WO2017204510A1 - C-메틸로테노이드계 화합물을 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

C-메틸로테노이드계 화합물을 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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boerabinone
sepsis
compound
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송경식
배종섭
이태호
양은주
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경북대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to C -methyltenenoid compounds and their use. More specifically, as a novel compound showing inhibitory activity of various inflammatory reactions mediated by the HMGB1 protein, a C -methyltenenoid compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof are provided and are contained as an active ingredient. It relates to a pharmaceutical composition for prophylaxis or treatment.
  • Sepsis is a systemic symptom associated with chills caused by microorganisms or toxins produced by microorganisms such as Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus, Staphylococcus aureus, and pneumococcus, along with chills. Say the state that appears. If these symptoms worsen, it is accompanied by hypotension, decreased urine volume, and septic shock.
  • TNF- ⁇ , IL-6 which mediates or promotes inflammatory response for the treatment of sepsis based on the treatment of sepsis with conventional antibiotics or the overactivation of the inflammatory system during the onset of early sepsis, a clinically important characteristic
  • mediators such as IL-1
  • HMGB1 High mobility group box 1
  • HMGB1 High mobility group box 1
  • HMGB1 High mobility group box 1
  • Cells that secrete HMGB1 include monocytes, macrophages, and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), and when HMGB1 is activated and secreted, it causes severe vasculitis, sepsis and death. This leads to.
  • HMGB1 binds to receptor for advanced glycation end products (RAGE) or pattern receptors (TLR2, TLR4) to induce the expression of adhesion molecules (VCAM-1, ICAM-1, E-selectin) on endothelial cells.
  • RAGE advanced glycation end products
  • TLR2, TLR4 pattern receptors
  • VCAM-1, ICAM-1, E-selectin adhesion molecules
  • Inflammatory responses in endothelial cells are initiated by HMGB1, increasing the secretion of TNF, IL-6 and inducing phosphorylation of NF-kB, ERK-1, ERK-2.
  • HMGB1 is detected in the serum of sepsis patients and that serum levels of HMGB1 are greatly increased in patients with poor prognosis. It is also known that an increase in HMGB1 concentration in plasma of patients with severe sepsis is highly likely to die. Therefore, HMGB1 is a target molecule for the prevention or treatment of sepsis or other vascular diseases.
  • Abronia nana is an uneconomic ornamental plant belonging to the Asteraceae family and is known to grow in the deserts of North America.
  • isoflavone-based compounds have been reported as constituents of plants of the genus Avronia, and C -methyltenoid compounds and their physiological activities have been studied, but HMGB1 or intestine has been studied.
  • the inhibitory effect on sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP) surgery is unknown.
  • the present invention has been made to solve the above problems, the inventors of the present invention while devoted to the research on the development of a material having an inhibitory effect on the HMGB1 induced sepsis response, C- methyltenenoid new compounds to HMGB1 It was confirmed that it can suppress the induced septic reaction, and based on this, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a compound represented by the following formula (1), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of vascular diseases comprising the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound may be separated from Abronia nana .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vasculitis diseases, containing the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the composition may inhibit the proinflammatory response of HMGB1 (High mobility group box 1) mediated.
  • the vascular disease may be sepsis or septic shock.
  • the present invention provides a method for preventing or treating vascular disease, comprising administering the composition to a subject.
  • the present invention provides a use of the composition for the prevention or treatment of vascular diseases.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases according to the present invention includes the compound represented by Formula 1 as an active ingredient, and specifically confirmed the effect of inhibiting the pro-inflammatory response induced by HMGB1 through the compound. Accordingly, the present invention is expected to be applicable as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of vascular diseases such as sepsis and septic shock.
  • Figure 1 shows the chemical structural formula of the C -methyltenenoid compound represented by the formula (1).
  • Figure 2 shows the results of analyzing the effect of the C- methyltenenoid compound on HMGB1 secretion and receptor expression.
  • Methyl Rotterdam cannabinoid type B and the effects of the compound, 2 degree C for HMGB1 secretion from CLP- induced sepsis mouse model-methyl Rotterdam effect of cannabinoid-based compounds C to Fig LPS- mediated HMGB1 secretion from HUVECs A is a 2 and, C of Figure 2 is C in HUVECs - will verify the effect on the expression of the methyl Rotterdam cannabinoid compound HMGB1 receptors (TLR2, TLR4 and RAGE), D in Figure 2 is C - methyl Rotterdam cannabinoid-based compounds HUVEC cells Toxicity is the result of evaluation.
  • Figure 3 is the result of analyzing the effect of the C- methyltenenoid compound on HMGB1-mediated permeability.
  • 3A and 3B show the effect of C -methyltenenoid compounds on barrier destruction by HMGB1 in HUVECs.
  • FIG. 3C shows the results of evaluation of HMGB1-mediated vascular permeability in mice in vivo .
  • D confirms the effect of the C -methyltenenoid compound on the expression of HMGB1-mediated phosphorylation p38.
  • FIG. 4 shows the results of analyzing the effect of the C- methyltenenoid compounds on HMGB1-mediated pre-inflammatory reaction.
  • FIG. 4A is the effect of C -methyltenoid-based compounds on the expression of CAM induced by HMGB1, and B, C and D in FIG. 4 are C -on the adhesion and migration of cells through activated HUVECs, respectively. It is the effect of the methyltenenoid compound, and Figure 4E confirms the effect of the C- methyltenenoid compound on HMGB1-induced leukocyte migration in the mouse model.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the effect of C -methyltenenoid compounds on the production of HMGB1-mediated TNF- ⁇ / IL-6 and the activation of NF- ⁇ B / ERK.
  • FIG. 5A shows the effect on TNF- ⁇ production
  • FIG. 5B shows the effect on IL-6 production
  • FIG. 5C shows the effect on NF- ⁇ B activation
  • FIG. 5D shows ERK.
  • 5E confirms the effect of migration of NF- ⁇ B p65 to the nucleus in HUVECs by immunofluorescence staining.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing the effect of C -methyltenenoid compounds on survival in CLP-induced sepsis mouse model.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid are useful.
  • Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. Obtained from non-toxic organic acids such as dioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • Such pharmaceutically nontoxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, and iodide.
  • the acid addition salts according to the present invention can be dissolved in conventional methods, for example, by dissolving a compound represented by the formula (1) in an excess of an aqueous solution of an acid, which salt is a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. It can be prepared by precipitation using. It may also be prepared by evaporating the solvent or excess acid from the mixture and then drying or by suction filtration of the precipitated salt.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving the compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt as the metal salt.
  • the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable negative salt (eg silver nitrate).
  • the compounds of the present invention include all salts, isomers, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods, as well as pharmaceutically acceptable salts.
  • the compound represented by the formula (1) can be used to identify and isolate from natural products, for example, Abronia ( Abronia nana ), it is apparent to those skilled in the art that the chemically synthesized shows the same effect as that extracted Do.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vasculitis diseases, containing the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of vascular diseases by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment means any action that improves or beneficially changes the symptoms for vascular diseases by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • vascular inflammation disease refers to the inflammation of the blood vessel walls caused by various causes, the blood vessels are narrowed or destroyed due to the effects thereof, and in severe cases, the blood supply to the tissues is not good and causes damage to the tissues.
  • Vascular inflammatory diseases that can be prevented or treated by the composition according to the present invention may be sepsis, septic shock, arteriosclerosis, diabetes and vasculitis, and the like, preferably sepsis or septic shock, but are not limited thereto. It is not.
  • C -methyltenenoid compounds were isolated from Abronia nana (see Example 2), HMGB1 secretion, HMGB1 receptor expression, HMGB1-mediated permeability, HMGB1-mediated pre-inflammatory
  • the effects of C -methyltenenoid-based compounds on HMGB1-mediated vascular barrier destruction reactions, such as the response, the production of HMGB1-mediated TNF- ⁇ / IL-6, and the activation of NF- ⁇ B / ERK were confirmed in vitro .
  • survival in the CLP-induced sepsis mouse model was further confirmed in vivo through experiments.
  • C -methyltenoid-based compounds inhibit the secretion of LPS and CLP-mediated HMGB1, inhibit HMGB1 receptor (TLR2 and TLR4) expression, and increase HMGB1-mediated barrier destruction through increased barrier integrity and inhibition of CAM expression. It can be seen that it suppresses.
