WO2018008812A1 - 판크레아틴의 살균방법 및 이를 이용한 판크레아틴 제조방법 - Google Patents

판크레아틴의 살균방법 및 이를 이용한 판크레아틴 제조방법 Download PDF

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sodium hypochlorite
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황지환
박래환
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넨시스(주)
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Definitions

  • the present invention relates to a method for sterilizing pancreatin and a method for preparing pancreatin using the same. Specifically, sodium hypochlorite is added to a composition in which pancreatin is dispersed or dissolved in one or more solvents so as to have a specific concentration. It relates to a method for sterilizing pancreatin and to a method for producing pancreatin using the sterilization method, characterized in that the sterilization is carried out for a certain time.
  • Pancreatin is a complex enzyme derived from the pancreas of mammals such as cattle and pigs. It is composed of three enzymes: amylase, lipase, and protease. This pancreatin is economical compared to other enzymes because it is obtained primarily as a by-product from cattle or pigs that are slaughtered for meat. For this reason, it is widely used throughout the industry, such as drug substance, food additives, feed additives, laundry detergents, leather processing.
  • pancreatin is mainly used in the field of medicine for the purpose of improving and treating indigestion, digestive dysfunction, pancreatic exocrine disorders, etc. Due to the characteristics of this field, the content of main enzymes such as amylase, lipase, and protease is important. Of course, the content of impurities such as fat components and the contamination of viruses or microorganisms should be managed more importantly.
  • Pancreatin is generally extracted from bovine or pork pancreas using water as an extraction solvent to extract amylase, lipase, and protease, which are water-soluble main components, and then obtained by industrially precipitating and drying the main components by adding an organic solvent.
  • water instead of using water as an extraction solvent, a method of obtaining pancreatin of high titer by sequentially extracting carbon dioxide and a mixed solvent of carbon dioxide and ethanol (Korea Patent No. 10-0251816) and water and halogenated hydrocarbons as extraction solvents
  • a method for producing pancreatin by continuous extraction using the same (Korean Patent Publication No. 10-1995-0018450) is known, but it has a disadvantage in that it is economically poor in industrial use, such as using an expensive supercritical fluid extractor.
  • pancreatin is heated to less than 9% of solvent content at temperatures below 85 ° C.
  • Manufacturing method to lower the has been disclosed, but there is a disadvantage in that additional process energy costs are increased by applying heat.
  • sodium hypochlorite has been generally used as a fungicide for killing rot or pathogen of food.
  • sodium hypochlorite has been generally used as a fungicide for killing rot or pathogen of food.
  • there have been no attempts to purify enzymes using sodium hypochlorite as a disinfectant since the field of refining enzymes has refrained from using the compound in fear of adversely affecting the activity of the enzyme.
  • pancreatin production techniques as described above, and came to pay attention to the bactericidal effect of sodium hypochlorite that has not been used in the existing enzyme production field. Therefore, various studies have been conducted on the effect of sodium hypochlorite on pancreatin, and as a result, lipase, amylase, and the major components of pancreatin are treated when sodium hypochlorite is treated at a certain concentration and time. Sterilization can be effectively carried out while maintaining the activity of the protease, and the production of pancreatin using this sterilization method was confirmed that the production of pancreatin of good quality at low cost was completed.
  • the main object of the present invention is to provide a sterilization method that can effectively sterilize microorganisms while minimizing the effect on the activity of amylase, lipase and protease, the main component enzymes of pancreatin.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing pancreatin, which is excellent in enzymatic activity and safe from microbial contamination by using the sterilization method.
  • the present invention is added to the composition of the form of dispersing or dissolving pancreatin in at least one solvent so that sodium hypochlorite to a concentration of 0.05 to 16 ⁇ g / ml and 1 to 240 minutes It provides a method for sterilizing pancreatin, characterized in that the maintenance and sterilization.
  • the sterilization method of the present invention is particularly effective for pancreatin derived from pigs or cattle.
  • sodium hypochlorite it is preferable to add sodium hypochlorite to a concentration of 0.128 to 8 ⁇ g / ml and to maintain sterilization for 5 to 60 minutes.
  • the present invention provides a method for preparing a composition
  • a method for preparing a composition comprising: a) mixing a ground product of an animal pancreas with water, adding calcium chloride and acetone and stirring to obtain a composition in which pancreatin is dispersed or dissolved; b) adding sodium hypochlorite to the composition at a concentration of 0.05-16 ⁇ g / ml and holding for 1 to 240 minutes; c) adding acetone to the composition to which sodium hypochlorite is added, stirring and solid-liquid separation to obtain a solid; d) washing the solid with acetone; And e) drying the washed solids.
  • the method for producing pancreatin of the present invention is particularly effective when using the pancreas of pigs or cattle as a raw material.
  • the step b) is preferably performed by adding sodium hypochlorite to the filtrate so as to have a concentration of 0.128 to 8 ⁇ g / ml and maintaining it for 5 to 60 minutes.
