WO2017191350A1 - Método para la regeneración de tejidos vegetales dañados mediante celulosa bacteriana - Google Patents

Método para la regeneración de tejidos vegetales dañados mediante celulosa bacteriana Download PDF

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WO2017191350A1
WO2017191350A1 PCT/ES2017/070278 ES2017070278W WO2017191350A1 WO 2017191350 A1 WO2017191350 A1 WO 2017191350A1 ES 2017070278 W ES2017070278 W ES 2017070278W WO 2017191350 A1 WO2017191350 A1 WO 2017191350A1
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cellulose
plant tissue
plant
bacterial
tissue
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PCT/ES2017/070278
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Anna LAROMAINE SAGUÉ
Nuria SÁNCHEZ COLL
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Centro De Investigación En Agrigenómica
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G17/00—Cultivation of hops, vines, fruit trees, or like trees
    • A01G17/18—Means for filling-up wounds in trees
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/34—Shaped forms, e.g. sheets, not provided for in any other sub-group of this main group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/16—Coating with a protective layer; Compositions or apparatus therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L1/00—Compositions of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08L1/02—Cellulose; Modified cellulose

Definitions

  • the present invention falls within the field of agriculture and botany, specifically within the methods and materials useful for the regeneration of wounds in plants.
  • Wounds in plants are frequently caused by cuts during the process of harvesting their fruits and, in general, during the activity of the agricultural industry. Although such wounds can also be caused by various other causes such as, for example, natural aggressions, infections by phytopathogenic organisms or human manipulation. Wounds in plants represent a dangerous route of entry for pathogenic organisms, thus facilitating the development of serious infections in plant tissues that can be extended to the entire plant, which can ultimately lead to serious losses in agricultural crops . The healing of wounds in plant tissues is, therefore, a challenge of great relevance for the agricultural and grafting industry.
  • ES2163977A1 where a waterproofing-sealant composition of tree cuts is disclosed, which has as its main products an ethene-vinyl copolymer emulsion, insulating-barrier products with respect to ozone, fatty acid triesters and glycerin; a protective colloid based on a cellulose hydroxyethyl ether colloid and a quartz-based cap-pore.
  • JPH1033069A describes a patch for treating plant wounds, which is obtained by mixing chitin powder with a non-vulcanized natural rubber, in addition to components such as an antibacterial agent, an antifungal agent, a plasticizer and a natural material such as Cellulose as filler material.
  • EP0290155A2 refers to an absorbent material in sheet form for application in wounds of plants comprising several layers of different materials.
  • CN102334514A refers to an agent to cure
  • i wounds on trees that, among other components, contain hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose.
  • Cellulose constitutes an almost inexhaustible biopolymer, being the most abundant natural polysaccharide in the biosphere.
  • cellulose is predominantly obtained from plants, it can also be synthesized by bacteria, algae and fungi.
  • bacterial cellulose (CB) produced by microbes has the same molecular formula as vegetable cellulose but has the particularity of being a pure biopolymer that has a higher degree of polymerization and a better crystallinity.
  • the CB also has high porosity, is transparent in the UV-NIR and has a high water retention capacity.
  • a unique feature of CB is the possibility of modifying its micro (nano) structure and shape during biosynthesis.
  • CB has important effects on wound regeneration in humans, especially in burn recovery (Czaja W., et al., 2006, Biomaterials, 27: 145; Rajwade JM., Et al., 2015, Applied Microbiology and Biotechnology, 99: 2491).
  • new treatments are required for the regeneration of wounds in plant tissues that allow correct tissue healing and, preferably, also help prevent and / or treat infections caused by pathogenic organisms that may be favored by the existence of tissue structure damage.
  • the present invention provides a method for effectively regenerating damaged plant tissues. Said method is based on the use of cellulose, preferably bacterial cellulose (CB), which is applied directly on the damaged area allowing its rapid healing or healing.
  • CB bacterial cellulose
  • the present invention thus demonstrates the regenerative potential of cellulose, preferably bacterial cellulose, over plant wounds
  • the method described in the present invention provides a chemical composition material to the structure of the plant.
  • This method has the advantage that it allows a correct and complete healing of the damaged area in a short period of time since, as the examples described below demonstrate, the creation of new tissue in the damaged areas can be observed after approximately, although not limited, 48h.
  • said method is applicable in the regeneration of wounds caused by any cause, from cuts to damage caused by abrasion, in any type of fabric, although preferably in non-lignified tissues, and in any type of plant.
  • the cellulose used in the method of the invention can be used in combination with one or more antibacterial, antifungal and / or antiviral components, such as silver nanoparticles, thus further allowing the prevention and / or treatment of bacterial, fungal infections. or viral on the damaged area of the plant.
  • method of the invention comprises: a. contacting, preferably directly, the damaged plant tissue with cellulose, preferably with a cellulose sheet, and
  • the cellulose is applied directly to the damaged plant tissue, ex vivo or in vivo, so that said cellulose completely or partially covers, more preferably totally, the affected area.
  • Cellulose has a linear or fibrous structure, in which multiple hydrogen bonds are established between the hydroxyl groups of different juxtaposed glucose chains, making them very resistant and insoluble to water. In this way, compact fibers that constitute the cell wall of plant cells originate, thus giving them the necessary stiffness.
  • Cellulose can be extracted or obtained from plant sources, particularly from woody plants, such as, for example, but not limited to, trees, such as pine or eucalyptus, or other plants, such as grasses, bamboos, starch, wheat, corn, barley , sorghum, sugarcane bagasse, cottons, linens, hemp or others.
  • Cellulose can also be obtained from other non-plant sources, such as bacteria, algae or fungi, or by in vitro enzymatic synthesis or in vitro chemical synthesis from benzylated glucose derivatives.
  • bacteria from which bacterial cellulose can be obtained are, but not limited to, bacteria of the genera Dictyostelium, Acetobacter, Alkali-genes, Pseudomonas, Aerobacter, Achromobacter, Azotobacter, Salmonella, Sarcina, Agrobacterium, Rhizobium or Gluconacetobacter.
  • An example of fungi from which fungal cellulose can be obtained is, but not limited to, Trichoderma reesei.
  • Examples of algae from which cellulose can be obtained are, although not limited to, Cladophora, Rhodophyta, Pyrrophyta, Chrysophycease, Xanthophyceae, Phaeophyta or Chlorophyta.
  • Cellulose as defined in the present invention may be, but is not limited to, lignocellulose, plant cellulose, cellulose of bacterial origin, cellulose of fungal origin, cellulose fibers, nanocomposite cellulose or cellulose crystals, preferably nanocellulose, microcrystalline cellulose or cellulose nanocrystals.
  • the cellulose format can be any that allows it to cover the area to be regenerated or cured, for example and without limitation, in the form of a sheet, in the form of a gel or in the form of a suspension.
  • the suspension can be combined with a suitable propellant by subjecting the assembly to pressure, and applied in the area to be treated as a spray, or alternatively be atomized without the need to use a propellant.
  • the cellulose is plant or bacterial cellulose.
  • Bacterial cellulose produced by microorganisms, has the same molecular formula as plant cellulose, so both can be applied interchangeably in the method described in the present invention by presenting similar physicochemical properties.
  • the examples shown below demonstrate the usefulness of both types of cellulose, plant and bacterial, in the healing of wounds in plant tissues.
  • bacterial cellulose has the advantages that it has a higher degree of polymerization than plant cellulose and a better crystallinity and purity.
  • it has high porosity and high water retention capacity. Therefore, this type of cellulose is preferably used in the regeneration method of damaged plant tissue described in the present invention.
  • the cellulose is bacterial cellulose.
  • Bacterial cellulose or “CB” is that cellulose formed and secreted by bacteria, preferably in culture.
  • the CB for its purity and highly crystalline structure, stands out as an alternative source to that of plant origin.
  • the production of CB in the Monera kingdom is diversified, the synthesis is observed in species within the genera, but without limitation, Achromobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Sarcina, Zoogloea and Gluconacetobacter, to the latter belongs G.
  • bacterial cellulose is produced by bacteria of the genus Gluconacetobacter.
  • the bacterium of the genus Gluconacetobacter is selected from among Gluconacetobacter xylinus or Gluconacetobacter europaeus.
  • G. xylinus is the most preferred in the present invention, since it has a high cellulose production rate.
  • Gluconacetobacter xylinus (formerly Acetobacter xylinum), is a Gram negative bacterium belonging to the Acetobactereaceae family; strict aerobic that performs the incomplete oxidation of various sugars and alcohols (process known as oxidative fermentation). Its natural habitat is fruits and vegetables in the process of decomposition; It is capable of producing CB on liquid and solid media by forming a "film” or "cream” on the surface. The CB film functions as a "flotation" mechanism, allowing G. xylinus to be in the inferred air / liquid to more easily obtain the 0 2 necessary for its growth.
  • the film is a physical barrier that protects the bacteria from UV radiation, increases the ability to colonize substrates and its highly hygroscopic nature allows it to retain moisture preventing the drying of the substrate.
  • Two characteristics are particular to CB microfibrils: their polarity is unidirectional and they are variable in thickness.
  • the crystallization mechanism of microfibrils in G. xylinus can give rise to two cellulose aloforms: if the microfibrils are oriented in parallel, cellulose I is synthesized, while if the arrangement of the microfibrils is antiparallel, cellulose II is obtained. Both cellulose I and cellulose II are within the scope of the present invention.
  • the microstructure of the CB is made up of microfibrils with a diameter of 4 to 7 nm and a polymerization degree of 2,000 to 14,000 glucose molecules.
  • the microfibrils in turn crystallize in packages and tapes, which reach a thickness of 1 to 9 ⁇ and form an extensive cross-linked structure stabilized by hydrogen bonds.