  • C -methyltenenoid-based compounds reduced monocyte adhesion and migration to HUVECs, and this barrier protection effect was confirmed in mouse models (see Examples 3-7).
  • composition containing the C -methyltenenoid compound according to the present invention can be used as an effective treatment for severe vascular inflammatory diseases such as sepsis and septic shock.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose , Polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • it may further include a lubricant, wetting agent, sweetener, flavoring agent, emulsifier, suspending agent, preservative and the like.
  • compositions of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is determined by the condition and weight of the patient, Depending on the extent, drug form, route of administration, and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • composition according to the invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the type, severity, and activity of the patient's disease. , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts.
  • the composition according to the present invention may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex and weight of the patient, and generally 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per 1 kg of body weight is administered daily or every other day or 1 to 1 day. It can be divided into three doses. However, the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a method for the treatment of vascular diseases comprising administering the pharmaceutical composition to the subject.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle, etc. Mean mammal.
  • mice In order to induce a sepsis animal model for this study, sepsis was induced in mice using a CLP operation (Cecal Ligation and Puncture operation). More specifically, 6-7 week old male C57BL / 6 mice (Orient Bio (Orient Bio Co., Seongnam, Gyeonggi-do, Korea)) were purchased and acclimated in the laboratory for 12 days, and used for 2% isoflurane (Isoflurane).
  • CLP operation Cal Ligation and Puncture operation
  • mice After anesthesia, the mouse was incised 2 cm long in the abdomen to induce a sepsis model, exposing the cecum and nearby intestines, followed by a strong tying of the cecum 5 mm from the end of the cecum with a 3.0-silk suture, 22
  • the catheter was gently squeezed out, leaking a small amount of feces (intestinal digest) through the perforation site, exposing it to the abdominal cavity, and closing the open abdominal region with a 4.0-silk suture.
  • the sutured mice were used, and the positive control group was treated with saline, and each mouse was exposed to septic symptoms 24 hours after CLP surgery. It was characterized by shivering, bristled hair, or weakness, etc.
  • the survival of mice was 6 hours after CLP surgery according to Kaplan-Meire survival analysis. It was confirmed after 132 hours.
  • Vascular endothelial cells (HUVECs) for HMGB1 detection were purchased from Cambrex Bio Science (Charles City, IA) and used and cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture medium used Endothelial basal medium (EBM-2) containing growth supplements, and all experiments were performed using 3 to 5 generation cells.
  • Human neutrophils were collected from 5 healthy volunteers by venipuncture and 15 ml of blood each.
  • HMGB1 secreted from HUVECs 100 ng / ml LPS (lipopolysaccharide) was treated for 16 hours in cultured HUVECs, followed by 0-2 ⁇ M Boerabinone X. After 6 hours, the culture was collected and used for the experiment in the HMGB1 detection ELISA (compeptive enzyme-linked immunosorbent assay).
  • HMGB1 protein was coated and reacted overnight at 4 ° C. Thereafter, the plate was washed three times with PBS-T (PBS-0.05% Tween 20) and stored at 4 ° C.
  • PBS-T PBS-0.05% Tween 20
  • the lyophilized culture was pre-reacted with HMGB1 antibody (diluted 1: 1000 in PBS-T) for 90 minutes at 37 ° C in a 96-well round bottom microtiter plate, and transferred to a plate coated with HMGB1 protein for 30 minutes at room temperature. I was. Afterwards, the plate was washed three times with PBS-T again, and reacted with peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody (diluted 1: 2000 in PBS-T) for 90 minutes at room temperature.
  • the active compound is prepared from an Abroonia suspension culture [A ⁇ -secretase (BACE1) -inhibiting C -methylrotenoid induced by yeast elicitation in Abronia nana. suspension cultures. Appl Biochem Biotechnol 172, 3529-3537, 2014] according to the method of induction and suspension culture of the abroonia cell mass (callus) was carried out. Cells cultured for 24 hours after the induction of the inducer (elicitor) was extracted using 4 liters of methanol, the extraction solvent methanol was removed using a vacuum condenser.
  • Abroonia suspension culture [A ⁇ -secretase (BACE1) -inhibiting C -methylrotenoid induced by yeast elicitation in Abronia nana. suspension cultures. Appl Biochem Biotechnol 172, 3529-3537, 2014] according to the method of induction and suspension culture of the abroonia cell mass (callus) was carried out. Cells cultured
  • the hydrogen signal of ⁇ H 2.07 correlates with the carbon signal of ⁇ C 8.50, ⁇ H 3.19 is ⁇ C 56.6, ⁇ H 3.58 is ⁇ C 57.0, ⁇ H 5.90 is ⁇ C 96.5, It was confirmed that ⁇ H 6.30 is ⁇ C 90.9, ⁇ H 6.83 is ⁇ C 112.0, ⁇ H 6.94 is ⁇ C 106.3, and ⁇ H 8.89 has a correlation with ⁇ C 129.5.
  • H-1 of ⁇ H 8.89 correlated with ⁇ C 151.8 (C-4a) and ⁇ C 161.2 (C-3) to determine the position of the hydroxyl group of the A ring.
  • the position of C-4a was determined by confirming the correlation with the acetal hydrogen of H-1 and H-6 ( ⁇ H 5.90) at the same time.
  • the methoxyl groups of ⁇ H 3.19 and ⁇ C 56.6 were positioned by the interaction with the acetal hydrogen of H-6.
  • ⁇ H 3.58 and ⁇ C 56.6 which are other methoxyl groups, bind to C-9 as ⁇ H 3.58 correlates with C-9 ( ⁇ C 164.7).
  • the compound 1 was found to be log ⁇ 260 .5 nm , 4.2 on the UV spectrum, was expected to have a structure of C 19 H 17 O 7 .
  • HR-FABMS measurement showed that the molecular ion peak [M + H] + was observed at 357.0974 m / z, showing a value similar to the expected molecular weight of 357.1991.
  • the compound 1 is [3,11-dihydroxy-6,9-dimethoxy-10-methyl [1] benzo-pyrano [3,4-b] [1] benzopyran-12 represented by the following formula (1): (6H) -one] to obtain a C- methyltenenoid-based compound was named Boerabinone X.
  • HMGB1 secreted from HUVECs 100 ng / ml LPS (lipopolysaccharide) was treated for 16 hours in cultured HUVECs, followed by 0-2 ⁇ M Boerabinone X. After 6 hours, the culture was collected and used for the experiment in the HMGB1 detection ELISA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay).
  • HMGB1 secretion was confirmed using a CLP-induced sepsis mouse model very similar to human sepsis.
  • HMGB1 receptors TLR2, TLR4 and RAGE
  • Boerabinone X was treated according to the concentration interval (0 to 2 ⁇ M). After 6 hours, the culture solution was removed and the cells were washed with phosphate buffer solution and fixed for 15 minutes at room temperature using 50 ⁇ L of 1% paraformaldehyde. The cells were washed again and then treated with 100 ⁇ L of mouse anti-human monoclone antibodies (A-9, H-80 and A-9) at 37 ° C. and washed three times.
  • Boerabinone X To assess the cytotoxicity of Boerabinone X, cells were passaged at a density of 5 x 10 3 cells / well in 96-well plates, replaced with new cultures after 24 hours, and then 1 The treatment was performed at concentration ranges up to 20 ⁇ M. After 48 hours, cells were washed once and reacted for 4 hours by adding 100 ⁇ L of 1 mg / mL MTT (Microculture tetrazolium) solution. Thereafter, 150 ⁇ L DMSO (dimethyl sulfoxide) was treated to dissolve formazan in salt form produced by living cells, and absorbance was measured at 540 nm.
  • MTT Microculture tetrazolium
  • Boerabinone X is not determined to show cytotoxicity to HUVECs in the treatment concentration.
  • Permeability assay was performed to investigate the effect of Boeravinon X on the barrier integrity of HUVECs.
  • spectrophotometry of the degree of permeation of albumin-bound Evans blue solution with albumin-bound HUVECs cells Measured by. More specifically, first, HUVECs were cultured for 3 days by passage at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well in a 12 mm diameter transwell having a 3 ⁇ m pore size. Cultured HUVECs were treated with 1 ⁇ g / mL HMGB1 for 16 hours, followed by Boerabinone X for 6 hours.
