WO2017200025A1 - 糖尿病を判定するための血液試料の分析方法及びシステム - Google Patents

糖尿病を判定するための血液試料の分析方法及びシステム Download PDF

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amino acid
diabetes
determining
blood
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PCT/JP2017/018592
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善隆 猪阪
友則 木村
圭子 安田
健司 浜瀬
真史 三田
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国立大学法人大阪大学
国立大学法人九州大学
株式会社資生堂
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7042—Aging, e.g. cellular aging

Definitions

  • the present invention relates to a blood sample analysis method for determining diabetes based on amino acid amounts of D-form and L-form from a blood sample, a test method for diabetes, and a sample analysis system for outputting pathological information about diabetes.
  • Diabetes is a metabolic disorder characterized by hyperglycemia and is roughly divided into type 1 and type 2 diabetes.
  • Type 1 diabetes is a disease that develops when an immune reaction is induced by genetic factors and viral infection, and ⁇ -cells are selectively destroyed, and is usually caused by autoimmunity but rarely occurs spontaneously.
  • Type 2 diabetes is diabetes that is caused by two causes: decreased insulin secretion and decreased sensitivity.
  • Type 2 diabetes is classified as a lifestyle-related disease, but its cause has not been fully clarified. It is believed that type 2 diabetes develops when a person who is genetically prone to diabetes (genetic factor) sends a lifestyle habit of becoming susceptible to diabetes (environmental factor).
  • Insulin mainly has an action of suppressing blood sugar, promotes uptake of glucose, amino acids and potassium in skeletal muscle and promotes protein synthesis, inhibits gluconeogenesis in the liver, inhibits synthesis and degradation of glycogen, and in adipose tissue It has the effect of suppressing blood sugar by promoting sugar uptake and utilization, promoting fat synthesis and inhibiting decomposition, and promoting the formation of various storage substances such as glycogen and fat.
  • blood sugar in the blood is always kept within a certain range by the action of insulin.
  • HbA1C hemoglobin A1C
  • HbA1C which is usually a protein biomarker
  • HbA1C serves as a long-term measure of blood glucose control.
  • HbA1C has also been used to confirm the effectiveness of treatment for diabetes in patients, but inconsistent results sometimes occurred in patients who received treatment. Therefore, for the determination of diabetes, HbA1C and fasting blood glucose level are usually used in combination as markers, and when both markers indicate diabetes, only one marker indicates diabetes while diagnosis is made for diabetes. In some cases, the diagnosis of diabetes is further made by observing typical symptoms of diabetes. Therefore, it will still ultimately depend on the interpretation and judgment of the diagnosing physician.
  • HbA1C is not suitable for determination of short-term therapeutic effects in patients who have been treated for diabetes, and its therapeutic effects can be achieved by combining short-term diabetes markers such as 1,5-andro-D-glycitol and glucoalbumin. Judgment and follow-up are performed.
  • Diabetic nephropathy is known as a complication of diabetes. If the blood glucose level continues to be high due to diabetes, the glomeruli of the kidney are damaged and the renal function is reduced. Diabetes is cited as one of the causes of chronic renal failure, and the treatment policy differs between patients with renal failure who have diabetes and those who do not have diabetes. There is a need to do high. In patients with renal failure, urinary albumin level or urinary albumin / creatinine ratio is known as a marker for diabetes mellitus, but there are problems in terms of quantitativeness, sensitivity, cost, and the like.
  • Patent Document 4 D-amino acids, which have been conventionally considered not to exist in mammalian organisms (Patent Document 4), have some physiological functions. It was expected to bear. Some D-amino acids in body fluids have been shown to vary independently of L-amino acids, and have been shown to vary depending on the type of disease (Patent Document 5). In Patent Document 5, changes in D-amino acids and L-amino acids in diabetic patients were examined. Of these 40 chiral amino acids, D-alanine, L-cysteine and L-glutamic acid were found in diabetic patients. While it was confirmed that it fluctuated, fluctuations in other amino acids could not be confirmed.
  • the present inventors have analyzed chiral amino acids in the blood of a cohort suffering from renal impairment, and found that in this cohort, some chiral amino acids surprisingly fluctuate in relation to diabetes. Invented.
  • the present invention relates to a blood sample analysis method for determining diabetes, and relates to an analysis method capable of determining diabetes based on the amount of at least one amino acid among chiral amino acids.
  • the present invention relates to a sample analysis system capable of performing the analysis method of the present invention.
  • a sample analysis system includes a storage unit, an input unit, an analysis measurement unit, a data processing unit, and an output unit, and can analyze a blood sample and output diabetic condition information. .
  • the present invention relates to a program that can be installed in the sample analysis system of the present invention and a storage medium that stores the program.
  • It can provide a novel diabetes marker that can fluctuate based on a principle different from the amount of albumin appearing in urine due to protein glycation or decreased renal function, and it can be used with multiple chiral amino acid amounts in combination for higher accuracy Enable judgment.
  • FIG. 1-A shows an ROC curve for the sensitivity and specificity of diabetes diagnosis by D-Asp.
  • FIG. 1-B shows an ROC curve for the sensitivity and specificity of diabetes diagnosis by D-Pro.
  • FIG. 1-C shows an ROC curve for the sensitivity and specificity of diabetes diagnosis by L-Gln.
  • FIG. 1-D shows an ROC curve for the sensitivity and specificity of diabetes diagnosis by L-Ile.
  • FIG. 2-A shows the amount of D-Asp in a subject suffering from diabetes and a subject not suffering from diabetes.
  • FIG. 2-B shows the amount of D-Pro in a subject suffering from diabetes and a subject not suffering from diabetes.
  • FIG. 2-C shows the amount of L-Gln in a subject with diabetes and a subject without diabetes.
  • FIG. 3-A is a diagram showing the correlation between age and D-Ala value (1), a diagram showing a ROC curve (2), and a diagram showing a ROC curve between age and D / L% value (3).
  • FIG. 3B is a diagram showing the correlation between age and D-Pro value (1), a diagram showing a ROC curve (2), and a diagram showing a ROC curve between age and D / L% value (3).
  • FIG. 3C is a diagram (1) showing the correlation between the age and the D-allo-Ile value, and a diagram (2) showing the ROC curve.
  • FIG. 3D is a diagram (1) showing the correlation between the age and the D-Leu value, and a diagram (2) showing the ROC curve.
  • FIG. 3E is a diagram (1) showing the correlation between the age and the L-Ile value, and a diagram (2) showing the ROC curve.
  • FIG. 3F is a diagram (1) showing the correlation between the age and the L-Ser value, and a diagram (2) showing the ROC curve.
  • FIG. 4-A shows the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Asn value, (2) D-Asn value, and (3) D / L-Asn value.
  • FIG. 4-B is a diagram showing the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Ser value, (2) D-Ser value, and (3) D / L-Ser value.
  • FIG. 4-C shows the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Asp value, (2) D-Asp value, and (3) D / L-Asp value.
  • FIG. 4-D is a diagram showing a correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Ala value, (2) D-Ala value, and (3) D / L-Ala value.
  • FIG. 4-E is a diagram showing the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR), (1) L-Ile value, and (2) D-allo-Ile value.
  • FIG. 4-F is a diagram showing the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Phe value, (2) D-Phe value, and (3) D / L-Phe value.
  • FIG. 4-G is a diagram showing a correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Lys value, (2) D-Lys value, and (3) D / L-Lys value.
  • FIG. 4-H is a diagram showing a correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR), (1) L-Thr value, and (2) D-Allo-Thr value.
  • FIG. 4-I shows the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Pro value, (2) D-Pro value, and (3) D / L-Pro value.
  • FIG. 4-J is a diagram showing the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Leu value, (2) D-Leu value, and (3) D / L-Leu value.
  • FIG. 4-K is a diagram showing the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Trp value.
  • FIG. 4-L is a diagram showing the correlation between the estimated glomerular filtration rate (eGFR) and (1) L-Tyr value.
  • FIG. 5 is a block diagram of the analysis system of the present invention.
  • FIG. 6 is a flowchart showing an example of an operation for determining diabetes combination.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of an operation for determining a renal disorder and diabetes complication.
  • the present invention relates to a blood sample analysis method for determining diabetes in a subject, comprising the steps of measuring the amount of at least one amino acid among chiral amino acids, and the measured amount of the at least one amino acid.
  • the present invention relates to an analysis method including a step of determining diabetes. Since the pathological condition of diabetes can be determined by the analysis method of the present invention, in another aspect, the present invention can also be called a diagnostic method.
  • the step of measuring the amount of chiral amino acid only the target chiral amino acid may be measured, or it may be measured together with other chiral amino acids. Chiral amino acids can also be diagnostic markers for other diseases. Therefore, from the viewpoint of analyzing a plurality of diseases at once, it is preferable to measure D-form and L-form collectively for 20 types of protein-constituting amino acids in a blood sample.
  • a step of acquiring a blood sample and a step of processing the acquired blood sample may be performed prior to the step of measuring the amount of chiral amino acid.
  • the blood sample may be any sample as long as it is a sample derived from blood such as blood, serum, or plasma.
  • the presence or absence of diabetes can be determined by comparing a specific chiral amino acid amount with a cutoff value. Whether the cut-off value exceeds the high value side or the low value side can be appropriately selected depending on whether the chiral amino acid used increases or decreases when suffering from diabetes. For example, in the case of D-Asp, D-Pro, and L-Gln, it is decreased in diabetic patients. Therefore, when belonging to the low value group, it can be determined that the patient suffers from diabetes, and when belonging to the high value group, diabetes is Can be determined not to be affected.
  • the measured value includes an index value obtained from the measured amount.
  • the index value may be a measured amount of amino acid or may be calculated based on the measured amount. For example, a corresponding isomer (ie, L-form for D-form, D-form for L-form) ) And the ratio, etc.
  • a variable in addition to the amount of the corresponding isomer, any variable that can influence the amount of chiral amino acid such as age, weight, sex, BMI, etc. can be used.
  • the amount of at least one chiral amino acid in a blood sample is classified into two or more groups based on the cutoff value, and diabetes can be determined according to the classification.
  • the inventors have found that when the amount of a specific chiral amino acid in the blood is high or low, it has been found to develop diabetes. Can be determined to be suffering from. Therefore, the determination may be performed by a medical assistant who is not a doctor, or may be performed by an analysis organization or the like. Therefore, it can be said that the analysis method of the present invention is a preliminary method or an auxiliary method of diagnosis.