  • the condensation of the tapes gives rise to the three-dimensional structure or macrostructure of the CB.
  • the macrostructure of the CB is totally dependent on the growing conditions; Thus, under static culture conditions a "film” or "cream” is generated at the air / liquid interface of the culture medium.
  • the microfibrils which are continuously released by the bacteria, crystallize into tapes, which overlap forming parallel planes.
  • CB is preferably produced under static culture conditions, thus generating a "film" at the air / substrate interface of the culture medium.
  • the CB has a purity superior to that present in cellulose from any vegetable source, which gives it a series of advantageous characteristics, such as, high degree of crystallization, high resistance to pressure, elasticity and durability.
  • Cellulose has a high capacity to absorb water and due to a smaller diameter of microfibrils, the CB has a larger surface area than that present in wood pulp.
  • CB is metabolically inert, non-toxic, or causes allergic reaction to contact, properties of particular importance for the purpose described in the present invention.
  • the CB can be produced by chemical synthesis in vitro or by, for example, but not limited to, the culture of the producing bacteria in the presence of a culture medium and culture conditions (pH, T °, oxygenation, light / dark , C0 2 , etc.) suitable for the production of cellulose.
  • a culture medium and culture conditions pH, T °, oxygenation, light / dark , C0 2 , etc.
  • Those skilled in the art will recognize the bacterial culture media and the culture conditions that can be used for this purpose.
  • the "culture medium” is a suitable nutritive medium, that is, it comprises the nutrients necessary for the maintenance and in vitro growth of the producing bacterium, for the development of its metabolic activity and, therefore, for the production of CB.
  • Said culture medium may be liquid, solid or semi-solid, although preferably it is liquid.
  • the bacteria to grow properly in the culture medium it must meet a series of conditions such as temperature, humidity, light / dark and adequate oxygen pressure, as well as a correct degree of acidity or alkalinity (pH).
  • the culture medium must be free of all contaminating microorganisms.
  • the producing bacterium can be grown in a solid, semi-solid or liquid culture medium, preferably liquid, in the presence of suitable salts and nutrients to favor the growth and proliferation of bacterial cells.
  • the suitable nutrient medium comprises, for example, but not limited to, agar or gelatin or albumin, carbon sources (for example, glucose, sucrose or mannitol), nitrogen sources (e.g., peptones), sulfur, phosphorus, vitamin sources, amino acids and hormones and / or growth factors (for example, meat extract or yeast extract), inorganic salts (for example, sodium or potassium), hydrogen ions, citric acid, etc.
  • the bacteria can be grown, for example, but not limited to, by flask or Erlenmeyer culture and small or large scale growth carried out in a laboratory or industrial bioreactor, in a suitable medium and under conditions that allow the production of CB .
  • the bacteria is initially grown in solid medium, for example, but not limited to agar, and subsequently the culture is transferred to a liquid medium to be expanded.
  • the culture of the bacteria for the production of cellulose is more preferably practiced under static conditions.
  • the optimum temperature range for crops is 20 to 35 ° C, the temperature at which production takes place.
  • the pH of the culture medium may vary from preferably 4.0 to 6.0, the optimum pH being dependent on the producing strain.
  • the composition of the culture medium is variable according to the strain used, carbohydrates are the appropriate carbon source for the synthesis of CB, so the production of CB can occur in media containing, for example but not limited to, sucrose, glucose, fructose , lactose or mannitol.
  • the bacteria can synthesize de novo glucose from lactic acid or succinic acid.
  • Yeast extract is the most commonly used nitrogen source for the growth of G.
  • Peptone, polypeptone, tryptone, corn liquor and ammonium sulfate can also be used in the production of CB.
  • the addition of sodium or potassium phosphate to buffer pH changes, and the addition of sulfate or magnesium chloride is common.
  • the incubation periods are dependent on the culture system, in static culture long periods of culture are preferred, preferably one to two weeks, although periods of 5 or more days are also suitable.
  • Cellulose is thus formed in the nutrient medium, preferably in the form of a film, and can be recovered directly from the medium, from the air / liquid interface in the event that the culture develops in liquid medium.
  • the cellulose is in the form of a film or sheet.
  • the formed CB film is collected and subjected to a treatment comprising the washing steps and optionally drying.
  • the washing comprises immersion of the CB film in alcohol, preferably ethanol, its transfer to a deionized aqueous medium and a step in which the CB is boiled and subsequently neutralized.
  • the boiling step takes place for a time of preferably between 30 and 50 min, more preferably 40 min.
  • Said step may be repeated several times, preferably four more times, in the presence of NaOH at a temperature between 80 and 100 ° C, preferably 90 ° C, for a time between 10 and 30 min, preferably 20 min.
  • the CB can then be subjected to an optional drying step, in which the cellulose is cut to the desired shape and size and dried at room temperature for preferably between 3 and 5 days, more preferably 4 days.
  • the CB film alternatively, before or after washing and drying, is broken, moistened when necessary and homogenized to form a gel textured material.
  • the CB film alternatively, before or after washing and drying, is broken, combined with a liquid, which is preferably water, and homogenized to form a dispersion.
  • a liquid which is preferably water
  • the suspension can be combined with a suitable propellant by subjecting the assembly to pressure, and applied in the area to be treated as a spray or sprayed without the need to use a propellant.
  • the method of the invention also allows regenerating damaged plant tissues as a result of an infection by some pathogen. This effect will be particularly enhanced if the cellulose used is combined with one or more antimicrobial, antifungal and / or antiviral agents, since this approach will allow not only the regeneration of the tissue affected by the infection but also the disappearance or reduction of the pathogenic load present in the affected area. Therefore, in another preferred embodiment, the cellulose further comprises an antibacterial, antifungal and / or antiviral agent. Said agent may be found, but not limited to, coating the cellulose piece or it may be embedded in it.
  • said agent is an antibacterial agent, such as, but not limited to, antibiotics, nanoparticles, microparticles, milparticles, beads or spheres, etc., loaded with at least one antibacterial agent, natural products, such as lactic acid, citric acid, acetic acid, and its salts, essential oils, etc.
  • the antibacterial agent are nanoparticles, even more preferably silver and / or copper nanoparticles.
  • the nanoparticles such as silver and / or copper nanoparticles
  • the nanoparticles can be produced by methods well known to those skilled in the art.
  • Ag nanoparticles can be Manufacture by laser ablation or thermal decomposition of AgN0 3 in situ under microwave irradiation, as described in the examples below.
  • cellulose films preferably from CB, as described in the present invention, adhere better to the damaged plant surface if they are moistened. Therefore, in another preferred embodiment of the method of the invention, the cellulose is wet or wet.
  • the cellulose used in the method of the invention When the cellulose used in the method of the invention is vegetable cellulose, it must have a high relative humidity, "high relative humidity” being a high water content, preferably a relative humidity greater than 60%, more preferably a relative humidity greater than 80% or 90%, even more preferably a relative humidity around 99% or 99%.
  • high relative humidity being a high water content, preferably a relative humidity greater than 60%, more preferably a relative humidity greater than 80% or 90%, even more preferably a relative humidity around 99% or 99%.
  • low relative humidity being understood as a low water content, preferably a relative humidity of less than 60% or 60%, more preferably a relative humidity of 60%.
  • the plant tissue referred to in the method of the invention is non-lignified plant tissue, lignified plant tissue, on which cellulose, and more preferably CB in any of The formats indicated in this document are equally effective for healing, healing or regenerating wounds in plants, for plant tissue regeneration or for regenerating damaged plant tissues.
  • Non-lignified plant tissue or “non-woody tissue” means plant tissue that has not undergone lignification, or deposit of lignin or oxygenated derivatives of cellulose and xylanases, in the cell wall. That is, that plant tissue that does not include lignin.
  • “Lignified plant tissue” means that tissue in which any of the circumstances referred to above occurs, that is, it does include lignin.
  • the plant tissue is selected from the list consisting of: leaf, fruit, stem, branch, flower or root.
  • the plant tissue is leaves.
  • the method of the invention is useful for the healing or regeneration of wounds or damaged plant tissue in any plant, however, in another preferred embodiment the plant tissue belongs to a plant of the Solanaceae family. More preferably, the plant tissue belongs to Nicotiana benthamiana or Solanum lycopersicum.
  • the method of the invention is useful for healing or regenerating wounds or plant tissue damaged by any cause, however, in another preferred embodiment the tissue damage is caused by cutting, abrasion, puncture, pressure, rupture or infection, more preferably by cutting or infection. In another preferred embodiment, wound healing or regeneration occurs on cuts caused in grafted plants.
  • cellulose when cellulose is associated with an antibacterial, antifungal and / or antiviral agent, it is useful not only in the regeneration of tissue damage caused as a result of a bacterial, fungal and / or viral infection, but also in the treatment and / or prevention of the infection itself.
  • the cellulose when the cellulose is bound to silver and / or copper nanoparticles as described above, it is able to regenerate the damage produced in the tissue as a result of a bacterial infection and in addition to preventing and / or treating said infection in the sense of causing the disappearance or reduction of the bacterial load in the tissue.
  • tissue damage is caused by an infection, more preferably by a bacterial infection, even more preferably by a bacterial infection caused by one or more Gram-negative bacteria.
  • the bacterial infection is caused by E. coli or Pseudomonas syringae.
  • cellulose, preferably CB, associated with Ag nanoparticles in contact with plant tissue in the presence of a P. syringae infection prevents and treats such infection, detecting low bacterial load, tissue regeneration and little tissue necrotized
  • the "infections” referred to in the present invention are those caused by any phytopathogenic organism.