  • pancreatin it is a very easy way to react by adding sodium hypochlorite to a composition containing pancreatin, which effectively kills microorganisms present in the composition while maintaining the activity of lipases, amylases and proteases, the major enzymes of pancreatin. Can be.
  • the sterilization method of the present invention is applied to the manufacturing process of pancreatin, it is possible to prepare pancreatin of excellent quality with excellent enzymatic activity and safe from microbial contamination.
  • 1 is a graph showing the bactericidal effect of aerobic microorganisms and the main enzyme (amylase, lipase and protease) activity analysis of pancreatin according to the concentration of sodium hypochlorite.
  • Figure 2 is a graph showing the results of analysis of the bactericidal effect of aerobic microorganisms and pancreatin major enzymes (amylase, lipase and protease) activity when the concentration of sodium hypochlorite is 0.128 ⁇ g / ml.
  • Figure 3 is a graph showing the results of analysis of the bactericidal effect of aerobic microorganisms and the main enzyme (amylase, lipase and protease) activity of pancreatin according to the reaction time when the concentration of sodium hypochlorite is 8 ⁇ g / ml.
  • Figure 4 is a graph showing the bactericidal effect of aerobic microorganisms and the main enzyme (amylase, lipase and protease) activity analysis of aerobic microorganisms according to the reaction time when the concentration of sodium hypochlorite is 16 ⁇ g / ml.
  • the present invention can maintain the activity of lipase, amylase and protease, the major enzymes of pancreatin, even under conditions in which sodium hypochlorite is present at a certain concentration, and under these conditions, microorganisms with high potential for contamination during pancreatin production. Based on the results of research that the possibility of killing is possible.
  • sodium hypochlorite was added to the solution in the form of dispersing or dissolving pancreatin in a solvent at a concentration of 0.05 to 16 ⁇ g / ml and maintained for 1 to 240 minutes, thereby lipase, amylase and It has been shown that the microorganisms can be killed with sufficient activity of the protease.
  • sodium hypochlorite was added at a concentration of 0.128 to 8 ⁇ g / ml and maintained for 5 to 60 minutes in order to sufficiently sterilize the activity of the enzymes.
  • the pancreatin be present in a dispersed or dissolved state in a solvent, and sodium hypochlorite is added thereto.
  • a solvent any of those conventionally used as a solvent in the manufacturing process of pancreatin can be used.
  • water or a proenzymatic organic solvent is used, and a mixed solvent thereof may also be used.
  • Protic enzymatic organic solvents include acetone, chloroform, dichloromethane, propanol, butanol, and the like, and in the present invention, all or a mixture thereof may be used.
  • the concentration of pancreatin is 100 to 100,000 USP unit / ml amylase and protease, and 20 to 20,000 USP unit / ml in the case of lipase It is preferable to sterilize by adding sodium chlorate.
  • the reaction temperature that is, the time during which sterilization is performed by adding sodium hypochlorite to a state in which the creatine is dispersed or dissolved, is preferably between room temperature, that is, 10 to 30 ° C, and more preferably 17 to 27 ° C.
  • the method for producing pancreatin according to the present invention is applied to the method for sterilizing pancreatin as described above.
  • A) Mixing the pulverized product of the animal pancreas with water, adding calcium chloride and acetone and stirring to obtain a composition in which pancreatin is dispersed or dissolved.
  • Making b) adding sodium hypochlorite to the composition at a concentration of 0.05-16 ⁇ g / ml and holding for 1 to 240 minutes; c) adding acetone to the composition to which sodium hypochlorite is added, stirring and solid-liquid separation to obtain a solid; d) washing the solid with acetone; And e) drying the washed solids.
  • Step a) may be referred to a step of extracting and activating pancreatin from animal organ pulverization.
  • the ratio of the pulverized product and water is 1: 0.5 to 1: 10
  • calcium chloride and acetone are preferably used at 0.005 to 0.05 times and 0.2 to 0.4 times, respectively, based on the weight of the pulverized product. 5 to 20 hours are suitable for stirring.
  • step a it is preferable to remove by-products other than pancreatin from the animal organ pulverized product so that the process of the next step can be efficiently performed.
  • Centrifugation or filtration commonly used in the preparation of pancreatin can be used.
  • by-products can be removed by centrifugation to remove the precipitate and to obtain a supernatant, and the method of filtration also removes the filter residues by using a filtering network and removes the by-products by obtaining the filtrate. can do. It is more preferable to use the said centrifugation and filtration together.
  • Step b) is a step of applying the sterilization method of the present invention to add sodium hypochlorite to the composition to a concentration of 0.05 to 16 ⁇ m / ml and maintain for 1 to 240 minutes to be sterilized.
  • the temperature is preferably between room temperature, that is, 10 ⁇ 30 °C, more preferably 17 ⁇ 27 °C.
  • sodium hypochlorite is preferably added at a concentration of 0.128 to 8 ⁇ g / ml and maintained for 5 to 60 minutes.
  • Step c) may be referred to as removing the sodium hypochlorite used in step b).
  • acetone pancreatin is precipitated and sodium hypochlorite is dissolved in acetone. Solid-liquid separation in this state to obtain a solid can remove sodium hypochlorite.