  • the analysis method of the present invention may include a step of calculating as a disease state index value for determining diabetes instead of the step of determining diabetes.
  • the specific chiral amino acid used for the determination of diabetes refers to D-form or L-form of protein-constituting amino acids. Since D body and L body have different dynamics and metabolism in the body, prognosis can be predicted with high accuracy by discriminating between D body and L body.
  • the protein constituting amino acids include alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His).
  • Isoleucine Ile
  • leucine Leu
  • lysine Lys
  • methionine Met
  • proline Pro
  • Ser proline
  • Ser serine
  • Thr tryptophan
  • Trp tryptophan
  • Tr tyrosine
  • Val valine
  • D-aspartic acid D-Asp
  • D-proline D-Pro
  • L-glutamine L-Gln
  • L-isoleucine L-Ile
  • D-Asp D-aspartic acid
  • D-Pro D-proline
  • L-glutamine L-Gln
  • L-isoleucine L-Ile
  • the boundary for determining diabetes can be arbitrarily determined by analyzing the cohort and performing statistical processing.
  • the statistical processing method may be any method known to those skilled in the art, for example, ROC analysis, t-test, etc. may be used, and the average value, median value, X percentile value of the healthy group or diabetic group Can also be used.
  • any numerical value can be selected for X, and 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 85, 90, 95, and 97 can be appropriately used.
  • the cut-off value may be one, or the disease state can be classified according to the severity of the disease.
  • the cut-off value that defines the boundary varies depending on the type of cohort, but as an example, the cut-off value for determining diabetes by ROC analysis of the cohort used in the present example is 0.1 ⁇ g for D-aspartic acid. / Ml, 2.5 ⁇ g / ml for D-proline, 665 ⁇ g / ml for L-glutamine, and 49.3 ⁇ g / ml for L-isoleucine. If the subject's blood D-amino acid concentration is higher or lower than these cut-off values, it can be determined that diabetes has developed. However, it is not intended that the cut-off value used be limited to the cut-off value.
  • the target may be any target, and for example, the analysis method of the present invention can be performed on a healthy person or a person who may have diabetes.
  • the subject may include any subject because the method of analyzing the present invention is used in a medical examination.
  • the subject is a subject suffering from a renal disorder.
  • the determination of diabetes in the present invention makes it possible to determine whether or not the patient has diabetes as a complication in a patient who has been determined to suffer from a renal disorder. Therefore, in one aspect, the subject in the present invention refers to a patient diagnosed or determined as having a renal disorder. Renal disorder refers to a condition in which renal function is reduced, and is roughly classified into acute renal failure and chronic renal failure. A decrease in renal function is determined by a decrease in glomerular filtration rate (GFR), but it may be determined by an estimated glomerular filtration rate (eGFR) calculated from creatinine values based on variables such as age and sex. Good.
  • GFR glomerular filtration rate
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • a renal disorder marker showing a decrease in renal function such as serum creatinine concentration, KIM-1 or NGAL.
  • a patient determined to have renal disorder can be determined in advance or simultaneously based on the measured amount of at least one amino acid used to determine renal disorder among chiral amino acids. .
  • a further aspect of the present invention relates to a method for analyzing a blood sample for the purpose of determining a renal disorder and determining diabetic complications in any subject.
  • a step of measuring the amount of at least one amino acid used for determination of renal disorder and at least one amino acid used for determination of diabetes mellitus, and at least one used for determination of the renal disorder A step of determining renal damage based on the measured amount of amino acid of the step, and a step of determining diabetes combined based on the measured amount of at least one amino acid used for determination of the diabetes combined when it is determined to be renal disorder including.
  • Determination of kidney damage is made based on the amount of at least one chiral amino acid in the blood sample.
  • nephropathy can be determined by applying the amount of at least one chiral amino acid in a blood sample to two or more pre-classified groups, and in a further aspect the severity of nephropathy. The severity can be determined.
  • the boundary for determining renal impairment can be arbitrarily determined by analyzing the cohort and performing statistical processing.
  • the statistical processing method may be a method known to those skilled in the art. For example, ROC analysis, t-test or the like may be used, and the average value, median value, and X percentile value of the healthy group or patient group may be used. It can also be used. Here, any numerical value can be selected for X, and 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 85, 90, 95, and 97 can be appropriately used.
  • the cut-off value may be one, or the disease state can be classified according to the severity of the disease.
  • the chiral amino acids used for the determination of renal damage include D-asparagine, D-serine, D-aspartic acid, D-allo-threonine, D-alanine, D-proline, D-leucine, L-histidine, and L-serine.
  • L-aspartic acid, L-alanine, L-isoleucine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-lysine, and L-tyrosine, and their cut-off values can be arbitrarily determined by cohort analysis. it can. If the blood D-amino acid concentration in the subject is higher than the cut-off value, it can be determined that the renal disorder has occurred.
  • the invention in a further aspect of the invention, relates to a method for determining an eGFR value based on the amount of at least one chiral amino acid in a blood sample.
  • This method includes the steps of measuring the amount of at least one chiral amino acid in a blood sample and determining an eGFR value based on the measured value of the at least one chiral amino acid.
  • the step of determining the eGFR value based on the measured value of the chiral amino acid can be determined based on a predetermined regression curve.
  • the step of determining the eGFR value based on the measured value of the chiral amino acid comprises dividing the cohort into a plurality of groups according to the amount of the chiral amino acid, and the group and the eGFR value or the range thereof are associated in advance.
  • the measured values may be classified into the group.
  • Such chiral amino acids include D-asparagine, D-serine, D-aspartic acid, D-allo-threonine, D-alanine, D-proline, D-leucine, L-histidine, L-serine, L-asparagine.
  • At least one amino acid selected from the group consisting of acid, L-alanine, L-isoleucine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-lysine, and L-tyrosine can be used.
  • Chiral amino acids can be used as markers of renal damage and diabetes depending on the type of the amino acid. By measuring chiral amino acids comprehensively, it is possible to determine complications of diabetes after determining renal damage. be able to.
  • Chiral amino acids that do not increase or decrease in patients with renal impairment are preferred in determining diabetes complications in patients with renal impairment, such as D-aspartic acid (D-Asp), L-glutamine (L-Gln), and L- At least one amino acid selected from the group consisting of isoleucine (L-Ile), or any combination thereof is used.
  • D-Asp D-aspartic acid
  • L-Gln L-glutamine
  • L-Ile L- At least one amino acid selected from the group consisting of isoleucine
  • the measurement of the amount of chiral amino acid in the sample may be performed using any method known to those skilled in the art.
  • OPA o-phthalaldehyde
  • Boc-L-Cys N-tert-butyloxycarbonyl-L-cysteine
  • other modifying reagents are derivatized stereospecifically with D- and L-amino acids, and then By using a analytical column such as ODS-80TsQA to separate a mixture of 100 mM acetate buffer (pH 6.0) and acetonitrile by gradient elution, it is possible to simultaneously measure D-form and L-form of amino acids. Can be used.
  • D- and L-amino acids are derivatized with a fluorescent reagent such as 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F) in advance, and then ODS-80TsQA, Mightysil RP.
  • a fluorescent reagent such as 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F) in advance, and then ODS-80TsQA, Mightysil RP.
  • NBD-F 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole
  • ODS-80TsQA Mightysil RP.
  • the optical resolution column system in the present specification refers to a separation analysis system using at least an optical resolution column, and may include a separation analysis using an analysis column other than the optical resolution column. More specifically, passing a sample containing components having optical isomers along with a first liquid as a mobile phase through a first column filler as a stationary phase to separate the components of the sample; Individually holding each of the components of the sample in a multi-loop unit, each of the components of the sample individually held in the multi-loop unit as a stationary phase together with a second liquid as a mobile phase Supplying the second column packing material having an optically active center through a flow path to split the optical isomers contained in each of the sample components, and the optical isomerism contained in each of the sample components
  • the D- / L-amino acid concentration in the sample can be measured by using an optical isomer analysis method characterized by including a step of detecting a body ( Patent No.
  • D-amino acids can be quantified by immunological techniques using monoclonal antibodies that identify optical isomers of amino acids, such as monoclonal antibodies that specifically bind to D-leucine, D-aspartic acid, etc. (JP 2009-184981 specification).
  • the amount of chiral amino acid in the blood sample may be used alone for the determination of diabetes, or may be used in combination with the amount of one or more other chiral amino acids that can be used for the determination of diabetes.
  • the analysis method of the present invention may further include a step of measuring a variable related to diabetes, and the amount of chiral amino acid and such a variable can be combined and used for determination of diabetes.
  • variables include a history of diabetes, age, sex, presence or absence of fasting blood glucose, and known diabetes markers and markers associated with diabetes.
  • known markers include HbA1C, fasting blood glucose level, 1,5-andro-D-glycitol, glucoalbumin, urinary albumin level or urinary albumin / creatinine ratio.
  • treatment suitable for diabetes and / or diabetic nephropathy is selected and performed.
  • it is necessary to further perform treatment such as blood glucose level management and lifestyle improvement.
  • blood glucose control biguanide, thiazolidine, sulfonylurea, insulin secretagogue, DPP4 inhibitor, ⁇ -glucosidase inhibitor, SGLT2
  • Dosing treatment such as inhibitors is performed.
  • improvement of lifestyle habits for example, smoking cessation, exercise for lowering the BMI value, and dietary restrictions are instructed.
  • These treatment policies are determined based on the amount of chiral amino acid after an inquiry with a doctor.
  • the present invention relates to a method for treating diabetic renal disorder, which comprises carrying out the analysis method of the present invention and further treating renal disorder complicated with diabetes.
  • a method for treating diabetic renal disorder which comprises carrying out the analysis method of the present invention and further treating renal disorder complicated with diabetes.
  • the detail of the treatment method it can select suitably by referring the nonpatent literature 1 and the nonpatent literature 2, for example. These references are incorporated herein.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for determining an estimated age in a subject using chiral amino acids.
  • This method comprises at least one amino acid selected from the group consisting of D-alanine, D-leucine, D-allo-isoleucine, D-proline, L-serine, and L-isoleucine in a blood sample. Measuring the amount, and determining the age based on a measured amount of the at least one amino acid and a correlation curve between a predetermined age and a D-amino acid value. This method is based on the finding that some of the chiral amino acids in blood are correlated with age (FIGS. 3A-F).