  • the damaged plant tissue is allowed to heal in the presence (in contact, preferably direct) of the cellulose for the necessary time. This step, therefore, will take place over a period of time such that it allows healing, preferably total, of the damaged area to occur.
  • the degree of tissue regeneration can be determined, for example, but not limited to, by visualizing the amount of new tissue created in the affected area. In the examples shown below, tissue regeneration is demonstrated after, but not limited to, 48h.
  • step (b) takes place over a period of at least 24 hours. In a more preferred embodiment, step (b) takes place over a period of at least 48 hours.
  • Another aspect of the invention relates to a composition comprising cellulose, preferably CB, in any of the formats indicated above, more preferably in the form of one or more sheet / s or film / s, and nanoparticles, preferably silver nanoparticles and / or copper.
  • the cellulose is coated with said nanoparticles, although they could also be in any other arrangement, such as embedded in said cellulose.
  • the CB is obtained from bacteria of the genus Gluconacetobacter.
  • the bacterium of the genus Gluconacetobacter is selected from among Gluconacetobacter xylinus or Gluconacetobacter europaeus, more preferably G. xylinus.
  • tissue damage is caused by an infection, more preferably bacterial, even more preferably by E. coli or Pseudomonas syringae.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition as described above for the treatment and / or prevention of infections, preferably bacterial, more preferably by E. coli or Pseudomonas syringae, in plants or plant tissues, preferably not lignified, more preferably in leaf, fruit, stem, branch, flower or root, even more preferably in leaves.
  • infections preferably bacterial, more preferably by E. coli or Pseudomonas syringae
  • plants or plant tissues preferably not lignified, more preferably in leaf, fruit, stem, branch, flower or root, even more preferably in leaves.
  • FIG. 1 TEM images of bacterial cellulose (CB) films coated with Ag nanoparticles (Ag-CB) (top and bottom-left). Bottom-right, size distribution of Ag nanoparticles (AgNPs).
  • FIG. 2 Toxicity test using the biomarker Escherichia coli. The degree of toxicity of the different substances / materials is determined based on their ability to eliminate the bacteria (aura).
  • FIG. 3 Regeneration test of cuttings of Nicotiana benthamiana leaves, at 48 h post-treatment with bacterial cellulose (CB) films.
  • FIG. 4 Regeneration test for damage caused by puncture in Nicotiana benthamiana leaf in the presence and absence of bacterial cellulose (CB).
  • FIG. 5 Scanning electron microscopy (SEM) showing regeneration of damage caused by cutting on sheets of Nicotiana benthamiana in the presence and absence of bacterial cellulose (CB).
  • FIG. 6 Effects of bacterial cellulose (CB) or bacterial cellulose with silver nanoparticles (Ag-CB) on sections of Nicotiana benthamiana leaves that also include infection by Pseudomonas syringae. About the cuts Micropore adhesive tape (3M GmbH, Neuss, Germany) (Tape), Ag-CB, CB or nothing was added.
  • CB bacterial cellulose
  • Ag-CB silver nanoparticles
  • FIG. 7 Effects of bacterial cellulose (CB) and plant cellulose on leaf sections of Nicotiana benthamiana.
  • Micropore tape (3M GmbH, Neuss, Germany) (Tape), filter paper (vegetable cellulose), CB or nothing was added over the cuts.
  • EXAMPLE 1 Production of bacterial cellulose (CB) films.
  • the bacterial strains used were: Gluconacetobacter xylinum (GX) (ATCC 1 1142) (Yamada Y, Hoshino K, Ishikawa T (1997) Biosci, Biotechnol, Biochem 61 (8): 1244-1251) and Gluconacetobacter europaeus (GE) (MF03 ) (Yamada Y, Hoshino K, Ishikawa T (1997) Biosci, Biotechnol, Biochem 61 (8): 1244-1251) and were acquired from the Spanish Type Culture Collection (Spain).
  • GX Gluconacetobacter xylinum
  • ATCC 1 1142 Yamada Y, Hoshino K, Ishikawa T (1997) Biosci, Biotechnol, Biochem 61 (8): 1244-1251
  • GE Gluconacetobacter europaeus
  • Glucose, peptone, yeast extract and agar were purchased from Conda Lab, NaOH, Na 2 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 and citric acid monohydrate were purchased from Sigma Aldrich and used as received.
  • GX is the bacteria most widely used to produce cellulose, due to its high production speed. GX was cultured in solid agar and an isolated colony was expanded in liquid medium for 3 days. Then, 8 ml of GX solution was transferred to an Erlenmeyer with 200 ml of liquid medium. A thin layer of bacterial cellulose grew on top of the liquid media for more than 5 days for GX.
  • Culture media for GX consisted of 20 g / l glucose, 5 g / l peptone, 5 g / l yeast extract, 1.15 g / l citric acid monohydrate and 6.8 g / L of Na 2 HP0 4 ⁇ 12 H 2 0. The culture conditions were 25 ° C and pH 7 initially.
  • CB films harvested from the air / liquid interface were immersed in ethanol. Subsequently, they were transferred to deionized water (DI) and boiled for 40 min, four more times with 0.1 M NaOH at 90 ° C for 20 min and, finally, neutralized with DI water for 24 h.
  • DI deionized water
  • the silver nanoparticles were manufactured by thermal decomposition of AgN0 3 in situ under microwave irradiation as follows: AgN0 3 and polyvinyl pyrrolidone (PVP) were mixed in the 1: 10 ratio in 4.5 ml of DI water.
  • PVP polyvinyl pyrrolidone
  • Microwave (MW) experiments were carried out using a CEM Discover reactor (12-Hybrid Explorer) operating at a frequency of 2.45 GHz and with a maximum power of 300 W. Conventionally, the power was automatically adjusted to heat the sample to the reaction parameters (temperature and time). The temperature and pressure were controlled by the use of a volume-independent infrared sensor.
  • the solutions containing AgN0 3 and PVP were heated at 90 ° C for 2 minutes in the microwave. Then, the solution was automatically cooled to 50 ° C by using compressed nitrogen for approximately 3 min.
  • the silver-cellulose films (Ag-CB) were harvested from the solution, cleaned in 10 ml of water and sonicated for 3 min. The CB film changed from transparent color - white to brown, indicating the incorporation of AgNP (Ag nanoparticle) into the structure.
  • the suspended nanoparticles were separated by adding 40 ml of acetone with 20 ⁇ of PVP (used as electrostatic surfactant) and centrifugation at 6000 rpm for 20 min.
  • Thermogravimetric analysis (TGA): the TGA of Ag-cellulose films was performed with a TGA-DSC / DTA analyzer (NETZSCH STA 449 F1 Jupiter, ICMAB) with a heating rate of 10 ° C / min from room temperature to 800 ° C in air. A 96.79% weight reduction was obtained, which indicated an Ag-NPs weight of approx. 0.047mg Since a cellulose band of 1 cm 2 was used for this analysis, with a weighted weight of 1 mg, the concentration of AgNPs per unit area of 0.0321 mg / cm 2 cellulose can be estimated.
  • TGA-DSC / DTA analyzer NETZSCH STA 449 F1 Jupiter, ICMAB
  • SEM Scanning electron microscopy
  • TEM images were obtained with a JEOL JEM-1210 electron microscope, which operates at 120 kV.
  • the average size of the NPs was calculated by adjusting a histogram of the sizes (of at least 200 nanoparticles) to a Gaussian function.
  • a CB size distribution was obtained: 17.3 ⁇ 8.9 nm (Fig. 1).
  • UV-Vis Spectroscopy Ag-CB films and Ag solutions were analyzed in a range of 300 to 800 nm and a peak was observed around 407-415 nm, indicative of the presence of the nanoparticles. Based on the literature, this peak indicates the presence of 15 nm Ag-NPs.
  • EXAMPLE 2 Toxicity test of bacterial cellulose films.
  • Escherichia coli was grown in LB-agar medium overnight at 37 ° C. A colony was collected and incubated in 4 ml of liquid LB-agar medium overnight at 37 ° C. 2 ml of the liquid culture were seeded with a spreader in LB-agar medium and incubated overnight at 37 ° C. The following materials / solutions were added:
  • - Ag-CB a piece of Ag-CB.
  • Nicotiana benthamiana plants were planted in alveoli tray for a week. The seedlings were transferred to individual pots (5 ") filled with Sphagnum peat substrate (Gramoflor) for 3 weeks under constant conditions: 23-26 ° C day and 21-22 ° C in darkness, 50-60% humidity and a dark-photoperiod regime of 16 hours of light / 8 h of darkness. Two leaves per plant were used for the test.
  • the cuts were made with sterile surgical blades number 10 (Albion Surgicals Limited, Sheffield, England). Particularly a 1 cm cut was made. Each cut was immediately covered with a 1 cm long band of the material to be tested: - Bacterial cellulose (CB).
  • CB Bacterial cellulose
  • Nicotiana benthamiana plants were planted in alveoli tray for a week. The seedlings were transferred to individual pots (5 ") filled with Sphagnum peat substrate (Gramoflor) for 3 weeks under constant conditions: 23-26 ° C day and 21-22 ° C in darkness, 50-60% humidity and A regime of darkness-photoperiod of 16 h of light / 8 h of darkness. Two leaves per plant were used for the test.
  • the punctures were made with 21G x 1 1 2 "needles (Terumo, Shibuya, Japan). Each puncture was immediately covered with a 1 cm long band of the material to be tested:
  • CB Bacterial cellulose
  • SEM Scanning electron microscopy: After the curing process, the samples were cut and placed in an SEM aluminum substrate on a carbon tape adhesive. Then, they were metallized using (Au / Pd, 25 mA, 4 '). Subsequently, images were taken with a scanning electron microscope (FEI Quanta 200 FEG-ESEM) under high vacuum conditions or low vacuum conditions. An elementary analysis was performed using the SEM microscope in the selected areas. The results are shown in Fig. 4, where the appearance of new tissue can be observed in the area adjacent to the puncture in the sample treated with CB.
