WO2017145239A1 - 生体試料分析チップ、生体試料分析装置、及び生体試料分析方法 - Google Patents

生体試料分析チップ、生体試料分析装置、及び生体試料分析方法 Download PDF

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真由 青木
武田　健一
原田　邦男
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株式会社日立製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a biological sample analysis chip, a biological sample analysis device, and a biological sample analysis method.
  • the blocking current type nanopore sequencer is composed of a thin film membrane having pores of the same size as a biological sample, and a liquid tank having electrodes disposed above and below the membrane.
  • the liquid tank is filled with the solution, and the biological sample is introduced from one side of the liquid tank.
  • a voltage is applied to the electrodes, and a change in the current value flowing between the electrodes when the biological sample passes through the pores is measured. By such measurement, the structural characteristics of the biological sample are determined.
  • the formation method of the nanopore sequencer of the blocking current method can be broadly divided into two types, “Bio type” and “Solid type”.
  • the bio-type is a technique using biomolecules.
  • a membrane in which an amphiphilic lipid bilayer is placed in a liquid tank filled with a solution is disposed.
  • pores are formed by allowing a modified protein (Mycrobacterium smegmatis porin A, etc.) having nanometer-size pores to float on the lipid bilayer membrane.
  • the bio-type has a problem that the protein and lipid bilayer used are easily denatured. Therefore, there is an expectation for a solid type that does not handle biomolecules.
  • the solid type is a method that uses materials and processes with high mechanical strength.
  • a silicon nitride film is used as a membrane, and nanometer-sized pores are formed in the membrane by irradiation with an electron beam or application of voltage.
  • nanopore sequencers One problem with nanopore sequencers is that the reading accuracy is low, and it is necessary to slow down the reading speed to improve accuracy, and it is necessary to read the same structure multiple times, improving the throughput as a single sequencer. Is a difficult point. Therefore, it is an effective means to arrange a plurality of nanopore sequencers in an array and measure the structure of biomolecules in parallel. In the arrayed structure of the nanopore sequencer, it is necessary to parallelize not only the pores but also the peripheral structures such as the associated liquid tanks and electrodes.
  • patent document 1 is disclosing the parallel method of the liquid tank in a bio type.
  • a plurality of independent liquid tanks are formed by replacing a surplus of polar liquid continuous between parallel wells with a nonpolar liquid, and a nonpolar liquid layer sandwiched with polar liquids.
  • a membrane made of an amphiphilic lipid bilayer is later formed in a self-organizing manner.
  • a material having a high mechanical strength represented by a silicon nitride film is formed on a substrate, and then an opening is formed in the substrate to expose the silicon nitride film.
  • a substrate having a membrane is formed.
  • the member which comprises a liquid tank is attached to the upper and lower sides of the board
  • the liquid tank is provided with at least two flow paths (for example, a flow path for introducing a solution and a flow path for discharging gas and excess liquid existing in the liquid tank).
  • Patent Document 2 discloses an array of solid nanopore sequencers.
  • Patent Document 2 discloses a structure in which one of the two channels connected to the liquid tank also serves as an electrode.
  • the membrane material if the membrane material does not have fluidity and amphiphilicity, the membrane cannot be provided between the liquid tanks arranged above and below.
  • a material having a high mechanical strength represented by a silicon nitride film is used as a membrane. Therefore, the method of Patent Document 1 cannot be applied to a solid-type nanopore sequencer.
  • Patent Document 2 only discloses that components (liquid tanks, electrodes, and the like) are simply arranged in parallel, and such a configuration increases the array area. It becomes a factor that hinders integration and parallelization.
  • Patent Document 2 does not describe any isolation method between parallel liquid tanks and no wiring configuration connected to each of the electrodes. Therefore, with respect to the array of solid nanopore sequencers, a configuration that enables integration and parallelization of sequencers is required.
  • the present invention provides a technique for integrating and paralleling liquid tanks, flow paths, electrodes, and the like in the array of solid-type nanopore sequencers.
  • the present application includes a plurality of means for solving the above-described problems.
  • a first liquid including a first substrate, a membrane disposed on the first substrate, and a first electrode.
  • a plurality of second liquid tanks each including a tank, at least one flow path and a second electrode; and a second substrate disposed below the first substrate;
  • the liquid tanks are substantially insulated from each other, and the membrane disposed on the first substrate constitutes a part of the first liquid tank and a part of the plurality of second liquid tanks.
  • the second liquid tank is disposed between the first liquid tank and the plurality of second liquid tanks, and the second substrate includes the at least one flow path and the second electrode,
  • a biological sample analysis chip constituting a part of the plurality of second liquid tanks is provided.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a main part of a biological sample analysis chip in Example 1.
  • FIG. It is a principal part cross-sectional schematic diagram of the biological sample analysis chip
  • 3 is a plan layout diagram of a second substrate in Example 1.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view of a relevant part of a biological sample analysis chip in Example 2.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view of a relevant part of a biological sample analysis chip in Example 3.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view of a relevant part of a biological sample analysis chip in Example 4. It is a principal part block diagram explaining the biological sample analyzer in Example 5.
  • FIG. 9 is a schematic cross-sectional view of a relevant part for explaining a biological sample analyzer in Example 5.
  • 10 is a schematic cross-sectional view of an example of a biological sample analyzer having a solution supply nozzle in Example 5.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view of an example of a biological sample analyzer having a drive mechanism in Example 5.
  • Example 1 below, the Example of the biological sample analysis chip in case the number of arrays is two is described. Of course, the number of arrays of biological sample analysis chips may be two or more.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a biological sample analysis chip in Example 1.
  • the biological sample analysis chip mainly includes a membrane 100, a first substrate 101, a support material 103, and a second substrate 200.
  • the biological sample analysis chip further includes a first liquid tank 102, a plurality of second liquid tanks 201A and 201B, a first electrode 104, a plurality of flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2, and a plurality of Second electrodes 203A and 203B, a plurality of wirings 204A and 204B, and a plurality of external connection terminals 205A and 205B are provided.
  • the membrane 100 is disposed on the first substrate 101.
  • a support material 103 is disposed on the first substrate 101.
  • the first liquid tank 102 is a space disposed above the membrane 100. More specifically, the first liquid tank 102 is a space formed by the membrane 100 and the support material 103.
  • the first electrode 104 is disposed in the first liquid tank 102.
  • the plurality of second liquid tanks 201 ⁇ / b> A and 201 ⁇ / b> B are spaces arranged below the membrane 100. More specifically, the plurality of second liquid tanks 201 ⁇ / b> A and 201 ⁇ / b> B are spaces formed by the membrane 100, the first substrate 101, and the second substrate 200.
  • the first substrate 101 includes a plurality of openings 101A and 101B so as to constitute a part of the plurality of second liquid tanks 201A and 201B.
  • a space surrounded by the inner walls of the plurality of openings 101A and 101B, the membrane 100, and the first surface 200A of the second substrate 200 becomes a plurality of second liquid tanks 201A and 201B.
  • the membrane 100 disposed on the first substrate 101 includes the first liquid tank 102 and a part of the plurality of second liquid tanks 201A and 201B. It arrange
  • the membrane 100 has a plurality of pores 105A and 105B.
  • FIG. 1 shows a state before the pores 105A and 105B are formed in the membrane 100
  • FIG. 2 shows a state where the pores 105A and 105B are formed in the membrane 100.
  • the plurality of pores 105A and 105B are formed immediately before the analysis. A method for forming the pores 105A and 105B will be described later.
  • the pores 105A and 105B may be formed in the membrane 100 in advance.
  • the membrane 100 is divided into a plurality of sections for each of the second liquid tanks 201A and 201B between the first liquid tank 102 and the second liquid tanks 201A and 201B.
  • the membrane 100 since the two second liquid tanks 201A and 201B are provided for the first liquid tank 102, the membrane 100 has two compartments.
  • the membrane 100 includes pores 105A and 105B for each of the sections. That is, the plurality of pores 105A and 105B are provided so as to correspond to the second liquid tanks 201A and 201B.
  • the second substrate 200 is disposed below the first substrate 101.
  • the first substrate 101 and the second substrate 200 are in direct contact.
  • the second substrate 200 is a printed circuit board.
  • the second substrate 200 may be a printed circuit board having an insulating property.
  • the second substrate 200 has an electrode and a wiring configuration described below formed on the surface or the surface and the inside thereof.
  • the second substrate 200 includes a plurality of flow paths 202A1, 202A2, 202B1, and 202B2, a plurality of second electrodes 203A and 203B, a plurality of wirings 204A and 204B, and a plurality of external connection terminals 205A and 205B. .
