WO2017154839A1 - 肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助する方法、装置、コンピュータプログラム製品及びキット - Google Patents

肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助する方法、装置、コンピュータプログラム製品及びキット Download PDF

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WO2017154839A1
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peptide
hepatocellular carcinoma
monoclonal antibody
recurrence
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哲也 中面
桂吾 齊藤
雅央 三浦
浩三 須藤
琢也 飯野
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国立研究開発法人国立がん研究センター
シスメックス株式会社
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/54—Determining the risk of relapse

Definitions

  • the present invention relates to a method, an apparatus, a computer program product, and a kit for assisting in predicting recurrence risk in patients with hepatocellular carcinoma.
  • Hepatocellular carcinoma is one of the primary liver cancers and is a malignant tumor arising from hepatocytes.
  • hepatectomy or the like that removes cancer and surrounding tissues by surgery is performed.
  • the recurrence rate of all hepatocellular carcinoma patients is known to be 70% or more in 3 years after the operation. Therefore, patients with hepatocellular carcinoma need to be examined continuously after surgery.
  • GPC3 Glypican 3 ⁇
  • GPC3 is a glycoprotein consisting of 580 amino acids of about 60 kDa and bound to the cell membrane via a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor in the C-terminal region. GPC3 is expressed in 70-100% of liver tissue of hepatocellular carcinoma patients, but is hardly detected in liver tissue of healthy people.
  • GPC3 is considered to be cleaved between R358 / S359 by an enzyme called Furin in vivo and separated into an N-terminal peptide of about 40 kDa and a C-terminal peptide of about 30 kDa, Usually, the N-terminal side peptide and the C-terminal side peptide are considered to be bound to the cell membrane in a state of being covalently bound by a disulfide bond (full length type).
  • Patent Document 1 discloses a method for diagnosing cancer by detecting solubilized GPC3 using two types of antibodies that recognize the N-terminal peptide of GPC3.
  • the inventors of Patent Document 1 have a dominant N-terminal peptide as secretory GPC3 in mouse serum, and measuring GPC3 level using an anti-GPC3 antibody that recognizes the N-terminal peptide is a cancer. It is concluded that it is preferable in the diagnosis of On the other hand, it is suggested that it is difficult to diagnose cancer and predict the risk of recurrence using a detection system using a C-terminal peptide recognition antibody (Table ⁇ 1, paragraph 0138, etc. of Patent Document 1).
  • Patent Document 2 discloses GPC3 levels in a body fluid sample obtained from a subject, an anti-GPC3 monoclonal antibody that recognizes the C-terminal peptide of GPC3, and an anti-GPC3 polyclonal antibody that recognizes any site in the amino acid sequence of GPC3.
  • a method of screening for hepatocellular carcinoma (HCC) in a subject by using and measuring is disclosed.
  • Patent Document 2 does not mention the structure of GPC3 to be detected.
  • the detection system described in the same document has a GPC3 C-terminal peptide and a full-length peptide. It is considered to be detected.
  • Patent Document 2 paragraphs 0063 and 0064 describe that it is preferable to prepare polyclonal and monoclonal antibodies using the C-terminal peptide as an antigen. Furthermore, in Example, polyclonal antibodies (Example 1) and monoclonal antibodies (Example 2) were prepared using the C-terminal peptide antigen and detected using these. From these things, it is thought that patent document 2 makes the C-terminal side peptide the detection object. In fact, Patent Document 1 describes that the full-length peptide is below the detection limit, and considering this, it is considered that the determination of cancer in Patent Document 2 is performed based on the measurement result of the C-terminal peptide.
  • the present inventors consider that the full-length type of blood GPC3 is an important factor in predicting poor prognosis, and further improve the accuracy of diagnosis of hepatocellular carcinoma or prediction of recurrence risk. Therefore, a new problem has been found that a new detection system for detecting the full-length GPC3 type is provided.
  • the present inventors have used a detection system using an N-terminal side peptide-recognizing monoclonal antibody and a C-terminal side peptide-recognizing monoclonal antibody.
  • GPC3 concentration can be measured, and based on that, surprisingly, the risk of recurrence of hepatocellular carcinoma can be determined with higher accuracy compared to the conventional technology. It was found that type GPC3 was hardly detected, and the present invention was completed.
  • hepatocytes using a first monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3 and a second monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3, hepatocytes are used.
  • the risk of recurrence in patients with hepatocellular carcinoma including the step of determining that the recurrence risk of hepatocellular carcinoma is low when the concentration of the GPC3 peptide is less than a predetermined threshold.
  • a method for assisting in prediction is provided.
  • the first monoclonal antibody recognizing a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3 and the second monoclonal antibody recognizing a peptide having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3 are used.
  • a computer including a processor and a memory under the control of the processor, wherein the memory includes the following steps: a first monoclonal antibody and a second antibody in a blood sample of a patient with hepatocellular carcinoma.
  • An apparatus suitable for obtaining data that assists in predicting the above is provided.
  • a computer-readable medium which is recognized by the following steps: both the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody in the blood sample of a patient with hepatocellular carcinoma.
  • a computer program product is provided for causing a computer to perform the acquisition.
  • a kit for diagnosis of recurrence risk for patients with hepatocellular carcinoma including a first monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3, and a second monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3, is provided.
  • the present invention it is possible to provide a method for assisting prediction of recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient capable of obtaining a more accurate determination result as compared with the conventional technique.
  • FIG. 2 is a graph showing the GPC3 concentration in a blood sample of a hepatocellular carcinoma patient measured in Example 1.
  • FIG. 2 is a Kaplan-Meier curve which shows the recurrence risk classification result stratified by the level of GPC3 concentration measured in Example 1. It is a figure explaining the epitope analysis performed in Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the epitope analysis performed in Example 3.
  • FIG. 4 is a view showing an epitope region of a C-terminal recognition type monoclonal antibody specified in Example 3.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining epitope analysis of an N-terminal recognition type monoclonal antibody performed in Example 3. It is a figure which shows the result of the epitope analysis of the N terminal recognition type monoclonal antibody performed in Example 3.
  • FIG. 4 is a view showing an epitope region of an N-terminal recognition type monoclonal antibody specified in Example 3. It is a graph which shows the comparison of the detection precision by the presence or absence of the addition of a nonspecific reaction inhibitor. It is a graph which shows the comparison of the detection precision by the presence or absence of the addition of a nonspecific reaction inhibitor. It is a figure which shows the analysis result based on the presence or absence of the hepatitis B virus infection performed in Example 5.
  • FIG. 4 is a view showing an epitope region of a C-terminal recognition type monoclonal antibody specified in Example 3.
  • FIG. 4 is
  • the method for assisting in predicting the recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient has a first monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3 and an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3.
  • a second monoclonal antibody that recognizes the peptide the concentration of GPC3 peptide recognized by both the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody in the blood sample of a hepatocellular carcinoma patient (hereinafter also referred to as “GPC3 concentration”) ).
  • blood samples include blood (whole blood), plasma, serum and the like obtained from patients with hepatocellular carcinoma, and preferably serum or plasma is used.
  • the blood sample may be a peptide solution obtained by performing a pretreatment for extracting a peptide from blood, plasma or serum.
  • the pretreatment method is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the blood sample may be a diluted specimen obtained by diluting blood, plasma, or serum with an appropriate aqueous medium.
  • Such an aqueous medium is not particularly limited as long as it does not interfere with blood protein concentration measurement, and examples thereof include water, physiological saline, and phosphate buffered saline (PBS).
  • a blocking solution a solution containing a blocking agent such as albumin or casein.
  • radical treatment of hepatocellular carcinoma includes, for example, hepatectomy, liver transplantation, percutaneous ethanol injection therapy, radiofrequency ablation therapy, and proton beam or carbon beam heavy particle beam therapy.
  • the hepatocellular carcinoma patient may receive an auxiliary or preliminary treatment performed before the radical treatment.
  • auxiliary or preliminary treatment include hepatic artery embolization, immunotherapy such as hepatic arterial infusion chemotherapy and vaccine. Therefore, blood samples collected from patients who have undergone hepatic artery embolization, immunotherapy such as hepatic arterial infusion chemotherapy or vaccine as auxiliary or preliminary treatment, but have not yet received the above-mentioned radical treatment Can be used.
  • the method for measuring the GPC3 concentration is not particularly limited as long as it is a method capable of obtaining a value or index reflecting the GPC3 concentration in the blood sample, and can be appropriately selected from measurement methods known in the art.
  • an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction is preferable, for example, an enzyme immunoassay method, a chemiluminescence immunoassay method, a fluorescent immunoassay method, a radioimmunoassay method, an immunoturbidimetric method, Examples include immunoprecipitation, western blotting, and affinity chromatography.
  • enzyme immunoassay ELISA particularly sandwich ELISA is preferred.
  • the value of GPC3 concentration may be the measured value itself, or may be a value obtained by applying the measured value to a calibration curve.
  • a calibration curve can be prepared from values obtained by preparing a dilution series of GPC3 protein having a known concentration and measuring them in the same manner as a blood sample. Based on this calibration curve, the concentration of GPC3 in the sample can be quantified.
  • the GPC3 protein for preparing a calibration curve may be a protein derived from a living body secreted by a liver cancer cell line such as HepG2, or a recombinant protein.
  • the first monoclonal antibody is not particularly limited as long as it recognizes a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3.
  • the amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3 refers to any one site in full-length GPC3, for example, GPC3 peptide cleaved between the 358th amino acid and the 359th amino acid.
  • the first monoclonal antibody is preferably an antibody that recognizes a peptide having the 1st to 358th amino acid sequence of GPC3, and more preferably an antibody that recognizes a peptide having the 301st to 358th amino acid sequence of GPC3.
  • the second monoclonal antibody is not particularly limited as long as it recognizes a peptide having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3.
  • the amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3 is a CPC in the full-length GPC3 among GPC3 peptides cleaved between any one site in the full-length GPC3, for example, the 358th amino acid and the 359th amino acid.
  • the second monoclonal antibody is preferably an antibody that recognizes a peptide having the amino acid sequence of 359 to 580 of GPC3, and more preferably an antibody that recognizes a peptide having the amino acid sequence of 543 to 552 of GPC3.
  • the origin of the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody is not particularly limited, and may be an antibody derived from any mammal such as mouse, rat, hamster, rabbit, goat, horse or camel. Moreover, the isotype of the antibody is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the measurement method. Antibodies include antibody fragments and derivatives thereof, and examples include Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments.
  • the first monoclonal antibody immunizes a mouse with a peptide having only the amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3, extracts the spleen from the immunized mouse, obtains antibody-producing cells, and obtains the antibody-producing cells obtained
  • the second monoclonal antibody can also be prepared in the same manner except that immunization is performed using a peptide having only the amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3.
  • the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody may be commercially available products.
  • amino acid sequence of the peptide antigen used for the production of the first monoclonal antibody is a part or all of the amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3.
  • amino acid sequence of the peptide antigen used for the production of the second monoclonal antibody is a part or all of the amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3.
  • both the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody are recognized in the blood sample of a hepatocellular carcinoma patient.
  • the GPC3 peptide to be detected is the detection target.
  • the presence form of GPC3 in the blood sample is a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3 but not having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3 (N-terminal form, for example, 1 to 358, 25 to 358 of GPC3 or A peptide having the amino acid sequence 301 to 358) and a peptide having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3 but not having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3 (for example, a C-terminal form such as 359-580 or 543 of GPC3)
  • a peptide having both the amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3 and the amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3 for example, 1-580 or 301-580th of GPC3
  • a peptide having the amino acid sequence of Neither of the conventional GPC3 detection systems described in Patent Documents 1 and 2 is a method for detecting the full-length form of GPC3.