  • Nicotiana benthamiana plants were planted in alveoli tray for a week. The seedlings were transferred to individual pots (5 ") filled with Sphagnum peat substrate (Gramoflor) for 3 weeks under constant conditions: 23-26 ° C day and 21-22 ° C in darkness, 50-60% humidity and a dark-photoperiod regime of 16 h of light / 8 h of darkness Two blades per plant were used for the test The cuts were made with sterile surgical blades number 10 (Albion Surgicals Limited, Sheffield, England). a cut of 1 cm.
  • the virulent bacterium Pseudomonas syringae DC3000 was inoculated through the cut using a plunger syringe.
  • the contour of the inoculated area was marked with a waterproof marker.
  • Each inoculated cut was immediately covered with a 1 cm long band of the material to be tested:
  • CB Bacterial cellulose
  • EXAMPLE 4 Plant tissue regeneration test with vegetable cellulose films.
  • Nicotiana benthamiana plants were planted in alveoli tray for a week. The seedlings were transferred to individual pots (5 ") filled with Sphagnum peat substrate (Gramoflor) for 3 weeks under constant conditions: 23-26 ° C day and 21-22 ° C in darkness, 50-60% humidity and a dark-photoperiod regime of 16 hours of light / 8 hours of darkness Two leaves per plant were used for the test.
  • Sphagnum peat substrate Gramoflor
  • the cuts were made with sterile surgical blades number 10 (Albion Surgicals Limited, Sheffield, England). Particularly a 1 cm cut was made. Each cut was immediately covered with a 1 cm long band of the material to be tested: - Vegetable cellulose: filter paper (PrimeSource, Morgan Scott Group Inc., USA).

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Abstract

La presente invención proporciona un método para regenerar tejidos vegetales dañados. Dicho método está basado en el uso de celulosa, preferiblemente celulosa bacteriana (CB), la cual se aplica directamente sobre la zona dañada permitiendo su rápida cicatrización. La presente invención demuestra así el potencial regenerador de la celulosa, preferiblemente celulosa bacteriana, sobre heridas en plantas. En una realización preferida del método de la invención, se emplea la celulosa en combinación con nanopartículas de plata para, además de regenerar el tejido, prevenir y/o tratar infecciones bacterianas en el mismo.

Description

MÉTODO PARA LA REGENERACIÓN DE TEJIDOS VEGETALES DAÑADOS MEDIANTE CELULOSA BACTERIANA
DESCRIPCIÓN La presente invención se encuadra dentro del campo de la agricultura y la botánica, específicamente dentro de los métodos y materiales útiles para la regeneración de heridas en plantas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las heridas en plantas se producen frecuentemente por cortes durante los procesos de recolección de sus frutos y, en general, durante la actividad de la industria agrícola. Aunque dichas heridas pueden también producirse por otras diversas causas como, por ejemplo, agresiones naturales, infecciones por organismos fitopatógenos o manipulación humana. Las heridas en plantas representan una peligrosa vía de entrada para organismos patógenos, facilitando así el desarrollo de graves infecciones en los tejidos vegetales que pueden hacerse extensibles a la totalidad de la planta, lo que puede conducir en último término a graves pérdidas en los cultivos agrícolas. La curación de heridas en tejidos vegetales es, por tanto, un desafío de gran relevancia para la industria agrícola y de injertos.
En este sentido, se han desarrollado diversas aproximaciones para solventar este problema. Una de ellas es la descrita en ES2163977A1 , donde se divulga una composición impermeabilizante-sellante de cortes en árboles, que tiene como productos principales una emulsión copolimérica eteno-vinílica, productos aislante- barrera respecto al ozono, triésteres de ácidos grasos y glicerina; un coloide protector a base de un coloide de éter hidroxietílico de celulosa y un tapa-poros a base de cuarzo. Por otro lado, JPH1033069A describe un parche para tratar heridas de plantas, que se obtiene mezclando polvo de quitina con un caucho natural no vulcanizado, además de componentes tales como un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un plastificante y un material natural como polvo de celulosa como material de relleno. EP0290155A2 se refiere a un material absorbente en forma laminar para aplicación en heridas de plantas que comprende varias capas de diferentes materiales. Por último, CN102334514A se refiere a un agente para curar
i heridas en árboles que, entre otros componentes, contiene hidroxietil celulosa, carboximetil celulosa y hidroxipropil celulosa.
La celulosa constituye un biopolímero casi inagotable, siendo el polisacárido natural más abundante de la biosfera. La celulosa, con una estructura jerárquica compleja, y más recientemente la nanocelulosa o los nanocristales de celulosa, están siendo activamente investigados en el diseño de nuevos (bio)nanocompuestos.
Aunque la celulosa se obtiene predominantemente a partir de plantas, también puede ser sintetizada por bacterias, algas y hongos. En particular, la celulosa bacteriana (CB) producida por microbios tiene la misma fórmula molecular que la celulosa vegetal pero tiene la particularidad de ser un biopolímero puro que presenta un mayor grado de polimerización y una mejor cristalinidad. La CB también presenta alta porosidad, es transparente en el UV-NIR y tiene una alta capacidad de retención de agua. Además, una característica singular de la CB es la posibilidad de modificar durante la biosíntesis su estructura micro (nano) y su forma.
Se ha observado que la CB tiene efectos importantes en la regeneración de heridas en humanos, sobre todo en recuperación de quemaduras (Czaja W. , et al., 2006, Biomaterials, 27: 145; Rajwade JM., et al., 2015, Applied Microbiology and Biotechnology, 99: 2491).
Se requieren, por tanto, nuevos tratamientos para la regeneración de heridas en tejidos vegetales que permitan una correcta cicatrización del tejido y que, preferiblemente, ayuden también a prevenir y/o tratar infecciones provocadas por organismos patógenos que se puedan ver favorecidas por la existencia de daños en la estructura tisular.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para regenerar eficazmente tejidos vegetales dañados. Dicho método está basado en el uso de celulosa, preferiblemente celulosa bacteriana (CB), la cual se aplica directamente sobre la zona dañada permitiendo su rápida curación o cicatrización. La presente invención demuestra así el potencial regenerador de la celulosa, preferiblemente de la celulosa bacteriana, sobre heridas en plantas. El método descrito en la presente invención aporta un material de composición química a la estructura de la planta.
Este método presenta la ventaja de que permite una correcta y completa cicatrización del área dañada en un periodo corto de tiempo ya que, como demuestran los ejemplos descritos más delante, la creación de nuevo tejido en las áreas dañadas se puede observar al cabo de aproximadamente, aunque sin limitarnos, 48h.
Además, dicho método es de aplicación en la regeneración de heridas provocadas por cualquier causa, desde cortes hasta daños provocados por abrasión, en cualquier tipo de tejido, aunque preferiblemente en tejidos no lignificados, y en cualquier tipo de planta.
Por otro lado, la celulosa empleada en el método de la invención puede utilizarse en combinación con uno o varios componentes antibacterianos, antifúngicos y/o antivirales, tales como nanopartículas de plata, permitiendo así adicionalmente la prevención y/o tratamiento de infecciones bacterianas, fúngicas o víricas sobre la zona dañada de la planta. Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la curación, cicatrización o regeneración de heridas en plantas, para la regeneración tisular vegetal o para regenerar tejidos vegetales dañados, de ahora en adelante "método de la invención", que comprende: a. poner en contacto, preferiblemente directo, el tejido vegetal dañado con celulosa, preferiblemente con una lámina de celulosa, y
b. permitir la regeneración del tejido vegetal dañado.
Preferiblemente, en el paso (a) del método de la invención la celulosa se aplica directamente sobre el tejido vegetal dañado, ex vivo o in vivo, de manera que dicha celulosa cubra total o parcialmente, más preferiblemente totalmente, el área afectada.
Aunque en el método de la invención se prefiere la aplicación de celulosa en forma de lámina, también es posible su aplicación en otros formatos, como por ejemplo y sin limitarse, en forma de suspensión o en forma de gel. La "celulosa" es el principal componente de las paredes celulares vegetales. Desde el punto de vista bioquímico, la celulosa (C6H10O5)n con un valor mínimo de n = 200, es un polímero natural, constituido por una larga cadena de carbohidratos polisacáridos. La estructura de la celulosa se forma por la unión de moléculas de β-glucosa a través de enlaces B-1 ,4-glucosídico, lo que hace que sea insoluble en agua. La celulosa tiene una estructura lineal o fibrosa, en la que se establecen múltiples puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de glucosa, haciéndolas muy resistentes e insolubles al agua. De esta manera, se originan fibras compactas que constituyen la pared celular de las células vegetales, dándoles así la necesaria rigidez. La celulosa se puede extraer u obtener de fuentes vegetales, particularmente de plantas leñosas, tales como por ejemplo aunque sin limitarnos, árboles, como el pino o el eucalipto, u otras plantas, tales como pastos, bambúes, almidón, trigo, maíz, cebada, sorgo, bagazo de caña de azúcar, algodones, linos, cáñamos u otros. La celulosa se puede también obtener de otras fuentes no vegetales, tales como bacterias, algas u hongos, o por síntesis enzimática in vitro o síntesis química in vitro a partir de derivados de glucosa bencilados. Ejemplos de bacterias a partir de las cuales se puede obtener celulosa bacteriana son, aunque sin limitarnos, bacterias de los géneros Dictyostelium, Acetobacter, Alcali-genes, Pseudomonas, Aerobacter, Achromobacter, Azotobacter, Salmonella, Sarcina, Agrobacterium, Rhizobium o Gluconacetobacter. Un ejemplo de hongos a partir de los cuales se puede obtener celulosa fúngica es, aunque sin limitarnos, Trichoderma reesei. Ejemplos de algas a partir de las cuales se puede obtener celulosa son, aunque sin limitarnos, Cladophora, Rhodophyta, Pyrrophyta, Chrysophycease, Xanthophyceae, Phaeophyta o Chlorophyta.
