WO2017135348A1 - 標的ｄｎａの測定方法 - Google Patents

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WO2017135348A1
WO2017135348A1 PCT/JP2017/003707 JP2017003707W WO2017135348A1 WO 2017135348 A1 WO2017135348 A1 WO 2017135348A1 JP 2017003707 W JP2017003707 W JP 2017003707W WO 2017135348 A1 WO2017135348 A1 WO 2017135348A1
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target dna
nucleic acid
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target
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達樹 松野
公一 阿部
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富士レビオ株式会社
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring target DNA.
  • Patent Document 1 discloses removing non-target nucleic acids from a mixed solution containing target nucleic acids and non-target nucleic acids.
  • Patent Document 2 discloses isolating or purifying a target nucleic acid from a mixed solution containing a target nucleic acid and a non-target nucleic acid.
  • the present inventors have found that there is a problem that the target DNA may not be analyzed properly if the genomic DNA is not completely cleaved. .
  • the target DNA may not be analyzed properly if the genomic DNA is not completely cleaved.
  • detecting a modified nucleobase present in the target DNA after a genomic DNA cleavage reaction by a restriction enzyme not only the modified nucleobase present in the target DNA but also the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the target DNA in the genomic DNA Modified nucleobases present in non-target DNA linked to the target DNA via one or more uncut sites in can also be detected.
  • the non-target DNA can efficiently complementarily bind to the target DNA in a single strand. There is a risk of disturbing the analysis.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of appropriately analyzing a target DNA after a genomic DNA cleavage reaction with a restriction enzyme.
  • Patent Documents 1 and 2 describe increasing the purity or concentration of the target nucleic acid, but after removing the incompletely cleaved DNA fragment containing the target DNA and after removing the incompletely cleaved DNA fragment containing the target DNA There is no description or suggestion about analyzing the target DNA.
  • a method for measuring target DNA including: (1) A genomic DNA is cleaved with a restriction enzyme in a solution, (a) a completely cleaved DNA fragment consisting of the target DNA, (b) an incompletely cleaved DNA fragment containing the target DNA, and (c) not containing the target DNA Obtaining a mixture containing DNA fragments; (2) (b) An incompletely cleaved DNA fragment containing the target DNA is removed from the mixture, and (a) a completely cleaved DNA fragment comprising the target DNA and (c) a DNA fragment not containing the target DNA are contained. Obtaining a solution; and (3) analyzing the target DNA in the solution obtained in (2) above.
  • nucleic acid probe specific for non-target DNA is the following nucleic acid probe: (1) a nucleic acid probe specific for 5 ′ adjacent DNA; (2) a nucleic acid probe specific for 3 ′ adjacent DNA; or (3) a combination of a nucleic acid probe specific for 5 ′ adjacent DNA and a nucleic acid probe specific for 3 ′ adjacent DNA.
  • the analysis is performed using a nucleic acid probe specific for the target DNA.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the modified nucleobase in the target DNA is analyzed.
  • [6] The method according to [5], wherein the modified nucleobase is methylcytosine.
  • [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the analysis is performed by immunoassay, mass spectrometry, electrochemical analysis, high performance liquid chromatography analysis, or nanopore analysis.
  • the method of the present invention can appropriately analyze a target DNA after a genomic DNA cleavage reaction with a restriction enzyme.
  • the method of the present invention is particularly useful when a restriction enzyme with low cleavage efficiency is used for cleavage of genomic DNA.
  • the method of the present invention is particularly useful when it is necessary to reduce the time for the genomic DNA cleavage reaction with a restriction enzyme in order to shorten the total time required for measuring the target DNA.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amount of uncleaved DNA after genomic DNA cleavage reaction with restriction enzymes at various reaction times.
  • FIG. 3 is a diagram showing the amount of uncleaved DNA captured by a nucleic acid probe specific to the target DNA.
  • FIG. 4 is a diagram showing the removal efficiency (relative evaluation of the uncut rate) of incompletely cut DNA fragments containing the target DNA using a nucleic acid probe specific for non-target DNA.
  • the method of the present invention is carried out by the following (1) to (3): (1) A genomic DNA is cleaved with a restriction enzyme in a solution, (a) a completely cleaved DNA fragment consisting of the target DNA, (b) an incompletely cleaved DNA fragment containing the target DNA, and (c) not containing the target DNA Obtaining a mixture containing DNA fragments; (2) (b) An incompletely cleaved DNA fragment containing the target DNA is removed from the mixture, and (a) a completely cleaved DNA fragment comprising the target DNA and (c) a DNA fragment not containing the target DNA are contained. Obtaining a solution; and (3) analyzing the target DNA in the solution obtained in (2) above.
  • genomic DNA used in the present invention is obtained from an arbitrary biological sample.
  • organisms from which such biological samples are derived include mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep), birds (eg, chickens) and the like.
  • mammals eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep
  • birds eg, chickens
  • Examples include animals, insects, microorganisms, plants, fungi, fish, and viruses.
  • a biological sample can also be a blood-related sample (eg, whole blood, serum, plasma), saliva, urine, milk, tissue or cell extract, or a mixture thereof, which is the blood itself or a sample derived from blood. Also good.
  • the biological sample may further be derived from a mammal suffering from a disease (eg, cancer, leukemia), or a mammal potentially having a disease.
  • a disease eg, cancer, leukemia
  • Genomic DNA can be appropriately obtained from such a biological sample by any method (eg, genomic DNA extraction method).
  • a mixture containing the following DNA fragments is obtained (eg, see FIG. 1): (A) a completely cleaved DNA fragment comprising target DNA; (B) an incompletely cut DNA fragment containing the target DNA; and (c) various DNA fragments not containing the target DNA.
  • Cleavage of genomic DNA with a restriction enzyme can be performed at an appropriate temperature and reaction time depending on the type of restriction enzyme.
  • the restriction enzyme used in the present invention is an enzyme having the ability to cleave double-stranded DNA, and may produce either a blunt end or a sticky end by cleaving the double-stranded DNA.