  • Estimate based on the chiral amino acid value for age determination by acquiring regression curves and cut-off values between age and chiral amino acid for age determination in an arbitrary cohort in advance.
  • the age can be determined. According to this method, it is possible to estimate the age of an unconscious person or a patient with dementia.
  • a cut-off value capable of discriminating subjects over 70 years old is 4.7 ⁇ g / ml or more in the case of D-alanine (D-Ala) when calculated using the cohort of the present invention.
  • D-proline D-Pro
  • D-alloisoleucine D-allo-Ile
  • L-serine L-Ser
  • L-isoleucine L-Ile
  • a cut-off value for age can be selected as appropriate.
  • a cut-off value for age can be selected as appropriate.
  • FIG. 5 is a configuration diagram of the sample analysis system of the present invention.
  • a sample analysis system 10 includes a storage unit 11, an input unit 12, an analysis measurement unit 13, a data processing unit 14, and an output unit 15, analyzes a target blood sample, and provides pathological information. Can be output.
  • the storage unit 11 stores a cut-off value of the amount of chiral amino acid in blood and diabetes pathological information for determining diabetes input from the input unit 12,
  • the analytical measurement unit 13 separates and quantifies a chiral amino acid for distinguishing at least one of the protein-constituting amino acids in the target blood sample,
  • the data processing unit 14 determines the target diabetes information by comparing the measured value of the amount of the at least one chiral amino acid with the cut-off value stored in the storage unit 11,
  • the output unit 15 can output pathological information about the target diabetes.
  • the storage unit 11 further stores a cutoff value of the amount of chiral amino acid in the blood and information on the renal disorder for determining the renal disorder input from the input unit 12,
  • the analytical measurement unit 13 separates and quantifies a chiral amino acid for determining at least one renal disorder among protein-constituting amino acids in the subject blood sample,
  • the data processing unit 14 compares the measured value of the amount of the chiral amino acid for determining the at least one renal disorder with the cutoff value of the chiral amino acid for determining the renal disorder stored in the storage unit 11.
  • it may include determining information on the renal disorder of the target, whereby the output unit 15 can output the pathological information on diabetes together with the information on the renal disorder of the target.
  • the storage unit 11 includes a memory device such as a RAM, a ROM, and a flash memory, a fixed disk device such as a hard disk drive, or a portable storage device such as a flexible disk and an optical disk.
  • the storage unit 11 is a computer program used for various processes of the information processing apparatus, in addition to the data measured by the analysis measurement unit, the data and instructions input from the input unit 12, the arithmetic processing results performed by the data processing unit 14, etc. Memorize the database.
  • the computer program may be installed via a computer-readable recording medium such as a CD-ROM or DVD-ROM, or via the Internet.
  • the computer program is installed in the storage unit using a known setup program or the like.
  • the input unit 12 is an interface or the like, and includes operation units such as a keyboard and a mouse. As a result, the input unit can input data measured by the analysis measurement unit 13, instructions for calculation processing performed by the data processing unit 14, and the like. For example, when the analysis measurement unit 13 is outside, the input unit 12 may include an interface unit that can input measured data or the like via a network or a storage medium, separately from the operation unit.
  • the analytical measurement unit 13 performs a process for measuring the amount of chiral amino acid in the blood sample. Therefore, the analytical measurement unit 13 has a configuration that enables separation and measurement of chiral amino acids. Amino acids may be analyzed one by one, but some or all types of amino acids can be analyzed together.
  • the analytical measurement unit 13 is not intended to be limited to the following, but may be, for example, a high performance liquid chromatography system (HPLC) including a sample introduction unit, an optical resolution column, and a detection unit.
  • HPLC high performance liquid chromatography system
  • the analysis measurement unit 13 may be configured separately from the sample analysis system 10, and measured data or the like may be input via the input unit 12 using a network or a storage medium.
  • the data processing unit 14 is configured to determine the complication of diabetes by comparing the measured amount of chiral amino acid with the cutoff value stored in the storage unit 11.
  • the data processing unit 14 executes various arithmetic processes on the data measured by the analysis measurement unit 13 and stored in the storage unit 11 in accordance with a program stored in the storage unit 11.
  • the arithmetic processing is performed by a CPU included in the data processing unit 14.
  • the CPU includes a functional module that controls the analysis measurement unit 13, the input unit 12, the storage unit 11, and the output unit 15, and can perform various controls.
  • Each of these units may be configured by an independent integrated circuit, a microprocessor, firmware, and the like.
  • the output unit 15 is configured to output a pathological condition index value and / or pathological condition information that is a result of performing the arithmetic processing in the data processing unit 14.
  • the calculation processing result in the data processing unit 14 may be directly output to the output unit 15 or may be output to the output unit 15 as needed after being temporarily stored in the storage unit 11.
  • the output unit 15 may be a display device such as a liquid crystal display that directly displays the result of the arithmetic processing, an output unit such as a printer, or an interface unit for outputting to an external storage device or via a network. There may be.
  • FIG. 6 is a flowchart showing an example of an operation for determining diabetes by the program of the present invention.
  • the program of the present invention is a program that causes an information processing apparatus including the input unit 12, the output unit 15, the data processing unit 14, and the storage unit 11 to determine diabetes information.
  • the program of the present invention is as follows: A predetermined cutoff value of at least one chiral amino acid input from the input unit 12 and diabetes information are stored in the storage unit 11; A measured value of the amount of at least one chiral amino acid input from the input unit 12 is stored in the storage unit 11; In the data processing unit 14, the cutoff value stored in the storage unit 11 is compared with the measurement value stored in the storage unit 11 to determine diabetes information; and the diabetes information is output to the output unit 15. And a command for causing the information processing apparatus to execute the operation.
  • the program of the present invention may be stored in a storage medium or provided via an electric communication line such as the Internet or a LAN.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an example of an operation for determining the complication of diabetes together with the pathological information of the renal disorder by the program of the present invention.
  • the program of the present invention is a program that causes an information processing apparatus including the input unit 12, the output unit 15, the data processing unit 14, and the storage unit 11 to determine information on diabetes mellitus.
  • the program of the present invention is as follows: The at least one chiral amino acid for determining renal impairment and the predetermined cutoff value of at least one chiral amino acid for determining diabetes input from the input unit 12 are combined with information on renal impairment and diabetes combined, respectively.
  • the measured values of at least one chiral amino acid for determining renal impairment and at least one chiral amino acid for determining diabetes input from the input unit 12 are respectively stored in the storage unit 11;
  • the cut-off value stored in the storage unit 11 and the measurement value stored in the storage unit 11 are respectively compared to determine information on renal disorder and diabetes combination; It includes a command for causing the information processing apparatus to output information on renal disorder and diabetes to the output unit 15.
  • the program of the present invention may be stored in a storage medium or provided via an electric communication line such as the Internet or a LAN.
  • the system of the present invention may be an estimated age determination system.
  • the system includes a storage unit, an input unit, a data processing unit, and an output unit, and includes the following: From the input unit, an amount of at least one kind of amino acid in the blood chiral amino acids for determining the age, and a regression curve or cut-off value with age are input, and stored in the storage unit, From the input unit, a measurement value of the amount of at least one of the chiral amino acids in the target blood sample is input, and stored in the storage unit, A data processing unit determines an estimated age of the subject based on the stored measurement value of the amino acid amount and the regression curve or cutoff value; Can be output to the estimated age output section.
  • the present invention also relates to an eGFR value determination system that performs the method for determining an eGFR value of the present invention.
  • the system includes a storage unit, an input unit, a data processing unit, and an output unit, and includes the following: From the input unit, the amount of at least one amino acid among the chiral amino acids in blood for determining the eGFR value and the regression curve or cut-off value of the eGFR value are input, and stored in the storage unit, From the input unit, a measurement value of the amount of at least one of the chiral amino acids in the target blood sample is input, and stored in the storage unit, A data processing unit determines a target eGFR value based on the stored measurement value of the amino acid amount and the regression curve or cut-off value; The eGFR value can be output to the output unit.
  • the analysis measurement unit 13 measures the value from the blood sample and stores it in the storage unit 11.
  • a command for causing the information processing apparatus to execute the storage may be included.
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • the formula is as follows: ⁇ Wherein the unit of age is years, the unit of SCr is mg / dL, and the unit of glomerular filtration rate (GFR) is mL / min / 1.73 m 2 body surface ⁇ . For female patients, a correction factor of 0.739 was applied to the calculated value of the mathematical formula.
  • Serum creatinine was measured by an enzymatic method in the same facility. Random urine samples (10 ml) were collected at baseline determination and the ratio of urine protein to creatinine was measured. Other variables at baseline are age, gender, diabetes, systolic blood pressure, diastolic blood pressure, hemoglobin, and renin-angiotensive system inhibitors defined according to codes E10-E14 of the International Classification of Diseases 10th Edition (ICD10) , Beta blockers, and calcium blockers. Patient baseline characteristics are as follows:
  • the first endpoint defined as “kidney outcome” was the sum of end-stage renal disease (ESKD) requiring renal replacement therapy and all-cause mortality.
  • EKD end-stage renal disease
  • the patient received regular follow-up care in an outpatient setting. Data was collected as a source document at the end of 2011. Baseline and follow-up data were collected from hospital medical records and discharge summaries, outpatient records, first visits and visits to dialysis care physicians, and death certificates. Endpoints were confirmed by at least two physicians. Patient follow-up was available accurately. Because (i) this facility is a central hospital in the southern part of Osaka, and there are no other central hospitals in this region, and (ii) the local partnership with doctors in the first visit and dialysis care was good. It is.
  • Sample preparation from human plasma was carried out by modification as described in Journal of Chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 966, 187-192 (2014). Briefly, 20 times the amount of methanol was added to the plasma, and an aliquot (10 ⁇ l of supernatant from methanol homogenate) was taken into a cathode ray tube and NBD derivatized (0.5 ⁇ l of plasma was used for the reaction). ).
  • the solution was dried under reduced pressure and 20 ⁇ l of 200 mM sodium borate buffer (pH 8.0) and 5 ⁇ l of fluorescent labeling reagent (40 mM 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (NBD- Anhydrous MeCN) containing F) was added and then heated at 60 ° C. for 2 minutes. 0.1% TFA aqueous solution (75 ⁇ l) was added and 2 ⁇ l of the reaction mixture was subjected to 2D-HPLC.