La celulosa tal y como se define en la presente invención puede ser, aunque sin limitarnos, lignocelulosa, celulosa vegetal, celulosa de origen bacteriano, celulosa de origen fúngico, fibras de celulosa, celulosa nanocompuesta o cristales de celulosa, preferiblemente nanocelulosa, celulosa microcristalina o nanocristales de celulosa. El formato de la celulosa puede ser cualquiera que le permita recubrir la zona a regenerar o curar, por ejemplo y sin limitarse, en forma de lámina, en forma de gel o en forma de suspensión. La suspensión puede combinarse con un propelente adecuado sometiendo al conjunto a presión, y ser aplicada en la zona a tratar como un spray, o alternativamente ser atomizada sin la necesidad de utilizar un propelente. En una realización preferida del método de la invención, la celulosa es celulosa vegetal o bacteriana. La celulosa bacteriana, producida por microorganismos, tiene la misma fórmula molecular que la celulosa vegetal, por lo que ambas pueden ser aplicadas indistintamente en el método descrito en la presente invención al presentar propiedades físico-químicas similares. Los ejemplos mostrados más adelante demuestran la utilidad de ambos tipos de celulosa, vegetal y bacteriana, en la curación de heridas en tejidos vegetales. Sin embargo, la celulosa bacteriana presenta las ventajas de que tiene un mayor grado de polimerización que la celulosa vegetal y una mejor cristalinidad y pureza. Además, presenta alta porosidad y una alta capacidad de retención de agua. Por todo ello, este tipo de celulosa es la preferiblemente empleada en el método de regeneración de tejido vegetal dañado descrito en la presente invención. Así, en una realización más preferida, la celulosa es celulosa bacteriana. La "celulosa bacteriana" o "CB" es aquella celulosa formada y secretada por bacterias, preferiblemente en cultivo. La CB, por su pureza y estructura altamente cristalina, destaca como fuente alternativa a la de origen vegetal. La producción de CB en el reino Monera está diversificada, la síntesis se observa en especies dentro de los géneros, pero sin limitarnos, Achromobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Sarcina, Zoogloea y Gluconacetobacter, a este último pertenece G. xylinus, la especie con mayor capacidad productora. Esta bacteria permite la biogénesis de CB a partir de una gran variedad de sustratos, rindiendo un producto de alta pureza (libre de lignina y hemicelulosa) y de estructura similar a la de origen vegetal. Este microorganismo presenta además la ventaja de una fácil manipulación. Por ello, en una realización aún más preferida, la celulosa bacteriana es producida por bacterias del género Gluconacetobacter. En una realización particular, la bacteria del género Gluconacetobacter se selecciona de entre Gluconacetobacter xylinus o Gluconacetobacter europaeus. De entre estas dos bacterias, G. xylinus es la más preferida en la presente invención, ya que presenta una elevada velocidad de producción de celulosa.
Gluconacetobacter xylinus (anteriormente Acetobacter xylinum), es una bacteria Gram negativa perteneciente a la familia Acetobactereaceae; aerobio estricto que realiza la oxidación incompleta de diversos azúcares y alcoholes (proceso conocido como fermentación oxidativa). Su hábitat natural son frutas y vegetales en proceso de descomposición; es capaz de producir CB sobre medios líquidos y sólidos formando una "película" o "nata" sobre la superficie. La película de CB funciona como mecanismo de "flotación", permitiéndole a G. xylinus estar en la inferíase aire/líquido para obtener con mayor facilidad el 02 necesario para su crecimiento. La película es una barrera física que protege a la bacteria de la radiación UV, aumenta la capacidad de colonizar sustratos y su carácter altamente higroscópico le permite retener humedad previniendo la desecación del sustrato. Dos características son particulares de las microfibrillas de CB: su polaridad es unidireccional y son de grosor variable. El mecanismo de cristalización de las microfibrillas en G. xylinus puede dar origen a dos aloformas de celulosa: si las microfibrillas se orientan en forma paralela se sintetiza celulosa I, mientras que si el arreglo de las microfibrillas es antiparalela se obtiene celulosa II. Tanto la celulosa I como la celulosa II se encuentran dentro del alcance de la presente invención. La microestructura de la CB está conformada por microfibrillas con un diámetro de 4 a 7 nm y un grado de polimerización de 2.000 hasta 14.000 moléculas de glucosa. Las microfibrillas a su vez cristalizan en paquetes y cintas, las cuales alcanzan un grosor de 1 a 9 μπι y forman una extensa estructura reticulada estabilizada por puentes de hidrógeno. La condensación de las cintas da lugar a la estructura tridimensional o macroestructura de la CB. La macroestructura de la CB es totalmente dependiente de las condiciones de cultivo; así, en condiciones de cultivo estático se genera una "película" o "nata" en la interfase aire/líquido del medio de cultivo. Las microfibrillas, que son continuamente liberadas por la bacteria, se cristalizan en cintas, las cuales se solapan formando planos paralelos. En cultivo agitado, se logra un menor grado de agrupamiento, la cantidad de planos paralelos es menor y en consecuencia se forman gránulos irregulares, cadenas fibrosas o ramificadas de CB. En el contexto de la presente invención, la CB se produce preferiblemente en condiciones de cultivo estático, generándose así una "película" en la interfase aire/sustrato del medio de cultivo.
Como ya se ha comentado, la CB presenta una pureza superior a la presente en la celulosa procedente de cualquier fuente vegetal, lo cual le otorga una serie de características ventajosas, tales como, alto grado de cristalización, alta resistencia a la presión, elasticidad y durabilidad. La celulosa tiene alta capacidad para absorber agua y debido a un menor diámetro de las microfibrillas, la CB posee una mayor área superficial que la presente en la celulosa de madera. Además de estas propiedades fisicoquímicas de importancia industrial, la CB es inerte metabólicamente, no tóxica, ni provoca reacción alérgica al contacto, propiedades de particular importancia para el fin descrito en la presente invención.
La CB se puede producir por síntesis química in vitro o bien mediante, por ejemplo aunque sin limitarnos, el cultivo de la bacteria productora en presencia de un medio de cultivo y de unas condiciones de cultivo (pH, T°, oxigenación, luz/oscuridad, C02, etc.) adecuados para la producción de celulosa. Los expertos en la materia reconocerán los medios de cultivo bacterianos y las condiciones de cultivo que pueden ser empleados para tal fin.
El "medio de cultivo" es un medio nutritivo adecuado, es decir, que comprende los nutrientes necesarios para el mantenimiento y crecimiento in vitro de la bacteria productora, para el desarrollo de su actividad metabólica y, por tanto, para la producción de CB. Dicho medio de cultivo puede ser líquido, sólido o semisólido, aunque preferiblemente es líquido. Para que la bacteria crezca adecuadamente en el medio de cultivo, éste debe reunir una serie de condiciones como son temperatura, grado de humedad, luz/oscuridad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad (pH). Asimismo, el medio de cultivo debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Por tanto, la bacteria productora se puede cultivar en un medio de cultivo sólido, semisólido o líquido, preferiblemente líquido, en presencia de las sales y nutrientes adecuados para favorecer el crecimiento y proliferación de las células bacterianas. El medio nutritivo adecuado comprende, por ejemplo aunque sin limitarnos, agar o gelatina o albúmina, fuentes de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa o manitol), fuentes de nitrógeno (por ejemplo, peptonas), azufre, fósforo, fuentes de vitaminas, aminoácidos y hormonas y/o factores de crecimiento (por ejemplo, extracto de carne o extracto de levadura), sales inorgánicas (por ejemplo, sodio o potasio), iones de hidrógeno, ácido cítrico, etc.
La bacteria se puede cultivar, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante cultivo en matraz o Erlenmeyer y crecimiento a pequeña o a gran escala llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial, en un medio adecuado y en condiciones que permitan la producción de CB. Preferiblemente, la bacteria se cultiva inicialmente en medio sólido, por ejemplo aunque sin limitarnos, en agar, y posteriormente se transfiere el cultivo a un medio líquido para ser ampliado.
El cultivo de la bacteria, preferiblemente de G. xylinus, para la producción de celulosa se practica más preferiblemente en condiciones estáticas. El rango de temperatura óptima para los cultivos es de 20 a 35° C, temperatura a la cual se lleva a cabo la producción. El pH del medio de cultivo puede variar de preferiblemente 4.0 a 6.0, siendo el pH óptimo dependiente de la cepa productora. La composición del medio de cultivo es variable acorde con la cepa utilizada, los carbohidratos son la fuente de carbono adecuada para la síntesis de CB, así la producción de CB puede darse en medios conteniendo, por ejemplo aunque sin limitarnos, sacarosa, glucosa, fructosa, lactosa o manitol. La bacteria puede sintetizar glucosa de novo a partir de ácido láctico o ácido succínico. El extracto de levadura es la fuente de nitrógeno de mayor empleo para el crecimiento de G. xylinus, y por tanto la preferida en la presente invención; peptona, polipeptona, triptona, licor de maíz y sulfato de amonio pueden ser también utilizados en la producción de CB. Es común, además, la adición de fosfato de sodio o potasio para amortiguar los cambios de pH, y la adición de sulfato o cloruro de magnesio. Los periodos de incubación son dependientes del sistema de cultivo, en cultivo estático se prefieren largos periodos de cultivo que van, preferiblemente, de una a dos semanas, aunque periodos de 5 o más días son también adecuados.
