WO2017170849A1 - ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地および多能性幹細胞の培養方法 - Google Patents

ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地および多能性幹細胞の培養方法 Download PDF

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美保 古江
信一郎 庄司
佳奈 柳原
正義 塚原
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National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
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    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Definitions

  • the present invention provides a culture medium for naive pluripotent stem cells for efficiently growing naive pluripotent stem cells while maintaining undifferentiation and pluripotency (pluripotency) of naive pluripotent stem cells.
  • the purpose is to provide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for proliferating pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiation and pluripotency (pluripotency) of pluripotent stem cells and maintaining a naive type. To do.
  • Human iPS cells are cells that can be induced by introducing genes of factors 3 to 4 into somatic cells and have the ability to differentiate into almost all cells in the body (pluripotency). Because of this characteristic, it is expected that living tissue is artificially produced from iPS cells and transplanted into a patient's body to be applied to regenerative medicine for treating diseases that have been difficult to treat. In addition, since human cells that could not be obtained in the past can be produced, application to screening such as disease elucidation models, effects of new drugs, or safety evaluation is also expected.
  • Human pluripotent stem cells including human iPS cells, are fetal fibroblasts such as mice or humans, or on-feeder cultures using placenta-derived cells as feeder cells, or matrigel, vitronectin, laminin, fibronectin It can be maintained by feeder-less culture using a flask having a surface coated with an extracellular matrix such as a recombinant protein or the like with an extracellular matrix.
  • Adhesive cells cannot be cultured in suspension unless microcarrier beads are used.
  • Human pluripotent stem cells are known to produce aggregates and differentiate spontaneously when suspended.
  • human iPS cells when human iPS cells are cultured in suspension, it is necessary to disperse human iPS cells into a single cell or a group of several to several tens of cells. At this time, human iPS cells cause apoptosis. have.
  • Y-27632 a ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase) inhibitor
  • pluripotent stem cells are classified into “naive type” and “prime type”.
  • mice conditions for culturing a naive type having epiblast properties before implantation and a prime type having epiblast properties after implantation are known.
  • the “naive type” is more undifferentiated, has a higher ability to create chimeric individuals, and has the ability to differentiate into germ cells such as sperm and ova, so it is qualitatively superior to the prime type. Is mentioned.
  • stratified dome-shaped colonies are formed and grow uniformly and stably.
  • suspension culture can be carried out as an aggregate in serum-free culture (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 2 On the other hand, in the case of a human, it is known that when it is produced from the inner cell mass of a fertilized egg before implantation, it becomes “prime type”. Human iPS cells are also of the prime type.
  • Y-27632 is added at a concentration of 10 ⁇ M to the previously reported suspension culture system of human iPS cells (Non-Patent Documents 3 to 8). From the gene expression pattern, it is considered to be “prime type”.
  • mouse ES cells shift to a naive type by culturing in a 2i / L medium containing a MEK inhibitor, a GSK inhibitor and LIF.
  • a MEK inhibitor a MEK inhibitor
  • GSK inhibitor a GSK inhibitor
  • LIF a GSK inhibitor
  • Methods for inducing human iPS cells to “naive” include MEK inhibitor (PD0325901), GSK inhibitor (CHIR99021, IM12, or BIO), JNK inhibitor (SP600125), P38 inhibitor (SB203580), PKC inhibition.
  • Medium containing any one or more of signal agent (Go6983), ROCK inhibitor (Y-27632), BMP inhibitor (Dorsomorphin), BRAF inhibitor (SB590885), SRC inhibitor (WH-4-023)
  • the common point of the “naive type” induction method is that the medium always contains a MEK inhibitor and a GSK inhibitor, and the cells are grown by adhesion culture using feeder cells or matrigel.
  • the expression of genes peculiar to “na ⁇ ve” such as STELLA and TFCP2L1 may be significantly increased as compared to “prime” found in general media. are known.
  • the present invention provides a culture medium for naive pluripotent stem cells for efficiently growing naive pluripotent stem cells while maintaining undifferentiation and pluripotency (multipotency) of naive pluripotent stem cells.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors have found that the above problem can be solved by allowing a low concentration of ROCK inhibitor to be present in the medium, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (9).
  • a method for culturing pluripotent stem cells. (9) The method for culturing pluripotent stem cells according to (8), wherein the ROCK inhibitor is Y-27632.
  • naive type pluripotent stem cells are maintained undifferentiated and pluripotent (multipotent) while naive Type pluripotent stem cells can be efficiently proliferated.
  • undifferentiation and pluripotency can be achieved by culturing naive pluripotent stem cells in a medium containing a low concentration of ROCK inhibitor. While maintaining, the naive form of pluripotent stem cells can be efficiently maintained.
  • FIG. 1A and FIG. 1B are diagrams showing the results of observing iPS cell proliferation in the presence of a ROCK inhibitor.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the number of iPS cells and the viability of iPS cells in the presence of a ROCK inhibitor.
  • 3A-3D are specific to iPS cell undifferentiated marker genes NANOG and OCT3 / 4, na ⁇ ve type specific marker gene STELLA, and mid-lung lobe differentiation in the presence of ROCK inhibitors 3 is a graph showing the results of confirming the expression level of NCAM, which is a unique marker gene, by real-time PCR.
  • FIG. 4 is a graph showing iPS cell proliferation in the presence of low concentrations of ROCK inhibitors and growth factors.
  • FIG. 5A to FIG. 5D are graphs showing the expression of undifferentiated marker genes and na ⁇ ve specific marker genes in iPS cells in the presence of low concentrations of ROCK inhibitors and growth factors.
  • FIG. 6 is a graph showing the proliferation rate of iPS cells in the presence of low concentrations of ROCK inhibitors and low molecular compounds.
  • 7A and 7B are graphs showing the expression of undifferentiated marker genes in iPS cells in the presence of low concentrations of ROCK inhibitors and low molecular compounds.
  • the present invention is a medium for culturing naive pluripotent stem cells (hereinafter also referred to as “the medium of the present invention”) containing a ROCK inhibitor at a concentration of 5 ⁇ M or less.
  • the medium of the present invention comprises 5 ⁇ M or less of a ROCK inhibitor in a basal medium for pluripotent stem cells.
  • the basal medium for pluripotent stem cells by adding a ROCK inhibitor at a concentration of 5 ⁇ M or less, the na ⁇ ve type pluripotent stem cells are maintained while maintaining undifferentiation and pluripotency (pluripotency).
  • a ROCK inhibitor at a concentration of 5 ⁇ M or less, the na ⁇ ve type pluripotent stem cells are maintained while maintaining undifferentiation and pluripotency (pluripotency).
  • limit especially if it is a culture medium which can proliferate a pluripotent stem cell efficiently, A chemical synthesis culture medium is preferable from the point which is easy to prepare and prevents the dispersion
  • the basal medium for pluripotent stem cells comprises one or more sugar (s), one or more inorganic salts (s), one or more amino acids (s), one or more vitamins (s), and one It is preferable to contain the above trace component (s).
  • antibiotics such as kanamycin can be included as appropriate for use in drug sensitivity tests.
  • sugar (s) examples include monosaccharides such as glucose, lactose, mannose, fructose and galactose, and disaccharides such as sucrose, maltose and lactose.
  • monosaccharides such as glucose, lactose, mannose, fructose and galactose
  • disaccharides such as sucrose, maltose and lactose.
  • glucose is particularly preferable.
  • These saccharides can be added alone or in combination.
  • Examples of the inorganic salt (s) include calcium chloride, calcium nitrate, copper sulfate pentahydrate, iron (III) nitrate nonahydrate, iron (II) sulfate heptahydrate, magnesium chloride hexahydrate. , Magnesium sulfate, potassium chloride, sodium chloride, disodium hydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate dihydrate, sodium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate dihydrate and zinc sulfate heptahydrate It is done. Any inorganic salt or a combination thereof can be used as long as it is a component that advantageously acts to maintain the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
  • amino acid (s) examples include alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cystine, cysteine, glutamine, glycine, histidine, glutamic acid, hydroxyproline, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, Examples include tryptophan, tyrosine and valine, and L-amino acids are preferred.
  • the amino acid (s) may include derivatives such as derivatives, salts and hydrates thereof.
  • arginine derivatives include L-arginine hydrochloride and L-arginine monohydrochloride.