  • restriction enzymes include AatII, AccI, AccII, AccIII, AclI, AfaI, AflII, AluI, Aor13HI, Aor51HI, ApaI, ApaLI, AsuII, BalI, BamHI, BanII, BciTg, BciT130I, Bcn, BlnI, BmeT110I, BmgT120I, Bpu1102I, Bsp1286I, Bsp1407I, BspT104I, BspT107I, BssHII, Bst1107I, BstPI, BstXI, Cfr10I, ClaI, CpoI, DdeI, DraI, DpnE EcoRII, EcoRV, Eco 14, EcoT22I, FbaI, FokI, HaeII, HaeIII, HapII, HhaI, Hin1I, HincII, HindIII, HinfI
  • the genomic DNA cleavage reaction time by the restriction enzyme may be shortened. This is because the method of the present invention can appropriately analyze the target DNA in the genomic DNA even if the digestion of the genomic DNA with the restriction enzyme is incomplete.
  • Removal of incompletely cleaved DNA fragment containing target DNA can be performed using non-target DNA in the incompletely cleaved DNA fragment. For example, such removal can be achieved by removing incompletely cleaved DNA fragments using nucleic acid probes specific for non-target DNA, or by fractionation based on the total molecular weight of target DNA and non-target DNA. This can be done by removal.
  • the removal can be performed using a nucleic acid probe specific for the non-target DNA.
  • Nucleic acid probe specific for non-target DNA is one or more (for example, 1 to 3, preferably 1 or 2, more preferably 1) recognition of restriction enzyme at the 5 'or 3' end of target DNA in genomic DNA It means a nucleic acid probe that is complementary to part or all of a non-target DNA (eg, see FIG. 1) linked to a target DNA via a site (uncut site).
  • the nucleic acid probe specific for non-target DNA may be a DNA probe or a heterologous nucleic acid probe.
  • the heterologous nucleic acid probe means a nucleic acid probe having a main chain structure different from the main chain structure of the target DNA (structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety) as a part or the whole of the main chain structure.
  • heterologous nucleic acid probes include RNA probes (eg, normal RNA probes composed of natural ribonucleotides having a hydroxyl group at the 2 ′ position, and hydroxyl groups at the 2 ′ position modified with an alkyl group such as a methyl group).
  • RNA probes composed of ribonucleotides
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • BNA bridged nucleic acid
  • S phosphorothioate nucleic acid probes
  • two or more such Examples include chimeric nucleic acid probes in which nucleic acid probes are linked, and chimeric nucleic acid probes in which one or more such nucleic acid probes and DNA probes are linked.
  • the nucleic acid probe specific to the non-target DNA may be a DNA probe.
  • the number of nucleotide residues constituting the nucleic acid probe specific to the non-target DNA should be long enough to hybridize with the non-target DNA. Although not particularly limited as long as it is present, for example, it may be 12 or more, preferably 15 or more, preferably 18 or more, more preferably 20 or more.
  • the number of nucleotides constituting a nucleic acid probe specific for non-target DNA may also be, for example, 100 or less, 80 or less, 60 or less, or 50 or less. Nucleic acid probes specific for non-target DNA can be prepared by probe synthesis methods known in the art.
  • the nucleic acid probe specific for non-target DNA can be used in a free form or a form immobilized on a solid phase.
  • Nucleic acid probes specific for non-target DNA may be labeled with a substance or group that allows immobilization to a solid phase. Labeling can be performed, for example, at the 5 'end or 3' end of a nucleic acid probe specific for non-target DNA.
  • Examples of the group or substance that can be immobilized on a solid phase include a group or substance that enables covalent binding to a solid phase, and an affinity substance.
  • groups or substances that enable covalent binding to a solid phase include, for example, thiol groups or substances having thiol groups (such thiol groups introduced into nucleic acid probes specific for non-target DNA are Can bind to maleimide groups on the solid phase), amino groups or substances with amino groups (such amino groups introduced into nucleic acid probes specific for non-target DNA can bind to maleic anhydride on the solid phase ).
  • the affinity substance examples include streptavidin, biotin, digoxigenin, dinitrophenol, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, and a pair of single-stranded nucleic acids complementary to each other and capable of forming a double-stranded nucleic acid (eg, poly A sequence) And a single-stranded nucleic acid pair having a poly-T sequence).
  • the solid phase one coated with another affinity substance having affinity with the affinity substance possessed by the nucleic acid probe specific for the non-target DNA can be used.
  • a nucleic acid probe specific for non-target DNA may be immobilized on a solid phase after hybridization with an incompletely-cut DNA fragment containing the target DNA.
  • solid phase examples include particles (eg, magnetic particles); membranes (eg, nitrocellulose membrane), supports such as glass, plastic and metal; and containers such as plates (eg, multiwell plates) and tubes. It is done.
  • particles eg, magnetic particles
  • membranes eg, nitrocellulose membrane
  • supports such as glass, plastic and metal
  • containers such as plates (eg, multiwell plates) and tubes. It is done.
  • the nucleic acid probe specific for non-target DNA is: (I) a nucleic acid probe specific for 5 ′ flanking DNA; (Ii) a nucleic acid probe specific for 3 ′ flanking DNA; (Iii) A combination of a nucleic acid probe specific for 5 ′ adjacent DNA and a nucleic acid probe specific for 3 ′ adjacent DNA.
  • the 5 ′ flanking DNA means a non-target DNA (restriction enzyme cleavage unit) adjacent to the target DNA via a restriction enzyme recognition site (uncut site) on the 5 ′ end side of the target DNA in genomic DNA (example) , See FIG.
  • a nucleic acid probe specific for 5 ′ adjacent DNA means a nucleic acid probe complementary to a part or all of such 5 ′ adjacent DNA.
  • the 3 ′ adjacent DNA means a non-target DNA (restriction enzyme cleavage unit) adjacent to the target DNA via a restriction enzyme recognition site (uncut site) on the 3 ′ end side of the target DNA in the genomic DNA (example) , See FIG.
  • a nucleic acid probe specific for 3 ′ adjacent DNA means a nucleic acid probe complementary to a part or all of such 3 ′ adjacent DNA.
  • step (2) may be performed by: (2-1) combining a nucleic acid probe specific for non-target DNA with the mixture; (2-2) Incubating the mixed solution to obtain a hybridization complex containing the nucleic acid probe and the DNA fragment of (b); (2-3) Separating the hybridization complex from or in the mixed solution to obtain a solution containing the DNA fragments of (a) and (c) above.
  • step (2-1) an appropriate amount of the nucleic acid probe is combined with the mixed solution.
  • the nucleic acid probe may be added to the mixed solution.
  • the mixed solution may be transferred to a solid phase on which the nucleic acid probe is fixed.