  • the plurality of flow paths 202 A 1, 202 A 2, 202 B 1, 202 B 2 are through holes that penetrate the second substrate 200.
  • Two flow paths 202A1 and 202A2 are provided for the second liquid tank 201A, and two flow paths 202B1 and 202B2 are provided for the second liquid tank 201B.
  • the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, and 202B2 are not limited to this structure, and may be formed in a form that connects the outside and the second liquid tank. In this example, two flow paths are provided for each second liquid tank, but it is sufficient that at least one flow path is provided for one second liquid tank.
  • the second electrode 203A is disposed in the second liquid tank 201A and on the first surface 200A of the second substrate 200.
  • the second electrode 203 ⁇ / b> B is disposed in the second liquid tank 201 ⁇ / b> B and on the first surface 200 ⁇ / b> A of the second substrate 200.
  • the external connection terminal 205A is disposed on the second surface 200B opposite to the first surface 200A on which the second electrode 203A is disposed.
  • the external connection terminal 205A is connected to the second electrode 203A through the wiring 204A.
  • the external connection terminal 205B is disposed on the second surface 200B opposite to the first surface 200A on which the second electrode 203B is disposed.
  • the external connection terminal 205B is connected to the second electrode 203B through the wiring 204B.
  • the preparation procedure of the biological sample analysis chip shown in FIGS. 1 and 2 will be described. First, the first substrate 101 is prepared, and a silicon nitride film is provided on the first substrate 101. Next, openings 101A and 101B are formed in the first substrate 101 from the back surface of the first substrate 101 using dry etching and wet etching. As a result, a silicon nitride film 100 having a plurality of windows is formed.
  • an insulating glass epoxy substrate is used for the second substrate 200.
  • Copper is used for the wirings 204A and 204B.
  • Metal vias are formed in portions extending in the vertical direction connecting the plurality of layers of the second substrate 200.
  • a multilayer film of copper and gold is used for the external connection terminals 205A and 205B.
  • the external connection terminals 205A and 205B are arranged on the outer periphery of the second substrate 200 (here, the outer periphery of the second surface 200B).
  • a plurality of through holes are formed as flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2. At this time, the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2 and the wirings 204A, 204B are laid out so as not to overlap.
  • FIG. 3 shows a part of the planar layout diagram (second electrode, wiring arranged in the horizontal direction, flow path) of the second substrate 200 formed by the above procedure.
  • the second electrodes 203 ⁇ / b> A and 203 ⁇ / b> B are disposed on the surface layer (first surface 200 ⁇ / b> A) of the second substrate 200.
  • the wirings 204 ⁇ / b> A and 204 ⁇ / b> B are respectively disposed on the inner layer of the second substrate 200.
  • the external connection terminals 205 ⁇ / b> A and 205 ⁇ / b> B are arranged on the surface layer on the opposite side of the second substrate 200 (the second surface 200 ⁇ / b> B opposite to the first surface 200 ⁇ / b> A). Yes.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view taken along the line P-P ′ in FIG.
  • the second electrode 203A and the external connection terminal 205A are connected via a wiring 204A, and the wiring 204A is formed so as to bypass the flow paths 202A1 and 202A2 (the wiring 204A and the flow path 202A1). 202A2).
  • the second electrode 203B and the external connection terminal 205B are connected via a wiring 204B, and the wiring 204B is formed so as to bypass the flow paths 202B1 and 202B2 (the wiring 204B and the flow path 202B1, 202B2 is not connected).
  • a silver-silver chloride paste with good potential stability is used for the second electrodes 203A and 203B.
  • the ends of the wirings 204A and 204B are covered with the paste, and the second electrodes 203A and 203B are formed. After that, the first substrate 101 and the second substrate 200 formed by the above procedure are bonded (combined) using a clamp.
  • 2nd liquid tank 201A, 201B is comprised by the space formed with the membrane 100, the 1st board
  • FIG. The second liquid tank 201A and the second liquid tank 201B are configured as independent spaces by the first substrate 101 and the second substrate 200, respectively, and the second liquid tank 201A and the second liquid tank 201B Is substantially insulated.
  • substantially insulating means resistance values generated in the nanometer-order pores 105A and 105B opened in the membrane 100 when the analysis is performed using the biological sample analysis chip described in this embodiment.
  • the resistance value between the second liquid tank 201A and the second liquid tank 201B is larger than that of the second liquid tank 201A, and it is insulated to a level that does not hinder the measurement of the current value flowing through the pores 105A and 105B. means.
  • the second electrode 203A is arranged in the second liquid tank 201A by the coupling by the clamp described above.
  • flow paths 202A1 and 202A2 are connected to the second liquid tank 201A.
  • the second electrode 203B is disposed in the second liquid tank 201B.
  • flow paths 202B1 and 202B2 are connected to the second liquid tank 201B.
  • the first liquid tank 102 is a common liquid tank for the second liquid tanks 201A and 201B.
  • the first electrode 104 is introduced into the first liquid tank 102.
  • the first electrode 104 is a silver-silver chloride rod.
  • the first liquid tank 102 and the second liquid tanks 201A and 201B are filled with the electrolyte solution, and both surfaces of the membrane 100 are brought into contact with the electrolyte solution.
  • the solution is introduced into the second liquid tank 201A from the flow path 202A1 or the flow path 202A2. Further, the solution is introduced into the second liquid tank 201B from the flow path 202B1 or the flow path 202B2.
  • nanometer-sized pores 105 ⁇ / b> A and 105 ⁇ / b> B are formed in the membrane 100. More specifically, following the filling of the solution, the first electrode 104 is grounded, and a pulsed voltage is applied between the second electrodes 203A and 203B. Nanometer-sized pores 105A and 105B are formed in the membrane 100 by the mechanism of dielectric breakdown. Since the diameters of the pores 105A and 105B increase as the current value flowing through the pores 105A and 105B increases, the diameter is controlled by the current value (Itaru Yanagi et al., Sci. Rep. 4, 5000 (2014), And International Publication No. 2015/097765).
  • the biological sample analysis chip in the case where the number of arrays shown in FIG. 1 is two is realized. If this method is used, integration of a liquid tank, a flow path, an electrode, and wiring becomes possible.
  • the biological sample analysis chip of this embodiment includes a first substrate 101 including a membrane 100, a plurality of through holes (channels 202A1, 202A2, 202B1, 202B2), and a plurality of second electrodes 203A, 203B in an array.
  • the second substrate 200 is provided.
  • the second substrate 200 is provided with wirings 204A and 204B connected to the plurality of second electrodes 203A and 203B and a plurality of external connection terminals 205A and 205B. According to such a configuration, in the arraying of the solid nanopore sequencer, it is possible to realize integration and parallelization of the liquid tank, the flow path, the electrode, and the wiring.
  • the second liquid tank 201A only by configuring the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2 as through holes of the second substrate 200, Insulation between 201B becomes possible.
  • the second substrate 200 by forming the second substrate 200 using the multilayer wiring technique, it is possible to take out the wiring from each of the second electrodes 203A and 203B even when the array scale is increased.
  • the membrane 100 is the procedure for creating the biological sample analysis chip according to the present embodiment, but the effectiveness of the present invention is not limited to this case.
  • a silicon nitride film is used for the membrane 100
  • a silicon oxide film, graphene, graphite, an organic substance, a polymer material, or the like may be used as the membrane 100.
  • Electrode material Although a silver-silver chloride electrode is used for the electrode of this embodiment, other metals such as platinum and gold may be used as the electrode material. Further, although glass epoxy is used for the second substrate 200, other insulators such as Teflon may be used.
  • the support material 103 of the first liquid tank 102 has a wall-like shape and a large opening is provided in the upper part of the first liquid tank 102.
  • the present invention is not limited to this configuration.
  • another structure such as a configuration in which the first liquid tank 102 has a ceiling or a structure in which the support member 103 of the first liquid tank 102 is provided on the second substrate 200 may be used.
  • the pores 105A and 105B are formed by applying a voltage to the membrane 100, but the present invention is not limited to this.
  • the pores 105A and 105B may be formed by other methods such as irradiating the membrane 100 with an electron beam (see A. J. Storm et al., Nat. Mat. 2 (2003)).
  • first substrate 101 and the second substrate 200 are combined by clamping, but the first substrate 101 and the second substrate 200 may be directly bonded.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view of the biological sample analysis chip in Example 2, and a schematic cross-sectional view of the biological sample analysis chip having a structure in which an insulating layer is sandwiched between the first substrate 101 and the second substrate 200.