  • the amount of acetone added is preferably set to 3 to 10 times the weight of the pulverized product of step a).
  • the step d) may be referred to as a step of additionally removing the sodium hypochlorite that could not be removed in step c) with acetone.
  • the solid obtained in step c) may be washed by adding acetone, stirring and solid-liquid separation to obtain a solid.
  • the amount of acetone added is preferably 1 to 3 times the weight of the a) comminuted.
  • the step e) is preferably a step of removing acetone, and then drying is performed after grinding to increase drying efficiency.
  • pancreatin preparation in a form that is easy to formulate.
  • Porcine pancreas 670kg and duodenum 40kg was ground using a grinder, and then homogeneously dispersed in 800kg of purified water, and 6.7kg of calcium chloride and 200kg of acetone were added thereto, followed by stirring at room temperature (22 ⁇ 5 ° C) for 10 hours.
  • sodium hypochlorite was added to a final concentration of 0.128 ⁇ g / ml and stirred for 30 minutes at room temperature (22 ⁇ 5 °C).
  • the filter residue was pulverized finely to a size of approximately 0.5 cm or less and dried in a vacuum dryer for 10 hours. After drying, the dried product was put into a mixer, homogenized for 30 minutes, and ground to a size of about 0.2 mm or less by using a grinder. This gave about 70 kg of pancreatin in the form of a ground product (see Table 1).
  • a binder solution in which 6.28 kg of hydroxypropylcellulose was dissolved in a mixed solvent of 15.7 kg of isopropanol, 3.14 kg of methylene chloride, and 7.85 kg of purified water, was added to a ribbon mixer together with 69.22 kg of the final milled product obtained in Example 1 above.
  • the granules were manufactured by using an extruded granulator having a size of 1 mm of the discharge body. The granules were dried for 30 minutes using a fluidized bed dryer and then screened.
  • a tertiary coating solution was prepared, and then the tertiary coating was performed by spraying the tertiary coating solution while flowing the granules with the secondary coating in a fluidized bed coater.
  • Pancreatin was prepared in the same manner as in Example 1, but pancreatin was prepared by varying the concentration of sodium hypochlorite.
  • concentrations of sodium hypochlorite were 0.2 ng / ml, 0.05 ⁇ g / ml, 0.128 ⁇ g / ml, 0.64 ⁇ g / ml, 3.2 ⁇ g / ml, 8 ⁇ g / ml, 16 ⁇ g / ml, 80 ⁇ g / ml and 400 ⁇ g / ml, respectively.
  • ML 2,000 ⁇ g / mL was added.
  • pancreatin sample thus prepared was taken and used as a sample, and the control group was prepared without adding sodium hypochlorite.
  • the sample of Experimental Example 1-1 was diluted with a suitable concentration using purified water, and then plated on LB agar medium and cultured at 37 ° C. for at least 24 hours to measure the number of colonies generated.
  • the digestion test of the Korean Pharmacopoeia of the sample of Experimental Example 1-1 was tested according to each term of lipase, amylase and protease to evaluate the activity of each enzyme.
  • the concentration of sodium hypochlorite was 0.05 ⁇ g / ml
  • the microbial killing effect was about 70%, and from 0.128 ⁇ g / ml, most of the microorganisms were killed.
  • the enzyme activity of lipase, amylase and protease was more than 80% at 8 ⁇ g / ml, and the activity of amylase was reduced to 50% at 16 ⁇ g / ml.
  • sodium hypochlorite can be used at a concentration of 0.05 to 16 ⁇ g / ml for the sterilization of pancreatin, and a concentration of 0.128 to 8 ⁇ g / ml is believed to be effective.
  • Pancreatin was prepared in the same manner as in Example 1, but the concentration of sodium hypochlorite was fixed at 0.128 ⁇ g / ml, 8 ⁇ g / ml and 16 ⁇ g / ml, respectively, and the reaction time of sodium hypochlorite was 1 minute and 5 minutes, respectively. Pancreatin was prepared in different minutes, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes, and 240 minutes.
  • pancreatin sample thus prepared was used as a sample to analyze bactericidal effect and enzyme activity in the same manner as in Experimental Example 1.
  • 0.128 ⁇ g / ml shows a microbial killing effect of 80% or more with only one minute of reaction time, and the concentration of sodium hypochlorite is relatively high.
  • the activity of amylase was reduced to about 40% even though the reaction time was 240 minutes, but the lipase activity was maintained at about 80% and the protease activity was almost 100%.
  • reaction time of sodium hypochlorite for the sterilization of pancreatin is possible from 1 to 240 minutes, the reaction time of 5 to 60 minutes is believed to be effective.
  • the method for sterilizing pancreatin and the method for producing pancreatin of the present invention can be applied to produce pancreatin widely used throughout the industry, such as pharmaceutical ingredients, food additives, feed additives, laundry detergents, leather processing.
  • pancreatin widely used throughout the industry, such as pharmaceutical ingredients, food additives, feed additives, laundry detergents, leather processing.