  • the nucleic acid probe may be used in an excess amount with respect to its target site (1 equivalent) in genomic DNA in order to efficiently remove incompletely cleaved DNA fragments including the target DNA.
  • a hybridization complex is obtained by incubation of the mixed solution.
  • Incubations can be performed under any conditions that can form a hybridization complex.
  • Such conditions eg, salt concentration of solution, incubation temperature, incubation time
  • the separation can be performed using, for example, a solid phase.
  • the magnetic particles in the mixed solution can be collected by manipulating the magnetic force, so by collecting the supernatant of the mixed solution not containing the magnetic particles, A target solution containing the DNA fragments of (a) and (c), wherein the amount of the DNA fragment of (b) is reduced, can be obtained.
  • the target solution can be obtained by transferring the mixed solution from the support or container.
  • the nucleic acid probe Even if the nucleic acid probe is not immobilized on a solid phase, it may be immobilized on the solid phase after hybridization complex formation if it is labeled with a substance or group that allows immobilization on the solid phase. Since it is possible, the target solution can be obtained in the same manner as described above.
  • Target DNA Analysis of target DNA can be performed by any method (for example, International Publication No. 2015/025862; International Publication No. 2015/025863; International Publication No. 2015/025864; International Publication) No. 2015/108177; DNA Research 13, 37-42 (2006); Analytical Chemistry 77 (2), 504-510 (2005); Analytical Chemistry 83, 7595-7599 (2011); Nucleic Acids 34 (8) e61 (2006); Scientific Reports 501 (2), srep00501 (2012)).
  • the target DNA may be analyzed after capturing the target nucleic acid using a nucleic acid probe specific to the target DNA.
  • the nucleic acid probe specific to the target DNA means a nucleic acid probe complementary to a part or all of the target DNA found in the genomic DNA (a restriction enzyme cleavage unit; see FIG. 1).
  • the nucleic acid probe specific to the target DNA is a DNA probe or a heterologous nucleic acid probe as described above, but may be a heterologous nucleic acid probe from the viewpoint of high specificity or the like.
  • the number of nucleotide residues constituting the nucleic acid probe specific for the target DNA is the same as that described for the nucleic acid probe specific for the non-target DNA.
  • the nucleic acid probe specific to the target DNA can be used in a free form or a form fixed on a solid phase.
  • the nucleic acid probe specific for the target DNA may be labeled with a substance or group that allows immobilization to the solid phase.
  • the details of the label, the solid phase, the group that enables immobilization to the solid phase, and the substance that enables immobilization to the solid phase are the same as those described for the nucleic acid probe specific to the non-target DNA.
  • a specific region in the target DNA for example, a modified nucleobase in the region may be analyzed.
  • a modified nucleobase refers to a nucleobase having a structure modified with respect to the nucleobase.
  • the term “nucleobase” includes, for example, adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T).
  • the nucleobase is preferably cytosine (C).
  • Examples of the modification include introduction of a substituent into the nucleobase, elimination of a group (eg, amino group, oxo group, methyl group) possessed by the nucleobase, and exchange of the group possessed by the nucleobase with a substituent. .
  • the substituent is not particularly limited as long as it can be possessed by a naturally occurring nucleobase.
  • Administrative Instructions under the Patent Cooperative Treaty (enforced on January 1, 2009), Annex C, Appendix 2, Examples include substituents possessed by modified nucleobases in modified nucleotides described in Table 2: List of Modified Nucleotides.
  • the modified nucleotides described in this document are the “Guidelines (July 2002) or (December 2009) for preparation of a description including a base sequence or amino acid sequence” published by the Japan Patent Office. ) ", Annex 2, Table 2: Can be the same as the modified nucleotide described in the modified base table. Accordingly, reference can also be made to the above guidelines for modified nucleobases.
  • the substituent is preferably methyl, hydroxymethyl or carboxyl, more preferably methyl or hydroxymethyl, and even more preferably methyl.
  • the position of modification such as substitution is not particularly limited, but in the case of a nucleobase (C or T) having a pyrimidine ring, it is, for example, in the 2nd, 4th to 6th position, preferably in the 5th position, and the purine ring In the case of a nucleobase having A (G), it is, for example, the 2nd, 6th, or 8th position.
  • the modified nucleobase is not particularly limited as long as it can exist in nature.
  • Administrative Instructions under the Patent Cooperation Treaty (enforced on January 1, 2009), Annex C, Appendix 2, Table 2: Examples thereof include modified nucleobases possessed by modified nucleotides described in Modified Nucleotides.
  • the modified nucleotides described in this document may be the same as the modified nucleotides described in Appendix 2, Table 2: Modified Base Table of the above guidelines. Accordingly, reference can also be made to the above guidelines for modified nucleobases.
  • the modified nucleobase is preferably methylcytosine (eg, 5-methylcytosine), hydroxymethylcytosine (eg, 5-hydroxymethylcytosine), carboxyl cytosine (eg, 5-carboxyl cytosine), more preferably methyl Cytosine and hydroxymethylcytosine, even more preferably methylcytosine.
  • a modified nucleobase is known to cause a change in the function of the nucleic acid (eg, a change in the transcriptional regulatory ability of a given gene).
  • modified nucleobases can be analyzed by immunoassay (eg, International Publication No. 2015/025862; International Publication No. 2015/025863; International Publication No. 2015/025864; International Publication No.
  • the analysis may be performed after capturing the target DNA on the solid phase.
  • the modified nucleobase when a modified nucleobase is analyzed by mass spectrometry, electrochemical analysis, or high performance liquid chromatography analysis, the target DNA captured on the solid phase is decomposed by endonuclease or / and exonuclease, and the DNA fragment becomes a monomer. After recovering the solution decomposed into bases (nucleotides), the modified nucleobase can be analyzed by subjecting this solution to such a technique.
  • the modified nucleobase when the modified nucleobase is analyzed by nanopore analysis, the target DNA captured on the solid phase is dissociated from the solid phase by treatment with an alkaline aqueous solution or heat treatment to obtain a solution containing DNA fragments,
  • the modified nucleobase can be analyzed by subjecting this solution to nanopore analysis.
  • the modification frequency of the target DNA by the modified nucleobase may be evaluated in consideration of the amount of genomic DNA or target DNA used.