  • derivatives of aspartic acid include L-aspartic acid sodium salt monohydrate, L-aspartic acid monohydrate, potassium L-aspartate, magnesium L-aspartate, and the like.
  • cysteine derivatives include L-cysteine dihydrochloride and L-cysteine hydrochloride monohydrate.
  • lysine derivatives include L-lysine hydrochloride.
  • Derivatives of glutamic acid include L-glutamic acid monosodium salt and the like.
  • L-asparagine monohydrate and the like can be mentioned.
  • examples of the derivative of tyrosine include L-tyrosine disodium dihydrate and the like.
  • examples of histidine derivatives include histidine hydrochloride and histidine hydrochloride monohydrate.
  • Examples of lysine derivatives include L-lysine hydrochloride.
  • vitamin (s) examples include ascorbic acid, biotin, choline, folic acid, inositol, niacin, pantothenic acid, pyridoxine, riboflavin, thiamine, vitamin B12, and paraaminobenzoic acid (PABA).
  • ascorbic acid is preferably added.
  • the vitamin (s) can include derivatives such as derivatives, salts and hydrates thereof.
  • ascorbic acid 2-phosphate ester Ascorbic acid 2-phosphate
  • magnesium ascorbate phosphate magnesium ascorbate phosphate
  • sodium ascorbate sulfate sodium ascorbyl aminopropyl phosphate
  • sodium ascorbate phosphate sodium ascorbate phosphate
  • Examples of derivatives of choline include choline chloride and the like.
  • Examples of niacin derivatives include nicotinic acid, nicotinamide and nicotinic alcohol.
  • Examples of the derivative of pantothenic acid include calcium pantothenate, sodium pantothenate, panthenol and the like.
  • Examples of derivatives of pyridoxine include pyridoxine hydrochloride, pyridoxal hydrochloride, pyridoxal phosphate, and pyridoxamine.
  • Derivatives of thiamine include, for example, thiamine hydrochloride, thiamine nitrate, bisthiamine nitrate, thiamine dicetyl sulfate ester salt, fursultiamine hydrochloride, octothiamine and benfotiamine.
  • the trace component is preferably a component that advantageously acts on maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
  • the trace component include components used as usual medium components such as glutathione, hypoxanthine, lipoic acid, linolenic acid, phenol red, putrescine, pyruvic acid, thymidine, and NaHCO 3 .
  • the trace components can include derivatives such as derivatives, salts and hydrates thereof. Examples of the derivative include putrescine dihydrochloride.
  • basal medium for pluripotent stem cells include known chemical synthesis such as commercially available Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), minimum essential medium (MEM), Eagle basal medium (BME), RPMI 1640 medium, and F12 medium.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • MEM minimum essential medium
  • BME Eagle basal medium
  • F12 medium F12 medium
  • a medium such as a medium, a medium in which any two or more of these mediums such as a DMEM / F12 medium (a medium in which DMEM and F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1), and the like, Examples include a medium supplemented with an acid, preferably ascorbic acid 2-phosphate.
  • ESF Nutrient Medium (hereinafter also referred to as “mESF Basal Medium”) shown in Miho Furue et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim. can do.
  • ROCK inhibitor means a substance that inhibits the activity of Rho kinase.
  • Rho kinase is a kind of low molecular weight GTP binding protein (low molecular weight G protein) included in the category of GTPase which is a degradation enzyme of GTP (guanosine triphosphate). It has a coiled-coil region at the part and a Rho interaction region at the carboxy terminus.
  • ROCK inhibitor examples include (+)-(R) -trans-4- (1-aminoethyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride (Y-27632), 1- (5- Isoquinolinesulfonyl) -2-methylpiperazine (H-7), 1- (5-isoquinolinesulfonyl) -3-methylpiperazine (isoH-7), N-2- (methylamino) ethyl-5-isoquinolinesulfonamide Hydrochloride (H-8), N- (2-aminoethyl) -5-isoquinolinesulfonamide dihydrochloride (H-9), N- [2- (p-bromocinnamylamino) ethyl] -5-isoquinoline Sulfonamide dihydrochloride (H-89), N- (2-guanidinoethyl) -5-isoquinolinesulfonamide hydrochloride (HA-1004),
  • the concentration of the ROCK inhibitor contained in the medium of the present invention is 5 ⁇ M or less, preferably 4 ⁇ M or less, more preferably 3 ⁇ M or less, still more preferably 2 ⁇ M or less, and particularly preferably 1.5 ⁇ M or less. It is. Moreover, the lower limit value of the ROCK inhibitor concentration is not particularly limited, but it is usually preferably 0.3 ⁇ M or more. When the concentration of the ROCK inhibitor exceeds 5 ⁇ M, the ratio of naive type pluripotent stem cells decreases. Moreover, it can suppress that the proliferation of a pluripotent stem cell falls by setting it as 0.3 micromol or more.
  • the medium of the present invention contains 5 ⁇ M or less of a ROCK inhibitor.
  • the pluripotent stem cells are cultured using the medium, the naive form of the pluripotent stem cells is maintained, so that it is not necessary to include a MEK inhibitor in the medium.
  • the medium of the present invention contains a ROCK inhibitor at a concentration of 5 ⁇ M or less, it is difficult to cause apoptosis when pluripotent stem cells are dispersed in a single cell or a group of several to several tens of cells. For this reason, the culture medium of this invention is preferably used also when carrying out suspension culture of a pluripotent stem cell. As described above, since pluripotent stem cells can be cultured in suspension, a large amount of cells can be produced at a low cost.
  • the culture medium of the present invention may not contain feeder cells and extracellular matrix, which are necessary for adhesion culture when suspension culture is performed.
  • the medium of the present invention may further contain a growth factor. Since the medium of the present invention has a low content of the ROCK inhibitor, the proliferation of pluripotent stem cells may be reduced. By containing a growth factor in the medium of the present invention, the effect of restoring the proliferation of pluripotent stem cells is exhibited.
  • growth factors include activin A transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), macrophage inflammatory protein-1 ⁇ (MIP-1 ⁇ ), epithelial cells Growth factor (EGF), fibroblast growth factor-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) , Nerve cell growth factor (NGF), hepatocyte growth factor (HGF), leukemia inhibitory factor (LIF), protease nexin I, protease nexin II, platelet derived growth factor (PDGF), cholinergic differentiation factor (CDF) Chemokines, Notch ligands (eg, Delta1 etc.), Wnt proteins, angiopoietin-like proteins 2, 3, 5 or 7 (Angpt2, , 5 or 7), insulin-like growth factor (IGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), pleiotrophin (Pleiotrophin) and heparan sulfate
  • the growth factor may be used alone or in combination of two or more.
  • its concentration is usually preferably 0.1 to 1000 ng / mL, more preferably 1 to 20 ng / mL.
  • the medium of the present invention may contain a GSK3 inhibitor, a BRAF inhibitor, an endogenous protein that inhibits BMP, or the like.
  • GSK3 inhibitor examples include CHIR99021 (6- ⁇ 2- [4- (2,4-dichloro-phenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) -pyrimidin-2-ylamino]].
  • BRAF inhibitors include, but are not limited to, GDC-0879, BAY 7304506 (Regorafenib), RAF265 (CHIR-265), SB590885 and Sorafenib. Among these, SB590885 is preferable.
  • BMP inhibitors include compounds that activate transcription factors SMAD1, SMAD5, or SMAD8, and inhibit BMP2, BMP4, BMP6, or BMP7, such as Noggin, chordin, and follistatin. Among these, Noggin is preferable.
  • MEK inhibitors include, but are not limited to, PD184352 and PD98059 that inhibit MEK1, PD0325901, U0126, and SL327 that inhibit MEK1 and MEK2.
  • the GSK3 inhibitor, BRAF inhibitor, endogenous protein that inhibits BMP, or the like may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • the concentration is usually preferably 0.001 to 20 ⁇ M, more preferably 0.02 to 10 ⁇ M.
  • the medium for culturing naive pluripotent stem cells of the present invention is used for efficiently growing naive pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiation and pluripotency (multipotency) of naive pluripotent stem cells. Although used, specifically human pluripotent stem cells are targeted.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells isolated from early embryos (embryonic stem cells: ES cells); embryonic germ cells isolated from embryonic primordial germ cells (EG cells) ( For example, see Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95: 13726-31); germline stem cells (GS cells) isolated from testis immediately after birth (for example, Nature. 2008, 456: 344).