  • cancer is determined based on the measurement result of the N-terminal form of GPC3.
  • cancer is determined based on the measurement result of the C-terminal form of GPC3.
  • the present inventors set GPC3 full length form as a measurement object. We have found for the first time that the detection accuracy of hepatocellular carcinoma patients can be predicted with high reliability by using the full-length GPC3 peptide detection system, with improved detection accuracy compared to the conventional detection system. This is a viewpoint that the present inventors have unexpectedly found, contrary to the conventional knowledge in the technical field.
  • the GPC3 peptide to be detected is not particularly limited as long as it is recognized by both the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody. That is, the GPC3 peptide to be detected is a peptide having both the N-terminal amino acid sequence of GPC3 and the C-terminal amino acid sequence of GPC3, in other words, the full-length form of GPC3.
  • the GPC3 peptide to be detected may be a full-length protein including the first to 580th amino acid sequences of GPC3, or may be a peptide including the 301st to 552th amino acid sequences of GPC3.
  • the amino acid sequence of the full length GPC3 peptide is shown in SEQ ID NO: 57.
  • the GPC3 peptide to be detected may be added with a sugar chain, heparan sulfate or the like. Since the GPC3 peptide to be detected is recognized by both the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody, it is considered that substantially no N-terminal form and C-terminal form are detected. It is done.
  • the method of the present embodiment can detect substantially only the full-length form of GPC3, thereby contributing to highly accurate recurrence risk prediction that could not be achieved by the prior art. It is also possible to non-specifically detect components other than the detection target (N-terminal form, C-terminal form, and other contaminants) using the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody.
  • the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody may be labeled with a labeling substance known in the art as necessary.
  • labeling substances include radioisotopes such as 32 P, 35 S, 3 H and 125 I, fluorescent substances such as fluorescein, rhodamine and Alexa Fluor (registered trademark), alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase and the like. Enzymes such as luciferase, biotin, avidin, streptavidin and the like can be mentioned.
  • the type of the solid phase is not particularly limited. Examples thereof include a solid phase made of a material that physically adsorbs antibodies, and a solid phase on which molecules that specifically bind to antibodies are immobilized. Examples of the molecule that specifically binds to an antibody include protein A or G, an antibody that specifically recognizes the antibody (that is, a secondary antibody), and the like. Moreover, both can also be combined using the combination of the substance which intervenes between an antibody and a solid phase. Examples of combinations of such substances include biotin and avidin (or streptavidin), glutathione and glutathione-S-transferase, hapten and anti-hapten antibody, and the like. For example, when the first monoclonal antibody or the second monoclonal antibody is previously biotin-modified, the antibody can be captured by a solid phase on which avidin or streptavidin is immobilized.
  • the solid phase material can be selected from organic polymer compounds, inorganic compounds, biopolymers, and the like.
  • Organic polymer compounds include latex, polystyrene, polypropylene, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid heavy Examples thereof include acrylonitrile butadiene styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, and polyvinyl acetate acrylate.
  • inorganic compounds include magnetic substances (such as iron oxide, chromium oxide, cobalt, and ferrite), silica, alumina, and glass.
  • examples of the biopolymer include insoluble agarose, insoluble dextran, gelatin, and cellulose. Two or more of these may be used in combination.
  • the shape of the solid phase is not particularly limited, and examples thereof include particles, microplates, microtubes, test tubes and the like.
  • the measurement step is preferably performed in the presence of a nonspecific reaction inhibitor.
  • the presence of a nonspecific reaction inhibitor can suppress the possibility of being determined as a false positive.
  • the nonspecific reaction inhibitor is not particularly limited as long as it suppresses the antibody used in the measurement from binding to a substance other than the target antigen. Specific examples include mouse serum, sheep serum, goat serum, mouse antibody, sheep antibody, goat antibody, and the like. Nonspecific reaction inhibitors are commercially available, and for example, TRUBlock (Meridian Life Science), ASSAY DEVELOPMENT BLOCKING KIT (SCANTIBODIS LABORATOR), THBR2 (Special Immunology Research Institute) are known.
  • the method of the present embodiment determines that the risk of recurrence of hepatocellular carcinoma is high when the concentration of the GPC3 peptide is equal to or higher than a predetermined threshold, and if the concentration of the GPC3 peptide is lower than the predetermined threshold, Including a step of determining that the risk of cancer recurrence is low (hereinafter, also simply referred to as “determination step”).
  • GPC3 peptide concentration may be GPC3 positive when the concentration is greater than or equal to a threshold value, and GPC3 negative when the concentration is less than the threshold value.
  • recurrence means that a patient who has undergone radical treatment for hepatocellular carcinoma suffers from hepatocellular carcinoma again.
  • “High risk of recurrence” means that a patient with hepatocellular carcinoma who has undergone radical treatment is likely to have hepatocellular carcinoma again after the radical treatment.
  • “low risk of recurrence” means that a patient with hepatocellular carcinoma who has undergone radical treatment is less likely to suffer from hepatocellular carcinoma again after the radical treatment.
  • the threshold value is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • multiple hepatocellular carcinoma patients who had no recurrence for a certain period of time after surgery eg, 3 years, 4 years, or 5 years
  • the concentration of GPC3 full-length form of cancer patients (relapsed patient group) can be measured in advance and set to a value that can classify the non-relapsed patient group and the relapsed patient group with the highest accuracy.
  • the threshold value can be set in consideration of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc. according to the purpose of the test.
  • a threshold value is set from a range that is higher than the value of GPC3 concentration of the non-relapsed patient and lower than the value of GPC3 concentration of the relapsed patient.
  • a threshold value is set as a value that can distinguish between a patient without recurrence and a patient with cancer recurrence with high accuracy.
  • the GPC3 concentration threshold is set to 15 pg / mL.
  • the concentration of GPC3 peptide in the blood sample of a hepatocellular carcinoma patient is compared with the threshold value set in advance as described above, and it is classified into a non-relapsed patient group or a recurrent patient group. Is predicted.
  • a determination result that the risk of recurrence is low is output when the patient is classified into a non-relapse patient group, and a determination result that the risk of recurrence is high is output when the patient is classified as a recurrence patient group.
  • GPC3 concentration data is accumulated for those who are not hepatocellular carcinoma patients, for example, healthy subjects or patients with diseases other than hepatocellular carcinoma, and based on the data, a reference value (e.g., average value) of the blood concentration of GPC3 Value, median value, etc.), and this reference value may be used as a threshold value.
  • a reference value e.g., average value of the blood concentration of GPC3 Value, median value, etc.
  • hepatocellular carcinoma recurs earlier than a GPC3-negative patient.
  • Methods are provided to assist in predicting the risk of recurrence in patients with hepatocellular carcinoma who are determined to be likely. That is, in hepatocellular carcinoma patients infected with hepatitis B virus, it is possible to predict not only the recurrence but also the recurrence timing based on the presence or absence of GPC3 detection.
  • Hepatitis B virus (Species: Hepatitis B virus; HBV) refers to the virus classification published in 2015 by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Family: Hepadnaviridae) A type of virus belonging to the genus Orthohepadnavirus. In virus classification, classification rearrangement and genus name modification are frequently performed. Therefore, even if the classification is rearranged or the genus name is changed in the classification by ICTV or an academic authority equivalent to it in the future, the virus corresponding to hepatitis B virus in the 2015 ICTV classification is It is assumed to be included in the hepatitis B virus.
  • genotype of hepatitis B virus is not particularly limited and may be any of genotypes A to J known as of the filing date of the present application and subtypes thereof (for example, Aa / 1 etc.) and may be discovered in the future. It may be an unknown genotype as of the filing date of the present application.
  • Infectious means that hepatitis B virus is present in the patient's body fluid, particularly blood, at least at a detectable level.
  • the diagnostic assistance method further includes a step of detecting hepatitis B virus in a blood sample of a hepatocellular carcinoma patient. Also good. Whether or not the patient is infected with hepatitis B virus can be examined by a virus detection method known to those skilled in the art. Examples of such detection methods include enzyme immunoassay ELISA and direct sequencing.
  • hepatitis B virus when it is known in advance that the subject is infected with hepatitis B virus, it is not necessary to perform the detection process of hepatitis B virus.
  • a patient diagnosed as having hepatitis B and subsequently progressing to hepatocellular carcinoma is a subject, it is known that the subject is infected with hepatitis B virus. It is not necessary to perform the detection process of hepatitis B virus.
  • a blood sample of a person infected with hepatitis B virus having hepatocellular carcinoma is used.
  • the above-mentioned infected person can obtain a GPC3 positive group (Group 1) or GPC3 peptide concentration with a GPC3 peptide concentration equal to or higher than the predetermined threshold.
  • a GPC3 positive group Group 1
  • GPC3 peptide concentration with a GPC3 peptide concentration equal to or higher than the predetermined threshold.
  • the GPC3-negative group is determined to have a longer recurrence-free period of hepatocellular carcinoma or more likely not to recur than the GPC3-positive group.
  • the GPC3 positive group is determined to have a high possibility of recurrence of hepatocellular carcinoma within a predetermined period.
  • the predetermined period can be a period in which the GPC3 positive group and the GPC3 negative group can be separated with the highest accuracy based on information on the recurrence-free period of the GPC3 positive group and the GPC3 negative group.
  • the predetermined period may be 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, or 12 months.
  • the present invention includes a method for treating hepatocellular carcinoma.
  • This method comprises a step of performing a radical treatment on a patient who has been determined to have a “high risk of recurrence” by the above-mentioned determination step; and a step of administering a drug that reduces the risk of recurrence of hepatocellular carcinoma after the radical treatment.
  • the radical treatment is as described above.
  • Known drugs can be used as the drug that reduces the risk of recurrence, and examples include antiviral drugs such as interferon.
  • the present invention includes an apparatus suitable for acquiring data that assists in predicting the recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient.
  • the present invention also includes a computer program product that causes a computer to acquire data that assists in predicting the recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient.
  • the medium included in the computer program product may be a medium in which the computer program is recorded non-temporarily and is readable by the computer.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a recurrence risk prediction assistance device for obtaining data for assisting in prediction of recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient.
  • the recurrence risk prediction auxiliary device 11 shown in FIG. 1 includes a measurement device 22 and a determination device 33 connected to the measurement device 22.
  • the type of the measuring device is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the measuring method of GPC3.
  • the measuring device 22 is a plate reader capable of detecting a signal generated by an ELISA method using a labeled antibody.
  • the plate reader is not particularly limited as long as it can detect a signal based on the labeling substance used for measuring the marker, and can be appropriately selected according to the type of the labeling substance.
  • the signal is optical information such as a chemiluminescent signal or a fluorescent signal.
  • the measuring device 22 acquires optical information based on the labeled antibody that specifically binds to GPC 3, and transmits the obtained optical information to the determination device 33.
  • the optical information acquired by the measurement device 22 includes information on a sample whose concentration is known for calculating the concentration value.
  • the measurement device 22 can also be used for detection of hepatitis B virus by selecting an appropriate labeled antibody.
  • the determination device 33 includes a computer main body 33a, an input unit 33b, and a display unit 33c that displays sample information and determination results.
  • the determination device 33 receives optical information from the measurement device 22.
  • the processor of the determination device 33 executes a program that acquires data that assists in predicting the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient based on the optical information.
  • FIG. 2 is a block diagram showing the software of the computer main body 33a of the recurrence risk prediction auxiliary device 11 as functional blocks.
  • the determination device 33 includes a reception unit 301, a storage unit 302, a calculation unit 303, a determination unit 304, and an output unit 305.