  • symbol is attached
  • the insulating layer 300 is disposed between the first substrate 101 and the second substrate 200.
  • the first substrate 101 may be disposed on the second substrate 200 with the insulating layer 300 interposed therebetween.
  • the second electrodes 203A and 203B, the wirings 204A and 204B, the external connection terminals 205A and 205B, and the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, and 202B2 are formed on the second substrate 200 by using a printed circuit board wiring technique. Thereafter, a patterned insulating layer 300 is formed on the second substrate 200.
  • the insulating layer 300 includes a plurality of openings 300A and 300B so as to correspond to the plurality of second liquid tanks 201A and 201B.
  • a resin is used for the insulating layer 300.
  • the first substrate 101 on which the membrane 100 is formed is bonded onto the insulating layer 300.
  • the insulating layer 300 constitutes a part of the plurality of second liquid tanks 201A and 201B.
  • the plurality of second liquid tanks 201 ⁇ / b> A and 201 ⁇ / b> B are spaces formed by the membrane 100, the first substrate 101, the insulating layer 300, and the second substrate 200.
  • the biological sample analysis chip in the case where the number of arrays shown in FIG. Compared to the first embodiment, a mechanism for clamping the first substrate 101 and the second substrate 200 is unnecessary, and the handling becomes simple. Note that the insulating layer 300 may be patterned after being formed over the second substrate 200.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view of a biological sample analysis chip in Example 3.
  • the surface of the first substrate 101 opposite to the side on which the membrane 100 is formed is brought into contact with the second substrate 200.
  • the membrane 100 of the first substrate 101 is The surface on the film forming side is arranged on the second substrate 200 side.
  • the second electrodes 203A and 203B, the wirings 204A and 204B, the external connection terminals 205A and 205B, and the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, and 202B2 are formed on the second substrate 200 by using a printed circuit board wiring technique. Thereafter, a patterned insulating layer 300 is formed on the second substrate 200. Resin is used for the insulating layer 300. Next, the first substrate 101 including the membrane 100 is bonded to the insulating layer 300 with the surface on which the membrane 100 is formed facing down.
  • the first substrate 101 constitutes a part of the first liquid tank 102.
  • the first liquid tank 102 is a space formed by the membrane 100, the first substrate 101, and the support material 103.
  • the plurality of second liquid tanks 201 ⁇ / b> A and 201 ⁇ / b> B are spaces formed by the membrane 100, the insulating layer 300, and the second substrate 200.
  • the biological sample analysis chip in the case where the number of arrays shown in FIG. Note that the insulating layer 300 may be patterned after being formed over the second substrate 200.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view of a biological sample analysis chip in Example 4.
  • the portion extending in the vertical direction connecting the plurality of layers of the second substrate 200 is formed of a metal via.
  • the portion extending in the vertical direction connecting the plurality of layers of the second substrate 200 is formed by the plated through hole method.
  • the external connection terminals 205A and 205B and the wirings 204A and 204B are formed by using the wiring technique of the printed circuit board. Thereafter, through-holes (through holes) are formed in the regions of the flow paths 202A1 and 202B1, thereby exposing a part of the wirings 204A and 204B to the wall surfaces of the flow paths 202A1 and 202B1.
  • a metal film is arranged on the inner wall of the through hole.
  • copper plating and gold plating are applied to the inner wall of the through hole.
  • a portion plated with metal is used as a part of the second electrodes 203A and 203B. Accordingly, the second electrodes 203A and 203B are connected to the wirings 204A and 204B, respectively. Thereafter, two other through holes are formed in the second substrate 200. These through holes are used as the flow paths 202A2 and 202B2.
  • the biological sample analysis chip in the case where the number of arrays shown in FIG. Compared with the other embodiments, there is an effect that the area of the via is suppressed. Since the second electrodes 203A and 203B are formed on the inner wall of the through hole, an electrode material that can form a film on the inner wall of the through hole and has good coverage may be employed in this embodiment. .
  • Embodiments 2 and 3 including the insulating layer 300 can also be applied to Embodiments 2 and 3 including the insulating layer 300.
  • the patterned insulating layer 300 is formed on the second substrate 200 after the through hole formation procedure described above.
  • FIG. 7 is a block diagram illustrating a biological sample analyzer in Example 5
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional view of the biological sample analyzer.
  • the biological sample analyzer includes a biological sample analysis chip 500, a liquid feeding device 600, a circuit board (control circuit) 800, and a power supply and control unit 900.
  • the biological sample analysis chip 500 corresponds to the biological sample analysis chips of Examples 1 to 4 described above.
  • FIG. 8 shows a biological sample analysis chip corresponding to Example 2 as an example.
  • the circuit board 800 includes an amplifier 810, a switch 820, and a control circuit unit 830 such as an analog-digital conversion circuit, and manages a biological sample analysis sequence.
  • the power supply and control unit 900 includes a power supply 910 and a PC (Personal Computer) 920.
  • the power supply and control unit 900 is connected to the liquid delivery device 600 and the circuit board 800.
  • the power source 910 is used to apply a voltage between the first electrode 104 and the second electrodes 203A and 203B.
  • the circuit board 800 independently controls the voltage between the first electrode 104 and the second electrodes 203A and 203B.
  • the PC 920 controls the power source 910 and each component of the apparatus, and controls the entire apparatus (control of liquid feeding, supply of power to the circuit board 800, input of measurement start, etc.).
  • the PC 920 also has a function of a measurement unit that measures current values independently between the first electrode 104 and the second electrodes 203A and 203B.
  • the PC 920 includes at least a processor such as a CPU (Central Processing Unit), a memory, and a storage unit such as a hard disk.
  • the PC 920 supplies a voltage applied between the first electrode 104 and the second electrodes 203A and 203B, and a current value between the first electrode 104 and the second electrodes 203A and 203B (the biological sample has a pore 105A). , 105B), a change in current value when passing through 105B) is measured and recorded in the storage unit.
  • the PC 920 detects the structural feature of the biological sample using the measured current value.
  • FIG. 7 is an example, and is not limited to this configuration.
  • the analog-to-digital conversion circuit of the circuit board 800 may be disposed in the power supply and control unit 900, and there are various device variations.
  • a system suitable for the measurement environment may be constructed.
  • the liquid feeding device 600 includes a pump 610 and a tank 620, and supplies the solution to the first liquid tank 102 and the second liquid tanks 201A and 201B of the biological sample analysis chip 500.
  • the control of the liquid amount and the timing of supplying the solution in the liquid delivery device 600 are controlled by the power supply and control unit 900.
  • the biological sample analysis chip 500 is disposable, and the biological sample analysis chip 500 is configured to be removable from the circuit board 800 prepared in advance. .
  • FIG. 8 shows a mechanism in which the biological sample analysis chip 500 is configured to be removable from the circuit board 800.
  • the circuit board 800 includes a socket 700.
  • the socket 700 is provided with metal pins (connection portions) 701A and 701B having metal protrusions.
  • the metal pin 701A can be electrically connected to the external connection terminal 205A
  • the metal pin 701B can be electrically connected to the external connection terminal 205B.
  • the metal pins 701A and 701B can repeat contact and non-contact with the external connection terminals 205A and 205B.
  • the external connection terminals 205A and 205B can be connected to the circuit board 800 via the metal pins 701A and 701B, and can be connected to the power supply and control unit 900 via the circuit board 800. As a result, a voltage can be applied to the biological sample analysis chip 500 from the power source 910 of the power source and control unit 900.
  • the biological sample analysis chip 500 has a disposable configuration, the external connection terminals 205A and 205B and the metal pins 701A and 701B can be repeatedly contacted and non-contacted. Therefore, the biological sample analysis chip 500 can be replaced.
  • the biological sample analysis chip 500 is placed on the socket 700 of the circuit board 800, thereby enabling analysis.
  • This configuration does not require soldering, and the biological sample analysis chip 500 can be repeatedly attached and detached.
  • the first liquid tank 102 and the second liquid tanks 201 ⁇ / b> A and 201 ⁇ / b> B are filled with the electrolyte solution, so that the electrolyte solution contacts both surfaces of the membrane 100.
  • the solution is introduced through the flow path 202A1 or the flow path 202A2
  • the solution is introduced from the flow path 202B1 or the flow path 202B2.
  • the biological sample analyzer may include a solution supply nozzle connected to the pump 610 of the liquid feeding device 600 as a mechanism for introducing the solution.
  • the solution supply nozzle has a configuration that can be inserted into the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2.
  • the solution supply nozzle may be disposed in the vicinity of the ends of the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2.