  • embryonic stem cells isolated from early embryos
  • EG cells embryonic germ cells isolated from embryonic primordial germ cells
  • GS cells germline stem cells isolated from testis immediately after birth
  • stem cells derived from bone marrow such as iliac bone marrow or jaw bone marrow
  • mesenchymal stem cells such as stem cells derived from adipose tissue
  • somatic cells such as skin cells, Somatic cell-derived induced pluripotent stem cells that induce dedifferentiation of somatic cells and have the same pluripotency as ES cells [or induced pluripotent stem cells (induced (Primipotent stem cell; iPS cell)].
  • human ES cell H9 strain WA09
  • human ES cell H1 (WA01) strain Universally of Wisconsin, WISC Bank
  • KhES-1, KhES-2 and KhES-3 Kyoto Univ. Medical Research Center, RIKEN BioResource Center
  • human ES cells such as HES3, HES4 and HES6 (Monash University, WISC Bank,); by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, C-Myc gene and Sox2 gene Obtained iPS cells (Kyoto University iPS Cell Laboratory, RIKEN BioResource Center); Tic (JCRB1331 strain), Dotcom (JCRB1327 strain), Squeaky (JCRB1329 strain), Toe (JCRB1338 strain), and L llipop (JCRB1336 strain) (National Center for Child Health and Development, JCRB Cell Bank, National Institute of Biomedical Innovation); UTA-1 strain (University of Tokyo) and UTA-1-SF-2-2 strain (JCRB1493) (University of Tokyo,
  • the method for culturing pluripotent stem cells of the present invention comprises cultivating naive pluripotent stem cells in a medium containing a ROCK inhibitor at a concentration of 5 ⁇ M or less, thereby maintaining the naive type of pluripotent stem cells.
  • a method characterized by proliferating sex stem cells hereinafter also referred to as “culture method of the present invention”.
  • the ROCK inhibitor is as described above, and the preferred concentration is also as described above.
  • the medium contains a MEK inhibitor. There is no need.
  • the culture method of the present invention is preferably carried out by suspension culture. By culturing in suspension culture, a large amount of cells can be produced at low cost. Therefore, the culture method of the present invention does not require cell culture using feeder cells and extracellular matrix that were necessary for adhesion culture when culture is performed in suspension culture.
  • a growth factor may be used to increase the proliferation efficiency of pluripotent stem cells.
  • the types of growth factors used in the culture method of the present invention and the amount added to the medium are as described above.
  • a GSK3 inhibitor In the culture method of the present invention, a GSK3 inhibitor, a BRAF inhibitor, an endogenous protein that inhibits BMP, or the like may be used.
  • the types of GSK3 inhibitor, BRAF inhibitor or endogenous protein that inhibits BMP, and the amount added to the medium are as described above.
  • the culture in the culture method of the present invention is usually 33 to 40 ° C., preferably 34 to 39 ° C., more preferably 37 ° C., usually 1 to 20%, preferably 3 to 15%, more preferably 8 to 10%.
  • it is usually carried out at a high humidity of 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 95%, particularly preferably 100%.
  • the pluripotent stem cells that can be used are as described above.
  • a method for confirming whether or not cells cultured by the culture method of the present invention are undifferentiated and naive cells
  • antibodies against various markers proteins
  • Method of determining by detecting expression of differentiation marker and / or non-detection of expression of differentiation marker method of determining by detecting expression of various markers (genes), method of observing morphological characteristics of cells, and specific differentiation
  • a method for determining whether or not the ability to differentiate into a specific cell can be exhibited by stimulation with an inducer is mentioned.
  • non-identification such as NANOG, OCT3 / 4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-2-54, TRA-1-60, TRA-1-80, CD90 or alkaline phosphatase is not used.
  • the differentiation marker it can be determined that the pluripotent stem cells cultured by the culture method of the present invention maintain undifferentiation.
  • a marker such as STELLA is expressed, it can be determined that the pluripotent stem cells cultured by the culture method of the present invention are na ⁇ ve.
  • the expression of the undifferentiated and / or differentiation marker is confirmed at the protein level, it can be confirmed by, for example, a flow cytometry method, an immunostaining method, an ELISA, or the like using a specific antibody of each marker.
  • the expression of the marker is confirmed at the gene level, it can be confirmed by, for example, RT-PCR using a specific primer pair or Northern blotting using a specific probe or microarray analysis of each marker gene. .
  • Examples of the method for confirming the presence or absence of marker expression by the flow cytometry method include the following methods.
  • the cells cultured by the method of the present invention are suspended in 1 ml of 10% goat serum for 30 minutes and then centrifuged, and then incubated with a mouse antibody against the marker protein of interest for 30 hours, after which the cultured cells are treated with 1% goat. Wash 3 times with PBS containing serum, react with fluorescently labeled goat anti-mouse IgG antibody for 30 minutes, wash 3 times with PBS containing 1% goat serum, and resuspend cells for appropriate flow cytometry It can be determined using equipment.
  • Examples of the method for confirming the presence or absence of marker expression by the immunostaining method include the following methods.
  • the cells cultured by the method of the present invention are fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, washed with PBS several times, and the permeability of the cultured cells is increased with Triton X or the like and blocked with 10% goat serum. , And then immunostained with a mouse antibody against the target marker protein, reacted with fluorescently labeled goat anti-mouse IgG, and determined by observation with a fluorescent microscope.
  • PFA paraformaldehyde
  • Examples of the method for confirming the presence or absence of the expression of alkaline phosphatase include the following methods. Cells cultured by the method of the present invention are fixed with 4.5 mM citrate, 2.25 mM sodium citrate, 3 mM sodium chloride, 65% methanol and 4% paraformaldehyde for 5 minutes, washed, and then fastred substrate kit ( Using an appropriate kit such as Sigma), so-called alkaline phosphatase staining can be performed to visualize alkaline phosphatase.
  • Example 1 Effect on iPS Cell Proliferation in the Presence of ROCK Inhibitor
  • the following components sterilized by passing through a 20 ⁇ m filter in mESF Basal Medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 136-17805) are shown in Table 1. What was mixed with the addition amount shown was used as hESF-FX medium.
  • rHSA-Oleic acid was added to 50 mL of 100 mg / mL recombinant human serum albumin (rHSA, Millipore, 9501-20) with 235 ⁇ L of 200 mg / mL Oleic acid (Sigma Aldrich, O1383-5G) overnight. Prepared by mixing.
  • Tic-FX cells iPS cell Tic strain (JCRB1331) was adapted to feeder-free xenofree culture (FX)] were used.
  • a ROCK inhibitor (Y-27632) was dissolved in hESF-FX medium to 1 ⁇ M, 3 ⁇ M and 10 ⁇ M. 3 mL of each medium was added to an ultra-low adhesion 6-well plate (Corning) and the Tic-FX cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 10% CO 2 (floating culture).
  • FIGS. 1A and 1B The state of the plate after 1 day, 3 days and 5 days after culturing was observed. The results are shown in FIGS. 1A and 1B.
  • FIG. 1A is a photomicrograph at 4 ⁇ magnification
  • FIG. 1B is a photo at 2 ⁇ magnification.
  • the number of cells per well and cell viability after 5 days of culture were measured. The result is shown in FIG.
  • the higher the ROCK inhibitor concentration the greater the number of cells.
  • the number of cells per well and the cell survival rate both increased as the concentration of the ROCK inhibitor increased.
  • Example 2 Expression of marker gene specific to undifferentiated marker gene and naive type Expression of marker gene was confirmed by real-time PCR.
  • Real-time PCR was performed with a real-time PCR apparatus (Applied Biosystems 7300) using the following reaction procedure and primers.
  • NANOG forward primer tgaacctcagctacaaacag (SEQ ID NO: 1) NANOG reverse primer tggtggtaggaagagtaaag (SEQ ID NO: 2) OCT3 / 4 forward primer gacagggggaggggaggagctagg (SEQ ID NO: 3) OCT3 / 4 reverse primer cttccctccaaccagttgccccaaa (SEQ ID NO: 4) STELLA forward primer gttactgggcggagttcgta (SEQ ID NO: 5) STELLA reverse primer tgaagtggcttggtgtctg (SEQ ID NO: 6) NCAM forward primer ggcatttacaagtgtgtggttac (SEQ ID NO: 7) NCAM reverse primer ttggcgcattcttgaacatga (SEQ ID NO: 8) GAPDH forward primer caa
  • NANOG and OCT3 / 4 which are undifferentiated marker genes
  • STELLA which is a marker gene specific for naive type
  • neuronal differentiation specific in cells 5 days after the culture The expression level of NCAM as a marker gene was confirmed by the real-time PCR. The results are shown in FIGS. 3A to 3D.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of the target gene in each sample to GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) used as the internal standard.