  • the receiving unit 301 is connected to the measurement device 22 via a network so that communication is possible.
  • the determination unit 304 information for performing the risk of recurrence risk of hepatocellular carcinoma via the input unit 33b, for example, whether or not the specimen determined to be high risk is infected with hepatitis B virus, Information regarding whether or not to detect hepatitis B virus can be input.
  • the receiving unit 301 receives information transmitted from the measuring device 22.
  • the storage unit 302 is used to calculate a threshold necessary for determination and a concentration value of each marker, a processing program, and further, when hepatitis B virus detection is performed, a hepatitis B virus is infected in an antigen-antibody reaction. Optical information (signals, etc.) obtained when there is and / or no infection is stored.
  • the calculation unit 303 uses the information acquired by the reception unit 301 to calculate the density value of each marker according to the formula stored in the storage unit 302.
  • the determination unit 304 determines whether the marker concentration value calculated by the calculation unit 303 is greater than or less than the threshold stored in the storage unit 302, and when hepatitis B virus detection is performed.
  • the output unit 305 outputs the determination result by the determination unit 304 as data that assists in predicting the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient.
  • FIG. 3 is a block diagram showing a hardware configuration of the computer main body 33a shown in FIG.
  • the computer main body 33a includes a CPU (Central Processing Unit) 330, a ROM (Read Only Memory) 331, a RAM (Random Access Memory) 332, a hard disk 333, an input / output interface 334, A reading device 335, a communication interface 336, and an image output interface 337 are provided.
  • the CPU 330, the ROM 331, the RAM 332, the hard disk 333, the input / output interface 334, the reading device 335, the communication interface 336, and the image output interface 337 are connected by a bus 338 so that data communication is possible.
  • the CPU 330 can execute a computer program stored in the ROM 331 and a computer program loaded in the RAM 332. Each function shown in FIG. 2 is executed by the CPU 330 executing the application program. Thereby, the determination apparatus 33 functions as an apparatus for acquiring data that assists in predicting the recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient.
  • the ROM 331 is configured by a mask ROM, PROM, EPROM, EEPROM, or the like.
  • the ROM 331 stores computer programs executed by the CPU 330 and data used for the computer programs.
  • the RAM 332 is configured by SRAM, DRAM, or the like.
  • the RAM 332 is used for reading out computer programs recorded in the ROM 331 and the hard disk 333.
  • the RAM 332 is also used as a work area for the CPU 330 when executing these computer programs.
  • the hard disk 333 is used to execute a computer program such as an operating system to be executed by the CPU 330, an application program (a computer program for obtaining data for assisting prediction of recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient), and the computer program. Data is installed.
  • a computer program such as an operating system to be executed by the CPU 330, an application program (a computer program for obtaining data for assisting prediction of recurrence risk of a hepatocellular carcinoma patient), and the computer program. Data is installed.
  • the reading device 335 includes a flexible disk drive, a CD-ROM drive, a DVD-ROM drive, and the like.
  • the reading device 335 can read the computer program or data recorded on the portable recording medium 340.
  • the input / output interface 334 includes, for example, a serial interface such as USB, IEEE 1394, and RS-232C, a parallel interface such as SCSI, IDE, and IEEE 1284, and an analog interface including a D / A converter, an A / D converter, and the like. It is configured.
  • An input unit 33b such as a keyboard and a mouse is connected to the input / output interface 334. The operator can input various commands and data to the computer main body 33a through the input unit 33b.
  • the communication interface 336 is, for example, an Ethernet (registered trademark) interface.
  • the computer main body 33a can transmit print data to a printer or the like via the communication interface 336.
  • the measurement device 22 can transmit measurement data (optical information) to the determination device 33 through the communication interface 336.
  • the image output interface 337 is connected to a display unit 33c configured by an LCD, a CRT, or the like. Thereby, the display part 33c can output the video signal according to the image data given from CPU330.
  • the display unit 33c displays an image (screen) according to the input video signal.
  • FIG. 4A is an example of a flowchart of auxiliary data acquisition for recurrence risk prediction.
  • concentration value of GPC3 is acquired from optical information based on the labeled antibody specifically bound to GPC3 and determination is performed using the obtained concentration value will be described as an example.
  • the present embodiment is not limited to this example.
  • step S 1-1 the receiving unit 301 of the recurrence risk prediction auxiliary device 11 receives optical information from the measuring device 22.
  • step S1-2 the calculation unit 303 calculates the density value of GPC3 from the optical information received by the reception unit 301 according to an equation for calculating the density value stored in the storage unit 302. .
  • step S1-3 the determination unit 304 determines whether the density value calculated in step S1-2 is greater than or less than the threshold value stored in the storage unit 302.
  • the routine proceeds to step S1-4, and the determination unit 304 outputs a determination result indicating that the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient is high to the output unit 305.
  • the routine proceeds to step S1-5, and the determination unit 304 transmits a determination result indicating that the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient is low to the output unit 305. To do.
  • step S1-6 the output unit 305 outputs the determination result and displays it on the display unit 33c.
  • the recurrence risk prediction assistance apparatus 11 can provide data for assisting the prediction of the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient to a doctor or the like.
  • FIG. 4B is an example of a flowchart of auxiliary data acquisition for recurrence risk prediction performed for a sample known to be infected with hepatitis B virus.
  • the present embodiment is not limited to this example.
  • step S 2-1 the reception unit 301 of the recurrence risk prediction auxiliary device 11 receives optical information from the measurement device 22.
  • step S2-2 the calculation unit 303 calculates the density value of GPC3 from the optical information received by the reception unit 301 according to an equation for calculating the density value stored in the storage unit 302. .
  • step S2-3 the determination unit 304 determines whether the density value calculated in step S2-2 is greater than or less than the threshold value stored in the storage unit 302.
  • the routine proceeds to step S2-8, and the determination unit 304 transmits a determination result indicating that the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient is low to the output unit 305.
  • step S2-3 when the concentration value of GPC3 is greater than or equal to the threshold value in step S2-3, the routine proceeds to step S2-4, and the determination unit 304 determines that the recurrence risk of the patient with hepatocellular carcinoma is high, and thereafter the routine Proceeds to step S2-5.
  • step S2-5 if “input infected with hepatitis B virus” is input from the input unit 33b, the routine proceeds to step S2-6, and the determination unit 304 determines that hepatocellular carcinoma is predetermined. The determination result indicating that there is a high possibility of recurrence within the period is sent to the output unit 305. On the other hand, if it is determined in step S2-5 that “infected with hepatitis B virus” has not been input from the input unit 33b, the routine proceeds to step S2-7. The determination result indicating that the recurrence risk of the cancer patient is high is transmitted to the output unit 305.
  • step S2-9 the output unit 305 outputs the determination result and displays it on the display unit 33c.
  • the recurrence risk prediction assistance apparatus 11 can provide data for assisting the prediction of the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient to a doctor or the like.
  • FIG. 4C is an example of a flowchart for obtaining auxiliary data for predicting recurrence risk when performing the detection process of hepatitis B virus.
  • the present embodiment is not limited to this example.
  • step S 3-1 the receiving unit 301 of the recurrence risk prediction auxiliary device 11 receives optical information from the measuring device 22.
  • step S3-2 the calculation unit 303 calculates the density value of GPC3 from the optical information received by the reception unit 301 according to an equation for calculating the density value stored in the storage unit 302. .
  • step S3-3 the determination unit 304 determines whether the density value calculated in step S3-2 is greater than or less than the threshold value stored in the storage unit 302.
  • the routine proceeds to step S3-10, and the determination unit 304 transmits a determination result indicating that the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient is low to the output unit 305.
  • step S3-3 when the concentration value of GPC3 is greater than or equal to the threshold value in step S3-3, the routine proceeds to step S3-4, and the determination unit 304 determines that the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient is high, and then the routine Advances to step S3-5. If it is determined in step S3-5 that “the detection of hepatitis B virus is necessary” is not input from the input unit 33b, the routine proceeds to step S3-9, and the determination unit 304 determines that hepatocellular carcinoma A determination result indicating that the patient has a high recurrence risk is transmitted to the output unit 305.
  • step S3-6 the routine proceeds to step S3-6, and the reception unit 301 receives the hepatitis B virus infection from the measurement device 22. Receive information about presence / absence. Thereafter, the routine proceeds to step S3-7, and the determination unit 304 determines whether the patient is infected with hepatitis B virus based on the information acquired in step S3-6. If it is determined that the patient is infected with the hepatitis B virus, the routine proceeds to step S3-8, and the determination unit 304 determines that hepatocellular carcinoma is likely to recur within a predetermined period. The determination result shown is transmitted to the output unit 305.
  • step S3-9 the determination unit 304 outputs a determination result indicating that the risk of recurrence of hepatocellular carcinoma is high. To the unit 305.
  • step S3-11 the output unit 305 outputs the determination result and displays it on the display unit 33c.
  • the recurrence risk prediction assistance apparatus 11 can provide data for assisting the prediction of the recurrence risk of the hepatocellular carcinoma patient to a doctor or the like.
  • the present invention provides a hepatocyte comprising a first monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3, and a second monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3. Also included is a kit for risk diagnosis of cancer patients.
  • the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody are as described above.
  • the kit may further contain the nonspecific reaction inhibitor.
  • the kit may further contain the above solid phase, for example, a 96-well plate or magnetic particles.
  • the kit includes a first reagent container 501 containing a first reagent containing a first monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the N-terminal side of GPC3, And a second reagent container 502 containing a second reagent containing a second monoclonal antibody that recognizes a peptide having an amino acid sequence on the C-terminal side of GPC3.
  • the kit according to the present embodiment may further include a package insert 503 describing the above method, and a box 500 that houses the first reagent container 501, the second reagent container 502, and the reagent package insert 503.
  • the kit may further contain a reagent containing a substance for detecting hepatitis B virus.
  • the substance for detecting hepatitis B virus is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of hepatitis B virus detection method. Examples of such substances include antibodies that specifically recognize the envelope of hepatitis B virus and primers suitable for amplification of hepatitis B virus genomic DNA.
  • the present invention includes the use of the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody for producing a GPC3 peptide detection reagent kit.
  • the present invention also includes the use of a substance for detecting hepatitis B virus for producing a GPC3 peptide detection reagent kit.
  • the substance and kit for detecting the first monoclonal antibody, the second monoclonal antibody, and the hepatitis B virus are as described above.
  • Example 1 Prediction of recurrence risk 39 HCC patient blood samples were obtained before hepatectomy at the National Cancer Center Hospital East (Kashiwa, Chiba) with the consent of the patient, and plasma was obtained by centrifugation. Acquired. Of these, 28 had confirmed recurrence of HCC within 4 years after hepatectomy and 11 had no recurrence. 50 healthy human plasma samples were purchased from Sanfuco. All samples were stored frozen at ⁇ 80 ° C. until just before use.
  • GPC3 in each patient and healthy subject plasma sample was performed as follows. First, a 96-well immunoplate (MaxiSorp black 96-well immunoplate, ThermoScientifc) was coated with 50 ⁇ L each of 2 ⁇ g / mL of commercially available GPC3 N-terminal recognition monoclonal antibody diluted with phosphate buffered saline (PBS). Incubated for 1 hour at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • HISCL washing solution (Sysmex)
  • pH 7.4 containing blocking buffer 150 mM NaCl, 10 mg / mL BSA, 5 mg / mL Casein, 0.01 w / v% NaN 3 Buffer solution
  • a measurement sample diluted twice with a dilution buffer prepared by adding a nonspecific reaction inhibitor for HISCL (Sysmex) to the blocking buffer, and add room temperature Incubated for 1 hour.