  • the solution supply nozzle may be configured to be inserted into the ends of the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2, or configured to be in contact with the ends of the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, 202B2. May be.
  • FIG. 9 is a schematic cross-sectional view of a biological sample analyzer having a solution supply nozzle.
  • the circuit board 800 has an opening at the center thereof. According to this configuration, since the cavity is provided under the biological sample analysis chip 500, the solution supply nozzle 630 can be inserted into the flow paths 202A1, 202A2, 202B1, and 202B2 through the cavity.
  • the biological sample 510 is introduced into the first liquid tank 102. Thereafter, using the power supply and control unit 900 and the circuit board 800, voltages are independently applied to the second electrodes 203A and 203B. As a result, the biological sample 510 passes through the pores 105A and 105B. By applying a voltage, an electric field is generated around the pores 105A and 105B, and an electrophoretic force that draws the biological sample 510 charged in the liquid to the electric field is generated. The movement of the biological sample 510 is controlled by this electrophoresis force.
  • the detected current value changes between before the biological sample 510 passes through the pores 105A and 105B and between when the biological sample 510 passes through the pores 105A and 105B. This is because the pores 105A and 105B are partially blocked by the cross-sectional area of the biological sample 510, and the resistance values of the pores 105A and 105B change.
  • the PC 920 of the power supply and control unit 900 detects and records a change in current value generated in each of the pores 105A and 105B independently and in parallel.
  • the biological sample analysis method when the number of arrays is two is realized. If this method is used, the arrayed biological sample analysis chip can be measured in parallel, and the analysis throughput can be improved.
  • the effectiveness of the present invention is not limited to this case.
  • the movement of the biological sample 510 is controlled only by the force of electrophoresis, but the movement of the biological sample 510 can also be controlled using a drive mechanism.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view of a biological sample analyzer having a drive mechanism. Only the differences from the apparatus configuration and analysis method of the above embodiment will be described below.
  • the biological sample analyzer further includes a drive mechanism 520 to which the biological sample is fixed and which controls the distance between the membrane 100 and the biological sample 510.
  • the drive mechanism 520 may include a motor and a piezoelectric element.
  • the biological sample 510 fixed to the drive mechanism 520 is introduced into the first liquid tank 102.
  • the biological sample 510 is passed through the pores 105A and 105B.
  • voltages are independently applied to the second electrodes 203A and 203B.
  • the pores 105A and 105B are partially blocked, and the resistance values of the pores 105A and 105B change.
  • the PC 920 of the power supply and control unit 900 detects and records a change in current value generated in each of the pores 105A and 105B independently and in parallel. According to this configuration, the speed at which the biological sample 510 passes through the pores 105A and 105B can be easily controlled, and the reading accuracy can be improved.
  • the liquid tank, the flow path, the electrodes, and the wiring can be integrated in the array of the solid nanopore sequencer.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes various modifications.
  • the above embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment.
  • the structure of another Example can also be added to the structure of a certain Example.
  • another configuration can be added, deleted, or replaced.
  • the functions of the measurement unit, the processing unit, and the like may be realized by software by the processor interpreting and executing a program that realizes each function.
  • Information such as programs, tables, and files for realizing each function can be stored in various types of non-transitory computer-readable media.
  • the non-transitory computer-readable medium for example, a flexible disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a hard disk, an optical disk, a magneto-optical disk, a CD-R, a magnetic tape, a nonvolatile memory card, a ROM, and the like are used.
  • control lines and information lines indicate what is considered necessary for the explanation, and not all the control lines and information lines on the product are necessarily shown. All the components may be connected to each other.
  • membrane 101 first substrate 102: first liquid tank 103: support material 104: first electrode 105A, 105B: pore 200: second substrate 201A, 201B: second liquid tank 202A1, 202A2 202B1, 202B2: flow paths 203A, 203B: second electrodes 204A, 204B: wirings 205A, 205B: external connection terminals 300: insulating layer 500: biological sample analysis chip 510: biological sample 520: drive mechanism 600: liquid delivery device 800: Circuit board 900: Power supply and control unit