  • the reaction solution having the above composition was subjected to an amplification reaction according to the following protocol. (1) 98 ° C, 2 minutes (2) 98 ° C, 10 seconds (3) 68 ° C, 1 minute
  • reaction steps (2) to (3) were repeated 50 cycles. The results are shown in Table 1.
  • nucleotide sequence of probe nucleic acid (nucleic acid probe specific to target DNA) for capturing target DNA is 5 ′ -UGC AGG ACC ACU CGA GGC UGC CAC-3 '(SEQ ID NO: 3; nucleic acid main chain is 2'-O-methylated RNA, 5' end is biotin-labeled), artificially synthesized by Hokkaido System Science I used something.
  • the magnetic particles were washed twice with 250 ⁇ L of TBS-T, suspended by adding 20 ⁇ L of distilled water, and then the Primer set designed in the region sandwiching the cleavage site of the restriction enzyme XspI and the cleavage site were not sandwiched.
  • the amount of DNA trapped in the magnetic particles and the amount of uncut DNA by the restriction enzyme XspI were measured by real-time PCR amplification using a primer set designed in the region.
  • Primer set designed in the region sandwiching the cleavage site of restriction enzyme XspI is: Forward Primer sequence is 5'-TCT AGA CCC CGC CCC ACG-3 '(SEQ ID NO: 1), Reverse Primer sequence is 5'-CTG CAG CAC CAC TCG AGG CTG-3 ′ (SEQ ID NO: 2), which was artificially synthesized by Hokkaido System Science, was used.
  • the Primer set designed in the region that does not sandwich the cleavage site is 5'-TAG AAC GCT TTG CGT CCC GAC-3 '(SEQ ID NO: 4) for the Forward Primer sequence, 5'-GAG AGC TCC GTC CTC for the Reverse Primer sequence.
  • C-3 ′ (SEQ ID NO: 5), which was artificially synthesized by Hokkaido System Science, was used.
  • reaction steps (2) to (3) were repeated 50 cycles. The results are shown in Table 2.
  • nucleotide sequence of the probe nucleic acid (nucleic acid probe specific for the target DNA) for capturing the target DNA is 5′-UGC AGG ACC ACU CGA GGC UGC CAC -3 ′ (SEQ ID NO: 3; the main chain of the nucleic acid is 2′-O-methylated RNA, and the 5 ′ end is labeled with biotin), which was artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. was used.
  • the nucleotide sequence of a probe nucleic acid (a nucleic acid probe specific to a non-target DNA having polyadenine) for capturing an uncut target DNA by a restriction enzyme is 5′-GTG GGG CGG GGT CTA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA-3 ′ (SEQ ID NO: 6), which was artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd., was used.
  • the magnetic particles were washed twice with 250 ⁇ L of TBS-T, suspended by adding 20 ⁇ L of distilled water, and then the Primer set designed in the region sandwiching the cleavage site of the restriction enzyme XspI and the cleavage site were not sandwiched.
  • the amount of DNA trapped in the magnetic particles and the amount of uncut DNA by the restriction enzyme XspI were measured by real-time PCR amplification using a primer set designed in the region.
  • Primer set designed in the region sandwiching the cleavage site of restriction enzyme XspI is: Forward Primer sequence is 5'-TCT AGA CCC CGC CCC ACG-3 '(SEQ ID NO: 1), Reverse Primer sequence is 5'-CTG CAG CAC CAC TCG AGG CTG-3 ′ (SEQ ID NO: 2), which was artificially synthesized by Hokkaido System Science, was used.
  • the Primer set designed in the region that does not sandwich the cleavage site is 5'-TAG AAC GCT TTG CGT CCC GAC-3 '(SEQ ID NO: 4) for the Forward Primer sequence, 5'-GAG AGC TCC GTC CTC for the Reverse Primer sequence.
  • C-3 ′ (SEQ ID NO: 5), which was artificially synthesized by Hokkaido System Science, was used.
  • reaction steps (2) to (3) were repeated 50 cycles. The results are shown in Table 3.
  • Example 1 Analysis of methylcytosine in target DNA by immunoassay (1) Cleavage of genomic DNA Genomic DNA is cleaved with a restriction enzyme in a solution to obtain a mixed solution containing the following DNA fragments (eg, FIG. 1). See).
  • Example 2 Analysis of methylcytosine in target DNA by mass spectrometry, electrochemical analysis, or high performance liquid chromatography analysis (1) Cleavage of genomic DNA This is carried out in the same manner as in Example 1 (1). (2) Removal of DNA fragment of (b) The method is the same as in Example 1 (2). (3) Analysis of target DNA (3-1) Perform the same method as in Example 1 (3-1). (3-2) Decompose the target DNA captured on the solid phase with endonuclease or / and exonuclease. Then, a solution in which the DNA fragment (a) is decomposed into monomer bases (nucleotides) can be collected.
  • Methylcytosine contained in the target DNA decomposed into monomer bases is analyzed by mass spectrometry (eg, Analytical Chemistry 77 (2), 504-510 (2005)), electrochemical analysis (eg, Analytical Chemistry 83). , 7595-7599 (2011)), or high performance liquid chromatography analysis (eg, Nucleic Acids Research 34 (8), e61 (2006)).
  • Example 3 Analysis of methylcytosine in target DNA by nanopore analysis (1) Cleavage of genomic DNA This is carried out in the same manner as in Example 1 (1). (2) Removal of DNA fragment of (b) The method is the same as in Example 1 (2). (3) Analysis of target DNA (3-1) Perform the same method as in Example 1 (3-1). (3-2) The target DNA captured on the solid phase is dissociated from the solid phase by treatment with an alkaline aqueous solution (eg, 50 mM NaOH aqueous solution) or heat treatment (eg, 95 ° C., 2 minutes). A solution containing the DNA fragment of a) can be obtained. (3-3) Methylcytosine contained in the target DNA dissociated from the solid phase is analyzed by nanopore analysis (eg, Scientific Reports 501 (2), srep00501 (2012)).
  • the method of the present invention is useful for measuring target DNA.

