 48-well treatment culture plate at 500 ⁇ L / well.
  • CAR-T 001 and 004 to 007 [Effector (E)] obtained in Example 8 were diluted with RPMI 1640 medium containing 10% FBS so that the E: T ratio was 1: 5 to 1: 100.
  • E: T ratio 1: 5
  • GMR.CAR-T cells were prepared at 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and 500 ⁇ L / well was added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells. Added.
  • E: T ratio 1: 50
  • 1: 100 GMR.CAR-T cells were prepared to be 0.1 ⁇ 10 5 cells / mL or 0.05 ⁇ 10 5 cells / mL, respectively, and tumors The cells were added to a 48-well treatment culture plate seeded with cells at 500 ⁇ L / well. The co-culture test was conducted for 5 days.
  • the cells in each well were collected, and the number of viable cells was counted under staining with trypan blue.
  • the centrifuged cells were suspended by adding 5 ⁇ L of APC-Anti-Human-CD3 antibody and 5 ⁇ L of PE-Anti-Human-CD33 antibody, and subjected to an antibody labeling reaction at 4 ° C. under light shielding for 20 minutes.
  • the anti-tumor cell activity% of CAR-T 001 and 004 to 007 or Mock-T cells was calculated by the following formula.
  • -CAR-T cell number effector cell number x GM-CSF positive rate% / 100
  • FIG. 15 shows the antitumor cell activity (A) and tumor cell killing ability (B) of CAR-T 001 and 004 to 007 or Mock-T cells against THP-1.
  • the anti-tumor cell activity of CAR-T 004 was stronger than that of CAR-T 001, 005, 006, 007, and maintained 90% or more in E: T ratio 1: 100.
  • T ratio 1 100.
  • CAR-T 004 was the strongest, and killing ability about twice as strong as that of CAR-T 001 without shRNA or CAR-T 007 as a negative control.
  • FIG. 16 shows the antitumor cell activity (A) and tumor cell killing ability (B) of CAR-T 001 and 004 to 007 or Mock-T cells against Kasumi-1.
  • A antitumor cell activity
  • B tumor cell killing ability
  • CAR-T 004 was the strongest, and killing ability was about 1.5 times stronger than that of CAR-T 001 without shRNA or CAR-T 007 as a negative control.
  • FIG. 17 shows the antitumor cell activity (A) and tumor cell killing ability (B) of CAR-T 001 and 004 to 007 or Mock-T cells against shinAML-1.
  • the anti-tumor cell activity of CAR-T 004 was stronger than that of CAR-T 001, 005, 006, 007, and maintained 80% or more even in E: T ratio 1: 100.
  • T ratio 1 100.
  • T ratio 1 100.
  • CAR-T 004 was the strongest, and killing ability was more than twice as strong as that of CAR-T 001 without shRNA or the negative control CAR-T ⁇ 007.
  • FIG. 18 shows the antitumor cell activity (A) and tumor cell killing ability (B) of CAR-T 001 and 004 to 007 or Mock-T cells against MV4-11 cells.
  • the anti-tumor cell activity of CAR-T 004 was stronger than that of CAR-T 001, 005, 006, 007, and maintained 70% or more in E: T ratio 1 ⁇ : 100.
  • T ratio 1 ⁇ 100.
  • CAR-T 004 was the strongest, and killing ability was about 1.5 times stronger than that of CAR-T 001 without shRNA or CAR-T 007 as a negative control.
  • Example 11 Evaluation of GM-CSF secretion amount
  • Culture supernatants from day 1 to day 5 with an E: T ratio of 1: 5 in the co-culture test conducted in Example 10 were collected and stored frozen at ⁇ 30 ° C. until measurement.
  • the cryopreserved culture supernatant was thawed and diluted 10-fold with D-PBS, and then the amount of GM-CSF secretion in the culture supernatant was measured using Human GM-CSF Quantikine ELISA Kit (R & D Systems).
  • the amount of GM-CSF secretion of CAR-T 001 and 004 to 007 was corrected by the GM-CSF positive rate% of CAR-T cells.
  • FIGS. 19 and 20 show the measurement results of the GM-CSF concentration in the coculture supernatant of any of CAR-T 001 and 004 to 007 and THP-1, Kasumi-1, shinAML-1, or MV4-11 cells.
  • CAR-T 001 without shRNA introduced was confirmed to increase GM-CSF secretion in any of the co-cultures with tumor cells.
  • CAR-T 007, into which the negative control shRNA was introduced showed almost no knockdown effect.
  • CAR-T-004 was the most correlated CAR-T cell with the knockdown effect on GM-CSF and the improvement of anti-tumor cell activity of CAR-T cells.
  • CAR-T 006 which is considered to have the highest knockdown effect on GM-CSF, the antitumor cell activity is uniformly inferior to other CAR-Ts, so the siRNA knockdown effect is rather high. There is also a possibility that cytokine secretion itself accompanying tumor cell killing is reduced.
  • FIGS. 21 to 24 show vector maps, respectively, CH2CH3 partial deletion (FIG. 21), CH2 partial deletion (FIG. 22), CH2CH3 partial deletion and (G4S) 3 insertion (FIG. 21). 23), and a hinge CH2 partial deletion form (FIG. 24) was produced.
  • PCR primers used for Inverse-PCR are as follows: primers for CH2CH3 partial deletion (SEQ ID NOs: 33 and 34), primers for CH2 partial deletion (SEQ ID NOs: 35 and 36), CH2CH3 partial deletion, and Primers for (G4S) 3 insert (SEQ ID NOs: 37 and 38) and hinge CH2 partial deletion primers (SEQ ID NOs: 39 and 40) were designed and synthesized, respectively (consigned to Eurofin Genomics Co., Ltd.).
  • CAR 001 was prepared to 50 ng / ⁇ L and used as a template, and each PCR primer was prepared so that the concentration in the reaction solution was 0.2 or 0.3 ⁇ M.
  • Inverse-PCR used KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.), and the reaction composition followed the protocol attached to the kit.
  • the reaction conditions were (i) 94 ° C. for 2 minutes, (ii) 98 ° C. for 10 seconds, (iii) 68 ° C. for 7 minutes, and (ii) and (iii) were repeated for 10 cycles.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ (Toyobo Co., Ltd.) was transformed with each of the obtained circular plasmids and cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • the emerged colonies were further cultured in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin for about 16 hours.
  • Each plasmid was purified from the cultured Escherichia coli culture solution using QIAprep Spin Miniprep (Kit (Qiagen), and the nucleotide sequence was confirmed.
  • the plasmids in which the modification of the target nucleotide sequence was confirmed: CAR 008 (GMR.CAR dCH2CH3), CAR 009 (GMR.CAR dCH2), CAR 010 (GMR.CAR dCH2CH3 + (G4S) 3), and CAR 011 (GMR.CAR dHingeCH2) were obtained.
  • CAR 008 is a hinge region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • CAR 009 is a hinge region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and CH3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • CAR 010 contains a hinge region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and (G4S) 3 sequence consisting of SEQ ID NO: 42
  • CAR011 contains a CH3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • Example 13 Preparation of GMR.CAR + shRNA insert spacer modified plasmid (CAR 012-015)] Using CAR 004 as a template, a GMR.CAR expression plasmid in which the extracellular spacer domain part was modified was prepared in the same manner as in Example 12 by the inverse-PCR method.
  • CAR 012 (GMR.CAR + shRNA dCH2CH3), CAR 013 (GMR.CAR + shRNA dCH2) ), CAR014 (GMR.CAR + shRNA dCH2CH3 + (G4S) 3), and CAR015 (GMR.CAR + shRNA dHingeCH2) were obtained.
  • the extracellular spacer domains of the resulting plasmids CAR 012, CAR 013, CAR 014, and CAR 015 have the same structure as CAR 008, CAR 009, CAR 010, and CAR 011, respectively. Similar to CAR 004, it contains shRNA (FIG. 4, SEQ ID NO: 29) having complementarity to the sequence of the 5 ′ untranslated region of GM-CSF.
  • Example 14 CMR-CAR-T cells (CAR-T 008 to 011, CAR-T 012 and CAR-T 014) culture and amplification 3] ⁇ Day 0: Isolation of PBMC and preparation of non-specific stimulation OKT 3 blast> Collect peripheral blood from healthy adult donors, dilute it twice with D-PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), overlay the diluted peripheral blood on Ficoll-Paque PLUS, and centrifuge at 400 xg for 30 minutes. And PBMCs were collected. The sorted PBMCs were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation.
  • D-PBS Wicoll-Paque PLUS
  • the suspension was suspended in TexMACS medium containing 5 ng / mL IL-15 so that the isolated PBMC was 2 to 4 ⁇ 10 6 cells / well / 2 mL.
  • OKT3 blast was prepared by stimulating the target.
  • PBMC virus peptide pulse The isolated PBMC were stimulated with a viral peptide using a peptivator peptide pool (registered trademark, Miltenyi Biotech). Specifically, PBMC was suspended in a peptide pool supplemented with 0.05 ⁇ g / ⁇ L of AdV5 Hexon, CMV pp65, EBV BZLF1 and EBV EBNA-1 in 50 ⁇ L of D-PBS, respectively, and virus peptide stimulation was performed at 37 ° C. for 30 minutes. gave.
  • the culture method of this example was defined as a PBMC-ACE method as a modification of the ACE method described in Example 8.
  • PBMC isolation and gene transfer Peripheral blood was collected from healthy adult donors, diluted twice with D-PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then diluted with Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare), 400 xg, 30 Centrifugation was performed for 1 minute, and PBMCs were collected. The sorted PBMCs were washed twice with D-PBS and isolated by centrifugation. For introduction of the GMR.CAR expression plasmid into PBMC, 10 ⁇ 10 6 cells were used.
  • Mock-T cells not subjected to gene transfer operation 1 ⁇ 10 6 cells were cultured in the same manner. Half of the medium during culture was discarded, and medium replacement was performed as appropriate by adding half the amount of TexMACS medium containing twice the amount, that is, 20 ng / mL IL-7 and 10 ng / mL IL-15. Mock-T cells without gene transfer were continuously cultured on a 24-well treatment culture plate, and medium exchange and amplification were performed according to the degree of cell proliferation.
  • CAR-T cell amplification > G-Rex filled with 2 x 10 6 feeder cells prepared as in Day 0 in 30 mL of TexMACS medium containing 10 ng / mL IL-7 and 5 ng / mL IL-15 Then, GMR.CAR-T cells were amplified until Day 14. The expression rate of GMR.CAR-T cells amplified until Day 14 was measured by the following method.