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Abstract

　生体試料分析チップは、第１の基板と、前記第１の基板に配置されたメンブレンと、第１の電極を備える第１の液槽と、少なくとも１つの流路と第２の電極とをそれぞれ備える複数の第２の液槽と、前記第１の基板の下方に配置された第２の基板とを備え、前記複数の第２の液槽間は実質的に絶縁されており、前記第１の基板に配置された前記メンブレンは、前記第１の液槽の一部及び前記複数の第２の液槽の一部を構成するように前記第１の液槽と前記複数の第２の液槽との間に配置されており、前記第２の基板は、前記少なくとも１つの流路と前記第２の電極とを備え、前記複数の第２の液槽の一部を構成している。

Description

生体試料分析チップ、生体試料分析装置、及び生体試料分析方法
　本発明は、生体試料分析チップ、生体試料分析装置、及び生体試料分析方法に関する。
　ＤＮＡやタンパク質などの生体試料を分析する生体試料分析装置として封鎖電流方式のナノポアシーケンサの開発が進められている。
　封鎖電流方式のナノポアシーケンサは、生体試料と同程度の大きさの細孔を有する薄膜のメンブレンと、メンブレンの上下に配置された、電極を有する液槽とから構成される。このような構成において、液槽が溶液で満たされ、液槽の片側から生体試料が導入される。そして、電極には電圧が印加され、生体試料が細孔を通過する際に両電極間に流れる電流値の変化が計測される。このような計測により、生体試料の構造的な特徴を判定する。
　現在の、封鎖電流方式のナノポアシーケンサの形成方法は、「バイオ式」と「ソリッド式」の２種類に大きく分かれる。バイオ式は、生体分子を用いる手法である。バイオ式では、まず、溶液で満たした液槽に両親媒性の脂質２重膜を乗せたメンブレンが配置される。次に、脂質２重膜のメンブレンにナノメートルサイズの細孔を有する改変タンパク質（Mycrobacterium smegmatis porin A等）を浮かばせることにより、細孔が形成される。バイオ式は、使用するタンパク質及び脂質２重膜などが変性しやすいという問題を有する。したがって、生体分子を扱わないソリッド式に期待が寄せられている。
　ソリッド式は、機械強度の強い材料及びプロセスを使う手法である。ソリッド式では、例えばシリコン窒化膜がメンブレンとして用いられ、電子線の照射又は電圧の印加により、メンブレンにナノメートルサイズの細孔が形成される。
　ナノポアシーケンサにおける一つの課題は、読み取り精度が低く、精度向上のために読み取り速度を遅くする必要がある点、また、同じ構造を複数回読むことを必要とし、単独のシーケンサとしてスループットを向上させることが難しい点である。そこで、複数のナノポアシーケンサをアレイ状に配置し、生体分子の構造を並行して計測することが有効な手段となる。ナノポアシーケンサのアレイ化構造では、細孔のみならず、付随する液槽、電極等の周辺構造も並列化する必要がある。
　バイオ式のナノポアシーケンサに関しては、シーケンサがアレイ化された構成の開発が進んでいる。例えば、特許文献１は、バイオ式における液槽の並列化手法を開示している。特許文献１では、並列したウェル間で連続している極性液体の余剰分を無極性液体で置換することで複数の独立した液槽が形成され、極性液体でサンドイッチされた無極性液体層に、両親媒性の脂質２重膜でできたメンブレンが、後から自己組織的に形成される。
　一方、一般的なソリッド式のナノポアシーケンサでは、シリコン窒化膜に代表される機械強度の強い材料が基板に成膜され、次に、開口を基板に形成することによりシリコン窒化膜を露出させる。これにより、メンブレンを持つ基板が形成される。そして、メンブレンを持つ基板の上下に、液槽を構成する部材が取付けられる。液槽には、少なくとも２つの流路（例えば、溶液を導入するための流路と、液槽内に存在する気体及び余分な液体を排出するための流路）が設けられる。
　例えば、特許文献２は、ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化について開示している。特許文献２は、液槽に接続する２つの流路のうち一方の流路が電極を兼ねる構造を開示している。
国際公報２０１４／０６４４４３号 特開２０１２－２６９８６号公報
　特許文献１の方法に関しては、メンブレンの材料に流動性及び両親媒性が備わっていなければ、上下に配置した液槽の間にメンブレンを設けることができない。上記ソリッド式のナノポアシーケンサでは、シリコン窒化膜に代表される機械強度の強い材料がメンブレンとして用いられるため、特許文献１の方法をソリッド式のナノポアシーケンサに適用することができない。
　ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化を行う場合、アレイを構成する各シーケンサに対して構成要素（液槽、流路、電極など）を独立して提供し、且つ、これらの構成要素を集積化することが必要である。しかし、特許文献２は、構成要素（液槽、電極など）を単に並列に配列することしか開示しておらず、このような構成は、アレイ面積を増大させることになり、結果として、シーケンサの集積化及び並列化を阻害する要因となる。
　また、特許文献２には、並列する液槽間のアイソレーション方法、及び、電極のそれぞれに接続する配線の構成が何ら記載されていない。したがって、ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化に関して、シーケンサの集積化及び並列化を可能とする構成が求められている。
　そこで、本発明は、ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化において、液槽、流路、電極などを集積化及び並列化する技術を提供する。
　例えば、上記課題を解決するために、請求の範囲に記載の構成を採用する。本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例をあげるならば、第１の基板と、前記第１の基板に配置されたメンブレンと、第１の電極を備える第１の液槽と、少なくとも１つの流路と第２の電極とをそれぞれ備える複数の第２の液槽と、前記第１の基板の下方に配置された第２の基板とを備え、前記複数の第２の液槽間は実質的に絶縁されており、前記第１の基板に配置された前記メンブレンは、前記第１の液槽の一部及び前記複数の第２の液槽の一部を構成するように前記第１の液槽と前記複数の第２の液槽との間に配置されており、前記第２の基板は、前記少なくとも１つの流路と前記第２の電極とを備え、前記複数の第２の液槽の一部を構成している、生体試料分析チップが提供される。
　本発明によれば、ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化において、液槽、流路、電極などを集積化及び並列化することができる。なお、本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。
実施例１における生体試料分析チップの要部断面模式図である。 実施例１における生体試料分析チップの要部断面模式図であり、メンブレンに細孔が形成された状態を示す図である。 実施例１における第２の基板の平面レイアウト図である。 実施例２における生体試料分析チップの要部断面模式図である。 実施例３における生体試料分析チップの要部断面模式図である。 実施例４における生体試料分析チップの要部断面模式図である。 実施例５における生体試料分析装置を説明する要部ブロック図である。 実施例５における生体試料分析装置を説明する要部断面模式図である。 実施例５における、溶液供給ノズルを有する生体試料分析装置の一例の断面模式図である。 実施例５における、駆動機構を有する生体試料分析装置の一例の断面模式図である。
　以下、図面を用いて本発明の実施例について説明する。各図面は模式的に描いており、説明に不用な箇所は省略している。実施例に記載する構造、材料、及び形成方法は、本発明の思想を具現化するための一例であり、材料及び寸法などを厳密に特定するものではない。
＜実施例１＞
　以下では、アレイ数が２つの場合の生体試料分析チップの実施例について説明する。当然ながら、生体試料分析チップのアレイ数は２つ以上であってもよい。
　図１は、実施例１における生体試料分析チップの断面模式図を示す。生体試料分析チップは、主に、メンブレン１００と、第１の基板１０１と、サポート材１０３と、第２の基板２００とから構成されている。
　生体試料分析チップは、さらに、第１の液槽１０２と、複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂと、第１の電極１０４と、複数の流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２と、複数の第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂと、複数の配線２０４Ａ、２０４Ｂと、複数の外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂとを備える。
　メンブレン１００は、第１の基板１０１上に配置されている。また、サポート材１０３が、第１の基板１０１上に配置されている。第１の液槽１０２は、メンブレン１００の上方に配置された空間である。より詳細には、第１の液槽１０２は、メンブレン１００とサポート材１０３とによって形成される空間である。第１の電極１０４は、第１の液槽１０２に配置されている。
　複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂは、メンブレン１００の下方に配置された空間である。より詳細には、複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂは、メンブレン１００と第１の基板１０１と第２の基板２００とによって形成される空間である。第１の基板１０１は、複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂの一部を構成するように複数の開口部１０１Ａ、１０１Ｂを備える。複数の開口部１０１Ａ、１０１Ｂの内壁と、メンブレン１００と、第２の基板２００の第１の面２００Ａによって囲まれた空間が、複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂとなる。
　上記のように、第１の基板１０１に配置されたメンブレン１００は、第１の液槽１０２の一部及び複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂの一部を構成するように第１の液槽１０２と複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂとの間に配置されている。
　メンブレン１００は、複数の細孔１０５Ａ、１０５Ｂを有する。図１は、細孔１０５Ａ、１０５Ｂがメンブレン１００に形成される前の状態を示しており、図２は、細孔１０５Ａ、１０５Ｂがメンブレン１００に形成された状態を示している。本例では、複数の細孔１０５Ａ、１０５Ｂは分析の直前に形成される。細孔１０５Ａ、１０５Ｂの形成方法については後述する。なお、別の例として、細孔１０５Ａ、１０５Ｂはメンブレン１００に予め形成されていてもよい。
　メンブレン１００は、第１の液槽１０２と第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂの間において第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂ毎に複数の区画に分けられている。本例では、第１の液槽１０２に対して２つの第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂが設けられているため、メンブレン１００は２つの区画を有する。メンブレン１００は、当該区画毎に細孔１０５Ａ、１０５Ｂを備える。すなわち、複数の細孔１０５Ａ、１０５Ｂは、第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂに対応するように設けられている。