  • fluorescent labeling reagent 40 mM 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (NBD- Anhydrous MeCN) containing F
  • the target amino acid fraction was automatically collected using a multi-loop valve and enantioselective column (KSAACSP-001S or Sumichiral oA-3200, 1.5 mm. e. ⁇ 250 mm; self-filling, material was obtained from Shiseido and Sumika Chemical Analysis Service))).
  • KSAACSP-001S or Sumichiral oA-3200, 1.5 mm. e. ⁇ 250 mm; self-filling, material was obtained from Shiseido and Sumika Chemical Analysis Service
  • Ile and Thr having four stereoisomers (L-form, D-form, L-allo-form, D-allo-form), L-form and D-form, and diastereoisomers (L-allo-form and D alloisomers) from the first-dimensional reversed-phase mode (these diastereoisomers are separated in reversed-phase mode).
  • the enantiomers (L and D, L-Allo and D-Allo) were then separated in two dimensions by an enantioselective column.
  • the mobile phase was a mixed solution of MeOH-MeCN containing citric acid or formic acid, and NBD-amino acid fluorescence was excited at 470 nm and detected at 530 nm. All quantitative data were acquired by fluorescence detection. HPLC-MS / MS was used to confirm the presence of D-amino acids in the actual biological matrix.
  • the cut-off value for determining diabetes was calculated based on the ROC curve, and was 0.1 ⁇ g / ml for D-aspartic acid, 2.5 ⁇ g / ml for D-proline, 665 ⁇ g / ml for L-glutamine, And 49.3 ⁇ g / ml for L-isoleucine.
  • D-Allo-Ile is 0.1 ⁇ g / ml or more, D-Leu is 0.5 ⁇ g / ml or more, L-Ser is 134.6 or less, and L-Ile is 58. It was 6 or less. In the case of D / L% -Ala, it was 1.3 or more, and in the case of D / L% -Pro, it was 1.1 or more.

Abstract

血液試料からＤ体及びＬ体のアミノ酸量に基づき、腎障害対象において糖尿病合併を判定するための血液試料の分析方法、糖尿病合併の検査方法、並びに糖尿病合併についての病態情報を出力する試料分析システムの提供を目的とする。　糖尿病合併を判定するために、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－プロリン、Ｌ－グルタミン、及びＬ－イソロイシンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を使用することにより、本発明の目的を達成する。

Description

糖尿病を判定するための血液試料の分析方法及びシステム
　本発明は、血液試料からＤ体及びＬ体のアミノ酸量に基づき糖尿病を判定するための血液試料の分析方法、糖尿病の検査方法、並びに糖尿病についての病態情報を出力する試料分析システムに関する。
　糖尿病は、高血糖を特徴とする代謝障害であり、１型と２型糖尿病に大別される。１型糖尿病は、遺伝的要因及びウイルス感染により、免疫反応が誘発され、β細胞が選択的に破壊されて発症する病気であり、通常、自己免疫により生じるが、稀に特発的に生じることが知られている。２型糖尿病は、インスリン分泌低下と感受性低下の二つを原因とする糖尿病である。２型糖尿病は、生活習慣病に分類されているが、その原因は完全に明らかにされているわけではない。遺伝的に糖尿病になりやすい体質（遺伝因子）の人が、糖尿病になりやすいような生活習慣を送ること（環境因子）によって２型糖尿病が発症すると考えられている。
　インスリンは、主として血糖を抑制する作用を有しており、骨格筋におけるグルコース、アミノ酸、カリウムの取り込み促進とタンパク質合成の促進、肝臓における糖新生の抑制、グリコーゲンの合成促進・分解抑制、脂肪組織における糖の取り込みと利用促進、脂肪の合成促進・分解抑制などの作用により血糖を抑制し、グリコーゲンや脂肪などの各種貯蔵物質の新生を促進する作用を有する。健常者では、インスリンの作用により、血中の血糖は常に一定範囲に保たれている。血糖は、エネルギー源として重要である反面、高濃度のグルコースはそのアルデヒド基の反応性の高さのため生体内のタンパク質と反応して糖化反応を起こし、生体に有害な作用をもたらす。そのため、インスリン恒常性における異常により生じる過剰な血糖は、神経障害や微小血管障害を引き起こし、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などを発症する。最終的には、失明、皮膚潰瘍形成、四肢切断、心臓病、及び腎障害を含む多数の合併症に結びつくことになる。
　糖尿病の診断には、通常タンパク質バイオマーカーであるヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）が使用される。ヘモグロビンは、血中での寿命が長いため、ＨｂＡ１Ｃは、血糖管理の長期的尺度としての役目を果たしている。一方で、ＨｂＡ１Ｃは、患者の糖尿病治療の効果を確認するためにも使用されているが、治療を受けた患者においては矛盾する結果が生じることもあった。したがって、糖尿病の判定には、通常、ＨｂＡ１Ｃと空腹時血糖値とをそれぞれマーカーとして併用し、両方のマーカーがともに糖尿病を指し示す場合は、糖尿病と診断する一方で、一方のみのマーカーが糖尿病を指し示す場合には、さらに糖尿病の典型的症状を観察することで糖尿病の診断が行われている。したがって、依然として最終的には、診断する医師の解釈及び判断に依存することになる。また、ＨｂＡ１Ｃは、糖尿病治療を受けた患者における短期の治療効果の判定には適しておらず、１，５－アンドロ－Ｄ－グリシトールやグルコアルブミンなどの短期糖尿病マーカーを併用することで治療効果の判定や経過観察が行われている。
　したがって、医師の解釈や判断を排除して、診断を可能にする糖尿病マーカーの開発が望まれており、生体試料中のＡｐｏＣＩＩＩタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ＯＬＭＦ４ポリペプチドなどが新規の糖尿病マーカーとして発見されている（特許文献１～３）が、ＨｂＡ１Ｃを代替して使用できるような満足行くマーカーは未だ得られていない。
　糖尿病の合併症として、糖尿病性腎症が知られている。糖尿病により血糖値が高い状態が続くと、腎臓の糸球体が損傷され、腎機能が低下する。慢性腎不全の原因の一つとして糖尿病が挙げられ、糖尿病合併腎不全患者と、糖尿病非合併腎不全患者とは治療方針がことなるため、腎不全患者における糖尿病の合併の診断をより簡便かつ精度高く行うことが必要とされている。腎不全患者においては尿アルブミン値又は尿アルブミン/クレアチニン比が糖尿病合併のマーカーとして知られているが、定量性、感度、コスト等の点で問題がある。
　従来、哺乳類の生体には存在しないと考えられていたＤ-アミノ酸が、検出技術の発達に伴い（特許文献４）、様々な組織において存在することが明らかにされてきており、何らかの生理機能を担うことが予測されていた。体液中の幾つかのＤ－アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸とは独立して変動することが分かっており、疾病の種類に応じて変動することが示された（特許文献５）。特許文献５では、糖尿病患者におけるＤ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸の変動が調べられていたが、これらの４０種のキラルアミノ酸のうち、Ｄ－アラニン、Ｌ－システイン及びＬ－グルタミン酸が、糖尿病患者で変動することが確認されていた一方で、他のアミノ酸での変動は確認できていなかった。
特許第５８７６８２６号公報 特許第５５７１６９６号公報 特許第５６９８２５４号公報 特許第４２９１６２８号公報 国際公開第２０１３／１４０７８５号
Transl Res. 2012 Apr;159(4):303-12. International Diabetes Fegderation　Managing Older People with type 2 diabetes　Global Guide line
　空腹時血糖値やＨｂＡ１Ｃなどの既存の糖尿病の診断マーカー、及び尿アルブミン値又は尿アルブミン/クレアチニン比といった腎障害における糖尿病合併診断マーカーに代わる診断マーカーを同定し分析する技術、並びにそれにより糖尿病を正確に判定、検査又は診断する技術の開発が望まれている。
　本発明者らは、腎障害を患うコホートの血中のキラルアミノ酸の解析していたところ、当該コホートにおいて、幾つかのキラルアミノ酸が驚くべきことに糖尿病と関連して変動することを見出し、本発明に至った。
　したがって、本発明は、糖尿病を判定するための血液試料の分析方法であって、キラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量に基づき、糖尿病を判定できる、分析方法に関する。
　さらに別の態様では、本発明の分析方法を実施することができる試料分析システムに関する。このような試料分析システムは、記憶部と、入力部と、分析測定部と、データ処理部と、出力部とを含んでおり、血液試料を分析し、糖尿病の病態情報を出力することができる。
　さらに別の態様では、本発明の試料分析システムにインストールされうるプログラム及び当該プログラムを格納する記憶媒体にも関する。
　タンパク質の糖化や腎機能の低下により尿中に現れるアルブミン量とは異なる原理で変動しうる新規の糖尿病マーカーを提供することができ、複数のキラルアミノ酸量を併用して用いることでより精度の高い判定を可能にする。