  • the cells were washed with an appropriate amount of D-PBS, the cells were precipitated by centrifugation, the supernatant was removed, and the samples resuspended in an appropriate amount of D-PBS were analyzed using FACSCanto II (BD) and FLOWJO (Tomy Digital Biology). ), And the expression rate of GM-CSF / CD3-positive GMR.CAR was measured.
  • GMR.CAR-T cells obtained by electrical introduction into PBMC and T cell culture / amplification operations T008, CAR-T 009, CAR-T 010, CAR-T 011, CAR-T 012, and CAR-T 014 were defined.
  • FIG. 25 shows the expression analysis results of CAR-T 001 and 008 to 011 on day -14.
  • GMR.CAR expression rates are CAR-T 001: 29.8%, CAR-T 008: 33.1%, 3.1CAR-T 09: 25.9%, CAR-T 010: 33.6%, CAR-T 011: ⁇ 16.4%, Both were higher than the expression rate (0.91%) in Mock-T cells, and GMR.CAR-expressing T cells with different spacer sites were successfully produced.
  • the prepared GMR.CAR-expressing T cells were diluted with Mock-T cells to achieve an expression rate of 25.9% (CAR-T-011 remained at 16.4%), and anti-tumor cell activity was evaluated. .
  • FIG. 26 shows the expression analysis results of CAR-T 008, CAR-T 010, CAR-T 012, and CAR-T 014 on day 14.
  • the GMR.CAR expression rates were CAR-T008: 23.6%, CAR-T010: 32.3%, CAR-T012: 4.00%, and CAR-T014: 7.18%, respectively.
  • Example 15 Evaluation of anti-tumor cell activity of CAR-T 008-011
  • MV4-11 cells American Type Culture Collection (ATCC)
  • RPMI 1640 containing 10% FBS so that MV4-11 cells [target (T)] was 5 x 10 5 cells / mL.
  • T target cells
  • Thermo Fisher Scientific prepared in medium (Thermo Fisher Scientific). They were seeded on a 48-well treatment culture plate at 500 ⁇ L / well (the number of cells in the well was 2.5 ⁇ 10 5 cells).
  • CAR-T 001 and 008 to 011 [Effector (E)] were diluted with RPMI 1640 medium containing 10% FBS so that E: T ratios were 1:25 and 1: 125. That is, when the E: T ratio was 1:25, CAR-T was prepared at 0.2 ⁇ 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells at 500 ⁇ L / well ( The number of cells in the well is 0.1 x 10 5 ). Similarly, at an E: T ratio of 1: 125, it was adjusted to 0.04 x 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells at 500 ⁇ L / well (inside the wells). The number of cells is 0.02 x 10 5 ).
  • the co-culture test was conducted for 5 days. A similar co-culture test was performed for Mock-T cells into which no gene was introduced, and a group in which only tumor cells were cultured at the same number of cells was also set as a control group (CAR-T non-added group). On the fifth day of the co-culture test, cells in each well were collected, and 5 ⁇ L of APC Anti-Human CD3 antibody (Miltenyi Biotech) and 5 ⁇ L of PE Anti-Human CD33 antibody (Miltenyi Biotech) were added to the centrifuged cells. The antibody was turbid, and the antibody labeling reaction was carried out at 4 ° C. under light shielding for 20 minutes.
  • FIG. 27 shows the results of anti-tumor cell activity% against the prepared MV4-11 cells of CAR-T 001 and 008 to 011.
  • the data showed the 3-well mean value of% anti-tumor cell activity of the same donor CAR-T.
  • CAR-T 001 and 008-011 showed strong antitumor cell activity in MV4-11 cells at an E: T ratio of 1:25, and anti-tumor cell activity at E: T ratio of 1: 125 depending on the type of spacer. The difference was recognized.
  • Example 16 Evaluation of anti-tumor cell activity of CAR-T 012 and CAR-T 014
  • MV4-11 cells American Type Culture Collection (ATCC)
  • RPMI 1640 containing 10% FBS so that MV4-11 cells [target (T)] was 5 x 10 5 cells / mL.
  • Prepared in medium Thermo Fisher Scientific). They were seeded on a 48-well treatment culture plate at 500 ⁇ L / well (the number of cells in the well was 2.5 ⁇ 10 5 cells).
  • CAR-T 012 and 014 [Effector (E)] were diluted with RPMI 1640 medium containing 10% FBS so that the E: T ratio was 1: 5, 1:25, and 1: 125. That is, when the E: T ratio was 1: 5, CAR-T was prepared to be 1 ⁇ 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells at 500 ⁇ L / well ( The number of cells in the well is 0.5 x 10 5 ). In addition, at an E: T ratio of 1:25, it was adjusted to 0.2 x 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells at 500 ⁇ L / well (cells in the well).
  • the number will be 0.1 x 10 5 ).
  • E T ratio of 1: 125, it was adjusted to 0.04 x 10 5 cells / mL and added to a 48-well treatment culture plate seeded with tumor cells at 500 ⁇ L / well (inside the wells). The number of cells is 0.02 x 10 5 ).
  • the co-culture test was conducted for 4 days. A similar co-culture test was performed on Mock-T cells into which no gene had been introduced, and a group in which only tumor cells were cultured at the same number of cells was also set as a control group (CAR-T non-added group). On the 4th day of co-culture test, collect cells from each well and centrifuge the cells with 5 ⁇ L APC Anti-Human CD3 antibody (Miltenyi Biotech) and PE Anti-Human CD33 antibody (Miltenyi Biotech) 5 ⁇ L. The suspension was added and the antibody labeling reaction was carried out for 20 minutes at 4 ° C. in the dark.
  • FIG. 28 shows the results of anti-tumor cell activity% of the prepared CAR-T 012 and 014 against MV4-11 cells together with the results of CAR-T 008 and 010.
  • CAR-T 012 and 014 showed strong antitumor cell activity in MV4-11 cells at an E: T ratio of 1: 5, compared to Mock-T cells at E: T ratios of 1:25 and 1: 125. Antitumor cell activity was observed.
  • FIG. 29 shows the tumor cell killing ability of CAR-T012, CAR-T014 and Mock-T cells against MV4-11 cells.
  • CAR-T012 and 014 were strong, and killing ability was about three times stronger than CAR-T008 or CAR-T010 into which shRNA was not introduced.
  • Example 17 Antitumor cell activity persistence evaluation
  • THP-1 or MV4-11 cells American Type Culture Collection (ATCC)
  • 10% of each tumor cell [target (T)] is 5 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • FBS-containing RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific
  • BD FACS Canto II
  • the co-culture test as Term 1 was conducted for 4 days. A similar co-culture test was performed on Mock-T cells into which no gene was introduced, and a group in which only tumor cells were cultured at the same number of cells was also set as a control group (CAR-T non-added group). On the 4th day of the co-culture test, cells in the “analysis” wells were collected, and 5 ⁇ L of APC Anti-Human CD3 antibody (Miltenyi Biotech) and PE anti-Human CD33 antibody (Miltenyi Biotech) were added to the centrifuged cells. 5 ⁇ L was added to the suspension, and the antibody labeling reaction was carried out for 20 minutes at 4 ° C. in the dark.
  • the next term 2 was advanced. Specifically, 2 wells of tumor cells previously seeded at 2.5 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ L / well were prepared, and the culture solution co-cultured as “continuation” with Term 1 was added to 500 ⁇ L / well. Wells were added in equal aliquots and further co-cultured for 4 days. This operation was repeated with a culture period of 4 days or 3 days. In addition, it was decided not to proceed to the next term for the group in which the number of tumor cells increased compared to the time when co-culture was started.
  • the present invention provides CAR-T cells that specifically bind human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) receptor to target cells that express on the cell surface and impart excellent cytotoxic activity. Is done.