　第２の基板２００は、第１の基板１０１の下方に配置されている。本実施例では、第１の基板１０１と第２の基板２００は、直接接触している。本実施例では、第２の基板２００は、プリント基板で構成されている。第２の基板２００は、絶縁性を有するプリント基板であればよい。第２の基板２００には、その表面又は表面とその内部に、以下で説明する電極及び配線構成が形成されている。
　第２の基板２００は、複数の流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２と、複数の第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂと、複数の配線２０４Ａ、２０４Ｂと、複数の外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂとを備える。
　複数の流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２は、第２の基板２００を貫通する貫通孔である。第２の液槽２０１Ａに対して２つの流路２０２Ａ１、２０２Ａ２が設けられており、第２の液槽２０１Ｂに対して２つの流路２０２Ｂ１、２０２Ｂ２が設けられている。なお、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２は、この構造に限定されず、外部と第２の液槽とを接続するような形式で形成されればよい。なお、この例では、第２の液槽ごとに２つの流路が設けられているが、１つの第２の液槽に対して少なくとも１つの流路が設けられればよい。
　第２の電極２０３Ａは、第２の液槽２０１Ａ内で、且つ、第２の基板２００の第１の面２００Ａ上に配置されている。第２の電極２０３Ｂは、第２の液槽２０１Ｂ内で、且つ、第２の基板２００の第１の面２００Ａ上に配置されている。
　外部接続端子２０５Ａは、第２の電極２０３Ａが配置された第１の面２００Ａとは反対側の第２の面２００Ｂ上に配置されている。外部接続端子２０５Ａは、配線２０４Ａを介して第２の電極２０３Ａに接続されている。また、外部接続端子２０５Ｂは、第２の電極２０３Ｂが配置された第１の面２００Ａとは反対側の第２の面２００Ｂに配置されている。外部接続端子２０５Ｂは、配線２０４Ｂを介して第２の電極２０３Ｂに接続されている。
　図１及び図２に記載の生体試料分析チップの作成手順について説明する。まず、第１の基板１０１が準備され、シリコン窒化膜が第１の基板１０１上に設けられる。次に、第１の基板１０１の裏面からドライエッチングとウェットエッチングを用いて第１の基板１０１に開口部１０１Ａ、１０１Ｂが形成される。これにより、複数のウィンドウを持つシリコン窒化膜のメンブレン１００が形成される。
　次に、第２の基板２００に、プリント基板多層配線技術を用いて、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂと、第２の電極２０３Ａに繋がる配線２０４Ａと、第２の電極２０３Ｂに繋がる配線２０４Ｂと、配線２０４Ａに繋がる外部接続端子２０５Ａと、配線２０４Ｂに繋がる外部接続端子２０５Ｂと、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２とが形成される。
　一例として、第２の基板２００には、絶縁体のガラスエポキシ基板が使用される。配線２０４Ａ、２０４Ｂには、銅が使用される。第２の基板２００の複数の層間を繋ぐ垂直方向に伸びる部分には、金属ビアが形成される。外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂには、銅と金の積層膜が使用される。外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂは、第２の基板２００の外周部（ここでは、第２の面２００Ｂの外周部）に配置される。第２の基板２００には、複数のスルーホールが流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２として形成される。この際、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２と、配線２０４Ａ、２０４Ｂとが重ならないようにレイアウトされる。
　図３は、上記手順で形成した第２の基板２００の平面レイアウト図の一部（第２の電極、水平方向に配置した配線、流路）を示す。ここで、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂは、第２の基板２００の表層（第１の面２００Ａ）に配置されている。配線２０４Ａ、２０４Ｂは、それぞれ、第２の基板２００の内層に配置されている。図３では描画されていないが、外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂは、それぞれ、第２の基板２００の反対側の表層（第１の面２００Ａとは反対側の第２の面２００Ｂ）に配置している。
　図１は、図３のＰ－Ｐ’間の断面図を示したものである。図３において、第２の電極２０３Ａと外部接続端子２０５Ａは、配線２０４Ａを介して繋がっており、配線２０４Ａは、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２を迂回するように形成されている（配線２０４Ａと流路２０２Ａ１、２０２Ａ２とは繋がっていない）。同様に、第２の電極２０３Ｂと外部接続端子２０５Ｂは、配線２０４Ｂを介して繋がっており、配線２０４Ｂは、流路２０２Ｂ１、２０２Ｂ２を迂回するように形成されている（配線２０４Ｂと流路２０２Ｂ１、２０２Ｂ２とは繋がっていない）。
　図１の説明に戻る。第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂには、電位安定性の良い銀－塩化銀ペーストが使用される。当該ペーストによって配線２０４Ａ、２０４Ｂの端部が被覆され、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂが形成される。その後、上記手順で形成した第１の基板１０１と第２の基板２００が、クランプを用いて結合される（合体させる）。
　第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂは、メンブレン１００と第１の基板１０１と第２の基板２００で形成される空間によって構成される。第２の液槽２０１Ａと第２の液槽２０１Ｂは、第１の基板１０１と第２の基板２００とによってそれぞれ独立した空間として構成され、第２の液槽２０１Ａと第２の液槽２０１Ｂとの間は実質的に絶縁されている。ここで、「実質的に絶縁」とは、本実施例に記載の生体試料分析チップを用いて分析を行う際に、メンブレン１００に開けられるナノメートルオーダーの細孔１０５Ａ、１０５Ｂで発生する抵抗値よりも、第２の液槽２０１Ａと第２の液槽２０１Ｂとの間の抵抗値の方が大きく、細孔１０５Ａ、１０５Ｂに流れる電流値の測定に支障がないレベルに絶縁されていることを意味する。
　上記のクランプによる結合によって、第２の液槽２０１Ａには、第２の電極２０３Ａが配置される。また、第２の液槽２０１Ａには、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２が接続される。同様に、第２の液槽２０１Ｂには、第２の電極２０３Ｂが配置される。また、第２の液槽２０１Ｂには、流路２０２Ｂ１、２０２Ｂ２が接続される。
　次に、第１の基板１０１上に、壁状のサポート材１０３が取り付けられ、これにより、第１の液槽１０２が形成される。本実施例では、第１の液槽１０２は、第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂに対して共通の液槽である。そして、第１の電極１０４が第１の液槽１０２に導入される。第１の電極１０４は、銀－塩化銀の棒である。
　次に、第１の液槽１０２及び第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂに電解質の溶液が充填され、メンブレン１００の両面を電解質溶液に接触させる。第２の液槽２０１Ａには、流路２０２Ａ１又は流路２０２Ａ２から溶液が導入される。また、第２の液槽２０１Ｂには、流路２０２Ｂ１又は流路２０２Ｂ２から溶液が導入される。
　その後、第１の電極１０４と、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂとの間に電圧が印加される。これにより、メンブレン１００に、ナノメートルサイズの細孔１０５Ａ、１０５Ｂが形成される。より詳細には、溶液の充填に続いて、第１の電極１０４がグラウンドに接地され、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂ間にパルス状の電圧が印加される。絶縁破壊のメカニズムによりメンブレン１００に、ナノメートルサイズの細孔１０５Ａ、１０５Ｂが形成される。細孔１０５Ａ、１０５Ｂの径は、細孔１０５Ａ、１０５Ｂに流れる電流値が大きいほど大きくなることから、電流値で制御される（Itaru Yanagi et al.、 Sci. Rep. 4、 5000 (2014)、及び、国際公開２０１５／０９７７６５号参照）。
　上記手順を経て、図１に示すアレイ数が２つの場合の生体試料分析チップが実現される。この手法を用いれば、液槽、流路、電極及び配線の集積化が可能となる。
　本実施例の生体試料分析チップは、メンブレン１００を備える第１の基板１０１と、複数のスルーホール（流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２）と複数の第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂをアレイ状に配置した第２の基板２００とを備える。また、第２の基板２００には、複数の第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂに接続する配線２０４Ａ、２０４Ｂと、複数の外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂが設けられている。このような構成によれば、ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化において、液槽、流路、電極及び配線を集積化及び並列化を実現することができる。
　また、第２の基板２００が絶縁体のプリント基板で構成される場合、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２を第２の基板２００のスルーホールとして構成するだけで、第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂ間の絶縁が可能となる。
　また、多層配線技術を用いて第２の基板２００を形成することにより、アレイ規模が拡大した場合でも、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂのそれぞれから配線を外部に取り出すことが可能となる。
　以上が本実施例による生体試料分析チップの作成手順であるが、本発明の有効性はこの場合に限定されるわけではない。例えば、メンブレン１００には、シリコン窒化膜が用いられたが、メンブレン１００として、シリコン酸化膜、グラフェン、グラファイト、有機物質、又は高分子材料などが用いられてもよい。
　本実施例の電極には銀－塩化銀電極が用いられたが、電極の材料として、例えば白金、金などの他の金属が用いられてもよい。また、第２の基板２００にはガラスエポキシが用いられたが、例えばテフロンなどの他の絶縁体が用いられてもよい。
　本実施例では、第１の液槽１０２のサポート材１０３が壁状の形状であり、第１の液槽１０２の上部に大きな開口部が設けられているが、この構成に限定されない。例えば、第１の液槽１０２が天井を有する構成、又は、第１の液槽１０２のサポート材１０３が第２の基板２００上に設けられる構成などの他の構造であってもよい。