  • the GPC3 C-terminal recognition monoclonal antibody labeled with the attached protocol using Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH was washed 9 times with 300 ⁇ L of HISCL washing solution, and terminated with dilution buffer.
  • the solution was diluted to a concentration of 0.1 ⁇ g / mL, added 50 ⁇ L at a time, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • a full-length recombinant GPC3 (R & D Systems) diluted with a blocking buffer so as to be 15 to 20,000 pg / mL was used.
  • a calibration curve was prepared using a 4-parameter logistic regression method. After all measurements were completed, the GPC3 concentration in the measurement sample was quantified from the luminescence intensity using a calibration curve.
  • Example 2 Recurrence risk prediction using Kaplan-Meier Furthermore, the GPC3 positive / negative group determined from the measurement results obtained in Example 1 was tested for a significant difference in recurrence risk prediction. When a Kaplan-Meier curve was created for the presence or absence of recurrence and a log rank test was performed, the P value was 0.0002 as shown in FIG. 7, indicating that the GPC3 positive group tends to relapse significantly.
  • StatFlex ver.6 (Artec) was used as statistical analysis software.
  • Example 3 Epitope analysis of the antibody used this time The epitope of the antibody used in Examples 1 and 2 was analyzed, and the reason for the dramatic improvement in HCC recurrence risk judgment accuracy is to correctly capture the full-length GPC3 It verified about. Epitope analysis of the C-terminal recognition monoclonal antibody used for detection was performed by competitive ELISA using overlapping peptides (Table 2) as shown in FIG.
  • a competitive inhibitory solution was prepared by mixing with 35 ⁇ L of a competitive peptide prepared in a blocking buffer or a full-length recombinant GPC3 solution at a molar ratio of 10 times that of an antibody and incubating at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with 300 ⁇ L of HISCL washing solution, and 50 ⁇ L of Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG (Jackson Immuno Research), diluted 5000 times with blocking buffer, was added and incubated at room temperature for 1 hour. Finally, the plate was washed 9 times with 300 ⁇ L of HISCL washing solution, 50 ⁇ L of SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific) was added, incubated at room temperature for 5 minutes, and luminescence intensity was measured with a microplate reader. The strength of competition was evaluated as an absorptance, and was calculated by dividing the difference in signal intensity decreased by adding a competitive peptide by the signal intensity when no competitive peptide was added.
  • the gel subjected to the same electrophoresis was transferred to Immobilon-FL PVDF (Merck Millipore) under the conditions of 4 ° C, 100 V, and 1 hour.
  • This membrane was immersed in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.05% v / v% Tween-20 and 40% mg / mL BSA, and shaken at room temperature for 1 hour. Further, the membrane was immersed in an N-terminal recognition type monoclonal antibody solution diluted to 0.5 ⁇ g / mL with Tris buffered saline containing 0.1 ⁇ v / v%% Tween-20, 50 ⁇ mg / mL skim milk, and 1% at room temperature. Shake for hours.
  • the membrane was then washed 3 times with Tris-buffered saline containing 0.05% v / v% Tween-20, and Tris-buffered saline containing 0.1% v / v% Tween-20, 50% mg / mL. Soaked in Polyclonal Goat Anti-Mouse Immunoglobulins / HRP solution diluted 1000 times with 1 and shaken at room temperature for 1 hour.
  • the membrane was washed three times with Tris-buffered saline containing 0.05% v / v% Tween-20, and light was emitted using Pierce® Western® Blotting® Substrate® Plus (Thermo® Scientific). The membrane after light emission was imaged using ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare). The operation followed the instruction manual attached to the kit.
  • FIG. 13 shows the results of silver staining (left) and Western blot (right). From this result, it was found that the N-terminal recognition type monoclonal antibody used in this example reacts with GPC3 301-400 a.a. and 25-358 a.a. Therefore, as shown in FIG. 14, it was determined that 301-358 a.a., which is a sequence common to both, is the epitope region of this antibody.
  • Example 4 Verification of effect of addition of non-specific reaction inhibitor First N-terminal recognition monoclonal antibody (biotin-labeled) that recognizes peptides 301 to 358 of GPC3, and peptides 543 to 552 of GPC3 Using a second C-terminal recognition type monoclonal antibody (alkaline phosphatase labeling) that recognizes, 10 types of commercially available plasma (Proteogenex) were measured by an automatic immunoassay device HISCL-800 (Sysmex). The antibody was labeled with biotin using Biotin Labeling Kit-SH (Dojindo Laboratories) according to the attached protocol.
  • Biotin Labeling Kit-SH Biotin Labeling Kit-SH
  • the sample for preparing a calibration curve was the same as that used in ELISA.
  • diluted solutions of each antibody were prepared with the same dilution rate as ELISA, and blocking buffer for ELISA (no non-specific countermeasures) and mouse IgG at a final concentration of 2 mg / mL were added to the dilution solvent.
  • Two types of blocking buffers were prepared.
  • HAMA represents a human anti-mouse antibody (Human ⁇ Anti -Mouse Antibody).
  • Example 5 Prediction of early recurrence of hepatitis B patients Of 39 blood samples of HCC patients, 28 cases in which recurrence was observed within 4 years were analyzed based on the presence or absence of viral infection. The relapse group had a median age of 68 years (63-72), of which 18 were HCV positive, 7 were HBV positive, and 3 were no viral infection. The median duration of recurrence was 10 months (3-21).
  • a commercially available GPC3 N-terminal recognition type monoclonal antibody was biotinylated using Biotin Labeling Kit-SH (Dojindo Laboratories).
  • a commercially available GPC3 C-terminal recognition type monoclonal antibody was converted to ALP using Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH (Dojindo Laboratories).
  • the biotinylated antibody obtained above, the measurement sample, and the nonspecific reaction inhibitor were suspended, and streptavidin-modified HISCL magnetic beads were added and suspended in the obtained suspension. The beads were magnetized to remove the supernatant, and the beads were washed with HISCL washing solution to perform B / F separation.
  • the obtained beads, the ALP antibody and the nonspecific reaction inhibitor obtained above were suspended, the beads were magnetized, and B / F separation was performed in the same manner as described above.
  • HISCL substrate buffer and HISCL luminescent substrate were suspended in the obtained beads, and the luminescence intensity was measured using HISCL-800.
  • FIG. 17 shows the results of comparing the recurrence-free period for each GPC3-positive group and negative group for each virus infection type.
  • the upper part of the broken line represents the patients in the relapse-free group, and the lower part of the broken line represents the patients in the relapse group.
  • diamonds represent GPC3-positive groups
  • triangles represent GPC3-negative recurrence groups
  • squares represent GPC3-negative no recurrence groups.
  • the GPC3 positive group had a shorter time to recurrence (no recurrence period) (average 3.7 months) than the GPC3 negative group in which relapse was observed. .
  • recurrence was observed in all patients who were HBV positive and GPC3 positive.

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Abstract

本発明は、肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助する方法、装置、コンピュータプログラム製品及びキットに関する。

Description

肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助する方法、装置、コンピュータプログラム製品及びキット
　本発明は、肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助する方法、装置、コンピュータプログラム製品及びキットに関する。
　肝細胞がんは原発性肝がんの一つであり、肝細胞から発生する悪性腫瘍である。肝細胞がんの治療では、がん及びその周囲の組織を手術によって取り除く肝切除術などが行われる。一方、肝切除術などの治療を行っても、肝細胞がん患者全体の再発率は、術後３年で70％以上になることが知られている。そのため、肝細胞がん患者は、術後も継続的に検査を受ける必要がある。
　肝細胞がんの検査では、血液中の腫瘍マーカーの測定と、画像検査(超音波検査、CT及びMRIなど)とを組み合わせて行われている。肝細胞がんのマーカーとして、グリピカン3 (GPC3)が知られている。GPC3は、580アミノ酸からなる約60 kDaの糖タンパク質であり、C末端領域でグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して細胞膜に結合している。GPC3は、肝細胞がん患者の肝臓組織の70～100％で発現がみられるが、健常人の肝臓組織においては殆ど検出されない。GPC3は、生体内において、Furinと呼ばれる酵素によってR358/S359間で切断され、約40 kDaのN末端側ペプチドと、約30 kDaのC末端側ペプチドとに分かれていると考えられているが、通常、N末端側ペプチド及びC末端側ペプチドは、ジスルフィド結合によって共有結合した状態(全長型)で細胞膜に結合していると考えられている。
　特許文献１には、GPC3のN末端側ペプチドを認識する２種類の抗体を用いて可溶化GPC3を検出することにより、がんを診断する方法が開示されている。特許文献１の発明者らは、マウス血清中の分泌型GPC3としてはN末端側ペプチドが優位であり、N末端側ペプチドを認識する抗GPC3抗体を用いてGPC3レベルを測定することが、がんの診断においては好ましいと結論付けている。一方、C末端側ペプチド認識抗体を用いた検出系を用いてがんの診断や再発リスクの予測をすることは難しいことを示唆している（特許文献１のTable 1、０１３８段落など）。GPC3のN末端側ペプチドを認識する2種類の抗体を用いた場合、GPC3のN末端側ペプチドと全長型ペプチドとを検出することになる。しかし、特許文献１では、全長型ペプチドが検出限界以下であるため、がんの判定はN末端側ペプチドの測定結果により行われていると考えられる。
　特許文献２には、被験者から得られた体液サンプル中のGPC3レベルを、GPC3のC末端側ペプチドを認識する抗GPC3モノクローナル抗体及びGPC3のアミノ酸配列中の任意の部位を認識する抗GPC3ポリクローナル抗体を用いて測定することにより、被験者の肝細胞がん(HCC)をスクリーニングする方法が開示されている。特許文献２には、検出されるGPC3の構造について言及されていないが、GPC3測定に用いられる抗体の種類からみて、同文献に記載の検出系では、GPC3のC末端側ペプチド及び全長型ペプチドが検出されると考えられる。なお、特許文献２の0063段落および0064段落においてC末端側ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製することが好適である旨記載している。さらに、ExampleにおいてC末端側ペプチド抗原を用いてポリクローナル抗体（Example 1）と、モノクローナル抗体（Example 2）とを作製し、これらを用いて検出している。これらのことから、特許文献２はC末端側ペプチドを検出対象としていると考えられる。実際、特許文献１では全長型ペプチドが検出限界以下であると記載しており、これを考慮すると特許文献２におけるがんの判定はC末端側ペプチドの測定結果により行われていると考えられる。
米国特許出願公開第２００６－００１４２２３号 米国特許出願公開第２００５－０２３３３９２号
　これまでに、特許文献１に記載されるような２種類のN末端側ペプチド認識抗体を用いる検出系によって血中GPC3を測定することが肝細胞がんの診断や予後予測に有用であることを裏付ける報告がされている。しかしながら、このような報告による肝細胞がんの予後予測においては、再発群と非再発群との分離が良好であるとはいえず、判定精度が不十分であった。一方、GPC3の生理的機能(細胞増殖の促進等)を発揮するためには、GPC3が全長型であることが重要である。また、肝細胞がん患者の肝臓組織染色においては、N末端側ペプチド認識抗体又はC末端側ペプチド認識抗体のいずれかを用いても、それら両方を用いる場合と同様の結果が得られることから、肝細胞がん患者の肝臓組織には全長型のGPC3が存在し、病態形成に関与しているはずである。さらに、健常人の肝臓にはGPC3は殆ど存在しないため、血中においてもGPC3は検出されないはずである。それにも拘らず、従来の検出系では健常人においても血中GPC3がある程度検出されており、この点からも、従来の検出系による検出精度は不十分である可能性が窺われる。
　これらの考察から、本発明者らは、血中GPC3の全長型こそが予後不良を予測するうえで重要な因子であると考え、肝細胞がんの診断又は再発リスク予測の精度をより向上させるために、GPC3の全長型を検出対象とする新たな検出系を提供するという新たな課題を見出した。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、N末端側ペプチド認識モノクローナル抗体及びC末端側ペプチド認識モノクローナル抗体を用いた検出系を用いれば、血液試料中の全長型GPC3濃度を測定することができ、それに基づけば、驚くべきことに、従来技術と比較して、肝細胞がんの再発リスクをより精度良く判定できること、この検出系を用いれば、健常人において全長型GPC3はほぼ検出されないことを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明によれば、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体を用い、肝細胞がん患者の血液試料中における、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度を測定する工程と、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の場合は、肝細胞がんの再発リスクが高いと判定し、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の場合は、肝細胞がんの再発リスクが低いと判定する工程とを含む、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法が提供される。
　また、本発明によれば、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体を用い、肝細胞がんを有するＢ型肝炎ウイルス感染者の血液試料中における、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度を測定する工程と、前記患者を、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の第1群または前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の第2群に分類する工程とを含み、前記第1群は、第2群に比べて早期に再発する可能性が高い患者群である、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法が提供される。
　また、本発明によれば、プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、下記のステップ：肝細胞がん患者の血液試料中の第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度の測定結果を取得するステップと、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の場合は、肝細胞がんの再発リスクが高いと判定し、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の場合は、肝細胞がんの再発リスクが低いと判定するステップとを前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータの取得に適する装置が提供される。
　さらに、本発明によれば、コンピュータに読み取り可能な媒体を備え、前記媒体には、下記のステップ：肝細胞がん患者の血液試料中の第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度の測定結果を取得するステップと、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の場合は、肝細胞がんの再発リスクが高いと判定し、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の場合は、肝細胞がんの再発リスクが低いと判定するステップとを前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータの取得をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品が提供される。
　さらに、本発明によれば、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体とを含む、肝細胞がん患者の再発リスク診断用キットが提供される。
　本発明によれば、従来の技術と比較して、より高精度の判定結果を得ることが可能な肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助する方法を提供できる。
再発リスク予測補助装置の一例を示した概略図である。 図１の再発リスク予測補助装置の機能構成を示すブロック図である。 図１に示された再発リスク予測補助装置のハードウェア構成を示すブロック図である。 図１に示された再発リスク予測補助装置を用いた、肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。 図１に示された再発リスク予測補助装置を用いた、肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。 図１に示された再発リスク予測補助装置を用いた、肝細胞がん患者の再発リスク予測を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。 キットの外観の一例を示す図である。 実施例１で測定した、肝細胞がん患者の血液サンプル中におけるGPC3濃度を示すグラフである。 実施例１で測定したGPC3濃度の高低により層別化した再発リスク分類結果を示すKaplan-Meier曲線である。 実施例３で行ったエピトープ解析を説明する図である。 実施例３で行ったエピトープ解析の結果を示す図である。 実施例３で行ったエピトープ解析の結果を示す図である。 実施例３で特定した、C末端認識型モノクローナル抗体のエピトープ領域を示す図である。 実施例３で行った、N末端認識型モノクローナル抗体のエピトープ解析を説明する図である。 実施例３で行った、N末端認識型モノクローナル抗体のエピトープ解析の結果を示す図である。 実施例３で特定した、N末端認識型モノクローナル抗体のエピトープ領域を示す図である。 非特異反応抑制剤の添加有無による検出精度の比較を示すグラフである。 非特異反応抑制剤の添加有無による検出精度の比較を示すグラフである。 実施例５で行った、Ｂ型肝炎ウイルス感染の有無に基づく解析結果を示す図である。
　本実施形態の肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法は、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体を用い、肝細胞がん患者の血液試料中における、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度（以下、「GPC3濃度」ともいう）を測定する工程を含む。
　血液試料としては、肝細胞がん患者から得られる血液（全血）、血漿、血清等が挙げられ、好ましくは血清または血漿が用いられる。また、血液試料は、血液、血漿または血清からペプチドを抽出する前処理を行って得られるペプチド溶液であってもよい。前処理方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。また、血液試料は、血液、血漿又は血清を適切な水性媒体で希釈して得られる希釈検体であってもよい。そのような水性媒体は、血中タンパク質の濃度測定を妨げない限り特に限定されず、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。GPC3濃度の測定を後述の免疫学的測定法で行う場合は、ブロッキング液（アルブミン、カゼインなどのブロッキング剤を含む溶液）で血液試料を希釈してもよい。
　血液試料は、根治的治療を受ける前の肝細胞がん患者から取得することが好ましい。ここで、肝細胞がんの根治的治療は、例えば、肝切除術、肝移植、経皮的エタノール注入療法、ラジオ波焼灼療法、及び陽子線や炭素線の重粒子線治療などが挙げられる。なお、肝細胞がん患者は、肝細胞がんの根治的治療の治療効果をより向上させるために当該根治的治療の前に行われる補助的又は予備的な治療を受けていてもよい。このような補助的又は予備的な治療としては、例えば、肝動脈塞栓術、肝動注化学療法やワクチンなどの免疫療法などが挙げられる。そのため、補助的又は予備的な治療として肝動脈塞栓術、肝動注化学療法やワクチンなどの免疫療法などを受けているが、上述の根治的治療をまだ受けていない患者から採取した血液試料も利用することができる。
　GPC3濃度の測定方法は、血液試料中のGPC3濃度を反映する値又は指標を取得できる方法であれば特に限定されず、当該技術において公知の測定法から適宜選択できる。そのような測定方法としては、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法が好ましく、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、免疫比濁法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、アフィニティクロマトグラフィ法などが挙げられる。それらの中でも、酵素免疫測定法のELISA法、特にサンドイッチELISA法が好ましい。
　GPC3濃度の値は、測定値そのものであってもよいし、測定値を検量線に当てはめて取得される値であってもよい。検量線は、濃度が既知のGPC3タンパク質の希釈系列を調製し、これらを血液試料と同様に測定して得られた値から作成できる。この検量線に基づいて、試料中のGPC3濃度を定量することができる。検量線作成のためのGPC3タンパク質は、HepG2などの肝がん細胞株が分泌する生体由来のタンパク質であってもよいし、組換え型タンパク質であってもよい。
　第1モノクローナル抗体としては、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものであれば特に限定されない。ここで、GPC3のN末端側のアミノ酸配列とは、全長型GPC3において任意の１つの部位、例えば358番目のアミノ酸と359番目のアミノ酸との間で切断されたGPC3ペプチドのうち、全長GPC3においてN末端側を構成するペプチドのアミノ酸配列をいう。第1モノクローナル抗体は、好ましくはGPC3の1～358番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体であり、より好ましくはGPC3の301～358番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体である。
　第2モノクローナル抗体としては、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものであれば特に限定されない。ここで、GPC3のC末端側のアミノ酸配列とは、全長型GPC3において任意の１つの部位、例えば358番目のアミノ酸と359番目のアミノ酸との間で切断されたGPC3ペプチドのうち、全長GPC3においてC末端側を構成するペプチドのアミノ酸配列をいう。第2モノクローナル抗体は、好ましくはGPC3の359～580番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体であり、より好ましくはGPC3の543～552番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体である。
　上記の第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の由来は特に限定されず、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダなどのいずれの哺乳動物に由来する抗体であってもよい。また、抗体のアイソタイプも特に限定されず、測定法に応じて適宜選択すればよい。抗体には、抗体のフラグメント及びその誘導体も含まれ、例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメントなどが挙げられる。