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Abstract

本発明は、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを適切に解析できる方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下を含む、標的ＤＮＡの測定方法を提供する： （１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること； （２）（ｂ）のＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）のＤＮＡ断片、及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに （３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。

Description

標的ＤＮＡの測定方法
　本発明は、標的ＤＮＡの測定方法に関する。
　標的核酸の解析前に、標的核酸の純度又は濃度がしばしば高められている。例えば、特許文献１は、標的核酸及び非標的核酸を含有する混合液から非標的核酸を除去することを開示している。特許文献２は、標的核酸及び非標的核酸を含有する混合液から標的核酸を単離又は精製することを開示している。
国際公開第２０１０／０９１８７０号 国際公開第２００６／１２１８８８号
　本発明者らは、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応を要する標的ＤＮＡの解析において、ゲノムＤＮＡが完全に切断されていない場合、標的ＤＮＡを適切に解析できないおそれがあるという課題があることを見出した。
　例えば、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡ中に存在する修飾核酸塩基を検出する場合、標的ＤＮＡ中に存在する修飾核酸塩基のみならず、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの５’又は３’末端側にある１以上の未切断部位を介して標的ＤＮＡに連結する非標的ＤＮＡ中に存在する修飾核酸塩基もまた検出されるおそれがある。
　また、当該非標的ＤＮＡの少なくとも一部の領域が標的ＤＮＡと対合し得る場合、単一鎖内において非標的ＤＮＡが標的ＤＮＡと効率良く相補結合し得ることから、核酸プローブを用いた標的ＤＮＡの解析に支障をきたすおそれがある。
　すなわち、本発明の課題は、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを適切に解析できる方法を提供することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを解析する場合、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去後に標的ＤＮＡを解析すればよいことを着想し（例、図１を参照）、本発明を完成するに至った。特許文献１及び２は、標的核酸の純度又は濃度を高めることについて記載しているが、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を除去すること、及び標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去後に標的ＤＮＡを解析することについては記載も示唆もしていない。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、標的ＤＮＡの測定方法：
（１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること；
（２）（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに
（３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。
〔２〕前記除去が非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、〔１〕の方法。
〔３〕非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブが以下の核酸プローブである、〔２〕の方法：
（１）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
（２）３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；又は
（３）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及び３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブの組み合わせ。
〔４〕前記解析が標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕標的ＤＮＡ中の修飾核酸塩基が解析される、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔５〕の方法。
〔７〕前記解析が、イムノアッセイ、質量分析、電気化学分析、高速液体クロマトグラフィー分析、又はナノポア分析により行われる、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
　本発明の方法は、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを適切に解析することができる。切断効率の低い制限酵素をゲノムＤＮＡの切断に用いる場合、本発明の方法は特に有用である。また、標的ＤＮＡの測定に要する総時間の短縮のため、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応の時間を短縮する必要がある場合、本発明の方法は特に有用である。
図１は、本発明の方法の概要を示す図である。 図２は、種々の反応時間における制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後の未切断ＤＮＡ量を示す図である。 図３は、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブにより捕捉された未切断ＤＮＡ量を示す図である。 図４は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いた、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去効率（未切断率の相対評価）を示す図である。
　本発明の方法は、下記（１）～（３）により行われる：
（１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること；
（２）（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに
（３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。
（１）ゲノムＤＮＡの切断
　本発明で用いられるゲノムＤＮＡは、任意の生物学的サンプルから得られるものである。このような生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類、ウイルスが挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体又は血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織又は細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、又は疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。ゲノムＤＮＡは、このような生物学的サンプルから、任意の方法（例、ゲノムＤＮＡ抽出法）により適宜入手することができる。
　溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断することにより、以下のＤＮＡ断片を含有する混合液が得られる（例、図１を参照）：
（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片；
（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片；及び
（ｃ）標的ＤＮＡを含まない種々のＤＮＡ断片。
　制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断は、制限酵素の種類に応じた適切な温度及び反応時間で行うことができる。本発明で用いられる制限酵素は、２本鎖ＤＮＡを切断する能力を有する酵素であり、２本鎖ＤＮＡの切断により平滑末端又は粘着末端のいずれを生じるものであってもよい。このような制限酵素としては、例えば、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆａＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｌｕＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｕＩＩ、ＢａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｃｉＴ１３０Ｉ、ＢｃｎＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｎＩ、ＢｍｅＴ１１０Ｉ、ＢｍｇＴ１２０Ｉ、Ｂｐｕ１１０２Ｉ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、Ｂｓｐ１４０７Ｉ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｐＴ１０７Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、ＢｓｔＰＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａＩ、ＤｐｎＩ、ＥａｅＩ、Ｅａｍ１１０５Ｉ、Ｅｃｏ５２Ｉ、Ｅｃｏ８１Ｉ、Ｅｃｏ０６５Ｉ、Ｅｃｏ０１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＴ１４、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＦｂａＩ、ＦｏｋＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｌＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｐＩ、ＭｕｎＩ、ＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｈＢＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓｐＲＳＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｃａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｉＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｑＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｖａｎ９１Ｉ、ＶｐａＫ１１ＢＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、及びＸｓｐＩが挙げられる。標的ＤＮＡの測定に要する総時間の短縮のため、制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断反応時間は短縮されてもよい。本発明の方法は、制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断が不完全であっても、ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡを適切に解析できるためである。
（２）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去
　標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去は、不完全切断ＤＮＡ断片中の非標的ＤＮＡを利用して行うことができる。例えば、このような除去は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いた不完全切断ＤＮＡ断片の除去、又は標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの総和の分子量に基づく分画による不完全切断ＤＮＡ断片の除去により行うことができる。