　本実施例では、細孔１０５Ａ、１０５Ｂは、メンブレン１００に電圧を印加することにより形成されたが、これに限定されない。細孔１０５Ａ、１０５Ｂは、電子線をメンブレン１００に照射するなどの他の方法によって形成されてもよい（A. J. Storm et al.、 Nat. Mat. 2 (2003)参照）。
　本実施例では、第１の基板１０１と第２の基板２００の合体はクランプで行ったが、第１の基板１０１と第２の基板２００が直接接着されてもよい。
＜実施例２＞
　図４は、実施例２における生体試料分析チップの断面模式図を示し、第１の基板１０１と第２の基板２００との間に絶縁層を挟んだ構造を有する生体試料分析チップの断面模式図を示す。上述の実施例１で説明した構成要素については、同じ符号を付して説明を省略する。
　本実施例では、絶縁層３００が、第１の基板１０１と第２の基板２００との間に配置されている。このように、第１の基板１０１は、絶縁層３００を介して第２の基板２００上に配置されてもよい。
　以下では、実施例１の形成手順と異なる点のみを説明する。プリント基板の配線技術を用いて、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂ、配線２０４Ａ、２０４Ｂ、外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂ、及び流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２が第２の基板２００に形成される。その後、パターニングした絶縁層３００が第２の基板２００上に成膜される。絶縁層３００は、複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂに対応するように複数の開口部３００Ａ、３００Ｂを備える。ここで、絶縁層３００には樹脂が用いられる。その後、メンブレン１００を形成した第１の基板１０１が絶縁層３００上に接着される。
　本実施例では、絶縁層３００が、複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂの一部を構成する。複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂは、メンブレン１００と第１の基板１０１と絶縁層３００と第２の基板２００とによって形成される空間である。
　上記手順により、図４に示すアレイ数が２つの場合の生体試料分析チップが実現される。実施例１と比較して、第１の基板１０１及び第２の基板２００をクランプする機構が不要となり、取扱いが簡便となる。なお、絶縁層３００は、第２の基板２００に成膜された後にパターニングされてもよい。
＜実施例３＞
　図５は、実施例３における生体試料分析チップの断面模式図を示す。上記の実施例では、メンブレン１００を成膜した側と反対側の第１の基板１０１の面を第２の基板２００と接触させたが、本実施例では、第１の基板１０１のメンブレン１００を成膜した側の面を第２の基板２００側に配置する。
　以下では、実施例２の形成手順と異なる点のみを説明する。プリント基板の配線技術を用いて、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂ、配線２０４Ａ、２０４Ｂ、外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂ、及び流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２が第２の基板２００に形成される。その後、パターニングした絶縁層３００が第２の基板２００上に成膜される。絶縁層３００には樹脂が用いられる。次に、メンブレン１００を備える第１の基板１０１が、メンブレン１００を成膜した側の面を下にした状態で、絶縁層３００に接着される。
　本実施例では、第１の基板１０１が、第１の液槽１０２の一部を構成する。第１の液槽１０２は、メンブレン１００と第１の基板１０１とサポート材１０３とによって形成される空間である。また、複数の第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂは、メンブレン１００と絶縁層３００と第２の基板２００とによって形成される空間である。
　上記手順により、図５に示すアレイ数が２つの場合の生体試料分析チップが実現される。なお、絶縁層３００は、第２の基板２００に成膜された後にパターニングされてもよい。
＜実施例４＞
　図６は、実施例４における生体試料分析チップの断面模式図を示す。上記の実施例１～３の配線２０４Ａ、２０４Ｂにおいて、第２の基板２００の複数の層間を繋ぐ垂直方向に伸びる部分は金属ビアで構成されている。これに対して、本実施例では、第２の基板２００の複数の層間を繋ぐ垂直方向に伸びる部分が、めっきスルーホール法で形成されている。
　以下では、実施例１の形成手順と異なる点のみを説明する。プリント基板の配線技術を用いて、外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂと、配線２０４Ａ、２０４Ｂとが形成される。その後、流路２０２Ａ１、２０２Ｂ１の領域にスルーホール（貫通孔）が形成され、これにより、流路２０２Ａ１、２０２Ｂ１の壁面に配線２０４Ａ、２０４Ｂの一部が露出される。
　貫通孔の内壁には、金属膜が配置される。一例として、貫通孔の内壁には、銅めっきと金めっきが施される。金属でめっきされた部分が、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂの一部として使用される。これにより、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂが、それぞれ、配線２０４Ａ、２０４Ｂに接続される。その後、第２の基板２００に２つの別のスルーホールが形成される。これらのスルーホールは、流路２０２Ａ２、２０２Ｂ２として使用される。
　上記手順により、図６に示すアレイ数が２つの場合の生体試料分析チップが実現される。他の実施例と比較して、ビアの分の面積が抑えられる効果がある。なお、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂはスルーホールの内壁に形成されるため、スルーホールの内壁に対して成膜可能で、且つ被覆性が良い電極材料が、本実施例に採用されればよい。
　なお、本実施例は、絶縁層３００を備える実施例２、３にも適用可能である。この場合、上記のスルーホールの形成手順の後に、パターニングした絶縁層３００が第２の基板２００上に成膜される。
＜実施例５＞
　以下では、実施例１～４に記載の生体試料分析チップを用いた生体試料分析装置及び生体試料分析法の実施例について説明する。図７は、実施例５における生体試料分析装置を説明するブロック図であり、図８は、生体試料分析装置の断面模式図である。
　生体試料分析装置は、生体試料分析チップ５００と、送液装置６００と、回路ボード（制御回路）８００と、電源及び制御ユニット９００とを備える。
　生体試料分析チップ５００は、上記で説明した実施例１～４の生体試料分析チップに対応する。図８は、一例として、実施例２に対応する生体試料分析チップを示す。
　回路ボード８００は、アンプ８１０と、スイッチ８２０と、アナログデジタル変換回路等の制御回路部８３０とを備え、生体試料分析のシーケンスを司る。電源及び制御ユニット９００は、電源９１０と、ＰＣ（Personal Computer）９２０とを備える。電源及び制御ユニット９００は、送液装置６００及び回路ボード８００に接続されている。
　電源９１０は、第１の電極１０４と第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂの間に電圧を印加するために使用される。回路ボード８００は、第１の電極１０４と第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂの間ごとに電圧を独立して制御する。ＰＣ９２０は、電源９１０及び当該装置の各構成要素など制御し、装置全体の制御（送液の制御、回路ボード８００への電源の供給、測定開始の入力など）を行う。また、ＰＣ９２０は、第１の電極１０４と第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂの間ごとに電流値を独立して測定する測定部の機能も備える。
　ＰＣ９２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）などのプロセッサと、メモリと、ハードディスクなどの記憶部を少なくとも備える。ＰＣ９２０は、第１の電極１０４と第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂの間に印加する電圧、及び、第１の電極１０４と第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂの間の電流値（生体試料が細孔１０５Ａ、１０５Ｂを通過したときの電流値の変化）を測定し、記憶部に記録する。ＰＣ９２０は、計測される電流値を用いて生体試料の構造上の特徴を検出する。
　なお、図７の例は一例であり、この構成に限定されない。例えば、回路ボード８００のアナログデジタル変換回路は、電源及び制御ユニット９００内に配置してもよく、装置のバリエーションは様々である。測定環境に適した系が構築されればよい。
　送液装置６００は、ポンプ６１０とタンク６２０とを備え、生体試料分析チップ５００の第１の液槽１０２及び第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂへの溶液の供給を行うものである。送液装置６００における液量の制御及び溶液を供給するタイミングは、電源及び制御ユニット９００によって制御される。
　装置運用コストを下げるためには、生体試料分析チップ５００が使い捨て可能な構成であり、生体試料分析チップ５００が、予め用意されている回路ボード８００に対して取り外し可能に構成されていることが望ましい。
　図８は、生体試料分析チップ５００が回路ボード８００に対して取り外し可能に構成された機構を示す。取り外し機構として、回路ボード８００は、ソケット７００を備える。ソケット７００には、金属の凸部を有する金属ピン（接続部）７０１Ａ、７０１Ｂが設けられている。金属ピン７０１Ａは外部接続端子２０５Ａと電気的に接続可能であり、金属ピン７０１Ｂは外部接続端子２０５Ｂと電気的に接続可能である。また、金属ピン７０１Ａ、７０１Ｂは、外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂに対して接触及び非接触を繰り返すことが可能である。
　外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂは、金属ピン７０１Ａ、７０１Ｂを介して回路ボード８００に接続し、また、回路ボード８００を介して電源及び制御ユニット９００に接続することができる。これにより、電源及び制御ユニット９００の電源９１０から生体試料分析チップ５００に対して電圧の印加が可能となる。生体試料分析チップ５００が使い捨て可能な構成の場合、外部接続端子２０５Ａ、２０５Ｂと金属ピン７０１Ａ、７０１Ｂとは接触及び非接触を繰り返すことが可能である。したがって、生体試料分析チップ５００の取り替えを行うことができる。
　この構成によれば、生体試料分析チップ５００を回路ボード８００のソケット７００上に配置することにより、分析が可能となる。この構成は、はんだ付けが不要であり、生体試料分析チップ５００の着脱を繰り返すことが可能となる。
　本実施例の生体試料分析装置を用いて、生体試料の分析を行う例を説明する。まず、第１の液槽１０２、及び、第２の液槽２０１Ａ、２０１Ｂに電解質の溶液が充填され、これにより、電解質の溶液がメンブレン１００の両面に接触する。第２の液槽２０１Ａについては、流路２０２Ａ１又は流路２０２Ａ２を介して溶液が導入され、第２の液槽２０１Ｂについては、流路２０２Ｂ１又は流路２０２Ｂ２から溶液が導入される。生体試料分析装置は、溶液を導入する機構として、送液装置６００のポンプ６１０に繋がった溶液供給ノズルを備えてもよい。溶液供給ノズルは、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２に挿入可能な構成を備える。