  • HMGB1 mediated vascular permeability was evaluated in mice. More specifically, male mice were anesthetized with 2% isoflurane using a small rodent gas anesthesia machine. During the experiment, the mouse was allowed to inhale anesthesia gas to maintain anesthesia. Inject 2 ⁇ g of HMGB1 per mouse intravenously, after 16 hours of treatment with Boerabinone X (0.72, 1.08 and 1.44 ⁇ g / mouse) for 6 hours, then use a 1% Evans Blue solution diluted in phosphate buffer solution intravenously. Injection.
  • mice were sacrificed, the abdominal cavity was washed with 5 mL saline, peritoneal exudate was collected, and centrifuged at 200 x g for 10 minutes. The absorbance of the supernatant was measured at 650 nm. Vascular permeability was expressed as “ ⁇ g dye / mouse” infiltrated into the abdominal cavity, which was calculated by a standard curve prepared according to previous reports (Polyphosphate elicits proinflammatory responses that are counteracted by activated protein C in both cellular and animal models.Journal of Thrombosis and Haemostasis 10, 1145-1151, 2012).
  • HMGB1 Since HMGB1 is known to induce a pro-inflammatory response by promoting the phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), it is pre-cultured with Boerabinone X and then activated with HMGB1 to raise the level of phosphorylated p38 MAPK. Quantification using the kit.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • HMGB1 induces expression of cell adhesion molecules (CAM) such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (IMC-1) and E-selectin on the surface of HUVECs, resulting in HUVECs It is known to mediate the inflammatory response by promoting the migration of white blood cells to the site of inflammation. Therefore, protein expression was analyzed by whole-cell ELISA to determine whether Boerabinone X inhibits the expression of HMGB1-mediated CAM.
  • CAM cell adhesion molecules
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
  • IMC-1 intercellular adhesion molecule-1
  • E-selectin E-selectin
  • the cultured HUVECs were treated with 1 ⁇ g / mL HMGB1 for 16 hours, and then Boerabinone X was treated according to the concentration interval (0-2 ⁇ M). After 6 hours, the culture solution was removed and the cells were washed with phosphate buffer solution and fixed for 15 minutes at room temperature using 50 ⁇ L of 1% paraformaldehyde. The cells were washed again and treated with 100 ⁇ L of mouse anti-human monoclone antibodies (vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (IMC-1) and E-selectin) at 37 ° C, respectively. , Repeated washing three times.
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
  • IMC-1 intercellular adhesion molecule-1
  • E-selectin E-selectin
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
  • IMC-1 intercellular adhesion molecule-1
  • E-selectin was significant by Boerabinone X. Appeared to decrease. This effect may be due to the HMGB1 mechanism of Boerabinone X.
  • HUVECs of 6 ⁇ 10 4 cells / well were passaged in transwells (6.5 mm diameter, pore size 8 ⁇ m) and incubated for 3 days to form single cell layers.
  • Cultured HUVECs were treated with 1 ⁇ g / mL HMGB1 (16 hours) and Boerabinone X (6 hours), respectively, before treating monocytes in the upper chamber.
  • Mononuclear leukocytes in the upper chamber and cells remaining at the top of the filter were removed and mononuclear leukocytes moved to the bottom of the filter were fixed with 8% glutaraldehyde. The cells were then stained with 0.25% crystal violet diluted in 20% methanol. All experiments were repeated two times, and nine wells of high power microscopic fields (HPF, 200 ⁇ ) randomly selected for each well were counted and expressed as a cell migration index.
  • HPF high power microscopic fields
  • HMGB1 induced leukocyte migration was examined in mice. More specifically, 20 ⁇ L of peritoneal exudate collected for neutrophil cell migration was mixed with 0.38 mL Turk's solution [0.01% crystal violet diluted in 3% acetic acid solution], and then the number of cells was measured through an optical microscope. It was.
  • Tumor necrosis factor- ⁇ , interleukin-6 and NF- ⁇ B and ERK1 / 2, which are proinflammatory factors induced by HMGB1, were confirmed to be affected by Boerabinone X. Specifically, the concentrations of tumor necrosis factor- ⁇ and interleukin-6 in cell culture supernatants were determined using ELISA kits (R & D Systems, Minneapolis, MN).
  • Boerabinone X regulates the most important signals associated with the induction of pro-inflammatory responses in human endothelial cells.
  • HMGB1 is known to activate NF- ⁇ B and ERK1 / 2 in vascular inflammatory responses. Therefore, in this example, the effect of Boerabinone X on the activation of NF- ⁇ B and ERK1 / 2 by HMGB1 was evaluated. More specifically, total and phosphorylated p65 NF- ⁇ B (# 7174, # 7173, Cell signaling Technology, Danvers, MA) for nuclear lysates and total and phosphorylated ERK1 / 2 (R & D Systems, Minneapolis, MN) was also measured using an ELISA kit.
  • Boerabinone X significantly affected various proinflammatory reactions. It can be judged that it can be suppressed.
  • HMGB1 migrates intracellular NF- ⁇ B p65 into the cell nucleus. Whether Boerabinone X inhibits this migration effect was evaluated using immunofluorescene staining.
  • HUVECs were incubated for 48 hours in cover glass coated with 0.05% poly-L-lysine. Thereafter, 1 ⁇ g / mL HMGB1 was treated for 1 hour, and Boerabinone X was not pretreated for 6 hours or no compound was treated. After compound treatment, 4% formaldehyde was treated and cells were fixed at room temperature for 15 minutes.
  • Triton X-100 Triton X-100
  • BSA bovine serum albumin
  • Inflammatory responses are an important factor in the development of vascular wounds and endothelial disorders are associated with leukocyte aggregation, especially during vascular inflammatory lesions.
  • Tumor necrosis factor- ⁇ and NF- ⁇ B are important mediators of vascular inflammatory responses, and NF- ⁇ B is a well-known pro-inflammatory transcription factor that activates in response to pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor- ⁇ and IL-1 ⁇ . do. Inhibition of the NF- ⁇ B signaling pathway results in a vasoprotective effect, which delays or prevents the development of vascular disease.
  • Boerabinone X inhibits the production of inflammatory mediators and NF. Inhibition of the - ⁇ B pathway has an anti-inflammatory effect.
  • Boerabinone X is expected to reduce mortality in the CLP-induced sepsis mouse model, it has a poor prognosis when associated with organ abnormalities, hypoperfusion or hypotension. Mortality was assessed by administering Boerabinone X after induction of sepsis.
  • the slides were again deparaffinized in an oven at 60 ° C. and then stained with hematoxylin after rehydration. Unstained hematoxylin was quickly submerged in 0.3% acid alcohol and counterstained with eosin. At this time, extra eosin was removed using ethanol series and xylene, and the cover glass was put on the slide. Analysis of lung tissue specimens by light microscopy can observe tissue structure, edema and infiltration of inflammatory cells. The results were divided into the following four steps.
  • Stage 3 moderate neutrophil infiltration, perivascular edema formation and partial destruction of lung tissue structure
  • the mouse survival was not changed after 1.44 ⁇ g / mouse Boerabinone X 12 hours after CLP surgery, but twice after 12 hours and 50 hours after surgery. Dosage increased over 40% to 60%.
  • Boerabinone X may be an important target for the treatment of sepsis and septic shock by HMGB1 secretion and inhibition of HMGB1-mediated inflammatory responses.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases according to the present invention includes a compound represented by Formula 1 as an active ingredient, and specifically confirmed the effect of inhibiting the pro-inflammatory response induced by HMGB1 through the compound. Accordingly, the present invention can be used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of vascular inflammatory diseases such as sepsis and septic shock, and the composition is expected to be used as a method for preventing or treating vascular inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명은 HMGB1으로 유도된 전염증 반응 억제하는 C-메틸로테노이드 화합물을 함유하는 혈관염증질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 C-메틸로테노이드 화합물을 통해 HMGB1으로 유도된 전염증 반응 억제를 구체적으로 확인하였는바, 본 발명은 패혈증 및 패혈성 쇼크와 같은 혈관염증질환의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

C-메틸로테노이드계 화합물을 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 C-메틸로테노이드 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, HMGB1 단백질이 매개하는 각종 염증반응의 억제 활성을 보인 신규 화합물로서, C-메틸로테노이드 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공하고, 이를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
패혈증(sepsis, 敗血症)은 녹농균, 대장균, 연쇄상구균, 포도상구균, 폐렴균 같은 미생물에 감염되었을 때 미생물이나 그 미생물이 생산한 독소에 의해 오한과 함께 고열, 관절통, 두통, 권태감 등의 전신적인 증상이 나타나는 상태를 말한다. 이러한 증상이 심해지면 저혈압이 동반되고 소변량이 줄며 패혈성 쇼크가 나타나기도 한다. 종래 항생제를 이용한 종래 항생제를 이용한 패혈증 치료법이나, 임상적 주요 특성인 초기 패혈증상의 발현시의 염증계의 과활성화를 바탕으로 패혈증의 치료를 위하여 염증반응을 매개하거나 촉진하는 TNF-α, IL-6, IL-1과 같은 매개체를 억제하려는 수많은 시도가 있으나 현재까지 환자의 생존율을 크게 개선하지 못하고 있는 실정이다.