  • the cells of the present invention can be used for adoptive immunotherapy for diseases such as JMML. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

Abstract

優れた標的細胞傷害性を有するキメラ抗原受容体（CAR）発現細胞の作製。　ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を提供する。

Description

遺伝子改変細胞及びその作製方法
　本発明は、養子免疫療法の分野において有用な、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞及びその作製方法に関する。
　さらに詳しく述べれば、本発明は、優れた標的細胞傷害性を有する、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体特異的キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞、該ポリヌクレオチドと共にヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞、及びこれらの作製方法及び医薬用途に関する。
　腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor : CAR）を発現させたT細胞（CAR-T）を使用した養子免疫療法は抗腫瘍効果が強力であることが報告され、近年開発が急速に進んでいる。特にCD19を標的とするCARの開発が進んでおり、臨床試験においても著効を示し、高い注目を集めている。CARは、一般的に、抗原との結合能力を保持した抗体由来の一本鎖ポリペプチドである単鎖抗体（scFv）を標的結合ドメインとして有し、細胞内シグナル伝達ドメインが連結されたタンパク質であり、代表的には免疫グロブリン重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）フラグメントのFv領域を連結した抗体ポリペプチドが標的結合ドメインとして使用されている（非特許文献１）。
　CAR-T療法は効果が高い反面、副作用も頻発することが臨床試験で明らかになっている。特に、抗原結合ドメインとして、多くの場合、マウス由来の単鎖抗体（scFv）を用いていることから、望まない免疫応答に伴う重篤なアナフィラキシーショックを生じる危険性を有している。そのため、優れた効果と安全性を両立したCARの提供が求められており、かかる観点から、従来の抗体型CARに替わる手法としてリガンド型CARの利用が提案されている（非特許文献２）。
中沢洋三、「信州医誌」、2013年、第61巻、第4号、p.197-203 Donald R. Shafferら、「Medical Sciences」、2014年、第2巻、p22-36
　リガンド型CARは、標的結合ドメインが標的細胞上に発現する受容体タンパク質に特異的に結合するリガンド、例えばサイトカイン、アフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質/ペプチドリガンド、ペプチド、及び免疫応答を促すためのワクチン等である。そのため、標的細胞表面に受容体が発現していれば、従来のCARと同様の標的細胞傷害活性を示すことが期待されている。さらに、内因性のタンパク質をリガンドとして使用することで、上述の望まない免疫応答の低減を期待することができる。
　しかしながら、リガンド型CARの開発は途上であり、臨床的に有効なものは未だ見出されていない。
　本発明者らのグループは、若年性骨髄単球性白血病（JMML）の腫瘍細胞表面にGM-CSF受容体が高発現していることに着目し、野生型GM-CSFのオープンリーディングフレームを標的結合ドメインとして用いたリガンド型CARであるGM-CSF受容体特異的キメラ抗原受容体（以下、「GMR.CAR」と記載する）が当該疾患の養子免疫療法に適用できる可能性を考え、検討を行った。その結果、GMR.CARを遺伝子導入したT細胞（以下、「GMR.CAR-T細胞」と記載する）がJMML患者由来のCD34+腫瘍細胞への細胞傷害活性を示すことを見出した。
　本発明者らは更に、GMR.CAR-T細胞が腫瘍細胞殺傷時に経時的にGM-CSFを自己分泌することを見出し、該GM-CSFの分泌上昇がGMR.CAR-T細胞の細胞傷害活性の向上を妨げる要因となり得るため、GMR.CARの治療への展開には、本課題を克服する必要があることも見出した。したがって、GMR.CAR-T細胞におけるGM-CSF遺伝子の発現を抑制し、且つ、細胞傷害活性を向上させたGMR.CARを提供することを更に検討した。
　その結果、本発明者らは、宿主細胞にGMR.CARをコードするポリヌクレオチドとGM-CSFに対するRNAi効果を誘導することのできるポリヌクレオチドを宿主細胞において同時に発現させることで、GMR.CAR-T細胞からのGM-CSFの分泌を抑制し、GMR.CAR-T細胞の標的細胞傷害活性も向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞。
［２］　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞。
［３］　GM-CSF受容体に結合するCARを細胞膜上に発現する、上記［１］又は［２］記載の細胞。
［４］　CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、上記［１］～［３］のいずれか記載の細胞。
［５］　細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、上記［１］～［４］のいずれか記載の細胞。
［６］　共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、上記［４］又は［５］記載の細胞。
［７］　細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、上記［４］～［６］のいずれか記載の細胞。
［８］　標的結合ドメインが配列番号２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、上記［１］～［７］のいずれか記載の細胞。
［９］　RNAiを誘導するポリヌクレオチドがsiRNA又はshRNAである、上記［２］～［８］のいずれか記載の細胞。
［１０］　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法。
［１１］　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同一又は異なるベクターを用いてそれぞれ細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法。
［１２］　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
［１３］　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクター。
［１４］　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターとを含む、CARタンパク質発現細胞の作製のためのキット。
［１５］　上記［１］～［９］のいずれか記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
［１６］　上記［１５］記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-182293号の開示内容を包含する。
　本発明のGMR.CAR-T細胞は、若年性骨髄単球性白血病（JMML）及び急性骨髄性白血病（AML）を始めとするGM-CSF受容体を細胞表面に発現している種々の細胞を標的とした養子免疫療法への効果が期待される。また、本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチド及びGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同時に発現させた遺伝子改変細胞は、遺伝子改変細胞からの経時的なGM-CSFの分泌を抑制し、且つ、標的細胞に対し、優れた細胞傷害活性を示す。
CD19.CARのベクターマップの例を示す。 本発明のGMR.CARのベクターマップの例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチドを含む合成配列（配列番号１９）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（配列番号２２）を含む合成配列（配列番号２９）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（配列番号２５）を含む合成配列（配列番号３０）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（配列番号２８）を含む合成配列（配列番号３１）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（SNC1-C（タカラバイオ株式会社））を含む合成配列（配列番号３２）の構成例を示す。 本発明のGMR.CAR+shRNAのベクターマップの例を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドとRNAiを誘導するポリヌクレオチドとを導入したHEK293T細胞におけるGMR.CAR発現率％を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）のday 14におけるGMR.CAR発現率％を示す。 GMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）のTHP-1、Kasumi-1又はK562細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 GMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）とTHP-1又はKasumi-1との共培養上清中のGM-CSF分泌量の経時的変化を示す。 GM-CSF（0、5、又は10 ng/ml）共存下におけるGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）のTHP-1（Ａ）又はKasumi-1細胞（Ｂ）に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）、及びGMR.CARをコードするポリヌクレオチドとRNAiを誘導するポリヌクレオチドとを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 004～007）のday 14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004～CAR-T 007及びポリヌクレオチドを導入していないMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004～CAR-T 007及びMock-T細胞のKasumi-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004～CAR-T 007及びMock-T細胞のshinAML-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004～CAR-T 007及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004～CAR-T 007及びMock-T細胞のいずれかと、THP-1（Ａ）又はKasumi-1細胞（Ｂ）との共培養上清におけるGM-CSF濃度の経時的変化を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004～CAR-T 007及びMock-T細胞のいずれかと、shinAML-1（Ａ）又はMV4-11細胞（Ｂ）との共培養上清におけるGM-CSF濃度の経時的変化を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（CH2CH3欠失体、GMR.CARｄCH2CH3）のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（CH2欠失体、GMR.CARdCH2）のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（CH2CH3欠失-(G4S)3挿入体、GMR.CARdCH2CH3＋(G4S)3）のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（ヒンジCH2欠失体、GMR.CARdhingeCH2）のベクターマップの例を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001、CAR-T 008～011）のday 14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 008、CAR-T 010、CAR-T 012及びCAR-T 014）のday 14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T001及びCAR-T 008～CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 CAR-T 012、CAR-T 014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 CAR-T 012、CAR-T 014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008～CAR-T 011及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008～CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008～CAR-T 011及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008～CAR-T 011及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008～CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008～CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。
　本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。
　本明細書において「キメラ抗原受容体（CAR）」とは、標的特異性をT細胞（例えば、ナイーブT細胞、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、又はそれらの組み合わせ等のT細胞）等の細胞に移植することができる改変受容体を指す。CARはまた、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られる。
　本明細書において「ドメイン」とは、ポリペプチド内の領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる領域を示す。
　「RNAi」（RNA interference；RNA干渉）とは、一般的に、標的遺伝子のmRNAと相同である配列を持つ鎖とこれと相補的な配列を持つ鎖で構成される二本鎖RNA（dsRNA）を細胞等に導入して、標的遺伝子mRNAの分解を誘導することで標的遺伝子の発現を抑制するメカニズムを意味する。RNAiは、配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。哺乳動物細胞に対するRNAiでは、標的mRNAの配列に対応する配列の短い二本鎖RNA（siRNA）が使用される。
　本明細書において「RNAiを誘導するポリヌクレオチド」とは、それを細胞に導入すると細胞内のプロセシングによって所望のsiRNA（標的遺伝子に対するRNAiを引き起こすsiRNA）が生ずるポリヌクレオチドをいい、例えば、shRNA（short hairpin RNA）を用いることができる。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAがループ構造部を介して連結された構造（ヘアピン構造）を有し、細胞内でループ構造部が切断されて二本鎖siRNAとなり、RNAi効果をもたらす。あるいは、本明細書において、「RNAiを誘導するポリヌクレオチド」として、アンチセンスRNA、リボザイムも含めることができる。
　本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、天然又は合成のDNA及びRNA、例えばゲノムDNA、cDNA（相補DNA）、mRNA（メッセンジャーRNA）、rRNA（リボソームRNA）、shRNA（小ヘアピンRNA）、snRNA（核内低分子RNA）、snoRNA（核小体低分子RNA）、miRNA（マイクロRNA）、及び／又はtRNAが含まれるが、これらに限定されない。
　本明細書において「翻訳領域」とは、mRNAの領域のうち、タンパク質に翻訳される領域（コーディング領域）のことをいい、「非翻訳領域」とは、コーディング領域の両側に位置し、タンパク質に翻訳されない領域を意味する。非翻訳領域としては、5'末端側の5'-非翻訳領域（5'-UTR）、及び3'末端側の3'-非翻訳領域（3'-UTR）が存在する。より具体的には、配列番号１にヒトGM-CSFの5'及び3'-非翻訳領域及び翻訳領域のヌクレオチド配列を含む配列を開示するが、この配列中、1～32番目のポリヌクレオチドが5'-UTR、33～467番目のポリヌクレオチドが翻訳領域、468から800番目のポリヌクレオチドが3'-UTRに相当する。