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Abstract

본 발명은 판크레아틴의 살균방법 및 이를 이용한 판크레아틴 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 하나 이상의 용매에 판크레아틴이 분산 또는 용해된 형태의 조성물에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 특정한 농도가 되도록 첨가하고 특정한 시간동안 유지하여 살균하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 살균방법 및 이 살균방법을 이용한 판크레아틴의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 판크레아틴이 함유된 조성물에 차아염소산나트륨을 첨가하여 반응시키는 매우 간편한 방법으로 판크레아틴의 주요 효소인 리파제, 아밀라아제 및 프로테아제의 활성을 유지하면서 조성물에 존재하는 미생물을 매우 효과적으로 사멸시킬 수 있다. 또한 본 발명의 살균방법을 판크레아틴의 제조과정에 적용하면 효소활성이 우수하고 미생물 오염으로부터 안전한 우수한 품질의 판크레아틴을 제조할 수 있다.

Description

판크레아틴의 살균방법 및 이를 이용한 판크레아틴 제조방법
본 발명은 판크레아틴의 살균방법 및 이를 이용한 판크레아틴 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 하나 이상의 용매에 판크레아틴이 분산 또는 용해된 형태의 조성물에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 특정한 농도가 되도록 첨가하고 특정한 시간동안 유지하여 살균하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 살균방법 및 이 살균방법을 이용한 판크레아틴의 제조방법에 관한 것이다.
판크레아틴은 소, 돼지와 같은 포유류의 췌장으로부터 추출한 복합효소제로 아밀라아제(amylase), 리파아제(lipase), 그리고 프로테아제(protease)의 세 가지 효소를 주성분으로 한다. 이 판크레아틴은 주로 육류 획득을 위해 도축되어지는 소나 돼지로부터 부산물로써 얻어지기 때문에 다른 효소제들에 비하여 경제적이다. 이런 이유로 원료의약품, 식품첨가물, 사료첨가제, 세탁세제, 피혁가공 등 산업 전반에 걸쳐서 널리 이용되고 있다.
특히, 판크레아틴은 소화불량, 소화기능장애, 췌장외분비장애 등의 개선 및 치료를 목적으로 하는 의약품분야에서 주로 사용되는데, 이 분야의 특성 상, 아밀라아제, 리파아제, 및 프로테아제 등 주성분 효소의 함량이 중요한 것은 물론 지방성분 등의 불순물 함량과 바이러스나 미생물의 오염 여부 등이 더욱 중요하게 관리되어져야 한다.
판크레아틴은 일반적으로 소 혹은 돼지의 췌장 분쇄물로부터 추출용매로서 물을 이용하여 수용성 주성분인 아밀라아제, 리파아제, 그리고 프로테아제를 추출한 후, 유기용매를 첨가하여 주성분을 침전시키고 건조하여 산업적으로 얻어내게 되는데, 추출용매로서 물을 이용하는 대신, 이산화탄소 그리고 이산화탄소와 에탄올의 혼합용매를 이용하여 순차적으로 추출함으로서 고역가의 판크레아틴을 얻어내는 방법(대한민국 등록특허 제10-0251816호) 그리고 물과 할로겐화 탄화수소를 추출용매로 이용하여 연속 추출하여 판크레아틴을 제조하는 방법(대한민국 공개특허 제10-1995-0018450호)이 알려져 있으나, 고가의 초임계유체추출기를 이용해야하는 등 산업적으로 이용하는데 경제성이 떨어지는 단점이 있다.
또한, 췌장조직 내에서 불활성화된 상태로 존재하는 주성분 효소들을 활성화하여 높은 역가의 판크레아틴을 얻어내기 위해 상온에서 pH 5 ~ 6 및 pH 7.5 ~ 8.5 조건의 두 단계 활성화 공정을 적용하거나(대한민국 등록특허 제10-0276840호), 선택적 안정화제를 첨가하여 고역가의 판크레아틴을 제조하는 방법(대한민국 등록특허 제10-0367659호)이 제안된 바 있으나, 추가된 공정에 의한 생산효율이 높지 않으며, 안정화제의 제거를 위해 추가 공정이 요구되는 단점이 있다.
최근에는 소나 돼지의 췌장으로부터 추출해내는 판크레아틴 제조공정의 특성 상 바이러스나 미생물의 오염 가능성이 높은데 이를 개선하고자 85℃ 이하의 온도에서 9% 미만의 용매함량으로 판크레아틴을 가열하여 바이러스 및 미생물의 함량을 낮추는 제조방법(대한민국 등록특허 제10-1555058호)이 공개되었으나 열을 가함으로써 추가적인 공정 에너지 비용이 많이 드는 단점이 있다.