한편, HMGB1(High mobility group box 1)은 상시 발현되는 핵단백질로서, 조직 손상이 일어나는 괴저 세포 및 주변 세포로부터 분비된다. 세포외 HMGB1에 대한 수용체(receptor)는 한가지 이상 존재하며, 수용체 시그널링에 의해 세포 분열, 세포 이동을 유발하며, 염증을 활성화하고, 면역반응을 개시한다. HMGB1를 분비하는 세포로는 단구세포(monocyte), 대식세포(macrophage), 인간탯줄정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)가 있으며, HMGB1가 활성화되고 분비되면 중증 혈관염증, 패혈증 및 사망에까지 이르게 된다.
HMGB1은 RAGE(Receptor for Advanced Glycation End products) 또는 패턴인식수용체(TLR2, TLR4)에 결합하여 내피세포상의 adhesion 분자(VCAM-1, ICAM-1, E-selectin)의 발현을 유도한다. 내피세포에서의 염증반응은 HMGB1에 의해 개시되어, TNF, IL-6의 분비를 증가시키고, NF-kB, ERK-1, ERK-2의 인산화를 유도한다.
패혈증 환자의 혈청에서 HMGB1이 검출되고, 나쁜 예후를 가진 환자에서 HMGB1의 혈청 수준이 매우 증가된다는 것이 알려져 있다. 또한, 중증 패혈증 환자의 혈장에서 HMGB1의 농도가 증가하면 사망할 가능성이 높다는 것이 알려져 있다. 따라서, HMGB1은 패혈증이나 다른 혈관염증질환의 예방 또는 치료를 위한 타겟분자이다.
종래, FDA가 승인한 유일한 패혈증 치료제인 자이그리스(Xigris)(Eli Lilly)가 효능이 없는 것으로 판명되어 2011년 시장에서 퇴출된 이후로, 현재 승인받은 중증 패혈증 치료제는 없는 상태이다. 따라서, 패혈증 치료약물의 개발은 임상적으로 상당한 의의를 가지며 치료제의 시장성도 매우 크다고 할 수 있다. 이에, 패혈증을 치료하기 위해 HMGB1을 표적으로 하여 천연식물로부터 단일 화합물을 추출하고자 하는 시도가 있어왔다.
아브로니아(Abronia nana)는 분꽃과에 속하는 비경제성 관상용 식물로서, 북미 사막지역에서 자생하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 아브로니아 속 식물의 구성성분으로는 현재까지 수 종의 이소플라본(isoflavone) 계열 화합물만이 보고되어 있는 실정이며, C-메틸로테노이드 화합물 및 그들의 생리활성에 관한 연구도 이뤄져 왔으나 HMGB1 혹은 장관천공(cecal ligation and puncture; CLP) 수술법으로 유도된 패혈증에 대한 억제효능은 알려진 바 없다.
따라서, HMGB1으로 유도된 패혈 반응에 대한 억제 효능을 갖는 천연식물자원으로부터의 새로운 소재의 연구가 진행되고 있으나(한국등록특허 10-1188581), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 HMGB1로 유도된 패혈 반응에 대한 억제 효능을 갖는 소재 개발에 대한 연구에 몰두하던 중, C-메틸로테노이드 신규 화합물이 HMGB1로 유도된 패혈 반응을 억제 시킬 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017005286-appb-I000001
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 유효성분으로 함유하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017005286-appb-I000002
본 발명의 일 구현예로, 상기 화합물은 아브로니아(Abronia nana) 로부터 분리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 유효성분으로 함유하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 HMGB1(High mobility group box 1) 매개의 전염증 반응을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 혈관염증질환은 패혈증 또는 패혈성 쇼크일 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물의 혈관염증질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하며, 상기 화합물을 통해 HMGB1으로 유도된 전염증 반응 억제 효과를 구체적으로 확인하였다. 이에, 본 발명은 패혈증 및 패혈성 쇼크와 같은 혈관염증질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 화학식 1로 표시되는 C-메틸로테노이드계 화합물의 화학구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 HMGB1 분비 및 수용체 발현에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과를 분석한 결과이다. 도 2의 A는 HUVECs에서 LPS-매개 HMGB1 분비에 대한 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과이고, 도 2의 B는 CLP-유도 패혈증 마우스 모델에서 HMGB1 분비에 대한 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과이고, 도 2의 C는 HUVECs에서 C-메틸로테노이드계 화합물이 HMGB1 수용체(TLR2, TLR4 및 RAGE)의 발현에 미치는 효과를 확인한 것이고, 도 2의 D는 C-메틸로테노이드계 화합물의 HUVEC 세포독성을 평가한 결과이다.
도 3은 HMGB1-매개 투과성에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과를 분석한 결과이다. 도 3의 A 및 B는 HUVECs에서 HMGB1에 의한 장벽 파괴에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과이고, 도 3의 C는 in vivo 마우스에서 HMGB1-매개 혈관 투과성을 평가한 결과이고, 도 3의 D는 HMGB1-매개 인산화 p38의 발현에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과를 확인한 것이다.
도 4는 HMGB1-매개 전-염증반응에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과를 분석한 결과이다. 도 4의 A는 HMGB1에 의해 유도된 CAM의 발현에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과이고, 도 4의 B, C 및 D는 각각 활성화된 HUVECs를 통한 세포의 부착 및 이동에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과이고, 도 4의 E는 마우스 모델에서 HMGB1-유도의 백혈구 이동에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과를 확인한 것이다.
도 5는 HMGB1-매개 TNF-α/IL-6의 생성 및 NF-κB/ERK의 활성화에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과를 분석한 결과이다. 도 5의 A는 TNF-α의 생성에 미치는 효과를, 도 5의 B는 IL-6의 생성에 미치는 효과를, 도 5의 C는 NF-κB 활성화에 미치는 효과를, 도 5의 D는 ERK의 활성화에 미치는 효과를, 도 5의 E는 HUVECs에서 NF-κB p65의 핵으로의 이동 효과를 면역형광염색법으로 확인한 것이다.
도 6은 CLP-유도 패혈증 마우스 모델에서 생존율에 미치는 C-메틸로테노이드계 화합물의 효과를 분석한 결과이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017005286-appb-I000003
본 발명의 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다.
본 발명에서 사용되는 용어 “염”은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
또한, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 천연물, 예를 들어, 아브로니아(Abronia nana)로부터 분리 동정한 것을 사용할 수 있으나, 화학적으로 합성된 것도 추출된 것과 동일한 효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 유효성분으로 함유하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관염증질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관염증질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 “혈관염증질환”은 여러 가지 원인에 의해서 혈관벽에 염증이 발생하여 그 영향으로 혈관이 좁아지거나 파괴되고, 심할 경우에는 조직에 혈액 공급이 잘 되지 않아 조직의 손상을 일으키는 것을 말하며, 본 발명에 따른 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 혈관염증질환으로는 패혈증, 패혈성 쇼크, 동맥경화증, 당뇨병 및 혈관염 등일 수 있으며, 바람직하게는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 아브로니아(Abronia nana)로부터 C-메틸로테노이드계 화합물을 분리하였으며(실시예 2 참조), HMGB1 분비, HMGB1 수용체 발현, HMGB1-매개 투과성, HMGB1-매개 전-염증반응, HMGB1-매개 TNF-α/IL-6의 생성 및 NF-κB/ERK의 활성화와 같은 HMGB1-매개 혈관 장벽 파괴 반응에 대해 C-메틸로테노이드계 화합물이 미치는 효과를 in vitro상으로 확인하였을 뿐만 아니라, CLP-유도 패혈증 마우스 모델에서 생존율을 실험을 통하여 in vivo상으로도 더욱 확인하였다.