　本明細書において「コードする」とは、当分野において通常使用されているように、所定のヌクレオチド配列が所定のタンパク質又は（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列情報を暗号化していることをいい、本明細書において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を「コードする」との文脈において使用する。
　上記の通り、本発明は、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を提供する。
　本発明のCARタンパク質はヒトGM-CSF受容体に特異的に結合する「標的結合ドメイン」を含む。標的（GM-CSF受容体）結合ドメインは、GM-CSF受容体に特異的な結合性を示し、GM-CSF受容体を細胞表面上に発現している標的細胞に対し、特異的な免疫応答を可能にする。
　したがって、GM-CSF受容体結合ドメインとして、GM-CSF受容体に結合するサイトカインであるGM-CSFのアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いることができる。好ましい態様として、GM-CSF受容体結合ドメインとして、ヒトGM-CSFのオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列を含むGM-CSFタンパク質を使用することができる。あるいは、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトGM-CSF受容体に対する結合能を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドも同様に使用することができる。更に、GM-CSF受容体に対する結合能を保持している限り、これらのポリペプチドの断片、すなわち結合性断片を使用しても良い。
　ここで、「ヒトGM-CSF受容体に対する結合能」を有するとは、ヒトGM-CSF受容体に対する結合定数が例えば1 － 1000 nM以下であることを意図する。この結合能は、抗原と抗体との結合能と比較して相対的に弱い結合であって良い。
　本明細書のCARタンパク質は、場合によって「細胞外スペーサードメイン」を含むことができる。細胞外スペーサードメインは、CARと抗原の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが望ましい。例えば、抗体のFcフラグメント、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工スペーサー配列、又はそれらの組み合わせを用いることができる。
　本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインとして、（i）IgG4のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（ii）IgG4のヒンジ領域、(iii)IgG4のヒンジ及びCH2、(iv)CD8aのヒンジ領域、（v）IgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（vi）IgG1のヒンジ領域、もしくは(vii)IgG1のヒンジ及びCH2、又はそれらの組み合わせを使用することができる。例えば、IgG1のヒンジ領域として、配列番号５に示すヌクレオチド配列によってコードされる以下のアミノ酸配列（配列番号６）を有するものを好適に使用することができるが、これに限定されるものではない。
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　また、IgG1のCH2領域として、配列番号７に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）を有するもの、CH3領域として、配列番号９に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）を有するものをそれぞれ好適に使用することができるが、これらに限定されるものではない。
　好ましい態様として、細胞外スペーサードメインはヒトIgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域又はその一部を使用することができる。
　また、好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、（i）ヒトIgG1のヒンジ領域単独（配列番号６）、（ii）ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号６）及びCH3領域（配列番号１０）の組み合わせ、（iii）CH3領域単独（配列番号１０）、で使用することができる。
　本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインに用いる人工スペーサー配列として、式(G4S)nで表されるスペーサー配列を使用することができる。式中、ｎは、１～１０であり、好ましくはｎ＝３である。例えば、配列番号４２を有するものを好適に使用することができる。このようなスペーサー配列を有するスペーサーは、ペプチドリンカーと呼ばれることもある。当分野において好適に使用されるペプチドリンカーを、本発明において適宜使用することができる。この場合、ペプチドリンカーの構成及び鎖長は、得られるCARタンパク質の機能を損なわない範囲で適切なものを選択することができる。
　更に好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号６）及び(G4S)3のスペーサー配列（配列番号４２）の組み合わせを使用することができる。
　細胞外スペーサードメインは、上記に例示したものから適宜選択して、又は当分野における技術常識に基づいて更に改変して、本発明のために使用することができる。
　細胞外スペーサードメインは、標的結合ドメインと、膜貫通ドメインとの間に存在し得るように、それぞれのドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列を連結してベクターに挿入し、宿主細胞において発現させることができる。あるいはまた、細胞外スペーサードメインは、予め作製したプラスミドCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として改変することもできる。
　細胞外スペーサードメインの改変は、例えば、CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞の宿主細胞におけるCAR遺伝子発現率の向上、シグナル伝達、細胞の老化、腫瘍への分布、抗原認識又はin vivo活性への影響を考慮した場合に有用である。
　本発明のCARタンパク質は、細胞膜上に存在し、標的結合ドメイン及び任意に細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン及び任意に共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。当分野において周知であるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインがいずれも親水性ドメインであるのに対して、細胞膜を構成する脂質二重層に対する親和性を有するドメインである。本発明のGMR.CARにおける膜貫通ドメインは、CARタンパク質が細胞膜上に存在でき、標的結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの機能を損なわない限り、特に限定するものではないが、後述する共刺激ドメインと同じタンパク質由来のポリペプチドが膜貫通ドメインとしての機能を果たす場合もあり得る。
　本発明の一態様として、膜貫通ドメインは、例えば、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。
　好ましい態様として、膜貫通ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（153‐179））を使用することができる。具体的には、配列番号１１に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (679-759)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を有するものを膜貫通ドメインとして好適に使用することができる。
　本発明のCARタンパク質は、場合によって「共刺激ドメイン」を含むことができる。共刺激ドメインは共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これらに限定されないが、CAR-T細胞の増殖、サイトカイン産生、機能分化、標的細胞の細胞死のような、細胞による共刺激応答が媒介される。
　本発明の一態様として、共刺激ドメインは、例えば、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD134 (OX40)、Dap10、CD2、CD5、CD30、CD40、PD-1、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、TNFR-1、TNFR-II、Fas、Lckを用いることができる。
　好ましい態様として、共刺激ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（180‐220））又は4-1BB（GenBank：U03397.1）等を使用することができる。具体的には、配列番号１３に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (760-882)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１４）を有するものを共刺激ドメインとして好適に使用することができる。
　本発明のCARタンパク質は「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。
　本発明の一態様として、細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ヒトCD3ζ鎖、FcγRIII、FcεRI、Fc受容体の細胞質末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を有する細胞質受容体又はそれらの組み合わせを用いることができる。
　好ましい態様として、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζ鎖（例えばNCBI Accession No. NM＿000734.3のヌクレオチド299-637）を使用することができる。具体的には配列番号１５に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１６）を有するものを細胞内シグナル伝達ドメインとして好適に使用することができる。
　目的とするポリヌクレオチドは常法に従い、容易に作製することができる。各ドメインのアミノ酸配列を示すNCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、これらの塩基配列をもとに、核酸を合成することができ、また、cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
　従って、本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチドは、上記のそれぞれのドメインをコードするポリヌクレオチドを連結して作製することができ、このポリヌクレオチドを適切な細胞に導入することによってGMR.CAR-T細胞を作製することができる。また、GMR.CARは、標的結合ドメイン以外の構成成分が同一である既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、常法に従い、標的結合ドメインを組み替えることによっても作製することができる。
　更に、目的に応じて、既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、1以上のドメイン、例えば細胞外スペーサードメインを、inverse-PCR（iPCR）法等を使用して、改変することができる。細胞外スペーサードメインの改変技術については、例えばOncoimmunology, 2016, Vol.5, No.12, e1253656等に記載されている。
　本発明はまた、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を提供する。
　本発明におけるヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、GM-CSF遺伝子の発現過程（転写、転写後調節、翻訳、翻訳後調節を含む）を抑制する核酸分子である。本発明における「発現の抑制」は一過的抑制及び恒常的抑制のいずれでもよい。
　標的特異的なRNAiを生じさせるためには、標的遺伝子のmRNA配列の一部と相補性を有するセンス鎖及びこれに相補的なアンチセンス鎖からなるsiRNAを細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させればよい。本発明の実施態様の一つとしては、RNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、siRNA又はshRNAを用いることができる。siRNAは、短鎖二本鎖RNA分子であり、通常、15～30塩基対である。shRNAは、生体内でダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生成することができるヘアピン型RNAである。siRNA及びshRNAは、例えばリポフェクタミン等のトランスフェクション試薬と共に、in vitro又はin vivoで細胞内に導入することができる。あるいはまた、siRNA及びshRNAは、細胞内でこれらを生成することができるようにDNAの形態でベクターに組み込んで細胞内に導入することができる。
　GM-CSF遺伝子を標的とするsiRNAは、通常、当該遺伝子のmRNAの配列における連続する領域と相同な配列からなるセンス鎖とその相補配列からなるアンチセンス鎖がハイブリダイズした二本鎖RNAである。ここでの「連続する領域」の長さは通常15～30塩基である。「連続する領域」は、GM-CSF遺伝子の翻訳領域、非翻訳領域、及び翻訳領域と非翻訳領域との境界を含んでいても良い。特に限定するものではないが、本発明において好適に使用できるsiRNA及びshRNAは、ヒトGM-CSF遺伝子のmRNAの非翻訳領域に対するものである。
　当業者であれば、siRNA及びshRNAの設計及び調製は、標的配列の情報等に基づいて容易に得ることができる。siRNAの設計には通常、標的配列に固有の配列（連続配列）が利用される。適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。あるいはまた、特定の標的タンパク質の発現を抑制又は阻害するsiRNA及びshRNAは、例えばタカラバイオ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック、キアゲン等の供給業者から市販品を入手することもできる。
　従って、特に限定するものではないが、例えば本発明者等が実施例において使用したヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、配列番号２０及び２１、２３及び２４、２６及び２７に示す配列を有するsiRNA、並びに配列番号２２、２５、２８に示すヌクレオチド配列を有するshRNA等を挙げることができる。
　RNAiを誘導するポリヌクレオチドのさらなる態様としては、所望のsiRNAを発現し得るベクターである。このようなベクターとしては、後のプロセスによってsiRNAに変換されるshRNAを発現するベクター（ステムループタイプ又はショートヘアピンタイプと呼ばれる）、センスRNAとアンチセンスRNAを別々に発現するベクター（タンデムタイプと呼ばれる）が挙げられる。これらのベクターは当業者であれば常法に従い作製することができる。
　宿主細胞におけるGM-CSFの恒常的抑制の実現という観点からは、RNAiを誘導するポリヌクレオチドとしてはshRNAを細胞内で発現するベクターを用いることが好ましい。
　本発明のRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、また、宿主細胞においてヒトGM-CSFを標的結合ドメインとして有するGMR.CARと同時に発現される。したがって、本発明のRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、宿主細胞においてGMR.CARの発現には影響を与えず、且つ、宿主細胞におけるGM-CSFの発現を抑制することが望ましい。
　前記特徴に鑑みて、本発明の実施態様の一つとしては、GM-CSFの非翻訳領域のmRNAの配列における任意の連続する15個乃至30個の領域と相補性を有する15個乃至30個の塩基配列をセンス鎖として有し、アンチセンス鎖としてセンス鎖と相補的な塩基配列を含む15個乃至30個の塩基配列をsiRNAとして使用することができる。GM-CSFの非翻訳領域としては、5'-末端側の非翻訳領域及び3'-末端側の非翻訳領域が存在するが、いずれの領域を使用してもよい。具体的には、5'-末端側の非翻訳領域としては、配列番号１で示されるヒトGM-CSFの全長ヌクレオチド配列の1から32番目の配列のうち任意の連続する15個乃至30個の領域を選ぶことができる。また、3'-末端側の非翻訳領域としては、配列番号１で示されるヒトGM-CSFの全長ヌクレオチド配列の468から800番目の配列のうち任意の連続する15個乃至30個の領域を選ぶことができる。より好ましくは、5'-末端側の非翻訳領域を用いることができる。