La celulosa se forma así en el medio nutritivo, preferiblemente en forma de película, y se puede recuperar directamente del medio, de la interfaz aire/líquido en el caso de que el cultivo se desarrolle en medio líquido. Así, en otra realización preferida del método de la invención, la celulosa está en forma de película o lámina.
Preferiblemente, la película de CB formada se recoge y se somete a un tratamiento que comprende los pasos de lavado y opcionalmente secado. Más preferiblemente, el lavado comprende la inmersión de la película de CB en alcohol, preferiblemente etanol, su transferencia a un medio acuoso desionizado y un paso en el que se hierve la CB y posteriormente se neutraliza. El paso de hervido tiene lugar durante un tiempo de preferiblemente entre 30 y 50 min, más preferiblemente 40 min. Dicho paso puede repetirse varias veces, preferiblemente cuatro veces más, en presencia de NaOH a una temperatura de entre 80 y 100°C, preferiblemente 90°C, durante un tiempo de entre 10 y 30 min, preferiblemente 20 min. La CB puede a continuación someterse a un paso opcional de secado, en el que se corta la celulosa con la forma y tamaño deseados y se seca a temperatura ambiente durante entre preferiblemente 3 y 5 días, más preferiblemente 4 días. En otra realización preferida la película de CB, alternativamente, antes o después del lavado y secado, se rompe, se humedece cuando es preciso y se homogeniza hasta formar un material con textura de gel.
En otra realización preferida la película de CB, alternativamente, antes o después del lavado y secado, se rompe, se combina con un líquido, que preferentemente es agua, y se homogeniza hasta formar una dispersión. También alternativamente, la suspensión puede combinarse con un propelente adecuado sometiendo al conjunto a presión, y ser aplicada en la zona a tratar como un spray o ser atomizada sin la necesidad de utilizar un propelente.
El método de la invención también permite regenerar tejidos vegetales dañados como consecuencia de una infección por parte de algún patógeno. Este efecto se verá particularmente potenciado si la celulosa empleada se combina con uno o varios agentes antimicrobianos, antifúngicos y/o antivirales, ya que esta aproximación permitirá no solo la regeneración del tejido afectado por la infección sino también la desaparición o reducción de la carga patogénica presente en el área afectada. Por ello, en otra realización preferida, la celulosa además comprende un agente antibacteriano, antifúngico y/o antiviral. Dicho agente puede encontrarse, aunque sin limitarnos, recubriendo la pieza de celulosa o puede estar embebido en ella.
En una realización más preferida, dicho agente es un agente antibacteriano, como por ejemplo aunque sin limitarnos, antibióticos, nanopartículas, micropartículas, milipartículas, perlas o esferas, etc., cargadas con al menos un agente antibacteriano, productos naturales, como ácido láctico, ácido cítrico, acético, y sus sales, aceites esenciales, etc. En una realización aún más preferida, el agente antibacteriano son nanopartículas, aún más preferiblemente nanopartículas de plata y/o cobre.
Las nanopartículas, como por ejemplo las nanopartículas de plata y/o cobre, se pueden producir mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, aunque sin limitarnos, las nanopartículas de Ag se pueden fabricar por ablación láser o por descomposición térmica de AgN03 in situ bajo irradiación con microondas, como se describe en los ejemplos más adelante.
Por otro lado, las películas de celulosa, preferiblemente de CB, tal y como se describen en la presente invención, se adhieren mejor a la superficie vegetal dañada si éstas se encuentran humedecidas. Por ello, en otra realización preferida del método de la invención, la celulosa está mojada o húmeda.
Cuando la celulosa empleada en el método de la invención es celulosa vegetal ésta debe presentar una humedad relativa alta, entendiéndose por "humedad relativa alta" un alto contenido en agua, preferiblemente una humedad relativa superior al 60%, más preferiblemente una humedad relativa superior al 80% o al 90%, aún más preferiblemente una humedad relativa en torno al 99% o del 99%. Por el contrario, cuando la celulosa empleada en el método de la invención es celulosa bacteriana ésta puede presentar una humedad relativa alta o baja, entendiéndose por "humedad relativa baja" un bajo contenido en agua, preferiblemente una humedad relativa inferior al 60% o del 60%, más preferiblemente una humedad relativa del 60%.
Aunque en una realización preferida el tejido vegetal al que se refiere el método de la invención es tejido vegetal no lignificado, en el ámbito de la invención se incluye igualmente tejido vegetal lignificado, sobre el que la celulosa, y más preferiblemente la CB en cualquiera de los formatos indicados en este documento, se muestra igualmente efectiva para la curación, cicatrización o regeneración de heridas en plantas, para la regeneración tisular vegetal o para regenerar tejidos vegetales dañados.
Se entiende por "tejido vegetal no lignificado" o "tejido no leñoso" aquel tejido vegetal que no ha sufrido lignificación, o depósito de lignina o derivados oxigenados de la celulosa y xilanasas, en la pared celular. Es decir, aquel tejido vegetal que no comprende lignina. Por "tejido vegetal lignificado" se entiende aquel tejido en que sí se da alguna de las circunstancias anteriormente referidas, es decir que sí comprende lignina. En una realización más preferida, el tejido vegetal se selecciona de la lista que consiste en: hoja, fruto, tallo, rama, flor o raíz. En una realización aún más preferida, el tejido vegetal son hojas. El método de la invención es útil para la curación o regeneración de heridas o de tejido vegetal dañado en cualquier planta, sin embargo, en otra realización preferida el tejido vegetal pertenece a una planta de la familia Solanaceae. Más preferiblemente, el tejido vegetal pertenece a Nicotiana benthamiana o Solanum lycopersicum.
El método de la invención es útil para la curación o regeneración de heridas o de tejido vegetal dañado por cualquier causa, sin embargo, en otra realización preferida el daño en el tejido es provocado por corte, abrasión, punción, presión, rotura o infección, más preferiblemente por corte o infección. En otra realización preferida, la curación o regeneración de las heridas se produce sobre los cortes provocados en plantas injertadas.
Como ya se ha comentado anteriormente, cuando la celulosa se encuentra asociada a un agente antibacteriano, antifúngico y/o antiviral, ésta es de utilidad no solo en la regeneración del daño tisular causado como consecuencia de una infección bacteriana, fúngica y/o vírica, sino también en el tratamiento y/o prevención de la infección en sí misma. Particularmente, cuando la celulosa se encuentra unida a nanopartículas de plata y/o cobre como se describe más arriba, ésta es capaz de regenerar el daño producido en el tejido como consecuencia de una infección bacteriana y además de prevenir y/o tratar dicha infección en el sentido de provocar la desaparición o reducción de la carga bacteriana en el tejido. Por ello, en una realización más preferida, el daño en el tejido es provocado por una infección, más preferiblemente por una infección bacteriana, aún más preferiblemente por una infección bacteriana provocada por una o más bacterias Gram-negativas. En una realización aún más preferida, la infección bacteriana es provocada por E. coli o Pseudomonas syringae. Como muestran los ejemplos descritos más adelante, la celulosa, preferiblemente CB, asociada a nanopartículas de Ag en contacto con el tejido vegetal en presencia de una infección por P. syringae previene y trata dicha infección, detectándose baja carga bacteriana, regeneración tisular y poco tejido necrotizado.
Las "infecciones" a las que se refiere la presente invención son aquellas provocadas por cualquier organismo fitopatógeno. En el paso (b) del método de la invención se deja cicatrizar el tejido vegetal dañado en presencia (en contacto, preferiblemente directo) de la celulosa durante el tiempo necesario. Este paso, por tanto, tendrá lugar durante un periodo de tiempo tal que permita que se produzca la cicatrización, preferiblemente total, del área dañada. Así, el experto en la materia sabrá reconocer cuál es el tiempo necesario durante el cual el tejido vegetal dañado y la celulosa deben mantenerse en contacto. El grado de regeneración tisular podrá determinarse, por ejemplo aunque sin limitarnos, mediante visualización de la cantidad de nuevo tejido creado en el área afectada. En los ejemplos mostrados más adelante, se demuestra regeneración tisular al cabo de, pero sin limitarnos, 48h. Por ello, en otra realización preferida del método de la invención, el paso (b) tiene lugar durante un periodo de tiempo de al menos 24 horas. En una realización más preferida, el paso (b) tiene lugar durante un periodo de tiempo de al menos 48h. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende celulosa, preferiblemente CB, en cualquiera de los formatos anteriormente indicados, más preferiblemente en forma de una o varias lámina/s o película/s, y nanopartículas, preferiblemente nanopartículas de plata y/o cobre. En una realización preferida, la celulosa se encuentra recubierta con dichas nanopartículas, aunque también podrían estar en cualquier otra disposición, como por ejemplo embebidas en dicha celulosa. En otra realización preferida, la CB se obtiene de bacterias del género Gluconacetobacter. En una realización particular, la bacteria del género Gluconacetobacter se selecciona de entre Gluconacetobacter xylinus o Gluconacetobacter europaeus, más preferiblemente G. xylinus.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición como se describe en el párrafo anterior para la regeneración de tejidos vegetales dañados, preferiblemente de tejidos no lignificados, más preferiblemente de tejidos seleccionados de la lista que consiste en: hoja, fruto, tallo, rama, flor o raíz, aún más preferiblemente de hojas. Preferiblemente el daño en el tejido es provocado por una infección, más preferiblemente bacteriana, aún más preferiblemente por E. coli o Pseudomonas syringae.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición como se describe más arriba para el tratamiento y/o prevención de infecciones, preferiblemente bacterianas, más preferiblemente por E. coli o Pseudomonas syringae, en plantas o tejidos vegetales, preferiblemente no lignificados, más preferiblemente en hoja, fruto, tallo, rama, flor o raíz, aún más preferiblemente en hojas. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1. Imágenes TEM de las películas de celulosa bacteriana (CB) recubiertas con nanopartículas de Ag (Ag-CB) (arriba y abajo-izquierda). Abajo-derecha, distribución por tamaño de las nanopartículas de Ag (AgNPs).