　好ましくは、除去は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行うことができる。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの５’又は３’末端側にある１以上（例えば１～３、好ましくは１または２、より好ましくは１）の制限酵素認識部位（未切断部位）を介して標的ＤＮＡに連結する非標的ＤＮＡ（例、図１を参照）の一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。
　非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、ＤＮＡプローブ又は異種核酸プローブであってもよい。
　異種核酸プローブとは、標的ＤＮＡの主鎖構造（糖部分及びリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部又は全体として有する核酸プローブを意味する。異種核酸プローブとしては、例えば、ＲＮＡプローブ（例、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、及び２’位のヒドロキシル基がメチル基等のアルキル基で修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ）プローブ又は架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、並びにこのような２以上の核酸プローブが連結したキメラ型核酸プローブ、このような１以上の核酸プローブとＤＮＡプローブが連結したキメラ型核酸プローブが挙げられる。
　低コストの観点から、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、ＤＮＡプローブであってもよい。
　非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブの長さ）は、非標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る程度に十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１２個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは１８個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下又は５０個以下であってもよい。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。
　非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、遊離の形態、又は固相に固定された形態で用いることができる。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、固相への固定を可能にする物質又は基で標識されていてもよい。標識は、例えば、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブの５’末端又は３’末端にて行うことができる。固相への固定を可能にする基又は物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基又は物質、及び親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基又は物質としては、例えば、チオール基又はチオール基を有する物質（非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基又はアミノ基を有する物質（非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、及び二本鎖核酸の形成能を有する互いに相補的な一本鎖核酸の対（例、ポリＡ配列を有する一本鎖核酸とポリＴ配列を有する一本鎖核酸の対）が挙げられる。この場合、固相としては、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、遊離の形態で用いられる場合、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片とのハイブリッド形成後に、固相に固定されてもよい。
　固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）；メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック及び金属等の支持体；並びにプレート（例、マルチウェルプレート）、チューブ等の容器が挙げられる。
　より好ましくは、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、以下である：
（ｉ）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
（ｉｉ）３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
（ｉｉｉ）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及び３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブの組み合わせ。
　５’隣接ＤＮＡとは、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの５’末端側にある制限酵素認識部位（未切断部位）を介して標的ＤＮＡに隣接する非標的ＤＮＡ（制限酵素切断単位）を意味する（例、図１を参照）。したがって、５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、このような５’隣接ＤＮＡの一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。
　３’隣接ＤＮＡとは、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの３’末端側にある制限酵素認識部位（未切断部位）を介して標的ＤＮＡに隣接する非標的ＤＮＡ（制限酵素切断単位）を意味する（例、図１を参照）。したがって、３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、このような３’隣接ＤＮＡの一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。
　このような５’隣接ＤＮＡ及び／又は３’隣接ＤＮＡを用いることで、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を効率良く除去することができる。
　５’隣接ＤＮＡ及び３’隣接ＤＮＡは、ＤＮＡプローブ又は異種核酸プローブであるが、低コストの観点から、ＤＮＡプローブであってもよい。
　より詳細には、工程（２）は、以下により行われてもよい：
（２－１）非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを混合液に合わせること；
（２－２）混合液をインキュベートして、上記核酸プローブ及び上記（ｂ）のＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーション複合体を得ること；
（２－３）混合液から又は混合液中でハイブリダイゼーション複合体を分離して、上記（ａ）及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含む溶液を得ること。
　工程（２－１）では、適量の上記核酸プローブが混合液と合わせられる。例えば、上記核酸プローブが混合液に添加されてもよい。あるいは、上記核酸プローブが固定された固相に混合液が移されてもよい。上記核酸プローブは、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を効率良く除去するため、ゲノムＤＮＡにおけるその標的部位（１当量）に対して過剰量で用いられてもよい。
　工程（２－２）では、混合液のインキュベーションによりハイブリダイゼーション複合体が得られる。インキュベーションは、ハイブリダイゼーション複合体を形成し得る任意の条件下で行うことができる。このような条件（例、溶液の塩濃度、インキュベーション温度、インキュベーション時間）は周知である（例、国際公開第２０１０／０９１８７０号、国際公開第２００６／１２１８８８号、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号を参照）。
　工程（２－３）では、分離は、例えば、固相を利用して行うことができる。上記核酸プローブが固相として磁性粒子に固定されている場合、磁力操作することにより混合液中の磁性粒子を収集することができるので、磁性粒子を含まない混合液上清を回収することで、上記（ｂ）のＤＮＡ断片の量が低減された、上記（ａ）及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含む目的の溶液を得ることができる。上記核酸プローブが固相として支持体又は容器に固定されている場合、混合液を支持体又は容器から移すことで、目的の溶液を得ることができる。上記核酸プローブは、固相に固定されていない場合であっても、固相への固定を可能にする物質又は基で標識されているときには、ハイブリダイゼーション複合体形成後に固相に固定することが可能であるので、上記と同様にして、目的の溶液を得ることができる。
（３）標的ＤＮＡの解析
　標的ＤＮＡの解析は、任意の方法により行うことができる（例、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号；ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３，３７－４２（２００６）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７７（２），５０４－５１０（２００５）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８３，７５９５－７５９９（２０１１）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３４（８），ｅ６１（２００６）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　５０１（２），ｓｒｅｐ００５０１（２０１２））。例えば、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて、標的核酸を捕捉した後に、標的ＤＮＡが解析されてもよい。
　標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、ゲノムＤＮＡ中に見出される標的ＤＮＡ（制限酵素による切断単位。図１を参照）の一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、上述したようなＤＮＡプローブ又は異種核酸プローブであるが、高特異性等の観点から、異種核酸プローブであってもよい。
　標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを構成するヌクレオチド残基の個数は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブについて述べたものと同様である。
　標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、遊離の形態、又は固相に固定された形態で用いることができる。標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、固相への固定を可能にする物質又は基で標識されていてもよい。標識、固相、固相への固定を可能にする基、固相への固定を可能にする物質の詳細は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブについて述べたものと同様である。
　本発明の方法では、標的ＤＮＡ中の特定の領域、例えば、当該領域中の修飾核酸塩基が解析されてもよい。修飾核酸塩基とは、核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。用語「核酸塩基」としては、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、核酸塩基への置換基の導入、核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ　Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　２，Ｔａｂｌｅ　２：Ｌｉｓｔ　ｏｆ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）又は（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチル、カルボキシルであり、より好ましくは、メチル、ヒドロキシメチルであり、さらにより好ましくはメチルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ又はＴ）の場合には、例えば、２位、４～６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（Ａ又はＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。