　これらの抗体及び抗体フラグメントの作製方法は当該技術において公知である。例えば、第1モノクローナル抗体は、GPC3のN末端側のアミノ酸配列のみを有するペプチドを用いてマウスを免疫し、免疫したマウスから脾臓を摘出して抗体産生細胞を取得し、得られた抗体産生細胞を腫瘍細胞と融合させてハイブリドーマを形成させ、適切に選択されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を取得すること等によって作製することができる。第2モノクローナル抗体についても、GPC3のC末端側のアミノ酸配列のみを有するペプチドを用いて免疫すること以外は同様にして作製することができる。また、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体は、市販の製品であってもよい。ここで、第1モノクローナル抗体の作製に用いられるペプチド抗原のアミノ酸配列は、GPC3のN末端側のアミノ酸配列の一部又は全部である。第2モノクローナル抗体の作製に用いられるペプチド抗原のアミノ酸配列は、GPC3のC末端側のアミノ酸配列の一部又は全部である。
　本実施形態の方法においては、上記の第1モノクローナル抗体と上記の第2モノクローナル抗体とを用いるため、肝細胞がん患者の血液試料中における、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドが検出対象となる。血液試料中におけるGPC3の存在形態としては、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するがGPC3のC末端側のアミノ酸配列を有しないペプチド(N末端フォーム、例えばGPC3の1～358、25～358又は301～358番目のアミノ酸配列を有するペプチド等)と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するがGPC3のN末端側のアミノ酸配列を有しないペプチド(C末端フォーム、例えばGPC3の359～580又は543～552番目のアミノ酸配列を有するペプチド等)と、GPC3のN末端側のアミノ酸配列及びGPC3のC末端側のアミノ酸配列の両方を有するペプチド(全長フォーム、例えばGPC3の1～580又は301～580番目のアミノ酸配列を有するペプチド等)とが考えられる。特許文献１及び２に記載されるような従来のGPC3検出系は、いずれもGPC3の全長フォームを検出対象とする方法ではない。例えば、特許文献１に記載の方法は、GPC3のN末端フォームの測定結果に基づいてがんの判定が行われている。特許文献２に記載の方法は、GPC3のC末端フォームの測定結果に基づいてがんの判定が行われている。特に、特許文献１に記載されるように、肝細胞がんの診断や予後予測においては、GPC3のN末端フォームを検出することが推奨されている。今回、本発明者らは、測定対象をGPC3の全長フォームとした。全長フォームのGPC3ペプチド検出系を用いることにより、従来の検出系を用いた場合よりも検出精度が向上し、高い信頼性をもって、肝細胞がん患者の再発リスクを予測できることを初めて見出した。このことは、従来の当該技術分野における知見に反して、本発明者らが意外にも見出した観点である。
　測定工程において、検出対象となるGPC3ペプチドは、上記の第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方によって認識されるものであれば特に限定されない。すなわち、検出対象となるGPC3ペプチドは、GPC3のN末端側のアミノ酸配列及びGPC3のC末端側のアミノ酸配列の両方を有するペプチド、言い換えればGPC3の全長フォームである。例えば、検出対象となるGPC3ペプチドは、GPC3の第1番目から第580番目のアミノ酸配列を含む全長タンパク質であり得るし、GPC3の第301番目から第552番目のアミノ酸配列を含むペプチドでもあり得る。全長GPC3ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５７に示す。検出対象となるGPC3ペプチドには、糖鎖やヘパラン硫酸などが付加していてもよい。検出対象となるGPC3ペプチドは、上記の第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方によって認識されるものであるから、N末端フォームおよびC末端フォームは、実質的にはいずれも検出されないものと考えられる。本実施形態の方法は、実質的にGPC3の全長フォームだけを検出することができ、それにより、従来技術ではなし得なかった高精度の再発リスク予測に寄与することができる。なお、第1モノクローナル抗体および第2モノクローナル抗体によって、検出対象以外の成分（N末端フォーム、C末端フォーム、その他夾雑物質）を非特異的に検出することも考えられる。当業界において、バックグラウンドシグナルとして検出され得る非特異的反応を完全に排除するのが困難であることは周知である。上記の「実質的にGPC3の全長フォームだけを検出」とは、本発明の作用効果を失わない限りにおいて検出対象以外の成分の非特異的検出を含んでいてもよいことを意味する。
　本実施形態において、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体は、必要に応じて、当該技術において公知の標識物質により標識されていてもよい。そのような標識物質としては、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ及び125Ｉなどの放射性同位体、フルオレセイン、ローダミン及びAlexa Fluor(登録商標)などの蛍光物質、アルカリフォスファターゼ(ALP)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びルシフェラーゼなどの酵素、ビオチン、アビジン及びストレプトアビジンなどが挙げられる。
　測定において抗体を捕捉するための固相を用いる場合、固相の種類は特に限定されない。例えば、抗体を物理的に吸着する材質の固相、抗体と特異的に結合する分子が固定化されている固相などが挙げられる。抗体と特異的に結合する分子としては、プロテインA又はG、該抗体を特異的に認識する抗体(すなわち二次抗体)などが挙げられる。また、抗体と固相との間を介在する物質の組み合わせを用いて、両者を結合させることもできる。そのような物質の組み合わせとしては、ビオチンとアビジン(又はストレプトアビジン)、グルタチオンとグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ハプテンと抗ハプテン抗体などの組み合わせが挙げられる。例えば、第1モノクローナル抗体又は第2モノクローナル抗体をあらかじめビオチン修飾している場合、アビジン又はストレプトアビジンが固定化された固相によって該抗体を捕捉できる。
　固相の素材としては、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム、コバルト及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。
　測定工程は、非特異反応抑制剤の存在下で行われることが好ましい。非特異反応抑制剤が存在することにより、偽陽性と判定される可能性を抑えることができる。
　非特異反応抑制剤としては、測定で使用する抗体が目的抗原以外の物質に結合することを抑制するものであれば特に制限されない。具体的には、マウス血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、マウス抗体及びヒツジ抗体、ヤギ抗体などが挙げられる。非特異反応抑制剤は市販されており、例えば、TRUBlock（Meridian Life Science社）、ASSAY DEVELOPMENT BLOCKING KIT（SCANTIBODIS LABORATOR社）、THBR2（株式会社特殊免疫研究所）等が知られている。
　本実施形態の方法は、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の場合は、肝細胞がんの再発リスクが高いと判定し、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の場合は、肝細胞がんの再発リスクが低いと判定する工程(以下、単に「判定工程」ともいう)を含む。本明細書では、GPC3ペプチドの濃度が閾値以上の場合にGPC3陽性、閾値未満の場合にGPC3陰性ということがある。
　ここで、再発とは、肝細胞がんの根治的治療を受けた患者が再び肝細胞がんを罹患することをいう。「再発リスクが高い」とは、根治的治療を受けた肝細胞がん患者が当該根治的治療から再び肝細胞がんに罹患する可能性が高いことを意味する。一方、「再発リスクが低い」とは、根治的治療を受けた肝細胞がん患者が当該根治的治療から再び肝細胞がんに罹患する可能性が低いことを意味する。
　閾値は、特に限定されず、当業者が予め適宜設定することができる。例えば、術後一定の期間（たとえば、3年、4年、または5年）無再発であった複数の肝細胞がん患者（無再発患者群）及び術後がんが再発した複数の肝細胞がん患者（再発患者群）のGPC3全長フォームの濃度を予め測定し、無再発患者群と再発患者群を最も精度良く分類できる値に設定することができる。閾値の設定に際しては、検査の目的に応じて感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮して設定することができる。また、次のようにして、閾値を設定してもよい:
　１)まず、無再発患者群から術前に得た血液試料と、再発患者群から術前に得た血液試料のそれぞれについて、GPC3濃度を測定する。
　２)測定結果に基づいて、無再発の患者のGPC3濃度の値よりも高く、且つ、再発した患者のGPC3濃度の値よりも低い範囲から閾値を設定する。
　好ましくは、無再発の患者とがんが再発した患者とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。なお、後述の実施例では、GPC3濃度の閾値を15 pg/mLに設定している。本実施形態では、肝細胞がん患者の血液試料中のGPC3ペプチドの濃度を、上記のようにして予め設定された閾値と比較し、無再発患者群および再発患者群の何れに分類されるかが予測される。検査の結果として、たとえば、無再発患者群に分類される場合は再発リスクが低いという判定結果が出力され、再発患者群に分類される場合は再発リスクが高いという判定結果が出力される。
　あるいは、肝細胞がん患者ではない者、例えば、健常者又は肝細胞がん以外の疾患の患者についてGPC3濃度のデータを蓄積し、該データに基づいてGPC3の血中濃度の基準値(例えば平均値、中央値など)を定め、この基準値を閾値としてもよい。
　さらなる実施形態では、上記のようにして再発リスクが高いと判定された患者が、さらにＢ型肝炎ウイルスに感染している場合には、GPC3陰性の患者よりも肝細胞がんが早期に再発する可能性が高いと判定する、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法が提供される。すなわち、B型肝炎ウイルスに感染した肝細胞がん患者においては、GPC3検出有無に基づき、再発の有無だけでなく再発時期の予測が可能となる。
　Ｂ型肝炎ウイルス(Species: Hepatitis B virus；HBV)とは、国際ウイルス分類委員会(International Committee on Taxonomy of Viruses: ICTV)により2015年に公表されたウイルス分類を参照して、ヘパドナウイルス科(Family: Hepadnaviridae)オルソヘパドナウイルス属(Order: Orthohepadnavirus)に属するウイルスの一種を意味する。ウイルス分類においては、分類の再編や属名等の改変が頻繁に行われる。よって、将来ICTVまたはそれに準ずる学術的権威機関による分類において分類が再編されたり、属名等が改変されたりしたとしても、2015年のICTV分類におけるＢ型肝炎ウイルスに相当するウイルスは、本明細書でいうところのＢ型肝炎ウイルスに包含されるものとする。
　Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型は特に限定されず、本願の出願日において既知のジェノタイプＡ～Ｊ及びこれらのサブタイプ(例えばAa/1等)のいずれであってもよいし、将来発見され得る、本願の出願日において未知のジェノタイプであってもよい。
　感染とは、少なくとも検出可能なレベルで患者の体液、特に血液中にＢ型肝炎ウイルスが存在することを意味する。
　被検者がＢ型肝炎ウイルスに感染しているか否かが分かっていない場合、診断補助方法は、肝細胞がん患者の血液試料中において、Ｂ型肝炎ウイルスを検出する工程をさらに含んでいてもよい。Ｂ型肝炎ウイルスに感染しているか否かは、当業者に公知のウイルス検出方法によって調べることができる。このような検出方法としては、例えば酵素免疫測定法のELISA法、直接シーケンス法等が挙げられる。
　一方、被検者がＢ型肝炎ウイルスに感染していることが予め分かっている場合、Ｂ型肝炎ウイルスの検出工程を行うことを要しない。例えば、Ｂ型肝炎に罹患していると診断され、その後肝細胞がんに進行した患者が被検者である場合、被検者がＢ型肝炎ウイルスに感染していることがわかっているため、Ｂ型肝炎ウイルスの検出工程を行う必要はない。
　この実施形態では、肝細胞がんを有するＢ型肝炎ウイルス感染者の血液試料が用いられる。上記と同様にGPC3ペプチドの濃度を測定し、所定の閾値と比較することにより、上記の感染者は、GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上のGPC3陽性群(第１群)またはGPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満のGPC3陰性群(第２群)に分類される。GPC3陽性群は、GPC3陰性群に比べて肝細胞がんの無再発期間が短い（早期に再発する）可能性が高いと判定される。GPC3陰性群は、GPC3陽性群よりも肝細胞がんの無再発期間が長い、または再発しない可能性が高いと判定される。
　別の実施形態では、肝細胞がんを有するＢ型肝炎ウイルス感染者のうち、GPC3陽性群は所定の期間内に肝細胞がんが再発する可能性が高いと判定される。所定の期間としては、GPC3陽性群とGPC3陰性群の無再発期間の情報に基づき、GPC3陽性群とGPC3陰性群とをもっとも高精度に分離できる期間とすることができる。たとえば、所定の期間は、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月とすることができる。
　本発明には、肝細胞がんの治療方法が含まれる。この方法は、上述の判定工程によって「再発リスクが高い」と判定された患者に対して根治的治療を行う工程；および根治的治療後に肝細胞がんの再発リスクを低下させる薬剤を投与する工程を含む。根治的治療については、上述のとおりである。再発リスクを低下させる薬剤としては公知の薬剤を用いることができ、たとえば、インターフェロンなどの抗ウイルス薬などが挙げられる。
　本発明には、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータの取得に適する装置が含まれる。また、本発明には、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータの取得をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。なお、該コンピュータプログラム製品が備える媒体は、コンピュータプログラムが非一時的に記録され、且つ、コンピュータが読取可能な媒体であってもよい。
　以下に、上記の本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの例に示される形態のみに限定されない。図１は、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータを取得するための、再発リスク予測補助装置の概略図である。図１に示された再発リスク予測補助装置１１は、測定装置２２と、該測定装置２２と接続された判定装置３３とを含んでいる。
　本実施形態において、測定装置の種類は特に限定されず、GPC3の測定方法に応じて適宜選択できる。図１に示される例では、測定装置２２は、標識抗体を用いるELISA法により生じるシグナルを検出可能なプレートリーダーである。プレートリーダーは、マーカーの測定に用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。以下に説明する例では、シグナルは、化学発光シグナルや蛍光シグナルなどの光学的情報である。
　抗原抗体反応を行ったプレートを測定装置２２にセットすると、測定装置２２は、GPC3と特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報を取得し、得られた光学的情報を判定装置３３に送信する。なお、測定装置２２に取得される光学的情報には、濃度値の算出のための濃度既知の検体の情報も含まれている。また、以下に説明する例では、測定装置２２は、適切な標識抗体を選択することにより、Ｂ型肝炎ウイルスの検出のために用いることもできる。
　判定装置３３は、コンピュータ本体３３ａと、入力部３３ｂと、検体情報や判定結果などを表示する表示部３３ｃとを含む。判定装置３３は、測定装置２２から光学的情報を受信する。そして、判定装置３３のプロセッサは、光学的情報に基づいて、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータを取得するプログラムを実行する。なお、入力部３３ｂから、後述する「Ｂ型肝炎ウイルスに感染している」や「Ｂ型肝炎ウイルスの検出が必要」を入力することができる。