한편, 차아염소산나트륨은 일반적으로 식품의 부패균이나 병원균을 사멸하기 위한 살균제로 사용되어 왔다. 하지만 효소를 정제하는 분야에서는 효소의 활성에 악영향을 미칠 것을 우려하여 화합물의 사용을 자제해왔기 때문에 지금까지 이 차아염소산나트륨을 살균제로 사용하여 효소를 정제하려는 시도가 이루어지지 않았다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래 판크레아틴 제조기술들의 문제점들을 극복하고자 하였으며, 기존 효소 제조 분야에서는 이용되지 않았던 차아염소산나트륨의 살균효과에 주목하게 되었다. 이에 차아염소산나트륨이 판크레아틴에 미치는 영향에 대해 다양한 연구를 시도하였으며, 이의 결과 판크레아틴에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 특정한 농도 및 특정한 시간으로 처리하는 경우 판크레아틴의 주요 성분인 리파제, 아밀라아제 및 프로테아제의 활성을 유지하면서 살균을 효과적으로 수행할 수 있고, 이러한 살균방법을 이용하여 판크레아틴을 제조하면 저비용으로 우수한 품질의 판크레아틴을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 판크레아틴의 주성분 효소들인 아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제의 활성에 대한 영향을 최소화하면서 미생물을 효과적으로 살균할 수 있는 살균방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 살균방법을 이용하여 효소활성이 우수하고 미생물 오염으로부터 안전한 판크레아틴 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하나 이상의 용매에 판크레아틴이 분산 또는 용해된 형태의 조성물에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 0.05 내지 16㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 1 내지 240분간 유지하여 살균하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 살균방법을 제공한다.
본 발명의 살균방법은 특히 돼지 또는 소 유래의 판크레아틴에 효과적이다.
본 발명의 살균방법에 있어서, 차아염소산나트륨을 0.128 내지 8㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 5 내지 60분간 유지하여 살균하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 a) 동물 췌장의 분쇄물과 물을 혼합하고 염화칼슘 및 아세톤을 첨가하고 교반하여 판크레아틴이 분산 또는 용해된 조성물을 수득하는 단계; b) 상기 조성물에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 0.05 내지 16㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 1 내지 240분간 유지하는 단계; c) 상기 차아염소산나트륨이 첨가된 조성물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 고액분리하여 고형물을 수득하는 단계; d) 상기 고형물을 아세톤으로 세척하는 단계; 및 e) 상기 세척된 고형물을 건조시키는 단계;를 포함하는 판크레아틴 제조방법을 제공한다.
본 발명의 판크레아틴 제조방법은 그 원료로 특히 돼지 또는 소의 췌장을 사용하는 경우에 효과적이다.
본 발명의 판크레아틴 제조방법에 있어서, 상기 b)단계는 차아염소산나트륨을 0.128 내지 8㎍/㎖의 농도가 되도록 상기 여과액에 첨가하고 5 내지 60분간 유지하는 방법으로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 판크레아틴이 함유된 조성물에 차아염소산나트륨을 첨가하여 반응시키는 매우 간편한 방법으로 판크레아틴의 주요 효소인 리파제, 아밀라아제 및 프로테아제의 활성을 유지하면서 조성물에 존재하는 미생물을 매우 효과적으로 사멸시킬 수 있다. 또한 본 발명의 살균방법을 판크레아틴의 제조과정에 적용하면 효소활성이 우수하고 미생물 오염으로부터 안전한 우수한 품질의 판크레아틴을 제조할 수 있다.
도 1은 차아염소산나트륨의 농도에 따른 호기성 미생물의 살균 효과 및 판크레아틴의 주효소(아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제) 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 차아염소산나트륨의 농도가 0.128㎍/㎖일 때 반응시간에 따른 호기성 미생물의 살균 효과 및 판크레아틴의 주효소(아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제) 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 차아염소산나트륨의 농도가 8㎍/㎖일 때 반응시간에 따른 호기성 미생물의 살균 효과 및 판크레아틴의 주효소(아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제) 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 차아염소산나트륨의 농도가 16㎍/㎖일 때 반응시간에 따른 호기성 미생물의 살균 효과 및 판크레아틴의 주효소(아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제) 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 차아염소산나트륨이 특정 농도로 존재하는 조건에서도 판크레아틴의 주효소인 리파제, 아밀라아제 및 프로테아제의 활성이 특정 시간동안 유지될 수 있고, 이 조건 하에서 판크레아틴의 제조과정에서 오염가능성이 높은 미생물의 사멸이 가능하다는 연구결과를 바탕으로 안출된 것이다.
본 발명의 연구결과에 따르면 용매에 판크레아틴이 분산 또는 용해된 형태의 용액에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 0.05 내지 16㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 1 내지 240분간 유지하면 리파제, 아밀라아제 및 프로테아제의 활성이 충분히 남아있는 상태로 미생물을 사멸할 수 있는 것으로 나타났다. 또한 상기 효소들의 활성이 보다 높게 유지된 상태로 충분히 살균이 이루어질 수 있도록 하기 위해 차아염소산나트륨을 0.128 내지 8㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 5 내지 60분간 유지하는 것이 좋은 것으로 나타났다.
본 발명의 살균방법에서 차아염소산나트륨의 살균효과를 위해서는 판크레아틴이 용매 내에 분산 또는 용해된 상태로 존재하도록 하고 여기에 차아염소산나트륨을 첨가하는 것이 바람직하다. 이때 용매로는 기존에 판크레아틴의 제조공정 중 용매로 사용하는 것을 모두 사용할 수 있다. 보통 물이나 친효소적 유기용매를 사용하며, 이들을 혼합한 용매도 사용할 수 있다. 친효소적 유기용매로는 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 프로판올, 부탄올 등이 있고, 본 발명에서는 이들 모두 또는 이들의 혼합물들을 사용할 수 있을 것이라 판단된다.