  • GAPDH glycosydehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the value in the graph means a relative value (unit: fold) of the amount of DNA before amplification, which is obtained from the difference between the Cp value of GAPDH and the Cp value of the target gene.
  • the internal standard is a gene whose expression level is always constant regardless of the cell state.
  • the Cp value is the number of cycles required to amplify the DNA to a level detectable by a measuring instrument when DNA is amplified by a PCR reaction (theoretically, the amount of DNA doubles in one cycle). .
  • the undifferentiated marker genes NANOG and OCT3 / 4 are more potent than the control (Tic-FX in FIGS. 3A and 3B) when the ROCK inhibitor concentration is 1 ⁇ M and 3 ⁇ M. Whereas the expression level was large, when the ROCK inhibitor was used at a concentration of 10 ⁇ M, both expression levels were lower than those of the control.
  • the expression level of the STELLA gene specific to the naive type was slightly higher than that of the control when the ROCK inhibitor concentration was 10 ⁇ M, but the ROCK gene concentration was 1 ⁇ M and 3 ⁇ M. In some cases, the expression level was higher than the control.
  • NCAM a marker gene specific for middle lung lobe differentiation
  • Example 3 Proliferation of iPS cells in the presence of growth factor A medium in which 1 ⁇ M Y-27632 and the components shown in Table 2 were added to the above basal medium was prepared, and 10% in an ultra-low adhesion 6-well plate (Corning) Tic-FX cells were grown in suspension culture at 37 ° C. in the presence of CO 2 . After 5 days, 10 days and 15 days after sowing, the cells were passaged and cultured until 20 days later. The passage was performed by treating the cell mass with Accutase (Millipore, SCR005) at 37 ° C. for 10 minutes. Cell numbers were counted 5 days, 10 days, 15 days and 20 days after seeding. The result is shown in FIG.
  • Example 4 Expression of marker gene specific to undifferentiated marker gene and naive type
  • marker gene expression was performed in real time in the same manner as in Example 2. Confirmed by PCR. The base sequences of the primers used for confirming the expression of the TFCP2L1 gene are shown below.
  • TFCP2L1 forward primer tgtgaggccaaagatgaccattta (SEQ ID NO: 11)
  • TFCP2L1 reverse primer caatcagctccaaggtggtcag (SEQ ID NO: 12)
  • FIGS. 5A to 5D The results are shown in FIGS. 5A to 5D.
  • a culture medium to which any of recombinant human LIF, recombinant human FGF2 and sodium heparan sulfate was not added was used (indicated as Tic-FX in FIGS. 5A to 5D).
  • Y-27632 which is a ROCK inhibitor
  • it is a pluripotency marker (undifferentiation marker gene) when a growth factor is added to the medium.
  • NANOG and OCT3 / 4 expression was found to be increased.
  • FIG. 5C and FIG. 5D it turned out that the STELLA gene specific to a na ⁇ ve type
  • Example 5 Cultivation of iPS cells in the presence of low molecular weight compounds Prepared by adding 1 ⁇ M Y-27632, 20 ng / mL LIF and 40 ng / mL FGF2 to the above basal medium. Various inhibitors were added to 1 ⁇ M (PD0325901), 0.3 ⁇ M (CHIR99021), 0.5 ⁇ M (SB590885), 1 ⁇ M (WH-4-023), 10 ⁇ M (SP600125), 10 ⁇ M (SB203580), 5 ⁇ M (Go6983), 5 ⁇ M, respectively. (GF109203X) The culture medium added so that it might become a density
  • Tic-FX cells were grown in a suspension culture in an ultra-low adhesion 6-well plate (Corning) in the presence of 10% CO 2 at 37 ° C. in each medium. Culture was performed for 5 days and the number of cells was counted. The results are shown in FIG. In FIG. 6, what is shown as “ ⁇ ” is the result of using a medium to which no inhibitor was added.
  • PD0325901 N-[(2R) -2,3-dihydroxypropoxy] -3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl) amino] -benzamide, manufactured by TOCRIS, 4192 CHIR99021: 6- ⁇ 2- [4- (2,4-Dichloro-phenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) -pyrimidin-2-ylamino] -ethylamino ⁇ -nicotinonitrile , Manufactured by TOCRIS, 4423 SB590885: 5- (2- (4- (2-dimethylaminoethoxy) phenyl) -5- (4-pyridinyl) -1H-imidazol-4-yl) -2,3-dihydro-1H-indoen-1-one Oxime, manufactured by R & D Systems, 2650/10 WH-4-023:
  • the growth rate of the cells was high in the medium supplemented with CHIR99021, SB590885 or Noggin.
  • pluripotency markers (NANOG and OCT3 / 4) in cells grown in a medium containing an inhibitor having a high cell growth rate was confirmed by real-time PCR in the same manner as in Example 2. The results are shown in FIGS. 7A and 7B.
  • As a control one cultured in a basal medium was used (indicated as Tic-FX in FIGS. 7A and 7B).

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Abstract

本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるためのナイーブ型多能性幹細胞培養用培地を提供する。本発明の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む。

Description

ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地および多能性幹細胞の培養方法
　本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるためのナイーブ型多能性幹細胞培養用培地を提供することを目的とする。また、本発明は、多能性幹細胞の未分化性と多能性（多分化能）を維持しつつ、かつナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖する方法を提供することを目的とする。
　ヒトｉＰＳ細胞は、体細胞に３～４因子の遺伝子を導入することにより誘導でき、生体内の殆ど全ての細胞に分化する能力（多能性）を有する細胞である。この特性から、生体組織をｉＰＳ細胞から人工的に作製し、患者の体内に移植することにより、これまで治療が困難であった疾患を治療する再生医療への応用が期待されている。また、従来、入手できなかったヒト細胞を作製できる可能性があることから、疾患解明モデルや新規薬剤の効果、あるいは、安全性評価などのスクリーニングへの応用も期待されている。
　ヒトｉＰＳ細胞を含むヒト多能性幹細胞は、マウスあるいはヒトなどの胎児由来線維芽細胞や、あるいは胎盤由来細胞などをフィーダー細胞として用いたオンフィーダー培養、またはマトリジェルや、ビトロネクチン、ラミニン、ファイブロネクチンなどの細胞外マトリックスや、あるいは組換えタンパク質などを細胞外マトリックスでコーティングした表面を有するフラスコを用いたフィーダーレス培養により、継代維持することができる。
　しかしながら、これら手法は細胞をフラスコ表面に接着させながら２次元的に培養するものであるため、細胞の大量調製には非効率的である。したがって、ヒトｉＰＳ細胞を３次元的に浮遊培養することができれば、少ないコストで大量の細胞を培養することが可能になると期待される。
　接着細胞は、マイクロキャリアビーズなどを用いない限り、浮遊培養することはできない。ヒト多能性幹細胞は、浮遊させると、凝集塊を作製し、自発的に分化することが知られている。また、ヒトｉＰＳ細胞を浮遊培養する場合には、ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞または数個～数１０個の細胞群に分散する必要があるが、このとき、ヒトｉＰＳ細胞はアポトーシスを起こすという問題を有している。この問題に対しては、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ）阻害剤であるＹ－２７６３２を培地に添加することにより、細胞間接着が促進され、単一細胞または数個～数１０個の細胞群の状態にしたときのヒトｉＰＳ細胞のアポトーシスを抑制することが知られている（非特許文献１）。