그 결과, C-메틸로테노이드계 화합물이 LPS와 CLP-매개의 HMGB1 분비를 저해하고, HMGB1 수용체(TLR2 및 TLR4) 발현을 억제하고, 장벽 통합성 증가와 CAM 발현 저해를 통하여 HMGB1-매개 장벽 파괴를 억제한다는 것을 알 수 있다. 또한, C-메틸로테노이드계 화합물이 HUVECs로의 단핵구 부착 및 이동을 감소시키고, 마우스 모델에서 이러한 장벽 보호 효과가 확인되었다(실시예 3 내지 7 참조).
따라서, 본 발명에 따른 C-메틸로테노이드계 화합물 함유 조성물은, 패혈증 및 패혈성 쇼크와 같은 중증 혈관 염증 질환에 대한 유효한 치료제로 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관염증질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험방법
1-1. 패혈증 동물 모델 구축
본 연구를 위한 패혈증 동물 모델을 유도하기 위해, 마우스의 맹장을 터트리는 CLP 수술법(Cecal Ligation and Puncture operation)을 이용하여 마우스에 패혈증을 유도하였다. 보다 구체적으로, 6 ~ 7주령의 수컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오 (Orient Bio Co. 경기도 성남, 대한민국)를 구입하여 12일간 실험실에서 순응화한 후 사용하였으며, 2% 이소플루란(Isoflurane)을 사용하여 마우스를 마취시킨 후, 패혈증 모델을 유도하기 위해 배 부위 2cm 길게 절개하여 맹장과 근처의 창자를 노출시켰다. 이 후, 맹장 끝으로부터 5㎜ 부위의 맹장을 3.0-실크 봉합선으로 강하게 묶고, 22-게이지 바늘로 이를 터트렸다. 맹장을 부드럽게 짜 내어 천공 부위를 통해 소량의 배설물(장내 소화물)이 누출되게 하여 복강에 노출시켰으며, 개복부위를 4.0-실크 봉합선으로 봉합하였다. 음성대조군은 단순히 배만 절개하고 다시 봉합한 마우스를 사용하였으며, 양성대조군은 식염수(saline)를 처리하였다. 각 마우스들은 CLP 수술 24시간 후부터 패혈 증상에 노출되었는데, 전율(shivering)이 있거나 털이 곤두서거나(bristled hair) 또는 무기력증(weakness) 등의 특징을 나타냈다. 마우스의 생존은 카플란-마이어의 생존 분석법(Kaplan-Meire survival analysis)에 따라 CLP 수술 6시간 후부터 132시간까지 확인하였다.
1-2. 세포 배양
HMGB1 검출 위한 혈관내피세포(HUVECs)는 Cambrex Bio Science (Charles City, IA)로부터 구입하여 사용하였으며, 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기 내에서 배양하였다. 배양액은 성장 보조인자(growth supplements)가 포함된 Endothelial basal medium(EBM-2)을 사용하였으며, 모든 실험은 3 ~ 5세대의 세포를 사용하여 수행되었다. 사람 호중구(neutrophils)는 5명의 건강한 지원자로부터 정맥천자(venipuncture)를 통해 각각 15㎖의 혈액을 채취하여 사용하였다.
1-3. 경쟁적(Competitive) ELISA
HUVECs에서 분비되는 HMGB1을 정량하기 위해서, 배양된 HUVECs에 100ng/㎖ LPS(lipopolysaccharide)를 16시간 동안 처리한 후, 0 ~ 2μM의 보에라비논 엑스를 처리하였다. 6시간 후, 배양액을 채취하여 HMGB1 검출 ELISA (compeptive enzyme-linked immunosorbent assay)에 실험에 사용하였다.
ELISA를 수행하기 위해 96 웰 플레이트(96-well flat bottom plastic microtiter plates)에 0.02%의 소듐 아자이드(sodium azide)를 포함하는 20mM 카보네이트/바이카보네이트 완충용액(carbonate/bicarbonate buffer, pH 9.6)에 녹인 HMGB1 단백질을 코팅하여 4℃에서 밤을 지새워 반응하였다. 이 후, 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% Tween 20)로 3회 반복 세척하여 4℃에서 보관하였다. 동결건조된 배양액은 96-well round bottom microtiter plate에서 HMGB1 항체(PBS-T에 1:1000 희석)와 37℃에서 90분간 전반응 시키고, 이를 HMGB1 단백질이 코팅되어 있는 plate로 옮겨 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 후, plate는 다시 PBS-T로 3회 반복 세척하였으며, peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG 항체(PBS-T에 1:2000 희석)와 실온에서 90분간 반응시켰다.
PBS-T로 세척된 plate는 60분간 실온의 어두운 곳에서 200μL 기질용액 (100μg/mL O-phenylenediamine과 0.003% H2O2)과 반응시켰다. 다음으로는 50μL의 8N H2SO4으로 모든 반응을 중단시킨 후, 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.
1-4. 통계
모든 실험은 최소한 3회 이상 실시되었으며, 데이터 수치는 평균 ± 표준오차(standard error of the mean; SEM)로 나타내었고, Student's t-test를 실시하였다. 통계학적 분석을 위해 SPSS for Windows, version 16.0 (SPSS, Chicago, IL)을 이용하였으며, 통계학적인 유의성은 p < 0.05 범위에서 판단하였다.
실시예 2. C -메틸로테노이드계 화합물 수득
본 발명에 따른 C-메틸로테노이드계 화합물을 얻기 위해 본 실시예에서는 아브로니아 현탁배양물로부터 활성 화합물을 기존의 문헌 [A β-secretase (BACE1)-inhibiting C-methylrotenoid induced by yeast elicitation in Abronia nana suspension cultures. Appl Biochem Biotechnol 172, 3529-3537, 2014]의 방법 준하여 아브로니아 세포덩어리(callus) 유도 및 현탁 배양을 실시하였다. 유도인자(elicitor) 접종 후 24시간 동안 배양된 세포는 4리터의 메탄올을 사용하여 추출한 후, 추출용매인 메탄올은 감압농축기를 이용하여 제거시켰다. 용매가 제거된 추출물은 500㎖의 물에 분산시켰고, 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 사용하여 2회 반복 분액한 후 감압 농축하였다. 이 후, 얻어진 9.4g의 에틸아세테이트 가용성 분획에 대하여 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) [6 × 60㎝, 노말-헥산(n-hexane) : 에틸아세티에트 = 5:1 ~ 3:1]를 수행하여 총 15개의 분획물을 얻었다. 이 때, 얻어진 열 번째 분획물에 대해 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20) 충진제를 사용한 컬럼 크로마토그래피를 재수행하여 회색의 무정형 고체인 화합물 1(80㎎)을 얻었다.
이 후, 상기 화합물 1의 1H 및 13C-NMR spectra를 측정하였고, 그 결과는 하기와 같다.
① 1H-NMR (500 MHz, pyridine-d 6, δ ppm)
: 13.33 (1H, s, 11-OH), 8.89 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-1), 6.94 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4), 6.83 (1H, dd, J = 8.5 and 2.0 Hz, H-2), 6.30 (1H, s, H-8), 5.90 (1H, s, H-6), 3.58 (3H, s, 9-OMe), 3.19 (3H, s, 6-OMe), 2.07 (3H, s, 10-Me).
② 13C-NMR (125 MHz, pyridine-d 6, δ ppm)
: 181.6 (s, C-12), 164.7 (s, C-9), 161.2 (s, C-3), 160.2 (s, C-11), 156.2 (s, C-7a), 151.8 (s, C-4a), 151.0 (s, C-6a), 129.5 (d, C-1), 123.8 (s, C-1a), 112.1 (s, C-12a), 112.0 (d, C-2), 110.0 (s, C-10), 107.2 (s, C-11a), 106.3 (d, C-4), 96.5 (d, C-6), 90.9 (d, C-8), 57.0 (q, 9-OMe), 56.6 (q, 6-OMe), 8.54 (q, 10-Me).