　図２は、再発リスク予測補助装置１１のコンピュータ本体３３ａのソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図２に示されるように、判定装置３３は、受信部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。受信部３０１は、測定装置２２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。判定部３０４には、入力部３３ｂを介して肝細胞がんの再発リスク予測の実施のための情報、例えば高リスクと判定された検体がＢ型肝炎ウイルスに感染しているか否か、あるいは、Ｂ型肝炎ウイルスの検出を行なうか否かに関する情報を入力することができる。
　受信部３０１は、測定装置２２から送信された情報を受信する。記憶部３０２は、判定に必要な閾値及び各マーカーの濃度値を算出するための式や処理プログラム、さらにＢ型肝炎ウイルス検出を行う場合には、抗原抗体反応においてＢ型肝炎ウイルスに感染している場合及び/又は感染していない場合に得られる光学的情報(シグナル等)などを記憶する。算出部３０３は、受信部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、各マーカーの濃度値を算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出されたマーカーの濃度値が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか又はそれ未満であるかを判定し、さらにＢ型肝炎ウイルス検出を行う場合には、受信部３０１において測定装置２２から取得した光学的情報が、記憶部３０２に記憶されたものと一致するか否かに基づいて、Ｂ型肝炎ウイルス感染の有無を判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータとして出力する。
　図３は、図２に示すコンピュータ本体３３ａのハードウェア構成を示すブロック図である。図３に示されるように、コンピュータ本体３３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３３１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３３２と、ハードディスク３３３と、入出力インターフェイス３３４と、読出装置３３５と、通信インターフェイス３３６と、画像出力インターフェイス３３７とを備えている。ＣＰＵ３３０、ＲＯＭ３３１、ＲＡＭ３３２、ハードディスク３３３、入出力インターフェイス３３４、読出装置３３５、通信インターフェイス３３６及び画像出力インターフェイス３３７は、バス３３８によってデータ通信可能に接続されている。
　ＣＰＵ３３０は、ＲＯＭ３３１に記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ３３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、図２に示す各機能が実行される。これにより、判定装置３３が、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータを取得するための装置として機能する。
　ＲＯＭ３３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３３１には、ＣＰＵ３３０によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
　ＲＡＭ３３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３３２は、ＲＯＭ３３１及びハードディスク３３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３３０の作業領域として利用される。
　ハードディスク３３３は、ＣＰＵ３３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータを取得するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
　読出装置３３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ－ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３３５は、可搬型記録媒体３４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
　入出力インターフェイス３３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ－２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３３４には、キーボード、マウスなどの入力部３３ｂが接続されている。操作者は、当該入力部３３ｂにより、コンピュータ本体３３ａに各種の指令やデータを入力することが可能である。
　通信インターフェイス３３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３３ａは、通信インターフェイス３３６により、プリンタなどへの印刷データの送信が可能である。測定装置２２は、通信インターフェイス３３６により、判定装置３３への測定データ(光学的情報)の送信が可能である。
　画像出力インターフェイス３３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３３ｃに接続されている。これにより、表示部３３ｃは、ＣＰＵ３３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
　次に、再発リスク予測補助装置１１による、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータ取得の処理手順を説明する。図４Ａは、再発リスク予測の補助データ取得のフローチャートの一例である。ここでは、GPC3と特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報からGPC3の濃度値を取得し、得られた濃度値を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
　まず、ステップＳ１－１において、再発リスク予測補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ１－２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、GPC3の濃度値を算出する。
　その後、ステップＳ１－３において、判定部３０４は、ステップＳ１－２で算出された濃度値が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか、それともそれ未満であるかを判定する。ここで、GPC3の濃度値が閾値以上であるとき、ルーチンは、ステップＳ１－４に進行し、判定部３０４は、肝細胞がん患者の再発リスクが高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、GPC3の濃度値が閾値未満であるとき、ルーチンは、ステップＳ１－５に進行し、判定部３０４は、肝細胞がん患者の再発リスクが低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
　そして、ステップＳ１－６において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、再発リスク予測補助装置１１は、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータを医師などに提供することができる。
　図４Ｂは、Ｂ型肝炎ウイルスに感染していることが分かっている検体について行われる再発リスク予測の補助データ取得のフローチャートの一例である。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
　まず、ステップＳ２－１において、再発リスク予測補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ２－２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、GPC3の濃度値を算出する。
　その後、ステップＳ２－３において、判定部３０４は、ステップＳ２－２で算出された濃度値が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか、それともそれ未満であるかを判定する。GPC3の濃度値が閾値未満であるとき、ルーチンは、ステップＳ２－８に進行し、判定部３０４は、肝細胞がん患者の再発リスクが低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
　一方、ステップＳ２－３において、GPC3の濃度値が閾値以上であるとき、ルーチンは、ステップＳ２－４に進行し、判定部３０４は肝細胞がん患者の再発リスクが高いと判定し、その後ルーチンはステップＳ２－５に進行する。
　ステップＳ２－５において、入力部３３ｂから「Ｂ型肝炎ウイルスに感染している」と入力された場合には、ルーチンはステップＳ２－６に進行し、判定部３０４は、肝細胞がんが所定の期間内に再発する可能性が高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。一方、ステップＳ２－５において、入力部３３ｂから「Ｂ型肝炎ウイルスに感染している」と入力されていない場合には、ルーチンはステップＳ２－７に進行し、判定部３０４は、肝細胞がん患者の再発リスクが高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
　そして、ステップＳ２－９において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、再発リスク予測補助装置１１は、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータを医師などに提供することができる。
　図４Ｃは、Ｂ型肝炎ウイルスの検出工程を行う場合の再発リスク予測の補助データ取得のフローチャートの一例である。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
　まず、ステップＳ３－１において、再発リスク予測補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ３－２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、GPC3の濃度値を算出する。
　その後、ステップＳ３－３において、判定部３０４は、ステップＳ３－２で算出された濃度値が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか、それともそれ未満であるかを判定する。GPC3の濃度値が閾値未満であるとき、ルーチンは、ステップＳ３－１０に進行し、判定部３０４は、肝細胞がん患者の再発リスクが低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
　一方、ステップＳ３－３において、GPC3の濃度値が閾値以上であるとき、ルーチンは、ステップＳ３－４に進行し、判定部３０４は肝細胞がん患者の再発リスクが高いと判定し、その後ルーチンはステップＳ３－５に進行する。そして、ステップＳ３－５において、入力部３３ｂから「Ｂ型肝炎ウイルスの検出が必要」と入力されていない場合には、ルーチンはステップＳ３－９に進行し、判定部３０４は、肝細胞がん患者の再発リスクが高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
　一方、入力部３３ｂから「Ｂ型肝炎ウイルスの検出が必要」と入力された場合には、ルーチンはステップＳ３－６に進行し、受信部３０１は、測定装置２２から、Ｂ型肝炎ウイルス感染の有無に関する情報を受信する。その後、ルーチンはステップＳ３－７に進行し、判定部３０４は、ステップＳ３－６で取得した情報に基づいて、患者がＢ型肝炎ウイルスに感染しているか否かを判定する。患者がＢ型肝炎ウイルスに感染していると判定された場合、ルーチンはステップＳ３－８に進行し、判定部３０４は、肝細胞がんが所定の期間内に再発する可能性が高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。一方、患者がＢ型肝炎ウイルスに感染していないと判定された場合、ルーチンはステップＳ３－９に進行し、判定部３０４は、肝細胞がんの再発リスクが高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
　そして、ステップＳ３－１１において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、再発リスク予測補助装置１１は、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータを医師などに提供することができる。
　本発明には、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体とを含む、肝細胞がん患者の再発リスク診断用キットも含まれる。第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体については上記のとおりである。キットは、上記の非特異反応抑制剤をさらに含んでいてもよい。また、キットは、上記の固相、例えば96穴プレートや磁性粒子などをさらに含んでいてもよい。
　本実施形態において、キットは、例えば図５に示されるように、GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体を含む第１試薬を収容した第１試薬容器５０１と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体を含む第２試薬を収容した第２試薬容器５０２とを含む。本実施形態のキットは、上記の方法を記載した添付文書５０３と、第１試薬容器５０１、第２試薬容器５０２及び試薬添付文書５０３を収容する箱５００とをさらに含んでいてもよい。
　また、キットは、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するための物質を含む試薬をさらに含んでいてもよい。Ｂ型肝炎ウイルスを検出するための物質は特に限定されず、Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法の種類によって適宜選択することができる。このような物質としては、例えばＢ型肝炎ウイルスのエンベロープ等を特異的に認識する抗体やＢ型肝炎ウイルスのゲノムDNAの増幅に適したプライマー等が挙げられる。
　本発明には、第1モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体の、GPC3ペプチド検出試薬キット製造のための用途も含まれる。また、本発明には、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するための物質の、GPC3ペプチド検出試薬キット製造のための用途も含まれる。第1モノクローナル抗体、第２モノクローナル抗体、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するための物質およびキットについては、上述の通りである。
　以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１：再発リスク予測
　HCC患者血液サンプル39例は、患者からの同意を得て、国立がん研究センター東病院（千葉県柏市）にて肝切除治療前に採取し、遠心分離により血漿を取得した。このうち28例は肝切除治療後4年以内にHCCの再発が確認されており、11例は無再発であった。
　健常人血漿サンプル50例はサンフコ社より購入した。いずれのサンプルも使用直前まで-80℃で凍結保存した。
　各患者および健常人血漿サンプル中のGPC3の測定は以下の通りに行った。まず、96ウェルイムノプレート（MaxiSorp黒色96ウェルイムノプレート、ThermoScientifc社）に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈した2 μg/mLの市販GPC3 N末端認識モノクローナル抗体を50 μLずつコートし、室温で1時間インキュベートした。次に、300 μLのHISCL洗浄液（シスメックス社）を用いて9回洗浄後、ブロッキングバッファー（150 mM NaCl、10 mg/mL BSA、5 mg/mL Casein、0.01 w/v % NaN3を含むpH 7.4の緩衝液）を250 μL加え、室温で2時間インキュベートした。その後、300 μLのHISCL洗浄液を用いて9回洗浄後、ブロッキングバッファーにHISCL用非特異反応抑制剤（シスメックス社）を加えて作製した希釈バッファーで２倍に希釈した測定サンプルを50 μL加え、室温で1時間インキュベートした。続いて、300 μLのHISCL洗浄液を用いて9回洗浄し、Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH（同仁化学研究所）を用いて添付プロトコール通りに標識した市販GPC3 C末端認識モノクローナル抗体を、希釈バッファーで終濃度0.1 μg/mLとなるように希釈し、50 μLずつ加えて室温で１時間インキュベートした。その後、300 μLのHISCL洗浄液を用いて9回洗浄し、HISCL発光基質セット（シスメックス社）を100 μLずつ加え、室温・暗所で30分間インキュベートしたのち、マイクロプレートリーダー（Infinite F200 PRO、TECAN社）で発光強度を測定した。