　溶液供給ノズルは、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２の端部の近傍に配置されてもよい。また、溶液供給ノズルは、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２の端部に挿入させるような構成でもよいし、流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２の端部を内包して接触するように構成されてもよい。
　図９は、溶液供給ノズルを有する生体試料分析装置の断面模式図である。本実施例では、回路ボード８００が、その中心部において開口部を有する。この構成によれば、生体試料分析チップ５００の下に空洞部が設けられるため、この空洞部を介して溶液供給ノズル６３０を流路２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２に挿入することができる。
　図８の説明に戻る。上記手順の後に、第１の液槽１０２に生体試料５１０が導入される。その後、電源及び制御ユニット９００と回路ボード８００とを用いて、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂに電圧が独立して印加される。これにより、生体試料５１０が細孔１０５Ａ、１０５Ｂを通過する。電圧を印加することにより、細孔１０５Ａ、１０５Ｂの周辺に電場が発生し、液中でチャージした生体試料５１０が電場に引き寄せられる電気泳動の力が発生する。生体試料５１０の移動は、この電気泳動の力により制御される。ここで、検出される電流値は、生体試料５１０が細孔１０５Ａ、１０５Ｂを通過する前と、生体試料５１０が細孔１０５Ａ、１０５Ｂを通過中との間で変化する。生体試料５１０の断面積により、細孔１０５Ａ、１０５Ｂが一部封鎖され、細孔１０５Ａ、１０５Ｂの抵抗値が変化するためである。電源及び制御ユニット９００のＰＣ９２０は、細孔１０５Ａ、１０５Ｂのそれぞれで発生する電流値の変化を独立及び並行して検出し、記録する。
　上記手順を経て、アレイ数が２つの場合の生体試料分析法が実現される。この手法を用いれば、アレイ化した生体試料分析チップを並行して計測し、分析スループットを向上させることができる。ただし、本発明の有効性はこの場合に限定されるわけではない。例えば、本実施例では、電気泳動の力のみで生体試料５１０の移動を制御したが、駆動機構を用いて生体試料５１０の移動を制御することも可能である。
　図１０は、駆動機構を有する生体試料分析装置の断面模式図を示す。以下では、上記の実施例の装置構成及び分析手法と異なる点のみを説明する。生体試料分析装置は、生体試料が固定され、メンブレン１００と生体試料５１０との距離を制御する駆動機構５２０をさらに備える。例えば、上記機能を実現するために、駆動機構５２０は、モータとピエゾ素子を備えてもよい。
　分析方法について説明する。上記の実施例で記載の方法でメンブレン１００に細孔１０５Ａ、１０５Ｂが形成された後、駆動機構５２０に固定した生体試料５１０を第１の液槽１０２に導入する。駆動機構５２０をメンブレン１００に向かって移動させることにより、生体試料５１０を細孔１０５Ａ、１０５Ｂに通過させる。また、電源及び制御ユニット９００と回路ボード８００とを用いて、第２の電極２０３Ａ、２０３Ｂに電圧が独立して印加される。ここで、生体試料５１０の断面積により、細孔１０５Ａ、１０５Ｂが一部封鎖され、細孔１０５Ａ、１０５Ｂの抵抗値が変化する。電源及び制御ユニット９００のＰＣ９２０は、細孔１０５Ａ、１０５Ｂのそれぞれで発生する電流値の変化を独立及び並行して検出し、記録する。この構成によれば、生体試料５１０が細孔１０５Ａ、１０５Ｂを通過する際の速度が制御しやすくなり、読み取り精度を向上させることができる。
　以上の実施例１～５によれば、ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化において、液槽、流路、電極及び配線を集積化することができる。また、複数のシーケンサを独立且つ並行して計測することを可能にし、分析スループットを向上させることができる。
　本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。上記実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることもできる。また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また、各実施例の構成の一部について、他の構成を追加・削除・置換することもできる。
　上記の測定部の機能、処理部等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、様々なタイプの非一時的なコンピュータ可読媒体(non-transitory computer readable medium)に記憶させることが可能である。非一時的なコンピュータ可読媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－Ｒ、磁気テープ、不揮発性のメモリカード、ＲＯＭなどが用いられる。また、上記の測定部の機能、処理部等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。
　上記の実施例において、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。全ての構成が相互に接続されていてもよい。
１００：メンブレン
１０１：第１の基板
１０２：第１の液槽
１０３：サポート材
１０４：第１の電極
１０５Ａ、１０５Ｂ：細孔
２００：第２の基板
２０１Ａ、２０１Ｂ：第２の液槽
２０２Ａ１、２０２Ａ２、２０２Ｂ１、２０２Ｂ２：流路
２０３Ａ、２０３Ｂ：第２の電極
２０４Ａ、２０４Ｂ：配線
２０５Ａ、２０５Ｂ：外部接続端子
３００：絶縁層
５００：生体試料分析チップ
５１０：生体試料
５２０：駆動機構
６００：送液装置
８００：回路ボード
９００：電源及び制御ユニット

Claims (15)

  1. 　第１の基板と、
    　前記第１の基板に配置されたメンブレンと、
    　第１の電極を備える第１の液槽と、
    　少なくとも１つの流路と第２の電極とをそれぞれ備える複数の第２の液槽と、
    　前記第１の基板の下方に配置された第２の基板とを備え、
    　前記複数の第２の液槽間は実質的に絶縁されており、
    　前記第１の基板に配置された前記メンブレンは、前記第１の液槽の一部及び前記複数の第２の液槽の一部を構成するように前記第１の液槽と前記複数の第２の液槽との間に配置されており、
    　前記第２の基板は、前記少なくとも１つの流路と前記第２の電極とを備え、前記複数の第２の液槽の一部を構成していることを特徴とする生体試料分析チップ。
  2. 　請求項１に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記メンブレンは、前記複数の第２の液槽に対応する複数の細孔を備えることを特徴とする生体試料分析チップ。
  3. 　請求項１に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記少なくとも１つの流路が、前記第２の基板を貫通する貫通孔で構成されていることを特徴とする生体試料分析チップ。
  4. 　請求項３に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記貫通孔の内壁に金属膜が配置され、前記金属膜が前記第２の電極の一部を構成していることを特徴とする生体試料分析チップ。
  5. 　請求項１に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記第２の基板が、前記第２の電極のそれぞれに接続する複数の配線と、前記複数の配線に接続する複数の外部接続端子とを備えることを特徴とする生体試料分析チップ。
  6. 　請求項５に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記配線が、前記第２の基板の内部に配置された金属ビアを含むことを特徴とする生体試料分析チップ。
  7. 　請求項１に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記第２の基板が、絶縁性を有するプリント基板で構成されていることを特徴とする生体試料分析チップ。
  8. 　請求項１に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記第１の基板は、前記第２の基板の上に直接配置されるか、又は、絶縁層を介して配置されていることを特徴とする生体試料分析チップ。
  9. 　請求項１に記載の生体試料分析チップにおいて、
    　前記第１の基板上に配置されたサポート材をさらに備え、
    　前記サポート材が、前記第１の液槽の一部を構成していることを特徴とする生体試料分析チップ。
  10. 　請求項５に記載の生体試料分析チップと、
    　前記第１の電極と前記複数の第２の電極との間に電圧を印加する電源と、
    　前記複数の外部接続端子に接続可能であり、前記第１の電極と前記複数の第２の電極との間ごとに前記電圧を独立して制御する制御回路と、
    　前記第１の電極と前記複数の第２の電極との間ごとに電流値を独立して測定する測定部とを備えることを特徴とする生体試料分析装置。
  11. 　請求項１０に記載の生体試料分析装置において、
    　生体試料が固定され、前記メンブレンと前記生体試料との距離を制御する駆動機構をさらに備え、
    　前記メンブレンは、前記複数の第２の液槽に対応する複数の細孔を備え、
    　前記駆動機構を用いて、前記生体試料を前記複数の細孔に通過させることを特徴とする生体試料分析装置。
  12. 　請求項１０に記載の生体試料分析装置において、
    　前記制御回路は、前記外部接続端子に対して接触及び非接触を繰り返すことが可能な接続部を備えることを特徴とする生体試料分析装置。
  13. 　請求項１０に記載の生体試料分析装置において、
    　前記流路の端部から溶液を供給するノズルをさらに備えることを特徴とする生体試料分析装置。
  14. 　請求項１０に記載の生体試料分析装置を用いた生体試料分析方法であって、前記メンブレンは、前記複数の第２の液槽に対応する複数の細孔を備えており、
    　前記生体試料分析チップの前記第１の液槽と前記第２の液槽を電解液で満たすステップと、
    　生体試料を前記第１の液槽に導入するステップと、
    　前記第１の電極と前記複数の第２の電極の間のそれぞれに電圧を独立して印加し、前記複数の細孔の近傍に発生する電場を用いて前記生体試料を前記複数の細孔のそれぞれに通過させるステップと、
    　前記生体試料が前記複数の細孔のそれぞれを通過したときの電流値を独立して測定するステップと
    を含むことを特徴とする生体試料分析方法。
  15. 　請求項１０に記載の生体試料分析装置を用いた生体試料分析方法であって、前記メンブレンは、前記複数の第２の液槽に対応する複数の細孔を備えており、
    　前記生体試料分析チップの前記第１の液槽と前記第２の液槽を電解液で満たすステップと、
    　生体試料が固定された駆動機構を用いて、前記複数の細孔に前記生体試料を通過させるステップと、
    　前記第１の電極と前記複数の第２の電極の間のそれぞれに電圧を独立して印加するステップと、
    　前記生体試料が前記複数の細孔のそれぞれを通過したときの電流値を独立して測定するステップと
    を含むことを特徴とする生体試料分析方法。
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