図１－Ａは、Ｄ－Ａｓｐによる糖尿病の診断の感度・特異度についてのＲＯＣ曲線を示す。 図１－Ｂは、Ｄ－Ｐｒｏによる糖尿病の診断の感度・特異度についてのＲＯＣ曲線を示す。 図１－Ｃは、Ｌ－Ｇｌｎによる糖尿病の診断の感度・特異度についてのＲＯＣ曲線を示す。 図１－Ｄは、Ｌ－Ｉｌｅによる糖尿病の診断の感度・特異度についてのＲＯＣ曲線を示す。 図２－Ａは、糖尿病を患う対象と、糖尿病を患わない対象におけるＤ－Ａｓｐの量を示す。 図２－Ｂは、糖尿病を患う対象と、糖尿病を患わない対象におけるＤ－Ｐｒｏの量を示す。 図２－Ｃは、糖尿病を患う対象と、糖尿病を患わない対象におけるＬ－Ｇｌｎの量を示す。 図２－Ｄは、糖尿病を患う対象と、糖尿病を患わない対象におけるＬ－Ｉｌｅの量を示す。 図３－Ａは、年齢とＤ－Ａｌａ値との相関を示す図（１）及びＲＯＣ曲線を示す図（２）、さらに年齢とＤ／Ｌ％値との間のＲＯＣ曲線を示す図（３）である。 図３－Ｂは、年齢とＤ－Ｐｒｏ値との相関を示す図（１）及びＲＯＣ曲線を示す図（２）、さらに年齢とＤ／Ｌ％値との間のＲＯＣ曲線を示す図（３）である。 図３－Ｃは、年齢とＤ－アロ－Ｉｌｅ値との相関を示す図（１）及びＲＯＣ曲線を示す図（２）である。 図３－Ｄは、年齢とＤ－Ｌｅｕ値との相関を示す図（１）及びＲＯＣ曲線を示す図（２）である。 図３－Ｅは、年齢とＬ－Ｉｌｅ値との相関を示す図（１）及びＲＯＣ曲線を示す図（２）である。 図３－Ｆは、年齢とＬ－Ｓｅｒ値との相関を示す図（１）及びＲＯＣ曲線を示す図（２）である。 図４－Ａは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ａｓｎ値、（２）Ｄ－Ａｓｎ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ａｓｎ値との相関を示す図である。 図４－Ｂは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｓｅｒ値、（２）Ｄ－Ｓｅｒ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ｓｅｒ値との相関を示す図である。 図４－Ｃは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ａｓｐ値、（２）Ｄ－Ａｓｐ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ａｓｐ値との相関を示す図である。 図４－Ｄは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ａｌａ値、（２）Ｄ－Ａｌａ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ａｌａ値との相関を示す図である。 図４－Ｅは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｉｌｅ値、及び（２）Ｄ－アロ－Ｉｌｅ値との相関を示す図である。 図４－Ｆは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｐｈｅ値、（２）Ｄ－Ｐｈｅ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ｐｈｅ値との相関を示す図である。 図４－Ｇは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｌｙｓ値、（２）Ｄ－Ｌｙｓ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ｌｙｓ値との相関を示す図である。 図４－Ｈは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｔｈｒ値、及び（２）Ｄ－アロ－Ｔｈｒ値との相関を示す図である。 図４－Ｉは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｐｒｏ値、（２）Ｄ－Ｐｒｏ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ｐｒｏ値との相関を示す図である。 図４－Ｊは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｌｅｕ値、（２）Ｄ－Ｌｅｕ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ｌｅｕ値との相関を示す図である。 図４－Ｋは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｔｒｐ値との相関を示す図である。 図４－Ｌは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｔｙｒ値との相関を示す図である。 図４－Ｍは、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と（１）Ｌ－Ｈｉｓ値、（２）Ｄ－Ｈｉｓ値、及び（３）Ｄ／Ｌ－Ｈｉｓ値との相関を示す図である。 図５は、本発明の分析システムの構成図である。 図６は、糖尿病合併を決定するための動作の例を示すフローチャートである。 図７は、腎障害及び糖尿病合併を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
　本発明は、対象において、糖尿病を判定するための血液試料の分析方法であって、キラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量を測定する工程、及び当該少なくとも１種類のアミノ酸の測定量を元に、糖尿病を判定する工程を含む、分析方法に関する。本発明の分析方法によって、糖尿病の病態を判断できることから、別の態様では、本発明は診断方法ということもできる。
　キラルアミノ酸の量を測定する工程は、目的のキラルアミノ酸のみを測定してもよいし、他のキラルアミノ酸とまとめて測定することもできる。また、キラルアミノ酸は、他の疾患の診断マーカーになりうる。したがって、複数の疾患を一度に解析する観点から、血液試料中の２０種のタンパク質構成アミノ酸について、Ｄ体及びＬ体をまとめて測定することが好ましい。キラルアミノ酸の量を測定する工程の前に、血液試料を取得する工程、取得された血液試料を処理する工程が行われてもよい。血液試料は、血液、血清、血漿など血液に由来する試料であれば任意の試料であってよい。
　糖尿病を判定する工程は、特定のキラルアミノ酸量がカットオフ値と比較することで糖尿病の罹患の有無を判定することができる。カットオフ値を高値側又は低値側のどちらに超えるかについては、使用するキラルアミノ酸が、糖尿病を罹患する場合に増加するのか減少するのかに応じて適宜選択できる。例えば、Ｄ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｐｒｏ、及びＬ－Ｇｌｎの場合、糖尿病患者では減少するため、低値群に属した場合に、糖尿病を罹患すると判定でき、高値群に属した場合に、糖尿病を罹患しないと判定できる。一方で、Ｌ－Ｉｌｅの場合、糖尿病患者では増加するため、高値群に属した場合に、糖尿病を罹患すると判定でき、低値群に属した場合に、糖尿病を罹患しないと判定できる。キラルアミノ酸の測定量のみから判定を行ってもよいし、キラルアミノ酸の測定量を、任意の変数や定数で加工した指標値を用いてもよい。したがって、測定量には、測定量から求めた指標値も含まれるものとする。本発明では、指標値とは、アミノ酸の測定量であってもよいし、測定量に基づいて計算されてもよく、例えば対応する異性体（すなわち、Ｄ体ならＬ体、Ｌ体ならＤ体）との濃度比、割合等であってもよい。変数としては、対応する異性体の量の他に、年齢、体重、性別、ＢＭＩなど、キラルアミノ酸量に影響しうる任意の変数を利用することができる。
　糖尿病の判定は、具体的に、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量を、カットオフ値に基づき２又はそれ以上の群に分類し、その分類に応じて糖尿病を決定することができる。本発明者らにより、血液中の特定のキラルアミノ酸の量が高値又は低値になると、糖尿病を発症していることが見いだされていることから、高値群又は低値群に属する場合に、糖尿病を患っていると判定できる。したがって、判定は、医師ではない医療補助者などにより行われてもよいし、分析機関などが行うこともできる。したがって、本発明の分析方法は、診断の予備的方法又は補助方法と言うこともできる。
　本発明の別の態様では、本発明の分析方法は、糖尿病を判定する工程に代わり、糖尿病を判定するための病態指標値として算出する工程を含んでもよい。この方法で分析の結果算出される病態指標値を、予め決定されたカットオフ値と比較することで、糖尿病を発症していることを判定することができる。
　本発明において、糖尿病の判定のために用いる特定のキラルアミノ酸とは、タンパク質構成アミノ酸のＤ体又はＬ体のことをいう。Ｄ体とＬ体は体内の動態や代謝が異なるため、Ｄ体とＬ体を識別することにより高い精度で予後予測が可能となる。タンパク質構成アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）が挙げられる。このうち、より高い精度で糖尿病を判定する観点から、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｄ－プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）、Ｌ－グルタミン（Ｌ－Ｇｌｎ）、及びＬ－イソロイシン（Ｌ－Ｉｌｅ）が好ましい。さらに好ましくは、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｄ－プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）、Ｌ－グルタミン（Ｌ－Ｇｌｎ）、及びＬ－イソロイシン（Ｌ－Ｉｌｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸、又はそれらの任意の組合せが使用される。
　糖尿病の判定のための境界は、コホートを解析し、統計処理することで任意に決定することができる。統計処理の手法は、当業者に周知のものを使用すればよく、例えばＲＯＣ解析、ｔ検定などが用いられてもよいし、健常者群又は糖尿病患者群の平均値、中央値、Ｘパーセンタイル値を使用することもできる。ここでＸは任意の数値を選択することができ、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７を適宜使用することができる。カットオフ値は１つであってもよいし、疾患の重篤度に応じて病態を分類することもできる。コホートの種類によって、境界を定めるカットオフ値は異なるが、一例として、本願実施例で使用したコホートをＲＯＣ解析により、糖尿病を決定するためのカットオフ値は、Ｄ－アスパラギン酸の場合０．１μｇ／ｍｌ、Ｄ－プロリンの場合２．５μｇ／ｍｌ、Ｌ－グルタミンの場合６６５μｇ／ｍｌ、及びＬ－イソロイシンの場合４９．３μｇ／ｍｌを使用することができる。対象の血中Ｄ－アミノ酸濃度が、これらのカットオフ値より高い又は低い場合に、糖尿病を発症していると認定することができる。しかしながら、使用されるカットオフ値を、上記カットオフ値に限定されることを意図するものではない。
　対象とは、任意の対象であってよく、例えば健常者、糖尿病を患う可能性のある者について、本発明の分析方法が行われうる。ある態様では、健康診断において、本発明を分析方法が使用されるため、対象には任意の対象が含まれてよい。
　本発明の別の態様では、対象は、腎障害を患う対象である。この場合、本発明において糖尿病の判定は、腎障害を患うと判定された患者において、糖尿病を合併症として有するか否かの判定が可能になる。したがって、一の態様では、本発明における対象とは、腎障害と診断又は判定された患者を指す。腎障害は、腎機能の低下が見られる状態をいい、急性腎不全と慢性腎不全に大別される。腎機能の低下は、糸球体濾過量（ＧＦＲ）の低下により決定されるが、クレアチニン値から、年齢、性別などの変数を元に算出される推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）により決定されてもよい。さらなる別の態様では腎機能の低下を示す腎障害マーカー、例えば血清クレアチニン濃度、ＫＩＭ－１やＮＧＡＬなどにより決定されてもよい。さらに別の態様では、腎障害と判定された患者を、キラルアミノ酸のうち、腎障害の判定に用いる少なくとも１のアミノ酸の量を測定し、その測定量に基づいて前もって又は同時に判定することもできる。