　修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ　Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　２，Ｔａｂｌｅ　２：Ｌｉｓｔ　ｏｆ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。修飾核酸塩基は、好ましくは、メチルシトシン（例、５－メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５－ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５－カルボキシルシトシン）であり、より好ましくは、メチルシトシン及びヒドロキシメチルシトシンであり、さらにより好ましくはメチルシトシンである。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。
　上述したような修飾核酸塩基の解析は、当該分野で公知である任意の方法により行うことができる。例えば、修飾核酸塩基の解析は、イムノアッセイ（例、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号；ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３，３７－４２（２００６））、質量分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７７（２），５０４－５１０（２００５））、電気化学分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８３，７５９５－７５９９（２０１１））、高速液体クロマトグラフィー分析（例、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３４（８），ｅ６１（２００６））、またはナノポア分析（例、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　５０１（２），ｓｒｅｐ００５０１（２０１２））により行うことができる。例えば、標的ＤＮＡを固相に捕捉した後、解析が行われてもよい。例えば、質量分析、電気化学分析、または高速液体クロマトグラフィー分析により修飾核酸塩基が解析される場合、固相に捕捉された標的ＤＮＡをエンドヌクレアーゼまたは／およびエキソヌクレアーゼにより分解して、ＤＮＡ断片がモノマー塩基（ヌクレオチド）に分解された溶液を回収した後、この溶液をこのような技術に付すことで、修飾核酸塩基を解析できる。また、ナノポア分析により修飾核酸塩基が解析される場合、固相に捕捉された標的ＤＮＡをアルカリ性水溶液による処理、または加熱処理により固相上から解離して、ＤＮＡ断片を含む溶液を得た後、この溶液をナノポア分析に付すことで、修飾核酸塩基を解析できる。本発明では、用いたゲノムＤＮＡ量又は標的ＤＮＡ量を考慮して、修飾核酸塩基による標的ＤＮＡの修飾頻度を評価してもよい。
　以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１：制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後の未切断率の評価（１）
（１－１）ゲノムＤＮＡの切断
　１．８μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と３ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＫＣｌ）２０μＬ中に溶解させ、３７℃で０分、又は２０分、４０分、６０分反応させることで、制限酵素ＸｓｐＩにより切断されたゲノムＤＮＡを得た。
（１－２）ゲノムＤＮＡの未切断率の評価
　上記で得られた制限酵素切断ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅により、制限酵素によって切断された割合を測定した。
　リアルタイムＰＣＲ増幅を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ　ＰＣＲ試薬（ＫＯＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ：ＴＯＹＯＢＯ社製）：１２．５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
５０ｘ　ＲＯＸ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｄｙｅ：０．０５μＬ
２５倍希釈した制限酵素切断ゲノムＤＮＡ：２μＬ
Ｔｏｔａｌ：２５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＣＣ　ＣＧＣ　ＣＣＣ　ＡＣＧ－３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣ　ＣＡＣ　ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ－３’（配列番号２）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　上記組成の反応溶液を、以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。
（１）９８℃、２分
（２）９８℃、１０秒
（３）６８℃、１分
　反応ステップ（１）を行ってから、反応ステップ（２）～（３）を５０サイクル繰り返した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、ヒトゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｓｐＩでの切断処理をしても、反応時間６０分では完全に切断できないことが確認できた（表１、図２）。
参考例２：制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後の未切断率の評価（２）
（２－１）ゲノムＤＮＡの切断
　１．８μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と３ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＫＣｌ）２０μＬ中に溶解させ、３７℃で２０分反応させることで、制限酵素ＸｓｐＩにより切断されたゲノムＤＮＡを得た。
（２－２）標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブにより捕捉されたＤＮＡの未切断率の評価
　標的ＤＮＡを捕捉するためのプローブ核酸（標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ）のヌクレオチド配列は、５’－ＵＧＣ　ＡＧＧ　ＡＣＣ　ＡＣＵ　ＣＧＡ　ＧＧＣ　ＵＧＣ　ＣＡＣ－３’（配列番号３；核酸の主鎖は２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　上記で得た制限酵素ＸｓｐＩにより切断されたゲノムＤＮＡの１０μＬを、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ（１ｐｍｏｌ）を含む緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）９０μＬに溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で１時間反応させることで、ゲノムＤＮＡ内の標的ＤＮＡと標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブのハイブリッドを形成させた。ハイブリダイゼーション反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社製Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。この磁性粒子を、２５０μＬのＴＢＳ－Ｔで２回洗浄し、２０μＬの蒸留水を加えて懸濁させた後、制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセット及び切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅により、磁性粒子に捕捉されたＤＮＡ量及び制限酵素ＸｓｐＩにより未切断のＤＮＡ量を測定した。
　リアルタイムＰＣＲ増幅を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ　ＰＣＲ試薬（ＫＯＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ：ＴＯＹＯＢＯ社製）：１２．５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
５０ｘ　ＲＯＸ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｄｙｅ：０．０５μＬ
磁性粒子に捕捉したＤＮＡサンプル：２μＬ
Ｔｏｔａｌ：２５μＬ
　制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＣＣ　ＣＧＣ　ＣＣＣ　ＡＣＧ－３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣ　ＣＡＣ　ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ－３’（配列番号２）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＴＡＧ　ＡＡＣ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＣＧＴ　ＣＣＣ　ＧＡＣ－３’（配列番号４）、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＧＡＧ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　ＧＣＡ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　Ｃ－３’（配列番号５）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　上記組成の反応溶液を以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。
（１）９８℃、２分
（２）９８℃、１０秒
（３）６８℃、１分
　反応ステップ（１）を行ってから、反応ステップ（２）～（３）を５０サイクル繰り返した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、制限酵素ＸｓｐＩにより切断されていないＤＮＡが、磁性粒子に捕捉された標的ＤＮＡのうち３．９％を占めることが確認された（表２、図３）。
参考例３：非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いた、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去効率の評価
（３－１）ゲノムＤＮＡの切断
　１．８μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と３ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＫＣｌ）２０μＬ中に溶解させ、３７℃で２０分反応させることで、制限酵素ＸｓｐＩにより処理したゲノムＤＮＡを得た。
（３－２）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去