HR-FABMS (m/z); [M+H]+=357.0974,(calculated for C19H16O7=356.0896).
1H-NMR을 측정한 결과, δ2.07에서 전형적인 C-메틸 그룹(methyl group)의 3H 시그널이 관측되었으며, δ3.19 및 3.58에서 두 개의 메톡실(methoxyl) 그룹의 3H 시그널이 관측되었다. 또한, δ13.33에서 1번 위치에 하이드록실(hydroxyl) 그룹이 존재할 때 카르복실(carboxyl) 그룹과의 수소결합에 의해 저자장으로 이동된 하이드록실 수소가 관측되었으며, δ5.90에서 아세탈 수소(acetal proton)가 확인되었다. 아로마틱 필드(aromatic field)에서 총 4개의 시그널이 관측되었으며, B환의 형성으로 인해 C환의 카르복실기의 비등방성 효과(anisotropic effect)로 인해 저자장으로 이동된 δ8.89의 시그널을 관측하였다. δ6.83의 시그널이 δ8.89와 ortho-coupling을 하고 있으며, δ6.94와 meta-coupling을 하고 있어 3번 위치에 치환기가 있음을 예상하였다.
13C-NMR 스펙트럼에서는 총 19개의 시그널이 관측되었으며, 이 중 δ8.50에서 C-메틸 탄소의 존재를 확인할 수 있었다. 2개의 메틸 탄소가 δ56.6과 57.0에서 관측되었으며, 1개의 아세탈 탄소가 δ96.5에서 관측되었다.
HMQC 분석결과, δH2.07의 수소 시그널은 δC8.50의 탄소 시그널과 상호관계 (correlation)가 있으며, δH3.19는 δC56.6, δH3.58은 δC57.0, δH5.90은 δC96.5, δH6.30은 δC90.9, δH6.83은 δC 112.0, δH6.94는 δC106.3, 그리고 δH8.89는 δC129.5와 상호관계가 있음을 확인하였다.
HMBC 분석결과, δH8.89의 H-1은 δC151.8 (C-4a) 및 δC161.2 (C-3)와 상호관계가 있음을 확인하여 A환의 하이드록실 그룹의 위치를 결정하였다. C-4a의 위치는 H-1 및 H-6 (δH5.90)의 아세탈 수소와 동시에 상호관계가 있음을 확인하여 결정하였다. δH3.19와 δC56.6의 메톡실 그룹은 H-6의 아세탈 수소와의 상호관계를 통해 위치를 결정하였다. D환의 경우에는, 또 다른 메톡실 그룹인 δH3.58과 δC56.6은 δH3.58이 C-9 (δC164.7)과 상호관계가 있음에 따라 C-9과 결합하고 있음을 확인하였다. δH2.07의 C-메틸 수소 시그널은 C-11 (δC160.2) 및 C-9 (δC164.7)과 3 bond 사이의 강한 상호관계를 나타내었으며, H-8 (δH6.83)은 C-10 (δC110.0) 및 C-11a (δC107.2)와 3 bond 사이의 강한 상호관계가 있음이 확인되었다. 또한 C-9 및 C-7a (δC156.2)와 2 bond 사이의 비교적 약한 상호관계를 나타내어 이들의 결과를 종합하여 D환의 위치를 결정하였다.
또한, 상기 화합물 1은 UV 스펙트럼 상 logε260 .5nm, 4.2로 나타났으며, C19H17O7의 구조로 예상되었다. HR-FABMS 측정결과, 분자 이온 피크(molecular ion peak) [M+H]+가 357.0974 m/z에서 관측되어 계산된 예상 분자량인 357.1991과 유사한 값을 나타내었다.
상기 결과에 의해, 상기 화합물 1은 하기 화학식 1로 표시되는 [3,11-dihydroxy-6,9-dimethoxy-10-methyl[1]benzo-pyrano[3,4-b][1]benzopyran-12(6H)-one]로 확인되는 C-메틸로테노이드계 화합물을 얻었으며, 이를 보에라비논 엑스로 명명하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017005286-appb-I000004
실시예 3. HMGB1 분비 및 수용체 발현에 미치는 보에라비논 엑스의 효과 검증
3-1. HUVECs에서의 HMGB1 분비에 미치는 효과
HUVECs에서 분비되는 HMGB1을 정량하기 위해서, 배양된 HUVECs에 100ng/㎖ LPS(lipopolysaccharide)를 16시간 동안 처리한 후, 0 ~ 2μM의 보에라비논 엑스를 처리하였다. 6시간 후, 배양액을 채취하여 HMGB1 검출 ELISA(competitive enzyme-linked immunosorbent assay)에 실험에 사용하였다.
그 결과, 도 2A에 도시된 바와 같이, LPS에 의해 HMGB1 분비의 증가는 본 발명에 따른 보에라비논 엑스 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
3-2. CLP-유도 패혈증 마우스 모델에서의 HMGB1 분비에 미치는 보에라비논 엑스의 효과
In vivo 상에서 보에라비논 엑스의 HMGB1 분비 억제 효과를 더 확인하기 위해서, 인간 패혈증과 매우 유사한 CLP-유도 패혈증 마우스 모델을 이용하여 HMGB1 분비 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 2B에 도시된 바와 같이, CLP에 의한 마우스 패혈증 모델에서의 생체 내 실험에서도 마찬가지로 보에라비논 엑스는 투여농도에 의존적으로 HMGB1 분비를 억제하는 것으로 나타났다. 이 때, 실험에 사용된 마우스의 평균 몸무게는 27g 이고, 혈액 부피는 2㎖라는 점을 감안하면, 투여된 보에라비논 엑스의 농도 0.72, 1.08 및 1.44㎍/마우스는 말초혈액에서 각각 1, 1.5 및 2μM 일 것으로 판단된다.
3-3. HMGB1 수용체(TLR2, TLR4 및 RAGE)의 발현에 미치는 보에라비논 엑스의 효과
HUVECs에서 보에라비논 엑스가 HMGB1 수용체(TLR2, TLR4 및 RAGE)의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 우선, 배양된 HUVECs에 1μg/mL HMGB1을 16시간 처리한 후, 보에라비논 엑스를 농도구간 (0 ~ 2μM)에 따라 처리하였다. 6시간 뒤, 배양액을 제거하고 세포는 인산완충용액으로 세척 후 50μL의 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하여 실온에서 15분간 고정시켰다. 세포를 다시 세척한 뒤 각각 100μL의 mouse anti-human monoclone 항체(A-9, H-80 및 A-9)를 37˚C에서 처리하였으며, 3회 반복 세척하였다. 이후 100μL의 peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 항체(1:2000으로 희석해서 사용)와 1시간 동안 반응시키고, 3회 반복 세척 후 기질(O-phenylenediamene)을 처리하였다. 흡광도는 490nm에서 측정하였으며, 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
그 결과, 도 2의 C에 도시된 바와 같이, HMGB1을 처리할 경우 TLR2, TLR4 및 RAGE의 발현이 4배 이상 증가하였고, 보에라비논 엑스로 처리할 경우 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
3-4. 보에라비논 엑스의 세포 독성 평가
보에라비논 엑스의 세포독성을 평가하기 위하여, 세포는 96웰 플레이트에 5 × 103 cells/well의 밀도로 계대배양 하였으며, 24시간 후에 새로운 배양액으로 교체해 준 뒤, 보에라비논 엑스를 1 ~ 20μM 까지 농도구간별로 처리하였다. 48시간 후, 세포를 1회 세척하고 100μL의 1mg/mL MTT(Microculture tetrazolium)용액을 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 이 후, 150μL DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하여 살아있는 세포에 의해 생성된 염 형태(salt form)의 포르마잔(formazan)을 용해시키고 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2의 D에 도시된 바와 같이, 최고농도인 20μM 까지도 세포생존율에는 영향을 미치지 않는 것으로 보아 보에라비논 엑스는 처리농도 내에서 HUVECs에 대해 세포독성을 나타내지 않는 것으로 판단된다.