　本発明のさらなる実施態様の一つとしては、RNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、例えば配列番号２０及び２１で示される配列を有するsiRNAを用いることができる。
　本発明のさらなる実施態様としては、配列番号２２で示される配列を有するshRNAを使用することができる。
　本発明において、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとは、ヒト細胞における発現に適するプロモータの制御下で同一ベクター中に存在し得るが、別々のベクター中に存在していても良い。適切なプロモータは、構成プロモータ（constitutive promoter）及び誘導プロモータ（inducible promoter）の両方でありうる。好ましいプロモータは、CMV及びSV-40に由来する。別々のベクターによってポリヌクレオチドが導入される場合、これらのベクターは、同時に、又は連続して宿主細胞へトランスフェクトされ得る。
　本発明の一実施形態としては、
　配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　尚、前記、「配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む」とは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号４２のアミノ酸配列のうち、任意の1又は２以上の組み合わせのいずれかを含むことを意味する。以下、本明細書において同様である。
　本発明の一実施形態としては、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii) 配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii) ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの5'-側非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii) 配列番号２２又は配列番号２５のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ii）ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ii）配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii) 配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ii）ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの5'側非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii) ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの5’側非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ii）配列番号２２又は配列番号２５のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　本発明の一実施形態としては、
　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
　(ii) 配列番号２２又は配列番号２５のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
　上記のポリヌクレオチドが導入される細胞としては、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来のT細胞又はT細胞を含む細胞集団が使用できる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官により採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞（PBMC）、免疫細胞[樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、NK細胞又は血球系細胞（好中球、好塩基球）]、臍帯血単核球、繊維芽細胞、前駆脂肪細胞、幹細胞、皮膚角化細胞、間葉系細胞、脂肪肝細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。
　本発明の好ましい実施態様の一つとしては、例えば、細胞傷害性タンパク質（パーフォリン、グランザイム等）を放出する細胞を用いることができる。具体的には、例えばT細胞、T細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）、NK細胞、NK-T細胞又はこれらを含有する細胞集団を使用することができる。さらに、これらの細胞に分化し得る細胞としてES細胞、iPS細胞等の各種幹細胞が含まれる。T細胞には、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、制御性T細胞、細胞傷害性T細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。T細胞及びT細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、PBMCが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたCARを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植する場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが望ましい。
　遺伝子改変細胞を作製するためのポリヌクレオチドの導入方法は、通常使用されているものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。ベクターを用いて導入する場合、使用され得るベクターとしては、特に限定するものではないが、例えばレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。また、非ウイルス性の態様として、プラスミドトランスポゾンを使用することができ、sleeping beautyトランスポゾンシステム（例えばHuang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9；Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71；Deniger DC, Yu J, et al. PLoS One. 2015; 10: e0128151；Singh H, Moyes JS, et al. Cancer Gene Ther. 2015; 22: 95-100；Hou X, Du Y, et al. Cancer Biol Ther. 2015; 16: 8-16；Singh H, Huls H, et al. Immunol Rev. 2014; 257: 181-90；及びMaiti SN, Huls H, et al. J Immunother. 2013; 36: 112-23に記載）又はpiggybacトランスポゾンシステム（Nakazawa Y, Huye LE, et al. J Immunother. 2009; 32: 826-36；Galvan DL, Nakazawa Y, et al. J Immunother. 2009; 32: 837-44；Nakazawa Y, Huye LE, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2133-43；Huye LE, Nakazawa Y, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2239-48；Saha S, Nakazawa Y, et al. J Vis Exp. 2012; (69): e4235；Nakazawa Y, Saha S, et al. J Immunother. 2013; 36: 3-10；及びSaito S, Nakazawa Y, et al. Cytotherapy. 2014; 16: 1257-69に記載）が好適に使用できる。
　本発明の好ましい態様の一つとしては、非ウイルス性の態様、特にpiggybacトランスポゾンシステムを使用することができる。具体例は実施例に示す。
　本発明はまた、上記の通り、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法を提供する。
　本発明はまた、上記の通り、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同一又は異なるベクターを用いてそれぞれ細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法を提供する。
　本発明の好ましい実施態様の一つとしては、宿主細胞におけるGMR.CARをコードするポリヌクレオチドとRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、宿主細胞において該二つのポリヌクレオチドが同時に発現する割合を高めるために、同一のベクターに組み込まれていることが望ましい。即ち、RNAiを誘導するポリヌクレオチドによって、宿主細胞においてGM-CSFの発現が抑制されている細胞にGMR.CARが発現することが望ましい。例えば、配列番号１の33～467番目のポリヌクレオチドと、配列番号２９～３１で示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとを用いて、遺伝子改変細胞を作製することができる。
　本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチド、及び場合によってRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターは、特に限定するものではないが、例えば大腸菌等の適切な宿主細胞において作製・維持することができる。
　また、本発明の遺伝子改変細胞の作製及び培養は、本願明細書の記載並びに当分野における技術常識に基づいて、T細胞又はT細胞若しくはT細胞の前駆細胞を含む細胞集団の培養に適した培地及び培養条件に従って行うことができる。培養に際しては、適切なサイトカイン、例えばIL-15、IL-7等を添加することができる。
　更に、実施例にも記載するように、本発明の遺伝子改変細胞の培養において、例えば国際公開WO 2017/061615号に開示されるような、抗体で刺激した活性化T細胞、又は抗体刺激後にウイルスペプチド抗原で処理したウイルスペプチド添加活性化T細胞をフィーダー細胞として添加することもできる。しかしながら、本願発明の遺伝子改変細胞の培養方法は、特に限定されるものではない。
　本発明の細胞は、GM-CSF受容体を表面に発現している標的細胞に対して、受容体特異的免疫応答を引き起こすことによって、細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。CARを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やCARの細胞内ドメインによって異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。細胞傷害性タンパク質の放出（パーフォリン、グランザイムなど）は、受容体を発現している細胞の破壊をもたらす。
　本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
　本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターとを含む、CARタンパク質発現細胞の作製のためのキットを提供する。
　本発明のベクター及びキットは、上記の本発明の遺伝子改変細胞を作製するために好適に使用することができる。
　本発明のGMR.CARを発現する細胞は、疾患の治療剤として使用することができる。従って、本発明は、上記の本発明の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤を提供する。該治療剤は、CARタンパク質を発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいても良い。本発明の治療剤による治療が期待される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であれば良く、限定されないが、例えば、GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する細胞が関連する疾患、例えば血液がん（白血病）が挙げられ、具体的には、例えば若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）が挙げられる。さらには、固形がんが挙げられ、具体的には、例えば、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がん等が挙げられる。
　固形がんに上記治療剤が適用される場合、GM-CSF受容体が標的細胞の微小環境を形成している細胞、例えば骨髄由来免疫抑制細胞（MDSCs）等に発現している疾患が含まれる。該疾患にあっては、標的細胞にGM-CSF受容体が発現していない場合であっても、例えば、腫瘍細胞傷害活性を高める目的で、他の治療剤と併用して用いることができる。
　ここで、「GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する」とは、発現強度が高い（例えば、フローサイトメトリーにおける平均蛍光強度（MFI）が高い）ことを意図する場合と、発現率（陽性率）が高いことを意図する場合があり得る。発現率が高い細胞を意図する場合、例えば、CD33/CD116発現率（陽性率）が少なくとも40％以上である細胞を意味する。好適には該発現率が80％以上の細胞を意味する。
　本発明の治療剤の一態様は、GM-CSF受容体を発現する腫瘍細胞に対する抗癌剤である。本発明の治療剤又は抗癌剤は、単独で使用することもできるが、異なるメカニズムの薬剤及び／又は治療と組み合わせて使用することができる。
　従って、本発明の治療剤は、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。本発明の治療剤又は医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば白血病の治療の場合には、静脈内投与とすることが好ましい。医薬組成物には、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。本発明の治療剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば、104～1010 CAR陽性細胞数/kg体重の範囲で１日１回～数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
［実施例１　GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）の作製］
　ヒトGM-CSF（NCBI Accession No.: NM_000758の翻訳領域（配列番号１、33～464塩基：終止コドン前）の両端にEcoRIとBclIサイトをつけたPCR産物をpTA2クローニングベクター（TOYOBO）にサブクローニングした。ヒトGM-CSF配列をサブクローニングしたpTA2クローニングベクターをEcoRIとBclIダブルダイジェストしヒトGM-CSF配列を切り出した。一方、pSL1190ベクター（Amersham社）をEcoRIとBamHIでダブルダイジェストした後、前述の切り出したヒトGM-CSF配列をcompatible siteを使用してpSL1190ベクターにライゲーションした（pSL1190-GMR.CAR）。pSL1190-GMR.CARをNotIとEcoRIでダブルダイジェストし、GMR.CAR配列部分を切り出した。
　一方、pIRES2-eGFP (Clontech)をトランスポゾンプラスミドとするため、5’側逆向き反復配列と3’側逆向き反復配列を挿入し、トランスポゾンプラスミドであるpIR-eGFPベクターとした。さらにpIR-eGFPベクターからピューロマイシン耐性遺伝子を除去し、pIRII-eGFPベクターとした。ベイラー医科大学において作製されたSFG-CD19 CAR retroviral vectorをEcoRIとNotIでダブルダイジェストし、anti-CD19 scFv (FMC63; Zola H. et al. Immunol Cell Biol. 1991 Dec;69 (Pt 6):411-22)-CD28-CD3ζの断片を得た。pIRII-eGFPベクターもEcoRIとNotIでダブルダイジェストし、anti-CD19 scFv (FMC63)-CD28-CD3ζとライゲーションし，pIRII-CD19.CARを作製した。得られたpIRII-CD19.CAR（Mol Ther. 2011; 19: 2239-48及びCytotherapy. 2014; 16: 1257-69）をNotIとEcoRIでダブルダイジェストした後に、切り出したGMR.CAR配列をライゲーションして、GMR.CAR発現プラスミドを取得した（CAR 001）。
　図１にCAR 001作製のもととなったpIRII-CD19.CARのベクターマップ、図２に作製されたCAR 001のベクターマップをそれぞれ示す。
［実施例２　siRNAのデザイン及びshRNAの合成］
　ヒトGM-CSF（NCBI Accession No.: NM_000758.3、配列番号１）の配列をもとに，タカラバイオ株式会社に委託し，１対の翻訳領域内のmRNAに特異的なsiRNAをデザインした（配列番号１７及び１８）。