　したがって、本発明のさらなる態様では、任意の対象において、腎障害と判定するとともに、糖尿病合併を判定することを目的とした血液試料の分析方法にも関する。この分析方法では、キラルアミノ酸のうち、腎障害の判定に用いる少なくとも１のアミノ酸と、糖尿病の合併の判定に用いる少なくとも１のアミノ酸の量を測定する工程、及び当該腎障害の判定に用いる少なくとも１のアミノ酸の測定量を元に、腎障害を判定する工程、及び腎障害と判定された場合に、当該糖尿病合併の判定に用いる少なくとも１のアミノ酸の測定量を元に、糖尿病合併を判定する工程を含む。
　糖尿病を判定するためには、従前空腹時血糖値やＨｂＡ１Ｃなどの既存の糖尿病の診断マーカーを用いるか、腎障害が診断された患者において尿アルブミン値又は尿アルブミン/クレアチニン比を測定する必要があった。したがって、腎障害を患う患者における糖尿病の併発を診断するためには、腎障害マーカーと糖尿病マーカーをそれぞれ解析する必要があったところ、本発明を用いれば、すでに取得されたキラルアミノ酸量を元に、腎障害を判定したうえで、糖尿病合併を判定することが可能となる。
　腎障害の判定は、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量に基づき行われる。
本発明者らにより、血液中のＤ－アスパラギン、Ｄ－セリン、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－アロ－スレオニン、Ｄ－アラニン、Ｄ－プロリン、Ｄ－ロイシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、及びＬ－チロシンからなる群から選ばれる少なくとも１のキラルアミノ酸の量が、ｅＧＦＲ値と相関することが見出されている（図４Ａ－Ｌ）ことから、これらのキラルアミノ酸量を用いて、腎障害を判別できる。より具体的には、腎障害は、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量を、予め分類された２又はそれ以上の群に当てはめることにより腎障害を判定でき、さらなる態様では腎障害の重篤度を判定することができる。
　腎障害の判定のための境界も同様にコホートを解析し、統計処理することで任意に決定することができる。統計処理の手法は、当業者に周知のものを使用すればよく、例えばＲＯＣ解析、ｔ検定などが用いられてもよいし、健常者群又は患者群の平均値、中央値、Ｘパーセンタイル値を使用することもできる。ここでＸは任意の数値を選択することができ、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７を適宜使用することができる。カットオフ値は１つであってもよいし、疾患の重篤度に応じて病態を分類することもできる。腎障害の判定に用いられるキラルアミノ酸としては、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－セリン、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－アロ－スレオニン、Ｄ－アラニン、Ｄ－プロリン、Ｄ－ロイシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、及びＬ－チロシンが挙げられ、それぞれのカットオフ値はコホート解析を行い任意に決定することができる。対象の血中Ｄ－アミノ酸濃度が、カットオフ値より高い場合に、腎障害と判定することができる。
　本発明のさらなる態様では、本発明は、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量に基づき、ｅＧＦＲ値を決定する方法に関する。この方法では、血液試料中の少なくとも１のキラルアミノ酸の量を測定する工程、及び当該少なくとも１のキラルアミノ酸の測定値に基づきｅＧＦＲ値を決定する工程を含む。一の態様では、キラルアミノ酸の測定値に基づきｅＧＦＲ値を決定する工程は、予め決定された回帰曲線に基づいて決定することができる。さらに別の態様では、キラルアミノ酸の測定値に基づきｅＧＦＲ値を決定する工程は、予めコホートをキラルアミノ酸の量に応じて複数の群に分け、当該群とｅＧＦＲ値又はその範囲とが予め関連づけておき、測定値を当該群に分類すればよい。このようなキラルアミノ酸としては、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－セリン、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－アロ－スレオニン、Ｄ－アラニン、Ｄ－プロリン、Ｄ－ロイシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、及びＬ－チロシンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を使用することができる。
　キラルアミノ酸は、その種類に応じて腎障害マーカーと糖尿病マーカーにもなりうることから、キラルアミノ酸を網羅的に測定しておくことで、腎障害を判定したうえで、糖尿病の合併症を判定することができる。
　腎障害患者において増加又は減少が見られないキラルアミノ酸が、腎障害患者において糖尿病合併を判定する上で好ましく、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｌ－グルタミン（Ｌ－Ｇｌｎ）、及びＬ－イソロイシン（Ｌ－Ｉｌｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸、又はそれらの任意の組合せが使用される。
　試料中のキラルアミノ酸量の測定は、当業者に周知ないかなる方法を用いて実施してもよい。例えば、予めｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－システイン（Ｂｏｃ－Ｌ－Ｃｙｓ）その他の修飾試薬で立体異性特異的にＤ－及びＬ－アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ－８０ＴｓＱＡのような分析カラムを用いて１００ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）とアセトニトリルの混液をグラジエント溶離して分離する方法により、アミノ酸のＤ－体及びＬ－体の同時測定に用いることができる。また、予め４－フルオロ－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ－Ｆ）のような蛍光試薬でＤ－及びＬ－アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ－８０ＴｓＱＡ、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ　ＲＰ－１８ＧＰ等のような分析カラムを用いて立体異性非特異的に各アミノ酸を分離した後、Ｐｉｒｋｌｅ型キラル固定相カラム（例えばＳｕｍｉｃｈｉｒａｌ　ＯＡ－２５００Ｓ又はＲ）を用いて光学分割する方法が、タンパク質を構成するアミノ酸の微量測定に用いることができる（浜瀬健司及び財津潔、分析化学、５３巻、６７７－６９０（２００４））。本明細書における光学分割カラム系は、少なくとも光学分割カラムを用いる分離分析系をいい、光学分割カラム以外の分析カラムによる分離分析を含む場合がある。より具体的に、光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、前記試料の前記成分の各々をマルチループユニットにおいて個別に保持するステップ、前記マルチループユニットにおいて個別に保持された前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に流路を通じて供給し、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップを含むことを特徴とする光学異性体の分析方法を用いることにより、試料中のＤ-／Ｌ-アミノ酸濃度を測定することができる（特許第４２９１６２８号）。代替的には、アミノ酸の光学異性体を識別するモノクローナル抗体、例えばＤ－ロイシン、Ｄ－アスパラギン酸等に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によってＤ－アミノ酸を定量することができる（特開2009-184981明細書）。
　本発明では、血液試料中のキラルアミノ酸量を単独で糖尿病の判定に用いてもよいし、糖尿病の判定に用いることができる他の１以上のキラルアミノ酸量と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の分析方法は、さらに糖尿病に関する変数を測定する工程を含んでもよく、キラルアミノ酸量と、かかる変数とを組み合わせて、糖尿病の判定に使用することができる。このような変数として、糖尿病の病歴、年齢、性別、空腹時血糖の有無が挙げられ、更には既知の糖尿病マーカーや糖尿病合併マーカーも挙げられる。このような既知のマーカーとしては、ＨｂＡ１Ｃ、空腹時血糖値、１，５－アンドロ－Ｄ－グリシトール、グルコアルブミン、尿アルブミン値又は尿アルブミン/クレアチニン比などが挙げられる。
　本発明の分析方法で糖尿病又は糖尿病と腎障害の合併を判定した場合に、糖尿病及び／又は糖尿病性腎症に適した治療が選択して行われる。以下のものに限定されるものではないが、例えば、血糖値管理、生活習慣改善などの治療をさらに行うことが必要となる。血糖値管理を目的として、インスリン抵抗性改善、インスリン分泌促進、糖吸収排泄調節を目的として、ビグアナイド薬、チアゾリジン薬、スルホニル尿素薬、インスリン分泌促進薬、ＤＰＰ４阻害薬、α－グルコシダーゼ阻害薬、ＳＧＬＴ２阻害薬などの投薬治療が行われる。生活習慣の改善としては、例えば禁煙やＢＭＩ値の低下のための運動、食事制限が指導される。これらの治療方針は、キラルアミノ酸量に基づいて、医師との問診を受けた上で決定される。したがって、本発明の別の態様では、本発明の分析方法を実施し、さらに糖尿病合併している腎障害の治療行うことを含む、糖尿病合併腎障害の治療方法に関する。治療方法の詳細については、例えば非特許文献１や非特許文献２を参照することで、適切に選択することができる。これらの文献は、本明細書中に援用される。
　本発明のさらなる態様では、キラルアミノ酸を用いて、対象における推定年齢の決定方法に関する。この方法は、血液試料中のＤ－アラニン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－アロ－イソロイシン、Ｄ－プロリン、Ｌ－セリン、及びＬ－イソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量を測定する工程、及び前記少なくとも１種類のアミノ酸の測定量と、予め決定された年齢とＤ－アミノ酸値との相関曲線に基づき年齢を決定する工程を含む。この方法は、血中のキラルアミノ酸のうちの幾つかが、年齢と相関性を有することを見いだしたことに基づく（図３Ａ～Ｆ）。予め、任意のコホートにおいて年齢と、年齢判定用のキラルアミノ酸との間で回帰曲線やカットオフ値を取得しておき、測定値と比較することで、年齢判定用のキラルアミノ酸値に基づき、推定年齢を決定することができる。かかる方法によると、意識不明者や認知症患者において年齢の推定が可能となる。
　カットオフ値としては、例えば７０歳超の対象を判別できるカットオフ値としては、本発明のコホートを用いて計算した場合に、Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）の場合４．７μｇ／ｍｌ以上であり、Ｄ-プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）の場合２．５μｇ／ｍｌ以上であり、Ｄ－アロイソロイシン（Ｄ－アロ－Ｉｌｅ）の場合０．１μｇ／ｍｌ以上である、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）の場合０．５０以上であり、Ｌ－セリン（Ｌ－Ｓｅｒ）の場合１３４．６以下であり、Ｌ－イソロイシン（Ｌ－Ｉｌｅ）の場合５８．６以下を選択することができる。年齢に対するカットオフ値が適宜選択することができる。年齢に対するカットオフ値が適宜選択することができる。