　検量線作製用の標準サンプルには、全長型のリコンビナントGPC3（R&D systems社）を15 ～ 20,000 pg/mLとなるようにブロッキングバッファーで希釈したものを使用した。また、検量線は4パラメーターロジスティック回帰法を用いて作製した。全ての測定終了後、検量線を用いて発光強度から測定サンプル中のGPC3濃度を定量した。
　得られた測定結果に対して、閾値を15 pg/mLとして陽性/陰性の判定を行った。図６および表1に示すように、再発28例の陽性率は71.4 %（20/28例）となったのに対して、無再発11例の陽性率は9.1 %（1/11例）となり、既存の他のHCCマーカー（AFPおよびPIVKA-II）と比べて無再発の判定効率が向上したことがわかる。また、図６に示すように、健常人ではGPC3がほとんど検出されなかった。このことは、GPC3が健常人の肝臓組織において殆ど検出されないという知見に合致する。よって、本実施形態の方法は、GPC3の検出精度が極めて高いといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２：Kaplan -Meierを用いた再発リスク予測
　さらに、実施例１で得られた測定結果で判定したGPC3陽性/陰性群について、再発リスク予測の有意差があるか検定した。再発の有無についてKaplan -Meier曲線を作成し、ログランク検定を行なったところ、図７に示す通りP値は0.0002となり、GPC3陽性群は有意に再発しやすい傾向が見られることが示された。なお、統計解析ソフトにはStatFlex ver.6（アーテック社）を用いた。
実施例３：今回使用した抗体のエピトープ解析
　実施例１及び２で使用した抗体のエピトープを解析し、HCCの再発リスク判定精度が飛躍的に向上した理由が全長型GPC3を正しく捉えることであるかについて検証した。
　検出用に用いたC末端認識型モノクローナル抗体のエピトープ解析は、図８のようなオーバーラッピングペプチド(表２)を用いた競合ELISAによって行なった。
[規則26に基づく補充 06.04.2017]　
Figure WO-DOC-TABLE-2
　市販のC末端認識型モノクローナル抗体を終濃度0.2 μg/mLとなるようにブロッキングバッファー（150 mM NaCl、2.5 mM EDTA、 0.1 mg/mL BSAを含むpH 7.0の緩衝液）で希釈した溶液35 μLを、モル比で抗体の10倍濃度となるようにブロッキングバッファーで調製した競合ペプチドあるいは全長型リコンビナントGPC3溶液35 μLと混合し、室温で1時間インキュベートし、競合阻害溶液とした。また、PBSで10 ng/mLとなるよう希釈した全長型リコンビナントGPC3を50 μLずつ96ウェルイムノプレート（MaxiSorp白色96ウェルイムノプレート、ThermoScientifc社）に加え、室温で1時間インキュベートした。このプレートを300 μLのHISCL洗浄液を用いて3回洗浄し、250 μLのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートした。次に、300 μLのHISCL洗浄液を用いて3回洗浄し、50μLの競合阻害溶液を加え、室温で1時間インキュベートした。その後、300 μLのHISCL洗浄液を用いて3回洗浄し、ブロッキングバッファーで5000倍に希釈したPeroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（Jackson Immuno Research社）を50 μL加え、室温で1時間インキュベートした。最後に、300 μLのHISCL洗浄液を用いて9回洗浄し、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Scientific社）を50 μL加え、室温で5分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで発光強度を測定した。競合の強さは吸収率として評価し、競合ペプチドを添加したことによって下がったシグナル強度の差分を、競合ペプチドを一切添加しなかった際のシグナル強度で割ることによって算出した。
　競合ペプチドとしては、まず配列番号の順にペプチドの4種混合溶液を用いて測定を行った。図９に示した通り、配列番号53から56の混合物を添加した際に高い吸収率を示すことが明らかとなった。
　次に、阻害が確認された競合ペプチド混合液およびその前後の配列番号ペプチドについて、それぞれ単独で用いて測定を実施した。図１０に示したとおり、配列番号53および54において強い吸収率を示すことが明らかとなった。
　このことから、図１１に示した通り、配列番号53および54に共通して存在する配列である、GPC3の543番目から552番目までの配列TPKDNEISTFをC末端認識型モノクローナル抗体のエピトープであると決定した。
　捕捉用に用いたN末端認識型モノクローナル抗体のエピトープ解析は、図１２のような部分リコンビナント蛋白質を用いたウェスタンブロット解析によって行なった。
　全長型リコンビナントGPC3およびN末部分リコンビナントGPC a.a.121-220（Abnova社）、a.a. 301-400（Abnova社）をそれぞれ5 ngずつ取り、4倍希釈したSample Buffer Solution 2ME+（和光純薬社）に溶解させた。この溶液を98℃で5分間加熱した後、SuperSep Ace 15% 13well（和光純薬社）に全量をアプライして電気泳動を行なった。その後、SilverQuest Silver Staining Kit（Thermo Scientific社）を用いてゲルを染色した。なお、操作はキット添付の取扱い説明書に従った。
　また、同様に電気泳動を行なったゲルをImmobilon-FL PVDF（Merck Millipore社）へ、4℃、100 V、1時間の条件でトランスファーした。このメンブレンを0.05 v/v % Tween-20、40 mg/mL BSAを含んだトリス緩衝生理食塩水（TBS）中に浸し、室温で1時間振盪した。さらにメンブレンを、0.1 v/v % Tween-20、50 mg/mL スキムミルクを含んだトリス緩衝生理食塩水で0.5 μg/mLになるよう希釈したN末端認識型モノクローナル抗体溶液中に浸し、室温で1時間振盪した。
　その後、メンブレンを0.05 v/v % Tween-20を含んだトリス緩衝生理食塩水を用いて3回洗浄し、0.1 v/v % Tween-20、50 mg/mL スキムミルクを含んだトリス緩衝生理食塩水で1000倍に希釈したPolyclonal Goat Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP溶液中に浸し、室温で1時間振盪した。
　最後に、メンブレンを0.05 v/v % Tween-20を含んだトリス緩衝生理食塩水を用いて3回洗浄し、Pierce Western Blotting Substrate Plus（Thermo Scientific社）を用いて発光させた。発光後のメンブレンはImageQuant LAS4000 mini（GEヘルスケア社）を用いて撮像した。なお、操作はキット添付の取扱い説明書に従った。
　図１３に銀染色（左）およびウェスタンブロット（右）の結果を示す。この結果より、本実施例で使用したN末端認識型モノクローナル抗体は、GPC3の301 - 400 a.a.および25 - 358 a.a.に対して反応することが分かった。よって、図１４の通り両者に共通して存在する配列である301 - 358 a.a.が本抗体のエピトープ領域であると決定した。
実施例４：非特異反応抑制剤の添加効果の検証
　GPC3の301番目から358番目のペプチドを認識する第一のN末端認識型モノクローナル抗体（ビオチン標識）と、GPC3の543番目から552番目のペプチドを認識する第二のC末端認識型モノクローナル抗体（アルカリフォスファターゼ標識）を用いて、自動免疫測定装置HISCL-800（シスメックス社）によって市販血漿10種（Proteogenex社）の測定を行った。なお、抗体のビオチン標識はBiotin Labeling Kit - SH（同仁化学研究所）を添付プロトコール通りに用いて行なった。
　検量線作製用のサンプルはELISAと同様のものを使用した。また、各抗体の希釈溶液については、ELISAと同様の希釈率のものを作製し、希釈溶媒にはELISA用のブロッキングバッファー（非特異対策なし）および終濃度2 mg/mLのマウスIgGを加えたブロッキングバッファー（非特異対策あり）の2種類を用意した。
　図１５（およびその拡大図の図１６）に示すように、非特異反応抑制剤を添加しなかった場合、いずれの検体も閾値である15 pg/mLを上回っており、偽陽性が発生してしまう恐れがあることが分かる。なお、図１５及び図１６中、「HAMA」は、ヒト抗マウス抗体(Human Anti -Mouse Antibody)を表す。
実施例５：B型肝炎患者早期再発予測
　HCC患者血液サンプル39例のうち、4年以内に再発が見られた28例について、ウイルス感染の有無に基づく解析を実施した。再発群は年齢中央値68歳（63-72）であり、このうちHCV陽性は18例、HBV陽性は7例、ウイルス感染なしは3例であった。また、無再発期間は中央値10ヶ月（3-21）であった。
　具体的な実験操作としては、まず、市販のGPC3 N末端認識型モノクローナル抗体を、Biotin Labeling Kit - SH（同仁化学研究所）を用いてビオチン化した。次いで、市販のGPC3 C末端認識型モノクローナル抗体を、Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH（同仁化学研究所）を用いてALP化した。上記で得られたビオチン化抗体と、測定サンプル及び非特異反応抑制剤とを懸濁し、得られた懸濁液に、ストレプトアビジン修飾されたHISCL磁性ビーズを添加して懸濁した。ビーズを集磁して上清を除き、HISCL洗浄液でビーズを洗浄してB/F分離を行った。得られたビーズと、上記で得られたALP化抗体及び非特異反応抑制剤とを懸濁し、ビーズを集磁し、上記と同様にしてB/F分離を行った。得られたビーズにHISCL基質バッファー及びHISCL発光基質を懸濁し、HISCL-800を用いて、発光強度を測定した。なお、用いるビオチン化抗体とALP化抗体の量については、15 pg/mLの全長型のリコンビナントGPC3（R&D systems社）をS/N = 2以上で測定可能なように調整した。
　GPC3陽性群および陰性群について、ウイルス感染タイプごとに分けて無再発期間を比較した結果を図１７に示す。図１７中、破線より上は無再発群の患者を表し、破線より下は再発群の患者を表す。また、菱形はGPC3陽性群を表し、三角はGPC3陰性再発群を表し、特に四角はGPC3陰性無再発群を表す。図１７から明らかなように、HBV陽性患者においては、GPC3陽性群は、再発が認められたGPC3陰性群に比べて再発までの期間（無再発期間）が短い(平均3.7ヶ月)ことがわかった。また、ＨＢＶ陽性であってGPC3陽性の全患者において再発が認められた。
　１１　　　再発リスク予測補助装置
　２２　　　測定装置
　３３　　　判定装置
　３３ａ　　コンピュータ本体
　３３ｂ　　入力部
　３３ｃ　　表示部
　３０１　　受信部
　３０２　　記憶部
　３０３　　算出部
　３０４　　判定部
　３０５　　出力部
　３３０　　ＣＰＵ
　３３１　　ＲＯＭ
　３３２　　ＲＡＭ
　３３３　　ハードディスク
　３３４　　入出力インターフェイス
　３３５　　読出装置
　３３６　　通信インターフェイス
　３３７　　画像出力インターフェイス
　３３８　　バス
　３４０　　記録媒体
　５００　　箱
　５０１　　第１試薬容器
　５０２　　第２試薬容器
　５０３　　添付文書

Claims (12)

  1. 　グリピカン3 (GPC3)のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体を用い、肝細胞がん患者の血液試料中における、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度を測定する工程と、
    　前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の場合は、肝細胞がんの再発リスクが高いと判定し、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の場合は、肝細胞がんの再発リスクが低いと判定する工程と、
    を含む、肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法。
  2. 　第1モノクローナル抗体が1～358番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 　第1モノクローナル抗体が301～358番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　第2モノクローナル抗体が359～580番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体である、請求項１～３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 　第2モノクローナル抗体が543～552番目のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体である、請求項１～４のいずれか１つに記載の方法。
  6. 　GPC3ペプチドが、GPC3の第301番目から第552番目のアミノ酸配列を含むペプチドである請求項１～５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 　前記判定工程において、肝細胞がんを有するＢ型肝炎ウイルス感染者のうち、GPC3陽性群は所定の期間内に肝細胞がんが再発する可能性が高いと判定する、請求項１～６のいずれか１つに記載の方法。
  8. 　測定工程が、非特異反応抑制剤の存在下で行われる、請求項１～７のいずれか１つに記載の方法。
  9. 　グリピカン3 (GPC3)のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体を用い、肝細胞がんを有するＢ型肝炎ウイルス感染者の血液試料中における、第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度を測定する工程と、
    　前記患者を、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の第1群または前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の第2群に分類する工程と、
    を含み、
    　前記第1群は、第2群に比べて早期に再発する可能性が高い患者群である、
    　肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法。
  10. 　プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、下記のステップ：
    　肝細胞がん患者の血液試料中の第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度の測定結果を取得するステップと、
    　前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の場合は、肝細胞がんの再発リスクが高いと判定し、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の場合は、肝細胞がんの再発リスクが低いと判定するステップと
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
    肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータの取得に適する装置。
  11. 　コンピュータに読み取り可能な媒体を備え、前記媒体には、下記のステップ：
    　肝細胞がん患者の血液試料中の第1モノクローナル抗体及び第2モノクローナル抗体の両方に認識されるGPC3ペプチドの濃度の測定結果を取得するステップと、
    　前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値以上の場合は、肝細胞がんの再発リスクが高いと判定し、前記GPC3ペプチドの濃度が所定の閾値未満の場合は、肝細胞がんの再発リスクが低いと判定するステップと
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
    肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助するデータの取得をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品。
  12. 　GPC3のN末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第1モノクローナル抗体と、GPC3のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを認識する第2モノクローナル抗体とを含む、肝細胞がん患者の再発リスク診断用キット。
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