　一方、ヒトGM-CSFの5'-非翻訳領域（5'-UTR）又は3'-非翻訳領域（3'-UTR）のmRNA配列に特異的なsiRNAをBLOCK-iT（商標登録）RNAi Designer（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用してデザインし、任意の3対のsiRNAを選択した（配列番号２０及び２１、２３及び２４、２６及び２７）。
　ヒトU6プロモーター配列直後に、上記のsiRNAセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれヘアピンループで繋ぎ合わせたDNA配列を人工合成した（タカラバイオ株式会社又はユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。人工合成遺伝子の5’側に制限酵素MunI（MfeI）によって切断される配列と3’側に制限酵素ClaIによって切断される配列を付加した。合成された配列を配列番号１９及び２９～３１に示した(図３～６）。陰性対照配列として、同様にMunI（MfeI）及びClaIの切断配列を付加したSNC1-C（タカラバイオ株式会社）を用いた（図７、配列番号３２）。
［実施例３　GMR.CAR+siRNAのコンストラクト作製］
　実施例２で人工合成したDNA（配列番号２９～３１）及びMunI（MfeI）及びClaIの切断配列を付加したSNC1-C（タカラバイオ株式会社、配列番号３２）をpTAKN-2ベクター（株式会社バイオダイナミクス研究所）又はpBAsiベクター（タカラバイオ株式会社）に組み込み、得られたベクターを100 ng/μLとなるよう溶解し、その1μL（100 ng相当）を用いて大腸菌HST04株（タカラバイオ株式会社）を形質転換した後、50μg/mLカナマイシン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。別に実施例１で作製したGMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）でも同様にHST04株を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。
　出現したコロニーをさらに50μg/mLカナマイシン又はアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製した。精製したプラスミド（0.5～1μg相当）を制限酵素MfeI及びClaI（New England Biolabs）により約3時間消化した。酵素処理済み反応液を1％アガロースゲル電気泳動にて分離し、pTAKN-2ベクターから切り出されたインサート断片とCAR 001の酵素処理済み断片をゲルから切り出し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（登録商標、マッハライ・ナーゲル、タカラバイオ株式会社）を用いて精製した。精製したインサート断片とベクター断片をDNA Ligation Kit<Mighty Mix>（タカラバイオ株式会社）を用いて連結した。連結された環状ベクターにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）、TOP10（サーモフィッシャーサイエンティフィック）又はHST04株を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。
　出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製した。精製したプラスミド（0.5～1μg相当）を制限酵素BamHI（New England Biolabs）により約3時間消化し、インサート断片の挿入を1％アガロースゲル電気泳動で確認し、挿入が確認されたサンプルにつき塩基配列確認を行い、塩基配列が配列番号２９～３２と完全一致したサンプルをGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド［それぞれCAR 004 (GMR.CAR+5'-UTR_1)、CAR 005 (GMR.CAR+5'-UTR_6)、CAR 006 (GMR.CAR+3'-UTR_500)又はCAR 007 (GMR.CAR+ SNC1-C)］（図８）とした。
　以下の検討にはGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド又は変異体GMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミドを含む大腸菌を培養し、Endofree Plasmid Maxi Kit（キアゲン）を用いて精製したプラスミド溶液を使用した。
［比較例１　GM-CSF変異体GMR.CAR発現プラスミド］
　翻訳領域のsiRNAはGMR.CARの標的結合ドメインであるGM-CSFの発現にも影響する可能性があるため、GM-CSF mRNA配列（NCBI Accession No.: NM_000758.3(配列番号１)の159-179塩基に相当）部分にアミノ酸置換の起こらないような変異を導入した（配列番号３及び４）。具体的には、配列番号１の塩基配列中159～179番目の塩基配列を、配列番号３の塩基配列中127～147番目の塩基配列に変異させた。この変異体はsiRNAが結合するmRNA配列部分の塩基に変異を導入した人工合成遺伝子とCAR 001の野生型GM-CSF配列を入れ替えることで作製した。すなわち、5’側に制限酵素XhoIで切断される配列と3’側に制限酵素DraIIIによって切断される配列を付加したXhoI - 分泌シグナル配列 - GM-CSF変異体 - ヒンジ配列 - DraIIIの断片を人工合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。この断片とCAR 001をXhoIとDraIIIで処理した断片とを結合させ、GM-CSF変異体GMR.CAR発現プラスミドを作製した。
［比較例２　GM-CSF変異体GMR.CAR+siRNAのコンストラクト作製］
　実施例２で人工合成したDNA（配列番号１９）及びMunI（MfeI）及びClaIの切断配列を付加したSNC1-C（タカラバイオ株式会社、配列番号３２）をそれぞれpBAsiベクター（タカラバイオ株式会社）に組み込み、実施例３と同様にして大腸菌HST04株（タカラバイオ株式会社）を形質転換した後、50μg/mLカナマイシン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。別に比較例１で作製したGM-CSF変異体GMR.CAR発現プラスミド（CAR 002）でも同様にHST04株を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。
　出現したコロニーをさらに50μg/mLカナマイシン又はアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養し、実施例３と同様の操作によって、塩基配列が配列番号１９及び３２と完全一致したサンプルをGM-CSF変異体GMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド［それぞれCAR 002 (変異体GMR.CAR+shRNA)、CAR 003 (変異体GMR.CAR+ SNC1-C)］とした。
［実施例４　GM-CSF変異体GMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド（CAR 002及びCAR 003）又はGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド（CAR 004～CAR 007）の発現確認］
　継代維持したHEK293T細胞（ヒト胎児腎細胞HEK293細胞にSV40 Large T 抗原を発現する派生株、理化学研究所）を10% FBS含有のD-MEM（和光純薬工業株式会社）を用いて希釈し、4 x 105個/well、500μLで24ウェルトリートメント培養プレートに播種し、一晩培養した。一晩培養した細胞に、50μL Opti-MEM（サーモフィッシャーサイエンティフィック）中に0.8μgのCAR 001～007を含有するプラスミド希釈液と50μL Opti-MEM中に2μLのリポフェクタミン2000試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を等量ずつ混和した溶液を20分間室温に放置し、播種した細胞に100μL/wellを加えた。そのまま約48時間CO2インキュベータ内で培養した。コントロールとして、Opti-MEMを100μL添加した群と、プラスミドを含まないリポフェクタミン試薬のみを添加した群を設定した。
　48時間後に各細胞を回収し遠心分離後、PE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（BD Pharmingen）2.5μL及びAPC Anti-Human CD116抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCalibur（BD）を用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。
　図９にCAR 001～007をHEK293T細胞に遺伝子導入してから48時間後のGM-CSF陽性のGMR.CAR発現率％の結果を示した。その結果、GM-CSF遺伝子の翻訳領域に対するRNAiを誘導し得るCAR 002を導入した場合のGMR.CARの発現率が他と比較して最も低かった。一方、陰性対照shRNA挿入体（CAR 003及びCAR 007）、非翻訳領域shRNA挿入体（CAR 004～006）の導入によるGMR.CARの発現率はほとんど低下しなかった。CAR 002はGM-CSF mRNAの翻訳領域内に特異的なshRNAが挿入され、かつGM-CSF遺伝子配列中のsiRNA認識部分に塩基変異を導入した変異体であるが、塩基変異を導入してもsiRNAがある程度のノックダウン効果を示し、GMR.CARの発現自体を抑制している可能性が考えられた。
［実施例５　GMR.CAR-T細胞の培養・増幅１］
＜Day 0: ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の分離とGMR.CAR発現ベクターの電気的導入＞
　健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUS（GEヘルスケア）に希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）のPBMCへの導入は10 x 106 個の細胞を用いた。具体的には、それぞれCAR 001 5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100 μLを混和し、10 x 106個のPBMCを懸濁した。懸濁した細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量を予め加温しておいた10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium（ミルテニーバイオテック）2 mL/wellで24ウェルトリートメント培養プレートにて培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。
＜Day 1-4: 遺伝子導入細胞の非特異的抗体刺激＞
　抗CD3抗体及び抗CD28抗体（ミルテニーバイオテック）を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、day 0の培養液全量を抗体コーティングプレートに移し、T細胞の非特異的抗体刺激をday 4まで行った。
＜Day 4: T細胞の増幅＞
　Day 1から非特異的抗体刺激を施したT細胞を24ウェルトリートメント培養プレートに戻し、引き続き培養して増幅を行った。
＜Day 7: CAR-T細胞の増幅＞
　細胞懸濁液全量を10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mLを充填したG-Rex 10（Wilson Wolf）に移し、Day 14までCAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR細胞の発現率を以下の方法にて測定した。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜Day 14: GMR.CAR発現率の評価＞
　細胞数をカウントし、1～2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1～2 x 105個の細胞を採取し、FITC Goat Anti-Human IgG (H+L) 抗体（Jackson ImmunoResearch Inc）2μL又はPE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（BD Pharmingen）2.5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCalibur（BD）を用いて解析し、IgG1/CD3陽性又はGM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をCAR-T 001と定義した。
　図１０に健康成人3ドナーから作製されたCAR-T 001のday 14における発現解析結果を示す。CAR-T 001のGMR.CAR発現率はそれぞれ、ドナー 1: 10.12％ (IgG/CD3陽性率)、ドナー 2: 15.38％及びドナー 3: 10.98％ (それぞれGM-CSF/CD3陽性率) であり、それぞれのドナーに対応するMock-T細胞における発現率（ドナー 1: 0.87％、 ドナー 2: 4.62％及びドナー 3: 4.37％）に比較していずれも高く、GMR.CAR発現T細胞（CAR-T 001）の作製に成功した。
［実施例６　CAR-T 001の抗腫瘍細胞活性とGM-CSF分泌量の評価］
＜抗腫瘍細胞活性評価：＞
　CAR-T 001の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1、Kasumi-1又はK562細胞（American Type Culture Collection(ATCC)）を使用し、それぞれの腫瘍細胞［ターゲット（Ｔ）］を10 x 105個/mLとなるように10％ FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は5 x 105個となる）。CAR-T 001［エフェクター（Ｅ）］は、Ｅ：Ｔ比1 : 5～1 : 50となるように10％ FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E : T比＝１：５の場合、CAR-T 001は2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は1 x 105個）。同様に、E : T比＝１：５０の場合は、0.2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.1 x 105個となる）。
　共培養試験は5日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、トリパンブルーによる染色下、生細胞数をカウントした。遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33の陽性率を測定し、以下の計算式によりCAR-T 001又はMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を算出した。
＜抗腫瘍細胞活性の算出＞
計算式：
・CD33陽性細胞数＝（トリパンブルー染色下生細胞数 ｘ FACSにおけるCD33陽性率％）／１００
・抗腫瘍細胞活性％＝１００－（CAR-T添加群のCD33陽性細胞数）／（CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数）ｘ１００
　図１１に健康成人3ドナー由来の細胞を用いて作製したCAR-T 001のTHP-1、Kasumi-1又はK562細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。データは3ドナーCAR-T 001の抗腫瘍細胞活性％の平均値を示した。CAR-T 001は、THP-1及びKasumi-1細胞をE : T比1 : 5で完全に殺傷し、E : T比1 : 50でも強い抗腫瘍細胞活性が認められた。一方、GM-CSFレセプターα鎖であるCD116を発現しないK562細胞をCAR-T 001は全く殺傷しなかった。
＜GM-CSF分泌量の評価：＞
　上記抗腫瘍細胞活性と同様の共培養試験のE : T比1 : 5の1日目から5日目の培養上清を採取し、測定まで-30℃に冷凍保存した。冷凍保存した培養上清を解凍してD-PBSで10倍に希釈した後、Human GM-CSF Quantikine ELISA Kit（R&D Systems）を用いて培養上清中のGM-CSF分泌量を測定した。
　図１２にCAR-T 001とTHP-1又はKasumi-1との共培養上清中のGM-CSF分泌量の結果を示した。CAR-T 001はTHP-1又はKasumi-1との共培養1日目からGM-CSF分泌を認め、THP-1細胞との共培養においては3日目をピークに、Kasumi-1との共培養においては5日目までGM-CSFの著しい上昇が確認された。一方、遺伝子導入操作を施さないMock-Tとの共培養では、いずれも培養上清中のGM-CSFの上昇は確認されなかった。
［実施例７　CAR-T 001の抗腫瘍細胞活性に対するGM-CSF共存の影響］
　CAR-T 001とTHP-1又はKasumi-1との5日間の共培養試験において、GM-CSF 0～10 ng/mLを人為的に添加し、GM-CSF共存によるCAR-T 001の抗腫瘍細胞活性に及ぼす影響を評価した。