　本発明の試料分析システム及びプログラムは、本発明の方法を実施するように構成される。図５は、本発明の試料分析システムの構成図である。このような試料分析システム１０は、記憶部１１と、入力部１２、分析測定部１３と、データ処理部１４と、出力部１５とを含んでおり、対象の血液の試料を分析し、病態情報を出力することができる。より具体的に、本発明の試料分析システム１０において、
　記憶部１１は、入力部１２から入力された糖尿病を判別するための、血中キラルアミノ酸量のカットオフ値と糖尿病の病態情報を記憶し、
　分析測定部１３は、前記対象の血液試料中のタンパク質構成アミノ酸のうちの少なくとも１の糖尿病を判別するためのキラルアミノ酸を分離して定量し、
　データ処理部１４は、前記少なくとも１のキラルアミノ酸の量の測定値を、記憶部１１に記憶されたカットオフ値と比較することにより、対象の糖尿病の情報を決定し、
　出力部１５が対象の糖尿病についての病態情報を出力することができる。
　本発明の試料分析システム及びプログラムにおいて、さらに
　記憶部１１は、入力部１２から入力された腎障害を判別するための血中キラルアミノ酸量のカットオフ値と腎障害の情報を記憶し、
　分析測定部１３は、前記対象の血液試料中のタンパク質構成アミノ酸のうちの少なくとも１の腎障害を判定するためのキラルアミノ酸を分離して定量し、
　データ処理部１４は、前記少なくとも１の腎障害を判別するためのキラルアミノ酸の量の測定値を、記憶部１１に記憶された腎障害を判別するためのキラルアミノ酸のカットオフ値と比較することにより、対象の腎障害の情報を決定すること
　を含んでもよく、これにより出力部１５が、対象の腎障害の情報と共に糖尿病についての病態情報を出力することができる。
　記憶部１１は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等のメモリ装置、ハードディスクドライブ等の固定ディスク装置、又はフレキシブルディスク、光ディスク等の可搬用の記憶装置などを有する。記憶部１１は、分析測定部で測定したデータ、入力部１２から入力されたデータ及び指示、データ処理部１４で行った演算処理結果等の他、情報処理装置の各種処理に用いられるコンピュータプログラム、データベースなどを記憶する。コンピュータプログラムは、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体や、インターネットを介してインストールされてもよい。コンピュータプログラムは、公知のセットアッププログラム等を用いて記憶部にインストールされる。
　入力部１２は、インターフェイス等であり、キーボード、マウス等の操作部も含む。これにより、入力部は、分析測定部１３で測定したデータ、データ処理部１４で行う演算処理の指示等を入力することができる。また、入力部１２は、例えば分析測定部１３が外部にある場合は、操作部とは別に、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を介して入力することができるインターフェイス部を含んでもよい。
　分析測定部１３は、血液試料中のキラルアミノ酸の量の測定工程を行う。したがって、分析測定部１３は、キラルアミノ酸の分離及び測定を可能にする構成を有する。アミノ酸は、１つずつ分析されてもよいが、一部又は全ての種類のアミノ酸についてまとめて分析することができる。分析測定部１３は、以下のものに限定されることを意図するものではないが、例えば試料導入部、光学分割カラム、検出部を備えた高速液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）であってもよい。分析測定部１３は、試料分析システム１０とは別に構成されていてもよく、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を用いて入力部１２を介して入力されてもよい。
　データ処理部１４は、測定されたキラルアミノ酸の量を、記憶部１１に記憶されたカットオフ値と比較することにより、糖尿病の合併を判定するように構成される。データ処理部１４は、記憶部１１に記憶しているプログラムに従って、分析測定部１３で測定され記憶部１１に記憶されたデータに対して、各種の演算処理を実行する。演算処理は、データ処理部１４に含まれるＣＰＵによりおこなわれる。このＣＰＵは、分析測定部１３、入力部１２、記憶部１１、及び出力部１５を制御する機能モジュールを含み、各種の制御を行うことができる。これらの各部は、それぞれ独立した集積回路、マイクロプロセッサ、ファームウェアなどで構成されてもよい。
　出力部１５は、データ処理部１４で演算処理を行った結果である病態指標値及び／又は病態情報を出力するように構成さる。データ処理部１４における演算処理結果は、直接出力部１５に出力されてもよいし、いったん記憶部１１に記憶された上で、必要に応じて出力部１５に出力されてもよい。出力部１５は、演算処理の結果を直接表示する液晶ディスプレイ等の表示装置、プリンタ等の出力手段であってもよいし、外部記憶装置への出力又はネットワークを介して出力するためのインターフェイス部であってもよい。
　図６は、本発明のプログラムによる糖尿病を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
　具体的に、本発明のプログラムは、入力部１２、出力部１５、データ処理部１４、記憶部１１とを含む情報処理装置に糖尿病の情報を決定させるプログラムである。本発明のプログラムは、以下の：
　入力部１２から入力された少なくとも１のキラルアミノ酸の予め決定されたカットオフ値と糖尿病の情報を記憶部１１に記憶させ；
　入力部１２から入力された少なくとも１のキラルアミノ酸の量の測定値を記憶部１１に記憶させ、
　データー処理部１４において、記憶部１１に記憶されたカットオフ値と、記憶部１１に記憶させた測定値とを比較させて、糖尿病の情報を決定し；そして
　糖尿病の情報を出力部１５に出力させる
ことを前記情報処理装置に実行させるための指令を含む。本発明のプログラムは、記憶媒体に格納されてもよいし、インターネット又はＬＡＮ等の電気通信回線を介して提供されてもよい。
　図７は、本発明のプログラムによる腎障害の病態情報とともに、糖尿病合併を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
　具体的に、本発明のプログラムは、入力部１２、出力部１５、データ処理部１４、記憶部１１とを含む情報処理装置に糖尿病合併の情報を決定させるプログラムである。本発明のプログラムは、以下の：
　入力部１２から入力された腎障害判定のための少なくとも１のキラルアミノ酸及び糖尿病の判定のための少なくとも１のキラルアミノ酸の予め決定されたカットオフ値をそれぞれ腎障害及び糖尿病合併の情報と併せて記憶させ；
　入力部１２から入力された腎障害判定のための少なくとも１のキラルアミノ酸及び糖尿病判定のための少なくとも１のキラルアミノ酸の測定値をそれぞれ記憶部１１に記憶させ、
　データー処理部１４において、記憶部１１に記憶されたカットオフ値と、記憶部１１に記憶させた測定値とをそれぞれ比較させて、腎障害及び糖尿病合併の情報を決定し；
　腎障害及び糖尿病の情報を出力部１５に出力させる
ことを前記情報処理装置に実行させるための指令を含む。本発明のプログラムは、記憶媒体に格納されてもよいし、インターネット又はＬＡＮ等の電気通信回線を介して提供されてもよい。
　本発明の別の態様では、本発明のシステムは、推定年齢の決定システムであってもよい。当該システムは、記憶部、入力部、データ処理部、及び出力部を含み、以下の：
　入力部から、年齢を判定するための血中キラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量と、年齢との回帰曲線又はカットオフ値が入力され、記憶部に記憶し、
　入力部から、対象の血液試料中のキラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量の測定値が入力され、記憶部に記憶し、
　データ処理部が、記憶された前記アミノ酸の量の測定値と、前記回帰曲線又はカットオフ値とに基づいて、対象の推定年齢を決定し；
　推定年齢の出力部に出力する
　ことができる。
　本発明のさらなる態様では、本発明は、本発明のｅＧＦＲ値を決定する方法を実行するｅＧＦＲ値の決定システムにも関する。このシステムは、記憶部、入力部、データ処理部、及び出力部を含み、以下の：
　入力部から、ｅＧＦＲ値を判定するための血中キラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量と、ｅＧＦＲ値との回帰曲線又はカットオフ値が入力され、記憶部に記憶し、
　入力部から、対象の血液試料中のキラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量の測定値が入力され、記憶部に記憶し、
　データ処理部が、記憶された前記アミノ酸の量の測定値と、前記回帰曲線又はカットオフ値とに基づいて、対象のｅＧＦＲ値を決定し；
　ｅＧＦＲ値を出力部に出力する
　ことができる。
　情報処理装置が、分析測定部１３を備える場合、入力部１２から少なくとも１のキラルアミノ酸の量の値を入力させる代わりに、分析測定部１３が、血液試料から当該値を測定し記憶部１１に記憶させることを情報処理装置に実行させるための指令を含んでもよい。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
集団及びサンプルの分析
　本発明者らは、２００５年８月～２００９年１月にわたり、りんくう総合医療センター（Rinku General Medical Centre）の第一腎臓内科から、透析を受けていないＣＫＤステージ３、４及び５を患う１１８名の継続患者を、前向き調査に登録した。一晩の絶食後に、患者からベースライン血液試料を取得し、プラスチック製チューブに入れて血漿を調製した。不十分な血液試料しか取得できなかった患者を先んじて取り除いた。
　本試験は、りんくう総合医療センターの倫理委員会により承認された試験であり、そしてヘルシンキ宣言に基づいて行われた。
　ベースラインの包含基準は、年齢９０歳未満、悪性腫瘍についての合併症無し、及び感染症への感染無しとした。不完全なベースラインデータしか得られなかった患者（ｎ＝２）又は不十分な量の血漿試料しか取得できなかった患者（ｎ＝４）、及び登録後１月以内に腎代替療法を開始した患者（ｎ＝４）を取り除いた。本試験は、りんくう総合医療センターの施設内倫理委員会及び大阪総合医療センターにより承認され、そして全ての患者に対して、本試験に参加することについて記入式のインフォームドコンセントを得た。腎機能は、日本人に対して新たに開発された等式に基づいて推定糸球体濾過量（eGFR)を使用して、本医院を最初に受診した際のベースラインデータから評価した。
　式は以下の通りである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　｛式中、年齢の単位は年であり、ＳＣｒの単位はｍｇ／ｄＬであり、そして糸球体濾過量（ＧＦＲ）の単位は、ｍＬ／min/1.73m2体表面である｝。
　女性患者には、数式の計算値に補正係数０．７３９をかけた。
　血清クレアチニンを、同施設内の酵素方法により計測した。ランダムな尿試料（１０ｍｌ）をベースライン決定時に回収して、尿タンパクとクレアチニンの比率を測定した。ベースラインにおける他の変数は、年齢、性別、国際疾病分類第１０版（ＩＣＤ１０）のコードＥ１０～Ｅ１４に従って定義される糖尿病、収縮期血圧、拡張期血圧、ヘモグロビン、及びレニン-アンギオテンシ系阻害剤、βブロッカー、及びカルシウムブロッカーの使用であった。患者のベースライン特徴は以下のとおりである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本試験において「腎臓アウトカム（kidney outcome）」として定義される最初のエンドポイントは、腎代替療法を必要とする末期腎臓病（ＥＳＫＤ）と、全死因死亡の合計とした。患者は、外来で通常のフォローアップケアを受けた。データーを、２０１１年末にソース文書として回収した。ベースライン及びフォローアップデータを、病院の医療記録及び退院サマリー、外来記録、初診及び透析ケア医師との面会、及び死亡診断書から回収した。エンドポイントは、少なくとも２名の医師により確認された。患者のフォローアップは、正確に利用できた。なぜなら（i)本施設が、大阪府の南部の中央病院であり、そしてこの地方に他の中央病院が無いこと、及び（ii)初診及び透析ケアの医師との地域的パートナーシップが良好であったからである。