본 발명의 살균방법을 효율적으로 수행하기 위해, 판크레아틴의 농도가 미국약전 역가 기준으로 아밀라아제 및 프로테아제는 100 ~ 100,000 USP unit/㎖, 그리고 리파아제의 경우에는 20 ~ 20,000 USP unit/㎖인 조성물에 차아염소산나트륨을 첨가하여 살균하는 것이 바람직하다.
반응 온도, 즉 판크레아틴이 분산 또는 용해된 상태에 차아염소산나트륨이 첨가되어 살균이 이루어지는 시간동안의 온도는 상온, 즉 10 ~ 30℃ 사이가 바람직하며, 보다 바람직하게는 17 ~ 27℃가 좋다.
본 발명의 판크레아틴 제조방법은 상기와 같은 판크레아틴의 살균방법을 적용한 것으로, a) 동물 췌장의 분쇄물과 물을 혼합하고 염화칼슘 및 아세톤을 첨가하고 교반하여 판크레아틴이 분산 또는 용해된 조성물을 수득하는 단계; b) 상기 조성물에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 0.05 내지 16㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 1 내지 240분간 유지하는 단계; c) 상기 차아염소산나트륨이 첨가된 조성물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 고액분리하여 고형물을 수득하는 단계; d) 상기 고형물을 아세톤으로 세척하는 단계; 및 e) 상기 세척된 고형물을 건조시키는 단계;를 포함하여 이루어진다.
상기 a)단계는 동물 장기 분쇄물로부터 판크레아틴을 추출하고 활성화하는 단계라고 할 수 있다. 이때 분쇄물과 물의 비율을 중량기준 1 : 0.5 ~ 1 : 10으로 하는 것이 바람직하며, 염화칼슘 및 아세톤은 상기 분쇄물의 중량을 기준으로 각각 0.005 ~ 0.05배, 0.2 ~ 0.4배로 사용하는 것이 바람직하다. 교반하는 시간은 5 ~ 20시간이 적당하다. 그리고 동물 장기로 췌장과 십이지장을 함께 사용하는 것이 바람직하다. 십이지장은 판크레아틴 효소들을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다.
상기 a)단계 이후에 동물 장기 분쇄물에서 판크레아틴 이외의 부산물을 제거하여 다음 단계의 과정이 효율적으로 이루어질 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 판크레아틴의 제조에서 통상적으로 이용되는 원심분리 또는 여과하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 원심분리를 통해 침전되는 물질을 제거하고 상등액을 수득하는 방법으로 부산물을 제거할 수 있으며, 여과하는 방법 또한 여과망을 사용하여 여과잔류물을 제거하고 여과액을 수득하는 방법으로 부산물을 제거할 수 있다. 상기 원심분리 및 여과를 병용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 b)단계는 본 발명의 살균방법을 적용하는 단계로 상기 조성물에 차아염소산나트륨을 0.05 내지 16㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 1 내지 240분간 유지하여 살균이 이루어지도록 한다. 이때 온도는 상온, 즉 10 ~ 30℃ 사이가 바람직하며, 보다 바람직하게는 17 ~ 27℃가 좋다. 그리고 효소 활성 및 살균 효과를 보다 높이기 위해 차아염소산나트륨을 0.128 내지 8㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 5 내지 60분간 유지하는 것이 바람직하다.
상기 c)단계는 b)단계에서 사용한 차아염소산나트륨을 제거하는 단계라고 할 수 있다. 다량의 아세톤을 첨가하면 판크레아틴은 침전되고 차아염소산나트륨은 아세톤에 용해된 상태로 존재하게 된다. 이러한 상태에서 고액분리하여 고형물을 수득하면 차아염소산나트륨을 제거할 수 있다. 이때 아세톤의 첨가량은 상기 a)단계 분쇄물의 중량 기준 3 ~ 10배로 하는 것이 바람직하다.
상기 d)단계는 c)단계에서 미처 제거하지 못한 차아염소산나트륨을 아세톤으로 세척하여 추가 제거하는 단계라고 할 수 있다. c)단계에서 수득한 고형물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 다시 고액분리하여 고형물을 수득하는 방법으로 세척할 수 있다. 이때 아세톤의 첨가량은 상기 a)단계 분쇄물의 중량 기준 1 ~ 3배로 하는 것이 바람직하다.
상기 e)단계는 아세톤을 제거하는 단계로 건조효율을 높이기 위해 분쇄과정을 거친 다음에 건조를 수행하는 것이 바람직하다.
이후 추가적으로 균질화 및 추가분쇄공정을 거치면 제형화가 용이한 형태의 판크레아틴 제제를 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 차아염소산나트륨을 사용한 판크레아틴 제조
돼지췌장 670kg 및 십이지장 40kg을 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, 800kg의 정제수에 균질하게 분산시키고, 여기에 염화칼슘 6.7kg 및 아세톤 200kg을 첨가하여 10시간동안 상온(22±5℃)에서 교반하였다.