　近年、多能性幹細胞は「ナイーブ型」と「プライム型」に分類されている。マウスにおいては、着床前のエピブラストの性質をもつナイーブ型と、着床後のエピブラストの性質をもつプライム型を培養する条件が知られている。「ナイーブ型」の方がより未分化な状態であり、キメラ個体を作り出す能力が高く、特に精子や卵子などの生殖細胞に分化する能力があるため、プライム型よりも質的に優れていることが挙げられる。また、重層化したドーム状コロニーを形成し、均一で安定に増殖する。また、凝集塊として無血清培養下に浮遊培養できるとの報告もある（非特許文献２）。一方、ヒトの場合は、着床前受精卵内部細胞塊から作製した場合は「プライム型」になることが知られている。また、ヒトｉＰＳ細胞もプライム型である。
　既報のヒトｉＰＳ細胞の浮遊培養系には、Ｙ－２７６３２が１０μＭ濃度で添加されるのが一般的であるが（非特許文献３～８）、この場合、ヒトｉＰＳ細胞は細胞の形状やマーカー遺伝子の発現パターンから「プライム型」であると考えられる。
　マウスＥＳ細胞においてはＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤およびＬＩＦを含む２ｉ／Ｌ培地中で培養することにより、ナイーブ型に移行することが報告されている。一方、２ｉ／Ｌ培地中でマウスのエピブラスト幹細胞やヒトの多能性幹細胞を培養すると細胞は分化することが知られている。
　ヒトｉＰＳ細胞を「ナイーブ型」に誘導する方法としては、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１、ＩＭ１２、またはＢＩＯ）、ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）、Ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）、ＰＫＣ阻害剤（Ｇｏ６９８３）、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）、ＢＭＰ阻害剤（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ＢＲＡＦ阻害剤（ＳＢ５９０８８５）、ＳＲＣ阻害剤（ＷＨ－４－０２３）のいずれかまたは複数のシグナル阻害剤を含む培地を用いたフィーダー培養またはフィーダーレス培養を行うことで「ナイーブ型」を誘導する方法が報告されている（非特許文献９～１４）。
　上記「ナイーブ型」誘導法の共通点は、培地がＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ阻害剤を必ず含み、フィーダー細胞またはマトリジェルを用いた接着培養により細胞を増殖させる点である。これら方法により誘導された「ナイーブ型」細胞では一般的な培地中で見られる「プライム型」と比較してＳＴＥＬＬＡやＴＦＣＰ２Ｌ１などの「ナイーブ型」に特有の遺伝子の発現が顕著に増加することが知られている。
　ヒトｉＰＳ細胞を、ＭＥＫ阻害剤を含まないで培養することにより、「ナイーブ型」のヒトｉＰＳ細胞を誘導した例は知られていない。
Watanabe K. el. Al., NATURE BIOTECHNOLOGY VOLUME 25, p.681 Hayashi Yohei et al. Stem Cells. 25, 3005-15 (2007) Ayumi Horiguchi et al. Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 118 No. 5, 588-592, 2014 Methods Enzymol., 325 (2000), pp. 273-284 Nature Biotechnology 25, 681 - 686 (2007) Guokai Chen et al. Cell Stem Cell 7, 240-248 (2010) Nil Emre et al. PLoS One 5, e12148 (2010) Yuehong Wu et al. Theriogenology (2015) [Epub ahead of print] Yasuhiro Takashima et al., Cell 158, 1254-1269 (2014) Thorold W. Theunissen et al. Cell Stem Cell 15, 471-487 (2014) Carol B. Ware et al. PNAS 111, 4484-4489 (2014) Bahram Valamehr et al. Stem Cell Reports 2, 366-381 (2014) Yun-Shen Chan et al. Cell Stem Cell 13, 663-675 (2013) Ohad Gafni et al. Nature 504, 282-286 (2013)
　本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるためのナイーブ型多能性幹細胞培養用培地を提供することを目的とする。
　本発明者らは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤を培地中に存在させることにより上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の（１）～（９）に関する。
（１）ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む、ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（２）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、（１）に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（３）ＭＥＫ阻害剤を含んでいない、（１）または（２）に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（４）フィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、（１）～（３）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（５）増殖因子を更に含む、（１）～（４）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（６）浮遊培養に使用される、（１）～（５）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（７）ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、（１）～（６）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（８）ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞のナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法。
（９）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、（８）に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１０）培地中にＭＥＫ阻害剤を含んでいない、（８）または（９）に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１１）培地中にフィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、（８）～（１０）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１２）浮遊培養で実施される、（８）～（１１）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１３）ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、（８）～（１２）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
　本発明のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地によれば、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤を含むことにより、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させることができる。また、本発明の多能性幹細胞の培養方法によれば、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、未分化と多能性（多分化能）維持しつつ、多能性幹細胞のナイーブ型を効率よく維持することができる。
図１Ａおよび図１Ｂは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのｉＰＳ細胞の増殖を観察した結果を示す図である。 図２は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのｉＰＳ細胞の数、およびｉＰＳ細胞の生存率を測定した結果を示すグラフである。 図３Ａ～図３Ｄは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下での、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４、ナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子であるＳＴＥＬＬＡ、並びに中肺葉分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭの発現量をリアルタイムＰＣＲにより確認した結果をそれぞれ示すグラフである。 図４は、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖を示すグラフである。 図５Ａ～図５Ｄは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子およびナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子の発現を示すグラフである。 図６は、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖率を示すグラフである。 図７Ａおよび図７Ｂは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子の発現を示すグラフである。
１．ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地
　本発明は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む、ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地（以下、「本発明の培地」ともいう。）である。本発明の培地は、多能性幹細胞用基礎培地に、５μＭ以下のＲＯＣＫ阻害剤を含んでなる。
　前記多能性幹細胞用基礎培地としては、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で添加することにより、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させることのできる培地であれば、特に制限されないが、調製が容易であり、ロットごとのばらつきを防ぐ点から化学合成培地が好ましい。
　前記多能性幹細胞用基礎培地は、１種類以上の糖（類）、１種類以上の無機塩（類）、１種類以上のアミノ酸（類）、１種類以上のビタミン（類）、および１種類以上の微量成分（類）を含むことが好ましい。また、薬剤感受性試験に使用するためにカナマイシン等の抗生物質を適宜含むこともできる。
　前記糖（類）としては、例えば、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトースおよびガラクトース等の単糖類、並びにスクロース、マルトースおよびラクトース等の二糖類が挙げられる。これらの中でもグルコースが特に好ましい。これら糖類は、１または２以上組み合わせて添加することもできる。
　前記無機塩（類）としては、例えば、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物および硫酸亜鉛七水和物が挙げられる。多能性幹細胞の未分化状態の維持に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類またはその組合せも用いることができる。
　前記アミノ酸（類）としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン等が挙げられ、Ｌ－体のアミノ酸が好ましい。前記アミノ酸（類）には、これらの誘導体、塩および水和物などの派生物を含めることができる。
　アルギニンの派生物としては、例えば、Ｌ－塩酸アルギニンおよびＬ－アルギニン一塩酸塩等が挙げられる。アスパラギン酸の派生物としては、例えば、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ－アスパラギン酸一水和物、Ｌ－アスパラギン酸カリウム、Ｌ－アスパラギン酸マグネシウム等が挙げられる。
　システインの派生物としては、例えば、Ｌ－システイン二塩酸塩およびＬ－システイン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ－リジン塩酸塩等が挙げられる。グルタミン酸の派生物としては、Ｌ－グルタミン酸一ナトリウム塩等が挙げられる。
　アスパラギンの派生物としては、例えば、Ｌ－アスパラギン一水和物等が挙げられる。チロシンの派生物としては、例えば、Ｌ－チロシン二ナトリウム二水和物等が挙げられる。ヒスチジンの派生物としては、例えば、ヒスチジン塩酸塩およびヒスチジン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ－リジン塩酸塩等が挙げられる。