실시예 4. 보에라비논 엑스의 HMGB1에 의해 유도된 HUVECs의 투과성 저해효과 검증
4-1. in vitro HUVECs에서의 투과성 분석
HUVECs의 장벽 통합성(integrity)에 미치는 보에라비논 엑스의 효과를 알아보기 위하여 투과성 분석(permeability assay)을 실시하였다. HMGB1에 의해 유도된 복강으로 침윤된 에반스 블루의 투과정도를 확인하기 위해서, 단층으로 배양된 HUVECs 세포를 알부민이 결합된 에반스 블루(albumin-bound Evans blue) 용액이 투과하는 정도를 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. 보다 구체적으로, 우선 HUVECs를 3㎛ pore size를 가지는 지름 12㎜의 transwell에 5 × 104 cells/well의 밀도로 계대하여 3일 동안 배양하였다. 배양된 HUVECs에 1μg/mL HMGB1을 16시간 동안 처리한 후, 보에라비논 엑스를 6시간 동안 처리하였다.
그 결과, 도 3A 및 B에 도시된 바와 같이, 2μM 보에라비논 엑스 자체로는 HUVECs 투과성에 영향을 미치지 않았으나, 혈관내피장벽(endothelial barrier integrity) 파괴 물질인 LPS 및 HMGB1을 처리하였을 때, 보에라비논 엑스에 의해 농도 의존적으로 혈관내피장벽이 보호되는 양상을 관찰하였다.
4-2. in vivo 마우스에서의 투과성 분석
혈관 장벽 보호 효과를 in vivo 상으로 더욱 확인하기 위해서, 마우스에서 HMGB1 매개 혈관 투과도를 평가하였다. 보다 구체적으로, 소형 설치류용 가스 마취기기(small rodent gas anesthesia machine)를 이용하여 2% 이소플루란으로 수컷 마우스를 마취시켰다. 실험 중에는 마우스가 마취가스를 흡입하도록 하여 마취상태를 유지시켰다. 마우스 한 마리당 2μg의 HMGB1을 정맥주사하고, 16시간 후에 보에라비논 엑스(0.72, 1.08 및 1.44μg/마우스)를 6시간 동안 처리한 후, 인산완충용액에 희석된 1% 에반스 블루 용액을 정맥주사 하였다. 30분 뒤 마우스를 희생시키고 5mL 식염수로 복강을 세척하여 복막 삼출물을 채취하여 200 × g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액의 흡광도는 650nm에서 측정하였다. 혈관투과성은 복강으로 침윤된 “μg dye/마우스”로 표현되었으며, 이는 이전의 보고에 따라 작성된 표준곡선(standard curve)에 의해 계산되었다(Polyphosphate elicits proinflammatory responses that are counteracted by activated protein C in both cellular and animal models. Journal of Thrombosis and Haemostasis 10, 1145-1151, 2012).
도 3의 C에 도시된 바와 같이, HMGB1에 의해 유도된 복강으로 침윤된 에반스 블루는 보에라비논 엑스에 의해 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
4-3. HGMB1 매개 p38 MAPK 활성 저해 분석
HMGB1는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 인산화를 촉진함으로써 전-염증 반응을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에, 보에라비논 엑스로 사전 배양한 후 HMGB1으로 활성화시켜 인산화된 p38 MAPK의 수준을 ELISA kit를 이용하여 정량화하였다.
그 결과, 도 3의 D에 도시된 바와 같이, HUVECs에서 HMGB1으로 유도된 p38 인산화가 보에라비논 엑스에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 보에라비논 엑스의 HMGB1 매개 CAM 발현, 세포 부착 및 이동 저해효과 검증
5-1 CAM 발현 분석
HMGB1은 HUVECs 표면에서 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 E-selectin와 같은 CAM(cell adhesion molecule)의 발현을 유도하고, 그 결과 HUVECs를 통해 염증부위로 백혈구의 이동을 촉진시킴으로써 염증반응을 매개한다는 것이 알려져 있다. 따라서, 보에라비논 엑스가 이러한 HMGB1 매개 CAM의 발현을 억제하는지를 확인하기 위하여 whole-cell ELISA법으로 단백질 발현을 분석하였다.
보다 구체적으로, 배양된 HUVECs에 1μg/mL HMGB1을 16시간 처리한 후, 보에라비논 엑스를 농도구간(0 - 2μM)에 따라 처리하였다. 6시간 뒤, 배양액을 제거하고 세포는 인산완충용액으로 세척 후 50μL의 1% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)를 사용하여 실온에서 15분간 고정시켰다. 세포를 다시 세척한 뒤 각각 100μL의 mouse anti-human monoclone 항체 (VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 E-selectin)를 37˚C에서 처리하였으며, 3회 반복 세척하였다. 이후 100 μL의 peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 항체(1:2000으로 희석해서 사용)와 1시간 동안 반응시키고, 3회 반복 세척 후 기질(O-phenylenediamene)을 처리하였다. 흡광도는 490nm에서 측정하였으며, 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
그 결과, 도 4의 A에 도시된 바와 같이, VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 E-selectin 발현이 보에라비논 엑스에 의해 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 보에라비논 엑스의 HMGB1 기전 조절 능력에 의한 것으로 판단된다.
5-2. In vitro 세포 부착성 및 이동 억제 효과
6 × 104 cells/well의 HUVECs를 transwell(지름 6.5mm, pore size 8μm)에 계대하고, 단세포층을 만들기 위해 3일 동안 배양하였다. 상단의 챔버에 단핵백혈구 (monocytes)를 처리하기 전, 배양된 HUVECs에 1μg/mL HMGB1(16시간) 및 보에라비논 엑스(6시간)를 각각 처리하였다. 상단의 챔버에 있던 단핵백혈구와 필터 윗부분에 남아있는 세포는 제거하고, 필터 아래쪽으로 이동한 단핵백혈구를 8% 글루탈알데히드(glutaraldehyde)를 사용하여 고정하였다. 이후, 20% 메탄올에 희석된 0.25% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 세포를 염색하였다. 모든 실험은 2반복 수행하였으며, 각 well 마다 무작위로 선정된 high power microscopic fields(HPF, 200×) 아홉 곳을 카운트하여 세포이동 지수(cell migration index)로 표현하였다.
도 4B, C 및 D에 도시된 바와 같이, HMGB1에 의해 증가된 세포부착분자 발현은 사람 유래 호중구가 HUVECs에 부착되거나 이동하는 것을 유동하는 것으로 나타났으나, 보에라비논 엑스에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다.
5-3. In vivo 마우스에서의 세포 이동 억제 효과
In vivo에서의 세포 이동성 효과를 확인하기 위해, 마우스에서 HMGB1 유도의 백혈구 이동을 조사하였다. 보다 구체적으로, 호중구 세포이동 측정을 위해 채취된 20μL의 복막 삼출물을 0.38mL Turk's solution [3% 아세트산(acetic acid) 용액에 희석된 0.01% 크리스탈 바이올렛]과 혼합한 뒤 광학현미경을 통해 세포 수를 측정하였다.
그 결과, 도 4의 E에 도시된 바와 같이, HMGB1에 의한 마우스 복강 내로의 백혈구 이동이 보에라비논 엑스에 의해 유의적으로 감소하였다.
실시예 6. 종양괴사인자-α, 인터루킨-6 및 NF - κB , ERK1 /2 활성화 및 NF - κB p65 이동에 미치는 보에라비논 엑스의 효과 검증
6-1. 종양괴사인자-α, 인터루킨-6 및 NF-κB, ERK1/2 활성화 분석
HMGB1에 의해 유도된 전염증 인자인 종양괴사인자-α, 인터루킨-6 및 NF-κB, ERK1/2가 보에라비논 엑스에 영향을 받는지 확인하였다. 구체적으로 세포 배양 상층액 중의 종양괴사인자-α 및 인터루킨-6의 농도는 ELISA kits(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 결정하였다.
그 결과, 도 5의 A에 도시된 바와 같이, HMGB1에 의해 유도된 종양괴사인자-α가 보에라비논 엑스에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 도 5의 B에 도시된 바와 같이, 인터루킨-6 또한 보에라비논 엑스에 의해 농도 의존적으로 감소하였다. 이는 보에라비논 엑스가 인간내피세포에서 전염증 반응의 유도와 관련된 가장 중요한 신호를 조절한다는 것을 의미한다.