FIG. 2. Ensayo de toxicidad utilizando el biomarcador Escherichia coli. El grado de toxicidad de las diferentes sustancias / materiales se determina en función de su capacidad de eliminar la bacteria (aura).
FIG. 3. Ensayo de regeneración de cortes en hojas de Nicotiana benthamiana, a las 48 h post-tratamiento con películas de celulosa bacteriana (CB).
FIG. 4. Ensayo de regeneración de daños provocados por punción en hoja de Nicotiana benthamiana en presencia y ausencia de celulosa bacteriana (CB).
FIG. 5. Microscopía electrónica de barrido (SEM) mostrando regeneración de daños provocados por corte en hojas de Nicotiana benthamiana en presencia y ausencia de celulosa bacteriana (CB).
FIG. 6. Efectos de la celulosa bacteriana (CB) o de la celulosa bacteriana con nanopartículas de plata (Ag-CB) sobre cortes en hojas de Nicotiana benthamiana que además comprenden infección por Pseudomonas syringae. Sobre los cortes se añadió cinta adhesiva de microporos (3M Deutschland GmbH, Neuss, Alemania) (Tape), Ag-CB, CB o nada.
FIG. 7. Efectos de la celulosa bacteriana (CB) y de la celulosa vegetal sobre cortes en hojas de Nicotiana benthamiana. Sobre los cortes se añadió cinta adhesiva de microporos (3M Deutschland GmbH, Neuss, Alemania) (Tape), papel de filtro (celulosa vegetal), CB o nada.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que ponen de manifiesto la efectividad de las películas de celulosa, preferiblemente de celulosa bacteriana, en la regeneración de tejidos vegetales dañados como consecuencia de diversas agresiones de diferente naturaleza.
EJEMPLO 1. Producción de películas de celulosa bacteriana (CB).
Las cepas bacterianas utilizadas fueron: Gluconacetobacter xylinum (GX) (ATCC 1 1142) (Yamada Y, Hoshino K, Ishikawa T (1997) Biosci, Biotechnol, Biochem 61 (8): 1244-1251) y Gluconacetobacter europaeus (GE) (MF03) (Yamada Y, Hoshino K, Ishikawa T (1997) Biosci, Biotechnol, Biochem 61 (8): 1244-1251) y se adquirieron de la Colección Española de Cultivos Tipo (España).
La glucosa, peptona, extracto de levadura y agar fueron adquiridos de Conda Lab, el NaOH, Na2HP04 · 12H20 y ácido cítrico monohidrato se compraron a Sigma Aldrich y se usaron tal y como se recibieron.
GX es la bacteria más extensamente utilizada para producir celulosa, debido a su elevada velocidad de producción. GX fue cultivada en agar sólido y una colonia aislada se amplió en medio líquido durante 3 días. Después, 8 mi de solución de GX se transfirieron a un Erlenmeyer con 200 mi de medio líquido. Una fina capa de celulosa bacteriana creció en la parte superior de los medios líquidos de más de 5 días para GX. Los medios de cultivo para GX consistieron en 20 g/l de glucosa, 5 g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levadura, 1 , 15 g/l de monohidrato de ácido cítrico y 6,8 g/L de Na2HP04 · 12H20. Las condiciones de cultivo fueron 25°C y pH 7 inicialmente. Las películas de CB cosechadas a partir de la interfaz aire / líquido se sumergieron en etanol. Posteriormente, se transfirieron a agua desionizada (DI) y se hirvieron durante 40 min, cuatro veces más con NaOH 0,1 M a 90 ° C durante 20 min y, finalmente, se neutralizaron con agua DI durante 24 h.
Films de celulosa bacteriana no secada previamente, se cortaron en forma de piezas rectangulares de 1 x 2 cm.
Secado a temperatura ambiente (RD) Las películas de CB se mantuvieron a temperatura ambiente durante 4 días hasta que se secaron por completo. Al secar a temperatura ambiente (RD), las presiones capilares del menisco de agua ejercen una fuerza compresiva en los poros de las películas que puede inducir la modificación de la estructura, la densidad y la porosidad de las películas de CB.
Síntesis de nanopartículas de plata
Las nanopartículas de plata fueron fabricadas por descomposición térmica de AgN03 in situ bajo irradiación con microondas de la siguiente manera: AgN03 y pirrolidona de polivinilo (PVP) se mezclaron en la proporción 1 : 10 en 4,5 mi de agua DI.
Los experimentos en Microondas (MW) se llevaron a cabo utilizando un reactor de CEM Discover (Explorador de 12-Hybrid) que opera a una frecuencia de 2,45 GHz y con una potencia máxima de 300 W. Convencionalmente, la potencia se ajustó automáticamente para calentar la muestra a los parámetros de reacción (temperatura y tiempo). La temperatura y la presión se controlaron mediante el uso de un sensor de infrarrojos volumen-independiente.
Las soluciones conteniendo AgN03 y PVP se calentaron a 90°C durante 2 minutos en el microondas. Después, la solución se enfrió automáticamente a 50 °C mediante el uso de nitrógeno comprimido durante aproximadamente 3 min. Las películas de plata- celulosa (Ag-CB) fueron cosechadas de la solución, se limpiaron en 10 mi de agua y se sonicaron durante 3 min. La película de CB cambió de color transparente-blanco a marrón, indicando la incorporación de la AgNP (nanopartícula de Ag) en la estructura. Las nanopartículas en suspensión se separaron mediante la adición de 40 mi de acetona con 20 μΙ de PVP (utilizado como surfactante electrostático) y centrifugación a 6000 rpm durante 20 min.
Técnicas de caracterización
Análisis termogravimétrico (TGA): el TGA de las películas de Ag-celulosa se realizó con un analizador de TGA-DSC / DTA (NETZSCH STA 449 F1 Júpiter, ICMAB) con una velocidad de calentamiento de 10 °C / min desde temperatura ambiente hasta 800 °C en aire. Se obtuvo una disminución de peso 96,79%, lo que indicó un peso de Ag- NPs de aprox. 0,047mg. Dado que se utilizó una banda de celulosa de 1 cm2 para este análisis, con un peso ponderado de 1 mg, se puede estimar que la concentración de AgNPs por unidad de superficie de es de 0,0321 mg / cm2 de celulosa.
Microscopía electrónica de barrido (SEM): Las muestras colocadas en un sustrato de aluminio SEM sobre un adhesivo de cinta de carbono permitieron la obtención de imágenes con un microscopio electrónico de barrido (QUANTA FEI 200 FEG-ESEM) en condiciones de alto vacío, un voltaje de aceleración de 10 a 30 kV, un punto del haz de electrones de 3,0, una presión de 2-9 x 10-4 Pa, y una distancia de 4-4,5 mm. Se pudo confirmar la distribución homogénea de AgNPs a lo largo de la superficie de la CB.
Microscopía electrónica de transmisión (TEM): las imágenes TEM se obtuvieron con un microscopio electrónico JEOL JEM-1210, que opera a 120 kV. El tamaño medio de las NPs se calculó mediante el ajuste a un histograma de las tallas (de al menos 200 nanopartículas) a una función de Gauss. La desviación estándar (o) se define como la raíz de la media de los cuadrados de las diferencias de todas las observaciones del tamaño medio, y la polidispersidad de la distribución (P) se define como el porcentaje de la desviación estándar (o) relacionado con el tamaño medio (P = o / (media · valor) x 100). Se obtuvo una distribución de tamaño de CB: 17,3 ± 8.9 nm (Fig. 1).
UV-Vis Spectroscopy: películas Ag-CB y soluciones de Ag se analizaron en un rango de 300 a 800 nm y se observó un pico alrededor de 407- 415 nm, indicativo de la presencia de las nanopartículas. En base a la literatura, este pico indica la presencia de Ag-NPs de 15 nm. EJEMPLO 2. Ensayo de toxicidad de las películas de celulosa bacteriana.
Escherichia coli se hizo crecer en medio LB-agar durante una noche a 37 °C. Se recogió una colonia y se incubó en 4 mi de medio LB-agar líquido una noche a 37 °C. Se sembraron 2 mi del cultivo líquido con un esparcidor en medio LB-agar y se incubaron una noche a 37 °C. Se añadieron los siguientes materiales/soluciones:
- Antibiótico: 5 μΙ de una solución de 10 mg / mi de gentamicina.
- Agua: 5 μΙ.
- Ag-CB: una pieza de Ag-CB.
- CB: una pieza de CB.
- Ag nano: 5 μΙ de una solución 62,7 mg/ml de nanopartículas de Ag (15 nm de diámetro).
- Ag nano 1 :10: 5 μΙ de una dilución 1 : 10 de la solución anterior de nanopartículas de Ag.
- AgN03: 5 μΙ de una solución de 635 mg / mi de AgN03.
- AgN03 1 :10: 5 μΙ de una dilución 1 :10 de la solución de AgN03 de 635 mg / mi.