　前記ビタミン（類）としては、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２およびパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）が挙げられる。これらの中でも、アスコルビン酸は添加されることが好ましい。前記ビタミン（類）には、これらの誘導体、塩および水和物などの派生物を含めることができる。
　アスコルビン酸の派生物としては、例えば、アスコルビン酸２－リン酸エステル（Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピルおよびアスコルビン酸リン酸ナトリウム等が挙げられる。
　コリンの派生物としては、例えば、塩化コリン等が挙げられる。ナイアシンの派生物としては、例えば、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよびニコチニックアルコール等が挙げられる。パントテン酸の派生物としては、例えば、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウムおよびパンテノール等が挙げられる。
　ピリドキシンの派生物としては、例えば、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサールおよびピリドキサミン等が挙げられる。チアミンの派生物としては、例えば、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミンおよびベンフォチアミン等が挙げられる。
　前記微量成分は多能性幹細胞の未分化状態の維持に有利に作用する成分であることが好ましい。前記微量成分としては、例えば、グルタチオン、ヒポキサンチン、リポ酸、リノレン酸、フェノールレッド、プトレシン、ピルビン酸、チミジンおよびＮａＨＣＯ３等通常培地成分として用いられている成分が挙げられる。前記微量成分には、これらの誘導体、塩および水和物などの派生物を含めることができる。派生物としては、例えば、プトレシン二塩酸を挙げることができる。
　多能性幹細胞用基礎培地として具体的には、例えば、市販のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０培地およびＦ１２培地等の公知の化学合成培地などの培地、並びにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）等のこれらの培地のいずれか２以上を適当な割合で混合した培地、およびこれらの培地に前記アスコルビン酸、好ましくはアスコルビン酸２－リン酸エステルを添加した培地が挙げられる。
　特にアニマルプロダクトフリーの基礎培地として、Miho Furue et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 41, 19-28 (2005)に示されるＥＳＦ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（以下、「ｍＥＳＦ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ」ともいう）を好適に例示することができる。
　ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害する物質を意味する。Ｒｈｏキナーゼとは、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）の分解酵素であるＧＴＰアーゼの範疇に含まれる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）の１種で、アミノ末端にセリン／スレオニンキナーゼ領域、中央部にコイルドコイル領域およびカルボキシ末端にＲｈｏ相互作用領域を有する。
　ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、（＋）－（Ｒ）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ－２７６３２）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－２－メチルピペラジン（Ｈ－７）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－３－メチルピペラジン（イソＨ－７）、Ｎ－２－（メチルアミノ）エチル－５－イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ－８）、Ｎ－（２－アミノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ－９）、Ｎ－［２－（ｐ－ブロモシンナミルアミノ）エチル］－５－イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ－８９）、Ｎ－（２－グアニジノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（ＨＡ－１００４）、１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ－１０７７）および（Ｓ）－（＋）－２－メチル－４－グリシル－１－（４－メチルイソキノリニル－５－スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ－１１５２）等が挙げられる。これらの中でも、（＋）－（Ｒ）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ－２７６３２）が好ましい。
　本発明の培地に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、５μＭ以下であり、好ましくは４μＭ以下であり、更に好ましくは３μＭ以下であり、より更に好ましくは２μＭ以下であり、特に好ましくは１．５μＭ以下である。また、ＲＯＣＫ阻害剤濃度の下限値は特に制限されないが、通常０．３μＭ以上とすることが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が５μＭを超えると、多能性幹細胞のナイーブ型の割合が低下する。また、０．３μＭ以上とすることにより、多能性幹細胞の増殖が低下するのを抑制することができる。
　多能性幹細胞のナイーブ型を維持するためには、通常、ＭＥＫ阻害剤を培地に含有する必要があったが、本発明の培地には、５μＭ以下のＲＯＣＫ阻害剤が含まれていることにより、該培地を用いて多能性幹細胞を培養した場合に、多能性幹細胞のナイーブ型が維持されるので、培地にＭＥＫ阻害剤を含有させる必要はない。
　本発明の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含んでいるため、多能性幹細胞を単細胞細胞または数個から数１０個の細胞群に分散した場合にアポトーシスを起こしにくくなっている。このため、本発明の培地は、多能性幹細胞を浮遊培養する場合にも、好ましく用いられる。このように、多能性幹細胞を浮遊培養することができるので、少ないコストで大量の細胞を生産することが可能になる。
　したがって、本発明の培地には、浮遊培養を行うときに、接着培養に必要であった、フィーダー細胞および細胞外マトリクスを含まなくてもよい。
　本発明の培地には、増殖因子を更に含有させてもよい。本発明の培地は、そのＲＯＣＫ阻害剤の含有量が低いため、多能性幹細胞の増殖が低下する場合がある。本発明の培地に、増殖因子を含有させることにより、多能性幹細胞の増殖が回復するという効果が発揮される。
　増殖因子としては、例えば、アクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ）トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、マクロファージ炎症蛋白質－１α（ＭＩＰ－１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子－１、２、３、４、５、６、７、８または９（ＦＧＦ－１、２、３、４、５、６、７、８または９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えば、Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５または７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）およびヘパラン硫酸等が挙げられる。これらの中でも、ＦＧＦ２、ＬＩＦまたはヘパラン硫酸が好ましい。
　本発明の培地においては、増殖因子を単独で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。増殖因子を用いる場合、その濃度は、通常０．１～１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは１～２０ｎｇ／ｍＬである。
　また、本発明の培地には、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等を含有させてもよい。このような化合物を培地に含有させることによって、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させることができる。
　ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（６－｛２－［４－（２，４－ジクロロ－フェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ピリミジン－２－イルアミノ］－エチルアミノ｝－ニコチノニトリル）、ＣＨＩＲ９８０１４（２－［［２－［（５－ニトロ－６－アミノピリジン－２－イル）アミノ］エチル］アミノ］－４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ピリミジン）、ＡＲ－ＡＯ１４４－１８、ＴＤＺＤ－８（４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）およびＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、１－ＡｚＫｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－ピリド［３’，２’：２，３］アゼピノ［４，５－ｂ］インドール－６（５Ｈ）－オン）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ－［３，２－ｄ］－［１］ベンズアゼピン－６（５Ｈ）－オン）等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でもＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
　ＢＲＡＦ阻害剤としては、例えば、ＧＤＣ－０８７９、ＢＡＹ　７３０４５０６（レゴラフェニブ）、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ－２６５）、ＳＢ５９０８８５およびソラフェニブが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でもＳＢ５９０８８５が好ましい。
　ＢＭＰ阻害剤としては、転写因子であるＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５またはＳＭＡＤ８を活性化する、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７を阻害する化合物、例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎおよびｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ等が挙げられる。これらの中でもＮｏｇｇｉｎが好ましい。
　ＭＥＫ阻害剤としては、例えば、ＭＥＫ１を阻害するＰＤ１８４３５２及びＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２を阻害するＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６及びＳＬ３２７等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の培地においては、前記ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等を単独で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、その濃度は、通常０．００１～２０μＭが好ましく、より好ましくは０．０２～１０μＭである。
　本発明のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるために使用されるが、具体的にはヒトの多能性幹細胞を対象とする。
　多能性幹細胞としては、例えば、初期胚より単離される胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）；胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）（例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31参照）；出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）；腸骨骨髄または顎骨骨髄等の骨髄由来の幹細胞；脂肪組織由来の幹細胞などの間葉系幹細胞；皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、被検体自身の体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する体細胞由来人工多能性幹細胞［または誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）］が挙げられる。