또한, NF-κB 및 ERK1/2의 활성화는 전염증 반응의 개시에 필요한데, HMGB1는 혈관 염증반응에서 NF-κB 및 ERK1/2의 활성화하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 실시예에서는 HMGB1에 의한 NF-κB 및 ERK1/2의 활성화에 미치는 보에라비논 엑스의 효과에 대하여 평가하였다. 보다 구체적으로, 핵 용해물(nuclear lysates)에 대한 전체 및 인산화된 p65 NF-κB(#7174, #7173, Cell signaling Technology, Danvers, MA)와 전체 및 인산화된 ERK1/2(R&D Systems, Minneapolis, MN) 역시 ELISA kit를 통해 측정되었다.
그 결과, 도 5의 C 및 D에 도시된 바와 같이, NF-κB 및 ERK1/2의 활성화는 보에라비논 엑스에 의해 감소됨을 확인하였는바, 각종 전염증 반응을 보에라비논 엑스가 유의적으로 억제할 수 있는 것으로 판단할 수 있다.
6-2. NF-κB p65의 세포핵으로의 이동 분석
HMGB1이 세포질내의 NF-κB p65를 세포핵내로 이동시키는 것이 알려져 있는바, 보에라비논 엑스가 이러한 이동 효과를 억제하는지를 면역형광염색법(Immunofluorescene staining)을 이용하여 평가하였다.
보다 구체적으로, HUVECs를 0.05% 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)으로 코팅된 커버글라스(cover glass)에서 48시간 동안 배양하였다. 이 후, 1μg/mL HMGB1을 1시간 동안 처리하였고, 보에라비논 엑스를 6시간 동안 전 처리하거나 화합물을 처리하지 않았다. 화합물 처리를 마친 후에는 4% 포름알데히드 (formaldhyde)를 처리하고 15분간 실온에서 세포를 고정하였다. 이 후, 세포 고정액을 제거한 후에는 0.05% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 15분간 처리하여 세포에 항체가 투과되도록 반응시키고(permeabilization), 이를 제거한 뒤, 5% BSA(bovine serum albumin)를 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰으며, 세포핵은 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI)로 염색시켰다. 염색된 세포는 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였으며(63 배율), 핵으로 이동된 p65 정량은 이전에 보고된 방법대로 계산하였다 [Analysis and quantitation of NF-kappaB nuclear translocation in tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) activated vascular endothelial cells. Microscopy and Microanalysis 12, 269-276, 2006].
그 결과, 도 5의 E에 도시된 바와 같이, 세포형태 유지에 중요한 F-액틴이 HMGB1에 의해 무작위적으로 파괴되고, actin 필라멘트 다발(bundle)이 세포경계 부분에 위치하게 된 것을 확인할 수 있었다. HMGB1에 의한 세포장벽 파괴는 세포간격(paracellular gap) 형성이 특징적으로 나타나는 반면에, 보에라비논 엑스를 처리한 구간에서는 F-액틴 링(ring) 형성과 함께 세포간격 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
염증반응은 혈관 상처의 발병에 중요한 요소이며, 내피 장애는 특히 혈관 염증 병변이 형성되는 동안 백혈구 집결과 관련 있다. 종양괴사인자-α 및 NF-κB는 혈관 염증 반응과 관련된 중요한 매개요소이고, NF-κB는 잘 알려진 전염증 전사인자로서, 종양괴사인자-α 및 IL-1β와 같은 전염증 싸이토카인에 반응하여 활성화된다. NF-κB 신호 경로가 억제되면 혈관보호 효과가 생기고, 이는 혈관 질환의 발전을 지연 또는 예방하게 된다. 따라서, 혈관 내피세포에서 종양괴사인자-α의 생성 억제 및 NF-κB의 활성 억제가 혈관 염증질환 치료의 중요한 타겟으로, 본 실시예를 통하여, 보에라비논 엑스가 염증 매개체의 생성 억제 및 NF-κB 경로의 억제를 통하여 항염증 효과를 발휘한다는 것을 알 수 있다.
실시예 7. 보에라비논 엑스에 의한 패혈증 동물모델의 생존율 증가 검증
패혈증은 중증 감염에 대한 전신성 반응으로, 장기 이상, 관류저하 또는 저혈압과 연관되면 나쁜 예후를 갖기 때문에, 보에라비논 엑스가 CLP-유도 패혈증 마우스 모델에서 사망률을 감소시킬 것으로 예상하고, CLP 수술법에 의한 패혈증 유도 후에 보에라비논 엑스를 투여하여 사망률을 평가하였다.
보다 구체적으로, 마우스의 맹장을 터트리는 CLP 수술법을 이용하여 패혈증이 유도된 마우스의 생존율을 확인하기 위해서, 수컷 마우스에 CLP 수술을 실시한 후, 12시간 및 50시간 경과 후에 보에라비논 엑스(0.72 도는 1.44μg/마우스)를 정맥주사 하였다. (n=5). 이 후, 수술 96시간 뒤에 마우스를 희생시켰다. 폐 조직의 변화 양상을 관찰하기 위해 각 마우스로부터 폐를 채취하고 인산완충용액(pH 7.4)으로 3회 반복 세척하여 남아있는 혈액을 제거한 뒤, 4% 포름알데히드 용액을 4˚C, 20시간 동안 처리하여 조직을 고정시켰다. 고정된 조직은 에탄올 시리즈(ethanol series)를 사용하여 탈수시켜, 파라핀에 침지시킨 후, 4μm 크기로 박절한 후 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드는 다시 60˚C 오븐에서 탈파라핀화 시켰으며, 재수화(rehydration) 과정을 거쳐 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색하였다. 염색되지 않은 헤마톡실린은 빠르게 0.3% 산성 알코올(acid alcohol)에 담가 제거하고, 에오신(eosin)으로 대비염색(counterstain) 하였다. 이 때 여분의 에오신은 에탄올 시리즈 및 자일렌(xylene)을 사용하여 제거하였으며, 슬라이드에 커버글라스를 씌웠다. 광학현미경을 통한 폐 조직 표본 분석은 조직의 구조, 부종 및 염증세포의 침윤 등을 관찰할 수 있다. 그 결과는 하기 4단계로 구분하였다.
1단계: 정상적인 조직병리학적 소견
2단계: 최소한의 호중구의 침윤
3단계: 중도의 호중구 침윤, 혈관주위 부종형성 및 부분적인 폐조직 구조 파괴
4단계: 고밀도의 호중구 침윤, 농양(abscess) 형성 및 완전한 폐조직 구조 파괴
도 6의 A에 도시된 바와 같이, CLP 수술 후, 12시간 후에 1.44μg/마우스 보에라비논 엑스를 정맥주사 하였을 때는 마우스 생존에 변화가 없었으나, 수술 후 12시간 및 50시간 후에 2회에 걸쳐 투여하자 생존율 40%에서 60%로 증가하는 것으로 나타났다.
또한, 도 6의 B 및 C에 따르면, CLP 수술에 의해 발생한 폐손상 즉, 염증세포의 간질(interstitium) 및 폐포(alveolar)로의 과도한 침윤에 의한 부종과 폐조직 구조의 손상이 관찰되었으나, 보에라비논 엑스 투여에 의해 효과적으로 감소하였다. 또한, 폐손상 점수(lung injury score)도 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.
이와 같이, 보에라비논 엑스에 의해 달성되는 생존율 증가는, HMGB1 분비 및 HMGB1 매개 염증반응의 억제가 패혈증과 패혈성 쇼크 치료에 중요한 타겟이 될 수 있다.
제조예 1. 주사제의 제조
실시예 1의 보에라비논 엑스 14.4μg
토코페롤 172mg
셀레늄 30mg
주사용 증류수 적량
pH 조정제 적량
1 바이알(10cc)의 주사에 상기 성분들을 통상적인 주사제 제조방법에 따라 제조하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
발명에 따른 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하며, 상기 화합물을 통해 HMGB1으로 유도된 전염증 반응 억제 효과를 구체적으로 확인하였다. 이에, 본 발명은 패혈증 및 패혈성 쇼크와 같은 혈관염증질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로써 활용이 가능하고, 상기 조성물은 혈관염증질환의 예방 또는 치료방법으로써 이용이 가능할 것으로 기대된다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017005286-appb-I000005
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 아브로니아(Abronia nana) 로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염.
  3. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 유효성분으로 함유하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 HMGB1(High mobility group box 1) 매개의 전염증 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 혈관염증질환은 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관염증질환의 예방 또는 치료 방법.
  7. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염의, 혈관염증질환의 예방 또는 치료 용도.
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