- AgN03 1 : 100: 5 μΙ de una dilución 1 : 100 de la solución de AgN03 de 635 mg / ml. Se tomaron fotografías digitales después de 24 horas. Los resultados se muestran en la Fig. 2, donde se observa claramente que la CB sola no es tóxica para las células vivas. El experimento de toxicidad consistió en aplicar sobre una placa con crecimiento confluente de Escherichia coli, bacteria biomarcadora, CB, nanopartículas de plata (Ag nano), Ag-CB o el compuesto AgN03. Como control positivo de toxicidad se utilizó el antibiótico gentamicina y como control negativo agua. Mientras que el antibiótico, Ag nano o AgN03 son tóxicos para las bacterias -se observa un halo alrededor del lugar de aplicación-, ni el agua ni la CB lo son, no alterándose el crecimiento de la bacteria tras su aplicación. EJEMPLO 3. Ensayo de regeneración tisular vegetal con películas de celulosa bacteriana.
Cortes
Plantas de Nicotiana benthamiana fueron sembradas en bandeja de alveolos durante una semana. Las plántulas se transfirieron a macetas individuales (5 ") llenas de sustrato de turba de Sphagnum (Gramoflor) durante 3 semanas bajo condiciones constantes: 23-26°C día y 21-22°C en oscuridad, 50-60% de humedad y un régimen de oscuridad-fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad. Dos hojas por planta fueron utilizadas para el ensayo.
Los cortes se realizaron con cuchillas quirúrgicas estériles número 10 (Albion Surgicals Limited, Sheffield, Inglaterra). Particularmente se hizo un corte de 1 cm. Cada corte se cubrió inmediatamente con una banda de 1 cm de longitud del material a ensayar: - Celulosa bacteriana (CB).
- Cinta de microporos (3M Deutschland GmbH, Neuss, Alemania).
- Ningún material.
La observación se realizó a diario y se tomaron fotografías a las 48 horas de hacer los cortes, con una cámara digital o con una cámara LCD conectada a una Olympus DP71 binocular (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Los resultados se muestran en la Figura 3. Los cortes cubiertos con CB muestran una regeneración tisular completa, llegándose a sellar la herida. En cambio, aquellos cortes en los cuales no se aplicó la CB quedaron abiertos y sin regenerar.
Microscopía electrónica de barrido (SEM): Después del proceso de curación, las muestras fueron cortadas y colocadas en un sustrato de aluminio SEM sobre un adhesivo de cinta de carbono. Luego, se metalizaron usando (Au / Pd, 25 mA, 4 '). Posteriormente, se tomaron imágenes con un microscopio electrónico de barrido (FEI Quanta 200 FEG-ESEM) en condiciones de alto vacío o condiciones de bajo vacío. Se realizó un análisis elemental mediante el microscopio SEM en las áreas seleccionadas. Los resultados se muestran en la Fig. 5, donde se puede observar la aparición de tejido nuevo en la zona adyacente al corte en la muestra tratada con CB. Punción
Plantas de Nicotiana benthamiana fueron sembradas en bandeja de alveolos durante una semana. Las plántulas se transfirieron a macetas individuales (5 ") llenas de sustrato de turba de Sphagnum (Gramoflor) durante 3 semanas bajo condiciones constantes: 23-26°C día y 21-22°C en oscuridad, 50-60% de humedad y un régimen de oscuridad-fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad. Dos hojas por planta fueron utilizadas para el ensayo.
Las punciones se realizaron con agujas 21G x 11 2" (Terumo, Shibuya, Japan). Cada punción se cubrió inmediatamente con una banda de 1 cm de longitud del material a ensayar:
- Celulosa bacteriana (CB).
- Cinta de microporos (3M Deutschland GmbH, Neuss, Alemania).
- Ningún material.
Microscopía electrónica de barrido (SEM): Después del proceso de curación, las muestras fueron cortadas y colocadas en un sustrato de aluminio SEM sobre un adhesivo de cinta de carbono. Luego, se metalizaron usando (Au / Pd, 25 mA, 4 '). Posteriormente, se tomaron imágenes con un microscopio electrónico de barrido (FEI Quanta 200 FEG-ESEM) en condiciones de alto vacío o condiciones de bajo vacío. Se realizó un análisis elemental mediante el microscopio SEM en las áreas seleccionadas. Los resultados se muestran en la Fig. 4, donde se puede observar la aparición de tejido nuevo en la zona adyacente a la punción en la muestra tratada con CB.
Corte e infección
Plantas de Nicotiana benthamiana fueron sembradas en bandeja de alveolos durante una semana. Las plántulas se transfirieron a macetas individuales (5 ") llenas de sustrato de turba de Sphagnum (Gramoflor) durante 3 semanas bajo condiciones constantes: 23-26°C día y 21-22°C en oscuridad, 50-60% de humedad y un régimen de oscuridad-fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad. Dos hojas por planta fueron utilizadas para el ensayo. Los cortes se realizaron con cuchillas quirúrgicas estériles número 10 (Albion Surgicals Limited, Sheffield, Inglaterra). Particularmente se hizo un corte de 1 cm.
A través del corte se inoculó la bacteria virulenta Pseudomonas syringae DC3000 utilizando una jeringa con émbolo. El contorno de la zona inoculada se marcó con un rotulador resistente al agua. Cada corte inoculado se cubrió inmediatamente con una banda de 1 cm de longitud del material a ensayar:
- Celulosa bacteriana (CB).
- Celulosa bacteriana con nanopartículas de Ag (Ag-CB)
- Cinta de microporos (3M Deutschland GmbH, Neuss, Alemania) (Tape).
- Ningún material.
La observación se realizó a diario y se tomaron fotografías a las 48 horas de hacer los cortes, con una cámara digital o con una cámara LCD conectada a una Olympus DP71 binocular (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Los resultados se muestran en la Figura 6. Los cortes infectados cubiertos con Ag-CB muestran unos niveles de infección más bajos, como se puede observar por la menor clorosis en la zona inoculada. La CB sin plata o la cinta de microporos (Tape) no mostraron ningún efecto sobre la infección.
EJEMPLO 4. Ensayo de regeneración tisular vegetal con películas de celulosa vegetal.
Plantas de Nicotiana benthamiana fueron sembradas en bandeja de alveolos durante una semana. Las plántulas se transfirieron a macetas individuales (5 ") llenas de sustrato de turba de Sphagnum (Gramoflor) durante 3 semanas bajo condiciones constantes: 23-26°C día y 21-22°C en oscuridad, 50-60% de humedad y un régimen de oscuridad-fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad. Dos hojas por planta fueron utilizadas para el ensayo.
Los cortes se realizaron con cuchillas quirúrgicas estériles número 10 (Albion Surgicals Limited, Sheffield, Inglaterra). Particularmente se hizo un corte de 1 cm. Cada corte se cubrió inmediatamente con una banda de 1 cm de longitud del material a ensayar: - Celulosa vegetal: papel de filtro (PrimeSource, Morgan Scott Group Inc., USA).
- Cinta de microporos: tape (3M Deutschland GmbH, Neuss, Alemania).
- CB.
- Ningún material Después de 5 días, la cinta de microporos no mostró recuperación de la herida y el papel de filtro mostró recuperación de la herida bajo una humedad relativa controlada del 99% (como se muestra en la Fig. 7). Sin embargo, bajo humedad relativa baja (crecimiento en cámara, 60%) solo la CB permaneció unida a la hoja y fue capaz de regenerar la herida. El papel de filtro se desprendió de la herida rápidamente y no pudo producirse regeneración.
Por lo tanto, estos estudios indican que el porcentaje de humedad tiene un gran impacto en el agua dentro de la estructura y en la regeneración tisular. La celulosa vegetal (papel de filtro) cuando se empleó bajo condiciones de humedad relativa alta (alto contenido en agua) fue también capaz de regenerar heridas en plantas (Fig. 7).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para regenerar tejidos vegetales dañados que comprende: a. poner en contacto el tejido vegetal dañado con celulosa, y
b. permitir la regeneración del tejido vegetal dañado.
2. El método según la reivindicación 1 , donde la celulosa es celulosa vegetal o bacteriana.
3. El método según la reivindicación 2, donde la celulosa es celulosa bacteriana.
4. El método según la reivindicación 3, donde la celulosa bacteriana es producida por bacterias del género Gluconacetobacter.
5. El método según la reivindicación 4, donde la bacteria del género Gluconacetobacter se selecciona de entre Gluconacetobacter xylinus o Gluconacetobacter europaeus.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la celulosa está en forma de gel, en forma de suspensión o en forma de película.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la celulosa está en forma de película.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la celulosa además comprende un agente antibacteriano, antifúngico y/o antiviral.
9. El método según la reivindicación 8, donde el agente son nanopartículas de plata y/o cobre.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la celulosa está mojada.
1 1. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el tejido vegetal es tejido vegetal lignificado o tejido vegetal no lignificado.
12. El método según la reivindicación 11 , donde el tejido vegetal es tejido vegetal no lignificado.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el tejido vegetal se selecciona de la lista que consiste en: hoja, fruto, tallo, rama, flor o raíz.
14. El método según la reivindicación 13, donde el tejido vegetal son hojas.
15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde el tejido vegetal pertenece a una planta de la familia Solanaceae.
16. El método según la reivindicación 15, donde el tejido vegetal pertenece a Nicotiana benthamiana o Solanum lycopersicum.
17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el daño en el tejido es provocado por corte, abrasión, punción, presión, rotura o infección.
18. El método según la reivindicación 17, donde la infección es bacteriana.
19. El método según la reivindicación 18, donde la infección bacteriana es provocada por E. coli o Pseudomonas syringae.
20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde el paso (b) tiene lugar durante un periodo de tiempo de al menos 24 horas.
21. El método según la reivindicación 20, donde el paso (b) tiene lugar durante un periodo de tiempo de al menos 48h.
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