　図１３にGM-CSF共存下におけるCAR-T 001のTHP-1又はKasumi-1に対する抗腫瘍細胞活性をグラフに示した。CAR-T 001のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性に対し、E : T比 1 : 5においてはGM-CSF共存の影響は認められなかったが、E : T比1 : 50においてGM-CSFの添加濃度依存的に抗腫瘍細胞活性が減弱することが確認された。またCAR-T 001のKasumi-1に対する抗腫瘍細胞活性に対してはE : T比 1 : 5及び 1 : 50においてGM-CSFの添加濃度依存的に抗腫瘍細胞活性が減弱することが確認された。
［実施例８　GMR.CAR-T細胞の培養・増幅２］
＜Day -3: PBMCの分離とT細胞の非特異的刺激OKT 3 blast（抗CD3抗体で非特異的に刺激を受けた芽球）の作製＞
　遺伝子導入操作3日前に健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMC 2～4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行いOKT3 blastの作製を行った。
＜Day 0: OKT3 blastのウイルスペプチドパルス＞
　Day -3に非特異的抗体刺激を施したOKT3 blastを回収し、Peptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてOKT3 blastを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。これらウイルスペプチドの頭文字を取ってACE法と定義した。30分後、OKT3 blastに適量のD-PBSを加え懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みOKT3 blastを回収し、細胞数をカウントした後、0.5～2 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。ウイルスペプチドパルスとUV照射を施さないOKT3 blastの残りは、5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中24ウェルトリートメント培養プレートでそのまま培養を続けた。
＜Day 0: PBMCの分離と遺伝子導入操作＞
　健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUS（GEヘルスケア）に希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入は10 x 106 個の細胞を用いた。具体的には、それぞれCAR 001及びCAR 004～CAR 007のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、10 x 106個のPBMCを懸濁した。懸濁した細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、各ドナーから1 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜Day 7: CAR-T細胞の増幅:＞
　細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mL中にDay 0と同様に作製したフィーダー細胞2 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。
＜Day 14: GMR.CAR発現率の評価＞
　細胞数をカウントし、1～2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1～2 x 105個の細胞を採取し、PE Rat Anti-Human GM-CSF抗体2.5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）及びGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド（それぞれCAR 004、CAR 005、CAR 006又はCAR 007）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をそれぞれ、CAR-T 001、CAR-T 004、CAR-T 005、CAR-T 006及びCAR-T 007と定義した。
＜ACE法によって作製されたCAR-T 001及び004～007の結果：＞
　図１４に、健康成人1ドナーのPBMCからACE法で作製されたCAR-T 001及び004～007のday 14における発現解析結果を示した。ACE法で作製されたCAR-T 001及び004～007のGMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001: 24.41％、CAR-T 004: 13.17％、CAR-T 005: 16.47％、CAR-T 006: 11.21％及びCAR-T 007: 13.19％であり、対応するMock-T細胞における5.99％に比較していずれも高く、ACE法によるCAR-T 001及び004～007の作製が確認された。
［実施例９　腫瘍細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現解析］
　CAR-T 001及び004～007の抗腫瘍細胞活性評価に使用した腫瘍細胞株の細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現率をフローサイトメトリーにより解析した。急性骨髄性白血病（AML）の細胞株であるTHP-1、Kasumi-1、MV4-11株（American Type Culture Collection(ATCC)）、shinAML-1株（信州大学付属病院においてAML患者から樹立した細胞株）又は慢性骨髄性白血病（CML）の細胞株であるK562細胞の解析を行った。具体的には、1～2 x 105個の細胞を採取し、APC Anti-Human CD116抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック）5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33/CD116の発現率を測定した。
　表１に各腫瘍細胞表面のCD33/CD116発現率を示した。THP-1、Kasumi-1、shinAML-1及びMV4-11すべてにおいてCD33/CD116陽性率は90％以上であった。一方でK562におけるCD33/CD116陽性率は4.29％と低く、K562細胞表面におけるGM-CSFレセプターα鎖の発現が低いことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例１０　ACE CAR-T 001及び004～007の抗腫瘍細胞活性］
　CAR-T 001及び004～007の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1、Kasumi-1、shinAML-1又はMV4-11を使用し、それぞれの腫瘍細胞［ターゲット（Ｔ）］を5 x 105個/mLとなるように10％ FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで播種した。実施例８で取得したCAR-T 001及び004～007［エフェクター（Ｅ）］は、Ｅ：Ｔ比1 : 5～1 : 100となるように10% FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。
　すなわち、E : T比＝１：５の場合、GMR.CAR-T細胞は1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。同様に、E : T比＝１：５０、１：１００の場合は、それぞれGMR.CAR-T細胞は0.1 x 105個/mL又は0.05 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。共培養試験は5日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。ウェル内のエフェクター及びターゲットの細胞数、E : T比の組み合わせを以下の表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、トリパンブルーによる染色下、生細胞数をカウントした。遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体5μL及びPE Anti-Human CD33抗体 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33の陽性率を測定し、以下の計算式によりCAR-T 001及び004～007又はMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を算出した。
＜抗腫瘍細胞活性の算出＞
計算式：
・CD33陽性細胞数＝（トリパンブルー染色下生細胞数 ｘ FACSにおけるCD33陽性率％）／１００
・抗腫瘍細胞活性%＝１００－（CAR-T添加群のCD33陽性細胞数）／（CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数）ｘ１００
＜CAR-T細胞の腫瘍細胞殺傷能（単一CAR-T細胞が殺傷した腫瘍細胞数）の算出＞
・CAR-T細胞数＝エフェクターの細胞数ｘGM-CSF陽性率％／１００
・死細胞数＝CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数―CAR-T添加群のCD33陽性細胞数
・単一CAR-T細胞が殺傷した腫瘍細胞数＝死細胞数／CAR-T細胞数
　図１５にCAR-T 001及び004～007又はMock-T細胞のTHP-1に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。CAR-T 004の抗腫瘍細胞活性はCAR-T 001、005、006、007よりも強く、E : T比1 : 100においても90％以上を維持した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも2倍程度強い殺傷能だった。
　図１６にCAR-T 001及び004～007又はMock-T細胞のKasumi-1に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも1.5倍程度強い殺傷能だった。
　図１７にCAR-T 001及び004～007又はMock-T細胞のshinAML-1に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。CAR-T 004の抗腫瘍細胞活性はCAR-T 001、005、006、007よりも強く、E : T比1 : 100においても80％以上を維持した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも2倍以上強い殺傷能だった。
　図１８にCAR-T 001及び004～007又はMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。CAR-T 004の抗腫瘍細胞活性はCAR-T 001、005、006、007よりも強く、E : T比1 : 100においても70％以上を維持した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも1.5倍程度強い殺傷能だった。
［実施例１１　GM-CSF分泌量の評価］
　実施例１０で実施した共培養試験のE : T比1 : 5の1日目から5日目の培養上清を採取し、測定まで-30℃に冷凍保存した。冷凍保存した培養上清を解凍してD-PBSで10倍に希釈した後、Human GM-CSF Quantikine ELISA Kit（R&D Systems）を用いて培養上清中のGM-CSF分泌量を測定した。CAR-T 001及び004～007のGM-CSF分泌量はCAR-T細胞のGM-CSF陽性率％により補正した。
　図１９及び２０にCAR-T 001及び004～007のいずれかと、THP-1、Kasumi-1、shinAML-1又はMV4-11細胞との共培養上清におけるGM-CSF濃度の測定結果を示した。shRNAが導入されていないCAR-T 001は、いずれの腫瘍細胞との共培養においてもGM-CSF分泌量の上昇が確認された。一方で、GM-CSFの非翻訳領域に対するshRNAが挿入されたCAR-T 004、005、及び006は、CAR-T 001と比較していずれの腫瘍細胞との共培養においてもGM-CSFの分泌量が低下しており、配列番号２９～３１のいずれのshRNAを用いた場合においてもGM-CSFのノックダウン効果が認められた。陰性対照のshRNAが導入されたCAR-T 007ではノックダウン効果はほとんど認められなかった。
　GM-CSFに対するノックダウン効果とCAR-T細胞の抗腫瘍細胞活性の向上が最も相関したCAR-T細胞はCAR-T 004であった。GM-CSFに対するノックダウン効果が最も高いと考えられるCAR-T 006に関しては、抗腫瘍細胞活性が他のCAR-Tよりも一様に劣ることから、siRNAによるノックダウン効果が高いというよりはむしろ、腫瘍細胞の殺傷に伴ったサイトカイン分泌自体が低下している可能性も考えられる。
［実施例１２　GMR.CARスペーサー改変体発現プラスミド（CAR 008～011）の作製］
　CAR 001を鋳型として、細胞外スペーサードメイン部分を改変したGMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。具体的には、図２１～２４にベクターマップをそれぞれ示す、CH2CH3部分欠失体（図２１）、CH2部分欠失体（図２２）、CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図２３）、及びヒンジCH2部分欠失体（図２４）を作製した。
　Inverse-PCRに用いるPCRプライマーは、以下に示すように、CH2CH3部分欠失体用プライマー（配列番号３３及び３４）、CH2部分欠失体用プライマー（配列番号３５及び３６）、CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー（配列番号３７及び３８）、ヒンジCH2部分欠失体用プライマー（配列番号３９及び４０）をそれぞれデザインし、合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。
＜CH2CH3部分欠失体用プライマー＞
　　フォワードプライマー：5'- TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTC -3'（配列番号３３）
　　リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGAT -3'（配列番号３４）
＜CH2部分欠失体用プライマー＞
　　フォワードプライマー：5'- GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC -3'（配列番号３５）
　　リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGATTTGGGC -3'（配列番号３６）
＜CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー＞
　　フォワードプライマー：5'- GGTGGTGGTGGATCCGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTAAAGATCCCAAA
TTTTGGGTGCTGG -3'（配列番号３７）
　　リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGATTTGGGC -3'（配列番号３８）
＜ヒンジCH2部分欠失体用プライマー＞
　　フォワードプライマー：5'- GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC -3'（配列番号３９）
　　リバースプライマー：5'- CTCCTGGACTGGCTCCCAGCAGTC -3'（配列番号４０）
　CAR 001を50 ng/μLに調製して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調製した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。
　PCR反応後のサンプルの一部を1～1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的のサイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。次いで、残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドCAR 001を切断して排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせて環状プラスミドとした。得られた各環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。
　出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の改変が確認されたプラスミド：CAR 008 (GMR.CAR dCH2CH3)、CAR 009 (GMR.CAR dCH2)、CAR 010 (GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)、及びCAR 011 (GMR.CAR dHingeCH2)を取得した。得られたプラスミドの細胞外スペーサードメインは、CAR 008は配列番号６のアミノ酸配列からなるヒンジ領域、CAR 009は配列番号６のアミノ酸配列からなるヒンジ領域及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるCH3領域、CAR 010は配列番号６のアミノ酸配列からなるヒンジ領域及び配列番号４２からなる(G4S)3配列、CAR011は配列番号１０のアミノ酸配列からなるCH3領域をそれぞれ含んでいる。