이후 여과포가 구비된 원심분리기로 원심분리하여 상등액의 여과액을 수득한 다음 최종농도가 0.128㎍/㎖이 되도록 차아염소산나트륨을 첨가하여 상온(22±5℃)에서 30분간 교반하였다.
반응이 끝난 후, 아세톤 4,200kg을 첨가하여 잘 섞어주고 스크류잭으로 압착여과하여 여과잔류물을 수득하였다. 여기에 다시 아세톤 1,200kg을 첨가하여 잘 분산되도록 섞어주고 다시 여과하여 여과잔류물을 수득하였다.
여과잔류물을 대략 직경 0.5㎝의 크기 이하로 잘게 분쇄한 후 진공건조기에서 10시간 건조시켰다. 건조가 끝나면 건조물을 혼합기에 투입하여 30분간 균질화하고 분쇄기를 이용하여 대략 직경 0.2㎜의 크기 이하로 분쇄하였다. 이렇게 하여 분쇄물 형태의 판크레아틴 약 70kg 정도를 수득하였다(표 1 참조).
원료 생산설비 공정
돼지 췌장 670kg십이지장 40kg 분쇄기 분쇄
정제수 800kg아세톤 200kg염화칼슘 6.7kg 반응조 추출 및 효소활성화
원심분리기 부산물 제거
차아염소산나트륨 반응조 살균
아세톤 4,200kg 반응조 침전/불활화
스크류잭 압착여과(차아염소산나트륨 제거)
아세톤 1,200kg 반응조 탈수/탈지
스크류잭 압착여과
분쇄기 분쇄
진공건조기 건조
혼합기 혼합
분체기 분쇄
포장
판크레아틴 제품: 70kg±3.5kg
실시예 2. 판크레아틴 장용과립 제조
이소프로판올 15.7kg, 염화메틸렌 3.14kg 및 정제수 7.85kg을 혼합한 혼합용제에 히드록시프로필셀룰로오스 6.28kg을 녹인 결합액을 상기 실시예 1에서 수득한 최종 분쇄물 69.22kg과 함께 리본믹서기에 투입하여 연합한 다음 이것을 토출 체눈의 크기가 1㎜인 압출식 제립기를 이용하여 과립을 제조하였다. 제조된 과립은 유동층건조기를 이용하여 30분간 건조한 다음 선별하였다.
히드록시프로필메틸셀룰로오스 2.1kg 및 폴리에틸렌글리콜6000 0.2kg을 에탄올 30kg과 염화메틸렌 14kg을 혼합하여 만든 혼합용제에 녹여 1차 코팅액을 준비한 다음 앞서 선별된 과립을 유동층코팅기에 투입하고 1차 코팅액을 분사하면서 1차 코팅을 수행하였다.
히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 18kg 및 폴리에틸렌글리콜 1kg을 에탄올 252kg과 염화메틸렌 108kg을 혼합한 혼합용제에 녹여 2차 코팅액을 준비한 다음 앞서 1차 코팅이 완료된 과립을 유동층코팅기에서 유동시키면서 2차 코팅액을 분사하여 2차 코팅을 수행하였다.
스테아린산 3.2kg을 에탄올 14kg과 염화메틸렌 7kg을 혼합한 혼합용제에 녹여 3차 코팅액을 준비한 다음 앞서 2차 코팅이 완료된 과립을 유동층코팅기에서 유동시키면서 3차 코팅액을 분사하여 3차 코팅을 수행하였다.
3차 코팅이 완료된 과립은 선별기를 이용하여 선별하였고 최종적으로 판크레아틴장용과립 약 100kg을 수득하였다(표 2 참조).
원료 생산설비 공정
판크레아틴 69.22kg히드록시프로필셀룰로오스 6.28kg이소프로판올 15.7kg염화메틸렌 3.14kg정제수 7.85kg 리본믹서 연합
제립기 제립
유동층건조기 건조
분쇄기 분쇄
선별기 선별
히드록시프로필메틸셀룰로오스 2.1kg폴리에틸렌글리콜6000 0.2kg에탄올 30kg염화메틸렌 14kg 유동층코팅기 코팅(1차)
히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트 18kg폴리에틸렌글리콜 1kg에탄올 252kg염화메틸렌 108kg 유동층코팅기 코팅(2차)
스테아린산 3.2kg에탄올 14kg염화메틸렌 7kg 유동층코팅기 코팅(3차)
선별기 선별
판크레아틴 장용과립 제품: 100kg±5kg
실험예 1. 차아염소산나트륨의 농도별 살균효과 및 효소활성 분석
1-1. 시료 준비
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 판크레아틴을 제조하되, 차아염소산나트륨의 농도를 달리하여 판크레아틴을 제조하였다. 차아염소산나트륨의 농도는 각각 0.2ng/㎖, 0.05㎍/㎖, 0.128㎍/㎖, 0.64㎍/㎖, 3.2㎍/㎖, 8㎍/㎖, 16㎍/㎖, 80㎍/㎖, 400㎍/㎖, 2,000㎍/㎖이 되도록 첨가하였다.