　標的ＤＮＡを捕捉するためのプローブ核酸（標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ）のヌクレオチド配列は５’－ＵＧＣ　ＡＧＧ　ＡＣＣ　ＡＣＵ　ＣＧＡ　ＧＧＣ　ＵＧＣ　ＣＡＣ－３’（配列番号３；核酸の主鎖は２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。制限酵素により未切断の標的ＤＮＡを捕捉するためのプローブ核酸（ポリアデニンを有する、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ）のヌクレオチド配列は５’－ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ－３’（配列番号６）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　上記で得た制限酵素ＸｓｐＩにより処理したゲノムＤＮＡの１０μＬを、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ（１ｐｍｏｌ）、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ（１ｐｍｏｌ）、３７．５μｇのポリチミンでコートされた磁性粒子（インビトロジェン社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５；粒子１）を含む緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１．５Ｍ　イミダゾール、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ）９０μＬに溶解させた。
　また、粒子１の代わりに、３７．５μｇのポリチミンでコートされた磁性粒子（サーモフィッシャー社製Ｓｅｒａ－Ｍａｇ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；粒子２）を使用した以外は、上記と同じ組成の溶液を調製した。
　さらに、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及びポリチミンでコートされた磁性粒子を添加してない溶液を調製した。
　これらの溶液を、９５℃で５分間反応させた後、３７℃で１時間反応させることで、ゲノムＤＮＡ内の標的ＤＮＡと標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブのハイブリッドを形成させた。同時に標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片と、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、ポリチミンでコートされた磁性粒子の３者のハイブリットも形成させた。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を磁石上で３分間集磁操作を行って、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を溶液中で沈殿させ、分離した。
（３－３）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去効率の評価
　上記で得られた溶液の上清（標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片が除去）に３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社製Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。この磁性粒子を、２５０μＬのＴＢＳ－Ｔで２回洗浄し、２０μＬの蒸留水を加えて懸濁させた後、制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセット及び切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅により、磁性粒子に捕捉されたＤＮＡ量及び制限酵素ＸｓｐＩにより未切断のＤＮＡ量を測定した。
　リアルタイムＰＣＲ増幅を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ　ＰＣＲ試薬（ＫＯＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ：ＴＯＹＯＢＯ社製）：１２．５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
５０ｘ　ＲＯＸ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｄｙｅ：０．０５μＬ
磁性粒子に捕捉したＤＮＡサンプル：２μＬ
Ｔｏｔａｌ：２５μＬ
　制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＣＣ　ＣＧＣ　ＣＣＣ　ＡＣＧ－３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣ　ＣＡＣ　ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ－３’（配列番号２）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＴＡＧ　ＡＡＣ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＣＧＴ　ＣＣＣ　ＧＡＣ－３’（配列番号４）、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’－ＧＡＧ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　ＧＣＡ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　Ｃ－３’（配列番号５）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　上記組成の反応溶液を以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。
（１）９８℃、２分
（２）９８℃、１０秒
（３）６８℃、１分
　反応ステップ（１）を行ってから、反応ステップ（２）～（３）を５０サイクル繰り返した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いることにより、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片が効率良く除去できることが明らかとなった（表３、図４）。よって、本方法論により、標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片を特異的に捕捉することができると考えられる。
実施例１：イムノアッセイによる標的ＤＮＡ中のメチルシトシンの解析
（１）ゲノムＤＮＡの切断
　溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、以下のＤＮＡ断片を含有する混合液を得る（例、図１を参照）。
（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片
（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片
（ｃ）標的ＤＮＡを含まない種々のＤＮＡ断片
（２）上記（ｂ）のＤＮＡ断片の除去
（２－１）非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとして５’隣接ＤＮＡプローブ及び／又は３’隣接ＤＮＡプローブ（磁性粒子に固定）、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとして２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡプローブ（５’末端はビオチン標識）を混合液に添加する。
（２－２）混合液をインキュベートして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。
（２－３）混合液中の磁性粒子を集磁した後、混合液の上清（磁性粒子を含まない）を回収する。本上清を、上記（ｂ）のＤＮＡ断片の量が低減された、上記（ａ）及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含む溶液として用いる。本溶液中では、上記（ａ）のＤＮＡ断片は、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡプローブとハイブリダイゼーション複合体を形成している。
（３）標的ＤＮＡの解析
（３－１）上記（２）で得られた溶液を、ビオチンと親和性を有するストレプトアビジンが固定されたマルチウェルプレートに移す。そうすると、上記（ａ）のＤＮＡ断片及び２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション複合体がマルチウェルプレートに固定されるので、標的ＤＮＡを固相に捕捉することができる。
（３－２）固相に捕捉された標的ＤＮＡ中のメチルシトシンを、イムノアッセイ（例、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号；ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３，３７－４２（２００６））により解析する。
実施例２：質量分析、電気化学分析、または高速液体クロマトグラフィー分析による標的ＤＮＡ中のメチルシトシンの解析
（１）ゲノムＤＮＡの切断
　実施例１（１）と同様の方法により行う。
（２）上記（ｂ）のＤＮＡ断片の除去
　実施例１（２）と同様の方法により行う。
（３）標的ＤＮＡの解析
（３－１）実施例１（３－１）と同様の方法により行う。
（３－２）固相に捕捉された標的ＤＮＡをエンドヌクレアーゼまたは／およびエキソヌクレアーゼにより分解する。そうすると、上記（ａ）のＤＮＡ断片がモノマー塩基（ヌクレオチド）に分解された溶液を回収することができる。
（３－３）モノマー塩基に分解された標的ＤＮＡ中に含まれるメチルシトシンを、質量分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７７（２），５０４－５１０（２００５））、電気化学分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８３，７５９５－７５９９（２０１１））、または高速液体クロマトグラフィー分析（例、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３４（８），ｅ６１（２００６））により解析する。
実施例３：ナノポア分析による標的ＤＮＡ中のメチルシトシンの解析
（１）ゲノムＤＮＡの切断
　実施例１（１）と同様の方法により行う。
（２）上記（ｂ）のＤＮＡ断片の除去
　実施例１（２）と同様の方法により行う。
（３）標的ＤＮＡの解析
（３－１）実施例１（３－１）と同様の方法により行う。
（３－２）固相に捕捉された標的ＤＮＡをアルカリ性水溶液（例、５０ｍＭ　ＮａＯＨ水溶液）による処理、または加熱処理（例、９５℃、２分間）により固相上から解離することで、上記（ａ）のＤＮＡ断片を含む溶液を得ることができる。
（３－３）固相上から解離された標的ＤＮＡ中に含まれるメチルシトシンを、ナノポア分析（例、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　５０１（２），ｓｒｅｐ００５０１（２０１２））により解析する。
　本発明の方法は、標的ＤＮＡの測定に有用である。

Claims (7)

  1. 　以下を含む、標的ＤＮＡの測定方法：
    （１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること；
    （２）（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに
    （３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。
  2. 　前記除去が非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、請求項１記載の方法。
  3. 　非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブが以下の核酸プローブである、請求項２記載の方法：
    （１）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
    （２）３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；又は
    （３）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及び３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブの組み合わせ。
  4. 　前記解析が標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 　標的ＤＮＡ中の修飾核酸塩基が解析される、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項５記載の方法。
  7. 　前記解析が、イムノアッセイ、質量分析、電気化学分析、高速液体クロマトグラフィー分析、又はナノポア分析により行われる、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
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