［実施例１３　GMR.CAR+shRNA挿入体のスペーサー改変体発現プラスミド（CAR 012～015）の作製］
　CAR 004を鋳型として、実施例１２と同様に細胞外スペーサードメイン部分を改変したGMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。
　使用したプライマー及び方法は実施例１２と同様に行い、塩基配列確認により目的の塩基配列の改変が確認されたプラスミド：CAR 012 (GMR.CAR+shRNA dCH2CH3)、CAR 013 (GMR.CAR+shRNA dCH2)、CAR 014 (GMR.CAR+shRNA dCH2CH3+(G4S)3)、及びCAR 015 (GMR.CAR+shRNA dHingeCH2)を取得した。得られたプラスミドCAR 012、CAR 013、CAR 014、及びCAR 015の細胞外スペーサードメインは、それぞれCAR 008、CAR 009、CAR 010、及びCAR 011と同じ構成となっており、これらのプラスミドは更に、CAR 004と同様、GM-CSFの5'側非翻訳領域の配列に相補性を有するshRNA（図４、配列番号２９）を含んでいる。
［実施例１４　GMR.CAR-T細胞(CAR-T 008～011、CAR-T 012及びCAR-T 014)の培養・増幅３］
＜Day 0: PBMCの分離と非特異的刺激OKT 3 blastの作製＞
　健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMC 2～4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリート培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行い、OKT3 blastの作製を行った。
＜Day 0: PBMCのウイルスペプチドパルス＞
　単離したPBMCにpeptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてPBMCを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。本実施例の培養法を、実施例８に記載したACE法の変法としてPBMC-ACE法と定義した。30分後、PBMCに適量のD-PBSを加え懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みPBMCを回収し、細胞数をカウントした後、0.5～2 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。
＜Day 0: PBMCの分離と遺伝子導入操作＞
　健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUS（GEヘルスケア）に希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入は10 x 106 個の細胞を用いた。具体的には、それぞれCAR 008～011、CAR 012及びCAR 014のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、10 x 106個のPBMCを懸濁した。懸濁した細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜Day 7: CAR-T細胞の増幅:＞
　細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mL中にDay 0と同様に作製したフィーダー細胞2 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。
＜Day 14: GMR.CAR発現率の評価＞
　細胞数をカウントし、1～2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1～2 x 105個の細胞を採取し、遠心分離した細胞にPE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCantoII(BD)及びFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。それぞれ作製された発現プラスミド(CAR 008～011、CAR 012及びCAR 014)を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をそれぞれ、CAR-T 008、CAR-T 009、CAR-T 010、CAR-T 011、CAR-T 012、及びCAR-T 014と定義した。
　図２５にCAR-T 001及び008～011のday 14における発現解析結果を示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、 CAR-T 001 : 29.8％、 CAR-T 008: 33.1％、 CAR-T 009:25.9％、CAR-T 010: 33.6％、CAR-T 011: 16.4％であり、Mock-T細胞における発現率（0.91％）と比較していずれも高く、スペーサー部位の異なるGMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。以降の実験では、作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を25.9%に揃えて（CAR-T 011は16.4%のまま）、抗腫瘍細胞活性を評価した。
　図２６にCAR-T 008、CAR-T 010、CAR-T 012及びCAR-T 014のday 14における発現解析結果を示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T008: 23.6%、CAR-T010 : 32.3％、CAR-T012:4.00％、CAR-T014: 7.18％であった。
[実施例１５　CAR-T 008～011の抗腫瘍細胞活性評価]
　実施例１４で得られたCAR-T 001及び008～011の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、MV4-11細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、MV4-11細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。それらを48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。 CAR-T 001及び008～011［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 25及び1 : 125となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比1：25の場合、CAR-T は0.2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.1 x 105個となる）。同様に、E : T比1：125の場合、0.04 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.02 x 105個となる）。
　共培養試験は5日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、また、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについて、FACS Canto II（BD）とFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。CAR-T 001 、008～011及びMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を実施例１０と同様にして算出した。
　図２７に作製したCAR-T 001及び008～011のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。データは同一ドナーCAR-Tの抗腫瘍細胞活性％の3ウェル平均値を示した。CAR-T 001及び008～011は、MV4-11細胞をE:T比1:25で強い抗腫瘍細胞活性が認められ、E:T比1:125ではスペーサーの種類の違いによって抗腫瘍細胞活性に違いが認められた。
[実施例１６　CAR-T 012及びCAR-T 014の抗腫瘍細胞活性評価]
　実施例１４で得られたCAR-T 012及び014の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、MV4-11細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、MV4-11細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。それらを48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。 CAR-T 012及び014 ［エフェクター（E）］は、E：T比1:5、1 : 25及び1 : 125となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比1：5の場合、CAR-T は1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.5 x 105個となる）。また、E : T比1：25の場合、0.2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.1 x 105個となる）。同様に、E : T比1：125の場合、0.04 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.02 x 105個となる）。
　共培養試験は4日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験4日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5 μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5 μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについて、FACS Canto II（BD）とFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。 算出したCD33の陽性細胞数をもとにCAR-T 00X～00Y及びMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を実施例１０と同様にして算出した。
　図２８に作製したCAR-T 012及び014のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果をCAR-T 008及び010の結果と共に示した。CAR-T 012及び014は、MV4-11細胞をE:T比1:5で強い抗腫瘍細胞活性が認められ、E:T比1:25及び1:125でもMock-T細胞と比較して抗腫瘍細胞活性が認められた。
　図２９にCAR-T012、CAR-T014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する腫瘍細胞殺傷能を示した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T012、014が強く、shRNAが導入されていないCAR-T008又はCAR-T010よりも3倍程度強い殺傷能だった。
［実施例１７　抗腫瘍細胞活性持続性評価］
　CAR-T 001、008～012及び014の腫瘍細胞傷害活性の持続性を評価するため、長期間の腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1又はMV4-11細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、それぞれの腫瘍細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。 CAR-T 001、008～012、及び014 ［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 1及び1 : 5となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比＝1：1の場合、CAR-T は5 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。同様に、E : T比＝1：5の場合、 1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.5 x 105個となる）。なお、各群2ウェルずつ用意し、1ウェルはFACS Canto II（BD）での「解析用」、もう1ウェルは次のタームで新しい腫瘍細胞へ添加するための「継続用」として用いた。
　ターム1としての共培養試験は4日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様の共培養試験を行い、また、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験4日目に「解析用」のウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについてFACS Canto II、FLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。ここまでをターム1とする。
　共培養開始時と比較して腫瘍細胞が殺傷された（腫瘍細胞数が減少した）群に関しては、次のターム2へ進めた。具体的には、予め2.5 x 105個/500 μL/wellで播種された腫瘍細胞を2ウェル用意し、そこへターム1で「継続用」として共培養しておいた培養液を500 μL/wellずつ等分に添加し、さらに4日間共培養した。この作業を培養期間4日または3日で繰り返した。なお、共培養開始時と比較して腫瘍細胞数が増加した群に関しては、次のタームへは進めないこととした。
　図３０～図４１に各腫瘍細胞をターゲットとしたときの持続的な抗腫瘍細胞活性評価の結果を示した。CAR-T 001、008～012、及び014は持続的に腫瘍細胞を殺傷することが確認された。また、MV4-11に対しては、スペーサーの違いで殺傷回数に違いが認められた。具体的にはCAR－T 001及びCAR－T 010において、より長期的な腫瘍殺傷効果が期待できる。
　本発明により、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体を細胞表面に発現している標的細胞に特異的に結合し、優れた細胞傷害活性を付与するCAR-T細胞が提供される。本発明の細胞は、JMML等の疾患に対する養子免疫治療に使用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞。
  2. 　(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
    　(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
    が導入された遺伝子改変細胞。
  3. 　GM-CSF受容体に結合するCARを細胞膜上に発現する、請求項１又は２記載の細胞。
  4. 　CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、請求項１～３のいずれか１項記載の細胞。
  5. 　細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、請求項１～４のいずれか１項記載の細胞。
  6. 　共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、請求項４又は５記載の細胞。
  7. 　細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、請求項４～６のいずれか１項記載の細胞。
  8. 　標的結合ドメインが配列番号２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１～７のいずれか１項記載の細胞。
  9. 　RNAiを誘導するポリヌクレオチドがsiRNA又はshRNAである、請求項２～８のいずれか１項記載の細胞。
  10. 　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法。
  11. 　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同一又は異なるベクターを用いてそれぞれ細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法。
  12. 　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
  13. 　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクター。
  14. 　ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターとを含む、CARタンパク質発現細胞の作製のためのキット。
  15. 　請求項１～９のいずれか１項記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
  16. 　請求項１５記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
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