이렇게 제조된 각각의 판크레아틴 샘플을 채취하여 시료로 사용하였고, 대조군으로는 차아염소산나트륨을 첨가하지 않은 것을 사용하였다.
1-2. 살균효과 분석
상기 실험예 1-1의 시료를 정제수를 이용하여 적정농도로 계단희석한 다음 LB 한천배지에 도말하고 37℃에서 24시간 이상 배양하여 생성된 균의 집락수를 측정하였다.
1-3. 효소활성 분석
상기 실험예 1-1의 시료를 대상으로 대한약전의 소화력시험법 리파제, 아밀라아제 및 프로테아제의 각 항에 따라 시험하여 각 효소에 대한 활성을 평가하였다.
1-4. 실험결과
이의 결과, 도 1에서와 같이 차아염소산나트륨의 농도가 0.05㎍/㎖만 되더라도 70% 정도의 미생물 사멸효과를 나타내며, 0.128㎍/㎖부터는 거의 대부분의 미생물이 사멸하는 것으로 나타났다. 그리고 효소활성은 8㎍/㎖까지는 리파제, 아밀라아제 및 프로테아제 모두 80% 이상의 활성을 나타내었으며, 16㎍/㎖에서 아밀라아제의 활성이 50%까지 감소하는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 바탕으로 판크레아틴의 살균을 위해 0.05 ~ 16㎍/㎖의 농도로 차아염소산나트륨을 사용할 수 있으며, 0.128 ~ 8㎍/㎖의 농도가 효과적일 것으로 판단된다.
실험예 2. 차아염소산나트륨의 시간별 살균효과 및 효소활성 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 판크레아틴을 제조하되, 차아염소산나트륨의 농도를 각각 0.128㎍/㎖, 8㎍/㎖, 16㎍/㎖로 고정하고 차아염소산나트륨의 반응시간을 각각 1분, 5분, 15분, 30분, 60분, 120분, 240분으로 달리하여 판크레아틴을 제조하였다.
이렇게 제조된 각각의 판크레아틴 샘플을 시료로 사용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 살균효과 및 효소활성을 분석하였다.
이의 결과, 도 2 내지 4에서와 같이 차아염소산나트륨의 농도가 상대적으로 낮은 0.128㎍/㎖의 경우에도 1분의 반응시간만으로 80% 이상의 미생물 사멸효과를 나타내며, 차아염소산나트륨의 농도가 상대적으로 높은 16㎍/㎖의 경우 반응시간 240분까지도 비록 아밀라아제의 활성이 40% 정도로 낮아지기는 하였지만 리파제의 활성은 약 80%, 프로테아제의 활성은 거의 100%로 유지되는 것으로 나타났다.
따라서 판크레아틴의 살균을 위해 차아염소산나트륨의 반응시간은 1 ~ 240분까지 가능하며, 5 ~ 60분의 반응시간이 효과적일 것으로 판단된다.
본 발명의 판크레아틴의 살균방법 및 판크레아틴 제조방법은 원료의약품, 식품첨가물, 사료첨가제, 세탁세제, 피혁가공 등 산업 전반에 걸쳐서 널리 이용되는 판크레아틴을 생산하는데 적용할 수 있다. 특히 매우 간편한 방법으로 판크레아틴의 활성을 유지하면서 효과적인 살균이 가능하며, 효소활성이 우수하고 미생물 오염으로부터 안전한 우수한 품질의 판크레아틴을 제조할 수 있어 판크레아틴의 대량생산에 매우 용이할 것이다.

Claims (6)

  1. 하나 이상의 용매에 판크레아틴이 분산 또는 용해된 형태의 조성물에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 0.05 내지 16㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 1 내지 240분간 유지하여 살균하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 살균방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 판크레아틴은 돼지 또는 소 유래의 판크레아틴인 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 살균방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    차아염소산나트륨을 0.128 내지 8㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 5 내지 60분간 유지하여 살균하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴의 살균방법.
  4. a) 동물 췌장의 분쇄물과 물을 혼합하고 염화칼슘 및 아세톤을 첨가하고 교반하여 판크레아틴이 분산 또는 용해된 조성물을 수득하는 단계;
    b) 상기 조성물에 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 0.05 내지 16㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 1 내지 240분간 유지하는 단계;
    c) 상기 차아염소산나트륨이 첨가된 조성물에 아세톤을 첨가하여 교반하고 고액분리하여 고형물을 수득하는 단계;
    d) 상기 고형물을 아세톤으로 세척하는 단계; 및
    e) 상기 세척된 고형물을 건조시키는 단계;를 포함하는 판크레아틴 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 동물은 돼지 또는 소인 것을 특징으로 하는 판크레아틴 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 b)단계는 차아염소산나트륨을 0.128 내지 8㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가하고 5 내지 60분간 유지하는 것을 특징으로 하는 판크레아틴 제조방법.
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