　具体的には、例えば、ヒトＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）；ヒトＥＳ細胞Ｈ１（ＷＡ０１）株（ウィスコンシン大学、ＷＩＳＣ　Ｂａｎｋ）；ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３（京大再生研付属幹細胞医学研究センター、理化学研究所バイオリソースセンター）並びにＨＥＳ３、ＨＥＳ４およびＨＥＳ６（モナッシュ大学、ＷＩＳＣ　Ｂａｎｋ、）などのヒトＥＳ細胞；Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ－Ｍｙｃ遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（京都大学ｉＰＳ細胞研究所、理化学研究所バイオリソースセンター）；Ｔｉｃ（ＪＣＲＢ１３３１株）、Ｄｏｔｃｏｍ（ＪＣＲＢ１３２７株）、Ｓｑｕｅａｋｙ（ＪＣＲＢ１３２９株）、Ｔｏｅ（ＪＣＲＢ１３３８株）、およびＬｏｌｌｉｐｏｐ（ＪＣＲＢ１３３６株）（以上成育医療センター、医薬基盤健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）；ＵＴＡ－１株（東京大学）およびＵＴＡ－１－ＳＦ－２－２株（ＪＣＲＢ１４９３）（東京大学、医薬基盤健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）；Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所、理化学研究所バイオリソースセンター、医薬基盤健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）等のｉＰＳ細胞が挙げられる。
２．多能性幹細胞の培養方法
　次に、本発明の多能性幹細胞の培養方法について説明する。本発明の多能性幹細胞の培養方法は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞のナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする方法（以下、「本発明の培養方法」ともいう。）である。ＲＯＣＫ阻害剤については上述した通りであり、その好ましい濃度についても上述した通りである。
　多能性幹細胞のナイーブ型を維持するためには、通常、ＭＥＫ阻害剤を培地に含有させる必要があったが、本発明の培養方法においては、培地中に５μＭ以下のＲＯＣＫ阻害剤が含まれており、このため、この培地を用いて多能性幹細胞を培養した場合に、多能性幹細胞のナイーブ型が維持されるので、本発明の培養方法においては、培地にＭＥＫ阻害剤を含有させる必要はない。
　本発明の培養方法は浮遊培養で行うことが好ましい。浮遊培養で培養を行うことにより、少ないコストで大量の細胞を生産することが可能になる。したがって、本発明の培養方法は、浮遊培養で培養を行う時に、接着培養に必要であったフィーダー細胞および細胞外マトリクスを用いて細胞培養を行う必要がない。
　本発明の培養方法では、多能性幹細胞の増殖効率を高めるために、増殖因子を用いてもよい。本発明の培養方法に用いられる増殖因子の種類、培地への添加量は上述した通りである。
　また、本発明の培養方法では、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等を用いてもよい。ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等の種類、培地への添加量は上述した通りである。
　本発明の培養方法における培養は、通常３３～４０℃、好ましくは３４～３９℃、より好ましくは３７℃にて、通常１～２０％、好ましくは３～１５％、より好ましくは８～１０％の二酸化炭素の存在下で、通常７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは１００％の高湿度下で行なうことが好ましい。
　使用することのできる多能性幹細胞としては上述した通りである。
　本発明の培養方法により培養される細胞が未分化性、およびナイーブ型を維持している細胞であるか否かを確認する方法としては、例えば、各種マーカー（タンパク質）に対する抗体を用いて、未分化マーカーの発現の検出および／または分化マーカーの発現の不検出により判定する方法、各種マーカー（遺伝子）の発現の検出により判定する方法、細胞の形態学的特徴を観察する方法、並びに特定の分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を発揮できるか否かを判定する方法が挙げられる。
　前記マーカーを用いて判定する方法においては、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－２－５４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８０、ＣＤ９０またはアルカリホスファターゼ等の未分化マーカーが発現している場合は、本発明の培養方法で培養した多能性幹細胞が未分化性を維持していると判断することができる。また、ＳＴＥＬＬＡ等のマーカーが発現している場合は、本発明の培養方法で培養した多能性幹細胞がナイーブ型であると判断することができる。
　前記未分化および／または分化マーカーの発現をタンパク質レベルで確認する場合には、例えば、各マーカーの特異抗体を用いて、フローサイトメトリー法、免疫染色法またはＥＬＩＳＡ等により確認することができる。前記マーカーの発現を遺伝子レベルで確認する場合には、例えば、各マーカー遺伝子の、特異的プライマー対を用いたＲＴ－ＰＣＲまたは特異的プローブを用いたノーザンブロッティング若しくはマイクロアレイ解析等によって確認することができる。
　前記フローサイトメトリー法によりマーカー発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の方法で培養した細胞を１ｍｌの１０％ヤギ血清中に３０分間懸濁後遠心分離し、次に対象のマーカータンパク質に対するマウス抗体とともに３０時間インキュベートし、その後当該培養細胞を、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、再懸濁した細胞を適切なフローサイトメトリー用機器を用いて判定することができる。
　前記免疫染色法によりマーカー発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の方法で培養した細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、複数回ＰＢＳにて洗浄後、トライトンＸなどで培養細胞の透過性を増加させ、１０％ヤギ血清でブロッキングを行った後、対象マーカータンパク質に対するマウス抗体を用いて免疫染色し、蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、蛍光顕微鏡観察により判定することができる。
　前記アルカリホスファターゼの発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の方法で培養した細胞を、４．５ｍＭクエン酸、２．２５ｍＭクエン酸ナトリウム、３ｍＭ塩化ナトリウム、６５％メタノールおよび４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、洗浄し、次にＦａｓｔＲｅｄ基質キット（シグマ社製）等の適当なキットを用い、アルカリホスファターゼを可視化する、いわゆるアルカリホスファターゼ染色することができる。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
［実施例１］
ＲＯＣＫ阻害剤存在下でのｉＰＳ細胞の増殖における影響
　以下の実施例においては、ｍＥＳＦ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬社製、１３６－１７８０５）に２０μｍフィルターを通過して滅菌した下記成分を、表１に示す添加量で混合したものをｈＥＳＦ－ＦＸ培地として使用した。
　ｒＨＳＡ－Ｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄは５０ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ　組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ、ミリポア社製、９５０１－２０）に２３５μＬの２００ｍｇ／ｍＬのＯｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（シグマアルドリッチ社製、Ｏ１３８３－５Ｇ）を添加し、終夜混合することにより調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、ｉＰＳ細胞としては、Ｔｉｃ－ＦＸ細胞［ｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株（ＪＣＲＢ１３３１）を、フィーダーフリー・ゼノフリー培養（ＦＸ）に順化させた株］を使用した。
　ｈＥＳＦ－ＦＸ培地にＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を、１μＭ、３μＭおよび１０μＭとなるように溶解した。それぞれの培地を、超低接着６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に３ｍＬずつ加え、上記Ｔｉｃ－ＦＸ細胞を、１０％のＣＯ２存在下、３７℃にて培養した（浮遊培養）。
　培養１日後、３日後、５日後のプレートの様子を観察した。結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａは倍率４倍、図１Ｂは倍率２倍の顕微鏡写真である。また、培養５日後のウェル当たりの細胞数および細胞の生存率を測定した。その結果を図２に示す。
　図１Ａおよび図１Ｂに示すように、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が高いほど細胞数は増えていた。また、図２に示すように、ウェルあたりの細胞数、細胞の生存率は、いずれもＲＯＣＫ阻害剤の濃度が高くなるにつれ上昇していた。
［実施例２］
未分化マーカー遺伝子およびナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子の発現
　マーカー遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。リアルタイムＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社製７３００）にて、下記の反応手順およびプライマーにより実施した。
（反応手順）９５℃３０秒→［（９５℃５秒→６０℃３１秒）×４０サイクル］→Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｃｙｃｌｅ
（プライマー）
ＮＡＮＯＧフォワードプライマー　tgaacctcagctacaaacag（配列番号１）
ＮＡＮＯＧリバースプライマー　tggtggtaggaagagtaaag（配列番号２）
ＯＣＴ３／４フォワードプライマー　gacagggggaggggaggagctagg（配列番号３）
ＯＣＴ３／４リバースプライマー　cttccctccaaccagttgccccaaa（配列番号４）
ＳＴＥＬＬＡフォワードプライマー　gttactgggcggagttcgta（配列番号５）
ＳＴＥＬＬＡリバースプライマー　tgaagtggcttggtgtcttg（配列番号６）
ＮＣＡＭフォワードプライマー　ggcatttacaagtgtgtggttac（配列番号７）
ＮＣＡＭリバースプライマー　ttggcgcattcttgaacatga（配列番号８）
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー　caaagttgtcatggatgacc（配列番号９）
ＧＡＰＤＨリバースプライマー　ccatggagaaggctgggg（配列番号１０）
　実施例１で培養した細胞について、培養後５日後の細胞中の、未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４、ナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子であるＳＴＥＬＬＡ、並びに神経細胞分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭの発現量を、前記リアルタイムＰＣＲにより確認した。結果を図３Ａ～図３Ｄに示す。
　図３Ａ～図３Ｄ中、縦軸は、内部標準として使用したＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）に対する各サンプルの目的遺伝子の発現量の比を意味する。具体的には、グラフの値はＧＡＰＤＨのＣｐ値と目的遺伝子のＣｐ値の差から求められる増幅前のＤＮＡ量の相対値（単位はｆｏｌｄ）を意味する。
　なおここで、内部標準は細胞の状態によらず常に発現量が一定となる遺伝子である。また、Ｃｐ値とは、ＰＣＲ反応によってＤＮＡを増幅させたとき、測定器で検出可能な量まで増幅させるのに必要なサイクル数（理論上、１サイクルでＤＮＡ量は２倍になる）である。
　図３Ａおよび図３Ｂに示すように、未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４は、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１μＭおよび３μＭの時には、対照（図３Ａおよび図３Ｂ中、Ｔｉｃ－ＦＸ）よりも発現量が多かったのに対し、ＲＯＣＫ阻害剤を１０μＭ濃度で用いた場合には、両者の発現量は対照よりも低くなった。