サンプル調製
　ヒト血漿からのサンプル調製は、Journal of Chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 966, 187-192 (2014)の記載に従い改変して行った。簡潔に記載すると、２０倍量のメタノールを血漿に加え、そして一定量（メタノールホモジネートから得た１０μｌの上清）を、褐色管にとり、そしてＮＢＤ誘導化した（0.5μｌの血漿を反応に用いた）。溶液を減圧下で乾燥し、２０μｌの２００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び５μｌの蛍光標識試薬（４０ｍＭの４-フルオロ-７-ニトロ２，１，３-ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ－Ｆ）をいれた無水ＭｅＣＮ）を加え、次に６０℃で２分間加熱した。０．１％ＴＦＡ水溶液（７５μｌ）を加え、そして２μｌの反応混合液を２Ｄ-ＨＰＬＣに供した。
２Ｄ-ＨＰＬＣによるアミノ酸エナンチオマーの測定
　アミノ酸のエナンチオマーを、J Chromatogr A 1217, 1056-1062 (2010)やJournal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 877, 2506-2512 (2009)に記載される通りに、マイクロ２Ｄ-ＨＰＬＣプラットフォームを用いて定量した。簡潔に記載すると、アミノ酸のＮＢＤ-誘導体を、逆相カラム（モノリシックＯＤＳカラム、０．５３ｍｍi.d.×１００ｍｍ；資生堂）を用い、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ及びＴＦＡを含む水性移動相を用いて勾配溶出した。Ｄ体及びＬ体を分離して測定するために、標的アミノ酸の画分をマルチループバルブを用いて自動的に回収し、そしてエナンチオ選択カラム（ＫＳＡＡＣＳＰ－００１Ｓ又はＳｕｍｉｃｈｉｒａｌ　ｏＡ－３２００，　１．５ｍｍi.e. ×２５０ｍｍ；自己充填、材料を資生堂及びSumika Chemical Analysis Serviceから取得した））に供した。４種の立体異性体（Ｌ体、Ｄ体、Ｌ-アロ体、Ｄ-アロ体）を有するＩｌｅやＴｈｒの計測には、Ｌ体及びＤ体と、ジアステレオ異性体（Ｌ-アロ体及びＤアロ体）とを第一次元の逆相モードにより分離した（これらのジアステレオ異性体は、逆相モードで分離される）。次にそのエナンチオマー（ＬとＤ、Ｌ－アロとＤ－アロ）をエナンチオ選択カラムにより二次元で分離した。移動相は、クエン酸又はギ酸を含むＭｅＯＨ-ＭｅＣＮの混合溶液であり、そしてＮＢＤ-アミノ酸の蛍光を、４７０ｎｍで励起し、５３０ｎｍで検出した。全ての定量データを蛍光検出により取得した。ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて、実際の生物的マトリクス中のＤ-アミノ酸の存在を確認した。
統計処理
　糖尿病の判定は、International Classification of Diseases, Tenth Revision (ICD - 10) codes E10 - E14 に基づき、二人の医師によって判定された。分離した各キラルアミノ酸量を、糖尿病患者及び糖尿病を患わない患者とで分けたところ、Ｄ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｐｒｏ、及びＬ－Ｇｌｅで有意に低値を示し、Ｌ－Ｉｌｅで有意に高値を示した（図２Ａ－２Ｄ）。次にこれらの各キラルアミノ酸の糖尿病の診断特異性を調べるため、本コホートについてＲＯＣ曲線を描いた（図１Ａ－Ｄ）。かかるＲＯＣ曲線に基づき糖尿病判定のためのカットオフ値を求めたところ、Ｄ－アスパラギン酸の場合０．１μｇ／ｍｌ、Ｄ－プロリンの場合２．５μｇ／ｍｌ、Ｌ－グルタミンの場合６６５μｇ／ｍｌ、及びＬ－イソロイシンの場合４９．３μｇ／ｍｌであった。
　次に分離した各キラルアミノ酸量と、年齢との相関を調べた。年齢と各キラルアミノ酸量とを散布図に表し、相関係数を算出したところ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－アロ－Ｉｌｅ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｌ－Ｉｌｅ、及びＬ－Ｓｅｒにおいて、その血液試料中の量と年齢との相関が得られた（ｐ＜０．０５）（図３Ａ－Ｆ（１））。次に７０歳以上の群と、７０歳未満の群とに患者を分け、これらの各キラルアミノ酸と年齢の決定特異性調べるためＲＯＣ曲線を描いた（図３Ａ－Ｆ（２））。また、Ｄ－Ａｌａ及びＤ－Ｐｒｏについては、対応する異性体（すなわちＬ－Ａｌａ及びＬ－Ｐｒｏ）との割合、Ｄ／Ｌ％を算出し、Ｄ／Ｌ％についても同群における年齢の決定特異性調べるためＲＯＣ曲線を描いた（図３Ａ－Ｂ（３））。かかるＲＯＣ曲線に基づき７０歳超の対象を決定するためのカットオフ値を求めたところ、Ｄ－Ａｌａの場合４．７μｇ／ｍｌ以上であり、Ｄ－Ｐｒｏの場合２．５μｇ／ｍｌ以上であり、Ｄ－アロ－Ｉｌｅの場合０．１μｇ／ｍｌ以上である、Ｄ－Ｌｅｕの場合０．５μｇ／ｍｌ以上であり、Ｌ－Ｓｅｒの場合１３４．６以下であり、Ｌ－Ｉｌｅの場合５８．６以下であった。Ｄ／Ｌ％－Ａｌａの場合１．３以上であり、Ｄ／Ｌ％－Ｐｒｏの場合１．１以上であった。
　次に分離した各キラルアミノ酸量と、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）との相関を調べた。ｅＧＦＲ値と各キラルアミノ酸量とを散布図に表し、相関係数を算出したところ、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－セリン、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－アロ－スレオニン、Ｄ－アラニン、Ｄ－プロリン、Ｄ－ロイシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アラニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、及びＬ－チロシンにおいて、その血液試料中の量とｅＧＦＲ値との相関が得られた（図４Ａ－Ｌ（１）～（３））。

Claims (13)

  1. 　対象において、糖尿病を判定するための血液試料の分析方法であって、
    　Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－プロリン、Ｌ－グルタミン、及びＬ－イソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量を測定する工程、
    　前記少なくとも１種類のアミノ酸の測定量を予め決定されたカットオフ値と比較し、糖尿病を判定する工程
    　を含む、前記分析方法。
  2. 　前記カットオフ値が、ＲＯＣ曲線に基づいて求められる、請求項１に記載の分析方法。
  3. 　前記カットオフ値が、Ｄ－アスパラギン酸の場合０．１μｇ／ｍｌ、Ｄ－プロリンの場合２．５μｇ／ｍｌ、Ｌ－グルタミンの場合６６５μｇ／ｍｌ、及びＬ－イソロイシンの場合４９．３μｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の分析方法。
  4. 　前記対象が、腎障害を患う対象である、請求項１～３のいずれか一項に記載の分析方法。
  5. 　記憶部、入力部、データ処理部、及び出力部を含む対象において、糖尿病を判定するための血液分析システムであって、
    　入力部から、糖尿病を判定するための血中キラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量のカットオフ値と糖尿病の病態情報が入力され、記憶部に記憶し、
    　入力部から、対象の血液試料中のキラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量の測定値が入力され、記憶部に記憶し、
    　データ処理部が、記憶された前記アミノ酸の量の測定値を、記憶されたカットオフ値と比較して、対象の糖尿病の病態情報を決定し；
    　糖尿病の病態情報を出力部に出力する
    　を含み、前記糖尿病を判定するための血中キラルアミノ酸が、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－プロリン、Ｌ－グルタミン、及びＬ－イソロイシンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である、前記血液分析システム。
  6. 　分析測定部をさらに含み、該分析測定部が、対象の血液試料から前記血中キラルアミノ酸を分離して定量して測定値を決定し、入力部に代わり又は入力部を介して測定値を入力する、請求項５に記載の血液分析システム。
  7. 　前記カットオフ値が、ＲＯＣ曲線に基づいて求められる、請求項５又は６に記載の血液分析システム。
  8. 　前記カットオフ値が、Ｄ－アスパラギン酸の場合０．１μｇ／ｍｌ、Ｄ－プロリンの場合２．５μｇ／ｍｌ、Ｌ－グルタミンの場合６６５μｇ／ｍｌ、及びＬ－イソロイシンの場合４９．３μｇ／ｍｌである、請求項５～７のいずれか一項に記載の血液分析システム。
  9. 　対象において、年齢の推定方法であって、
    　血液試料中のＤ－アラニン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－アロ－イソロイシン、Ｄ－プロリン、Ｌ－セリン、及びＬ－イソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量を測定する工程、
    　前記少なくとも１種類のアミノ酸の測定量と、予め決定された年齢とアミノ酸値とに基づき年齢を決定する工程
    　を含む、前記推定方法。
  10. 　前記年齢を決定する工程が、カットオフ値に基づき決定される、請求項９に記載の推定方法。
  11. 　前記カットオフ値が、ＲＯＣ曲線に基づき決定され、７０歳以上を推定するためのカットオフ値が、Ｄ－アラニンの場合４．７μｇ／ｍｌ以上であり、Ｄ－プロリンの場合２．５μｇ／ｍｌ以上であり、Ｄ－アロ－イソロイシンの場合０．１μｇ／ｍｌ以上である、Ｄ－ロイシンの場合０．５以上であり、Ｌ－セリンの場合１３４．６以下であり、Ｌ－イソロイシンの場合５８．６以下である、請求項１０に記載の推定方法。
  12. 　前記年齢を決定する工程が、予め決定された回帰曲線に基づき決定される、請求項９に記載の推定方法。
  13. 　記憶部、入力部、データ処理部、及び出力部を含む対象の推定年齢の決定システムであって、
    　入力部から、年齢を判定するための血中キラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量と、年齢との回帰曲線又はカットオフ値が入力され、記憶部に記憶し、
    　入力部から、対象の血液試料中のキラルアミノ酸のうちの少なくとも１種類のアミノ酸の量の測定値が入力され、記憶部に記憶し、
    　データ処理部が、記憶された前記アミノ酸の量の測定値と、前記回帰曲線又はカットオフ値とに基づいて、対象の推定年齢を決定し；
    　推定年齢の出力部に出力する
    　を含み、前記年齢を判定するための血中キラルアミノ酸が、Ｄ－アラニン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－アロ－イソロイシン、Ｄ－プロリン、Ｌ－セリン、及びＬ－イソロイシンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸である、前記決定システム。
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