　また、図３Ｃに示すように、ナイーブ型に特異的なＳＴＥＬＬＡ遺伝子は、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１０μＭでは、対照よりもわずかに発現量が多かったが、ＲＯＣＫ遺伝子の濃度を１μＭおよび３μＭとした場合には、発現量が対照よりも多くなっていた。
　この結果から、ＲＯＣＫ阻害剤を、従来用いられている１０μＭ濃度よりも低濃度（１μＭおよび３μＭ）で用いた場合に、未分化を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖できることがわかった。
　また、図３Ｄに示すように、中肺葉分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭは、ＲＯＣＫ阻害剤濃度が１μＭでは対照とほとんど変わらず、３μＭおよび１０μＭでは、発現量は対照よりも上昇していた。
［実施例３］
増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖
　上記基礎培地に、１μＭのＹ－２７６３２と、表２に示す成分を加えた培地を作製し、超低接着６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）中、１０％のＣＯ２存在下、３７℃にてＴｉｃ－ＦＸ細胞の増殖を浮遊培養で行った。播種の５日後、１０日後、１５日後に継代し、２０日後まで培養を行った。継代はＡｃｃｕｔａｓｅ（ミリポア社製、ＳＣＲ００５）を用いて細胞塊を３７℃で１０分間処理することにより行った。播種の５日後、１０日後、１５日後および２０日後に細胞数をカウントした。その結果を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図４に示すように、１μＭのＹ－２７６３２の存在下では、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＦＧＦ２を加えたもの（Ｎｏ．１）と、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＦＧＦ２および２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦを加えたもの（Ｎｏ．２）では、増殖率は低かった。これに対し、４０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２および２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦを加えたもの（Ｎｏ．３）と、組換えヒトＬＩＦ、組換えヒトＦＧＦ２およびヘパラン硫酸ナトリウムを、それぞれ２０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬ加えたもの（Ｎｏ．４）では増殖率が上昇した。
　この結果から、浮遊細胞の効率的な培養には、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤とともに、組換えヒトＬＩＦ、組換えヒトＦＧＦ２、ヘパラン硫酸ナトリウム等の増殖因子を培地に加えることが好ましいことがわかった。
［実施例４］
未分化マーカー遺伝子およびナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子の発現
　実施例３で培養した細胞（表２のＮｏ．３および４の細胞）について、マーカー遺伝子の発現を、実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲで確認した。ＴＦＣＰ２Ｌ１遺伝子の発現の確認に用いたプライマーの塩基配列を下記に示す。
ＴＦＣＰ２Ｌ１フォワードプライマー　tgtgaggccaaagatgaccattta（配列番号１１）
ＴＦＣＰ２Ｌ１リバースプライマー　caatcagctccaaggtggtcag（配列番号１２）
　結果を図５Ａ～図５Ｄに示す。なお、対照として、培地に組換えヒトＬＩＦ、組換えヒトＦＧＦ２およびヘパラン硫酸ナトリウムをいずれも添加しないものを用いた（図５Ａ～図５Ｄにおいて、Ｔｉｃ－ＦＸと表わす）。
　図５Ａおよび図５Ｂに示すように、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ－２７６３２が低濃度で存在する場合でも、培地に増殖因子を添加した場合には、多能性マーカー（未分化マーカー遺伝子）である、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４の発現が増大していることがわかった。また、図５Ｃおよび図５Ｄに示すように、ナイーブ型に特異的なＳＴＥＬＬＡ遺伝子およびＴＦＣＰ２Ｌ１遺伝子も、両者で発現していることがわかった。
［実施例５］
低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の培養
　上記基礎培地に、１μＭのＹ－２７６３２と、２０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦおよび４０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２とを加えた培地を作製し、それぞれに、下記に示す各種阻害剤を、それぞれ１μＭ（ＰＤ０３２５９０１）、０．３μＭ（ＣＨＩＲ９９０２１）、０．５μＭ（ＳＢ５９０８８５）、１μＭ（ＷＨ－４－０２３）、１０μＭ（ＳＰ６００１２５）、１０μＭ（ＳＢ２０３５８０）、５μＭ（Ｇｏ６９８３）、５μＭ（ＧＦ１０９２０３Ｘ）、２μＭ（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、４００ｎｇ／ｍＬ（Ｎｏｇｇｉｎ）の濃度となるように加えた培地を作製した。
　それぞれの培地を超低接着６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）中、１０％のＣＯ２存在下、３７℃にてＴｉｃ－ＦＸ細胞の増殖を浮遊培養で行った。培養を５日間行い、細胞数をカウントした。結果を図６に示す。図６において、－と示すものは、阻害剤を添加しなかった培地を用いた結果である。
（培地に添加した阻害剤）
　ＰＤ０３２５９０１：Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド、ＴＯＣＲＩＳ社製、４１９２
　ＣＨＩＲ９９０２１：６－｛２－［４－（２，４－ジクロロ－フェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ピリミジン－２－イルアミノ］－エチルアミノ｝－ニコチノニトリル、ＴＯＣＲＩＳ社製、４４２３
　ＳＢ５９０８８５：５－（２－（４－（２－ジメチルアミノエトキシ）フェニル）－５－（４－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－ｙｌ）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドエン－１－オン　オキシム、Ｒ＆Ｄシステムズ社製、２６５０／１０
　ＷＨ－４－０２３：２，６－ジメチルフェニル　Ｎ－（２，４－ジメトキシフェニル）－Ｎ－［２－［［４－（４－メチル－１－ピペラジニル）フェニル］アミノ］－４－ピリミジニル］カルバメート、ＭｅｄＣｈｅｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ社製、ＨＹ－１２２９９
　ＳＰ６００１２５：１，９－ピラゾロアントロン、シグマアルドリッチ社製、Ｓ５５６７－１０ＭＧ
　ＳＢ２０３５８０：４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－５－（４－ピリジル）１Ｈ－イミダゾール、和光純薬社製、１９３－１５６１１
　Ｇｏ６９８３：３－［１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－３－イル］－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、１３３１１
　ＧＦ１０９２０３Ｘ：３－（Ｎ－［ジメチルアミノ］プロピル－３－インドリル）－４－（３－インドリル）マレイミド，３－［１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］１Ｈ－インドール－３－イル］－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、ＴＯＣＲＩＳ社製、７４１
　Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：６－［４－（２－ピペリジン－１－イルエトキシ）フェニル］－３－ピリジン－４－イルピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン、シグマアルドリッチ社製、Ｐ５４９９－５ＭＧ
　Ｎｏｇｇｉｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ：Ｒ＆Ｄシステムズ社製、６０５７－ＮＧ－０２５／ＣＦ）
　図６に示すように、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ５９０８８５またはＮｏｇｇｉｎを添加した培地では、細胞の増殖率が高かった。
　次いで、細胞の増殖率が高かった阻害剤を加えた培地で増殖した細胞の多能性マーカー（ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４）の発現について、実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲで確認した。結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。なお、対照として、基礎培地で培養したものを用いた（図７Ａおよび図７Ｂにおいて、Ｔｉｃ－ＦＸと表わす）。
　図７Ａおよび図７Ｂから明らかなように、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ５９０８８５、またはＮｏｇｇｉｎを添加した培地では、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４の発現が増大していることがわかった。
　このことより、本発明の培地に加え、更にＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ５９０８８５またはＮｏｇｇｉｎを添加することによって、細胞の未分化状態を維持したまま、生産性を更に高めることができることがわかった。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年３月３０日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６－０６８７１８）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (13)

  1. 　ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む、ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
  2. 　ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、請求項１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
  3. 　ＭＥＫ阻害剤を含んでいない、請求項１または２に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
  4. 　フィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、請求項１～３のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
  5. 　増殖因子を更に含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
  6. 　浮遊培養に使用される、請求項１～５のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
  7. 　ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１～６のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
  8. 　ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞のナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法。
  9. 　ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、請求項８に記載の多能性幹細胞の培養方法。
  10. 　培地中にＭＥＫ阻害剤を含んでいない、請求項８または９に記載の多能性幹細胞の培養方法。
  11. 　培地中にフィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、請求項８～１０のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
  12. 　浮遊培養で実施される、請求項８～１１のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
  13. 　ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項８～１２のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
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